抗体纯化工艺
阅读：1012发布：2020-10-05
专利汇可以提供抗体纯化工艺专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种 蛋白质 (具体地说IgM 抗体 )纯化方法，包括使用非离子 聚合物 的层析步骤(例如羟 磷灰石 层析，聚乙二醇作为所述聚合物)去除蛋白质聚集物，随后使用强化溶解的添加剂(例如尿素混合物、亚烷基二醇或两性离子，尤其是甘 氨 酸)进行离子交换层析。，下面是抗体纯化工艺专利的具体信息内容。
1.从样本中纯化蛋白质产品的工艺，所述样本包含所述蛋白质产品和所述蛋白质产品的聚集物，所述工艺包括：
(a)第一层析步骤，包括使用非离子聚合物去除所述蛋白质产品的所述聚集物，其中所述非离子聚合物的浓度足以在所述层析条件下强化从所述蛋白质产品的聚集物分离所述蛋白质产品，由此在本步骤之后收集含有所述蛋白质产品基本不含聚集物的组分；
(b)合并步骤，将强化溶解性的添加剂与从所述第一层析步骤获得的含有所述蛋白质产品的组分相合并，或者与随后获得的含有所述蛋白质产品的组分相合并，该随后获得的组分来自所述从所述第一层析步骤获得的含有所述蛋白质产品的组分，其中所述强化溶解性的添加剂从由两性离子、尿素化合物和亚烷基二醇组成的群中选取；以及(c)第二层析步骤，包括使用离子交换层析，其中所述强化溶解性的添加剂的浓度足以强化所述蛋白质产品的溶解性并且基本上避免在所述层析条件下发生闭塞，且其中所述强化溶解性的添加剂不干扰所述第二层析步骤，并且其中所述工艺产生基本不含聚集物的纯化蛋白质产品。
2.如权利要求1所述的工艺，其中所述样本为细胞培养上清液。
3.如权利要求1所述的工艺，其中所述蛋白质产品为免疫球蛋白或其片段。
4.如权利要求3所述的工艺，其中所述免疫球蛋白为IgM。
5.如权利要求1所述的工艺，其中所述强化溶解的添加剂从由甘氨酸、甜菜碱、尿素、乙二醇和聚乙二醇组成的群中选取。
6.如权利要求1所述的工艺，其中所述第一层析步骤的所述非离子聚合物为聚乙二醇(PEG)。
7.如权利要求1所述的工艺，其中所述第一层析步骤包括羟磷灰石层析，其中所述非离子聚合物的浓度足以在羟磷灰石层析条件下强化从所述聚集物中分离所述蛋白质产品。
8.如权利要求7所述的工艺，其中所述非离子聚合物为聚乙二醇且所述强化溶解的添加剂从由甘氨酸和尿素组成的群中选取。
9.如权利要求8所述的工艺，其中在所述羟磷灰石层析后收集的所述组分被收集到含有所述强化溶解的添加剂的混合物中。
10.如权利要求1所述的工艺，其中对在所述第一层析步骤后收集的所述含有所述蛋白质产品的组分进行进一步的分离或纯化步骤，从而产生含有所述蛋白质产品的组分，所述蛋白质产品来自从所述第一层析获得的组分，所述进一步的分离或纯化步骤在将该组分与所述强化溶解的添加剂合并的步骤之前。
11.如权利要求1所述的工艺，其中所述第二层析步骤包括阴离子交换层析。
12.如权利要求1所述的工艺，其中所述第二层析步骤包括阳离子交换层析。
13.如权利要求11所述的工艺，其中所述第二层析步骤进一步包括阳离子交换层析。
14.如权利要求1所述的工艺，其中从所述第一层析步骤获得的含有所述蛋白质产品的所述组分与含有所述强化溶解的添加剂相合并。
15.如权利要求14所述的工艺，其中所述强化溶解的添加剂为两性离子。
16.权利要求1所述的工艺包括第三层析步骤，包括对从所述第二层析步骤获得的组分执行离子交换层析。
17.如权利要求16所述的工艺，其中所述第二层析步骤为阴离子交换层析，所述第三层析步骤为阳离子交换层析。
18.如权利要求16所述的工艺，其中所述第二层析步骤为阳离子交换层析，所述第三层析步骤为阴离子交换层析。
19.如权利要求1所述的工艺，其中所述强化溶解的添加剂为甘氨酸。
20.如权利要求4所述的工艺，其中所述第一层析步骤包括羟磷灰石层析，其中所述非离子聚合物的浓度足以在羟磷灰石层析条件下强化从所述IgM聚集物中分离IgM。
21.如权利要求20所述的工艺，其中所述非离子聚合物为聚乙二醇。
22.如权利要求21所述的工艺，其中所述非离子聚合物为浓度约10％的聚乙二醇。
23.如权利要求20所述的工艺，其中所述非离子聚合物为聚乙二醇，所述强化溶解的添加剂从由两性离子和尿素组成的群中选出。
24.如权利要求23所述的工艺，其中所述强化溶解的添加剂为甘氨酸。
25.如权利要求24所述的工艺，其中所述在第二层析步骤中使用甘氨酸，其浓度在约
0.5M到约1M之间，其中所述工艺产生几乎不含IgM聚集物的IgM，其中所述IgM的纯度超过约99％。
26.如权利要求25所述的工艺，进一步地其中在第一层析步骤的羟磷灰石层析之后收集的组分被收集到含有浓度约1M的甘氨酸的混合物中。
抗体纯化工艺
技术领域
[0002] 本披露涉及蛋白质纯化的方法和混合物，具体地，涉及抗体纯化工艺的方法和混合物，该工艺包括去除聚集物和使用强化溶解性的添加剂(例如带有两性离子的化合物)以强化抗体溶解性、避免聚集物的生成或在离子交换层析中发生闭塞，从而产生高纯度的基本不含聚集物的蛋白质产品。
背景技术
[0003] 在血液和淋巴液中发现的IgM抗体通常是首先响应感染的一类抗体，并能够引起其他免疫系统细胞破坏外来物质。虽然IgM在医疗应用上具有很好的前景，但是IgM具有一些能够限制其在标准抗体净化工具中使用的特性。相比IgG，IgM的溶解性较差，且在极端pH值下和低导电率环境下更容易变性(沉淀，包括聚集物的生成)。IgM通常能够耐受高盐度，该特性能够用于离子交换层析技术，但是当其暴露于高疏水表面时容易发生变性，这限制了疏水作用层析法(HIC)的有效性。更进一步地，尽管IgM在HIC中在合理的低盐度下能够以轮廓分明的出峰从中度疏水底物中洗脱，对中度疏水介质优选较高盐度以支持高容量，然而IgM会在较高盐度下发生沉淀。由于IgM通常电荷量比IgG更大，IgM与离子交换体的连结强度比IgG更大，且比大多数污染物的连结强度大得多。IgM的大尺寸对纯化是一种挑战，由于扩散系数小，对质量输运依赖于扩散作用的颗粒结构的多孔离子交换介质而言所述大尺寸会成为一个问题。
[0004] 尽管IgM的一些性质会限制其在标准纯化工具中的应用，IgM单克隆的电荷性质也提供了对IgG很少或从未遇到过的纯化机会。这些电荷性质允许开发出纯化正交工艺，该工艺仅需几个步骤，无需对产品施加不必要的应力。事实上，临床级的IgM纯化通常可通过三个在羟磷灰石、阴离子交换和阳离子交换上的连结-洗脱层析步骤实现。IgM纯化中的大部分进步来自使用单片结构的离子交换体，所述单片结构的离子交换体具有高连结容量并能承受快速流速。更进一步地，单片的膜状离子交换体在质量传输上依赖于对流而非扩散，由于对流与尺寸和流速无关，容量和溶解不受到IgM的大尺寸的影响。省略亲和步骤对开发有效、经济的纯化工艺也是一个积极的贡献。通过采用在线稀释加载样本，避免中间透析，也可提高工艺经济性。在每一个步骤中，回收率与IgG纯化中达到的回收率相当。(Gagnon等人，Purification of IgM Monoclonal antibodies，BioPharm International Supplements，March 2008，pages 26-35(March2，2008)；Gagnon等人，IgM Purification：
The Next Generation，13thAnnual Waterside Conference，Miami，February 4-6，2008，available atwww.validated.com as Document No.PSG-080129)
The Next Generation，13thAnnual Waterside Conference，Miami，February 4-6，2008，available atwww.validated.com as Document No.PSG-080129)
[0005] 去除聚集物
[0006] 许多蛋白质，包括例如IgG和IgM的抗体，能够形成聚集物，所述聚集物必须在纯化过程中去除，为了提供具有所需纯度和产品安全性(对医疗用蛋白质而言)的蛋白质产品。尽管去除聚集物是产品安全性的关键决定因素，其可能增加产品加工难度、增加纯化成本，并限制了对最终纯化(“精细纯化”)方式的选择。例如，尺寸排阻层析(SEC)去除聚集物并允许缓冲液更换，但是SEC也存在过程慢、容量低、需要不成比例地大的柱床(需要极高的填充技术)且需要大量的缓冲剂。吸附方法在去除聚集物的有效性上存在限制，它们的选择性并不直接与蛋白质的尺寸相关，相比非聚集态的蛋白质，聚集物被保留的趋势要强得多(可能是由于其参与了大量的与吸附固体物质之间的相互作用)，而超乎预料的分离度是由于克隆之间以及产品的聚合与非聚合状态之间的电荷分布的差异。
[0007] 非离子的聚合物和蛋白质(常用作抗体沉淀剂)可添加入缓冲剂中，使效果与蛋白质尺寸成正比。可选择非离子的聚合物和蛋白质作为添加剂(该添加剂可与吸附方法相容)，强化吸附方法将聚集物从非聚集态的抗体中分离的能力，并满足生产可注射到人体的产品的常规要求。例如，非离子的聚乙二醇(PEG)被理解为是无毒的，可用于USP等级，具有蛋白稳定的特性，且价格不高。由于PEG优先从蛋白表面分离出来，因此在所述蛋白质周围形成了一层纯水水合层，所述纯水水合层与具有高浓度PEG的主体溶剂之间的非连续性在热动力学上是不利的。当蛋白质与PEG溶液发生接触时，它们彼此共享一些水合水，因而将一些水释放回主体溶剂中，且相比单独的蛋白质之间的连接面积，它们具有较小的连接面。由于蛋白质表面积与蛋白质尺寸成正比，非离子有机聚合物的作用大小与蛋白质尺寸成正比，因而通过选择聚合物长度和浓度能够强化尺寸选择性。例如，沉淀IgM的PEG-6000的百分比含量范围比沉淀IgM的PEG-6000的百分比含量范围要低。
[0008] 通过开发PEG在不同的层析分离中的效果，PEG所影响的尺寸选择性能够应用于其它应用场合。当PEG在离子交换环境中被用作缓冲添加剂的一部分，通过离子交换可将较小的非聚集态的蛋白质从较大的聚集物中分离出来。聚集物分离也可在使用包含PEG的缓冲剂的羟磷灰石上进行，因而通过羟磷灰石层析去除聚集物。由于PEG对其他杂质的效果是可以预期的，在产品纯化过程中，能够考虑这些效果以达到理想的纯化效果。例如由于宿主细胞蛋白(HCP)通常比IgG小，PEG应当将其柱保留能力增强到一个较小的程度，同时由于DNA、内毒素和病毒通常比IgG大，PEG应当将其保留能力增强到一个较大的程度，这样才能更好地将污染物从产品中分离。因而，PEG能够被用于显著强化聚集物去除效率，并且如果需要的话，强化其他污染物的去除，特别包括病毒颗粒(Gagnon等人，″Nonionic Polymer Enhancement of Aggregate Removal in IonExchange and Hydroxyapatite Chromatography″presented at 12thAnnual Waterside Conference，San Juan，Puerto Rico，April 23-25，2007，可从www.validated.com获得，文件号PSG-070430)。发明内容
[0009] 本发明在某些实施方式中提供了从含有蛋白质产品和蛋白质产品聚集物的样本中纯化蛋白质产品的工艺，所述工艺包括以下步骤：(i)第一层析步骤，包括使用非离子聚合物去除所述蛋白质产品的聚集物，其中所述非离子聚合物的浓度在层析条件下足以强化所述蛋白质产品从所述蛋白质产品聚集物中的分离，由此在本步骤后收集组分，所述组分包括基本不含聚集物的所述蛋白质产品；(ii)合并强化溶解的添加剂和第一层析步骤中获得的所述包括蛋白质产品的组分或者包括随后获得的蛋白质产品的组分，该随后获得的组分来自所述第一层析步骤中获得的所述包括蛋白质产品的组分，其中所述强化溶解的添加剂从由两性离子、尿素化合物和亚烷基二醇组成的群中选择；和(iii)第二层析步骤，包括使用离子交换层析(或者，当所述第一层析步骤为离子交换层析时，羟磷灰石层析)其中所述强化溶解的添加剂的浓度足以在所述层析条件下强化所述蛋白质产品的溶解度并且基本避免闭塞，其中所述强化溶剂的添加剂不干扰所述第二层析步骤，且其中所述工艺产生基本不含有聚集物的纯化蛋白质产品。附图说明
[0011] 图2所示为实施例3中所描述的使用阴离子交换层析对LM1进行中间纯化的参考曲线，其中连续测量蛋白总量(A280，A300)、浊度(A600)、导电率和pH值。
[0012] 图3所示为实施例3中所描述的使用阴离子交换层析对LM1进行中间纯化的过程中的LM1洗脱峰的高解析度参考曲线，其中连续测量蛋白总量(A280，A300)、浊度(A600)、导电率和pH值。
[0013] 图4所示为实施例3中所描述的使用阳离子交换层析对LM1进行精细(最终)纯化的过程中的参考曲线，其中连续测量蛋白总量(A280，A300)、浊度(A600)、导电率和pH值。
[0014] 图5所示为实施例3中所描述的使用阳离子交换层析对LM1进行精细纯化的过程中的LM1洗脱峰的高解析度参考曲线，其中连续测量蛋白总量(A280，A300)、浊度(A600)、导电率和pH值。
[0015] 图6所示为对精细纯化后的纯化LM1采用HPSEC进行分析尺寸排阻层析的参考曲线，其中连续测量蛋白总量(A280，A300)、浊度(A600)、导电率和pH值。
具体实施方式
[0016] 本公开在某些实施方式中提供了在纯化工艺中的蛋白质产品纯化的方法和混合物，所述纯化工艺包括在第一层析分离步骤中使用非离子聚合物强化去除聚集物，接着进行离子交换层析步骤，其中使用某些强化溶解的添加剂，所述强化溶解的添加剂的使用浓度足够高以强化所述蛋白质产品的溶解，并在第二层析步骤(包括离子交换层析)中原本易于发生闭塞的操作条件下阻止闭塞的发生。这里使用的参考层析步骤的第一和第二的说法是关于其相对顺序而言的，并不排除所述第一步骤之前或所述第一和第二步骤之间的层析步骤。
[0017] 本公开在某些实施方式中提供了从混合物中纯化获得蛋白质产品的多步骤工艺的方法和混合物，包括第一层析步骤，所述第一层析步骤包括使用非离子聚合物；和第二层析步骤，所述第二层析步骤包括离子交换层析，其中，不根据本发明使用强化溶解的添加剂，所述蛋白质产品会形成聚集物或者在离子交换中纯化操作条件下促进发生闭塞。其中在某些实施方式中，所述工艺包括在使用强化溶解的添加剂之前，在至少一个步骤中使用非离子聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，以强化从所述混合物中去除聚集物。
[0018] 在第一层析步骤的下游位置，所述强化溶解的添加剂与含有所述蛋白质产品的组分合并，所述第一层析步骤包括使用非离子聚合物，例如聚乙二醇，以促进从所述蛋白质产品的聚集物中分离所述蛋白质产品。在某些实施方式中，由所述第一层析步骤收集到的所述包括所述蛋白质产品的组分被收集形成含有强化溶解的添加剂的混合物。在进一步的实施方式中，在所述第一层析步骤后收集到的所述含有所述蛋白质产品的组分进行进一步的分离和纯化步骤，由此所获得的组分随后与强化溶解的添加剂合并。
[0019] 在某些实施方式中的强化溶解的添加剂是两性离子，所述两性离子促进所述蛋白质产品的溶解，但具有足够低的导电性因而不干扰离子交换层析的操作。在某些实施方式中，所述工艺包括使用两性离子(例如甘氨酸)，所述两性离子的浓度足够在原本容易发生聚集或闭塞的操作条件下强化所述蛋白质产品的溶解并阻止闭塞的发生，其中含有两性离子的混合物适用于至少一个离子交换步骤中，并且所述工艺产生基本不含聚集物的高纯度蛋白质产品。
[0020] 在一个示例中，提供了用于从混合物中(例如，从细胞培养上清液中)纯化IgM的多步骤工艺的非限定的实施方式、方法和混合物，其中所述工艺包括在至少一个步骤中使用含有PEG的缓冲剂，以去除至少部分IgM聚集物并提供富集IgM(IgM单体)的样本，所述工艺进一步包括使用低导电性的含有两性离子的混合物，其中所述两性离子的浓度足够在原本容易在下游的离子交换步骤产生聚集物或闭塞的操作条件下强化IgM的溶解并阻止IgM聚集物的生成，所述工艺包括至少一个离子交换步骤，其中所述工艺产生基本不含聚集物的高纯度IgM产品。
[0021] 如本文所述，使用含有两性离子的混合物强化蛋白质溶解并防止生成聚集物或在某些纯化工艺步骤中发生闭塞，还提供了能够直接与离子交换介质相容的低导电性的样品缓冲剂，相比使用高盐度的缓冲剂强化蛋白质溶解并防止生成聚集物，其中高盐度缓冲剂不可直接与离子交换介质相容。进一步如本文所述，强化去除聚集物的含有非离子聚合物的缓冲剂可直接添加到含有两性离子的混合物中，以强化蛋白质溶解并基本上避免生成聚集物，由此避免可能影响纯化蛋白质产品的生成和质量的进一步的操作，例如去盐、去除聚合物或缓冲剂交换。这些方法和混合物使不同的正交纯化步骤之间具有相容性。
[0022] 在一个非限定的示例实施方式中，本发明提供了用于从细胞培养上清液中纯化IgM的多步骤工艺，其中，所述工艺包括在至少一个步骤中使用PEG，其使用方式强化IgM单体从IgM聚集物中的分离，并实现至少去除部分IgM聚集物，所述工艺进一步包括在后续步骤中使用低导电性的含有两性离子的混合物，其中所述两性离子的浓度足以在原本易于生成聚集物的条件下强化IgM的溶解并阻止IgM聚集物的生成。所述工艺进一步包括离子交换纯化步骤，其中所述含有两性离子的混合物不干扰该离子交换步骤。在一个实施方式中，使用甘氨酸作为两性离子，其浓度足以强化IgM的溶解，并在原本在离子交换层析中易于产生聚集物或发生闭塞的条件下防止生成IgM聚集物或发生闭塞。进一步地，在许多实际应用中，为了保持强化的溶解性和减少聚集物生成的危险，一旦开始所述纯化工艺，应当注意保证不间断地完成所述纯化工艺。
[0023] 在某些实施方式中，强化溶解的添加剂为两性离子、尿素、尿素衍生物(例如烷基脲(甲脲，乙脲等))或亚烷基二醇(例如乙二醇或丙二醇)。尽管本发明的不同种类的强化溶解的添加剂的机理被理解为是不同的，上述所有添加剂均在离子交换层析步骤中强化纯化蛋白质产品，所述离子交换层析步骤包括含有所述蛋白质产品的组分和非离子聚合物(例如聚乙二醇)，所述非离子聚合物由于被用于在先的层析步骤中，存在于含有所述蛋白质产品的组分内。在某些实施方式中，当所述强化溶解的添加剂为尿素，所述尿素可能的浓度可高达6摩尔，但优选低于2摩尔的浓度。在某些实施方式中，当所述强化溶解的添加剂为乙二醇时，所述乙二醇的浓度可高达50％，但优选低于20％的浓度。由于过高的乙二醇或尿素的浓度可破坏一些IgM抗体，在一些实施方式中，所述强化溶解的添加剂的浓度被调整到接近在第二层析步骤中阻止闭塞发生所需的最低浓度。
[0024] 含有两性离子的混合物
[0026] 甘氨酸(Gly；G)是可电离的氨基基团和可电离的羧酸基团组成的小氨基酸。在中性或近中性的在水溶液中，甘氨酸主要以两性离子的形式存在。甘氨酸的等电位点或等电位pH值位于所述甘氨酸分子所在的环境中的所述氨基基团和所述羧酸基团的pKa值的中间值。每摩尔甘氨酸被理解为可增加介电常数约18，甘氨酸被理解为应当充分强化溶剂的电极性，反过来应当强化带电分子(例如蛋白质)的溶解能力。水的介电常数约80，但对于大多数现存系统，水的介电常数约100。1.0M的甘氨酸介电常数约100。甘氨酸适合作为本文中的方法和混合物的两性离子。不希望受限于本理论，确定甘氨酸适用于本方法和混合物的除了其他原因之外的特别原因是在本文所提供的方法和混合物中的pH值范围内为两性离子，因此甘氨酸不会对溶液的导电性产生贡献，因而不会影响接下来的离子交换步骤。由于在本发明提供的方法和混合物的pH值范围内，甘氨酸的缓冲能力低到零，因此甘氨酸被理解为不会明显影响缓冲配置液。通过观察，甘氨酸通过离子交换相互作用对蛋白质的影响为零或几乎测量不到，且通过观察甘氨酸没有对实施本文提供的纯化工艺产生任何不需要的作用。
[0027] 其他适用的两性离子包括，但不限于，含有酸基团和碱基团(电解的)的两性电解质，所述两性电解质在其介电点以两性离子的形式存在；“Good’s”缓冲剂，例如基于氨基磺酸的缓冲液MES，MOPS，HEPES，PIPES和CAPS缓冲剂；氨基酸(氨基羧酸)缓冲液，例如甘氨酸、甘氨酸衍生物(二(羟乙基)甘氨酸，三(羟甲基)甘氨酸)和丙胺酸；可用作去污剂的缓冲剂，例如CHAPSO；以及天然产品，包括某些生物碱和甜菜碱。
[0028] 贯穿在本发明说明书中的“含有两性离子的混合物”这一说法包含含有两性离子的缓冲溶液和非缓冲溶液，所述两性离子的浓度足以在原本易于产生聚集物的条件下强化蛋白质溶解性并阻止聚集物生成。这里提供的含有两性离子的混合物的概念，可根据所述混合物的预计用途发生变化，本领域的技术人员能够确定用于特定用途的含有两性离子的混合物的合适的含义。在下面的实施例所描述的非限定的示例实施方式中，一些含有两性离子的混合物是非缓冲的，例如在pH值约7(+/-0.2)的水中的1.0M甘氨酸(非缓冲)，在其他示例实施方式中，含有两性离子的混合物包括缓冲剂和其他成分，例如pH值8.0的50mM Tris、1M甘氨酸、2mM EDTA或pH值6.2的50mM MES、1.0M甘氨酸或者缓冲液B：pH值6.2的20mM柠檬酸盐、1.0M甘氨酸。如示例实施方式所示，含有两性离子的混合物含有为实现其预期功能的充足的两性离子，例如1.0M甘氨酸，可进一步包括两性离子缓冲剂，例如MES，或非两性离子缓冲剂例如Tris。
[0029] 本发明提供的含有两性离子的混合物含有的两性离子的浓度足够满足特定用途，这些混合物被理解为可包含浓度超过特定用途所需的最小浓度的两性离子。作为预防措施，若不引起不必要的效果的话，含有两性离子的混合物可含有相比特定用途最低要求较高的两性离子等级。本领域技术人员可以针对特定用途或其他相似物确定合适的两性离子等级，可以确定增加或降低两性离子等级的效果。
[0030] 需要进一步理解的是，按照本发明提供的方法使用含有两性离子的混合物，可减少在原本易于产生聚集物和发生闭塞的离子交换工艺条件下的产生聚集物或发生闭塞的危险，但并不能完全排除这样的聚集或闭塞的可能。由此，为了尽可能减少暴露于易于发生聚合的环境中，不中断地完成所述工艺是有利的。
[0031] 纯化工艺
[0032] 本公开提供了多步骤纯化工艺的方法和混合物，所述多步骤纯化工艺包括，但不限于，提供样品捕捉、去除聚集物和多级纯化的步骤，其中当操作条件可易于进行纯化的蛋白质发生聚合时，使用含有混合物的强化溶解的添加剂。
[0033] 特别的，本公开提供了多步骤纯化工艺的方法和混合物，所述多步骤纯化工艺在应用于抗体(例如IgM或IgA)纯化时具有优势。尽管，可以理解，本领域的技术人员可操作本公开所提供的方法和混合物以纯化任何蛋白质，在下面提供的非限定性的描述中将注意力集中在使用本方法和混合物纯化抗体。进一步地，尽管，可以理解，本领域的技术人员可操作本公开所提供的方法和混合物以纯化任何抗体，在下面提供的非限定性的描述和实施例中提供的示例实施方式中，特别集中于使用本方法和混合物纯化IgM。使用本方法和混合物纯化IgM的下文非限定的描述和实施例中，提供了充足的指导和工作实施例使本领域的技术人员能够对其他蛋白质的纯化实施本发明。
[0034] 本公开提供了蛋白质纯化的多步骤工艺的方法和混合物，其中用于实施步骤的材料、试剂和条件可由本领域技术人员根据特定实施的条件和环境进行选择。类似的，本公开提供了蛋白质纯化的多步骤工艺的方法和混合物，其中所述步骤可按照任意的顺序实施。
[0035] 根据一个方面，提供了去除聚集物，其中在含有非离子聚合物(例如PEG)的缓冲液中的含有所述蛋白质产品的溶液，被加载到不通过尺寸排阻起作用的层析介质上，例如羟磷灰石或离子交换介质，由此蛋白质产品(单体)能够被从至少一些聚集物中分离，并收集到富集所述蛋白质产品且基本不含聚集物的样本。本领域技术人员能够确定使用不同层析介质和条件下含有PEG的缓冲剂的理想用量。不希望受到本公开的限制，在羟磷灰石层析过程中，尤其是使用陶瓷羟磷灰石时，使用含有PEG的缓冲剂去除聚集物的方法被发现是可靠和容易实现的，同时在阴离子交换层析或阳离子交换层析过程中，使用含有PEG的缓冲剂去除聚集物的方法有时候是有问题的，更进一步地，含有PEG的缓冲液中从阴离子交换介质或阳离子交换介质中洗脱的样本有时候会开始形成新的聚集物，所述新的聚集物需要额外的处理(如高盐度和/或甘氨酸)使其再次悬浮。
[0036] 根据另一方面，当操作条件易于发生聚合时，含有蛋白质产品的溶液也含有两性离子，所述两性离子的浓度足以在易于发生聚合的操作条件(例如冷却、低pH值或低导电性)下强化所述蛋白质产品的溶解并阻止生成聚集物。在一种实施方式中，含有所述蛋白质产品的溶液被导入含有两性离子的环境，例如所述溶液被收集在含有两性离子的混合物中，所述混合物具有足够高的两性离子浓度，使所述含有所述蛋白质产品的溶液被稀释后，保持所述两性离子的有效性。特别地，含有甘氨酸的混合物适用于操作条件易于产生聚集物的情况。本领域的技术人员能够理解甘氨酸能够通过强化含有甘氨酸的溶液的溶剂极性，强化蛋白质溶解，因而增加所述溶剂溶解带电分子(例如蛋白质)的容量。以示例方式，多克隆的IgM溶液在PBS中10mg/ml时是浑浊的，在1M甘氨酸中100mg/ml时是如水般清澈的。本领域的技术人员能够理解由于甘氨酸在该纯化工艺的pH值范围内是两性离子，不会对导电性有所贡献，因而不会干扰后续的离子交换步骤。类似的，由于在本方法和混合物的pH值范围内甘氨酸的缓冲容量为零，甘氨酸不会显著干扰缓冲剂配液。最后，需要理解的是，由于离子交换基团必须与所述溶剂竞争，因此通过离子交换的蛋白质相互作用在高介电常数下相对略弱，尽管如此，据观察在不同的示例实施方式中，介电常数约100的甘氨酸对通过离子交换对蛋白质相互作用的影响效果几乎无法测得，由此据观察甘氨酸对本纯化工艺不具有实际影响效果。如本发明所述，甘氨酸可用作强化溶解的添加剂，其浓度范围在约50mM到约5M之间，或者在约100mM到约4M之间，或者在约250mM到约3M之间，或者在约500mM到约2M之间，或者在约750mM到约1M之间。甘氨酸可用于溶液中，约50mM，或者约100mM，或者约250mM，或者约500mM，或者约750mM，或者约1M，或者约1.1M，或者约1.2M，或者约1.3M，或者约1.4M，或者约1.5M，或者约1.6M，或者约1.7M，或者约1.8M，或者约1.9M，或者约2M。需要理解的是，作为预防手段，甘氨酸的使用浓度可高于达到所需效果必须的浓度，如为了强化蛋白质溶解和/或避免生成聚集物，其中本领域技术人员能够确定在特定实施中所能够容忍的甘氨酸浓度。
[0037] 如本发明所述的蛋白质产品纯化产生基本不含聚集物的纯化的蛋白质产品。本发明所提供的基本不含聚集物的纯化的蛋白质样本的所述聚集物含量能够少于约5％，可预期少于约1％，或者少于约0.5％，或者少于约0.1％，可能小于用于测量聚集物容量的方法的检测下限。特别地，基本不含聚集物的纯化的IgM样本的所述聚集物含量能够少于约5％，可预期少于约1％，或者少于约0.5％，或者少于约0.1％，可能小于用于测量聚集物容量的方法的检测下限。
[0038] 本发明提供的蛋白质产品的纯化，对产品的分离和回收能够通过使用线性梯度、阶梯梯度或线性与阶梯梯度的组合实现。根据一个方面，线性梯度可用于将所述蛋白质产品从聚集物和/或其他污染物(例如HCP)中更好地分离。根据一个方面，阶梯梯度可用于减少洗脱产品的体积。为达到相同终点，选择线性和/或阶梯梯度，需要理解的是，每种选择都会产生选择性的微小变化，所述选择性会影响纯度和聚集物含量。阶梯和/或线性梯度的选择需要理解的是，步骤间隔的设定点在一定程度上决定于柱负荷，其中柱负荷达到95％的饱和容量的设定点显著低于负荷50％的柱设定点。针对特定实施方式，可利用本领域技术人员所知的因素和方法选择和使用梯度。
[0039] 初步纯化
[0040] 执行第一步骤完成初步纯化，产生富集所述蛋白质产品的组分。当初步纯化包括获取样品，初步纯化后收集的所述富集组分应当相比初始材料具有更高的蛋白质产品浓度。当初步纯化不包括获取样本，所述富集组分的蛋白质产品浓度可能不明显较大，但尽管如此，由于从所述初始材料中分离了至少部分污染物，依然会是富集的(例如，当所述初始材料通过介质，所述介质结合某些污染物但不结合所述蛋白质产品时)。当初步纯化包括去除聚集物时，所述富集组分可预期为基本不含聚集物。当初步纯化不包括去除聚集物时，会在另一个纯化步骤中去除聚集物。在一个实施方式中，第一步骤完成了获取样本、去除聚集物和初步纯化，产生高度富集蛋白质产品且基本不含聚集物的组分，其中蛋白质产品的浓度比所述初始材料中的浓度高。在另一个实施方式中，第一步骤完成了获取样本和初步纯化，但不包括去除聚集物，产生具有比初始材料中高的蛋白质产品浓度的组分，其中由于将所述蛋白质产品从至少一些污染物中分离出来，所述组分富集蛋白质产品，并且所述组分含有在所述第一步骤之前和/或之中形成的聚集物。可选地，如果预期中所述工序条件易于产生聚集物，初步纯化可使用含有两性离子的混合物实现。
[0041] 中间纯化
[0042] 执行另一步骤完成中间纯化，产生相比在初步纯化后收集到的组分具有更高所述蛋白质产品富集度的蛋白质产品组分。若初步纯化不包括样本获取，那么可以在中间纯化过程中执行样本获取以增加蛋白质产品的浓度。若初步纯化不包括去除聚集物，那么可以在中间纯化过程中执行去除聚集物。在一个实施方式中，在包括样本获取和去除聚集物的初步纯化之后，具有更高浓度和基本不含聚集物的蛋白质产品通过离子交换进一步纯化，例如阴离子交换或阳离子交换，产生具有更高纯度的浓缩的基本不含聚集物的蛋白质产品组分。在另一个实施方式中，在包括样本获取的初步纯化之后，浓缩的蛋白质产品组分通过包括去除聚集物的中间纯化进一步纯化，产生具有更高纯度的浓缩的基本不含聚集物的蛋白质产品组分。在另一个实施方式中，在将所述蛋白质产品从某些污染物中分离的初步纯化之后，所述蛋白质组分被进一步纯化，包括样本获取和去除聚合无，产生具有更高纯度的浓缩的基本不含聚集物的蛋白质产品组分。中间纯化的执行中可使用含有两性离子的混合物，也可不使用，需要理解的是，若所述操作条件易于产生聚集物，会使用含有两性离子的混合物执行中间纯化。
[0043] 最终、精细纯化
[0044] 执行进一步的步骤完成所述蛋白质产品的最终(或称“精细”)纯化。在该步骤后收集的所述蛋白质产品组分预期具有超过99％的纯度，其污染物或聚集物浓度在可测范围以下。精细纯化的执行中可使用含有两性离子的混合物或其他强化溶解的添加剂，也可不使用，需要理解的是，若所述操作条件易于产生聚集物，会使用含有两性离子的混合物执行精细纯化。可采用任何合适的方法执行精细纯化，包括但不限于，羟磷灰石层析或离子交换层析。
[0045] 附加步骤
[0046] 本发明所提供的纯化工艺可包括附加步骤，包括但不限于，过滤、病毒灭活(例如通过溶剂/去污剂混合物(S/D)方法)或去除污染物的附加步骤。尽管所述工艺可包括可选的过滤、去盐、二次过滤或缓冲交换步骤，可预期本发明所提供的方法和混合物能够减少或消除许多这样的步骤。在所述工艺过程中的任何时间可进行分析测量，例如评价在多个阶段收集到的样品的样品纯度和聚集物含量，以确定不同工艺参数的效果。在精细纯化后收集到的IgM组分的纯度可通过多种分析测量方法，例如分析SEC(例如实施例4中的HPSEC)、电泳测量(例如变形或非变形的胶电泳、IEF、一维或二维电泳等)、肽指纹图谱(气相层析-质谱联用(GC-MS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Maldi-TOF)等)，进行评价。根据一个方面，在精细纯化后对所述蛋白质产品组分执行分析SEC(例如HPSEC)以确认所述蛋白质产品具有超过99％的纯度且不含可测得的污染物。
[0047] 工艺步骤的顺序
[0048] 本发明所提供的工艺步骤的顺序可依照任何次序排列，只要预先注意使用非离子的聚合物实现去除聚集物，并按需要使用强化溶解的添加剂(例如含有两性离子的混合物)保持强化的溶解性并在不同层析模式之间提供相容性。在下面的实施例中所描述的示例实施方式中，所述第一纯化步骤涉及样本获取、去除聚集物和初步纯化，所述初步纯化使用PEG(以分离并去除聚集物)通过陶瓷羟磷灰石(CHT)执行，其中来自CHT的组分被收集到含有两性离子的混合物中，所述含有两性离子的混合物能够与下一步的中间纯化的阴离子交换介质相容，并与随后的精细纯化步骤地阳离子交换介质相容。根据本发明的纯化可采用不同的步骤顺序执行。在另一个实施方式中，所述第一步骤涉及样本获取和阳离子交换的初步纯化，随后进行中间纯化和通过CHT去除聚集物(使用PEG)，然后进行通过阴离子交换的精细纯化的最终步骤。在另一个实施方式中，所述第一步骤涉及获取样本和阴离子交换的初步纯化，随后进行中间纯化和通过CHT去除聚集物(使用PEG)，然后进行通过阳离子交换的精细纯化的最终步骤。在另一个实施方式中，所述第一步骤涉及获取样本和阳离子交换的初步纯化，随后进行阴离子交换的中间纯化，随后通过CHT去除聚集物并进行精细纯化的最终步骤。在另一个实施方式中，所述第一步骤涉及获取样本和阴离子交换的初步纯化，随后进行阳离子交换的中间纯化，随后通过CHT去除聚集物并进行精细纯化的最终步骤。
[0049] 在某些实施方式中，所述第一层析步骤包括阳离子交换层析，所述阳离子交换层析包括聚乙二醇，所述聚乙二醇的含量足够去除聚集物；所述第二层析步骤包括羟磷灰石层析或阴离子交换层析。在某些其他实施方式中，所述第一层析步骤包括阴离子交换层析，所述阴离子交换层析包括聚乙二醇，所述聚乙二醇的含量足够去除聚集物；所述第二层析步骤包括羟磷灰石层析或阳离子交换层析。
[0050] IgM抗体纯化
[0051] 本公开提供了在IgM纯化的应用上具有优势的特定方法和混合物。IgM的某些特性使通过少数步骤实现IgM的显著纯化的正交纯化程序的开发和使用成为可能，由此去除了可能导致回收IgM的产量和/或纯度下降的不必要的步骤。例如，大多数IgM(包括单克隆IgM)具有高电荷，因而通过离子交换方法保留的强度足够高以实现中等pH值下的高结合容量。另外，在生理pH值和导电性条件下IgM与羟磷灰石的结合强度大，使IgM纯化中优选使用羟磷灰石。
[0052] 由此，利用IgM可能利于纯化的某些特性提供了方法和混合物，并减少或避免了在纯化过程中由于IgM的某些特性可能引起的问题。例如，IgM纯化会与IgG纯化会有所不同，是由于IgM的可溶解范围比IgG窄、IgM相比IgG更易于发生变性、当暴露于疏水表面(例如在疏水作用层析中)时IgM常发生变性、且IgM对极端pH值敏感、并在惯常用于IgG的阴离子交换或吸引力纯化的条件下容易发生沉淀，其中低导电性的溶液会调整IgM的所述pH值敏感性。由此，在某些实施方式中，通过使用强化溶解的添加剂，在离子交换层析过程中的抑制闭塞。
[0053] 本方法和混合物提供了IgM纯化工艺，所述IgM纯化工艺包括使用含有PEG的溶液以强化从复杂混合物(例如细胞培养上清液)中去除IgM聚集物，并进一步包括在例子交换层析中使用含有两性离子的混合物(例如含有约1.0M的甘氨酸)，以强化IgM的溶解性并增强IgM在原本易于产生聚集物的环境下的稳定性，以达到在所述IgM纯化工艺中避免或至少减少新聚集物生成的目的。
[0054] 本方法和混合物的非限定的示例实施方式出现在下面的实施例中。在实施例中，采用本文提供的工艺纯化三种不同的单克隆IgMs(SAM6、CM1和LM1)。在如下所述的实施方式中，实行下面的纯化步骤：(I)样本获取并使用含有PEG的缓冲剂通过羟磷灰石层析进行初步纯化；(II)使用含有两性粒子的混合物通过阴离子交换层析进行中间纯化；以及(III)使用含有两性粒子的混合物通过阳离子交换层析进行精细纯化，以产生基本不含聚集物的高纯度IgM。这里给出的纯化步骤的顺序可依照任何顺序，只要所述工艺的执行方式能够完成聚集物的去除，并使用含有两性离子的混合物保持强化的IgM溶解性并避免IgM聚集物。根据这里给出的另一个方面，纯化步骤的顺序的执行方式，可在不同的步骤中提供在不同的层析模式之间具有相容性的缓冲剂。
[0055] 从细胞培养液中对IgM进行初步纯化
[0056] 在下面的实施例中出现的示例实施方式中，使用含有PEG的缓冲剂的羟磷灰石层析被用于获取样本、去除聚集物，初步纯化步骤产生高度富集IgM且基本不含聚集物的组分，其中含有IgM的组分随后被引到进入含有两性离子的混合物中。在使用PEG的情况下，IgM(单体)和IgM聚集物结合到羟磷灰石，但是由于PEG作为缓冲添加剂的尺寸选择作用，IgM(单体)和IgM聚集物具有不同的洗脱曲线。陶瓷羟磷灰石(CHT)适合该步骤。
[0057] 需要理解的是，为了从该步骤达到理想的纯化效果，在加载样本后进行大量的冲洗是很重要的。在加载样本并大量冲洗所述柱(介质)之后，通过增加盐浓度到预设程度，以线性梯度或以阶梯梯度洗脱所述样本，随后所述柱被保持在该盐浓度之下直到洗脱所述抗体峰。通过实施例的方法，从CHT中洗脱IgM可采用在5柱体积(CV)上添加125mM到350mM的线性梯度的磷酸钠(实施例1，25％到70％的缓冲剂B)，或者在5柱体积(CV)上添加165mM到365mM的线性梯度的磷酸钠(实施例2，33％到73％的缓冲剂B)，或者在5柱体积(CV)上添加100mM到325mM的线性梯度的磷酸钠(实施例2，20％到65％的缓冲剂B)。
所有的缓冲剂pH值为7.0并含有10％的PEG-600。
所有的缓冲剂pH值为7.0并含有10％的PEG-600。
[0058] 在从羟磷灰石洗脱的过程中，可根据方案收集来自IgM洗脱峰中点的组分以增强样本纯度，所述方案有望排除在所述洗脱峰前端的早洗脱污染物，更重要的是，有望排除在所述IgM洗脱峰的尾端比IgM更早洗脱的聚集物。如下文所述，所述IgM洗脱峰可直接收集到含有两性离子的混合物中，例如1M甘氨酸。由于聚集物的出现可导致混浊，所述“如水般清澈”的IgM洗脱峰显示出基本不含聚集物，且所述IgM组分在被收集到1M甘氨酸中之后依然保持清澈。所述线形梯度部分可被转化为阶梯梯度以减少洗脱产品的体积。
[0059] 在初步纯化步骤后的样本纯度(例如，聚集起来的IgM洗脱峰组分中的IgM含量，以总蛋白质的百分比表示)可以超过约50％，或者超过约60％，或者超过约70％，或者超过约80％，或者超过约85％，或者超过约90％，或者超过约95％。本领域技术人员能够为了特定的用途在该步骤后测量所述样本纯度，并且如果需要的话，改变工艺条件以改进样本纯度。在下面的示例实施方式中，在CHT后的SAM6样本纯度超过90％，可能超过95％(实施例1)，在CHT后的LM1样本纯度高达90％。在下面的实施例2中的示例实施方式中，在CHT后的CM1样本纯度仅为约50％，但考虑到在下面的阴离子交换步骤中污染物很容易去除污染物，这也认为是可以接受的。
[0060] 当初步纯化步骤为使用含有PEG的缓冲剂的羟磷灰石层析时，该步骤提供了主要的聚集物去除步骤。蛋白质样本中的所述聚集物的含量(以分析尺寸排阻层析法测得，以总蛋白质的百分比表示)少于约5％，且预期为少于1％。尤其地，IgM样本的所述聚集物含量少于约5％，且预期为少于1％。若所述聚集物含量超过1％，本领域技术人员可改变洗脱条件以实现更好地从聚集物中洗脱IgM，例如通过降低从羟磷灰石中洗脱的最终盐浓度。在某些实施方式中，聚集物的存在使用G4000SWXL上的分析尺寸排阻层析是无法测得的，其中检测下限约为0.1％，因此无可测得的聚集物通常是指聚集物含量少于0.1％。当分析后续纯化步骤获得的IgM组分时，聚集物全部或绝大多数消失，也就是说在所述初始材料中发现的聚集物是在细胞培养中产生的。该结果与IgG的聚集物生成模式相一致。但是，在该步骤之后，在所述纯化工艺接下来的部分之中必须避免可能导致新的聚集物生成的条件。由此，在所述纯化工艺接下来的部分之中，将使用含有两性离子的混合物强化IgM溶解性并避免生成聚集物。
[0061] 本领域技术人员能够确认适用于本步骤的PEG聚合物种类和浓度。在下面描述的非限定实施方式中，可使用相同浓度的PEG-600和PEG-1000，两者可互换。PEG-1000的效果被发现较强，其引起所述抗体的洗脱较晚，并相似地强化聚集物的去除。对应调整冲洗和洗脱缓冲液的盐浓度，PEG能够被完全忽略，其可能会导致IgM较早洗脱。
[0062] 1M甘氨酸的两性离子浓度可能高于必须浓度，由此作为预防手段。尽管降低甘氨酸浓度浓度可能并不会危害所述IgM产品的产生和/或纯度，但为了预备和为了大规模的纯化，应当在降低甘氨酸浓度之前通过实验确认降低两性离子浓度的效果。
[0063] 如下文所指出的，可在本步骤中，当抗体结合到CHT上时或者从CHT上洗脱后，通过溶剂/去污剂混合物(S/D)方法执行病毒灭活。
[0064] II使用阴离子交换层析执行IgM的中间纯化
[0065] 在下面的实施例中出现的示例实施方式中，在中间纯化步骤，可通过使用含有两性离子的混合物的阴离子交换进一步纯化所述IgM样本。在示例实施方式中，由于采用在初步纯化中CHT上使用了含有PEG的缓冲剂实现了聚集物的去除，在接下来的纯化步骤中的溶液不含有PEG但它们含有两性离子(甘氨酸)，其浓度足够强化IgM的溶解性并避免生成聚集物。推荐CHT上的所述初步纯化之后，尽快采用阴离子交换层析执行IgM的中间纯化，例如CHT上的所述初步纯化之后24小时以内。
[0066] 在示例实施方式中，样本溶液(从CHT收集的IgM洗脱峰聚集起来收集到1M甘氨酸中)的pH值被调整到合适的高pH值(Tris50mM，pH8.0)并加载到阴离子交换介质上，例如季胺强阴离子交换体，例如 ( 对流交互介质，BIA Separations，Klagenfurt，奥地利)。其他可使用的阴离子交换介质，包括可能相比QA具有更大容量的弱阴离子交换体(例如DEAE或EDA)，尽管弱阴离子交换体的选择性和缓冲效果的差异可能需要调整(例如更大量的柱平衡剂)，以及尽管在洗脱过程中削弱对pH值的控制。如果可能的话，可使用单片结构的阴离子交换体，如下面的实施例中所示，尽管也可使用非单片结构的离子交换体，其中工艺系数例如流速会进行调整，且污染物去除、容量、特别是病毒去除可能有所下降，这些需要纳入考虑。尽管可按任何顺序执行步骤，当从所述第一步骤洗脱的样本具有高盐度(例如从CHT洗脱的IgM具有高盐度)时，将阴离子交换层析作为第二步骤是有利的，由此从CHT洗脱的具有高盐度的组分不会出现与阴离子交换的相容性问题，尤其是在样本加载过程中的实际稀释之后。
[0067] 含有IgM的样本能够通过在线稀释被加载到所述柱上，所述在线稀释避免IgM经历pH值、缓冲剂成分或盐浓度的突然变化，所述变化易于产生聚集物(变性)。在实施例中的示例实施方式中，通过一个泵供应的一份含有IgM的样本被在线稀释到通过另一个泵供应的两份加载缓冲剂中，造成总稀释量为10X从CHT柱洗脱的IgM组分的体积。可采用其他在线稀释或不同的样本加载技术引导用于中间纯化的样本。
[0068] 当样本被加载后，所述柱被大量冲洗，洗脱材料的一个小峰。采用线性体度或阶梯梯度将所述盐浓度增加到预定程度洗脱IgM，随后所述柱被保持在该盐浓度之下直到洗脱所述抗体峰。在实施例的示例实施方式中，洗脱SAM6的NaCl梯度为约200mM NaCl，0.5M甘氨酸(实施例1)和洗脱CM1的NaCl梯度为约225mM NaCl，0.5M甘氨酸(实施例2)，洗脱LM1的磷酸钠梯度为约250mM磷酸钠，0.5M甘氨酸。组分的收集从前端的10％最大峰高度开始到尾端的10％最大峰高度为止，所述收集的组分被汇集到一起。可以预料在所述尾端会洗脱一些剩余的聚集物。由于洗脱缓冲剂的低pH值(6.2)，推荐在该步骤之后聚集的含有IgM的组分搁置时间少于约24小时。阴离子交换能够在一个小时内完成，但为了方便起见可能放慢，需要理解的是减少流速即不会改善也不会降低柱的性能。若打算但尚未执行病毒过滤步骤，可在通过阴离子交换完成中间纯化之后选择执行病毒过滤。
[0069] 使用阳离子交换层析执行IgM的精细纯化
[0070] 经过中间纯化后汇集起来的组分随后进行最终或精细纯化。在实施例中出现的示例实施方式中，聚集起来的从使用阴离子交换的中间纯化中洗脱的含有IgM的组分进一步进行纯化，该纯化通过使用含有两性离子的混合物的阳离子交换层析进行。由于初始缓冲剂的导电性相对较低(盐浓度低)，使用含有两性离子的混合物(例如1M甘氨酸)对于保持蛋白质溶解度并在阳离子交换条件下避免聚集物的产生是很重要的。合适的介质包括硫酸强阳离子交换剂 (单片)，或其他不同形式的强/弱阳离子交换介质，可由实践本方法和混合物的本领域技术人员进行选择和使用。
[0071] 在加载样本后，所述柱被大量冲洗。缓冲剂更换与所述柱相容性问题可通过在线稀释(例如10X)解决，所述在线稀释为使用含有1M甘氨酸的阳离子交换柱平衡缓冲剂稀释所述IgM样本。
[0072] 按照线性梯度或按照阶梯梯度将提高所述盐浓度到预设程度，由此洗脱IgM，随后所述柱被保持在该盐浓度之下直到洗脱所述抗体峰。从所述前端的10％最大峰高度开始收集，直到尾端预设截止点为止，并将收集到的组分聚集在一起，由此回收到高纯度的IgM。如果在所述溶液中出现任何聚集物，可以预期任何剩余的聚集物会在所述IgM峰的所述尾端洗脱。在所述IgM峰的尾端的收集IgM组分的截止点可以位于40％最大峰高度，或30％最大峰高度，或25％最大峰高度，或20％最大峰高度，或15％最大峰高度，或10％最大峰高度。
[0073] 该步骤的回收效率相对所述柱上处理的可测得的IgM，可以超过约75％，或超过约80％，或超过约85％，或超过约90％，或超过约95％，在精细纯化后收集到的IgM组分的纯度可以通过各种分析测量方法(例如在实施例4中采用HPSEC)进行评估。精细纯化后的纯度可以超过约80％，或超过约90％，或超过约95％，或超过约99％。最终的IgM制备被认为是不含有可测得得聚集物(即，如果出现任何聚集物，其出现的量低于所述检测下限)。
[0074] 需要理解的是，当执行阳离子交换步骤时，阳离子交换将所述抗体暴露于易于产生聚集物的条件下(包括低pH值和低导电性)，因而在避免聚集物产生上，所述阳离子交换步骤可能是在整个工艺中最关键的步骤。尽管甘氨酸的高浓度对溶解性的最大化是非常重要的，需要进一步理解的是，甘氨酸或者其他适用的两性离子的高浓度降低聚集物的风险但无法将其完全消除。本发明所提供的方法和混合物提供了避免不需要的聚集物生成的附加方法。例如，应当避免阳离子交换中的中断，注意保证阳离子交换工艺一旦开始应当无中断地完成。
[0075] 除非另行定义，本发明所使用的技术和科学术语的含义与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义一致。除非另行定义，本发明中所使用的下列词汇的含义如下所述。
[0076] 本发明中的表示单个的词汇“某”、“一个”、“所述”，除非文中清楚指出，包括复数含义。由此，例如，“一化合物”包括多个化合物，“一残基”或“一氨基酸”包括一种或多种残基和氨基酸。
[0077] 本发明所引用的所有公开出版物、专利和专利申请，为各种目的被明确引用在此作为参考。
[0078] 实施例
[0079] 实施例1.SAM6纯化步骤
[0080] I.获取样本和采用羟磷灰石层析的初步纯化
[0081] SAM6 IgM从一升澄清的细胞培养上清液的初始材料开始纯化，其包含约200gIgM/ml细胞培养上清液。首先，细胞培养上清液采用0.22微米(0.22μm)的滤网进行过滤，随后以1％的体积比添加pH7.0的500mM磷酸钠，产生5mM的最终磷酸盐浓度。如果所述上清液已经含有磷酸盐，向所述过滤上清液中添加pH7.0的500mM磷酸钠的量为达到至少5mM磷酸盐浓度所需的最小量。以1％的体积比添加pH8.0的1MTris溶液，产生10mM的最终Tris浓度，预期产生6.8到7.2之间的最终pH值。所述样本溶液可到达室温(18-23℃)。
[0082] 羟磷灰石层析的条件和试剂
[0083] 介质/柱：II型CHT，40微米，ATOLL 11.3x100mm柱
[0084] 流速：100-200cm/hr(Atoll柱上1.67-3.34ml/min)
[0085] 缓冲剂A：10mM磷酸钠，10％PEG-600，pH7.0
[0086] 缓冲剂B：500mM磷酸钠，10％PEG-600，pH7.0
[0087] 缓冲剂C：1.0M甘氨酸(非缓冲)pH7(+/-0.2)
[0088] 缓冲剂D：600mM KPO4，pH7
[0089] 缓冲剂E：1.0M NaOH
[0090] 缓冲剂F：0.1M NaOH，或20％乙醇，5mM磷酸钠pH7
[0091] 羟磷灰石层析
[0092] 在缓冲剂A(如上)中平衡所述柱(陶瓷羟磷灰石，CHTTMII型，40微米(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，11.3x100mm柱，预填ATOLL Gmbh))。对所述样本采用100柱体积(100CV)的缓冲剂A中。加载样本后，所述柱以2到5倍CV的缓冲剂A冲洗(冲洗1)。所述柱随后以25％缓冲剂B(125mM磷酸盐，10％PEG-600)冲洗，直到读数返回到通过测量280nm，A280的吸收量所确定的基值以下。
[0093] 采用一(1)CV线性梯度达到70％缓冲剂B(350mM磷酸盐，10％PEG-600)从所述柱中洗脱样本，所述柱被置于该置于该70％缓冲剂B中直到所述产品峰被洗脱。0.5CV的组分被直接收集到1.15CV的1M甘氨酸(缓冲剂C)中。所述洗脱峰是如水般清澈的，并且在以甘氨酸稀释时保持清澈。组分的储存温度为4℃。如推荐的，组分的收集从前端的10％最大峰高度开始到尾端的10％最大峰高度为止，所述收集的组分被汇集到一起进行进一步的纯化。可预期该收集/聚集的策略能够排除可能在所述样本峰的尾端开始洗脱的聚集物。用5-10CV的缓冲剂D清洗所述CHT柱，用缓冲剂E清洁，并贮存在缓冲剂F中。
[0094] CHT上的初步纯化在10cm床高、流速20cm/hr下，需要约6小时，包括约5小时加载样本。样本纯度超过90％IgM，聚集物浓度低于1％。
[0095] 关于初步纯化的注释
[0096] 初步的数据指出当在1x体积CHT上处理100x体积时，大多数的IgM都能够被结合。如果在后期的流过组分中发现明显的产品损失，那么所述产品的处理量应当相应降低。通过计算可知工艺时间会随床高增加，因而若床高加倍工艺时间也加倍。因此可以得出结论，在这些条件下，在整个工艺规模内适用15cm的床，10cm床也可适用，决定于持续获得良好填料质量的能力，在整个工艺规模内不应使用超过20cm的床。
[0097] 为了从本步骤达到理想的纯化效果，加载样本后进行大量冲洗是很重要的。当在该清洗中洗脱一个大峰时，可能达到后续IgM洗脱峰的两倍尺寸，意味着高达5％的显著产品损失，该峰可能包含各种污染物，例如宿主细胞蛋白(HCP)，还有IgM片段，所述IgM片段通常依然能够被抗-IgM抗体检测到，所述抗-IgM抗体无法区分完整的IgM和IgM片段。尽管冲洗缓剂的盐浓度可较低，以防止明显的IgM损失，但可能增加HPC的污染。
[0098] 如果希望或者需要，在该步骤中，当所述抗体被结合到CHT时或者在从CHT洗脱后，可通过溶剂/去污剂混合物(S/D)方法进行病毒灭活。如果在所述抗体被结合到CHT时执行，应当在所述第一次冲洗(缓冲剂A)后进行。在一种方法中，根据本领域所知的方法准备CV的S/D试剂，第一个CV的S/D试剂快速流过所述柱(200cm/hr)，其后第二个CV的S/D试剂花费一个小时缓慢流过所述柱。所述柱以至少10CV的10mM磷酸盐+S/D步骤中所用的去污剂进行冲洗，去除残余的2％的磷酸三丁脂(TNBP)，并以5CV的缓冲剂A进行冲洗以去除残余的去污剂并重新开始所述纯化。S/D处理也可在所述CHT步骤之后执行，这是因为其也能够与后续的阴离子交换步骤相容。注意，S/D处理对该抗体的效果未被评估。
[0099] II采用阴离子交换层析的中间纯化
[0100] 在完成CHT上的初步纯化之后的24个小时内开始采用阴离子交换层析的中间纯化。
[0101] 阴离子交换层析的条件和试剂
[0102] 介质/柱： 单片(8ml)
[0103] 流速：每分钟高达10CV
[0104] 缓冲剂A：50mM Tris，1M甘氨酸，2mM EDTA，pH8.0
[0105] 缓冲剂B：50mM MES，10mM NaCl，1.0M甘氨酸，pH6.2
[0106] 缓冲剂C：50mM MES，500mM NaCl，pH6.2
[0107] 缓冲剂D：1.0M NaOH
[0108] 缓冲剂E：0.01M NaOH或20％乙醇
[0109] 阴离子交换层析
[0110] 向从CHT中收集并聚集在一起的组分中以5％的体积比添加1MTris，pH8.0的溶液，产生50mM的最终Tris浓度，所述样本溶液可达到室温(18-23℃)。
[0111] 所述柱包括八(8)ml强阴离子交换体 单片，所述柱在缓冲剂A中被平衡，所述样本溶液通过在线稀释被加载到所述柱上，所述在线稀释如下所述：一份样本(由泵A供应)中加入两份缓冲剂A(由泵B供应)。该样本稀释产生的总稀释量为10x的从CHT柱洗脱的体积。用于该步骤的QA单片的期望柱容量约为每毫升单片30mg IgM。所述柱用缓冲剂B冲洗(冲洗1)，然后以77％缓冲剂B，23％缓冲剂C冲洗(冲洗2)，该冲洗洗脱一小峰。如果需要的话，缓冲剂C的制备可含有1M NaCl，以提供更有效的清洁，尽管需要相应调整梯度设定点。
[0112] 随后使用5CV线性梯度达到52％缓冲剂B，48％缓冲剂C从而洗脱样品，所述柱被置于52％缓冲剂B，48％缓冲剂C中直到所述样本峰被完全洗脱。所述样本峰包括在200mM NaCl和0.5M甘氨酸下洗脱的IgM，是清澈的。从前端的10％最大峰高度开始到尾端的10％最大峰高度为止所收集的组分被汇集到一起。可以预期任何残留的聚集物是在尾端被洗脱的。所述柱通过100％的缓冲剂C清洗，产生含有混合了几种污染物的少量IgM的小尖峰，随后产生一连串其他小污染物峰。所述柱在缓冲剂D中清洁并贮存在缓冲剂E中。该中间纯化步骤在不到一个小时内完成。
[0113] 在缓冲剂A中，可期待EDTA去除任何的钙，在CHT步骤中钙可能已经被所述样本携带，使用pH8.0强化所述介质的结合能力。清洗和洗脱可在pH6.2下执行以强化去除宿主细胞蛋白(HCP)，并提供洗脱样本，所述洗脱样本的pH值能够与在后续阳离子交换纯化中使用的缓冲剂直接相容。由于洗脱缓冲剂的低pH值(6.2)，在该步骤后聚集起来的含有IgM的组分的搁置时间少于约24小时。
[0114] 关于中间纯化的注释
[0115] 若计划进行病毒过滤步骤，但之前尚未执行，可在所述阴离子交换步骤后执行，其中应当使用追加溶液50mM MES，150mM NaCl，pH6.2，所述抗体应当在后续的阳离子交换步骤中再次浓缩。
[0116] 如果在所述CHT步骤后通过溶剂/去污剂混合物(S/D)方法执行病毒灭活(见上述注释)，那么应当对所述阴离子交换工艺执行附加的去污剂冲洗，例如，通过向阴离子交换缓冲剂A中添加去污剂，并在添加样本后使用至少10CV的缓冲剂A。在该情况下，推荐在缓冲剂B冲洗时重新开始纯化。
[0117] 该抗体与阴离子交换体的强结合意味着洗脱pH值可进一步降低；但这增加了产品变性的风险，并且尽管高甘氨酸溶液可降低该风险，但并不能完全消除。
[0118] III通过阳离子交换层析进行精细纯化
[0119] 阳离子交换层析在所述阴离子交换层析(如上所述)24小时内开始。
[0120] 阳离子交换层析的条件和试剂
[0121] 介质/柱： 单片(8ml)
[0122] 流速：每分钟高达10CV
[0123] 缓冲剂A：50mM MES，1.0M甘氨酸，pH6.2
[0124] 缓冲剂B：20mM柠檬酸盐，1.0M甘氨酸，pH6.2
[0125] 缓冲剂C：250mM柠檬酸盐，pH6.2
[0126] 缓冲剂D：1.0M NaOH
[0127] 缓冲剂E：0.01M NaOH或20％乙醇
[0128] 阳离子交换层析
[0129] 一旦开始，采用阳离子交换层析的最终纯化步骤应不中断地完成。
[0130] 样本(从阴离子交换中聚集起来的组分)可达到室温(18-23℃)。所述柱在缓冲剂A中平衡。样本依照1份样本溶液到9份缓冲剂A进行在线稀释，通过在线稀释加载样本。CIM SO3介质的容量显示为约30mg IgM/ml。所述柱以2-5CV缓冲剂A冲洗(冲洗1：2CV就足够了，不超过5CV)，然后以5CV 95％缓冲剂B、5％缓冲剂C冲洗(冲洗2)，该冲洗形成一小峰。
[0131] 样本使用5CV线形梯度达到60％缓冲剂B、40％缓冲剂C洗脱，所述柱被置于60％缓冲剂B、40％缓冲剂C中直到所述样本峰被完全洗脱。从前端的10％最大峰高度开始到尾端的10％最大峰高度为止所收集的组分被汇集到一起。洗脱的IgM是清澈的。可以预期任何残留的聚集物是在尾端被洗脱的。500mM磷酸盐pH7的溶液以10％的体积比被添加到所述聚集起来的组分中，以增加所述pH值，所述溶液被储存在4℃下。所述柱用缓冲剂B清洗，该清洗形成一小峰。所述柱在缓冲剂D中清洁并贮存在缓冲剂E中。
[0132] 关于精细纯化的注释
[0133] 由于所述阳离子交换将所述抗体暴露于易于产生聚集物的条件下(包括低pH值和低导电性)，因此所述阳离子交换步骤可能是在整个工艺中最关键的步骤。尽管甘氨酸的高浓度对溶解性的最大化是非常重要的，其只能降低风险但无法将其完全消除。应当避免中断，注意保证阳离子交换工艺一旦开始应当无中断地完成。
[0134] 实施例2.CM1纯化
[0135] I.获取样本和采用羟磷灰石层析的初步纯化
[0136] CM1 IgM从500ml澄清的细胞培养上清液的初始材料开始纯化，其包含约200μg IgM/ml细胞培养上清液。首先，细胞培养上清液可达到室温(18-23℃)，然后采用0.22微米(0.22μm)的滤网进行过滤，随后以1％的体积比添加pH7.0的500mM磷酸钠，产生5mM的最终磷酸盐浓度。如果所述上清液已经含有磷酸盐，向所述过滤上清液中添加pH7.0的500mM磷酸钠的量为达到至少5mM磷酸盐浓度所需的最小量。
[0137] 羟磷灰石层析的条件和试剂
[0138] 介质/柱：II型CHT，40微米，ATOLL 11.3x100mm柱
[0139] 流速：不超过200cm/hr(Atoll柱上3.34ml/min)
[0140] 缓冲剂A：10mM磷酸钠，10％PEG-600，pH7.0
[0141] 缓冲剂B：500mM磷酸钠，10％PEG-600，pH7.0
[0142] 缓冲剂C：1.0M甘氨酸(非缓冲)pH7(+/-0.2)
[0143] 缓冲剂D：600mM KPO4，pH7
[0144] 缓冲剂E：1.0M NaOH
[0145] 缓冲剂F：0.1M NaOH，或20％乙醇，5mM磷酸钠pH7
[0146] 羟磷灰石层析
[0147] 在缓冲剂A中平衡所述柱(陶瓷羟磷灰石，CHTTMII型，40微米(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，11.3x100mm柱，预填ATOLLGmbh))。对所述样本采用50柱体积(CV)。加载样本后，所述柱以2到5倍CV的缓冲剂A冲洗(冲洗1：2CV已足够，需要保证不超过5CV，无需冲洗到基值)。所述柱随后以23％缓冲剂B(165mM磷酸盐，10％PEG-600)清洗，直到读数返回到基值(冲洗2)。在所述第二次冲洗步骤中洗脱一个大峰，大致与所述产品峰相当，其中可预期该冲洗会洗脱IgM片段。如上所述，5-10％范围内的明显产品损失可能是该冲洗所转移的片段，如果完整产品的损失看起来过度了，应当降低缓冲剂B的浓度，但这可能增加HCP带来的污染。
[0148] 采用5CV线性梯度达到73％缓冲剂B(360mM磷酸盐，10％PEG-600)从所述柱中洗脱样本，在该点之后所述柱被置于该置于该73％缓冲剂B中直到所述产品峰被洗脱。0.5CV的组分被直接收集到1.15CV的1M甘氨酸(缓冲剂C)中。所述洗脱峰是如水般清澈的，并且在以甘氨酸稀释时保持清澈。组分的收集从前端的10％最大峰高度开始到尾端的10％最大峰高度为止，所述收集的组分被汇集到一起进行进一步的纯化。可预期该收集/聚集的策略能够排除可能在所述样本峰的尾端开始洗脱的聚集物。组分的储存温度为4℃。用5-10CM的缓冲剂D洗净所述CHT柱，用缓冲剂E清洁，并贮存在缓冲剂F中。
[0149] 对10cm床高的CHT上的初步纯化需要流速20mg/hr、约6小时，包括需要约2.5小时加载样本。基于阴离子交换结果，CHT之后的样本纯度约50％。本样本纯度相比SAM1(上述实施例1)或LM1(下述实施例3)低得多，但是所述污染物在后续阴离子交混步骤中很容易消除。所述CHT步骤被确认为在本工艺中的主要聚集物去除步骤，聚集物通过G400SWXL上的分析尺寸排阻层析无法测得(未展示数据)，这被认为意味着聚集物含量低于0.1％。相比加载在所述柱上的初始样本，总回收量是低的，这很大程度上是由于在所述冲洗步骤中去除了IgM片段并在所述清洗阶段去除了聚集物。
[0150] 关于初步纯化的注释
[0151] 所述CHT步骤的结合容量可能是所述纯化工艺中最模糊的参数。初步的数据指出当在1x体积CHT上处理50x样本体积时，大多数的IgM都能够被结合。CM1与CHT的强结合(比LM1和SAM6都要强)暗示了可能达到大得多的柱容量，但是主要污染物(如下所述)的竞争结合可能是一个限制。如任何实施方式所惯常的，流过的组分在最初的几轮中被保留下来并测量IgM含量以确定柱容量。当确认有效结合后，可确定所述加载体积。如果在后期的流过组分中发现明显的产品损失，那么所述产品的处理量应当相应降低。类似地，无法预期的柱寿命也给出了为CHT步骤准备专用柱的启示，所述专用柱被设计为容纳CHT的高密度和沉降速度，其中除非需要导入空气或应累积性能损失的需要，所述专用柱不应卸料。
[0152] 与预期一致，尤其由于在所述去除了IgM片段(在冲洗步骤中)和聚集物(在所述清洗阶段中)，该步骤的回收率是最低的。若在后续的两个阴离子交换步骤中回收率为90％，为了达到60％的整体工艺回收率只需要在CHT步骤达到75％的回收率。大多数商业IgG工艺达到50-60％的整体工艺回收率，除非初始聚集物浓度高，在这些情况下整体工艺回收率可能为25％或更低。根据获得适用于临床条件的材料的目的，评估这个阶段的数据，其中所述工艺可能不需要的工艺最高经济效率，在工艺发展中可能也不需要所述工艺的最高效率。
[0153] 由于CM1与LM1有一项共同的重要化学特征-与阳离子交换体的结合弱-并且由于LM1在某些条件下与PEG发生问题，对CM1进行额外的试验以确定其是否显示出相似的敏感性。从在10％PEG-600中的CHT中洗脱的CM1在洗脱时如水般清澈并且在室温下保持清澈，但是在4℃下迅速变混浊。通过使用1M甘氨酸稀释立刻逆转混浊过程，这与LM1中所观察到的一致，由此确定将CM1直接收集到1.0M甘氨酸稀释液中是可取的(1份样本由2.3份1.0M(非缓冲)甘氨酸、pH7稀释)。在稀释后，未发现更多的溶解度问题，但认为谨慎起见，建议在完成CHT步骤后24小时内开始下一步骤。考虑可能的冷却和/或不溶解问题。尽管像在所述CHT步骤中使用的那样PEG不产生新的溶解现象，其强化了已存在的现象。进一步地，确定需要非常注意预先冷却的材料以保证在任何形式的工艺之前其是充分溶解的。
[0154] 将样本在本工艺的所有步骤中置于18-23℃之中的规定，可能是预防性的。根据对直接从4℃的贮存中取出的材料所进行的有效试验，从4℃的材料开始是可能的，这使整个工艺更快更方便。依照之前预期的装瓶浓度(如果已知的话)，画出从4℃到23℃的温度溶解曲线，或者如果之前预期的装瓶浓度未知时设为20mg/ml。
[0155] PEG-600和PEG-1000在本工艺中可彼此替换使用。PEG-1000的效果相比PEG-600略强，并会引起所述抗体的洗脱稍早，类似地强化去除聚集物。如果PEG被完全省略，所述抗体的洗脱大大提前，冲洗洗脱/洗脱设定点分别为75mM磷酸盐和235mM磷酸盐。
[0156] 现在的甘氨酸浓度是预防性的，可能可以下降而不引起对所述产品的危险，但这应当在大尺量执行之前通过试验确认。
[0157] CHT之后的搁置时间可能可以延长到一周，但应当通过试验确认。评价较长搁置时间的一种方法可以是检查混浊度(600nm分光光度分析)和分析尺寸排阻曲线(测量聚集物含量)，两者均应每天检查。
[0158] 如前所述，可在所述抗体结合到CHT或从CHT中洗脱之后，通过溶剂/去污剂混合物方法进行病毒灭活。
[0159] II采用阴离子交换层析的中间纯化
[0160] 在完成CHT上的初步纯化之后的24个小时内开始采用阴离子交换层析的中间纯化。
[0161] 阴离子交换层析的条件和试剂
[0162] 介质/柱： 单片(8ml)
[0163] 流速：每分钟高达10CV
[0164] 缓冲剂A：50mM Tris，1.0M甘氨酸，2mM EDTA，pH8.0
[0165] 缓冲剂B：50mM MES，10mM NaCl，1.0M甘氨酸，pH6.2
[0166] 缓冲剂C：50mM MES，500mM NaCl，pH6.2
[0167] 缓冲剂D：1.0M NaOH
[0168] 缓冲剂E：0.01M NaOH或20％乙醇
[0169] 阴离子交换层析
[0170] 向从CHT中收集并聚集在一起的组分中以5％的体积比添加1MTris，pH8.0的溶液，产生50mM的最终Tris浓度。所述柱在缓冲剂A中平衡。样本溶液通过在线稀释被加载到所述柱上，所述在线稀释如下所述：一份样本中加入两份缓冲剂A。该样本稀释产生的总稀释量为10x的从CHT柱洗脱的体积。用于该步骤的QA单片的期望柱容量约为每毫升单片(介质)30mg IgM，预计碱性的pH值会进一步增加结合容量。所述柱用缓冲剂B冲洗(冲洗1)，然后以71％缓冲剂B，29％缓冲剂C冲洗(冲洗2)，该冲洗洗脱一污染物的大峰，也可能含有一些IgM。本实施例中所使用的MES缓冲剂是两性离子，能够为阴离子和阳离子交换都提供较好的缓冲效果。
[0171] 使用5CV线性梯度达到53％缓冲剂B，47％缓冲剂C从而洗脱样品，随后所述柱被置于53％缓冲剂B，47％缓冲剂C中直到所述样本峰被完全洗脱。从10％最大峰高度开始持续到峰下降到10％最大峰值(尾端)为止所收集的组分被汇集到一起。可以预期任何残留的聚集物是在尾端被洗脱的。所述柱通过100％的缓冲剂C清洗，产生含有混合了几种污染物的少量IgM的小尖峰，随后产生一连串其他小污染物峰。可使用1M NaCl取代500mM CaCl配置缓冲剂C，以达到更好的清洗效果，尽管需要根据更高的NaCl浓度调整所有的混合物或梯度。使用缓冲剂D清洁所述柱并将其贮存在缓冲剂E中。该中间纯化步骤在不到一个小时内完成。从所述阴离子交换体中洗脱的所述产品(CM1)具有约0.5M甘氨酸和约225mM NaCl的平均浓度，略高于SAM6(上文实施例1)或LM1(下文实施例3)。在该步骤之后的纯度为约95-98％IgM。本步骤回收率约90％。
[0172] 对于从上述给料量的CHT步骤的IgM量而言，8ml CIM QA单片柱尺寸过大了。在另一个实验中发现，在4ml/min下的1ml单片(3个0.34ml片堆叠而成)，结合了来自加载250ml细胞培养上清液的5ml CHT柱的所有IgM，意味着8ml单片能够保留来自加载2升细胞培养上清液的CHT柱的IgM。如前所述，可期待EDTA去除任何的钙，在CHT步骤中钙可能已经被所述样本携带，pH8.0有望强化所述介质的结合能力。清洗和洗脱步骤可在pH6.2下执行以强化去除HCP，并提供洗脱样本，所述洗脱样本能够与在后续阳离子交换纯化中的缓冲剂直接相容。然而，建议尽快执行下面的步骤，优选24小时以内，使所述洗脱样本保持在pH6.2下的时间尽可能地短。提高用于后续阳离子交换步骤的溶液的pH值是不现实的，这会引起结合效率的降低，即便在最佳环境下所述CM1 IgM与阳离子交换介质的结合也是弱的。
[0173] III通过阳离子交换层析进行精细纯化
[0174] 阳离子交换层析在所述阴离子交换层析(如上所述)24小时内开始。
[0175] 阳离子交换层析的条件和试剂
[0176] 介质/柱： 单片(8ml)
[0177] 流速：每分钟高达10CV
[0178] 缓冲剂A：10mM柠檬酸盐，1.0M甘氨酸，pH6.2
[0179] 缓冲剂B：250mM柠檬酸盐，pH6.2
[0180] 缓冲剂C：1.0M NaOH
[0181] 缓冲剂D：0.01M NaOH或20％乙醇
[0182] 阳离子交换层析
[0183] 样本溶液(从阴离子交换中聚集起来的组分)可达到室温(18-23℃)。所述柱在缓冲剂A中平衡。样本依照1份样本溶液到9份缓冲剂A进行在线稀释，通过在线稀释加载样本。注意缓冲剂A含有10mM柠檬酸盐，这与在其他实施例中的阳离子交换层析所使用的缓冲剂A不同。所述介质的单体容量显示为至少30mg IgM/ml。所述柱以2-5CV缓冲剂A冲洗(冲洗1：2CV就足够了，不超过5CV)。样本使用5CV线形梯度达到12％缓冲剂B洗脱，随后所述柱被置于12％缓冲剂B中直到所述样本峰被完全洗脱。从10％最大峰高度开始持续到所述峰下降到10％最大峰高度(尾端)为止所收集的组分被汇集到一起。在尾端的5％最大峰值处开始的长而低的峰中预计会洗脱聚集物，因此在尾端10％最大峰值处之后收集到的组分，不被汇集到从所述主峰中收集的组分中。500mM磷酸盐pH7的溶液以10％的体积比被添加到所述聚集起来的组分中，以提高pH值和导电性。由此产生含有25mM柠檬酸盐、50mM磷酸盐、800mM甘氨酸，pH～6.7的高纯度IgM溶液，所述溶液被储存在4℃下；或者可直接将组分收集在磷酸盐稀释液(500mM磷酸盐，pH7)中。所述柱用缓冲剂B清洗，该清洗形成一小峰，理论上含有聚集物。所述柱在缓冲剂C中清洁并贮存在缓冲剂D中。
[0184] 该步骤在少于1个小时内完成，但如果需要的话可以放慢。可以确定降低流速既不会改善也不会降低柱性能。整体回收率约为90％，从所述主洗脱峰收集的所述组分的纯度超过99％IgM。
[0185] 一旦开始，采用阳离子交换层析的最终纯化步骤应不中断地完成，这是因为阳离子交换将IgM CM1暴露于易于产生聚集物的条件下(低pH值和极低导电性)，尽管溶液中的甘氨酸能够改善溶解性，甘氨酸只能降低聚集物风险但无法将其完全消除。
[0186] 对于从上述给料量的CHT步骤中所回收的IgM量而言，这里的8ml柱尺寸过大了。在单独实验中，在1ml单片(3个0.34ml片堆叠而成)能够结合从加载250ml细胞培养上清液的5ml CHT柱之后的所述阳离子交换步骤中洗脱的所有IgM。该结果意味着8ml单片能够保留并释放由加载到CHT上的至少2升细胞培养上清液(CHT给料)所生产的IgM。
[0187] 实施例3.LM1纯化
[0188] II.获取样本和采用羟磷灰石层析的初步纯化
[0189] LM1IgM从一(1)升澄清的细胞培养上清液的初始材料开始纯化，其包含约200μg IgM/ml细胞培养上清液。首先，细胞培养上清液采用0.22微米(0.22μm)的滤网进行过滤。以1％的体积比添加pH7.0的500mM磷酸钠溶液，产生5mM的最终磷酸盐浓度。如果所述上清液已经含有磷酸盐，向所述过滤上清液中添加pH7.0的500mM磷酸钠的量为达到至少
5mM磷酸盐浓度所需的最小量。测量溶液pH值，若pH值低于pH6.8，添加pH8.0的1MTris溶液，产生6.8到7.2之间的最终pH值。所述样本溶液可到达室温(18-23℃)。
5mM磷酸盐浓度所需的最小量。测量溶液pH值，若pH值低于pH6.8，添加pH8.0的1MTris溶液，产生6.8到7.2之间的最终pH值。所述样本溶液可到达室温(18-23℃)。
[0190] 羟磷灰石层析的条件和试剂
[0191] 介质/柱：II型CHT，40微米，ATOLL 11.3x100mm柱
[0192] 流速：100-200cm/hr(Atoll柱上1.67-3.34ml/min)
[0193] 缓冲剂A：10mM磷酸钠，10％PEG-600，pH7.0
[0194] 缓冲剂B：500mM磷酸钠，10％PEG-600，pH7.0
[0195] 缓冲剂C：50mM Tris，1.0M甘氨酸，2mM EDTA，pH8(+/-0.2)
[0196] 缓冲剂D：600mM KPO4，pH7
[0197] 缓冲剂E：1.0M NaOH
[0198] 缓冲剂F：0.1M NaOH，或20％乙醇，5mM磷酸钠pH7
[0199] 羟磷灰石层析
[0200] 在缓冲剂A中平衡所述柱。对所述样本采用100柱体积(100CV)。加载样本后，所述柱以2到5倍CV的缓冲剂A冲洗(冲洗1：2CV就足够了，不超过5CV)。所述柱随后以20％缓冲剂B(100mM磷酸盐，10％PEG-600)冲洗，在该冲洗(冲洗2)中洗脱一大峰；所述峰包括宿主细胞蛋白(HCP)。所述柱以20％缓冲剂B冲洗直到读数返回到基值以下，在该步骤中“冲洗到基值”对最佳的IgM纯化是很重要的。
[0201] 尽管在该第二冲洗阶段洗脱的所述峰的含量有时显示了高达5％的明显产品损失，但这些产品可能是IgM片段。然而，当产品损失看来过大时，减少缓冲剂B的浓度，但需要了解减少缓冲剂B可能增加HCP的污染(即，在该冲洗步骤中HCP的彻底去除较弱，导致将HCP带到其它的步骤中去)。或者，如果发现产品损失较少或没有，提高所述冲洗步骤中的磷酸盐浓度，该提高以较小的冲洗体积将读数(280nm的UV吸收率)重新降低到基值，并去除更多的HCP。
[0202] 采用5CV线性梯度达到65％B(325mM磷酸盐，10％PEG-600)执行洗脱，在该点后所述柱被置于该置于该65％缓冲剂B中直到所述产品峰被洗脱。0.5CV的组分被直接收集到1.15CV的1M甘氨酸(缓冲剂C，50mM Tris，1.0M甘氨酸，2mM EDTA，pH8)中。所述洗脱峰是如水般清澈的，并且在以甘氨酸稀释时保持清澈。组分的收集从前端的10％最大峰高度开始，但只到尾端开始出现污染物峰的肩(见图1中所示的CHT中的LM1洗脱参考曲线)为止。尽管聚集物可能在所述峰的尾端已经开始洗脱，该收集/聚集的策略应该已经排除了聚集物。可以确定，尽管所述梯度的终点可以略为减小(可能低至300mM磷酸盐)，以提供较高的产品纯度，需要了解的是由于在后面的工艺步骤中去除了污染物，因此在该阶段不是必须采取该策略。组分的储存温度为4℃。用5-10CV的缓冲剂D清洗所述CHT柱，用缓冲剂E清洁，并贮存在缓冲剂F中。
[0203] 在该实施例中，省略了如实施例1和2中所述的样本稀释，这是因为稀释使样本加载时间加倍并且较低的稀释的样本的氯化钠含量会导致结合更多污染物，生产较低纯度的IgM组分。结果显示，当对1x体积的柱施加100x体积时(即100CV样本溶液)，大多数IgM都被结合，尽管流过的组分应当在前几轮中被留下，直到能够确定样本加载体积与柱容量之间的关系。如果确认了有效结合，那么就能够增加所述加载体积。如果在稍后的流过组分中检测到明显的产品损失，那么对应减少所述样本施加体积。采用具有不同产品浓度的不同细胞培养介质需要分别确认动态结合容量。
[0204] CHT上的初步纯化在10cm床高、流速200cm/hr下，需要约6小时，包括需要5小时加载样本。可以确定工艺时间随床高正比增加，即床高加倍则工艺时间加倍，这意味着初步纯化的CHT柱大概不应在整个工艺规模下超过20cm床高，其中15cm是合适的，10cm可能是合适的，由持续具有良好填料质量的能力决定。从CHT中洗脱后的样本纯度高达90％。由于CHT上的初步纯化也在IgM纯化中提供了主要的聚集物去除步骤，从CHT洗脱后的聚集物浓度低于1％，该参数通过尺寸排阻层析(SEC)确定。在聚集物浓度超过1％的情况下，降低缓冲剂B的浓度(例如如上所述，降低到60％缓冲剂B)，尽管SEC的结果始终显示聚集物浓度低于1％，由此在本阶段没有明显的理由需要对工艺进行调整。
[0205] 关于初步纯化的注释
[0206] 可以确认，可使用相同浓度的PEG-600和PEG-1000，两者可交换。PEG-1000的效果略强，会引起所述抗体的洗脱稍晚，并相似地强化聚集物的去除；然而PEG-600熔点较低且黏度较低。当完全省略PEG时，所述抗体的洗脱大大提前，冲洗洗脱/洗脱设定点分别为50mM磷酸盐和210mM磷酸盐，且几乎不去除聚集物。为了开发医疗用途的纯化产品，研究在不牺牲聚集物的去除的条件下所述PEG浓度能够降低多少是值得的。作为替代方案，另外，可替换使用PEG-400，由于PEG-400在室温下为液体，这能够简化缓冲剂的制备。
[0207] II采用阴离子交换层析的中间纯化
[0208] 阴离子交换层析的条件和试剂
[0209] 介质/柱： 单片(8ml)
[0210] 流速：每分钟高达10CV
[0211] 缓冲剂A：50mM Tris，1M甘氨酸，2mM EDTA，pH8.0
[0212] 缓冲剂B：10mM磷酸钠，1.0M甘氨酸，pH7.0
[0213] 缓冲剂C：500mM磷酸钠，pH7
[0214] 缓冲剂D：1.0M NaOH
[0215] 缓冲剂E：0.01M NaOH或20％乙醇
[0216] 阴离子交换层析
[0217] 所述样本溶液可达到室温(18-23℃)。所述柱在缓冲剂A中被平衡。对2.5CV/min的8ml单体使用循环流速2.5CV/min，样本容量的测量在12CV/min下进行。所述样本溶液通过在线稀释被加载到所述柱上，所述在线稀释为一份样本溶液中加入两份缓冲剂A，产生的总稀释量为10x的从CHT柱洗脱的体积。所述加载溶液中包括甘氨酸以强化抗体溶解性并在整个样本稀释中抑制IgM聚合。用于该步骤的QA单片的期望柱容量约为每毫升单片30mg IgM。所述柱用缓冲剂B冲洗(冲洗1)，然后以5CV 85％缓冲剂B，15％缓冲剂C冲洗(冲洗2)，该冲洗产生一小峰，但不会导致明显的IgM损失。
[0218] 使用5CV线性梯度达到51％缓冲剂B，49％缓冲剂C从而洗脱样品，随后所述柱被置于51％缓冲剂B，49％缓冲剂C中直到所述样本峰被完全洗脱。在约250mM磷酸钠(约0.5M甘氨酸中)下洗脱LM1，含有LM1的组分在洗脱时是清澈的。从前端的10％最大峰高度开始持续到所述峰下降到10％最大峰高度(尾端)为止所收集的组分被汇集到一起。可以预期任何残留的聚集物是在尾端被洗脱的。所述柱通过100％的缓冲剂C清洗，产生含有混合了几种污染物的少量IgM的小尖峰，随后产生一连串其他小污染物峰。所述柱在缓冲剂D中清洁并贮存在缓冲剂E中。该中间纯化步骤在不到一个小时内完成，尽管如果需要的话可以将其放慢。
[0219] 图2和图3显示了在下述特定条件下通过阴离子交换层析进行LM1中间纯化的参考曲线，其中图2显示了整个纯化步骤的参考曲线，图3显示了通过阴离子交换层析进行LM1中间纯化的洗脱峰高分析度曲线。
[0220] 图2和图3中的LM1阴离子层析执行条件
[0221] 层叠在一个外壳中的3x0.34ml片，4ml/min
[0222] 缓冲剂A：50mM Tris，1M甘氨酸，2mM EDTA，pH8
[0223] 缓冲剂B：10mM NaPO4，1M甘氨酸，pH7
[0224] 缓冲剂C：500mM NaPO4，pH7
[0225] 平衡柱
[0226] 通过在线稀释加载样本，所述样本为来自CHT的聚集起来的样本(已经以缓冲剂A稀释到3.3x)，所述在线稀释为1份样本，两份缓冲剂A
[0227] 用缓冲剂A冲洗
[0228] 用缓冲剂B冲洗
[0229] 洗脱：48CV LG到100％B
[0230] 如上所述，可期待EDTA去除任何的钙，由于CHT具有去除并用钙替代除钙以外的金属的能力，在CHT步骤中钙可能已经被所述样本携带。所述加载溶液保持pH8.0以强化所述介质的结合能力。清洗和洗脱在pH7.0下执行以强化去除HCP，并提供洗脱样本，所述洗脱样本能够与在后续阳离子交换纯化中的缓冲剂直接相容。若需要但尚未执行病毒过滤步骤，可在所述阴离子交换步骤后执行病毒过滤步骤。
[0231] III通过阳离子交换层析进行精细纯化
[0232] 阳离子交换层析的条件和试剂
[0233] 介质/柱： 单片(8ml)
[0234] 流速：每分钟高达10CV，较低的流速不会降低也不会显著提升性能
[0235] 缓冲剂A：10mM磷酸钠，1.0M甘氨酸，pH7
[0236] 缓冲剂B：500mM磷酸钠，pH7
[0237] 缓冲剂C：1.0M NaOH
[0238] 缓冲剂D：0.01M NaOH或20％乙醇
[0239] 阳离子交换层析
[0240] 样本溶液(从阴离子交换中聚集起来的组分)可达到室温。所述柱在缓冲剂A中平衡。样本依照1份样本溶液到9份缓冲剂A进行在线稀释，通过在线稀释加载样本。在这些条件下所述柱的容量显示为至少每毫升单体30mg IgM。所述柱以2-5CV缓冲剂A冲洗(冲洗1：2CV就足够了，不超过5CV)。样本使用5CV线形梯度达到15％缓冲剂B(75mM磷酸盐)洗脱，随后所述柱被置于15％缓冲剂B中直到所述样本峰被完全洗脱。含有IgM的组分在洗脱时是清澈的。可以确定由于LM1在低导电率值(低盐度)下被洗脱，可以添加NaCl，例如直到最终浓度0.1M，以稳定所述抗体并防止产生聚集物，其中NaCl能够在洗脱后立刻添加或者将组分直接收集到高盐度的稀释液中。收集到的组分被储存在4℃下。所述柱用缓冲剂B清洗，该清洗形成一含有显著的IgM量的小峰。所述柱在缓冲剂D中清洁并贮存在缓冲剂E中。
[0241] 图4和图5显示了在下述特定条件下采用阳离子交换层析的LM1精细纯化参考曲线，其中图4显示了整个纯化步骤的参考曲线，图5显示了通过LM1精细纯化的洗脱峰高解析度曲线。
[0242] 图4和图5中的精细纯化执行条件
[0243] 层叠在一个外壳中的3x0.34ml片，4ml/min
[0244] 缓冲剂A：10mM NaPO4，1M甘氨酸，pH7
[0245] 缓冲剂B：500mM NaPO4，pH7
[0246] 平衡柱
[0247] 通过在线稀释加载样本，所述样本为来自阴离子交换的聚集起来的样本，所述在线稀释为1份样本，9份缓冲剂A
[0248] 用缓冲剂A冲洗
[0249] 洗脱：48CV LG到100％B
[0250] 对采用阳离子交换层析的LM1纯化，所述洗脱峰的形状在尾端缺乏定义，是非典型的(见图4和5，尤其图5)。因此，为了防止收集到聚集物，汇集的规范被设定为排除大部分的尾端部分，例如组分的收集仅仅持续到在所述尾端所述峰降低到25％最大峰值的位置，为了保证在所述尾端洗脱的聚集物不会与IgM峰一起被收集。该策略的有效性通过在精细纯化后采用高性能尺寸排阻层析(HPSEC)分析所述LM1峰组分进行评估，如实施例4所述，并不能检测到聚集物的存在(即聚集物的浓度低于约0.1％的检测下限)，确认该方法能够产生不含有可检测的IgM聚集物的制品。
[0251] 实施例4.纯化的LM1的分析尺寸排阻层析
[0252] 对从精细纯化层析获得的含有IgM的组分进行分析尺寸排阻层析(SEC)以评估所述纯化的IgM的尺寸(分子半径)，以及纯度和所述含有IgM的样本的其他特征。在如上面的实施例4所述的采用阳离子交换层析的LM1精细纯化中，从所述洗脱峰收集并汇集在一起的100ml LM1样本被加载到GSW4000SEC介质(Toso BioSep，Stuttgart，DE)，以0.5ml/min的流速用SEC缓冲剂(25mM MES，0.5mM甘氨酸，0.5M NaCl，0.2M精氨酸，pH6.8)执行。通过测量280nm和300nm的吸收率测量蛋白质总量，测量600nm的吸收率测量混浊度，从而分析SEC洗脱液。也测量所述溶液的导电性。该样本的分析SEC曲线如图6所示。LM1在单一的峰中洗脱，意味着几乎不含例如IgM片段和IgM聚集物的污染物。所述LM1峰的中心在注入后8.55分钟洗脱(图6)。LM1洗脱时间为纯化CM1所观察到的所述SEC洗脱峰之后1.03分钟(数据未显示)，以及纯化SAM6所观察到的所述SEC洗脱峰之后1.03分钟(数据未显示)。已知所述SEC缓冲剂是为了防止特定氢结合、以及离子与疏水作用而特别配制的，这些结果显示了相比另两种抗体(CM1和SAM6)，LM1 IgM具有较小的水力半径。LM1也显示了从阳离子交换介质中的不寻常的洗脱曲线，注意所述阳离子交换洗脱曲线和所观察到的LM1对pH值的敏感度。
[0253] 在含有LM1的样本的SEC过程中，如A280和A300的测量结果的平行轨迹所证实的，在注入后20分钟处所见的洗脱峰是缓冲剂人造峰。如A280、A300、A600的测量结果的平行轨迹，以及同时发生的测得的导电性的增加所证实的，在注入后29到30分钟所观察到的人造峰是由于样本缓冲剂从所述柱洗脱的过程中引起的折射率的变化造成的。
[0254] 实施例5.SAM6纯化程序
[0255] I获取样本和采用羟磷灰石层析的初步纯化
[0256] 通过使用2M尿素替代实施例1的工艺中的1M甘氨酸执行所述SAM6纯化程序。含有尿素的缓冲剂在使用之前通过阴离子交换过滤进行过滤，例如Sartobind Q(单步，nano，1ml)。强烈建议使用ACS级或更好的尿素。含有尿素的缓冲剂被指定为在不超过7天内过期，作为预防措施尽量减少氨甲酰化的可能。
[0257] SAM6 IgM从一升澄清的细胞培养上清液的初始材料开始纯化，其包含约200μg IgM/ml细胞培养上清液。首先，细胞培养上清液采用0.22微米(0.22μm)的滤网进行过滤，随后以1％的体积比添加pH7.0的500mM磷酸钠，产生5mM的最终磷酸盐浓度。如果所述样本已经含有磷酸盐，向所述过滤上清液中添加pH7.0的500mM磷酸钠的量为达到至少5mM磷酸盐浓度所需的最小量。以1％的体积比添加1MTris pH8.0溶液，产生10mM的最终Tris浓度，预期产生6.8到7.2之间的最终pH值。所述样本溶液可到达室温(18-23℃)。
[0258] 羟磷灰石层析的条件和试剂
[0259] 介质/柱：II型CHT，40微米，ATOLL 11.3x100mm柱
[0260] 流速：100-200cm/hr(Atoll柱上1.67-3.34ml/min)
[0261] 缓冲剂A：10mM磷酸钠，10％PEG-600，pH7.0
[0262] 缓冲剂B：500mM磷酸钠，10％PEG-600，pH7.0
[0263] 缓冲剂C：1.0M甘氨酸(非缓冲)pH7(+/-0.2)
[0264] 缓冲剂D：10mM磷酸钠，2M尿素，2mM EDTA，pH7
[0265] 缓冲剂E：1.0M NaOH
[0266] 缓冲剂F：0.1M NaOH，或20％乙醇，5mM磷酸钠pH7
[0267] 羟磷灰石层析
[0268] 在缓冲剂A(如上)中平衡所述柱(陶瓷羟磷灰石，CHTTMII型，40微米(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，11.3x100mm柱，预填ATOLL Gmbh))。对所述样本采用100柱体积(100CV)、流速约0.1ml/min的缓冲剂A。加载样本后，所述柱以2到5倍CV的缓冲剂A冲洗(冲洗1)。所述柱随后以25％缓冲剂B(125mM磷酸盐，10％PEG-600)冲洗，直到读数返回到通过测量280nm，A280的吸收量所确定的基值以下。
[0269] 停止流动并且将Sartobind Q薄膜阴离子交换滤网结合到所述CHT柱的底部，然后在冲洗条件下重新开始流动直到所述监视器显示Q料筒达到平衡。(A 1mL料筒容纳10mL CHT柱，可能为10倍，可能多得多)。
[0270] 采用一(1)CV线性梯度达到70％缓冲剂B(350mM磷酸盐，10％PEG-600)从所述柱中洗脱样本，所述柱被置于该置于该70％缓冲剂B中直到所述产品峰被洗脱。0.5CV或更少的组分被收集，聚集的溶液使用缓冲剂C稀释到初始聚集体积的3.3倍。所述洗脱峰是如水般清澈的，并且在以甘氨酸稀释时保持清澈。组分的储存温度为4℃。如推荐的，组分的收集从前端的10％最大峰高度开始到尾端的10％最大峰高度为止，所述收集的组分被汇集到一起进行进一步的纯化。可预期该收集/聚集的策略能够排除可能在所述样本峰的尾端开始洗脱的聚集物。用5-10CV的缓冲剂D清洗所述CHT柱，用缓冲剂E清洁，并贮存在缓冲剂F中。
[0271] II采用阴离子交换层析的中间纯化
[0272] 在完成CHT上的初步纯化之后的24个小时内开始采用阴离子交换层析的中间纯化，且以4ml/min的最小流速在AKTA Explorer100上执行。
[0273] 阴离子交换层析的条件和试剂
[0274] 介质/柱： 单片(8ml)
[0275] 流速：每分钟高达10CV
[0276] 缓冲剂A：10mM磷酸钠，2M尿素，pH7
[0277] 缓冲剂B：50mM MES，10mM NaCl，2M尿素，pH6.2
[0278] 缓冲剂C：50mM MES，500mM NaCl，pH6.2
[0279] 缓冲剂D：1.0M NaOH
[0280] 缓冲剂E：0.01M NaOH或20％乙醇
[0281] 阴离子交换层析
[0282] 向从CHT中收集并聚集在一起的组分中以5％的体积比添加1MTris，pH8.0的溶液，产生50mM的最终Tris浓度，所述样本溶液可达到室温(18-23℃)。
[0283] 所述柱包括八(8)ml强阴离子交换体 单片，所述柱在缓冲剂A中被平衡，所述样本溶液通过在线稀释被加载到所述柱上，所述在线稀释为一份样本(由泵A供应)中加入4份缓冲剂A(由泵B供应)。该样本稀释产生的总稀释量为10x的从CHT柱洗脱的体积。用于该步骤的QA单片的期望柱容量约为每毫升单片30mg IgM。所述柱用缓冲剂B冲洗(冲洗1)，然后以95％缓冲剂B，5％缓冲剂C冲洗(冲洗2)。
[0284] 随后使用5CV线性梯度达到52％缓冲剂B，48％缓冲剂C从而洗脱样品，所述柱被置于52％缓冲剂B，48％缓冲剂C中直到所述样本峰被完全洗脱。从前端的10％最大峰高度开始到尾端的10％最大峰高度为止所收集的组分被汇集到一起。可以预期任何残留的聚集物是在尾端被洗脱的。所述柱通过100％的缓冲剂C清洗，产生含有混合了几种污染物的少量IgM的小尖峰，随后产生一连串其他小污染物峰。所述柱在缓冲剂D中清洁并贮存在缓冲剂E中。该中间纯化步骤在不到一个小时内完成。
[0285] 关于中间纯化的注释
[0286] 注意1-2M NaCl可能会实现更好的柱清洗效果。唯一的缺点是需要制备该额外的缓冲剂。所述柱使用Benzonase核酸酶进行临时清洗去除积累的DNA可延长柱寿命(例如，每10次使用，或者当背压变得过大时)。
[0287] 纯化应当尽可能快地进入到下一步骤，以限制产品暴露于尿素中的时间。Tris尿素缓冲剂的碱性pH值增加氨甲酰化的危险，但这通过简短的接触过程抵消。在较早的工艺中，使用pH7的磷酸盐，而所述容量规格也设在该pH值，因此Tris pH8可能能够替代之前的缓冲剂而不降低纯化性能。
[0288] III通过阳离子交换层析进行精细纯化
[0289] 阳离子交换层析在所述阴离子交换层析(如上所述)24小时内开始，且以4ml/min的最小流速在AKTA Explorer 100上执行。
[0290] 阳离子交换层析的条件和试剂
[0291] 介质/柱： 单片(8ml)
[0292] 流速：每分钟高达10CV
[0293] 缓冲剂A：10mM磷酸钠，2M尿素，pH7
[0294] 缓冲剂B：20mM柠檬酸盐，2M尿素，pH6.2
[0295] 缓冲剂C：250mM柠檬酸盐，pH6.2
[0296] 缓冲剂D：1.0M NaOH
[0297] 缓冲剂E：0.01M NaOH或20％乙醇
[0298] 阳离子交换层析
[0299] 一旦开始，采用阳离子交换层析的最终纯化步骤应不中断地完成。
[0300] 样本(从阴离子交换中聚集起来的组分)可达到室温(18-23℃)。所述柱在缓冲剂A中平衡。样本依照1份样本溶液到9份缓冲剂A进行在线稀释，通过在线稀释加载样本。CIM SO3介质的容量显示为约30mg IgM/ml。所述柱以2-5CV缓冲剂A冲洗(冲洗1：2CV就足够了，不超过5CV)，然后以5CV 95％缓冲剂B、5％缓冲剂C冲洗(冲洗2)，该冲洗形成一小峰。
[0301] 样本使用5CV线形梯度达到60％缓冲剂B、40％缓冲剂C洗脱，然后所述柱被置于60％缓冲剂B、40％缓冲剂C中直到所述样本峰被完全洗脱。从前端的10％最大峰高度开始到尾端的10％最大峰高度为止所收集的组分被汇集到一起。洗脱的IgM是清澈的。可以预期任何残留的聚集物是在尾端被洗脱的。pH7 500mM的磷酸盐溶液以10％的体积比被添加到所述聚集起来的组分中，以增加所述pH值，所述溶液被储存在4℃下。所述柱用缓冲剂B清洗，该清洗形成一小峰。所述柱在缓冲剂D中清洁并贮存在缓冲剂E中。
[0302] 关于精细纯化的注释
[0303] 所述IgM应当在纯化后不久，进行再次过滤去除尿素形成最终配液
[0304] 实施例6.LM1纯化程序
[0305] 通过使用LM1替代实施例5的工艺中的SAM6执行所述LM1纯化程序，同时对所使用的缓冲剂作出一定调整。在使用阴离子交换层析的所述中间纯化中，缓冲剂A和B如下制备：
[0306] 缓冲剂A：50mM Tris，2M EDTA，pH8.0
[0307] 缓冲剂B：10mM磷酸钠，2M尿素，pH7.0
[0308] 在采用阳离子交换层析步骤的精细纯化中，省略所述第二冲洗，缓冲剂B、缓冲剂B和C的混合物被下面的缓冲剂B所替代：500mM磷酸钠，pH7。所述洗脱步骤采用5CV线形梯度达到15％缓冲剂B(75ml磷酸盐)执行。从10％最大峰值到所述峰值后的25％pf最大峰值进行聚集。添加NaCl到0.1M浓度以稳定所述抗体并抑制聚合。
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