专利汇可以提供一种重组人源性抗乙肝表面抗原(HBsAg)Fab抗体及其制取方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供一种用作人乙肝表面 抗体 的重组人源性抗乙肝表面 抗原 (HBsAg)Fab抗体及其制取方法。上述重组人源性抗HBsAg抗体的制备方法为:利用 噬菌体 展示技术,获得一株人源性抗HBsAg Fab 片段 的基因,在原核表达系统中进行表达。在此 基础 上,利用PCR技术将Fab的轻重链基因扩增出来,构建到甲醇 酵母 表达载体中,两步法转化酵母,构建Fab工程菌,分泌表达生产Fab抗体片段。对该抗体结合活性进行的研究显示,该Fab抗体具有较强的HBsAg结合活性和抗原特异性。该基因的表达产物在临床的肝病 治疗 中具有较高应用价值。,下面是一种重组人源性抗乙肝表面抗原(HBsAg)Fab抗体及其制取方法专利的具体信息内容。
1.人源性抗HBsAg Fab抗体片段基因,其特征在于包括下述序列结构:人源性抗HBsAg Fab重链(Fd链)基因序列:CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGACATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGCTGGGGGGGCAGCAGCTGGTACGGGGACGGCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTAGC人源性抗HBsAg Fab轻链(k链)基因序列:GACATTGTGTTGACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTTCAGGGGAAGGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAACGGCCAATTAACCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCACCAGTATGATGGCTCCCCGGAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAATCGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGATCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
2.一种用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg Fab抗体,具有如下的序列结构:人源性抗HBsAg Fab抗体重链氨基酸序列:FEQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAGGAAAGTGTAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTS人源性抗HBsAg Fab抗体轻链氨基酸序列:DIVLTQSPGTLSLSSGEGATLSCRASQSVSNGQLTWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYDGSPETFGQGTKVEINRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLRSPVTKSFNRGEC
3.一种用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg抗体,其等电点为7.0-7.6,分子量为50KD,重组人源性抗HBsAg Fab抗体对HBsAg具有较强的中和作用。
4.根据权利要求1、2或3所述的重组人源性抗HBsAg抗体,其中所述抗体具有轻度的糖基化,SDS-PAGE和Western Blotting分析中,在分子量28KD附近有两条特异蛋白带,非还原处理的SDS-PAGE结果显示,在45KD附近有一条特异的蛋白带。
5.权利要求1所述的人源性抗HBsAg Fab抗体片段基因的制取方法,包括如下步骤:1)对乙肝疫苗志愿者加强免疫注射后取血,分离淋巴细胞,提取mRNA,反转录合成cDNA;2)用引物PCR扩增出抗HBsAg抗体的轻链基因和重链Fd的段基因,分别插入到载体pComb3H的相应位点构建含有抗体轻链和重链Fd段的载体质粒;3)用该质粒转化XL1-Blue,重组菌体在培养基中培养后加入噬菌体培养过夜,其上清即为噬菌体抗体库。
6.根据权利要求5所述的人源性抗HbsAg Fab抗体片段基因的制取方法,其中所述引物为:重链(VH)5’引物:VH1a CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGGGVH1f CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGGVH2f CAGGTGCAGCTACTCGAGTCGGGVH3a GAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGGVH4f CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGGVH4g CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGGVH6a VAGGTACAGCTCGAGCAGTCAGG重链3’引物:CG1a GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGGCG2a CTCGACACTAGTTTTGCGCTCAACTGTCTTCG3a TGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGGGTTTTCG4a GCATGAACTAGTTGGGGGACCATATTTGGAK链5’引物;V1a GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCAV2a GATATTGAGCTCACTCAGTCTCCAV3a GAAATTGAGCTGACGCAGTCTCCAK链3’引物:GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGATCTCAG
7.根据权利要求5所述的人源性抗HBsAg Fab抗体片段基因的制取方法,其中PCR的扩增包括:取反应物为模板,10倍的PCR缓冲液,1.5ul的0.1mM dNTP,1.2ul的20uM不同组合的3’,5’端引物,0.5ul的Vent DNA聚合酶,12.75ul的双蒸水;反应30个循环,反应产物用1.2%琼脂糖电泳回收;其中噬菌体抗体的筛选为:向预先包被HBsAg的微孔板内,每孔加入全套抗体库液50ul,37℃温育2小时,弃上清,用适量的0.5%Tween20的TBS清洗数遍;每孔加入50ul洗脱缓冲液,吸出孔内液体,室温放置10min,用适量的2mol/L Tris调PH至中性;用洗脱液感染2ml新鲜制备的XL1-blue,培养6-8小时,加辅助噬菌体VSM继续培养过夜,重新获得噬菌体,重复上述步骤,3轮筛选后收集感染的细菌,提取含Fab抗体基因双链噬菌体DNA。
8.权利要求2、3或4所述的人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg抗体的制取方法,包括如下步骤:1)利用噬菌体展示技术,获得一株人源性抗HBsAg Fab片段的基因;2)在原核表达系统中表达人源性抗HBsAg Fab片段的基因;3利用PCR技术将Fab的轻重链基因扩增出来,构建到甲醇酵母表达载体中;4)两步法转化酵母,构建Fab工程菌,分泌表达生产Fab抗体片段。
9.根据权利要求8所述的方法,其中:a)利用噬菌体展示技术,获得一株人源性抗HBsAg Fab片段的基因所采用的方法为:1)对乙肝疫苗志愿者加强免疫注射后取血,分离单核细胞,提取mRNA,反转录合成cDNA;2)用引物PCR扩增出抗HBsAg抗体的轻链基因和重链Fd的段基因,分别插入到载体pComb3H的相应位点构建含有抗体轻链和重链Fd段的载体质粒;3)用该质粒转化XL1-Blue,重组菌体在培养基中培养后加入噬菌体培养过夜,其上清既为噬菌体抗体库;b)在原核表达系统中进行表达人源性抗HBsAg Fab片段的基因并利用PCR技术将Fab的轻重链基因扩增出来,构建到甲醇酵母表达载体中采用如下方法:以阳性克隆为模板,在反应缓冲液中加入3’、5’端引物、聚合酶反应,反应产物用1.2%聚丙酰胺电泳回收,将H、L链的PCR产物回收酶切,分别插入到克隆载体pGEM-7Zf的相应酶切窗口上,构建H、L链基因的克隆载体,EcoR I和Xba I双酶切出重链基因片段,连接到载体pPICZα的强启动子PAOXI下游的相应酶切窗口上构建酵母表达载体pPICZα-A-H,BamH I和EcoR I双酶切出轻链基因片段,插入到载体质粒pPIC9K强启动子PAOXI下游的BamH I+EcoR I酶切窗口中,构建表达载体pPIC9K-L。c)两步法转化酵母,构建Fab工程菌,分泌表达生产Fab抗体片段工程菌的构建采用下述方法:表达载体pPIC9K-L转化Pastoris pichia酵母GS115、G418抗性平板筛选重组酵母,得到表达Fab L链基因的重组酵母,分别挑取筛选出的多拷贝重组子单菌落,接种到BMGY培养基中,28℃培养至OD600约为5-6左右,离心收菌,重悬于BMMY培养基中进行甲醇诱导培养,培养上清液进行SDS-PAGE和Western Blotting分析;再以此表达量最高的重组酵母为宿主菌,将表达载体pPICZα-A-H转入,用Zeocin抗性板筛选得到Fab工程菌;分别挑取筛选出的多拷贝重组酵母GS115/Fab的单菌落,接种到BMGY培养基中,28℃培养至OD600约为5-6左右,离心收菌,重悬于BMMY培养基中进行甲醇诱导培养;其中的重组Fab抗体酵母工程菌的发酵工艺为:从新鲜YPD,I%yeast extract,2%葡萄糖,2%琼脂粉]平板挑重组人源性抗HBsAg Fab抗体酵母工程菌GS115/Fab23或GS115/Fab51单菌落接种于100ml种子培养基中,30℃振荡培养20-24小时备用;按10%接种量接入2.5L发酵基础培养基中,5L发酵罐内,用氨水调PH至5-6;发酵开始搅拌转速为500rpm,30C恒温发酵。当溶氧加速上升时,开始流加补料生长培养基,流加速率维持溶氧大于20%;当光密度OD600为150-250左右时,停止补料,甘油耗尽后流加发酵诱导培养基。通过调节转速、罐压、通气量和甲醇流加速率使溶氧大于20%;发酵液的甲醇浓度控制在10g/L,诱导发酵100小时左右;经分析发酵上清总蛋白达到2.2g/L,目的蛋白约占总蛋白的19.3%。
10.根据权利要求8或9所述的方法,还包括对表达产物Fab抗体的纯化,所述纯化步骤包括:诱导表达的培养上清液先用(NH4)2SO4沉淀,脱盐后用羊抗人Fab偶联的HiTrap抗体柱进行亲和纯化,用0.1mol/L的Tris.Cl平衡,流速1ml/min,1小时后上样,上样完后改用10倍柱体积0.1mol/L的Tris.Cl缓冲液洗涤,再用10倍柱体积的0.01mol/L的Tris.Cl的缓冲液进行洗涤,将杂蛋白全部洗出后改用0.1mol./L的Gly缓冲液进行洗脱,280nm检测洗脱蛋白峰,收集蛋白峰;SDS-PAGE电泳鉴定,纯化的Fab抗体的纯度达到90%以上;将亲和纯化的Fab抗体进一步做分子筛层析纯化;用0.01mol/L Tris.Cl缓冲液平衡,流速0.6ml/min,上样后用同样的缓冲液进行洗脱,280nm检测蛋白峰,收集目的蛋白峰;SDS-PAGE电泳鉴定,纯化的Fab抗体的纯度可达到95%以上;或者首先制备鼠抗HBs ScFv单克隆抗体:用与该Fab抗体基因序列同源的ScFv抗体免疫小鼠制备单克隆抗体;将与Fab抗体基因序列同源的ScFv与完全弗式佐剂混合,注射于BALB/C雌小鼠腹股沟皮下,两周后同部位再注射一次,于第一次注射后0天检测小鼠组中抗ScFv抗体的滴度。将免疫成功的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以1∶5比例在聚乙二醇条件下进行融合;以有限稀释液将杂交瘤细胞克隆,第二次克隆后阳性率应达100%,再行二次克隆后,分离到13株能分泌抗ScFv单抗的杂交瘤细胞;选用抗HBs ScFv的14F7单克隆抗体细胞株,注射BALB/C小鼠腹腔进行单克隆抗体扩增,收获的腹水经辛酸纯化法纯化,用于制备14F7亲和层析柱;然后制备14F7亲和层析柱:①将初步纯化的鼠抗HBs ScFv MAb 14F7置于偶联缓冲液中透析平衡;②装置5mL HiTrapTMNHS activatited Sepharose HP柱,3×10ml冰冷1mmol/L HCl洗柱,流速0.5ml/min,洗脱柱上的异丙醇;③注入5~10ml MAb 14F7溶液,25℃吸附30min;④灭活缓冲液A、B交替洗柱,洗脱非特异性结合抗体并灭活未结合的活化基团;⑤中和缓冲液至pH中性,4℃保存备用;14F7亲和层析柱纯化重组Fab抗体先用再生缓冲液洗柱,0.1mol/L PH8.0的磷酸缓冲液平衡,再将脱盐样品直接从进样口上样,接着用0.1mol/L PH8.0、0.01mol/L PH8.0磷酸缓冲液分别洗去杂蛋白,最后用0.1mol/L甘氨酸-HCl洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱下来;收集样品洗脱液,将有目的蛋白的样品洗脱液分部收集并进行SDS-PAGE检测;薄层扫描分析显示,用14F7亲和层析柱纯化的重组Fab抗体的纯度可达98%左右,纯化的回收率可达70-85%;或者采用离子交换层析柱纯化重组Fab抗体步骤如下:①样品先过阴离子柱Buffer为0.01M PB,PH为6.5,收集穿流峰,即上样峰;②将收集的阴离子柱的穿流峰过阳离子柱,缓冲液为0.01M PB,PH为6.5,用1M NaCL洗脱,收集目的峰;薄层扫描分析显示,纯化的Fab抗体纯度达95%以上。
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