脂肪酸及其在与生物分子缀合中的用途
阅读：482发布：2023-01-22
专利汇可以提供脂肪酸及其在与生物分子缀合中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了包含经由连接基与 脂肪酸 连接的 生物 分子的缀合物，其中所述脂肪酸具有如下的式A1、A2或A3：其中R1、R2、R3、R4、Ak、n、m和p如本文定义。本发明还涉及本发明的缀合物如GDF15缀合物的制备方法及其 治疗 用途 如治疗或 预防 代谢障碍或 疾病 、2型糖尿病、肥胖、胰腺炎、血脂异常症、酒精性和非酒精性脂肪肝疾病/脂肪性 肝炎 和其它进行性肝疾病、抗胰岛素性、高胰岛素血、葡糖耐受不良、高血糖、代谢综合征、 高血压 、心 血管疾病 、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中 风 、心 力 衰竭、冠心病、糖尿病并发症(包括但不限于慢性肾病)、神经病、胃轻瘫和其它代谢障碍。本发明还提供了药理学活性剂的组合产品和药物组合物。，下面是脂肪酸及其在与生物分子缀合中的用途专利的具体信息内容。
1.包含经由连接基与脂肪酸连接的生物分子的缀合物，其中所述脂肪酸具有如下的式A1、A2或A3：
R1是CO2H或H；
R2、R3和R4相互独立地是H、OH、CO2H、-CH＝CH2或-C＝CH；
Ak是支链C6-C30亚烷基；
n、m和p相互独立地是6至30的整数；或其酰胺、酯或可药用盐。
2.根据权利要求1的缀合物，其中所述脂肪酸选自：
3 4 5 6 7 5 6
其中Ak、Ak 、Ak、Ak 和Ak独立地是(C8-20)亚烷基，R 和R独立地是(C8-20)烷基，或其酰胺、酯或可药用盐。
3.根据权利要求1或2的缀合物，其中所述脂肪酸选自：
其中Ak2是线性C8-C20亚烷基；或其酰胺、酯或可药用盐。
4.根据权利要求1、2或3的缀合物，其中连接基包含烷基、链烯基、环烃基、芳基、杂芳基、杂环基、聚乙二醇、一种或多种天然或非天然氨基酸或其组合，其中烷基、链烯基、环烃基、芳基、杂芳基、杂环基、聚乙二醇和/或天然或非天然氨基酸各自任选地组合和连接在一起或连接至生物分子和/或连接至脂肪酸部分，所述连接经由选自-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)-O-、＝NH-O-、＝NH-NH-或＝NH-N(烷基)-的化学基团；或其酰胺、酯或可药用盐。
5.根据权利要求1至4任一项的缀合物，其中连接基包含下式的非支链低聚乙二醇部分：
其中y是0至34；或其酰胺、酯或可药用盐。
6.根据权利要求1至5任一项的缀合物，其中连接基包含下式的杂环部分：
其中r是0至2的整数且s是0至3的整数；或其酰胺、酯或可药用盐。
7.根据前述权利要求任一项的缀合物，其中连接基包含一种或多种氨基酸，所述氨基酸独立地选自组氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺和甘氨酸；或其酰胺、酯或可药用盐。
8.根据前述权利要求任一项的缀合物，其中所述生物分子选自：1)人生长分化因子15(GDF15)或其同系物、变体、突变体、片段及其其它修饰形式或二聚体；2)APJ激动剂肽、3)催产素受体激动剂肽、4)serelaxin、5)NPFF、6)PIP肽、7)FGF23肽、8)AgRP肽和9)siRNA；或其酰胺、酯或可药用盐。
9.根据权利要求1或2的缀合物，其中经由连接基与脂肪酸连接的生物分子具有下式之一：
其中在式C和D中，his-hGDF15的两个单体单元或hGDF15*的两个单体单元在两个N-末端经由连接基与脂肪酸部分连接；或
其中在式E和F中，his-hGDF15的仅一个单体单元或hGDF15*的仅一个单体单元在N-末端经由连接基与脂肪酸部分连接；和
其中hGDF15*是hGDF15，其中N-末端的2或3个氨基酸已经分别被氨基酸序列XH-或XHX’-所替换，
其中H是组氨酸且X和X’独立地选自M和A；和
其中his-hGDF15是hGDF15，其中包含1至6个组氨酸氨基酸和任选的1或2个甲硫氨酸氨基酸的标签已经被加至hGDF15的N-末端；且
s是20和30之间的整数；且
其中his-hDGF152的2个单体单元或hGDF15*的2个单体单元之间的线表示二硫键。
10.包含具有式C的权利要求9的缀合物和具有式E的权利要求9的缀合物的混合物或者包含具有式D的权利要求9的缀合物和具有式F的权利要求9的缀合物的混合物。
11.根据前述权利要求任一项的缀合物，其中所述生物分子是MH(199-308)hGDF15、MHA(200-308)hGDF15、AHA(200-308)hGDF15或AH(199-308)GDF15；或其二聚体。
12.根据权利要求9或11的缀合物，其中经由连接基与脂肪酸连接的生物分子具有式G或式H：
其中AHA-hGDF15是SEQ ID NO:7，且脂肪酸在1个或2个单体单元的N-末端经由连接基连接，且其中两个AHA-hGDF15单元之间的线表示二硫键。
13.包含具有式G的权利要求12的缀合物和具有式H的权利要求12的缀合物的混合物。
14.根据前述权利要求任一项的缀合物，其中脂肪酸部分经由连接基与肽或蛋白质的N-末端连接；或其酰胺、酯或可药用盐。
15.根据前述权利要求任一项的缀合物，其中缀合物具有多于10小时、多于20小时或多于30小时的血浆稳定性半衰期。
16.根据前述权利要求任一项的缀合物，其中血浆稳定性的改善与非缀合生物分子相比是2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或75倍。
17.在需要其的受治疗者中治疗或预防选自代谢障碍或疾病、2型糖尿病、肥胖、胰腺炎、血脂异常症、酒精性和非酒精性脂肪肝疾病/脂肪性肝炎和其它进行性肝疾病、抗胰岛素性、高胰岛素血、葡糖耐受不良、高血糖、代谢综合征、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、糖尿病并发症(包括但不限于慢性肾病)、神经病、胃轻瘫和其它代谢障碍的疾病或障碍的方法，该方法包括给所述受治疗者施用治疗有效量的权利要求1至9、11、12和14-16任一项的缀合物；或权利要求10或13的缀合物的混合物，或其酰胺、酯或可药用盐，其中所述生物分子是人生长分化因子15(GDF15)、其同系物、变体、突变体、片段和其它修饰形式。
18.根据权利要求17的方法，其中GDF15突变体选自MH(199-308)hGDF15、MHA(200-308)hGDF15、AHA(200-308)hGDF15、AH(199-308)GDF15、MHHHHHHM-hGDF15和MHHHHHH-hGDF15或其二聚体。
19.根据权利要求1至9、11、12和14-16任一项的缀合物或根据权利要求10或13的缀合物的混合物，或其酰胺、酯或可药用盐，用作药剂。
20.根据权利要求1至9、11、12和14-16任一项的缀合物或根据权利要求10或13的缀合物的混合物，或其酰胺、酯或可药用盐，其中所述生物分子是人生长分化因子15(GDF15)、其同系物、变体、突变体、片段和其它修饰形式，用于治疗或预防代谢障碍或疾病、糖尿病、2型糖尿病、肥胖、胰腺炎、血脂异常症、酒精性和非酒精性脂肪肝疾病/脂肪性肝炎和其它进行性肝疾病、抗胰岛素性、高胰岛素血、葡糖耐受不良、高血糖、代谢综合征、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、糖尿病并发症(包括但不限于慢性肾病)、神经病、胃轻瘫和其它代谢障碍。
21.组合产品，包含治疗有效量的根据权利要求1至9、11、12和14-16任一项的缀合物或根据权利要求10或13的缀合物的混合物，或其酰胺、酯或可药用盐，其中所述生物分子是人生长分化因子15(GDF15)、其同系物、变体、突变体、片段和其它修饰形式；和一种或多种治疗活性共用药物。
22.根据权利要求21的组合产品，其中共用药物选自抗糖尿病剂、降血脂剂、抗肥胖剂、抗高血压剂和过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂。
23.根据权利要求22的组合产品，其中共用药物选自胰岛素、胰岛素衍生物和模拟物；
胰岛素促分泌剂；格列本脲、亚莫利阿玛尔；促胰岛素磺酰脲受体配体；噻唑啉二酮药物、吡格列酮、巴格列酮、利格列酮、netoglitazone、曲格列酮、恩格列酮、环格列酮、adaglitazone、达格列酮、胆固醇脂转移蛋白(CETP)抑制剂、GSK3(糖原合酶激酶-3)抑制剂；RXR配体；钠依赖性葡萄糖协同转运蛋白抑制剂；糖原磷酸化酶A抑制剂；双胍；α-糖苷酶抑制剂、GLP-1(高血糖素样肽-1)、GLP-1类似物、GLP-1模拟物；DPPIV(二肽基肽酶IV)抑制剂、3-羟基-3-甲基-戊二酰基辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂；鲨烯合酶抑制剂；FXR(farnesoid X受体)、LXR(肝X受体)配体；考来烯胺；贝特类药物；烟酸、阿司匹林；奥利司他或利莫那班；髓袢利尿剂、呋塞米、托塞米；血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；Na-K-ATP酶膜泵抑制剂；中性内肽酶(NEP)抑制剂；ACE/NEP抑制剂；血管紧张素II拮抗剂；肾素抑制剂；β-肾上腺素能受体阻断剂；影响收缩力的物质、多巴酚丁胺、米力农；钙通道阻断剂；醛固酮受体拮抗剂；醛固酮合酶抑制剂；非诺贝特、吡格列酮、罗西格列酮、替格他唑、BMS-298585和L-796449。
24.药物组合物，包含治疗有效量的根据权利要求1至9、11、12和14-16任一项的缀合物或根据权利要求10或13的缀合物的混合物或其酰胺、酯或可药用盐和一种或多种可药用载体。
25.下式化合物：
R1是CO2H或H；
R2和R3相互独立地是H、OH、CO2H、-CH＝CH2或-C＝CH；条件是R2和R3不相同；
R4是CO2H；
n和m相互独立地是6至30的整数；或其酰胺、酯或可药用盐。
26.根据权利要求25的化合物，其中化合物具有式A1，其中R2和R3中至少一个是CO2H。
27.根据权利要求25或26的化合物，选自：
脂肪酸及其在与生物分子缀合中的用途
发明领域
[0001] 本发明涉及GDF15的新的缀合物及其制备方法和使用方法，所述缀合物具有改善的半衰期和作用持续时间。本发明还涉及新的脂肪酸及其经由缀合在延长生物分子的半衰期中的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 肽和蛋白质被广泛用于医药实施中，由于它们可以通过重组DNA技术产生，所以可以预期，它们的重要性在未来数年将会增加。同样作为正在进行的人基因组研究的结果，已知的具有令人感兴趣的生物活性的内源性肽和蛋白质的数量正在快速增加。由于它们的生物活性，这些多肽和蛋白质中有许多原则上可用作治疗剂。然而，内源性肽或蛋白质不是总是适宜用作候选药物，因为它们经常由于被肽酶快速降解和/或由于肾过滤和尿排泄而具有数分钟的半衰期。多肽或蛋白质在人血浆中的半衰期的变化是非常大的(从数分钟至多于一周)。
[0004] 治疗剂的高清除率在希望历经延长时间段维持其高血液水平的情况中是不便的。目前已经用于克服这种缺陷的一种方式是给患者施用大剂量的感兴趣的治疗性肽或蛋白质，以便即使一些治疗性肽或蛋白质被降解，仍然有足够的治疗性肽或蛋白质保持为治疗活性的。但是，这种方法对于患者是不舒适的。由于大多数治疗性肽或蛋白质不能口服施用，治疗性肽或蛋白质将必须被连续输注，经常通过静脉内注射来输注，或者经常通过不方便的皮下注射途径来施用。经常施用的需求还导致很多潜在的肽或蛋白质治疗剂具有不可接受的高的预计治疗成分。存在大量降解的肽或蛋白质还可以产生不期望的副作用。
[0005] 施用不适和高成本是大多数具有吸引人的生物活性性质的治疗性肽或蛋白质不能被开发为候选药物的两个原因。
[0006] 因此，延长肽或蛋白质的半衰期的一种途径是以延缓其降解而仍然保持其生物学活性的方式修饰治疗性肽或蛋白质。血清白蛋白具有多于一周的半衰期，增加肽或蛋白质的血浆半衰期的一种途径已经用结合血清白蛋白或其它血浆蛋白质的化学实体将它们进行衍生化。
[0007] 然而，仍然需要鉴别出新的半衰期延长部分来修饰治疗性生物分子如肽和蛋白质以提供较长的体内作用持续时间并同时维持低毒性和治疗益处。
[0008] 发明简述
[0009] 本发明涉及包含经由连接基与脂肪酸连接的生物分子的缀合物，其中所述脂肪酸具有如下的式A1、A2或A3：
[0010]
[0011] R1是CO2H或H；
[0012] R2、R3和R4相互独立地是H、OH、CO2H、-CH＝CH2或-C＝CH；
[0013] Ak是支链C6-C30亚烷基；
[0014] n、m和p相互独立地是6至30的整数；或其酰胺、酯或可药用盐。
[0015] 已经发现，式A1、A2和A3脂肪酸当经由连接基与感兴趣的生物分子缀合时增加所述生物分子的半衰期的程度比更常用的脂肪酸残基高得多。
[0016] 在另一项实施方案中，本发明涉及包含与式A1脂肪酸连接的生物分子的缀合物，其中R2和R3中至少一个是CO2H。
[0017] 在本发明的另一项实施方案中，感兴趣的生物分子是治疗性肽、治疗性蛋白质或RNA。在该实施方案的另一方面，感兴趣的生物分子是肽或多肽。在该实施方案的还一个方面，肽或多肽是APJ激动剂肽、催产素受体激动剂肽、serelaxin、NPFF、PIP肽、FGF23肽、AgRP肽或生长分化因子15(GDF15)蛋白质及其同系物、变体、片段和其它修饰形式。
[0018] 在另一项实施方案，本发明涉及包含本发明的缀合物和一种或多种可药用载体的药物组合物。
[0019] 在另一项实施方案，本发明涉及包括本发明的缀合物和一种或多种治疗活性剂的药物组合的组合产品。
[0020] 在另一项实施方案中，本发明涉及式A1、A2或A3脂肪酸。
[0021] 在另一项实施方案中，本发明关注了本文所述的缀合物及其组合物用于治疗和/或阻止各种疾病、障碍和病症和/或其症状的用途。
[0022] 例如，本发明涉及在需要其的受治疗者中激活APJ受体的方法，该方法包括：给所述受治疗者施用治疗有效量的本发明的缀合物，其中生物分子是APJ激动剂。经由激活APJ受体，本发明的缀合物可用于治疗急性失代偿性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房纤维性颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、局部缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维变性、心律失常、水滞留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉疾病、脑血管意外、短暂性缺血发作、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症、灼伤(包括晒伤)和先兆子痫。在该实施方案的优选方面，本发明的缀合物可用于治疗急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或慢性心力衰竭。
[0023] 在另一项实施方案中，本发明涉及在需要其的受治疗者中激活催产素受体的方法，该方法包括：给所述受治疗者施用治疗有效量的本发明的缀合物，其中生物分子是催产素受体激动剂肽。经由激活催产素受体，本发明的缀合物可用于治疗孤独症(治疗性或预防性)、偏头痛、注意缺陷多动症(ADHD)、对立违抗性障碍(ODD)、应激、包括创伤后应激性障碍、焦虑、包括焦虑障碍和抑郁、精神分裂症、精神病学障碍和记忆丧失、酒精戒断、药物成瘾、Prader-Willi综合征、代谢性障碍或疾病、2型糖尿病、肥胖、血脂异常症、升高的血糖水平、升高的胰岛素水平和糖尿病性肾病、纤维肌痛、睡眠障碍、睡眠呼吸暂停、舒张期心力衰竭、尿失禁、动脉粥样硬化、高血压、勃起功能障碍、前列腺肥大综合征、非酒精性脂肪肝、泌乳功能受损病症(compromised lactation conditions)、引产病损、子宫张力缺乏病症、过量流血、炎症、疼痛、腹痛、背痛、男性和女性性功能障碍、肠易激惹综合征(IBS)、便秘、胃肠梗阻、外科手术失血、产后出血、创伤愈合、感染、乳腺炎、胎盘娩出损害、骨质疏松症；用于诊断癌症和胎盘功能不全。在该实施方案的优选方面，本发明的缀合物可用于治疗孤独症、焦虑、包括焦虑障碍和抑郁、偏头痛、ADHD、对立违抗性障碍、精神分裂症、精神病学障碍、肥胖、泌乳功能受损病症、引产病损、子宫张力缺乏病症、过量流血、产后出血。在更优选的实施方案中，本发明的缀合物可用于治疗Prader-Willi综合征。
[0024] 在另一项实施方案、本发明涉及治疗Cushing’s综合征、皮质醇增多症、异位ACTH综合征、肾上腺皮质质量变化、原发性色素结节性肾上腺皮质病(PPNAD)、Carney综合征(CNC)、皮质醇诱导的盐皮质激素过量、与创伤后应激障碍相关的病症、多毛症、薄皮肤、肌病、骨质疏松症、组织脆性增加、创伤愈合不佳、高血压、糖尿病、低血清钾、低嗜酸性粒细胞和淋巴细胞减少的方法，该方法包括：给所述受治疗者施用治疗有效量的本发明的缀合物，其中生物分子是AgRP肽。在该实施方案的优选方面，本发明的缀合物可用于治疗Cushing’s综合征、皮质醇增多症、异位ACTH综合征、骨质疏松症。
[0025] 在另一项实施方案中，本发明涉及治疗或预防FGF23-相关性疾病如年龄相关性病症(选自少肌症(sarcopenia)、皮肤萎缩、肌萎缩、脑萎缩、动脉粥样硬化、动脉硬化、肺气肿、骨质疏松症、骨关节炎、免疫无活性、高血压、痴呆、亨廷顿病、阿尔茨海默病、白内障、年龄相关性黄斑变性、前列腺癌、中风、预期寿命减少、记忆丧失、皱纹、肾功能受损和年龄相关性听力损失)、代谢障碍(选自II型糖尿病、代谢综合征、高血糖和肥胖)、高磷酸盐血(肿瘤样钙质沉着、高磷酸盐血骨肥厚综合征)、慢性肾病、慢性肾衰、癌症、乳癌和/或肌萎缩的方法，该方法包括：给所述受治疗者施用治疗有效量的本发明的缀合物，其中生物分子是FGF23肽。
[0026] 在另一项实施方案、本发明涉及治疗急性心力衰竭、射血分数降低的慢性心力衰竭(HFrEF)、射血分数正常的慢性心力衰竭(HFpEF)、舒张期功能障碍、心肌梗塞后重塑(post myocardial remodeling)、绞痛、高血压、肺高压、肺动脉高压、纤维变性(弥散性纤维变性、心纤维变性、肾纤维变性、肺纤维变性、肝纤维变性)、硬皮病、创伤愈合、临界性肢体缺血、外周血管病、间歇性跛行、肾功能不全和慢性肾病的方法，该方法包括：给受治疗者施用治疗有效量的本发明的缀合物，其中生物分子是serelaxin肽。在该实施方案的优选方面，本发明的serelaxin缀合物可用于治疗急性心力衰竭、射血分数降低的慢性心力衰竭(HFrEF)、射血分数正常的慢性心力衰竭(HFpEF)、舒张期功能障碍、心肌梗塞后重塑、绞痛、高血压、肺高压或肺动脉高压。
[0027] 在另一项实施方案、本发明涉及治疗或预防代谢障碍如2型糖尿病(T2DM)、胰脏β细胞受损、葡糖耐受不良、高血糖、抗胰岛素性、肥胖、血脂异常症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、代谢综合征和其它代谢障碍的方法，该方法包括：给受治疗者施用治疗有效量的本发明的缀合物，其中生物分子是PIP肽。
[0028] 在另一项实施方案、本发明涉及治疗或预防代谢障碍或疾病、2型糖尿病、肥胖、胰腺炎、血脂异常症、非酒精性脂肪性肝炎、抗胰岛素性、高胰岛素血、葡糖耐受不良、高血糖、代谢综合征、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、糖尿病并发症(包括但不限于慢性肾病)、神经病、胃轻瘫、欲望性尿失禁、镇静、神经性和炎性痛、记忆丧失和其它代谢障碍的方法，该方法包括：给受治疗者施用治疗有效量的本发明的缀合物，其中生物分子是NPFF肽。
[0029] 在本发明的另一方面，本发明涉及在需要其的受治疗者中治疗代谢障碍或疾病、糖尿病、2型糖尿病、肥胖、酒精和非酒精性脂肪肝疾病/脂肪性肝炎和其它发展性肝疾病、胰腺炎、血脂异常症、抗胰岛素性、高胰岛素血、葡糖耐受不良、高血糖、代谢综合征、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、糖尿病并发症(包括但不限于慢性肾病)、神经病、胃轻瘫和其它代谢障碍的方法，该方法包括：给所述受治疗者施用治疗有效量的本发明的缀合物，其中生物分子是人生长分化因子15(GDF15)、其同系物、变体、突变体、片段和其它修饰形式。
[0030] 在随后的发明详述中将阐述本发明的这些和其它方面。
[0032] 图1显示，实施例24比参比实施例3更有效地降低了血浆APOC3水平。
[0033] 发明详述
[0034] 定义：
[0036] 必须指出，除非上下文另外清楚地指出，否则如本文和所附权利要求书中使用的单数形式的实体、“该”和类似术语包括复数形式。因此，例如，称谓“缀合物”指一种或多种缀合物；称谓“多肽”包括一种或多种多肽的称谓；以此类推。
[0037] 术语烷基指包含1-30个碳原子的完全饱和的支链或非支链(例如直链或线性)烃部分。优选地，烷基包含5-20个碳原子、更优选10-15个碳原子。C10-15烷基指包含10-15个碳的烷基链。术语“亚烷基”指二价的如上文定义的烷基。
[0038] 术语“链烯基”指具有至少一条碳碳双键的支链或非支链烃。术语“C2-30-炔基”指具有2-7个碳原子并且包含至少一条碳碳三键的烃。
[0039] 术语“炔基”指具有至少一条碳碳三键的支链或非支链烃。术语“C2-30-炔基”指具有2-7个碳原子并且包含至少一条碳碳三键的烃。
[0040] 术语“芳基”指在环部分中具有6-10个碳原子的单环或双环芳族烃基。芳基的代表性实例有苯基或萘基。
[0041] 术语杂芳基包括单环或双环杂芳基，含有5-10个选自碳原子和1-5个杂原子的环成员，每个杂原子独立地选自O、N或S，其中S和N可以被氧化为各种氧化态。对于双环杂芳基系统，该系统为完全芳香性的(即，所有环为芳香性的)。
[0042] 术语环烃基指具有3-12个碳原子、优选3-8个或3-7个碳原子的饱和或不饱和、但是是非芳香性的单环、双环或三环烃基团。对于双环和三环环烃基系统，所有环是非芳香性的。例如，环烃基包括环烯基和环炔基。术语“环烯基”指具有至少一条碳碳双键的3-12个碳原子的双环或三环烃基团。术语“环炔基”指具有至少一条碳碳三键的3-12个碳原子的双环或三环烃基团。
[0043] 术语杂环基指含有至少一个选自O、S和N的杂原子的饱和或不饱和非芳族(部分不饱和，但是是非芳香性的)单环、双环或三环环系，其中N和S可以任选被氧化为各种氧化态。在一项实施方案中，杂环基部分表示含有5-7个环原子和任选含有选自O、S和N的另外杂原子的饱和单环。杂环可以被烷基、卤素、氧代基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基取代。在另一项实施方案中，杂环是双环或三环。对于多环系统，某个环可以是芳族的和与一个或多个饱和或部分饱和的环稠合。整个稠合系统不是完全芳香性的。例如，杂环系统可以是与饱和或部分饱和环烃基环系稠合的芳族杂环。
[0044] 术语“缀合物”意欲指生物分子与脂肪酸部分经由连接基共价连接形成的实体。术语“缀合”指产生生物分子和脂肪酸部分的共价连接的化学反应。
[0045] 生物分子:
[0046] 如本文所用的术语生物分子包括但不限于抗体(例如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、纳米抗体及其片段等)、胆固醇、激素、肽、蛋白质、化学治疗剂和其它类型的抗肿瘤剂、低分子量药物、维生素、辅因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶核酸、反义核酸、三链形成寡核苷酸、反义DNA或RNA组合物、嵌合DNA:RNA组合物、等位酶、适体、核酶、诱杀剂及其类似物、质粒和其它类型的表达载体和小核酸分子、RNAi剂、短干扰核酸(siNA)、信使核糖核酸”(信使RNA、mRNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小-RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子、肽核酸(PNA)、锁定核酸核苷酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、sisiRNA(小内部节段干扰RNA)、aiRNA(不对称干扰RNA)和在正义链和反义链之间具有1个、2个或更多个错配的siRNA(相关细胞和/或组织的那些，例如在细胞组织、受治疗者或生物体中)。这类化合物可以被纯化或部分纯化，可以是天然存在的或合成的，并且可以是化学修饰的。
[0047] 在一项实施方案中，生物分子是多肽、肽、蛋白质或RNAi剂、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小-RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)分子。
[0048] 在另一项实施方案中，生物分子是多肽(或蛋白质)或肽。多肽或肽的实例有APJ激动剂肽、催产素肽、serelaxin、NPFF、PIP肽、FGF23肽、AgRP肽和GDF15肽。在优选的实施方案中，生物分子是GDF15多肽及其同系物、变体、突变体、片段和其它修饰形式。
[0049] “核糖核酸”(RNA)是通过磷酸二酯键连接的核苷酸聚合物，其中每个核苷酸含有核糖或其修饰形式作为糖组分。核苷酸各自含有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或其修饰形式作为碱。mRNA分子中的遗传信息以mRNA分子的核苷酸碱基序列进行编码，其被安排为各自由三个核苷酸碱基组成的密码子。除了结束翻译(蛋白质合成)的终止密码子，每个密码子编码多肽的特定氨基酸。在活细胞内，mRNA被运输至核糖体(合成蛋白质的位置)，在那里其提供了蛋白质合成(翻译)的遗传信息。对于更完整的描述，参见Alberts B等人(2007)Molecular Biology of Cell,第5版,Garland Science。
[0050] 如本文所用的术语“RNAi剂”、“短干扰RNA”、“siRNA”、“短干扰核酸”、“siNA”等指能够通过以序列特异性方式介导RNA干扰(RNAi)或基因沉默来抑制或下调基因表达或病毒复制的任意核酸分子。该术语包括短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、短干扰寡核苷酸、化学修饰的短干扰核酸分子、sisiRNA(小内部节段干扰RNA)、aiRNA(非对称感染RNA)、在正义链和反义链之间具有1个、2个或更多个错配的siRNA(相关细胞和/或组织的那些)、其中在正义链和反义链之间存在一个或多个错配的RNAi剂、其中正义链相对于反义链而言非常短和/或具有一个或多个单链切口的RNAi剂或者能够介导RNA干扰的任意其它分子。RNAi剂可包含核糖核苷酸，或者在一个或多个糖、碱和/或磷酸基上被修饰或取代。作为非限制性的实例，RNAi剂可以在2’位置上被选自如下的2'-修饰所修饰：2'-脱氧基、2'-脱氧基-2'-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)和2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)。在一项实施方案中，所有嘧啶(尿苷和胞苷)为2'-O-甲基-修饰的核苷。在各种实施方案中，一个或多个磷酸基可以被选自如下的经修饰的核苷酸间连接基取代：硫代硫酸酯基、二硫代硫酸酯基、氨基磷酸酯基、硼烷膦酸酯基(boranophosphonoate)和酰胺连接基。在各种实施方案中，一个或多个核苷酸可以被DNA、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、阿拉伯糖核酸(ANA)、2′-氟阿拉伯糖核酸(FANA)、环己烯核酸(CeNA)、失水己糖醇核酸(HNA)、解锁定核酸(UNA)修饰或取代。RNAi剂的各种修饰和取代是本领域已知的，可用于本公开文本的内容中。siRNAs负责RNA干扰，后者为动物和植物中序列特异性转录后基因沉默的过程。siRNA通过核糖核酸酶III裂解由较长的双链RNA(dsRNA)而天然产生，所述双链RNA(dsRNA)与沉默的基因靶标同源或对其特异；人工RNAi剂可以通过本领域已知的任意方法产生。
[0051] 如本文所用的术语"多肽"指通过肽键连接的氨基酸的聚合物，无论是天然的还是合成的。少于约10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。术语“肽”意欲表示通过肽键连接的2个或更多个氨基酸的序列，其中所述氨基酸可以是天然的或非天然的。该术语囊括术语多肽和蛋白质，它们可以由两个或更多个通过共价相互作用如半胱氨酸桥或非共价相互作用结合在一起的肽组成。本领域公认的三字母缩写或一字母缩写用于表示构成本发明的肽或多肽的氨基酸残基。除了当以“D”开头时，氨基酸是L-氨基酸。当所述一字母缩写为大写字母时，其指D-氨基酸。当所述一字母缩写为小写字母时，其指L-氨基酸。基团或字符串或氨基酸缩写用于表示肽。应指出肽的左侧为N-末端，且序列从N-末端至C-末端书写。
[0052] 本发明的肽含有非天然氨基酸(即在自然界中不存在的化合物)，可以供选地采用本领域已知的其它氨基酸类似物。
[0053] 某些非天然氨基酸可以通过如下文献中记载的技术引入：Deiters等人,J Am Chem Soc 125:11782-11783,2003；Wang和Schultz,Science301:964-967,2003；Wang等人,Science 292:498-500,2001；Zhang等人,Science 303:371-373,2004或美国专利7,083,970。简言之，这些表达系统中的一些涉及位置特异性诱变以将无义密码子如琥珀型TAG引入编码本发明的多肽的可读框中。然后，这些表达载体被引入可利用对所引入无义密码子特异的tRNA的宿主中，并加载所选择的非天然氨基酸。有益于将部分与本发明的多肽缀合的具体非天然氨基酸包括具有乙炔和叠氮基侧链的那些。
[0054] "蛋白质"是包含一个或多个多肽链的大分子。那些多肽链的每一个可以与式A1、A2或A3脂肪酸分子缀合。蛋白质还可以包含非肽组分，例如碳水化合物基团。碳水化合物和其它非肽取代基可以通过产生蛋白质的细胞而加入蛋白质中，并且随细胞类型而异。本文根据它们的氨基酸骨架结构定义蛋白质；通常不具体指明取代基如碳水化合物基团，但是它们可以存在。非宿主DNA分子编码的蛋白质或多肽是"异源性"蛋白质或多肽。
[0055] "分离多肽或分离蛋白质"是基本上不含细胞组分如碳水化合物、脂质或其它与天然多肽相关的蛋白质性质的杂质的多肽或蛋白质(例如GDF15)。通常，分离多肽或蛋白质的制备物含有高纯形式、即至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、高于95％纯、例如96％、97％或98％或更纯或高于99％纯的多肽或蛋白质。一种显示特定蛋白质制备物含有分离多肽或蛋白质的方式是在蛋白质制备物的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶的考马斯亮蓝染色后出现单条。但是，术语"分离"不排除供选的物理形式如二聚体或供选的糖基化或衍生化形式的相同多肽或蛋白质的存在。优选地，分离多肽基本上不含在其自然环境中发现的将干扰其治疗、诊断、预防或研究用途的任意其它污染的多肽或其它污染物。
[0056] 本领域技术人员将理解，在本文所述的任意多肽或蛋白质的序列中进行各种氨基酸替换、例如保守氨基酸替换，并且没有必然地降低其活性。如本文所用的“常用作其取代基的氨基酸”包括保守替换(即用具有相当的化学特性的氨基酸替换)。对于保守替换的目的，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性(亲水性)天然氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬氨酸和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。氨基酸替换的实例包括用相应的D-氨基酸替换L-氨基酸、用高半胱氨酸或其它具有含硫醇侧链的非天然氨基酸替换半胱氨酸、用高赖氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、鸟氨酸或其它具有含氨基侧链的非天然氨基酸替换赖氨酸或用正缬氨酸替换丙氨酸等。
[0057] 如本文所用的术语“氨基酸”指天然存在的氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物和以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥功能的氨基酸模拟物，均为它们的D和L立体异构体形式，如果它们的结构允许这样的立体异构形式的话。氨基酸在本文中通过它们的名称、公知的三字母符号或IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission(生物化学命名委员会)推荐的一字母符号来称呼。
[0058] 术语“天然存在”指在自然界中发现的和未经过人处理的材料。类似地，如本文所用的“非天然存在”、“非天然”等指没有在自然界中发现和已经被人类进行结构修饰或合成的材料。当用于与氨基酸联系时，术语“天然存在”指20种常规氨基酸(即丙氨酸(A或Ala)、半胱氨酸(C或Cys)、天门冬氨酸(D或Asp)、谷氨酸(E或Glu)、苯丙氨酸(F或Phe)、甘氨酸(G或Gly)、组氨酸(H或His)、异亮氨酸(I或Ile)、赖氨酸(K或Lys)、亮氨酸(L或Leu)、甲硫氨酸(M或Met)、天冬酰胺(N或Asn)、脯氨酸(P或Pro)、谷氨酰胺(Q或Gln)、精氨酸(R或Arg)、丝氨酸(S或Ser)、苏氨酸(T或Thr)、缬氨酸(V或Val)、色氨酸(W或Trp)和酪氨酸(Y或Tyr)。
[0059] 如本文所用的术语“非天然氨基酸”和“非天然的氨基酸”可互换使用，表示无法使用来自任意生物体的未经修饰或经修饰的基因(无论相同或不同)在任意生物体中以生物合成方式产生的氨基酸结构。这些术语指在天然存在(野生型)的蛋白质序列或本发明的序列中不存在的氨基酸残基。这些包括但不限于不是20种天然存在的氨基酸之一的经修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸(Pyl)或吡咯啉-羧基-赖氨酸(Pcl，例如描述于PCT专利公开WO2010/48582)。此类非天然氨基酸残基可通过替换天然存在的氨基酸和/或通过将非天然氨基酸插入天然存在(野生型)的蛋白质序列或本发明的序列中而引入。还可掺入非天然氨基酸残基以赋予分子以预期的功能，例如，连接官能部分(例如PEG)的能力。当与氨基酸联用时，符号“U”意指如本文所用的“非天然氨基酸”或“非天然的氨基酸”。
[0060] 如本文提及多肽或蛋白质时所用的术语"类似物"指其中肽/蛋白质的一个或多个氨基酸残基已经被其它氨基酸残基替换和/或其中一个或多个氨基酸残基已经从肽/蛋白质中删除和/或其中已经在肽/蛋白质中添加一个或多个氨基酸残基的经修饰的肽或蛋白质。氨基酸残基的这种添加或删除可以在肽的N-末端和/或肽的C-末端发生。
[0061] 如本文所用的术语“缀合物的酯”指其中存在羧酸基团的酯衍生物(例如C-末端的-CO2H已经被转化为-COOR)的包含肽或多肽的缀合物，其中所述酯的R表示C1-6烷基基团如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等、C3-8环烃基基团如环戊基、环己基等、C6-10芳基基团如苯基、α-萘基等、C6-10芳基-C1-6烷基基团、例如苯基-C1-2烷基基团如苄基、苯乙基、二苯甲基等和α-萘基-C1-2烷基基团如α-萘基甲基等。当缀合物的肽或多肽部分在除C-末端以外的位置具有额外的羧基或羧酸酯基团时，其中这些基团被酰胺化或酯化的那些多肽也落入本发明的多肽的范围内。在此种情形下，这些酯可以例如与上文提及的C-末端酯属于相同种类的酯。
[0062] 如本文所用的术语“缀合物的酰胺”指其中存在羧酸基团的酰胺衍生物(例如-CO2H已经被转化为-CO(NR’R’))的包含肽或多肽的缀合物，其中R’是H或R且R如上文所定义。术语“缀合物的酰胺”还指其中存在氨基基团的酰胺衍生物(即不是与脂肪酸缀合的氨基基团)(例如-NH2已经被转化为-NH-C(O)R)的包含肽或多肽的缀合物，其中R如上文所定义。在优选的实施方案中，“缀合物的酰胺”是其中C-末端的羧酸基团已经被酰胺化的包含肽或多肽的缀合物(例如-CO2H已经被转化为-C(O)NH2、-C(O)NH-C1-6烷基、-C(O)NH-C1-2烷基苯基或-C(O)N(C1-6烷基)2)。
[0063] 术语“APJ”(也称为“apelin受体”、“血管紧张素样-1受体”、“血管紧张素II-样1受体”等)表示基因定位于人类11号染色体的长臂上的具有380个残基、7个跨膜结构域的Gi偶联受体(NCBI参考序列号:NP_005152.1，由NCBI参考序列号:NM_005161编码)。APJ是1993年使用简并寡核苷酸引物从基因组人类DNA首次克隆得到的(O'Dowd等人,Gene,136:355-60,1993)，与1型血管紧张素II受体具有显著同源性。尽管具有这一同源性，然而，血管紧张素II不结合APJ。尽管作为孤儿多年，但是已经分离出内源性配体并命名为apelin(Tatemoto等人,Biochem Biophys Res Commun251,471-6(1998))。
[0064] 术语“APJ激动剂”指apelin多肽：Apelin指具有77个残基的前蛋白(NCBI参考序列号:NP_0059109.3，由NCBI参考序列号:NM_017413.3编码)，其被加工成apelin肽的生物活性形式，例如apelin-36、apelin-17、apelin-16、apelin-13、apelin-12。全长成熟肽也称为“apelin-36”，包含36个氨基酸，但最高效亚型为apelin的13聚体(apelin-13)的焦谷氨酸化形式，其被称为“Pyr-1-apelin-13或Pyr1-apelin-13”。不同apelin形式例如描述于美国专利6,492,324B1中。Apelin肽激动剂还描述于专利申请号WO 2013/111110、美国申请号14/082771和美国临时申请号61/858263、61/858280和61/858290中，它们引入本文作为参考。
[0065] 术语“催产素受体激动剂肽”或“催产素肽”可互换使用，包括催产素及其类似物。催产素是9个氨基酸的环肽激素，具有两个半胱氨酸残基在1位和6位形成二硫桥。人催产素包含序列Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly。术语“催产素受体激动剂肽”还包括维持了生物活性的催产素类似物。这种类似物分子能够以与内源性催产素相似的方法发挥作用，包括结合催产素受体。特别感兴趣的催产素类似物是PCT申请WO 2014/095773(特别是实施例13)中公开的那些；美国专利申请号US2011/044905(特别是实施例49)中公开的那些；和Kazimierz Wisniewski等人,Journal of Medicinal Chemistry 2014,57,5306-
5317和Zbigniew Grzonka等人,Journal of Medicinal Chemistry 1983,26,1786-1787中公开的那些；这些文献全部引入本文作为参考。
5317和Zbigniew Grzonka等人,Journal of Medicinal Chemistry 1983,26,1786-1787中公开的那些；这些文献全部引入本文作为参考。
[0066] “PIP”或“促乳素诱导肽”指具有GenBank登记号NP_002643的蛋白质，其在各种生物过程中展示出作用。PIP在本领域还已知为巨囊性病的液状蛋白-15(GCDFP-15)；分泌性肌动蛋白结合蛋白(SABP)；腮腺外糖蛋白(extraparotid glycoprotein,EP-GP)；和17-kDa CD4-结合蛋白(GP17)。PIP在外分泌器官和在良性和恶性人乳腺肿瘤中表达。成熟分泌PIP蛋白质具有13kDa的分子量，其在SDS-PAGE中显示为17-20kDa多肽，提示了糖基化事件。PIP在对人体液有贡献的大多数器官中表达；PIP的表达在唾液腺中是最高的，其次是泪腺、前列腺、肌肉、气管和乳腺。PIP基因编码PIP多肽。
[0067] 如本文所用的“PIP肽”指人PIP或其保持了人PIP的至少一种活性的其同系物、变体、片段或修饰形式。
[0068] 人PIP的非限制性实例的序列如下：SEQ ID NO:11:
[0069] 1 MRLLQLLFRASPATLLLVLCLQLGANKAQDNTRKIIIKNF DIPKSVRPND EVTAVLAVQT[0070] 61 ELKECMVVKT YLISSIPLQG AFNYKYTACL CDDNPKTFYW DFYTNRTVQIAAVVDVIREL[0071] 121 GICPDDAAVI PIKNNRFYTIEILKVE(SEQ ID NO:11)
[0073] 如本文所用的术语“PIP”的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:11的氨基酸(aa)29-146，其因此缺少信号肽(氨基酸1-28)，在下文作为SEQ IDNO:12给出。
[0074] 1 QDNTRKIIIK NFDIPKSVRP NDEVTAVLAV QTELKECMVV KTYLISSIPLQGAFNYKYTA[0075] 61 CLCDDNPKTF YWDFYTNRTV QIAAVVDVIR ELGICPDDAA VIPIKNNRFY TIEILKVE[0076] (SEQ ID NO:12)
[0077] PIP的“同系物”、“变体”、“片段”或“修饰形式”等指与人PIP相似、但是不完全相同的多肽，但是其保持了人PIP的至少一种活性。这种多肽可具有与人PIP的序列(例如SEQ ID NO:12)不完全相同的序列，或者具有与人PIP的序列(例如SEQ ID NO:12)相同的序列、但是以某些其它方式不同(例如翻译后修饰)。这类多肽可以包括例如至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的相对于SEQ ID NO:12的序列一致性，或者具有最多5、10、15、20、25、30、
35、40、45或50个的相对于SEQ ID NO:12的氨基酸序列的氨基酸差异(例如替换、删除和/或添加)。在一些实施方案中，PIP同系物、变体、片段或修饰形式保持至少90％序列一致性或具有最多25个相对于SEQ ID NO:12的氨基酸差异。PIP同系物、变体、片段或修饰形式保持人PIP的至少一种活性。
35、40、45或50个的相对于SEQ ID NO:12的氨基酸序列的氨基酸差异(例如替换、删除和/或添加)。在一些实施方案中，PIP同系物、变体、片段或修饰形式保持至少90％序列一致性或具有最多25个相对于SEQ ID NO:12的氨基酸差异。PIP同系物、变体、片段或修饰形式保持人PIP的至少一种活性。
[0078] “FGF23”或“成纤维细胞生长因子23”指还已知为如下的多肽：FGF-23、ADHR；FGFN；HPDR2；HYPF；PHPTC；内部IDs:OMIM:605380MGI:1891427HomoloGene:10771GeneCards:
FGF23Gene；种属:人；Entrez 8074；Ensembl ENSG00000118972；UniProt:Q9GZV9；RefSeq(mRNA):NM_020638；RefSeq(蛋白质):NP_065689；位置(UCSC):Chr 12:4.48-4.49Mb；种属:
小鼠；Entrez:64654；Ensembl:ENSMUSG00000000182；UniProt:Q9EPC2；RefSeq(mRNA):NM_
022657；RefSeq(蛋白质):NP_073148；位置(UCSC):Chr 6:127.07-127.08Mb。FGF23基因编码FGF23多肽。
FGF23Gene；种属:人；Entrez 8074；Ensembl ENSG00000118972；UniProt:Q9GZV9；RefSeq(mRNA):NM_020638；RefSeq(蛋白质):NP_065689；位置(UCSC):Chr 12:4.48-4.49Mb；种属:
小鼠；Entrez:64654；Ensembl:ENSMUSG00000000182；UniProt:Q9EPC2；RefSeq(mRNA):NM_
022657；RefSeq(蛋白质):NP_073148；位置(UCSC):Chr 6:127.07-127.08Mb。FGF23基因编码FGF23多肽。
[0079] 如本文所用的“FGF23肽”指人FGF23或其保持了人FGF23的至少一种活性的同系物、变体、片段或修饰形式。
[0080] 包括信号肽在内的人FGF23的非限制性实例的序列显示在SEQ ID NO:9中：
[0081]
[0082] SEQ ID NO:9表示了全长人野生型FGF23、包括对功能而言不必需的信号肽(氨基酸1-24)。Yamashita等人,2000Biochem.Biophys.Res.Comm.277:494-498；Shimada等人,2001Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6500-6505；和Zhang等人,2004Protein Sci.13:2819-
2824。
2824。
[0083] 如本文所用的术语“FGF23”的非限制性实例是SEQ ID NO:9的氨基酸(aa)25-251，其因此缺少信号肽(氨基酸1-24)，在下文作为SEQ ID NO:8给出。
[0084]
[0085] FGF23的“同系物”、“变体”、“片段”或“修饰形式”等指与人FGF23(例如SEQ ID NO:8)相似、但是不完全相同的多肽，但是其保持了人FGF23的至少一种活性。这类多肽可以包括例如至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的相对于SEQ ID NO:8的序列一致性，或者具有例如最多5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个的相对于SEQ ID NO:8的氨基酸序列的氨基酸差异(例如替换、删除和/或添加)。在一些实施方案中，FGF23同系物、变体、片段或修饰形式保持至少90％序列一致性或具有最多25个相对于SEQ ID NO:8的氨基酸差异。
FGF23同系物、变体、片段或修饰形式保持人FGF23的至少一种活性。作为非限制性实例，这类活性(或功能)包括人FGF23已知具有的那些，包括在结合FGF23受体中的作用、与Klotho蛋白质相互作用、细胞增殖和细胞信号传导；和各种FGF23活性体外分析、包括Egr-1-荧光素酶分析中的活性；和与FGF23-相关性疾病相关的活性，所述疾病例如有年龄相关性病症(选自少肌症(sarcopenia)、皮肤萎缩、肌萎缩、脑萎缩、动脉粥样硬化、动脉硬化、肺气肿、骨质疏松症、骨关节炎、免疫无活性、高血压、痴呆、亨廷顿病、阿尔茨海默病、白内障、年龄相关性黄斑变性、前列腺癌、中风、预期寿命减少、记忆丧失、皱纹、肾功能受损和年龄相关性听力损失)、代谢障碍(选自II型糖尿病、代谢综合征、高血糖和肥胖)、高磷酸盐血(肿瘤样钙质沉着、高磷酸盐血骨肥厚综合征)、慢性肾病、慢性肾衰、癌症、乳癌和/或肌萎缩。
Yamashita等人,2000Biochem.Biophys.Res.Comm.277:494-498；Shimada等人,
2001Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6500-6505；Urakawa等人,2006Nature 444:770-774；
Zhang等人,2004Protein Sci.13:2819-2824；WO 2013/027191、WO 2011/092234和WO
2009/095372。在一些实施方案中，本发明提供了包含本文所述的脂肪酸和FGF23肽的缀合物，其中FGF23肽保持了FGF23的至少一种活性；在一些实施方案中，所保持的FGF23活性是体外Egr-1-荧光素酶分析中的功能。
FGF23同系物、变体、片段或修饰形式保持人FGF23的至少一种活性。作为非限制性实例，这类活性(或功能)包括人FGF23已知具有的那些，包括在结合FGF23受体中的作用、与Klotho蛋白质相互作用、细胞增殖和细胞信号传导；和各种FGF23活性体外分析、包括Egr-1-荧光素酶分析中的活性；和与FGF23-相关性疾病相关的活性，所述疾病例如有年龄相关性病症(选自少肌症(sarcopenia)、皮肤萎缩、肌萎缩、脑萎缩、动脉粥样硬化、动脉硬化、肺气肿、骨质疏松症、骨关节炎、免疫无活性、高血压、痴呆、亨廷顿病、阿尔茨海默病、白内障、年龄相关性黄斑变性、前列腺癌、中风、预期寿命减少、记忆丧失、皱纹、肾功能受损和年龄相关性听力损失)、代谢障碍(选自II型糖尿病、代谢综合征、高血糖和肥胖)、高磷酸盐血(肿瘤样钙质沉着、高磷酸盐血骨肥厚综合征)、慢性肾病、慢性肾衰、癌症、乳癌和/或肌萎缩。
Yamashita等人,2000Biochem.Biophys.Res.Comm.277:494-498；Shimada等人,
2001Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6500-6505；Urakawa等人,2006Nature 444:770-774；
Zhang等人,2004Protein Sci.13:2819-2824；WO 2013/027191、WO 2011/092234和WO
2009/095372。在一些实施方案中，本发明提供了包含本文所述的脂肪酸和FGF23肽的缀合物，其中FGF23肽保持了FGF23的至少一种活性；在一些实施方案中，所保持的FGF23活性是体外Egr-1-荧光素酶分析中的功能。
[0087] FGF23的“变体”指包含一个或多个突变(例如删除、替换或添加)、例如相对于SEQ ID NO:8而言的一个或多个突变、但是仍然保持了人FGF23的至少一种功能的FGF23。FGF23中的突变包括位置Y154、Q156、R176、R179、C206和C244处的那些。以前已经描述了这类突变。R179处的突变赋予FGF23以蛋白酶解抗性；在ADHR中，176RXXR179位点的突变阻止了FGF23的裂解和失活。White等人,2000Nat.Genet.26:345-348；Liu等人,2003J.Biol.Chem.278:37419-37426。Y154处的突变减少了降解；Q156处的突变消除了裂解位点；C206和C244处的突变减少了二聚化和聚集。WO 2013/027191和WO 2011/092234。
FGF23同系物、变体或修饰形式可进一步包含一个或多个另外的氨基酸(它们不是在野生型人FGF23中常发现的那些)。
FGF23同系物、变体或修饰形式可进一步包含一个或多个另外的氨基酸(它们不是在野生型人FGF23中常发现的那些)。
[0088] FGF23变体的非限制性实例如下所示：
[0089]
[0090] SEQ ID NO:10显示了FGF23的变体，其中信号肽(aa 1-24)已经被删除，但是在1位已经重新引入了起始M；并且相应于R179的氨基酸已经被突变为Q。SEQ ID NO:10还指定为“hFGF23R 179Q”、“FGF23R179”、“hFGF23(R179Q)”等，其代表了实施例28C中所用的FGF23变体。
[0091] 作为非限制性实例，另外的FGF23变体包括具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的序列、但是在Y154、Q156、R176、R179、C206和C244中的一处或多处还具有突变的那些。作为非限制性实例，另外的FGF23变体包括具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的序列、但是在Y154、Q156、R176、R179、C206和C244中的一处或多处还具有突变和进一步包含一个或多个另外的氨基酸(它们不是在野生型人FGF23中常发现的那些)的那些。
[0092] FGF23的“片段”指包含一个或多个删除的氨基酸、例如相对于SEQ ID NO:8而言的一个或多个删除的氨基酸、但是仍然保持了人FGF23的至少一种功能的FGF23。FGF23的功能性片段包括SEQ ID NO:8的氨基酸180-251，Goetz等人,2010Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:407-412。FGF23片段还可以具有一个或多个突变，例如在位置Y154、Q156、R176、R179、C206和C244中的任意一处或多处具有一个或多个突变，但是可保持人FGF23的至少一种活性。
[0093] FGF23的“修饰形式”指包含与FGF23的序列如SEQ ID NO:8相似或相同的序列、但是具有一个或多个修饰并保持人FGF23的至少一种活性的FGF23。作为非限制性实例，这类修饰可包括翻译后修饰(磷酸化、甲基化或添加碳水化合物)或与不是FGF23的第二个部分缀合。作为非限制性实例，这类第二个部分可以是信号肽、α或βKlotho或其片段(例如可溶性Klotho或sKlotho)、Fc(例如FcLALA)或其它修饰。WO 2011/092234和WO 2009/095372。
[0094] 如本文所用的术语“AgRP肽或多肽”等术语指野灰蛋白相关肽(Agouti-Related Peptide)，即在翻译后加工为其活性或成熟形式AgRP(83-132)的由132个氨基酸组成的信号传导分子，其含有10个半胱氨酸残基，形成了5个二硫键的网络。AgRP作为黑皮质素受体MC3R和MC4R的逆激动剂发挥作用。在所有情况中，术语“AgRP肽”包括其盐。在一些实施方案中，AgRP可以是酰胺形式，例如C-末端的-CO2H酰胺化形成C(O)-NH2。在其它实施方案中，AgRP可以是酸形式。
[0095] 术语“AgRP肽”还包括AgRP的较短的生物活性片段。片段是母体序列的一部分，其与母体序列相比在序列上是相同的、但是长度较短，并且保持了生物活性(即逆激动)。AgRP多肽的片段及其变体还已经在Jackson,P.J.等人,Biochemistry 41,7565-7572中进行了记载，该文献引入本文作为参考。例如，AgRP(87-120)和AgRP(87-132)具有与AgRP(83-132)大约相同的MC3R和MC4R亲和性，并且呈现出等同的逆激动作用。AgRP多肽的另外的片段已经在Christine G.Joseph等人,Peptides 24(2003),263-270中有记载；该文献引入本文作为参考。片段的实例有AgRP(86-132)和单环AgRP(109-118)以及其在N-和/或C-末端的延伸。
[0096] 术语“AgRP多肽”还包括"AgRP突变体多肽"，其为AgRP多肽，其中天然存在的AgRP多肽序列已经被修饰。这类修饰已经在PCT申请号WO2013/006656中有记载，该文献引入本文作为参考。
[0097] 术语“GDF15肽”、"GDF15多肽"和"GDF15蛋白质"可互换使用，指在哺乳动物如人或小鼠中表达的天然存在的野生型多肽。对于本公开文本的目的，术语"GDF15蛋白质"可以互换地用于指任意全长GDF15多肽，其由308个氨基酸残基组成；(NCI Ref.Seq.NP_004855.2)含有29个氨基酸的信号肽(氨基酸1-29)、167个氨基酸的前结构域(氨基酸30-196)和112个氨基酸的成熟结构域(氨基酸197-308)，其通过弗林蛋白酶样蛋白酶从前结构域切割。308-氨基酸GDF15多肽被称为“全长”GDF15多肽；112个氨基酸GDF15多肽(例如氨基酸197-308)是“成熟”GDF15多肽。成熟GDF15肽含有7个形成半胱氨酸结基序(具有三个链内二硫键)所必需的保守半胱氨酸残基和单个对TGF～超家族而言典型的链间二硫键。成熟GDF15肽含有两个另外的半胱氨酸残基，它们形成第四个链内二硫键。因此，具有生物活性的GDF15是通过一个链间二硫键共价连接的成熟肽的同二聚体。因此，GDF15蛋白质或多肽还包括蛋白质的多聚体、更特别是二聚体。构成同二聚体GDF15的每个单体单元可以与式A1、A2或A3脂肪酸连接。
[0098] 如本文所用的“GDF15”或“GDF15蛋白质”还指人GDF15或其同系物、变体、突变体、片段或修饰形式，它们保持了人GDF15的至少一种活性。
[0099] 术语"GDF15突变体多肽"或“GDF15变体多肽”包括其中天然存在的GDF15多肽序列已经被修饰的GDF15多肽。这类修饰包括但不限于一个或多个氨基酸替换、包括用非天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸类似物和氨基酸模拟物替换。
[0100] 在一个方面，术语"GDF15突变蛋白"或“GDF15变体多肽”指其中至少一个在天然GDF15多肽的指定位置上正常发现的残基被删除或被在天然GDF15多肽的该位置上未正常发现的残基所替换的GDF15蛋白质序列。在一些情况中，将可以期望的是，将在天然GDF15多肽的指定位置上正常发现的单个残基用多于一个在该位置上未正常发现的残基替换；在另一些情况中，还可以期望的是，维持天然GDF15多肽并在该蛋白质的指定位置插入一个或多个残基；在另一些情况中，还可以期望的是，整个删除指定的残基；所有这些构建体都被术语"GDF15突变蛋白”或“GDF15变体蛋白”所囊括。在本发明的一个方面，GDF15突变蛋白或“GDF15变体蛋白”具有选自SEQ ID NO 1至SEQ ID No 7任一项的序列。本发明还包括编码这类GDF15突变多肽序列或GDF15变体多肽序列的核酸分子。
[0101] GDF15的“同系物”、“变体”、“片段”或“修饰形式”等指与人GDF15相似、但是不相同的多肽，但是其保持了人GDF15的至少一种活性。
[0102] GDF15的“修饰形式”指包含与GDF15的序列相似或相同的序列、但是具有一个或多个修饰并保持人GDF15的至少一种活性的GDF15。作为非限制性实例，这类修饰可包括翻译后修饰(磷酸化、甲基化或添加碳水化合物)。
[0103] GDF15的“同系物”指相应于人GDF15、但是来自不同来源如哺乳动物如食蟹猴、小鼠或大鼠等、但是仍然保持了人GDF15的至少一种功能的多肽。在一些情况中，GDF15同系物可用于治疗或改进受治疗者的来自与该受治疗者相同的种属的GDF15突变多肽的成熟形式的代谢障碍。
[0104] 在各种实施方案中，GDF15多肽、同系物、变体、突变体、片段或修饰形式包含与天然存在的GDF15蛋白质至少约85％一致的氨基酸序列。在其它实施方案中，GDF15多肽包含与天然存在的GDF15多肽氨基酸序列至少约90％或约95、96、97、98或99％一致的氨基酸序列。这类GDF15多肽、同系物、变体、突变体、片段或修饰形式具有野生型GDF15突变多肽的至少一种活性，例如能够降低血液葡萄糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平；能够减轻体重；或能够改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰岛素敏感性。
[0105] 在各种各自的实施方案中，GDF15多肽或同系物、变体、突变体、片段或修饰形式具有的生物活性等于、高于或低于成熟GDF15蛋白质的天然存在形式的生物活性。生物活性的实例包括能够降低血液葡萄糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平；能够减轻体重；或能够改善葡萄糖耐量、脂质耐量或胰岛素敏感性；能够降低尿糖和蛋白质排泄。
[0106] 如本文在多肽或蛋白质的结构的文本中所用的术语“N-末端”(或“氨基末端”)和“C-末端”(或“羧基末端”)分别指多肽的末端的氨基和羧基端。
[0107] 如本文所用的术语“治疗性多肽”或“治疗性蛋白质”指正在被开发用于治疗性用途或已经被开发用于治疗性用途的多肽或蛋白质。
[0108] 连接基将生物分子和脂肪酸部分分开。其化学结构不是关键的，因为其主要用作间隔基。
[0109] 连接基是含有两个反应活性基团/官能团的化学部分，其中一个可以与生物分子反应且另一个与脂肪酸部分部分反应。连接基的两个反应活性基团/官能团经由连接部分或间隔基连接，所述连接部分或间隔基的结构不甚关键的，只要它不干扰连接基与生物分子和式A1、A2或A3脂肪酸部分的偶联。
[0110] 连接基可以由通过肽键连接在一起的氨基酸组成。在本发明的一些实施方案中，连接基由通过肽键连接在一起的1-20个氨基酸组成，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在各种实施方案中，所述1-20种氨基酸选自氨基酸甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和赖氨酸。在一些实施方案中，连接基由多种无空间位阻的氨基酸如甘氨酸和丙氨酸组成。在一些实施方案中，连接基是聚甘氨酸、聚丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合(例如聚(Gly-Ala))或甘氨酸和丝氨酸的组合(例如聚(Gly-Ser))。在一些实施方案中，连接基由多种选自组氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺和甘氨酸的氨基酸组成。在一些实施方案中，连接基含有聚组氨酸部分。
[0111] 在一些实施方案中，连接基包含1-20个氨基酸，所述氨基酸选自非天然氨基酸。虽然1-10个氨基酸残基的连接基对于脂肪酸部分的缀合是优选的，但是本发明关注了任意长度或组成的连接基。非天然氨基酸连接基的实例有具有下式的8-氨基-3,6-二氧杂辛酸：
[0112] 或其重复单元。
[0113] 本文所述的连接基是示例性的，更长的和包括其它残基的连接基也是本发明关注的。非肽连接基也是本发明关注的。
[0114] 在其它实施方案中，连接基包含一个或多个烷基基团、链烯基基团、环烃基基团、芳基基团、杂芳基基团、杂环基团、聚乙二醇和/或一个或多个天然或非天然氨基酸或其组合，其中烷基、链烯基、环烃基、芳基、杂芳基、杂环剂、聚乙二醇和/或天然或非天然氨基酸各自任选地组合和连接在一起或连接至生物分子和/或连接至脂肪酸部分，所述连接经由选自-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)-O-、＝NH-O-、＝NH-NH-或＝NH-N(烷基)-的化学基团。
[0115] 可以使用含有烷基间隔基的连接基例如有-NH-(CH2)z-C(O)-或-S-(CH2)z-C(O)-或-O-(CH2)z-C(O)-、-NH-(CH2)z-NH-、-O-C(O)-(CH2)z-C(O)-O-、-C(O)-(CH2)z-O-、-NHC(O)-(CH2)z-C(O)-NH-等，其中z是2-20。这些烷基连接基可以进一步被任意无空间位阻的基团、包括但不限于低级烷基(例如C1-C6)、低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2或苯基所取代。
[0116] 连接基可以是任何多聚体性质的。连接基可以包括生物稳定或生物可降解的聚合物链或单元。具有重复键的聚合物在生理条件下可以具有不同程度的稳定性，这取决于键的易变性。聚合物可以含有诸如聚碳酸酯(-O-C(O)-O-)、聚酯(-C(O)-O-)、聚氨酯(-NH-C(O)-O-)、聚酰胺(-C(O)-NH-)的键。这些价键以举例的方式提供，它们不意欲限制本发明的聚合物链或连接基中可采用的价键的类型。适宜的聚合物包括例如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚马来酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇(polyoxyethylated polyol)、肝素、肝素片段、多糖、纤维素和纤维素衍生物、淀粉和淀粉衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物、聚亚烷基二醇共聚物及其衍生物、聚乙烯基乙基醚等及其混合物。聚合物连接基例如是聚乙二醇(PEG)。PEG连接基可以是直链或支链的。本发明中的PEG连接基的分子量不限于任何特定的大小，但是某些实施方案具有100-5000道尔顿、例如500-1500道尔顿的分子量。
[0117] 连接基在两端含有在肽或多肽/蛋白质的氨基基团和脂肪酸部分的功能性/反应活性基团(例如式A1、A2和A3脂肪酸部分的羧酸官能团)之间形成桥的适当的功能性反应活性基团。
[0118] 连接基可以包含多个具有不同性质的连接部分(或间隔基)(例如氨基酸、杂环部分、PEG和/或烷基部分的组合)。在这种情况中，每个连接部分在两端含有在肽或多肽/蛋白质的氨基基团和下一个具有不同性质的连接部分之间形成桥的适当的功能性反应活性基团，和或含有在具有不同性质的在前连接部分和脂肪酸部分之间形成桥的适当的功能性反应活性基团。
[0119] 经修饰的肽或多肽和/或肽-多肽部分构建体(即与部分连接基连接的肽/多肽)包括能够与脂肪酸部分(或经修饰的脂肪酸部分：即已经连接了部分连接基)上的可用的反应活性官能团发生反应形成共价键的反应活性基团。反应活性基团是能够形成共价键的化学基团。反应活性基团位于缀合物的一个位置，通常可以是羧基、磷酰基、酰基基团、酯或混合酸酐、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、四嗪、炔、亚胺酸酯、吡啶-2-基-二硫烷基，由此能够与缀合物另一个位置上的官能团如氨基基团、羟基基团、链烯基基团、肼基团、羟胺基团、叠氮基团或硫醇基团形成共价键。
[0120] 对于将生物分子或经修饰的生物分子缀合至连接基和/或将连接基缀合至脂肪酸部分和/或将具有不同形式的各种连接基缀合在一起而言特别感兴趣的反应活性基团有N-羟基琥珀酰亚胺、炔(更特别是环辛炔)。
[0121] 官能团包括：1.硫醇基团，用于与马来酰亚胺、甲苯磺酰基砜或吡啶-2-基二硫烷基反应；2.氨基基团(例如氨基酸的氨基官能团)，用于与羧酸或活化羧酸(例如经由N-羟基琥珀酰亚胺化学的酰胺键形成)、磷酰基基团、酰基基团或混合酸酐键合；3.叠氮化物，以经历与末端炔和更特别是环辛炔的Huisgen环加成(更常已知为点击化学)；4.羰基基团，以分别与羟胺或肼反应形成肟或肼；5.烯烃和更特别是有张力的烯烃(strained alkene)，以与四嗪在氮杂[4+2]加成反应。虽然本文描述了连接基和官能团/反应活性基团的一些实例，但是本发明仍然关注了任意长度和组成的连接基。
[0122] 实施方案
[0123] 本文描述了本发明的各种实施方案。可以理解，各实施方案中详细说明的特征可以与其它详细说明的特征组合来提供其它实施方案。
[0124] 在实施方案1中，本发明涉及包含经由连接基与脂肪酸部分连接的生物分子的缀合物，其中所述脂肪酸部分具有如下的式A1、A2或A3：
[0125]
[0126] R1是CO2H、H；
[0127] R2、R3和R4相互独立地是H、OH、CO2H、-CH＝CH2或-C＝CH；
[0128] Ak是支链C6-C30亚烷基；
[0129] n、m和p相互独立地是6至30的整数；或其酰胺、酯或可药用盐。
[0130] 在实施方案1的另一方面，实施方案1的缀合物可以进一步包含如上所述的式A1、A2或A3脂肪酸。鉴于难以获得脂肪酸与生物分子的选择性缀合和/或获得单缀合，本发明的缀合物可以包含与一个或多个式A1、A2或A3脂肪酸部分连接的生物分子。另外，鉴于一些蛋白质的多聚体本性，构成多聚体蛋白质的各个单体单元可以与脂肪酸部分连接，但是不是所有单体单元必须与脂肪酸部分连接，只要至少一个单体单元与脂肪酸部分连接即可。在另一方面，本发明涉及本发明的缀合物的混合物。例如，混合物可以包含与一个式A1、A2或A3脂肪酸部分连接的生物分子如多聚体生物分子、例如二聚体生物分子和与多于一个式A1、A2或A3脂肪酸部分连接的生物分子如多聚体生物分子、例如二聚体生物分子。本发明下文的实施例进一步强调了脂肪酸与蛋白质或多肽的选择性或非选择性多缀合的这一方面。
[0131] 在实施方案1A中，本发明涉及实施方案1的缀合物，其中脂肪酸部分具有式A1。在该实施方案的特定方面，缀合物包含式A1的脂肪酸部分，其中n和m独立地是8至20、优选10至16。在该实施方案的另一方面，本发明涉及实施方案1或1A的缀合物，其中脂肪酸部分具有式A1和其中R2和R3中至少一个是CO2H。
[0132] 在实施方案2中，本发明涉及实施方案1或1A的缀合物，其中脂肪酸部分选自下式：
[0133]
[0134] 其中Ak3、Ak4、Ak5、Ak6和Ak7独立地是(C8-20)亚烷基，R5和R6独立地是(C8-20)烷基。
[0135] 在实施方案3中，本发明涉及实施方案1、1A或2的缀合物，其中脂肪酸部分选自下式：
[0136]
[0137] 在实施方案3A中，本发明涉及实施方案1、1A或2的缀合物，其中脂肪酸部分选自下式：
[0138]
[0139] 在实施方案3B中，本发明涉及实施方案1的缀合物，其中脂肪酸部分具有式A2或A3。在该实施方案的特定方面，缀合物包含其中p是8至20的式A2脂肪酸部分或其中Ak是C8-20亚烷基的式A3脂肪酸部分。
[0140] 在实施方案3C中，本发明涉及实施方案1或3B的缀合物，其中脂肪酸部分选自下式：
[0141]
[0142] 其中Ak2是C8-20亚烷基。
[0143] 在实施方案4中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的缀合物，其中连接基包括一个或多个烷基基团、链烯基基团、环烃基基团、芳基基团、杂芳基基团、杂环基团、聚乙二醇、一种或多种天然或非天然氨基酸或其组合，其中烷基、链烯基、环烃基、芳基、杂芳基、杂环基、聚乙二醇和/或天然或非天然氨基酸各自任选地组合和连接在一起或连接至生物分子和/或连接至脂肪酸部分，所述连接经由选自-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)-O-、＝NH-O-、＝NH-NH-或＝NH-N(烷基)-的化学基团。
[0144] 在实施方案5中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的缀合物，其中连接基包含下式的非支链低聚乙二醇(oligo ethylene glycol)部分：
[0145]
[0146] 其中y是0至34。
[0147] 在实施方案6中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的缀合物，其中连接基包含(或进一步包含)选自下式的杂环部分：
[0148]
[0149]
[0150] 和
[0151] 这类含杂环的连接基通过例如叠氮化物-炔Huisgen环加成(更常已知为点击化学)获得。更特别地，上文描绘的杂环中的一些来自环炔与含叠氮化物的部分的反应。
[0152] 环炔可以容易地从商业来源获得，因此其可以经由用含有叠氮化物官能团的部分(例如含有末端叠氮化物官能团的连接基)进行环加成来进行官能化。环炔点击化学在蛋白质标记中的用途的实例已经在US 2009/0068738中有记载，该文献引入本文作为参考。
[0153] 可以用于Huisgen环加成的环炔试剂的非限制性实例有：
[0154]
[0155]
[0156] 在实施方案6A中，本发明涉及根据实施方案1至5任一项的缀合物，其中连接基包含(或进一步包含)选自下式的杂环基：
[0157]
[0158] 其中r是0至2的整数且s是0至3的整数。
[0159] 这类杂环连接基可以用如下部分经由烯烃或优选有张力的烯烃如环烃的氮杂[4+2]环加成而获得：
[0160]
[0161] 其中Rf是例如-CH2NH2、-OH、-CH2-CO2H、-S-CH2-CO2H、-(O-CH2)4-6-C(O)-OH-或[0162]
[0163] 这类四嗪部分可以容易地从商业来源获得，可以与含烯烃的部分、例如含末端烯烃官能团的连接基发生反应。
[0164] 在实施方案6B中，本发明涉及根据实施方案1至5任一项的缀合物，其中连接基包含(或进一步包含)下式的杂环基：
[0165]
[0166] 这类杂环部分可以通过马来酰亚胺与含硫醇的部分、例如含末端硫醇官能团的连接基反应来获得。
[0167] 可以容易获得和/或可自商业途径获得的这些试剂直接或通过如上所述的连接基与感兴趣的肽或多肽连接。炔、马来酰亚胺或四嗪反应活性基团与脂肪酸部分或连接基-脂肪酸构建体(例如PEG-脂肪酸构建体)上存在的官能基团(分别有叠氮化物、硫醇和烯烃)反应。
[0168] 在实施方案7中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的缀合物，其中连接基包含或进一步包含一个或多个氨基酸，所述氨基酸独立地选自组氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺和甘氨酸。在该实施方案的一个特定方面，连接基包含1至6个选自组氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸的氨基酸。
[0169] 在实施方案8中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的缀合物，其中所述生物分子是肽或多肽。在实施方案8的一个特定方面，本发明涉及根据前述实施方案任一项的缀合物，其中肽或多肽是1)人生长分化因子15(GDF15)及其同系物、变体、突变体、片段和其它修饰形式；2)APJ激动剂肽；3)催产素受体激动剂肽；4)serelaxin；5)NPFF；6)PIP肽；7)FGF23肽；8)AgRP肽；或9)siRNA。
[0170] 在实施方案8A中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的缀合物，其中所述生物分子是人生长分化因子15(GDF15)及其同系物、变体、突变体、片段和其它修饰形式；或其二聚体。在该实施方案的一个方面，生物分子是人生长分化因子15(GDF15)突变体或变体。在优选的实施方案中，生物分子是GDF15或其变体或突变体的二聚体。鉴于GDF15多肽或突变体或变体的同二聚体性质，构成同二聚体的两条多肽链各自(即每个单体单元)可以经由连接基与式A1、A2或A3脂肪酸分子连接。因此，GDF15同二聚体可以经由连接基与一种或两种脂肪酸连接。经由连接基与脂肪酸部分连接的GDF15结构可以如下表示：
[0171]
[0172] 其中FA表示脂肪酸部分，L表示连接基，并且GDF15单体单元1和单体单元2均经由连接基与脂肪酸部分连接；或
[0173]
[0174] 其中FA是脂肪酸部分，L是连接基，并且只有一个单体单元经由连接基与脂肪酸部分连接，并且其中2个单体单元之间的线表示二硫键。而且，本发明还涉及包含结构A的缀合物和结构B的缀合物的混合物。
[0175] 在实施方案8B中，本发明关注了根据实施方案8A的缀合物，其中人GDF15突变体通过用其它残基替换成熟多肽的一个或多个氨基酸残基而获得。在该实施方案的一个特定方面，人GDF15的N-末端处的最后两个氨基酸残基(即精氨酸198和丙氨酸197)已经被氨基酸序列XH-所替换，其中H是组氨酸且X是选自甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺和甘氨酸的氨基酸。在该实施方案的优选方面，hGDF15突变体是MH(199-308)hGDF15或AH(199-308)hGDF15。
[0176] 在实施方案8C中，人GDF15的N-末端处的最后3个氨基酸残基(即天门冬酰胺199、精氨酸198和丙氨酸197)已经被氨基酸序列XHX’-所替换，其中H是组氨酸且X’和X是独立地选自选自甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺和甘氨酸的氨基酸。在该实施方案的另一方面，GDF15的N-末端处的最后3个氨基酸残基(即天门冬酰胺199、精氨酸198和丙氨酸197)已经被氨基酸序列AHX’-所替换，其中H是组氨酸且X’是独立地选自甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺和甘氨酸的氨基酸。在该实施方案的优选方面，仅修饰的GDF15蛋白质是MHA(200-308)hGDF15或AHA(200-308)hGDF15。
[0177] 与天然GDF15蛋白质相比，GDF15突变体能够在N-末端选择性地标记蛋白质(即在GDF15的优选的N-末端处缀合脂肪酸)。肽和蛋白质的选择性标记的进一步细节在共同提交的美国申请号62/015,858(律师案件PAT056275-US-PSP)和62/082,337(律师案件号PAT056275-US-PSP02)中有记载。
[0178] 在实施方案8D中，本发明涉及根据实施方案1至8任一项的缀合物，其中所述生物分子是APJ激动剂肽。在该实施方案的特定方面，APJ激动剂肽是PCT专利申请号WO 2013/111110、WO 2014/081702、WO 2015/013168、WO 2015/013165、WO 2015/013167和WO 2015/
013169中所述的肽，所述文献引入本文作为参考。
013169中所述的肽，所述文献引入本文作为参考。
[0179] 在实施方案8E中，本发明涉及根据实施方案1至8任一项的缀合物，其中所述生物分子是催产素受体激动剂肽。在该实施方案的特定方面，催产素受体激动剂肽PCT专利申请号WO 2009/122285(Ferring B.V.)和WO 2014/095773(Hoffman-La Roche)中所述的肽，所述文献引入本文作为参考。
[0180] 在实施方案8F中，本发明涉及根据实施方案1至8任一项的缀合物，其中所述生物分子是AgRP肽。在该实施方案的特定方面，AgRP肽是AgRP(83-132)，其中C-末端是游离CO2H或其酰胺(例如-C(O)NH2)的形式。
[0181] 在实施方案8G中，本发明涉及根据实施方案1至8任一项的缀合物，其中所述生物分子是FGF23肽。在该实施方案的特定方面，FGF23肽是在R179处具有突变和任选地在Y154、Q156、R176、R179、C206和C244处具有一个或多个另外的突变的SEQ ID NO:8的FGF23变体。在该实施方案的另一个特定方面，FGF23肽是在R179、Q156、C206和C244处具有突变的SEQ ID NO:8的FGF23变体。
[0182] 在实施方案8H中，本发明涉及根据实施方案1至8任一项的缀合物，其中所述生物分子是Serelaxin。
[0183] 在实施方案8I中，本发明涉及根据实施方案1至8任一项的缀合物，其中所述生物分子是NPFF肽。
[0184] 在实施方案8J中，本发明涉及根据实施方案1至8任一项的缀合物，其中所述生物分子是PIP肽。在该实施方案的特定方面，PIP肽是组氨酸标记的蛋白质MHHHHHHH-PIP，其中PIP具有SEQ ID NO:12。
[0185] 在实施方案8K中，本发明涉及根据实施方案1至8任一项的缀合物，其中所述生物分子是siRNA。
[0186] 在实施方案8L中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的缀合物，进一步包含经由连接基与生物分子连接的第二个脂肪酸部分。优选地，两个脂肪酸-连接基部分具有相同的结构。
[0187] 在实施方案9中，本发明涉及实施方案1、2、8、8A、8B或8C的缀合物，其具有如下结构：
[0188]
[0189]
[0190] 其中hGDF15*是hGDF15，其中N-末端的2或3个氨基酸已经分别被氨基酸序列XH-或XHX’-所替换，
[0191] 其中H是组氨酸且X和X’独立地选自M和A；或其二聚体；且
[0192] 其中his-hGDF15是hGDF15，其中包含1至6个组氨酸氨基酸和任选的1或2个甲硫氨酸氨基酸的标签已经被加至hGDF15的N-末端；或其二聚体；和
[0193] s是20-30的整数。
[0194] 在该实施方案的一个方面，标签包含组氨酸氨基酸和1或2个不相邻的甲硫氨酸氨基酸。在该实施方案的另一方面，组氨酸和甲硫氨酸氨基酸的安排使得与N-末端氨基酸相邻的位置上的氨基酸是组氨酸。在该实施方案的另一方面，标签选自MHHHHHHM-和MHHHHHH-。
[0195] 在实施方案9的特定方面，鉴于hGDF15*和his-hGDF15的同二聚体性质，构成同二聚体的一条或两条多肽链(单体单元)可以经由连接基与脂肪酸分子连接。结果，同二聚体可以在N-末端经由连接基与一个或两个脂肪酸分子连接。该实施方案可以通过具有下式的经由连接基与脂肪酸连接的GDF15生物分子表示：
[0196]
[0197] 其中his-hGDF15或hGDF15*(如上文所定义)的两个单体单元在两个N-末端经由连接基与脂肪酸部分连接；或
[0198]
[0199] 其中his-hGDF15或hGDF15*(如上文所定义)的仅一个单体单元在N-末端经由连接基与脂肪酸部分连接。而且，本发明还关注了本发明的缀合物的混合物；例如包含式C缀合物和式E缀合物的混合物或包含式D缀合物和式F缀合物的混合物。
[0200] 在实施方案10中，本发明涉及包含式C缀合物和式E缀合物的混合物的组合物。在实施方案10A中，本发明涉及包含式D缀合物和式F缀合物的混合物的组合物。
[0201] 因此，在实施方案10B中，本发明涉及根据权利要求1、2、9或10的缀合物，其包含：
[0202] 1.同二聚体hGDF15的变体，其中N-末端的2或3个氨基酸已经分别被氨基酸序列XH-或XHX’-所替换，其中H是组氨酸且X和X’独立地选自M和A；或
[0203] 同二聚体hGDF15，其中包含1至6个组氨酸氨基酸和任选的1或2个甲硫氨酸氨基酸的标签已经被加至hGDF15的N-末端；和
[0204] 2.一个或两个下式的脂肪酸：
[0205]
[0206] 其中脂肪酸经由连接基与多肽链的N-末端连接；或缀合物的混合物。
[0207] 在实施方案10C中，本发明涉及实施方案9、10、10A或10B的缀合物，其中hGDF15*是hGDF15，其中N-末端的2或3个氨基酸已经分别被氨基酸序列XH-或XHX’-所替换，[0208] 其中H是组氨酸且X和X’独立地选自M和A；或其二聚体；和
[0209] 其中his-hGDF15是hGDF15，其中包含4至6个组氨酸氨基酸和1或2个甲硫氨酸氨基酸的标签已经被加至hGDF15的N-末端；或其二聚体；
[0210] 且s是22至28的整数。在该实施方案的一个方面，标签包含组氨酸氨基酸和1或2个不相邻的甲硫氨酸氨基酸。在该实施方案的另一方面，组氨酸和甲硫氨酸氨基酸的安排使得与N-末端氨基酸相邻的位置上的氨基酸是组氨酸。在该实施方案的另一方面，标签选自MHHHHHHM-和MHHHHHH-。
[0211] 在实施方案11中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的缀合物，其中所述生物分子选自M-(His)6-hGDF15(SEQ ID No 1)、M-(his)6-M-hGDF15(SEQ ID NO:2)、MH(199-308)hGDF15(SEQ ID NO:4)、MHA(200-308)hGDF15(SEQ ID NO:6)、AHA(200-308)hGDF15(SEQ ID NO:7)和AH(199-308)GDF15(SEQ ID NO:5)；或其二聚体。
[0212] 在实施方案11A中，本发明涉及实施方案11的缀合物，其中所述生物分子选自MH(199-308)hGDF15(SEQ ID NO:4)、MHA(200-308)hGDF15(SEQ ID NO:6)、AHA(200-308)hGDF15(SEQ ID NO:7)和AH(199-308)GDF15(SEQ ID NO:5)；或其二聚体。
[0213] 在实施方案11B中，本发明涉及实施方案11的缀合物，其中所述生物分子选自AHA(200-308)hGDF15(SEQ ID NO:7)；或其二聚体。
[0214] 在实施方案12中，本发明涉及实施方案11B的缀合物，其中经由连接基与脂肪酸连接的生物分子具有式G或式H：
[0215]
[0216]
[0217] 其中AHA-hGDF15是SEQ ID NO:7，且脂肪酸在1个或2个单体单元的N-末端连接。而且，本发明关注了包含式G缀合物和式H缀合物的混合物。
[0218] 在实施方案13中，本发明涉及包含具有式G的实施方案12的缀合物和具有式H的实施方案12的缀合物的混合物的组合物。在该实施方案的特定方面，混合物是1:1摩尔比的式G缀合物和式H缀合物。
[0219] AHA-(200-308)-hGDF15(SEQ ID NO:7)被设计成除去在天然蛋白质中观察到的剪切位点以及除去潜在的甲硫氨酸(M1)甲酰化位点和N-199脱酰胺化位点。AHA的优良品质和同质性通过材料品质检查得以证实，所述检查显示没有用hGDF15天然序列观察到的剪切、脱酰胺化或甲硫氨酸氧化。
[0220]
[0221] 在实施方案14中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的缀合物，其中脂肪酸残基经由连接基连接在肽或蛋白质的N-末端。在实施方案15中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的缀合物，其中缀合物具有多于5小时的血浆稳定性半衰期。在该实施方案的一个方面，缀合物具有多于10小时的血浆稳定性半衰期。在该实施方案的另一方面，缀合物具有多于20小时或多于30小时的血浆稳定性半衰期。在该实施方案的另一方面，缀合物具有多于40小时或多于50小时的血浆稳定性半衰期。
[0222] 在实施方案16中，本发明涉及根据前述实施方案任一项的缀合物，其中与非缀合生物分子相比的血浆稳定性半衰期的改善为2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或75倍。
[0223] 在另一项实施方案中，生物分子、连接基和脂肪酸部分(R1至R4、n、m p和Ak)是下文实施例部分中所定义的那些。
[0224] 在一项实施方案中，本发明涉及下式的化合物：
[0225]
[0226] R1是CO2H或H；
[0227] R2和R3相互独立地是H、OH、CO2H、-CH＝CH2或-C＝CH；前提是R2和R3不相同；
[0228] R4是CO2H；
[0229] n和m相互独立地是6至30的整数；或其酰胺、酯或可药用盐。在该实施方案的另一方面，本发明涉及式A1化合物，其中R2和R3中至少一个是CO2H。在该实施方案的另一方面，本发明涉及选自如下的化合物：
[0230]
[0231] 肽/多肽和/或其修饰形式的合成
[0232] 本发明的肽或多肽可以通过合成化学方法或通过重组方法或两种方法的联合来产生。肽或多肽/蛋白质构建体可以制备成全长的或者可以合成为非全长片段和结合的。本发明的肽和多肽可以通过对肽合成而言本身已知的方法来产生。肽合成方法可以是固相合成和液相合成中的任一者。因此，感兴趣的肽和多肽可以如下来产生：将能够构成蛋白质的部分肽或氨基酸与其残余部分缩合，当产物具有保护基时分离保护基，由此可以生产预期的肽。已知的缩合和脱保护方法包括以下文献(1)至(5)中记载的操作。
[0233] (1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti,Peptide Synthesis,Interscience Publishers,纽约,1966；
[0234] (2)Schroeder和Luebke,The Peptide,Academic Press,纽约,1965；
[0235] (3)Nobuo Izumiya等人,Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis,Maruzen,1975；
[0236] (4)Haruaki Yajima和Shumpei Sakakibara,Biochemical Experiment Series 1,Protein Chemistry IV,205,1977；和
[0237] (5)Haruaki Yajima(编辑),Development of Drugs-Continued,14,Peptide Synthesis,Hirokawa Shoten。
[0238] 反应后，肽或多肽可以通过常规纯化技术如溶剂萃取、柱色谱法、液相色谱法、尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法和重结晶的联合来进行纯化和分离。当如上所分离的肽为游离化合物时，可通过已知方法将其转化成适宜的盐。相反地，如果所分离的产物是盐，则可通过已知方法将其转化成游离肽。
[0239] 可通过采用适于酰胺化的用于肽合成的树脂来获得多肽的酰胺。所述树脂包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨甲基树脂、4-苄氧基苄醇树脂、4-甲基二苯甲胺树脂、PAM树脂、4-羟基甲基甲基苯基乙酰氨基甲基树脂、聚丙烯酰胺树脂、4-(2',4'-二甲氧基苯基-羟甲基)苯氧基树脂、4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基树脂、2-氯三苯甲基氯树脂等。采用这类树脂，通过本身已知的各种缩合技术，根据目标肽的序列使其中侧链的α-氨基和官能基团已经适当保护的氨基酸在该树脂上缩合。在系列反应结束时，从树脂移除肽或被保护的肽，除去保护基团，并且在需要时形成二硫键，以获得目标多肽。
[0240] 对于上述被保护的氨基酸的缩合，可使用多种用于肽合成的活化试剂，例如HATU、HCTU或例如碳二亚胺。碳二亚胺包括DCC、N,N'-二异丙基碳二亚胺和N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。对于利用这类试剂的活化，可使用外消旋化抑制剂添加剂，例如HOBt或Oxyma Pure。被保护的氨基酸可与活化试剂及外消旋化抑制剂一起直接添加至树脂中，或者可预先活化为对称的酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，然后添加至树脂中。用于被保护的氨基酸的活化或与树脂缩合的溶剂可适当地选自已知可用于肽缩合反应的溶剂。例如，可提及的是N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯啶酮、氯仿、三氟乙醇、二甲亚砜、DMF、吡啶、二 烷、二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、乙酸乙酯或它们的适宜的混合物。反应温度可选自迄今已知可用于肽键形成的范围，通常选自约-20℃-50℃的范围。活化的氨基酸衍生物通常以1.5-4倍过量的比例使用。若通过利用茚三酮反应的测试发现缩合不充分，则可在不去除保护基团的情况下重复缩合反应以实现充分缩合。如果重复缩合仍无法提供足够程度的缩合，则可用乙酸酐或乙酰基咪唑使未反应的氨基乙酰化。
[0241] 用于起始材料氨基酸的氨基的保护基包括Z、Boc、叔戊氧基羰基、异冰片基氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、CI-Z、Br-Z、金刚烷基氧基羰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚磺酰基、二苯基硫膦基(diphenylphosphinothioyl)或Fmoc。可使用的羧基保护基包括但不限于上述的C1-6烷基、C3-8环烃基和C6-10芳基-C1-2烷基以及2-金刚烷基、4-硝基苄基、4-甲氧基苄基、4-氯苄基、苯甲酰甲基、苄氧羰基酰肼基、叔丁氧羰基酰肼基和三苯甲基酰肼基。
[0242] 丝氨酸和苏氨酸的羟基可通过酯化或醚化来保护。适于所述酯化的基团包括碳衍生的基团，例如低级烷酰基(例如乙酰基等)、芳酰基(例如苯甲酰基等)、苄氧羰基和乙氧基羰基。适于所述醚化的基团包括苄基、四氢吡喃基和叔丁基。用于酪氨酸的酚羟基的保护基包括Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z和叔丁基。
[0243] 用于组氨酸的咪唑保护基包括Tos、4-甲氧基-2,3,6-三乙基苯磺酰基、DNP、苄氧基甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc。
[0244] 起始氨基酸的活化羧基包括相应的酸酐、叠氮化物和活性酯，例如与诸如五氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4-二硝基苯酚、氰基甲醇、对硝基苯酚、HONB、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、HOBt等的醇形成的酯。起始氨基酸的活化氨基包括相应的磷酰胺。
[0245] 消除保护基的方法包括在催化剂如钯黑或披钯碳的存在下使用氢气催化还原，用无水氢氟酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或这类酸的混合物进行酸处理，用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪进行碱处理，在液氨中用金属钠还原。通过上述酸处理的消除反应通常在-20℃-40℃的温度下进行，并且可通过添加阳离子受体有利地进行，所述阳离子受体诸如苯甲醚、苯酚、苯甲硫醚、间甲酚、对甲酚、甲硫醚、1,4-丁二硫醇、1,2-乙二硫醇。用于保护组氨酸的咪唑基团的2,4-二硝基苯基可通过用硫酚处理来消除，而用于保护色氨酸的吲哚基团的甲酰基可通过用稀氢氧化钠溶液或稀氨水碱处理以及在1,2-乙二硫醇、1,4-丁二硫醇存在下通过上述酸处理来消除。
[0246] 用于保护不应参与起始原料反应的官能基团的方法、可使用的保护基、去除保护基的方法和活化欲参与反应的官能基团的方法可全部从已知基团和方法中有判断地选择。
[0247] 另一种获得多肽的酰胺形式的方法包括：首先使C-末端氨基酸的-羧基酰胺化，然后向N-侧延长肽链直至期望的链长度，然后选择性地脱保护C-末端肽的α-氨基和待形成目标多肽的剩余部分的氨基酸或肽的α-羧基，在混合溶剂(例如提及上文所的那些)中缩合所述两个片段，其中该两个片段的α-氨基和侧链官能基团已经用上文所述的适宜保护基进行了保护。该缩合反应的参数可以与上文所述相同。通过上述方法，从通过缩合获得的被保护的肽中去除所有保护基，从而提供期望的粗肽。可通过已知纯化方法来纯化该粗肽，将主要级分冷冻干燥，以提供目标酰胺化多肽。为获得多肽的酯，使C-末端氨基酸的α-羧基与期望的醇缩合，得到氨基酸酯，然后进行上文对制造酰胺所述的程序。
[0248] 或者，重组表达方法是特别有用的。利用宿主细胞的重组蛋白表达(人工工程化以包含编码肽序列的核酸的细胞，且其将转录和翻译并任选分泌肽至细胞培养基中)是现有技术常规使用的。对于重组生产方法，编码肽的氨基酸序列的核酸典型地通过常规方法合成并被整合至表达载体中。此类方法特别优选用于制备包含融合至另外的肽序列或其它蛋白质或蛋白质片段或结构域的肽的多肽组合物。宿主细胞可任选为选自以下的至少一种：E.Coli、COS-1、COS-7、HEK293、BHT21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、heLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞或其任意衍生的、固定化的或转化的细胞。
[0249] 本发明还囊括编码上述可以是RNA形式或DNA形式的变体的多核苷酸，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。DNA可以是双链或单链的。编码本发明的组合物的编码序列可以由于基因代码的冗余或简并而不同。
[0250] 编码本发明的组合物的多核苷酸可以包括以下那些：只有变体编码序列、变体编码序列和另外的编码序列如功能性多肽、或者前导序列或分泌序列或前蛋白序列；变体编码序列和非编码序列如内含子或变体编码序列的非编码序列5’和/或3’。因此，术语“编码变体的多核苷酸”不仅囊括可包括变体编码序列的多核苷酸，而且囊括包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0251] 本发明还涉及所述多核苷酸的变体，其编码含有指定替换的多肽的片段、类似物和衍生物。多核苷酸变体可以是人GDF15序列的天然存在等位变体、非天然存在的变体或截短的变体，如上文所述。因此，本发明还包括如上所述的编码变体的多核苷酸以及这类多核苷酸的变体，所述变体编码所公开的变体的片段、衍生物或类似物。这类核苷酸变体包括删除变体、替换变体、截短变体和添加或插入变体，只要存在第一个或第二个实施方案的指定氨基酸替换中的至少一个。
[0252] 在序列已经经手术连接至表达控制序列(即被放置以确保表达控制序列的功能)后，本发明的多核苷酸可以在宿主中表达。这些表达载体通常可以在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的完整部分进行复制。通常，表达载体将含有选择标记如四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶以允许检测用预期DNA序列转化的那些细胞。GDF15变体可以在哺乳动物细胞、昆虫、酵母、细菌或其它细胞中在适当启动子的控制下表达。还可以应用无细胞翻译系统、采用衍生自本发明的DNA构建体的RNA来产生这类蛋白质。
[0253] 大肠埃希氏菌(Escherichia Coli,E.coli)是可特别用于克隆本发明的多核苷酸的原核生物。其它适用的微生物宿主包括枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilus)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)和各种属的沙雷菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)，虽然也可以使用其它的微生物宿主作为选择。在这些原核生物宿主中，也可以制作表达载体，所述表达载体通常将含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，可以存在多种已知启动子中的任一种，例如乳糖启动子系统、色氨酸(Trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ或T7的启动子系统。启动子通常将任选地用操纵子序列来控制表达，并且具有核糖体结合位点序列等用于起始和完成转录和翻译。
[0254] 蛋白质表达领域的普通技术人员将认识到，可以在成熟序列的N-末端引入甲硫氨酸或甲硫氨酸-精氨酸序列用于在E.coli中表达，这也被本发明的范围内所关注。因此，除非另有指出，否则在E.coli中表达的本发明的组合物具有在N-末端引入的甲硫氨酸序列。
[0255] 其它微生物如酵母菌或真菌也可以用于表达。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母菌丝(Schizosaccharomyces pombe)和安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)是优选酵母宿主的实例，具有适宜的具有表达控制序列如启动子、包括3-磷酸基甘油酸激酶或其它糖酵解酶和复制起点、终止序列等预期的那些的载体。黑曲霉((Aspergillus niger)、(Trichoderma reesei)和
(Schizophyllum commune)是真菌宿主的实例，虽然也可以使用其它作为选择。
(Schizophyllum commune)是真菌宿主的实例，虽然也可以使用其它作为选择。
[0256] 哺乳动物组织细胞培养物也可用于表达和产生本发明的多肽。在本领域已经开发了很多能够分泌完整变体的适宜宿主细胞，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、NSO细胞、叙利亚仓鼠卵巢细胞系、HeLa细胞或人胚肾细胞系(即HEK293、HEK293EBNA)。
[0257] 哺乳动物细胞的表达载体可以包括表达控制序列如复制起点、启动子、增强子和必需的加工信息位点如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列有来自SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒、Raus肉瘤病毒等的启动子。优选的多聚腺苷酸化位点包括来自SV40和牛生长激素的序列。
[0258] 含有感兴趣的多核苷酸序列的载体(例如编码本发明的组合物和表达控制序列的那些)可以通过已知方法转入细胞宿主中，所述方法根据宿主细胞类型而不同。例如，氯化钙转染常用于原核生物细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可以用于其它细胞宿主。
[0259] 可以采用各种蛋白质纯化方法，这类方法是已知的，并且记载在例如Deutscher,Methods in Enzymology 182:83-9(1990)和Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,Springer-Verlag,NY(1982)中。所选择的纯化步骤将取决于例如用于本发明的组合物的生产方法的性质。
[0260] 多肽可以以基本上纯的或分离形式(例如不含其它多肽)制备。多肽可以存在于相对于可以存在的其它组分(例如其它多肽或其它宿主细胞组分)而言富含多肽的组合物中。例如，可以提供经纯化的多肽，以便多肽存在于基本上不含其它表达蛋白质的组合物中，例如少于90％、少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％或少于1％的组合物由其它表达蛋白质构成。
[0261] 脂肪酸部分的合成
[0262] 流程1描述了式A2脂肪酸部分的合成。
[0263]
[0264] 其中P1和P2是羧酸保护基如甲基、乙基、叔丁基、甲氧基苄基、苄基、苄基氧基、甲氧基甲基、甲基硫甲基、四氢吡喃基、苯甲酰基甲基、N-苯邻二甲酰亚胺、肉桂基、三苯基甲基、9-蒽基甲基、胡椒基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基或2-烷基1,3噁唑啉；其中LG是离去基如卤素(例如Br、Cl、I)或三氟甲磺酰基氧基，和其中R4和p如实施方案1中所述。
[0265] 在碱(例如氢化钠、碳酸钾或碳酸铯、氢氧化钠、二异丙基氨基锂、双(三甲基甲硅烷基) 氨基钠、双(三甲基甲硅烷基)氨基钾、四甲基哌啶锂(lithium tertamethylpiperidide)、1,8-二氮杂环十一碳-7-烯、N,N-二异丙基乙基胺或2,6-二叔丁基putridine)的存在下、在溶剂如DMF、THF或二甲基乙酰胺中用烷基化剂(1B)使被保护的丙二酸(1A)烷基化，产生了被保护的脂肪酸部分(1C)。当R4是OH或CO2H时，在烷基化步骤之前可以要求对这些官能团进行保护。羟基保护基是本领域已知的，例如有：1.醚，例如甲基醚、甲氧基甲基醚(MOM)、四氢吡喃基醚(THP)、叔丁基醚、烯丙基醚、苄基醚、叔丁基二甲基甲硅烷基醚、叔丁基二苯基甲硅烷基醚、三苄基甲硅烷基醚、异丙基二甲基甲硅烷基醚、三苯基甲基醚、硝基苄基醚、2.酯和碳酸酯，例如乙酸酯、甲酸酯、三氯乙酸酯、苯氧基乙酸酯、新戊酸酯、苯甲酸酯、甲基碳酸酯、苄基碳酸酯、烯丙基碳酸酯、硝酸酯、adamanoate酯、硝基苯基碳酸酯。
[0266] 式A2脂肪酸部分可采用适当的脱保护方法通过脱保护获得。标准方法可用于采用选自但不限于NaOH、KOH或LiOH的碱或选自但不限于TFA、HCl或BCl3的酸将中间体(1C)进行水解。当P1或P2是苄基或甲氧基苄基时，优选的脱保护方法是在催化剂、例如但不限于披钯碳的存在下氢化。
[0267] 流程2解释了其中R1是C(O)2H的式A1脂肪酸部分的合成。
[0268]
[0269] 其中P1和P2、LG如上文所定义，且R2、R3、n和m如实施方案1中所定义。
[0270] 被保护的丙二酸(1A)用烷基化剂(2A)和(2C)进行了2步连续的烷基化，它们的顺序可以颠倒，然后如上文流程1中所述采用适当的方法进行脱保护。当R2和R3是OH或CO2H时，在烷基化步骤之前可以要求对这些官能团进行保护。
[0271] 其中R1是H的式A1脂肪酸部分可以通过将相应的其中R1是CO2H的式A1脂肪酸部分进行脱羧来制备。脱羧条件是本领域已知的，例如在碱性条件(例如氢氧化铵)下脱羧。
[0272] 生物分子-连接基构建体的合成
[0273]
[0274] 其中B是生物分子或其修饰形式，Z1是C1-C20亚烷基连接基，其中亚烷基链任选被氧代基(＝O)取代，和其中一个或多个碳被O或NH替换；和其中C1是任选被氟取代的单、二或三环碳环或杂环环系。
[0275] 采用标准的酰胺偶联方法，使环炔(3B)经由其羧酸反应活的性基团与生物分子(3A)的氨基残基(例如赖氨酸的侧脸的N-末端的氨基官能团)连接。可以采用已知的偶联方法，包括但不限于在存在或不存在碱如叔胺(例如三乙胺或N,N-二异丙基乙基胺)或K2CO3的情况下用生物分子(3A)将中间体(3B)转化为其活化形式[例如转化为相应的吡咯烷-2,5-二酮(采用标准的N-氢琥珀酰亚胺化学)，采用诸如三光气、羰基二咪唑、氯甲酸4-硝基苯基酯或碳酸二琥珀酰亚胺基酯的试剂转化酸(3B)，采用诸如亚硫酰氯或草酰氯的试剂将酸(3B)转化为相应的酰卤，采用诸如ClC(O)O-异丁基、2,4,6-三氯苯甲酰氯或丙基膦酸酐环状三聚体(T3P)的试剂将酸(3B)转化为相应的混合酸酐，继之以噁唑烷-2,5-二酮、酰卤或混合酸酐的反应]。或者，可以采用缩合试剂、在存在或不存在诸如1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-氮杂苯并三唑或二甲基氨基吡啶的情况下使生物分子3A与酸3B偶联，所述缩合试剂包括但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC HCl)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷子基-(PyBOP)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)- (BOP)。优选地，采用NHS化学将环炔/酸中间体(3B)转化为其活化形式，然后与生物分子上的氨基官能团反应。
[0276] 生物分子的N-末端处的氨基官能团的选择性酰化已经在共同提交的美国申请号62/015,858(律师案卷PAT056275-US-PSP)和62/082,337(律师案件号PAT056275-US-PSP02)中进行了研发和报道。
[0277] 选择性酰化涉及NHS活化环辛炔类似物((3B)的NHS衍生物)与其中N-末端已经被修饰以包括与N-末端氨基酸相邻的组氨酸氨基酸的生物分子的反应。当在pH4进行时，该反应对于N-末端的氨基官能团而言是高度选择性的，这是由于存在组氨酸氨基酸的邻近效应。
[0278] 脂肪酸残基连接基构建体的合成
[0279] 用于点击化学的脂肪酸-连接基构建体
[0280] 流程4描述了具有末端叠氮基官能基团的脂肪酸-PEG连接基构建体的合成。
[0281]
[0282] 其中y是0至34，且FA是式A1、A2或A3中所述的脂肪酸部分，其经由其羧酸官能团之一与PEG连接基连接，FA具有下式：
[0283]
[0284] 脂肪酸部分(4B)经由酰胺偶联反应与含PEG的连接基(4A)连接。已知的偶联方法已经在上文流程3中进行了详细记载。优选地，采用NHS化学使脂肪酸部分上的酸官能团活化。
[0285] 当R1是CO2H、R2、R3和R4是CO2H或OH时，可能需要在偶联反应之前引入保护基以控制反应活性位点。羧酸和羟基基团的保护基已经在上文流程1中有记载。或者，可以采用NHS化学进行羧酸的选择性活化。
[0286] 用于直接与感兴趣的生物分子连接的脂肪酸-连接基
[0287] 流程5描述了具有末端CO2H官能基团的脂肪酸-PEG连接基构建体的合成。
[0288]
[0289] 其中FA如上文流程4中所定义，且y是0至34。
[0290] 脂肪酸(4B)可以采用上文所述的酰胺偶联与含PEG的连接基(5A)连接。
[0291] 用于采用谷氨酰胺转移酶与感兴趣的生物分子连接的脂肪酸-连接基构建体[0292] 流程5A描述了采用谷氨酰胺转移酶制备含有谷氨酸氨基酸的脂肪酸-连接基构建体，其允许了赖氨酸的位置选择性修饰。
[0293]
[0294] 其中y和FA如前面所定义。这类构建体允许赖氨酸的侧链上的氨基基团的选择性位置修饰。蛋白质的这种谷氨酰胺转移酶选择性位置修饰已经在2013年7月11日提交的美国申请号61/845,273(律师案卷号PAT055641-US-PSP)中有记载。
[0295] 本发明的缀合物的合成
[0296] 采用点击化学的缀合
[0297]
[0298] 其中B是感兴趣的生物分子或其修饰形式(例如含组氨酸标签的生物分子或突变体)，且y、C1、Z1、FA和y如上文所定义。
[0299] 用脂肪酸-连接基构建体(4C)的末端叠氮化物使环炔构建体(3C)进行Huisgen环加成，如点击化学中公知的那样。点击化学的实例已经在US 2009/0068738中有记载。
[0300] 采用偶联条件经由直接连接进行的缀合
[0301]
[0302] 其中B是感兴趣的生物分子或其修饰形式(例如含组氨酸标签的生物分子和/或突变体)，且脂肪酸-连接基构建体连接至生物分子的N-末端。
[0303] 采用标准的酰胺偶联方法，将脂肪酸-连接基构建体(5B)经由其羧酸反应活性基团连接至生物分子(3A)的氨基残基(例如连接至赖氨酸的N-末端或侧链的氨基官能团)。已知的偶联方法已经在上文流程3中详细记载。优选地，脂肪酸-连接基构建体上的酸官能团采用NHS化学进行活化。
[0304] 生物分子的N-末端处的氨基官能团的选择性酰化已经在共同提交的美国申请号62/015,858(律师案卷PAT056275-US-PSP)和62/082,337(律师案件号PAT056275-US-PSP02)中进行了研发和报道。选择性酰化涉及NHS活化化合物((5B)的NHS衍生物)与其中N-末端已经被修饰以包括与N-末端氨基酸相邻的组氨酸氨基酸的生物分子的反应。当在pH4进行时，该反应对于N-末端的氨基官能团而言是高度选择性的，这是由于存在组氨酸氨基酸的邻近效应。
[0305] 采用谷氨酰胺转移酶进行的缀合
[0306]
[0307] 生物分子在其赖氨酸侧链的选择性修饰可以采用谷氨酰胺转移酶获得。这类修饰已经报道在2013年7月11日提交的美国申请号61/845,273(律师案卷号PAT055641-US-PSP)或WO 2015/006728(该申请的实施例25)中。
[0308] 药物组合物
[0309] 本发明的缀合物可以以多种方式中的任一种施用，包括皮下、肌内、静脉内、腹腔内、吸入、鼻内、口服等。本发明尤其优选的实施方案使用本发明的缀合物或其酰胺、酯或盐的连续静脉内施用。本发明的缀合物可作为推注或作为连续输注在一段时间内施用。可以使用可植入泵。在本发明的某些实施方案中，间歇或连续缀合物施用持续1天至数天(例如2-3天或更多天)或更长时间段，例如数周、数月或数年。在一些实施方案中，提供间歇或连续缀合物施用至少约3天、优选至少约6天。在其它实施方案中，提供间歇或连续缀合物施用至少约1周。在其它实施方案中，提供间歇或连续缀合物施用至少约2周。在施用期间或在施用多个剂量之间维持平均血浆缀合物浓度高于特定阈值可能是所期望的。可例如基于受治疗者的生理状况、疾病严重性等来确定期望浓度。这些期望值可通过实施标准临床试验来确定。备选地，肽和其缀合物可通过FcRn机制被口服递送(Nat Rev Immunol.7(9),715-25,
2007；Nat Commun.3；3:610,2012,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 304:
G262–G270,2013)。
2007；Nat Commun.3；3:610,2012,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 304:
G262–G270,2013)。
[0310] 另一个方面，本发明提供包含本发明的缀合物或其酰胺、酯、盐及一或多种可药用载体的药物组合物。该药物组合物可被配制用于特定施用途径如口服施用、皮下施用、胃肠外施用和直肠施用等。此外，本发明的药物组合物可以以固体形式(包括但不限于胶囊、片剂、丸剂、颗粒、冻干粉、粉剂或栓剂)或以液体形式(包括但不限于溶液剂、混悬剂或乳剂)制备。可对药物组合物进行常规医药操作(例如无菌生产、灭菌)和/或可含有常规惰性稀释剂、块成形剂(cake forming agents)、张度剂、润滑剂或缓冲剂、以及辅助剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂和缓冲剂等。
[0311] 适于注射的药物组合物通常包括无菌水溶液(当可溶于水时)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。
[0312] 对于静脉内施用而言，适宜的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有情形下，组合物均应当是无菌的，并且应当是以易于注射的程度流动的。优选的药物制剂在制造和储存条件下是稳定的，而且必须能在抵抗微生物(例如细菌和真菌)污染作用的情况下保存。一般而言，相关载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其适宜的混合物。可通过例如使用诸如卵磷脂的包衣、在分散剂的情况下通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂如对羟基苯甲酸、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现对微生物作用的预防。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂如糖、多元醇(例如甘露醇)、氨基酸、山梨醇、氯化钠是优选的。可通过将可延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶纳入组合物中来延长可注射组合物的吸收。在一些实施方案中，多功能赋形剂如重组白蛋白可以引入制剂过程中以有助于缀合物产品对抗降解或聚集的稳定性、改善溶解性和帮助活性组分的施用和释放(BioPharm International,2012,第23卷,第3期,第40-44页)。
[0313] 某些可注射组合物是等渗水溶液或混悬液，栓剂有利地从脂肪乳液或混悬液制备。所述组合物可被灭菌和/或含有辅助剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可以含有其它治疗上有价值的物质。所述组合物分别根据常规混和、制粒或包衣方法来制备，并且含有约0.1-75％或含有约1-50％的活性成分。
[0314] 无菌可注射溶液可通过以下方式制备：将所需量的活性化合物与上文所列举的成分中的一种或组合掺入适当溶剂中，如需要的那样，随后过滤灭菌。通常，分散体通过将活性化合物掺入含有碱性分散介质和来自那些上文所列举的所需其它成分的无菌载体中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情形下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分和来自先前经灭菌过滤的其溶液的任意另外的期望成分的粉末。
[0315] 口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。出于口服治疗施用的目的，活性化合物可掺入到赋形剂中，以片剂、含锭(troches)或胶囊(例如明胶胶囊)的形式使用。口服组合物还可使用漱口用流体载体来制备。医药上相容的粘合剂和/或辅助材料可作为组合物的一部分被包含其中。片剂、丸剂、胶囊、含锭等可含有任意以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或矫味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精。用于经口递送的制剂可有利地引入用于改进在胃肠道内的稳定性和/或增强吸收的物质。
[0316] 对于通过吸入施用而言，本发明的治疗剂优选地从含有适宜抛射剂(例如诸如二氧化碳的气体)的加压容器或分配器或从喷雾器中以气溶胶喷雾剂形式递送。应注意到，肺为治疗剂的全身递送提供了很大的表面积。
[0317] 可将这些活性剂囊封于例如聚合微粒中，例如在美国公开20040096403中描述的那些，或与本领域已知的各种其它药物递送载体中的任一种联合。在本发明的其它实施方案中，活性剂与带电脂质联合递送，例如在美国公开20040062718中所述的那样。应注意到，后一系统已用于施用治疗性多肽、胰岛素，这表明这一系统适用于施用肽物质。
[0318] 还可通过经黏膜或经皮方式来实施全身施用。
[0319] 适用于经皮施用的组合物包括有效量的本发明的缀合物与适宜的载体。适用于经皮递送的载体包括帮助穿过宿主皮肤的可吸收性药理上可接受的溶剂。例如，经皮装置为绷带形式，其包含背衬部件、含有该化合物(任选地含有载体)的贮库、任选的速度控制屏障(其以受控的和预定的速度在延长时间递送化合物至宿主皮肤)以及将装置固定至皮肤上的工具。
[0320] 适用于局部施用(例如施用至皮肤及眼睛)的组合物包括水溶液、混悬液、软膏、乳膏、凝胶或例如通过气溶胶递送的可喷雾制剂等。此类局部递送系统将尤其适用于真皮施用。因此，它们特别适用于本领域熟知的局部施用制剂，包括化妆品制剂。其可含有增溶剂、稳定剂、张力增加剂、缓冲剂和防腐剂。
[0321] 在一些实施方案中，药物组合物用于皮下施用。适用于多肽治疗剂(例如抗体、融合蛋白等)的皮下施用的制剂组分和方法是本领域已知的。参见例如已公开的美国专利申请号2011/0044977和美国专利号8,465,739和美国专利号8,476,239。通常，用于皮下施用的药物组合物含有适宜的稳定剂(例如氨基酸如甲硫氨酸和或糖如蔗糖)、缓冲剂和张力剂(tonicifying agents)。
[0322] 如本文所用的局部施用还可涉及吸入或鼻内施用。它们可在使用或未使用适宜抛射剂的情况下以干燥粉末形式(单独、作为混合物(例如与乳糖的干混合物)或混合组分颗粒(例如与磷脂的))从干粉吸入器或以气溶胶喷雾形式从加压容器、泵、喷射器、雾化器或喷雾器中方便地递送。
[0323] 本发明还提供了药物组合物和剂型，其包含一种或多种可降低作为活性成分的本发明的化合物的分解速率的物质。本文称作“稳定剂”的此类物质包括但不限于抗氧化剂(例如抗坏血酸)、pH缓冲剂或盐缓冲剂、重组白蛋白。
[0324] 如本文所用的术语“可药用盐”指保持了本发明的缀合物的生物有效性和性质并且其通常在生物上或在其它方面不是不期望的盐。在许多情形下，本发明的缀合物能够借助氨基和/或羧基或与之类似的基团的存在形成酸和/或碱盐。
[0325] 可使用无机酸和有机酸来形成可药用的酸加成盐，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、chlortheophyllonate、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八烷酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、巴莫酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
[0326] 可由其衍生盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可由其衍生盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、羟乙酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。可与无机碱和有机碱来形成可药用的碱加成盐。
[0328] 可由其衍生盐的有机碱可包括例如伯、仲和叔胺、取代胺包括天然存在的取代胺、环状胺、碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙基胺、苄星(benzathine)、胆碱盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪及氨丁三醇。
[0329] 本发明的可药用盐可通过惯用化学方法从母体化合物、碱性或酸性部分来合成。通常，这些盐可通过使这些化合物的游离酸形式与化学计量的适当碱(例如Na、Ca、Mg或K的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)进行反应来制备，或通过使这些化合物的游离碱形式与化学计量的适当酸进行反应来制备。这些反应通常是在水或有机溶剂或二者的混合物中进行。通常，在可行的情况下，使用非水性介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是合乎需要的。其它适宜的盐的列表可例如在“Remington's Pharmaceutical Sciences”,第20版,Mack出版公司,伊斯顿,Pa.,(1985)；和Stahl和Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use”(Wiley-VCH,Weinheim,德国,2002)中找到。
[0330] 如本文所用的术语“可药用载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣材料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、多功能赋形剂如重组白蛋白等及其组合，其对本领域技术人员而言是已知的(例如参见Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329)。除了其与活性成分不相容以外，在治疗或药物组合物中考虑使用任何常规载体。
[0331] 本发明的方法
[0332] 已经报道了GDF15循环水平在多种病理学和生理学状况、最常见是妊娠(Moore AG 2000.J Clin Endocrinol Metab 85:4781-4788)、β-地中海贫血(Tanno T 2007,Nat Med
13:1096-101)(Zimmermann MB,2008Am J Clin Nutr 88:1026-31)和先天性红细胞生成障碍性贫血(Tamary H 2008,Blood.112:5241-4)中升高。在文献报道中，GDF15HIA已经与多种生物活性联系。GDF15敲除和转基因小鼠的研究提示，GDF15可以保护性对抗缺血性/再灌注-或超负荷-诱导的心脏损伤(Kempf T,2006,Circ Res.98:351-60)(Xu J,2006,Circ Res.98:342-50)、保护性对抗年龄相关性运动神经元和感觉神经元损失(Strelau J、2009,J Neurosci.29:13640-8)、温和地保护性对抗肾脏的代谢性酸中毒和可引起癌症患者的恶病质(Johnen H 2007Nat Med.11:1333-40)。很多小组还研究了GDF15在细胞凋亡和增殖中的作用，并采用不同的细胞培养物和异种移植物模型报道了有争议的结果。对转基因小鼠的研究显示，GDF15保护性地对抗致癌物或Ape突变引起的肠和肺中的瘤形成(Baek SJ
2006,Gastroenterology.131:1553-60；Cekanova M 2009,Cancer Prev Res 2:450-8)。
13:1096-101)(Zimmermann MB,2008Am J Clin Nutr 88:1026-31)和先天性红细胞生成障碍性贫血(Tamary H 2008,Blood.112:5241-4)中升高。在文献报道中，GDF15HIA已经与多种生物活性联系。GDF15敲除和转基因小鼠的研究提示，GDF15可以保护性对抗缺血性/再灌注-或超负荷-诱导的心脏损伤(Kempf T,2006,Circ Res.98:351-60)(Xu J,2006,Circ Res.98:342-50)、保护性对抗年龄相关性运动神经元和感觉神经元损失(Strelau J、2009,J Neurosci.29:13640-8)、温和地保护性对抗肾脏的代谢性酸中毒和可引起癌症患者的恶病质(Johnen H 2007Nat Med.11:1333-40)。很多小组还研究了GDF15在细胞凋亡和增殖中的作用，并采用不同的细胞培养物和异种移植物模型报道了有争议的结果。对转基因小鼠的研究显示，GDF15保护性地对抗致癌物或Ape突变引起的肠和肺中的瘤形成(Baek SJ
2006,Gastroenterology.131:1553-60；Cekanova M 2009,Cancer Prev Res 2:450-8)。
[0333] 还已经报道了GDF15在炎症、癌症和代谢中有作用(Samule Breit等人,Growth Factors,2011年10月；29(5):187-195)。GDF15还已经牵涉在生理学食欲和体重的调节中(Vicky Wang-Wei Tsai等人,Public Library of Science:PLOS ONE 2013,第8卷,第2期,e55174)。
[0334] 本发明提供了在需要其的受治疗者中治疗或预防代谢障碍或疾病、糖尿病、2型糖尿病、肥胖、胰腺炎、血脂异常症、酒精性和非酒精性脂肪肝疾病/脂肪性肝炎和其它进行性肝疾病、抗胰岛素性、高胰岛素血、葡糖耐受不良、高血糖、代谢综合征、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、糖尿病并发症(包括但不限于慢性肾病)、神经病、胃轻瘫和其它代谢障碍的方法，该方法包括：给所述受治疗者施用治疗有效量的本发明的缀合物或其酰胺、酯或盐或缀合物的混合物，其中所述生物分子是人生长分化因子15(GDF15)和其同系物、变体、突变体、片段和其它修饰形式。
[0335] 该方法可以具有诸如降低施用频率的有利作用。
[0336] 因此，作为进一步的实施方案，本发明提供了如本文所述的缀合物或其酰胺、酯或可药用盐或本文所述的缀合物的混合物用于治疗代谢障碍或疾病、2型糖尿病、肥胖、胰腺炎、血脂异常症、酒精性和非酒精性脂肪肝疾病/脂肪性肝炎和其它进行性肝疾病、抗胰岛素性、高胰岛素血、葡糖耐受不良、高血糖、代谢综合征、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、糖尿病并发症(包括但不限于慢性肾病)、神经病、胃轻瘫和其它代谢障碍的用途，其中所述生物分子是人生长分化因子15(GDF15)、其同系物、变体、突变体、片段和其它修饰形式。
[0337] 因此，作为进一步的实施方案，本发明提供了缀合物或其酰胺、酯或可药用盐或缀合物的混合物在疗法中的用途。
[0338] 治疗上使用的本发明的药物组合物或组合的有效量将取决于例如治疗背景和目标。本领域技术人员应了解，用于治疗的适当剂量水平因此将部分地根据所递送的分子、使用该缀合物的适应症、施用途径以及患者的尺寸(体重、体表或器官尺寸)和情况(年龄及健康状况)而改变。因此，临床医师可确定剂量并改变施用途径以获得最佳治疗效果。根据上述因素，典型剂量可以是约0.1μg/kg至高达约100mg/kg的范围或更高。在其它实施方案中，剂量范围可以是0.1μg/kg直至约100mg/kg；或1μg/kg直至约100mg/kg。在该实施方案的另一方面，剂量范围可以是5μg/kg至25μg/kg。在该实施方案的另一方面，剂量范围可以是10μg/kg至20μg/kg。
[0339] 给药频率将取决于所用制剂中的双重功能蛋白的药物动力学参数。通常，临床医师将施用组合物直至达到可实现期望效果的剂量。因此，组合物可作为单一剂量施用，按时间以两个或更多个剂量施用(各剂量可以或可不含有相同量的期望分子)，或通过植入装置或导管以连续输注方式施用。适当剂量的进一步细分是本领域技术人员以常规方式实施并在他们所实施的常规任务的范围内。可通过使用适当剂量-反应数据来确定适当剂量。
[0340] 如本文所用的术语"治疗有效剂量"和"治疗有效量"指缀合物在组织系统、动物或人类中引起研究者、医生或其它临床医师所追寻的生物学或医学响应的量，其包括缓解或改善所治疗疾病或障碍的症状，即支持可观测水平的一种或多种预期的生物学或医学响应的GDF15(或GDF15突变体)多肽缀合物的量，所述响应例如有降低血液葡萄糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平；降低体重；减少食物摄入或改善葡萄耐量、能量消耗或胰岛素敏感性)。
[0341] 术语"患者"或"受治疗者"可互换地用于指人或非人动物(例如哺乳动物)。
[0342] 在一项实施方案中，如本文所用的术语“治疗”任意疾病或障碍指改善该疾病或障碍(即减缓或阻止或减轻该疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一项实施方案中，“治疗”指减轻或改善至少一个身体参数，包括患者不能感受到的那些。在另一个实施方案中，“治疗”指在身体方面调控疾病或障碍(例如稳定可感受到的症状)或在生理学方面调控疾病或障碍(例如稳定身体参数)或二者。因此，治疗包括抑制(即阻止疾病、障碍或病症或与之相关的临床症状的发展或进一步发展)活性疾病(例如在GDF15缀合物的情况中，以便减轻体重、减少食物摄入、降低血流中的胰岛素和/或葡萄糖水平、增加葡萄糖耐量以使得葡萄糖水平的波动最小，和/或以便保护避免葡萄糖内稳态破坏导致的疾病)。
[0344] 如本文所用的术语"需要该治疗"指医师或其它看护者做出的患者需要或将受益于治疗的判断。这种判断是基于医师或看护者经验范围内的多种因素做出的。
[0345] 术语"预防"、"阻止"等指以一种方式(例如在疾病、障碍、病症或其症状发作前)开始的动作过程(例如施用本发明的缀合物包含缀合物的药物组合物)，从而暂时地或永久地阻止、遏制、抑制或减少受治疗者发展出疾病、障碍、病症等的风险(如通过例如不存在临床症状所确定的那样)或延缓其发作，通常是在受治疗者容易患有特定疾病、障碍或病症的背景下。在某些情况中，该术语还指减缓疾病、障碍或病症的进程或抑制其进展为有害的或其它方面不期望的状态。
[0346] 术语"代谢疾病或障碍"指一系列相关的特质，包括但不限于高胰岛素血、异常葡萄糖耐量、肥胖、脂肪至腹部或上身腔室的再分布、高血压、以高甘油三酯为特征的血脂异常症、低的高密度脂蛋白(HDL)-胆固醇和高的小而密低密度脂蛋白(LDL)颗粒。患有代谢疾病或障碍的受治疗者处于发展出2型糖尿病和例如动脉粥样硬化的风险中。
[0347] 短语"葡萄糖代谢障碍"囊括以与受治疗者相对于健康个体的葡萄糖水平升高和/或胰岛素水平升高相关的临床症状或临床症状组合为特征的任意障碍。葡萄糖和/或胰岛素水平升高可以表现在如下疾病、障碍和病症中：高血糖、II型糖尿病、妊娠糖尿病、I型糖尿病、抗胰岛素性、葡萄糖耐量降低、高胰岛素血、葡萄糖代谢受损、前驱糖尿病、代谢障碍(例如代谢疾病或障碍，其也称为X综合征)和肥胖等。本公开内容的GDF15缀合物及其组合物可用于例如获得和/或维持葡萄糖内稳态，例如降低血流中的葡萄糖水平和/或降低胰岛素水平至在健康个体中发现的范围。
[0348] 如本文所用的术语"抗胰岛素性"指其中正常量的胰岛素不能产生正常的生理学或分子响应的病症。在一些情况中，超过生理学量的胰岛素(内源性产生或外源性施用)能够完全地或部分地克服抗胰岛素性，并产生生物学响应。
[0349] 如本文所用的短语"葡萄糖耐量"指当葡萄糖摄入波动时个体控制血浆葡萄糖和/或血浆胰岛素水平的能力。例如，葡萄糖耐量包括个体在约120分钟内使血浆葡萄糖降回摄入葡萄糖之前测定的水平的能力。
[0350] 术语“葡糖耐受不良”或“葡萄糖耐量降低(IGT)”是血糖代谢障碍的前驱糖尿病状态，其伴有心血管病状的风险增加。前驱糖尿病病状阻止患者将葡萄糖有效地移入细胞中和将其用作有效的燃料来源，导致血液葡萄糖水平增加和某个程度的抗胰岛素性。
[0351] 术语“2型糖尿病”是以葡萄糖产生过量为特征的病症，循环葡萄糖水平由于葡萄糖清除不足够和胰腺不能产生足够的胰岛素而保持过分地高。
[0352] 如本文所用的术语"高血糖"指其中相对于健康个体而言增加量的葡萄糖在患者的血浆中循环的病症。高血糖可以采用本领域已知的方法、包括如本文所述的空腹血糖水平测定来诊断。
[0353] 术语“低血糖症”还称为低血糖，其在血液葡萄糖水平下降过低以至于不能给身体活动提供足够能量时发生。
[0354] 如本文所用的术语"高胰岛素血"指其中循环胰岛素水平增加的病症，同时血液葡萄糖水平增加或正常。高胰岛素血可以由抗胰岛素性引起，其伴有血脂异常症如高甘油三酯、高胆固醇、高低密度脂蛋白(LDL)和低高密度脂蛋白(HDL)；高尿酸水平；多囊卵巢综合征；II型糖尿病和肥胖。高胰岛素血可以诊断为具有高于约2pU/mL的血浆胰岛素水平。
[0355] 术语“胰腺炎”是胰腺的炎症。
[0356] 术语“血脂异常症”是脂蛋白代谢的障碍，包括脂蛋白超量产生或缺乏。血脂异常症可以通过血液中总胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和甘油三酯浓度升高和高密度脂蛋白(HDL)胆固醇浓度下降来表现。
[0357] 术语“脂肪肝疾病(FLD)”还称为脂肪肝，它是其中甘油三酯脂肪的大泡经由脂肪变性过程在肝细胞中蓄积(即脂质在细胞内异常滞留)的病症。尽管有多种起因，脂肪肝可以被认为是在世界范围在过度饮酒和肥胖的那些中发生的单一疾病(有或无抗胰岛素性胰岛素的作用)。当该脂肪代谢过程被破坏，脂肪可以在肝脏中过量蓄积，因而导致脂肪肝。脂肪蓄积还可以伴有肝脏的进行性炎症(肝炎)，称为脂肪性肝炎。通过考虑酒精的贡献，脂肪肝还称为酒精性脂肪变性或非酒精性脂肪肝疾病非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和更严重的形式如酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
[0358] 术语“脂肪性肝炎”是一种以肝细胞的脂肪变化为特征的肝脏疾病，伴有小叶内炎症和纤维变性。当不与过量酒精摄入相关时，其称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
[0359] 术语“进行性肝疾病”是多种肝脏病状引起的肝脏疾病，其从相对良性的状态如肝脂肪变性发展为更严重的状态、包括肝炎、纤维变性、肝硬化和肝细胞癌。PNPLA3已经被明确地与进行性肝疾病如NAFLD/NASH、AFLD/ASH、病毒性肝炎、Wilson’s疾病、遗传性血色病和原发性硬化性胆管炎相关联(Paola Dongiovanni等人,World Journal of Gastroenterology,2013,19(41),6969-6978).
[0360] 就人患者而言的术语“肥胖”可以定义为体重指数(BMI)为30或更高的成人(Centers for Disease Control and Prevention)。“代谢综合征”可以定义为一系列增加心脏疾病和其它疾病如糖尿病和中风的风险的危险因素。这些危险因素包括：高血糖—禁食后至少110毫克/分升(mg/dl)；高甘油三酯—血流中至少150mg/dL；低HDL--少于40mg/dl；和130/85mmHg或更高的血压(World Health Organization)。
[0361] 术语“心血管疾病”是与心脏或血管相关的疾病。
[0362] 术语“动脉粥样硬化”是以大动脉和中等大小的动脉的内膜中的不规律分布的脂质沉积为特征的血管疾病，有时导致动脉管腔缩窄和最终发展为纤维变性和钙化。病损通常是局部的，缓慢和间歇地进行。血液流速的受限导致大多数临床表现，所述临床表现随病损的分布和严重性而不同。
[0363] 术语“冠心病”还称为冠状动脉疾病，其为供应血液和氧气至心脏的小血管变窄。
[0364] “糖尿病并发症”是高血葡萄糖水平引起的问题，具有其它身体功能如肾脏、神经(神经病)、足(足溃疡和循环不佳)和眼(例如视网膜病变)。糖尿病还增加了心脏疾病和骨和关节障碍的风险。糖尿病的其它长期并发症包括皮肤问题、消化问题、性功能障碍以及牙齿和牙龈问题。
[0365] 如本文所用的短语"体重障碍"指与体重过重和/或食欲增加相关的病症。各种参数用于确定个体相对于参比健康个体而言是否超重，包括个体的年龄、身高、性别和健康状态。例如，通过评价个体的体重指数(BMI)可以认为个体是超重的或肥胖的，体重指数(BMI)是通过将个体体重的千克数除以个体身体的米数的平方计算而得。BMI范围为-18.5至-24.9kg/m的成人被认为具有正常体重；BMI为-25至-29.9kg/m的成人被认为是超重的(肥胖前期)；BMI为-30kg/m或更高的成人可以被认为是肥胖。食欲增加经常导致体重过重。存在一些伴有食欲增加的病症，包括例如夜食综合征，其特征为早晨食欲缺乏和晚间多食且常伴有失眠，但是其可以与下丘脑损害相关。
[0366] 除非本文另外指明或上下文另外明显矛盾，否则本文所述所有方法均可以任意适宜的顺序实施。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，而不对要求保护的本发明的范围进行任何限制。
[0367] 本发明的缀合物的活性和血浆稳定性可以通过下文描述的如下方法进行评价。
[0368] 分析和数据
[0369] 本发明的实施例1和19B的GDF15缀合物活性和血浆稳定性可以按照下文描述的体外和体内方法来评价。
[0370] 动物研究方法
[0371] 这份文件中描述的所有动物研究由生物医学研究动物照顾和使用委员会诺华研究所(Novartis Institutes for Biomedical Research Animal Care and Use Committee)按照地方和联邦规程和指导所批准。饮食诱导的肥胖雄性小鼠(C57BL/6NTac)购自Taconic并从6周龄开始喂食60％脂肪饮食(研究饮食D12492i)。到达后，将小鼠以每个笼子一只动物在12h:12h反亮-暗循环下进行圈养。在任意使用之前，动物均接受最少1周的适应期。通常小鼠在3-4月龄进行研究。在研究前一天，将小鼠按照体重随机分配，以便每组具有相似的平均体重。在研究当天，将小鼠放在新鲜笼子中，移除旧的食物。约1小时后和临近暗循环之前，小鼠接受溶媒(30mM乙酸钠,pH4)或脂质缀合的GDF15类似物(0.5mg/kg)的单次皮下剂量。在所有注射完成后，将小鼠重新称重，重新供应确定量的食物(每只小鼠～
50g)。历经2周历程、在图中指定的时间测定食物摄入和体重。在如上所述处置的替代动物中，在指定时间收集血浆，通过ELISA、按照生产商的指示(R&D Systems Quantikine Human GDF15Immunoassay；DGD150)测定GDF15水平。
50g)。历经2周历程、在图中指定的时间测定食物摄入和体重。在如上所述处置的替代动物中，在指定时间收集血浆，通过ELISA、按照生产商的指示(R&D Systems Quantikine Human GDF15Immunoassay；DGD150)测定GDF15水平。
[0372] DIO小鼠单次0.5mg/kg sc剂量
[0373] 在如上所述的分析中测试本发明的缀合物的活性和半衰期。
[0374] 表1
[0375]
[0376]
[0377] *瘦小鼠(Lean mice)
[0378] Exp 1:体内实验1；Exp 2:体内实验2。
[0379] 表1中的数据证明，本发明的缀合物与未缀合的hGDF15相比和/或与聚乙二醇化hGDF15相比具有显著更长的作用持续时间。
[0380] GDF15-缀合物在饲料喂养的狗中的效力：GDF15-脂肪酸缀合物
[0381] 研究目标：为了在比格犬中在急性设置(6小时)中和历经96小时时期评价皮下施用0.05mg/kg本发明的GDF15-脂肪酸部分缀合物或溶媒对照对食物摄入的效力。在整个14天的给药后时期在不同时间点收集血浆样品，以评价该化合物的PK性质。在整个研究中测定体重。
[0382] 动物：基线体重和处置
[0383]狗ID 体重(kg) 处置
50 12.65 溶媒
62 8.85 溶媒
77 10.15 溶媒
67 8.85 GDF15
73 9.95 GDF15
75 12.25 GDF15
50 12.65 溶媒
62 8.85 溶媒
77 10.15 溶媒
67 8.85 GDF15
73 9.95 GDF15
75 12.25 GDF15
[0384] 表2
[0385] 给药方法：在基线体重和血样收集后，给予溶媒或GDF15。GDF15-脂肪酸部分缀合物作为0.97mg/ml溶液供应，在没有稀释的情况下以0.05mg/kg皮下注射进行给药。将等体积的30mmol/l乙酸钠pH4溶媒(52μl/kg)通过皮下注射给予溶媒动物。
[0386] 血液收集：从头或颈静脉采集血样(3mL,在含有EDTA和蛋白酶抑制剂Diprotin A和抑肽酶的试管中)，放置在冰上直至于4℃以3,000rpm离心20分钟。将血浆以等分试样分配，于-70℃储存至分析。收集以下时间点：0、6.75、24.75、48.75、72.75和96.75小时。在第7、10和14天收集另外的样品。
[0387] 食物摄入测定：在给药后45分钟开始随意食物摄入的测定。该食物摄入测定由两个阶段组成：急性测定(0-6小时)和亚慢性测定(0-96小时)。
[0388] 从0-2小时，对狗给予500g普通饲料(Hill’s J/D饮食)。在2小时，移出剩余食物并称重，在2-4小时时期提供另外500g饲料。在4小时，移出剩余食物并称重，在4-6小时时期提供另外300g饲料。在6小时，移出剩余食物并称重。在该时间(6.75小时)收集血样。然后给狗提供500g饲料过夜。在第1-4天的早晨，移出剩余食物并称重，从每只动物收集血样。在第1-3天，然后给狗提供500g饲料达24小时时期。在第4天，将狗返回至它们的正常饲料配给(260g)。
[0389] 另外的食物摄入测定：在第7、14和28天，给予研究动物6小时以食用它们的每日饲料(260g)。在该时期结束时，收集任何剩余的食物并称重。
[0390] 体重测定：在基线和第2、4、7、10、14、18和28天测定体重。在禁食状态收集基线体重。在第2和4天收集的体重是未禁食的。对于溶媒处置的动物，所有其它体重在禁食状态收集。对于GDF15处置的动物，在第7-28天测定的体重是未禁食的，因为动物被连续给予食物以刺激食欲和获得体重。
[0391] 在饲料喂养的狗中的本发明的GDF15-脂肪酸分析缀合物的效应
[0392] 研究目标：为了在比格犬中在急性设置(6小时)中和历经96小时时期评价皮下施用溶媒对照和0.015mg/kg或0.005mg/kg本发明的GDF15-脂肪酸部分缀合物对食物摄入的效力(在该研究中，在所有狗中，溶媒组将在处置组之前进行)。在整个14天的给药后时期在不同时间点收集血浆样品，以评价该化合物的PK性质。在整个研究中测定体重。
[0393] 动物：基线体重和处置
[0394]
[0395]
[0396] 表3
[0397] 给药方法：在基线体重和血样收集后，给予溶媒剂量。通过皮下注射将52μl/kg 30mmol/l乙酸钠pH4溶媒(52μl/kg)给予溶媒动物。GDF15的给药在基线体重和血样收集后进行。GDF15-脂肪酸部分缀合物作为1.20mg/ml溶液供应，在稀释后以0.015mg/kg和
0.005mg/kg通过皮下注射进行给药。将GDF15储备液进行稀释以维持在前面研究中递送的
52μl/kg。
0.005mg/kg通过皮下注射进行给药。将GDF15储备液进行稀释以维持在前面研究中递送的
52μl/kg。
[0398] 血液收集：从研究的溶媒组和治疗组采集血样。从头或颈静脉采集血样(3mL,在含有EDTA和蛋白酶抑制剂Diprotin A和抑肽酶的试管中)，放置在冰上直至于4℃以3,000rpm离心20分钟。将血浆以等分试样分配，于-70℃储存至分析。收集以下时间点：0、6.75、24.75、48.75、72.75和96.75小时。在第7、10和14天收集另外的样品。
[0399] 食物摄入测定：在研究的溶媒组和处置组期间测定食物摄入。在给药后45分钟开始随意食物摄入的测定。该食物摄入测定由两个阶段组成：急性测定(0-6小时)和亚慢性测定(0-96小时)。
[0400] 从0-2小时，对狗给予500g普通饲料(Hill’s J/D饮食)。在2小时，移出剩余食物并称重，在2-4小时时期提供另外500g饲料。在4小时，移出剩余食物并称重，在4-6小时时期提供另外300g饲料。在6小时，移出剩余食物并称重。在该时间(6.75小时)收集血样。然后给狗提供500g饲料过夜。在第1-4天的早晨，移出剩余食物并称重，从每只动物收集血样。在第1-3天，然后给狗提供500g饲料达24小时时期。在第4天，将狗返回至它们的正常饲料配给(260g)。
[0401] 另外的食物摄入测定：在溶媒组第7和14天期间和在治疗组第7和28天之间的各天，给予研究动物6小时以食用它们的每日饲料(260g)。在该时期结束时，收集任何剩余的食物并称重。每周一次进行食物食用的定时测定。在喂食后1、2、4和6小时测定225g饲料的食用以测定释放每只动物的食用情况已经返回至正常。
[0402] 体重测定：在该研究的溶媒组和处置组期间测定体重。在溶媒组期间，在基线和第2、4、7、10和14天测定体重。在处置组期间，在基线和第2、4、7、10、14、17、21、24和28天测定体重。在第2和4天收集的体重是未禁食的。所有其它体重在禁食状态收集。
[0403] 在上述分析中测试了实施例2的缀合物。
[0404] 狗单次sc剂量
[0405]
[0406] 表4
[0407] GDF15-缀合物改善肥胖小鼠中代谢疾病、包括糖尿病和脂肪肝疾病的测定[0408] 饮食诱导的肥胖小鼠每周一次给予溶媒或实施例19Bm(0.5mg/kg/s.c.)达4周。在第一次剂量后2周测定非禁食葡萄糖和胰岛素，在第一次剂量后4周测定过夜禁食葡萄糖和胰岛素。实施例19Bm降低非禁食葡萄糖达23％(207.1mg/dl溶媒处置vs.160.4mg/dl实施例19Bm；p<0.05)。实施例19Bm与溶媒处置的小鼠相比降低非禁食胰岛素水平达75％(2.1vs
8.7ng/ml；p<0.05)。初始剂量后4周，实施例19Bm降低禁食血葡萄糖达28％
(142.7vs.199.5mg/dl；p<0.05)和降低禁食胰岛素达78％(0.77vs.3.5ng/ml；p<0.05)。脂肪肝疾病的标记也通过实施例19Bm的四个每周一次剂量得以改善。实施例19Bm降低肝脂肪变性达57.5％(11.36vs.26.73％肝脂肪；p<0.05)和降低肝细胞损害标记丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血清水平达58％(46.2vs.110.5U/L；p<0.05)。另外，实施例19Bm降低PNPLA3(进行性肝疾病中的原因性基因)的肝脏表达达77％(p<0.05)。
8.7ng/ml；p<0.05)。初始剂量后4周，实施例19Bm降低禁食血葡萄糖达28％
(142.7vs.199.5mg/dl；p<0.05)和降低禁食胰岛素达78％(0.77vs.3.5ng/ml；p<0.05)。脂肪肝疾病的标记也通过实施例19Bm的四个每周一次剂量得以改善。实施例19Bm降低肝脂肪变性达57.5％(11.36vs.26.73％肝脂肪；p<0.05)和降低肝细胞损害标记丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血清水平达58％(46.2vs.110.5U/L；p<0.05)。另外，实施例19Bm降低PNPLA3(进行性肝疾病中的原因性基因)的肝脏表达达77％(p<0.05)。
[0409] 本发明的实施例20和21的APJ-激动剂缀合物的活性和血浆稳定性可以按照下文描述的体外和体内方法进行评价。
[0410] hAPJ钙流分析：
[0411] 将Chem-5APJ稳定细胞(Millipore#HTS068C)以384孔模式以10,000个细胞/孔铺于25ul生长培养基中，然后在37℃组织培养箱中生长24小时。在分析前1小时，添加25ul/孔FLIPR钙4染料(Molecular Devices R8142)和2.5mM丙磺舒，在37℃组织培养箱中培育细胞1小时。将肽溶于HBSS、HEPES&0.1％BSA缓冲液中，一式三份从50uM至5pM连续稀释10倍。使用FLIPR Tetra将肽添加至具有染料的细胞中(1:5，最终肽浓度为10uM至1pM)。细胞内部的FLIPR染料在结合至钙后发射荧光，而来自细胞外部的荧光则被遮蔽。在FLIPR Tetra上使用470-495激发波长及515-575发射波长来测量荧光。在肽添加前10秒开始进行读数，总计读数3分钟。针对每个肽浓度计算最大-最小值并作图，并针对肽对钙流的刺激使用GraphPad prism软件来计算曲线拐点处的EC50值。
[0412] 体内分析：
[0413] 将缀合物溶于PBS(磷酸盐缓冲盐水)中至1mg/ml的浓度以形成给药溶液。经由外侧尾静脉将给药溶液以1ml/kg的体积(相当于1mg/kg的剂量)经静脉内施用至雄性Sprague-Dawley大鼠。在给药后在指定时间从颈静脉导管取静脉血样并立即放置在湿冰上。将这些样品于4℃离心，将上清血浆转移至新鲜试管待分析。
[0414] 生物分析：
[0415] 标准曲线的制备：通过将肽缀合物溶于水中至1mg/ml制备了储备液。将10uL储备液与990uL大鼠血浆混合以形成在血浆中的10,000ng/ml的工作储备液。将其在血浆中系列稀释以形成5000、1000、500、100、50、10、5和1ng/ml的标准。
[0416] 样品和标准的制备：将25uL血浆样品或标准转移至干净板中。向每个小瓶加入含100ng/ml格列本脲作为内标的150uL乙腈:MeOH(1:1)，将板涡旋以混合内容物。将板于4℃以4000rpm进行离心。将125uL上清液转移至干净板中，与50uL水混合，通过LC/MS进行分析。
[0417] LC/MS分析：
[0418] HPLC:具有自动采样器的Agilent 1290HPLC
[0419] 柱子:MAC-MOD ACE C18,3μm,30mm x 2.1mm i.d。
[0420] 流动相A：0.1％甲酸在乙腈中的溶液
[0421] 流动相B:0.1％甲酸在水中的溶液
[0422] 梯度方案：
[0423]
[0424] 质谱仪：AB Sciex 6500
[0425] MS条件：Q1(m/z+)809.3；Q3(m/z+)923.7；DP:60；CE:25
[0426] 数据分析：采用WatsonLIMS v7.4软件收集和分析MS数据。
[0427] 采用上述分析的本发明的APJ激动剂-缀合物的活性和稳定性
[0428]
[0429] 表5
[0430] 通过按照下述体外和体内方法可以评价本发明的实施例26A和26B的催产素缀合物的活性和血浆稳定性。
[0431] 体外分析描述
[0432] 材料&方法
[0433] 化合物板的制备
[0434] 所供应的化合物在DMSO中制备和最终在Eurofins Discovery Services分析缓冲液中制备至浓度比最终分析浓度高三倍。类似地，制备溶媒对
照和阳性对照以确保所有分析被适当地控制。
照和阳性对照以确保所有分析被适当地控制。
[0435] 参比对照
[0436] GPCR靶 参比激动剂 Emax
[0437] OT 催产素 1.25μM
[0438] 采用Eurofins Discovery Services 分析缓冲液制备孔。分析缓冲液是经修饰的Hanks平衡盐溶液(HBSS)，其中补充了HBSS以含
有20mM HEPES和2.5mM丙磺舒,pH7.4。
有20mM HEPES和2.5mM丙磺舒,pH7.4。
[0439] 钙流分析
[0440] 激动剂分析
[0441] 对于每个分析浓度，将所供应的化合物一式两份铺板。以相似方式制备参比激动剂催产素作为分析对照。参比激动剂催产素被包括在Emax(参比激动剂引起最大响应的浓度)中。
[0442] 在FLIPRTETRA仪器上进行激动剂分析，其中在建立荧光/发光基线后将受试化合物、溶媒对照和参比激动剂加入分析板中。激动剂分析总计为180秒，用于评价每种化合物激活所分析的GPCR的能力。完成3分钟激动剂分析后，将分析板于25℃孵育另外7分钟[0443] 数据加工：
[0444] 所有板进行适当的基线校正。一旦进行了基线校正，输出最大荧光/发光值，处理数据以计算激活百分比和抑制百分比。0至-30％的复值可能是生物变异的结果。数据处理计算如下：((Max RLU)-(基线平均值))/((阳性平均值)-(基线平均值))。
[0445] 体内分析描述：
[0446] 将缀合物溶于PBS(磷酸盐缓冲盐水)中至3mg/ml的浓度以形成给药溶液。经由外侧尾静脉将给药溶液以1ml/kg的体积(相当于3mg/kg的剂量)经静脉内施用至雄性Sprague-Dawley大鼠。在给药后在指定时间从颈静脉导管取静脉血样并立即放置在湿冰上。将这些样品于4℃离心，将上清血浆转移至新鲜试管待分析。
[0447] 生物分析：
[0448] 标准曲线的制备：通过将肽缀合物和肽在两个单独的小瓶中溶于二甲亚砜中至1mg/ml制备了储备液。将10uL每种储备液与980uL大鼠血浆混合以形成在血浆中的10,
000ng/ml的工作储备液。将其在血浆中系列稀释以形成5000、1000、500、100、50、10、5、1、
0.5和0.1ng/ml的标准。
000ng/ml的工作储备液。将其在血浆中系列稀释以形成5000、1000、500、100、50、10、5、1、
0.5和0.1ng/ml的标准。
[0449] 样品和标准的制备：将25uL血浆样品或标准转移至干净板中。向每个小瓶加入含100ng/ml格列本脲作为内标的150uL乙腈，将板涡旋以混合内容物。将板于4℃以4000rpm进行离心。将125uL上清液转移至干净板中，与150uL水混合，通过LC/MS进行分析。
[0450] LC/MS分析：
[0451] HPLC:具有自动采样器的Agilent 1290HPLC
[0452] 柱子:MAC-MOD ACE C18,3μm,30mm x 2.1mm i.d。
[0453] 流动相A：0.1％甲酸在乙腈中的溶液
[0454] 流动相B:0.1％甲酸在水中的溶液
[0455] 梯度方案：
[0456]
[0457] 质谱仪：AB Sciex 6500
[0458] 肽MS条件：Q1(m/z+)945.20；Q3(m/z+)687.27；DP:140；CE:39
[0459] 肽缀合物MS条件：Q1(m/z+)1270.85；Q3(m/z+)468.30；DP:140；CE:77
[0460] 数据分析：采用WatsonLIMS v7.4软件收集和分析MS数据。
[0461] 按照上述分析的本发明的催产素脂肪酸缀合物的活性和稳定性
[0462]
[0463] 表6
[0464] WO2014/095773的实施例13如下所示：
[0465]
[0466] 本发明的催产素-脂肪酸缀合物与未缀合的催产素类似物相比显示出半衰期增加75倍。
[0467] 通过按照下述的体外和体内方法可以评价本发明的实施例27A和27B的AgRP缀合物的活性和血浆稳定性。
[0468] A)HTRF cAMP分析方案：
[0469] HEK293/MC4R细胞的传代
[0470] 细胞：HEK293/MC4R稳定细胞系
[0471] 完全培养基：DMEM/F12 1:1(Gibco,目录号11039,对于分析,非酚红培养基目录号21041)
[0472] 10％FBS(热灭活,Gibco,目录号10082)
[0473] 200μg/mL遗传霉素(Gibco,目录号10131)
[0474] 15mM Hepes(GIBCO,目录号15630)
[0475] 2mM L-谷氨酰胺(GIBCO,目录号25030)
[0476] 烧瓶：150cm2组织培养处理瓶(Corning,目录号430825)。
[0477] -抽吸条件培养基
[0478] -用25mL DPBS(Gibco,目录号14190)洗涤，然后抽吸
[0479] *FBS抑制胰蛋白酶-EDTA处置。
[0480] -加入2.5mL 0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco,目录号25300)
[0481] -放置数分钟，拍瓶数次以使细胞分离
[0482] -加入25mL完全培养基以终止胰蛋白酶-EDTA处置
[0483] *用于分析的细胞制备，必须使用非酚红完全培养基。
[0484] -轻轻抽吸数次以使聚集的细胞重新混悬
[0485] -将混悬液转移至50mL离心管中
[0486] -于1200rpm自旋3min
[0487] -抽吸上清液
[0488] -轻轻拍底部使细胞分散
[0489] -加入5-10mL完全培养基，然后通过轻轻吸取使之重新混悬
[0490] *用于分析的细胞制备，必须使用非酚红完全培养基。
[0491] -转移0.5mL混悬液至样品试管中用于Vi-细胞
[0492] -采用Vi-细胞对细胞数进行计数*每次记录细胞密度和存活
[0493] -转移1-3x106个细胞至新的150cm烧瓶中
[0494] 对于3天：3x106个细胞/烧瓶
[0495] 对于4天：1x106细胞/烧瓶
[0496] -于37C以5％CO2进行孵育
[0497] 用于HTRF cAMP分析的细胞接种(分析前一天)
[0498] ·如传代部分中那样制备细胞混悬液
[0499] ·将混悬液稀释至2.34x 105个细胞/mL
[0500] *13mL对于一块384孔板是足够的。
[0501] ·将30μL细胞混悬液分配至聚-D-赖氨酸BIOCOAT 384-孔澄清(Becton Dickinson,目录号354660)的各孔中：7000个细胞/孔
[0502] *聚-D-赖氨酸涂布的板在该分析中是必要的。
[0503] *没有细胞用于cAMP标准的孔
[0504] ·于37℃用5％CO2进行孵育过夜
[0505] HTRF cAMP分析
[0506] 1.试剂的制备
[0507] ·1M IBMX
[0508] IBMX(MW 222.25g/mol,ACROS目录号228420010) 111mg
[0509] DMSO(Sigma Aldrich,目录号D2650) 500uL
[0510] 于4℃储存
[0511] ·40mg/mL BSA溶液
[0512] 牛血清清蛋白(Sigma A7030-50G) 200mg
[0513] dH2O 5mL
[0514] 于4℃储存
[0515] ·1mg/mL(176uM)AgRP母液(在HBSS中/2mg/mL BSA)
[0516] R&D人AgRP C-末端(目录号3726-AG-100) 100ug/小瓶
[0517] 1xHanks缓冲盐溶液(HBSS)(Gibco,目录号14065,w/Ca和Mg)95uL
[0518] 40mg/mL BSA溶液 5uL
[0519] 于4℃储存
[0520] ·2mM NDP-aMSH母液
[0521] NDP-aMSH(MW 1646.9,Bachem,目录号H1100) 1mg/小瓶
[0522] dH2O 304uL
[0523] *一旦溶解，将10uL等分试样分散在200uL试管中，然后于-20℃储存
[0524] ·分析缓冲液1
[0525] HBSS 10mL
[0526] 1M Hepes(Gibco,目录号15630) 0.2mL
[0527] 1M IBMX 20uL
[0528] *为避免IBMX沉淀，请将缓冲液涡旋直至完全溶解。
[0529] ·分析缓冲液2
[0530]
[0531] *为避免IBMX沉淀，请将缓冲液涡旋直至完全溶解。
[0532] ·6nM NDP-aMSH用于IgG滴定和AgRP滴定
[0533] 2uM NDP-aMSH(母液的1000-倍稀释) 10.8uL
[0534] 分析缓冲液1 3600uL
[0535] *一份384孔分析的实例
[0536] ·120nM AgRP用于IgG滴定
[0537] 10-倍稀释的母液(17.6uM) 26uL
[0538] 分析缓冲液2 3800uL
[0539] *一份384孔分析的实例
[0540] ·NDP-aMSH工作溶液用于滴定(参见试剂)
[0541] ·AgRP工作溶液用于滴定(参见试剂)
[0542] ·IgG工作溶液用于滴定(参见试剂)
[0543] ·cAMP标准溶液(参见试剂)
[0544] 2.分析(2步方案)
[0545] 分析试剂盒：Cisbio cAMP HiRange HTRF试剂盒(目录号62AM6PEB)
[0546] -制备IgG/AgRP混合料(1:1)
[0547] ·将15uL IgG工作溶液和15uL 120nM AgRP混合，然后于环境温度孵育1小时[0548] -制备分析板
[0549] ·通过将含有细胞的384-孔分析板倒放在Wipeall上、然后轻叩以除去培养基来清除培养基。
[0550] ·向各孔加入100μL DPBS，以相同方式清除。
[0551] *一旦清除PBS，尽可能快地进行下一步以避免干涸
[0552] ·基于你的样品排列向各孔转移10μL如下试剂
[0553]
[0554] -将384孔板于1200RPM快速自旋
[0555] -将细胞于环境温度孵育15分钟
[0556] -基于你的样品排列向各孔加入10μL如下试剂
[0557]
[0558] -将384孔板于1200RPM快速自旋
[0559] -将细胞于环境温度孵育另外30分钟
[0560] *该孵育时间不是如此严格。根据分析发展数据，+/-5min应当是可以的。
[0561] -加入10μL cAMP-d2(在试剂盒中提供的缓冲液中以1:4稀释)
[0562] *重要！！对于阴性对照，不是cAMP-d2，而是仅仅是溶解缓冲液。
[0563] -加入10μL抗-cAMP穴状化合物(Cryptate)(在试剂盒中提供的缓冲液中以1:4稀释)
[0564] -于1200RPM快速自旋。
[0565] -将孵育分析板于环境温度孵育45-60分钟。
[0566] -转移30μL每种样品至组织培养基处理的白色聚苯乙烯384-孔分析板(Corning,目录号3572)中
[0567] -于1200RPM快速自旋。
[0568] -采用Molecular device M5或M5e以以下设置进行荧光测定。
[0569] Molecular device M5/M5e设置
[0570]
[0571]
[0572] B)MC3cAMP分析
[0573] 材料：
[0574] 细胞：HEK293/MC3R稳定细胞系
[0575] 完全培养基：DMEM/F121:1(Gibco,目录号11039)
[0576] 10％FBS(热灭活,Gibco,目录号10082)x
[0577] 200μg/mL遗传霉素(Gibco,目录号10131)
[0578] 2mM L-谷氨酰胺(GIBCO,目录号25030)
[0579] 烧瓶:150cm2组织培养处理瓶(Corning,目录号430825).
[0580] 分析缓冲液
[0581]
[0582] 板
[0583] 384孔实底Greiner bio-one(目录号-781080)
[0584] 分析方案(拮抗剂方案)：
[0585] I.抽吸条件培养基
[0586] II.用25mL DPBS(Gibco,目录号14190)洗涤
[0587] III.加入2mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco,目录号25200-056)
[0588] IV.将烧瓶在孵育器中放置数分钟，拍瓶数次以使细胞分离。
[0589] V.加入10mL完全培养基以终止胰蛋白酶-EDTA处置，通过轻轻抽吸数次以使聚集的细胞重新混悬而将其充分混合
[0590] VI.转移1.5mL细胞至新的含有20mL完全培养基的150cm烧瓶中
[0591] VII.将剩余的混悬液转移至50mL离心管中
[0592] VIII.于1200rpm自旋4min。抽吸上清液
[0593] IX.向试管中加入6mL分析缓冲液，将细胞通过轻轻抽吸重新混悬
[0594] X.转移0.5mL混悬液至样品试管中用于Vi-细胞，加入另外0.5mL PBS。XI.采用Vi-细胞对细胞数进行计数*每次记录细胞密度和存活
[0595] i.将细胞以4K/孔铺在10ul/孔的含有IBMX的分析缓冲液中。
[0596] ii.将板在孵育器中放置～30mins，然后在混悬细胞上开始分析。
[0597] 进行了两步cAMP方案用于cAMP测定。
[0598] 操作
[0599] I.向10ul/孔的细胞中加入在分析缓冲液中以3x制备的5ul AgRP，仅加至激动剂孔中。
[0600] II.将5ul缓冲液加至阳性对照孔(将具有NDP-α-MSH的孔)中。
[0601] III.将板于37℃温育～20分钟。
[0602] IV.向含有AgRP DRC的孔中加入5ul/孔的以4X制备的激动剂EC80(NDP-α-MSH)。
[0603] V.对于NDP-α-MSH EC50计算，加入5ul/孔的以4X制备的激动剂(NDP-α-MSH)DRC(板中的最终最高浓度是100nM)
[0604] VI.仅向阴性对照中加入缓冲液。
[0605] VII.将384孔板脉冲自旋，将细胞在孵育器中孵育30分钟。
[0606] VIII.向各孔加入10μL如下试剂：
[0607] a.10μL cAMP-d2
[0608] b.*重要！！对于阴性对照，不要加入cAMP-d2，而是仅加入溶解缓冲液和10ul/孔的Tb-穴状化合物
[0609] c.10μL抗-cAMP穴状化合物
[0610] d.将板脉冲自旋，于室温孵育60分钟。
[0611] C.体内分析描述:
[0612] 将10纳摩尔缀合物溶于300μL PBS(磷酸盐缓冲盐水)中以形成给药溶液。经由外侧尾静脉将给药溶液(300μM)经静脉内施用至雄性Sprague-Dawley大鼠(相当于每只大鼠10纳摩尔的剂量)。在给药后在指定时间经由剪断尾巴取血并立即放置在湿冰上。将这些样品于4℃离心，将上清血浆转移至新鲜试管待分析。
[0613] 生物分析：
[0614] 标准曲线的制备：实施例27A和27B的两种脂肪酸缀合物和一种成熟人AgRP肽用于制备标准。通过将储备的标记肽在用酪蛋白稀释至100ug/ml的ELISA样品中稀释制备了每种AgRP的中间体储备液。对于分析，将中间体稀释至2500pg/mL的最高标准浓度，然后在用牛血清清蛋白(BSA)稀释的ELISA样品中2-倍系列稀释至16点，包括零剂量标准。
[0615] 样品稀释:将血浆样品在用BSA稀释的ELISA样品中10-倍稀释，然后5-倍系列稀释至31,250-倍。
[0616] 5B1人AgRP ELISA方法:于室温将384孔微板以30uL/孔在1x PBS中涂布抗人AgRP克隆5B1过夜。抽吸板并用基于乳的封闭剂以90uL/孔于室温封闭2小时。以30uL/孔进行所有其它孵育。将板再次抽吸，将标准于室温加入孔中达2小时。然后将板用基于磷酸盐的含吐温20的洗涤缓冲液洗涤3次，向孔中加入生物素化山羊抗人AgRP多克隆抗体以检测于室温2小时所结合的AgRP。将板再次洗涤，于室温30分钟向各孔加入HRP-标记的链霉抗生物素试剂。将板最后一次洗涤，向所有孔加入化学发光底物，在用于光输出的Spectramx M5上理解读板。
[0617] 数据分析:将原始数据组织化并用于基础PK参数分析。
[0618] 根据上述分析的本发明的AgRP脂肪酸缀合物的活性和稳定性：
[0619]
[0620] 表7
[0621] 通过按照下述体外方法可以评价实施例28A、28B和28C的FGF23缀合物的活性和血浆稳定性。
[0622] 体外活性分析
[0623] Egr-1-荧光素酶:纯化hFGF23-FA缀合物的生物活性在Egr-1-荧光素酶报道基因分析中进行了测试。hFGF23-FA缀合物与FGF23受体的结合导致Egr-1下游激活和Egr-1启动子所调整的荧光素酶报道基因的表达。Egr-1-荧光素酶报道基因是基于Urakawa等人(Nature,2006,第444卷,770-774)的报道来构建的。将接种在48-孔聚-D-赖氨酸板中的HEK293T细胞用Egr-1-荧光素酶报道基因、Klotho的全长跨膜形式和转染标准化报道基因(Renilla荧光素酶)进行转染。转染后5小时，将转染混合物用含有分等级浓度的测试蛋白质的3mL DMEM+1％FBS进行替换。稍后将细胞在被动溶解缓冲液(Promega,目录号E194A)中溶解20小时，采用Dual-Glo荧光素酶分析系统(Promega,目录号E2940)测定荧光素酶活性。
[0624] 结果
[0625]实施例 EC50(nM)
实施例28B 1.195
实施例28C 0.258
实施例28B 1.195
实施例28C 0.258
[0626] 表8
[0627] 通过按照下述的体外和体内方法可以测定本发明的实施例29A和29B的serelaxin脂肪酸缀合物的活性和血浆稳定性。
[0628] 体外活性分析#1:
[0629] 材料
[0630] DMEM:F12培养基(Gibco,目录号11320)
[0631] IBMX(Sigma,目录号I5879)
[0632] 384实底白色板(Greiner bio-one,目录号781945)
[0633] 20,000动态-2cAMP试剂盒(Cisbio,目录号62AM4PEC)
[0634] 腺苷3′,5′-环单磷酸(Sigma,目录号A9501)
[0635] Matrix-plate mate plus(用于添加5μl分析试剂)
[0636] PBS-Gibco(目录号10010-023)
[0637]
[0638]
[0639] 方案:
[0640] 第1天:在实底PDL涂布的白色板中在10μl DMEM:F12培养基中接种RXFP1-HEK293/亲本HEK293细胞8k
[0641] 第2天:用化合物进行分析
[0642] 激动剂模式(概述):
[0643] ·细胞在10μl DMEM:F12培养基中，@37℃O/N
[0644] ·于37℃将5μl 2000μM(4x)IBMX加至细胞中达30min
[0645] ·于37℃将5μl 4x化合物/Serelaxin加至上述物质中30min
[0646] (来自化合物稀释的步骤3，400nM-最终是100nM的最高浓度)
[0647] ·10μl cAMP-d2缀合物
[0648] ·10μl抗-cAMP穴状化合物缀合物
[0649] ·于室温孵育1小时
[0650] ·读FRET信号-Envision 665nm/620nm
[0651] 化合物制备
[0652] Serelaxin:
[0653] 1)将储备液683.3μM、即11.7μl稀释在188.3PBS pH7.4中，通过转移15μl化合物至30μl(最终是40μM)在PBS中稀释3x次–手工
[0654] 2)稀释1:10，即6μl上述物质在54μl DMEM:F12中(最终是4μM)-手工
[0655] 3)稀释1:10，即10μl上述物质在90μl DMEM:F12中(最终是400nM)-手工
[0656] Serelaxin-FA缀合物
[0657] 1)将储备液在PBS pH7.4中稀释至40μM，通过转移15μl化合物至30μl在PBS中稀释3x次
[0658] 2)稀释1:10，即6μl上述物质在54μl DMEM:F12中-手工
[0659] 3)稀释1:10，即10μl上述物质在90μl DMEM:F12中(1:100稀释)-手工脂肪酸[0660] 1)将储备液在PBS pH7.4中稀释至40μM，通过转移15μl化合物至30μl在PBS中稀释3x次
[0661] 2)稀释1:10，即6μl上述物质在54μl DMEM:F12中-手工
[0662] 3)稀释1:10，即10μl上述物质在90μl DMEM:F12中(1:100稀释)-手工
[0663] cAMP标准曲线稀释:
[0664] 1.稀释于DMEM:F12培养基中的150μl cAMP std至第一列(2800nM)
[0665] 2. 100μl DMEM:F12培养基至以后的列至10(1-11)
[0666] 3. 3x稀释，通过转移50μl至100μl
[0667] 4.来自步骤3的20μl至标准曲线板的适当孔
[0668] 5. 10μl Anti-d2&Anti-cAMP穴状化合物缀合物
[0669] 6.于室温孵育1小时
[0670] 7.读取FRET信号-Envision 665nm/620nm
[0671] 分析:
[0672] 采用Graph pad prism将cAMP nM浓度进行Log(x)转化。
[0673] 由采用4参数非线性回归的标准曲线外推cAMP量。
[0674] 采用10^Y转化将外推值转化为nM。
[0675] 采用4参数非线性回归，将计算机cAMP量对化合物浓度作图。
[0676] 结果：
[0677]化合物 EC50(nM)
Serelaxin 1.12
实施例29B的Serelaxin-FA缀合物 4.51
Serelaxin 1.12
实施例29B的Serelaxin-FA缀合物 4.51
[0678] 表9
[0679] 在牛血清清蛋白和人血清#2存在下的体外活性：
[0680] 材料:
[0681] DMEM:F12培养基(Gibco,目录号11320)
[0682] IBMX(Sigma,目录号I5879)
[0683] 384实底白板(Greiner bio-one,目录号781945)
[0684] 20,000动态-2cAMP试剂盒(Cisbio,目录号62AM4PEC)
[0685] 腺苷3′,5′-环单磷酸(Sigma,目录号A9501)
[0686] Matrix-plate mate plus(用于添加5μl分析试剂)
[0687] PBS-Gibco(目录号10010-023)
[0688] 1M HEPES Gibco(cat-15630-080)
[0689] 1X HBSS Gibco(cat-14175-095)
[0690] 分析缓冲液-1xHBSS+10mM HEPES
[0691] 牛血清清蛋白cat#A2153(Sigma-Aldrich)
[0692] Sigma Aldrich-H4522(人血清)
[0693] 条件:
[0694] ·600μM BSA
[0695] ·4％人血清
[0696] ·10％人血清(Sigma aldrich-H4522)
[0697] ·分析缓冲液
[0698] 受试化合物：
[0699] ·Serelaxin
[0700] ·Serelaxin-FA(实施例29A)
[0701] 化合物处理:
[0702] Serelaxin-：储备液是(796.57uM)即4.75mg/ml，MW是5963道尔顿Serelaxin 10uL储备液溶于190ul PBS中，最终浓度为40μM，将其通过转移30uL至60uL分析缓冲液中稀释3x倍，11点曲线(A2-A12)，第12个是零。
[0703] Serelaxin-FA缀合物：储备液是(287.79uM)、即2.61mg/ml，MW是9069道尔顿[0704] Serelaxin 27.798uL储备液溶于172.2ul PBS中，最终浓度为40μM，将其通过转移30uL至60uL分析缓冲液中稀释3x倍，11点曲线(A2-A12)，第12个是零。
[0705] BSA储备液制备：
[0706] 对于666.66uM BSA：通过溶解1.32gms BSA制备分析缓冲液30mls
[0707] 对于600uM BSA：通过溶解1.18gms BSA制备分析缓冲液30mls
[0708] 无BSA，仅具有分析缓冲液
[0709] 人血清
[0710] 对于4.44％HS：1.34mls在28.66mls分析缓冲液中
[0711] 对于4％HS：1.2mls在28.8mls分析缓冲液中
[0712] 对于11.11％HS：3.33mls在26.67mls分析缓冲液中
[0713] 对于10％HS：3mls在27mls分析缓冲液中
[0714] 操作：
[0716] 第2天：
[0717] 1.将细胞用50uL分析缓冲液洗涤2x次，在第一次和第二次洗涤后在纸巾上轻敲以除去分析缓冲液
[0718] 2.将细胞用15uL含各自培养基(单独的600uM BSA、4％BSA、10％人血清和分析缓冲液)的IBMX(666.66uM)的培养基于37℃预处理30分钟
[0719] 3.将化合物系列稀释3x次，11点曲线-从前孔转移15uL化合物至具有30uL PBS的随后的孔，孔11仅为PBS
[0720] 4.来自步骤3的在分析缓冲液中的稀释(1:10)(即10ul至90uL分析缓冲液中)[0721] 5.来自步骤4的在各自培养基(666.66μM BSA&4.44％&11.11％人血清和分析缓冲液)中的再次稀释，BSA的最终浓度为600μM，人血清是4&10％
[0722] 6.(*将化合物在各自的培养基中于室温孵育1小时，然后加入细胞中)
[0723] 7.来自步骤6的5uL、即4x Serelaxin/Serelaxin-FA至15uL细胞中于37℃达另外30分钟(Serelaxin的最高浓度是100nM)
[0724] 8.加入10uL cAMP d2缀合物
[0725] 9.加入10uL抗-cAMP-穴状化合物
[0726] 10.于室温孵育1小时
[0727] 11.在Envision上读取FRET
[0728] 12.在它们各自的培养基制备cAMP标准曲线。
[0729] cAMP标准曲线稀释：
[0730] cAMP标准的起始储备液是1120000nM
[0731] 1.通过将20uL cAMP储备液溶于60uL分析缓冲液中稀释起始储备液(1:4)
[0732] 2.步骤1在分析缓冲液中的(1:10)稀释(即20uL在180uL分析缓冲液中)
[0733] 3.步骤2在各浓度的4.44％&11.11％HS、666.66uM BSA或无BSA中的(1:10)稀释—最终浓度将结束为4％、10％HS和600μM BSA。
[0734] cAMP标准曲线
[0735] 1.将150μl各cAMP标准加入第一列(2800nM)
[0736] 2.将具有各浓度600uM BSA、4％&10％HS和0％)的100μl分析缓冲液加入随后的11列、即(2-12)
[0737] 3.通过转移50μl至100μl随后的孔进行3x稀释，第12孔为零，无cAMP
[0738] 4.来自步骤3的20μl至标准曲线板的适当孔中
[0739] 5.加入10μl d2缀合物
[0740] 6.于室温孵育1小时
[0741] 7.在HTRF-Envision上读数
[0742] 分析:
[0743] 采用Graph pad prism将cAMP nM浓度进行Log(x)转化。
[0744] 由采用4参数非线性回归的标准曲线外推cAMP量。
[0745] 采用10^Y转化将外推值转化为nM。
[0746] 采用4参数非线性回归，将计算机cAMP量对化合物浓度作图。
[0747] 结果:
[0748]
[0749] 表10
[0750] 体内分析
[0751] 可以在各种啮齿类动物模型中测试化合物(serelaxin和serelaxin缀合物)以评价短期和长期心血管响应。
[0752] 短期模型—将小鼠(任意品系，但是优选DBA/2)或大鼠(任意品系，但是优选Sprague-Dawley)通过吸入异氟烷进行麻醉，用在100％氧中的～2％异氟烷维持在稳定的手术麻醉水准，直肠温度维持在正常水平。通过叠压皮肤切口暴露出颈动脉和颈静脉(小鼠)或股动脉和静脉(大鼠)，血管插入导管。动脉导管与血压传感器连接，信号指向数字数据采集系统(例如Ponemah)用于连续测定动脉压和激发心率。或者，心率通过经由皮下插入的针状电极记录的心电图信号而触发。允许动脉压和心率稳定后，历经～3-4分钟静脉内施用植物神经阻断剂的合剂(例如各2mg/kg的阿托品和普萘洛尔)。当心血管参数重新稳定后，历经3秒将serelaxin或serelaxin缀合物作为静脉内推注进行注射。松弛素引起具有特征性的缓慢启动(峰响应～6分钟)和持久的作用持续时间(小时)的心率增加。在相同的动物制备物中，通过收集线下分析的系列超声心动图测定了心室功能(例如射血分数、缩短分数、心输出量)。
[0753] 长期模型—将小鼠(任意品系，但是优选DBA/2)或大鼠(任意品系，但是优选Sprague-Dawley)通过吸入异氟烷进行麻醉，用在100％氧中的～2％异氟烷维持在稳定的手术麻醉水准。在围手术期和手术后施用镇痛剂。动脉和静脉如上所述插导管，但是导管通过背侧皮肤区域穿出、用肝素化盐水冲洗和用不锈钢针塞住。还将皮下导管经皮下植入小鼠，以相同方式穿出。在大鼠中，导管直接穿过spring-tether/swivel系统定向。在研究当天，动脉导管与血压传感器连接，如上所述获得植物神经阻断，不同的是阻断剂还可以经由小鼠的皮下导管施用，之后通过连续静脉内或皮下输注植物神经阻断剂来维持两个品系的阻断。采用数字数据采集系统连续监测动脉压和心率。允许动脉压和心率稳定后，历经～3-4分钟静脉内或皮下施用植物神经阻断剂。当心血管参数重新稳定后，历经3秒将serelaxin或serelaxin缀合物作为静脉内推注进行注射。对于在小鼠或大鼠中历经数周时期评价心室功能和心率，每周1-3次皮下注射serelaxin缀合物，在基线和之后每周收集系列超声心动图。
[0754] Serelaxin来源：
[0755] Serelaxin(重组1-链人松弛素)
[0756] Connetics corporation,lot#00L605
[0757] 1.0mg/mL(5mL小瓶)在20nM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中
[0758] 将储备液在溶媒中稀释至每个剂量的预期serelaxin浓度。
[0759] 按照下述体外和体内方法可以评价实施例30的PIP缀合物的活性和血浆稳定性。
[0760] 葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)分析:
[0761] 在高脂肪饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠中进行GSIS测试追踪重组人促乳素诱导蛋白(hPIP)作为体内胰腺β细胞功能的度量。简言之，小鼠(m＝5-7/基团)禁食过夜(5:00PM-8:00AM)，测试当天的体重和血葡萄糖(BG；采用Embrace葡萄糖计测定)指定为基线时间点。接着，给小鼠一次性静脉内(IV)施用hPIP(天然和FA-缀合的PIP；在PBS中的溶液；以4ml/kg体重施用)或溶媒对照(PBS)。施用hPIP后45分钟，所有小鼠给予口服葡萄糖(3g/kg右旋糖；在PBS中的溶液；以4ml/kg体重施用)。在葡萄糖负荷之前立即(指定为0min时间点)和在给予葡萄糖后15和30分钟测定血葡萄糖。收集血样用于血浆分离，在给予葡萄糖后0、15和30min进行血浆胰岛素的测定。
[0762] 药物动力学(PK)分析:
[0763] 在DIO小鼠中在单次IV施用后测定hPIP暴露。简言之，给自由饮食的DIO小鼠(n＝2)一次性静脉内(IV)施用hPIP(天然和FA-缀合的PIP；在PBS中的溶液；以4ml/kg体重施用)。在给药后0.25、0.5、1、3、7、24和48小时收集样品并通过内部ELISA分析(方案如下所示)分离血浆。
[0764] 通过如下步骤测定分析：
[0765] ·将板于室温用30uL hPIP抗体(指定为PI P-8-AB；内部产生；NBC clone#87.19G9A11,以8ug/ml在PBS中)涂布过夜。
[0766] ·抽吸，然后用100uL封闭试剂封闭2小时。
[0767] ·抽吸，加入30uL样品孵育2小时，将样品和标准稀释于酪蛋白缓冲液(1％酪蛋白,1.7mM磷酸二氢钠,8.1mM磷酸氢二钠七水合物,0.15M氯化钠,0.7％Triton X-100和0.1％叠氮化钠)中。
[0768] ·将板用Teknova洗涤缓冲液(0.05％Tween,在PBS中)洗涤3x100uL
[0769] ·将30uL生物素化PIP抗体(指定为PIP-6Ab；内部生产,MBC clone#87.8C6B3,10ug/ml在酪蛋白缓冲液中)孵育1小时
[0770] ·如上所述进行洗涤
[0771] ·加入30uL链霉抗生物素-HRP(Pierce cat#21140,以0.4ug/ml,在HRP缓冲液中)HRP缓冲液(0.4％酪蛋白、1.7mM磷酸二氢钠、8.1mM磷酸氢二钠七水合物、0.15M氯化钠和0.1％氯乙酰胺)孵育30分钟。
[0772] ·如上所述进行洗涤
[0773] ·加入30Femto Chemiluminescent Substrate(Thermo cat#34096)和立即读数[0774] 根据上文所述分析的本发明的PIP脂肪酸缀合物的活性和稳定性
[0775]
[0776] **与溶媒相比
[0777] 表11
[0778] 本发明的PIP脂肪酸缀合物具有延长的暴露，导致效力改善。
[0779] 通过下述体外方法可以测定实施例31的NPFF缀合物的活性和血浆稳定性。
[0780] 用Cisbio cAMP试剂盒进行的cAMP分析方案
[0781] 在下述分析中在弗司扣林的存在下测试了本发明的NPFF-FA缀合物。
[0782] 试剂/材料
[0783]
[0784] 第1天：将细胞铺在384-孔板中
[0785] 按照“传代培养方案”。
[0786] 1.制备不含抗生素的生长培养基(如果需要的话)。
[0787] 2.在用70％乙醇喷雾后将不含抗生素的生长培养基瓶在37℃水浴中平衡。
[0788] 3.用Versene分离细胞(每T.75烧瓶3mL)。
[0789] 4.转移入50mL含17mL生长培养基的Falcon试管中。
[0790] 5.于150g离心4min。
[0791] 6.将细胞沉淀重新混悬于10mL刺激缓冲液中。对细胞计数。
[0792] 7.在含有抗生素的生长培养基中以5’000个细胞/50uL制备细胞混悬液。
[0793] 8.采用Viaflow 384-125uL吸管将50uL细胞混悬液铺板。
[0794] 9.将板在TC罩下放置15min。
[0795] 10.于37℃、5％CO2和90％湿度下孵育。
[0796] 第2天:
[0797] 试剂溶液的制备:
[0798] 1.分析缓冲液:
[0799] 500mL HBSS+10mL HEPES。于室温储存
[0800] 分析缓冲液:250mL HBSS/HEPES+250uL IBMX 1000X溶液+0.1％BSA(825uL)。每天新鲜制备。
[0801] 2.弗司扣林2X溶液:在分析中最终1uM:
[0802] 对于化合物稀释:40uL FSK/100mL分析缓冲液。
[0803] 对于NPFF稀释:10uL DMSO/10mL 2X FSK。
[0804] 3.NPFF稀释：在dH2O中的储备液1mM–在分析中最终1uM
[0805] a.5uL储备液/625uLuL FSK 2X/DMSO。
[0806] b.100uL溶液a+300uL FSK 2x/DMSO。在分析中最终1uM。
[0807] c.制备1o稀释步骤1/4:100uL+300uL在FSK 2X/DMSO中。
[0808] 4.化合物稀释:储备液10mM在DMSO中-在分析中最终40uM
[0809] a.5uL储备液/625uL FSK 2X。
[0810] b.制备11稀释步骤1/4:100uL+300uL FSK 2X。
[0811] 5.cAMP标准:
[0812] a.10uL cAMP标准储备液(1.12mM)+90uL分析缓冲液。
[0813] b.10uL稀释液a+90uL刺激缓冲液。
[0814] c.20uL稀释液b+428uL刺激缓冲液:500nM。
[0815] d.从稀释c开始制备11稀释1/2:100uL稀释液c+100uL刺激缓冲液。
[0816] 6.cAMP检测试剂:
[0817] a.d2-cAMP:1000uL/20mL溶解缓冲液(250uL/5mL用于1块384-孔板)。
[0818] b.穴状化合物缀合物:1000uL/20mL溶解缓冲液.(250uL/5mL用于1块384-孔板)。
[0819] 分析操作
[0820] 步骤1:
[0821] 1.制备刺激缓冲液。
[0822] 2.将Cisbio溶解缓冲液放置在室温下。
[0823] 3.制备WellMate(用70％醇、然后用dH2O和HBSS/HEPES洗涤)。
[0824] 4.制备弗司扣林和化合物稀释。
[0825] 步骤2:用弗司扣林刺激
[0826] 1.用50uL刺激缓冲液洗涤细胞:
[0827] a.轻拍板以除去O/N培养基。
[0828] b.将白色纸巾放在板顶部，采用VWR Symphony 4417离心机将板于300RPM倒置离心20秒。
[0829] c.采用WellMate添加50uL刺激缓冲液。
[0830] d.轻拍板以除去O/N培养基。
[0831] e.将白色纸巾放在板顶部，采用VWR Symphony 4417离心机将板于300RPM倒置离心20秒。
[0832] f.在显微镜下检测细胞。
[0833] 2.采用Viaflow 384添加10uL含IBMX的刺激缓冲液
[0834] 3.采用Viaflow 384添加10uL含化合物的2x弗司扣林溶液(在第7层)。将溶液混合，然后加入孔中。
[0835] 4.于室温孵育30min(将板放在抽屉中以避免温度变化)。
[0836] 5.制备cAMP标准曲线和cAMP检测试剂。
[0837] 6.将20uL/孔的cAMP标准曲线加至标准曲线板(与分析板相同的板)。
[0838] 步骤3:LANCE cAMP分析
[0839] 1.采用Combi 384将10uL d2cAMP/孔加至分析板
[0840] 2.手工将10uL/孔穴状化合物缀合物加至分析板。
[0841] 3.密封板。
[0842] 4.于室温孵育最少1小时(板可以在24小时内读数)。
[0843] 5.将Tape放置在板底。
[0844] 6.在Envision程序“Cisbio 384full plate”上读数。
[0845] 7.在附件文件中查看原始数据。
[0846] 8.用GraphPad分析数据(在附件文件中查看文件)。
[0847] 结果:
[0848]
[0849] 表12
[0850] 通过下述体内方法可以评价其中生物分子是siRNA的本发明的缀合物的活性和血浆稳定性。
[0851] 方法
[0852] 实施例24的缀合物是与GalNAc(参比实施例3)和脂肪酸缀合的APOC3siRNA的化合物。人APOC3转基因小鼠(B6；CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J)购自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)。小鼠随意取食标准啮齿动物饲料和饮水，具有12小时亮/暗循环。在这种条件下，APOC3转基因小鼠自发地发展出血浆TG含量显著增加的高甘油三酯血(Aalto-Setala K,J Clin Invest 1992)。每组四只小鼠皮下注射参比实施例3(APOC3siRNA-GalNAc)或实施例24的缀合物，剂量为25mg/Kg体重。在临注射前在基线和在注射后2、4、7和14天采集血。血浆用于采用来自Cisbio的HTRF分析测定人APOC3蛋白质水平。采用单因素ANOVA来比较各组之间的统计学差异。
[0853] 结果
[0854] 参比实施例3和缀合物24组中的基线血浆APOC3水平分别为176±21mg/dl和178±9mg/dl。参比实施例3时间依赖性地降低血浆APOC3水平，与基线水平相比在给药后5天降低
56％。通过比较，实施例24的缀合物更有效地降低血浆APOC3，在给药后5天降低80％(图1)。
作用持续时间对于参比实施例3和实施例24而言是类似的，如图1所示。
56％。通过比较，实施例24的缀合物更有效地降低血浆APOC3，在给药后5天降低80％(图1)。
作用持续时间对于参比实施例3和实施例24而言是类似的，如图1所示。
[0855] 本发明的缀合物具有至少5小时、至少10小时、至少20小时、至少30小时、至少40小时或至少50小时的血浆稳定性。在一项实施方案中，与非缀合生物分子相比的血浆稳定性改善为至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍或75倍。
[0856] 组合治疗
[0857] 本发明的缀合物可在施用一种或多种其它治疗剂的同时、之前或之后施用。本发明的缀合物可通过相同或不同施用途径与其它活性剂分开施用，或在同一药组合物中与其它活性剂一起施用。
[0858] 在一个实施方案中，本发明提供了产品，其包含前述实施方案任一项的缀合物或实施方案10和13中所述的缀合物混合物以及至少一种其它治疗剂，其用作在治疗中同时、分开或依序使用的组合制剂。在一个实施方案中，该治疗是在需要其的患者中治疗代谢障碍或疾病、2型糖尿病、肥胖、血脂异常症、升高的葡萄糖水平、升高的胰岛素水平和糖尿病性肾病，其包括：给所述患者施用治疗有效量的本发明的缀合物或其酰胺、酯或盐，其中生物分子是人生长分化因子15(GDF15)、其同系物、变体、突变体、片段和其它修饰形式。
[0859] 作为组合制剂提供的产品包括组合物，所述组合物在同一个药物组合物中一起包含前述实施方案任一项的缀合物以及其它治疗剂，或以分开的形式(例如以药盒形式)包含前述实施方案任一项的缀合物以及其它治疗剂。
[0860] 在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含前述实施方案任一项的缀合物或实施方案10或13的缀合物混合物以及另外的治疗剂。任选地，该药物组合物可包含如上文所述的可药用赋形剂。
[0861] 在一个实施方案中，本发明提供了包含两种或更多种分开的药物组合物的药盒，所述药物组合物的至少之一含有前述实施方案任一项的缀合物。在一个实施方案中，该药盒包含用于独立地保持所述组合物的装置，例如容器、分立式瓶或分立式箔片包。此类药盒的实例有例如常用于包装片剂、胶囊等的泡罩包装。
[0862] 本发明的药盒可用于施用不同剂型(例如口服及胃肠外)，以不同的剂量间隔施用独立的组合物，或用于相互之间调整独立组合物的剂量。为有助于依从性，本发明的药盒通常包含用于施用的说明书。
[0863] 在本发明的组合治疗中，本发明的缀合物及其它治疗剂可由相同或不同制造商制造和/或配制。此外，可将本发明的缀合物与其它治疗剂如下一起带入组合治疗中：(i)在发放组合产品给医师之前(例如在包含本发明的缀合物和其它治疗剂的药盒的情况下)；(ii)在即将施用前由医师自身(或在医师指导下)；(iii)由患者自己，例如在依序施用本发明的缀合物与其它治疗剂期间。
[0864] 本发明还提供了前述实施方案任一项的缀合物用于治疗本文给出的疾病或病症的用途，其中该患者先前(例如在24小时内)已经用其它治疗剂进行过治疗。本发明还提供了另外的治疗剂用于治疗本文给出的疾病或病症的用途，其中该患者先前(例如在24小时内)已经用前述实施方案任一项的缀合物进行过治疗。
[0865] 术语与第二活性剂或治疗“组合”包括共同施用本发明的缀合物(例如前述实施方案任一项所述的缀合物或本文以其他方式描述的缀合物)与第二种活性剂或治疗；首先施用本发明的化合物，随后施用第二种活性剂或治疗；以及首先施用第二种活性剂或治疗，随后施用本发明的缀合物。
[0866] 术语“第二种活性剂”和“共用活性剂”可互换使用，包括本领域已知可用于治疗或预防本文所述的疾病或障碍或者减轻其症状的任意活性剂，所述疾病或障碍例如是选自如下的障碍或疾病：代谢障碍或疾病、2型糖尿病、肥胖、胰腺炎、血脂异常症、酒精性和非酒精性脂肪肝疾病/脂肪性肝炎和其它进行性肝疾病、抗胰岛素性、高胰岛素血、葡糖耐受不良、高血糖、代谢综合征、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、糖尿病并发症(包括但不限于慢性肾病)、神经病、胃轻瘫和其它代谢障碍。
[0867] 在一项实施方案中，治疗是在需要其的患者中治疗代谢障碍或疾病、2型糖尿病、肥胖、胰腺炎、血脂异常症、酒精性和非酒精性脂肪肝疾病/脂肪性肝炎和其它进行性肝疾病、抗胰岛素性、高胰岛素血、葡糖耐受不良、高血糖、代谢综合征、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、糖尿病并发症(包括但不限于慢性肾病)、神经病、胃轻瘫和其它代谢障碍，其包括：给所述患者施用治疗有效量的本发明的缀合物或其酰胺、酯或盐，其中生物分子是人生长分化因子15(GDF15)、其同系物、变体、突变体、片段和其它修饰形式。
[0868] 用于与本发明的缀合物(其中生物分子是人生长分化因子15(GDF15)、其同系物、变体、突变体、片段和其它修饰形式)组合的第二种活性剂的实例包括：
[0869] 1.抗糖尿病剂，例如胰岛素、胰岛素衍生物和模拟物；胰岛素促分泌剂如磺脲(例如氯磺丙脲、妥拉磺脲、醋磺己脲、甲苯磺丁脲、格列本脲、格列美脲、格列吡嗪)；格列本脲和亚莫利阿玛尔；促胰岛素磺酰脲受体配体如氯茴苯酸类、例如那格列奈和瑞格列奈；噻唑啉二酮药物(例如罗西格列酮(AVANDIA)、曲格列酮(REZULIN)、吡格列酮(ACTOS)、巴格列酮(balaglitazone)、利格列酮(rivoglitazone)、netoglitazone、曲格列酮、恩格列酮、环格列酮、adaglitazone、达格列酮，它们增强胰岛素作用(例如通过胰岛素敏化)、因而促进外周组织的葡萄糖利用；蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)抑制剂如PTP-112；胆固醇脂转移蛋白(CETP)抑制剂如托彻普(torcetrapib)、GSK3(糖原合酶激酶-3)抑制剂如SB-517955、SB-4195052、SB-216763、NN-57-05441和NN-57-05445；RXR配体如GW-0791和AGN-194204；钠依赖性葡萄糖协同转运蛋白抑制剂如T-1095；糖原磷酸化酶A抑制剂如BAY R3401；双胍如二甲双胍和其它通过促进葡萄糖利用、减少肝葡萄糖产生和/或减少肠葡萄糖输出的活性剂；α-糖苷酶抑制剂如阿卡波糖和migiitoi)和其它减慢碳水化合物消化和因此减少从肠吸收餐后高血糖的活性剂；GLP-1(高血糖素样肽-1)、GLP-1类似物如Exendin-4和GLP-1模拟物；和DPPIV(二肽基肽酶IV)抑制剂如维格列汀；
[0870] 2.降血脂剂，例如3-羟基-3-甲基-戊二酰基辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，例如洛伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、维洛他汀(velostatin)、氟伐他汀、达伐他汀、阿托伐他汀、罗苏伐他汀和rivastatin(雷司他汀)；鲨烯合酶抑制剂；FXR(farnesoid X受体)和LXR(肝X受体)配体；胆汁酸螯合剂如考来烯胺和考来维仑；贝特类药物(fibrates)；烟酸和阿司匹林；
[0871] 3.抗肥胖剂，例如奥利司他或利莫那班、芬特明、托吡酯、qunexa和locaserin；
[0872] 4.抗高血压剂，例如髓袢利尿剂如依他尼酸、呋塞米和托塞米；血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂如贝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、莫昔普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利和群多普利；Na-K-ATP酶膜泵抑制剂如地高辛；中性内肽酶(NEP)抑制剂；ACE/NEP抑制剂如奥马曲拉、山帕曲拉和法西多曲；血管紧张素II拮抗剂如坎地沙坦、依普罗沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、替米沙坦和缬沙坦，特别是缬沙坦；肾素抑制剂如地替吉仑、占吉仑、特拉吉仑、阿利吉仑、RO 66-1132和RO-66-1168；β-肾上腺素能受体阻断剂如醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔；影响收缩力的物质如地高辛、多巴酚丁胺和米力农；钙通道阻断剂如氨氯地平、苄普地尔、地尔硫卓、非洛地平、尼卡地平、尼莫地平、硝苯地平、尼索地平和维拉帕米；醛固酮受体拮抗剂；和醛固酮合酶抑制剂；
[0873] 5.过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂，例如非诺贝特、吡格列酮、罗西格列酮、替格他唑(tesaglitazar)、BMS-298585、L-796449、在专利申请WO 2004/103995中具体描述的化合物、即实施例1至35的化合物或权利要求21中具体列出的化合物或在专利申请WO 03/043985中具体记载的化合物、即实施例1至7的化合物或权利要求19中具体列出的化合物和尤其是(R)-1-{4-[5-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噁唑-4-基甲氧基]-苯磺酰基}-2,
3-二氢-1H-吲哚-2-甲酸或其盐；和
3-二氢-1H-吲哚-2-甲酸或其盐；和
[0874] 6.在Expert Opin Investig Drugs 2003,12(4):623-633,图1至7中所述的特定的抗糖尿病化合物。
[0875] 而且，本公开内容还关注了与用于促进体重减轻、例如刺激代谢或降低食欲的活性剂和方法和用于促进体重减轻的改善的饮食和/或运动方案的组合治疗。
[0876] 本发明的实施例
[0877] 缩略语
[0878] CAN 乙腈
[0879] BEH 亚乙基桥杂化
[0880] BOC 叔丁氧羰基
[0881] BSA 牛血清清蛋白
[0882] DCM 二氯甲烷
[0883] DCC N,N’-二环己基碳二亚胺
[0884] DIC N,N’-二异丙基碳二亚胺
[0885] DIPEA N,N’-二异丙基乙胺
[0886] DMAP 二甲基氨基吡啶
[0887] DMF N,N’-二甲基甲酰胺
[0888] DTT 二硫苏糖醇
[0889] DOT 3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇
[0890] EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
[0891] EDTA 乙二胺四乙酸
[0892] ESI 电喷射离子化
[0893] FFA 荧光焦点分析(fluorescent focus assay)
[0894] Fmoc 芴基甲基氧基羰基氯
[0895] HCTU 六氟磷酸O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓[0896] HEP 庚烷
[0897] HFIP 六氟异丙醇
[0898] HPLC 高效液相色谱法
[0899] HRMS 高分辨质谱法
[0900] HOBT 羟基苯并三唑
[0901] HS 人血清
[0902] LC/MS 液相色谱法质谱法联用
[0903] MS 质谱法
[0904] MW 分子量
[0905] MRT 平均保留时间
[0906] NHS N-羟基琥珀酰亚胺
[0907] NMM N-甲基吗啉
[0908] NMR 核磁共振
[0909] PEG 聚乙二醇
[0910] pE 焦谷氨酸盐/酯
[0911] pbf 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
[0912] PG 保护基
[0913] PK 药物动力学
[0914] Pol 聚合物载体
[0915] QTOF 四级飞行时间质谱仪
[0916] Rt: 保留时间
[0917] Rt或RT: 室温
[0918] Rpm: 每分钟转数
[0919] Sc 皮下
[0920] SFC 超临界流体
[0921] SPPS 固相肽合成
[0922] TBME 甲基叔丁基醚
[0923] Trt 三苯甲基
[0924] THF 四氢呋喃
[0925] TEA 三甲胺
[0926] TIS 三乙基甲硅烷
[0927] t,s,quin,br,m,d (三重峰,单峰,五重峰,宽,多重峰)
[0928] UPLC 超效液相色谱法
[0929] 合成:
[0930] 描述的LCMS方法
[0931]
[0932]
[0933] HPLC-分析方法F
[0934] ·柱子:XBridge BEH300C18(100x4.6mm),3μm；部件号:186003612
[0935] ·洗脱剂A:0.1％TFA在水中/洗脱剂B:0.1％TFA在CAN中
[0936] ·流速:1.0ml/min
[0937] ·温度:40℃
[0938] ·梯度:
[0939]时间[min] A[％] B[％]
0.0 98 2
18 2 98
20 2 98
22 98 2
0.0 98 2
18 2 98
20 2 98
22 98 2
[0940] UPLC-HRMS–分析方法G
[0941] ·Waters Acquity BEH C18,1.7μm,2.1x50mm；部件号:186002350
[0942] ·洗脱剂A:0.05％FA+3.75mM乙酸铵在水中；洗脱剂B:0.04％FA在CAN中
[0943] ·流速:1.0ml/min
[0944] ·温度:50℃
[0945] ·梯度:2至98％,4.4min
[0946] 方法H:LC-MS方法
[0947] ·HPLC:流动相A:2％HFIP+0.1％TEA；流动相B:甲醇；
[0948] ·梯度:0min 95％A,4min:75％A,8min 10％A,8.1min 95％A,10min 95％A；
[0949] ·流速:250μl/min；
[0950] ·柱子:Acquity UPLC BEH C18,1.7um,2.1x50mm(Waters)；
[0951] ·柱温:75℃
[0952] ·MS:QTOF(Waters)阴性模式；
[0953] ·ESI:2.9kv；毛细管温度350℃；喷射气体:600ml/min；源温:150℃
[0954] 方法I:LC-MS方法:
[0955] ·流动相A:水+0.1％甲酸；
[0956] ·流动相B:乙腈+0.1％甲酸；
[0957] ·梯度:0min.98％A,0.06min.98％A,1.76min.2％A,2.06min.2％A,2.16min.98％；流速:1ml/min.；
[0958] ·柱子:ACQUITY UPLC BEH C18, 1.7μm,2.1mm X 50mm；
[0959] ·柱温:50℃；
[0960] ·检测器:UV/Vis/CAD(电雾式检测器)
[0961] UPLC HRMS方法J:
[0962] ·柱子:Acquity BEH300C4 1.7μm,2.1x50mm
[0963] ·洗脱剂A:水(0.1％TFA)
[0964] ·洗脱剂B:ACN(0.1％TFA)
[0965] ·流速:0.5mL/min
[0966] ·温度:40℃
[0967] ·梯度:20％保持0.5min,在10min升至80％ACN
[0968] 方法K:
[0969] ·柱子:Waters Protein BEH C4柱子,300埃,3.5um,4.6x100mm
[0970] ·流动相:A:水(0.05％TFA)B:ACN(0.05％TFA)
[0971] ·流速:2mL/min
[0972] ·温度:40℃
[0973] ·梯度:25％B保持1min,在10min由Hol25-60％CAN升至在10.5min的95％B并保持2mins，然后在25％平衡2min。总运行时间为15mins。
[0974] ·质谱仪:Waters ZQ质谱仪
[0975] ·UPLC:柱子:BEH C4,300埃,1.7um,2.1x50mm
[0976] 方法L:
[0977] ·柱子:Proswift Monolith 4.6x 50mm
[0978] ·流动相:A:水(0.1％甲酸)B:ACN(0.1％甲酸)
[0979] ·流速:1mL/min
[0980] ·温度:50℃
[0981] ·梯度:0min 3％B；3％至80％B,2min；2.1min 10％B；2.8min 95％B；2.9min 3％B[0982] ·质谱仪:Qtof ESI扫描范围100-1900；通过Max Ent 1在Mass Lynx软件包中去卷积
[0983] ·UPLC:Waters Acquity
[0984]
[0985]
[0986] 分析方法S:
[0987] ·Xbridge C18柱,3.5μM,3.0x 3.0mm
[0988] ·洗脱剂:A:水+5mM氢氧化铵B:ACN
[0989] ·流速:2mL/min
[0990] ·梯度:0.0min 2％B；2％至95％B,1.70min；2.00min 95％B；2.10min 5％B；
[0991] ·质谱仪:单四极ESI
[0992] ·HPLC:Agilent 1100series
[0993] ·温度:40C
[0994] 分析方法T:
[0995]
[0996] 中间体1:11-溴十一烷酸苄基酯
[0997]
[0998] 在N2下于室温将11-溴十一烷酸(4g,15.08mmol)、苄基醇(1.875mL,18.10mmol)和DMAP(92mg,0.754mmol)溶于DCM中。加入EDC-HCl(4.34g,22.63mmol)，反应物搅拌17小时。将反应物浓缩,然后用Et2O(150mL)稀释。混合物用水萃取(30mL)，水相用Et2O(150mL)萃取。
合并的有机物用盐水洗涤(20mL)，经Na2SO4干燥。除去溶剂，残余物经快速柱纯化(二氧化硅
120g,0-10％Et2O/石油醚)，得到中间体1，为无色液体(6.75g,定量):LCMS方法方法A Rt＝
1.79min,M+H 355.2；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.18-1.36(m,10H)1.37-1.47(m,2H)
1.64(quin,J＝7.33Hz,2H)1.85(dt,J＝14.56,7.06Hz,2H)2.35(t,J＝7.58Hz,2H)3.40(t,J＝6.88Hz,2H)5.11(s,2H)7.28-7.45(m,5H)。
合并的有机物用盐水洗涤(20mL)，经Na2SO4干燥。除去溶剂，残余物经快速柱纯化(二氧化硅
120g,0-10％Et2O/石油醚)，得到中间体1，为无色液体(6.75g,定量):LCMS方法方法A Rt＝
1.79min,M+H 355.2；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.18-1.36(m,10H)1.37-1.47(m,2H)
1.64(quin,J＝7.33Hz,2H)1.85(dt,J＝14.56,7.06Hz,2H)2.35(t,J＝7.58Hz,2H)3.40(t,J＝6.88Hz,2H)5.11(s,2H)7.28-7.45(m,5H)。
[0999] 中间体2:十一烷-1,1,11-三甲酸三苄基酯
[1000]
[1001] 在N2下于0℃将NaH(113mg,2.83mmol)混悬于DMF(6mL)中。历经30分钟将丙二酸二苄基酯(0.704mL,2.82mmol)缓慢加入搅拌的混悬液中。加入溶于DMF(3mL)中的中间体1(903mg,2.54mmol)，使反应物于0℃搅拌2.75小时，然后温热至室温，搅拌过夜。反应物用Et2O(75mL)稀释，用水(20mL)萃取。水相用Et2O(75mL)萃取，合并的有机物用盐水(30mL)洗涤。有机物经Na2SO4干燥，浓缩。将浓缩物经快速柱(二氧化硅80g,0-10％EtOAc/HEP)纯化，得到无色油(770mg,1.38mmol,34％)，70％纯度:LCMS方法B Rt＝1.41min,M+H 559.6。
[1002] 中间体3:二十二烷-1,11,11-三甲酸三苄基酯
[1003]
[1004] 于0℃在N2下向NaH(66.1mg,1.65mmol)在DMF(2mL)中的混悬液中加入在DMF(4mL)中的中间体2(770mg,1.38mmol)。35分钟后，将1-溴十一烷(0.338mL,1.52mmol)在DMF(2mL)中的溶液加入反应物中，使其温热至室温，然后搅拌25分钟。将反应物搅拌2天。将反应物用Et2O(75mL)稀释，用10％LiCl(25mL)萃取。水相用Et2O(75mL)萃取。合并的有机物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，蒸发溶剂。将残余物经快速柱(二氧化硅80g,0-10％EtOAc/HEP)纯化，得到中间体3，为无色油(590mg,0.827mmol,33％):LCMS方法方法B Rt＝1.89min,M+Na 735.5；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm0.87-0.95(m,3H)1.07(br.s.,4H)1.14-1.36(m,28H)
1.66(quin,J＝7.43Hz,2H)1.85-1.95(m,4H)2.37(t,J＝7.58Hz,2H)5.12(s,4H)5.14(s,
2H)7.27(d,J＝2.32Hz,1H)7.28-7.43(m,14H)。
1.66(quin,J＝7.43Hz,2H)1.85-1.95(m,4H)2.37(t,J＝7.58Hz,2H)5.12(s,4H)5.14(s,
2H)7.27(d,J＝2.32Hz,1H)7.28-7.43(m,14H)。
[1005] 中间体4:二十二烷-1,11,11-三甲酸
[1006]
[1007] 将溶于THF(12mL)中的中间体3(590mg,0.827mmol)与10％披钯碳在THF(8mL)中的混悬液合并。将混悬液搅拌，经由气囊放置在氢气氛围下。1小时后，将反应物穿过滤膜，将固体用EtOAc冲洗。将滤液蒸发，得到标题化合物，为无色油(353mg,0.798mmol,96％):LCMS方法方法B Rt＝1.16min,M+H 443.5；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.77-0.84(m,3H)1.06-1.33(m,32H)1.59(quin,J＝7.18Hz,2H)1.83-1.92(m,4H)2.32(t,J＝7.03Hz,2H)。
[1008] 中间体5:2-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)-2-十一烷基十三烷二元酸[1009]
[1010] 在N2下将DCC(126mg,0.610mmol)在DCM(1.57mL)中的溶液加入中间体4和N-羟基琥珀酰亚胺在DCM(5mL)和THF(5mL)中的溶液中。3.5小时后，蒸发溶剂，残余物经超临界流体色谱法(SFC；Princeton 2-乙基-吡啶,20x150mm,20-30％MeOH/CO2)纯化，得到标题化合物，为无色油(138mg,0.256mmol,50％):LCMS方法B Rt＝1.21min,M+H 540.5；1H NMR(600MHz,乙腈-d3)δppm 0.91(t,J＝7.20Hz,3H)1.22-1.42(m,34H)1.57(quin,J＝7.34Hz,2H)1.93-1.96(m,2H)2.28(t,J＝7.47Hz,2H)2.79(br.d,J＝6.30Hz,4H)。
[1011] 中间体6和6A:2-(叠氮基-PEG23-氨甲酰基)-2-十一烷基十三烷二元酸构建体(6)和12-(叠氮基-PEG23-氨甲酰基)二十三烷酸构建体(6A)
[1012]
[1013] 将中间体5(36mg,0.066mmol)和叠氮基-dPEG23-NH2(Quanta Biodesign:73mg,0.066mmol)在THF(1.5mL)中合并，在振摇盘上混合15分钟，然后加入DIPEA(17μL,
0.10mmol)。将反应物在振摇盘上放置过夜。蒸发溶剂，残余物经HPLC(Sunfire C18
30x50mm,55-80％ACN/水+0.1％TFA)纯化，得到中间体6(39mg,0.025mmol,38％)和中间体
6a(20mg,0.013mmol,20％):LCMS方法B Rt＝1.11min,[M+2H]+2 763.4；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.86-0.93(m,3H)1.10-1.19(m,2H)1.20-1.29(m,23H)1.32(br.s.,7H)1.58-
1.69(m,2H)1.69-1.79(m,2H)1.96-2.10(m,2H)2.35(t,J＝7.15Hz,2H)3.41(t,J＝5.07Hz,
2H)3.51-3.57(m,2H)3.58-3.62(m,2H)3.62-3.73(m,90H)7.46(br.s.,1H)；LCMS方法B Rt＝1.23min,[M+2]+2 740.9；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.83-0.96(m,3H)1.27(br.s.,
25H)1.29-1.37(m,7H)1.37-1.46(m,2H)1.53-1.73(m,4H)2.34(t,J＝7.21Hz,2H)3.41(t,J＝5.07Hz,2H)3.44-3.52(m,2H)3.55-3.60(m,2H)3.60-3.74(m,90H)6.19-6.30(m,1H)。
0.10mmol)。将反应物在振摇盘上放置过夜。蒸发溶剂，残余物经HPLC(Sunfire C18
30x50mm,55-80％ACN/水+0.1％TFA)纯化，得到中间体6(39mg,0.025mmol,38％)和中间体
6a(20mg,0.013mmol,20％):LCMS方法B Rt＝1.11min,[M+2H]+2 763.4；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.86-0.93(m,3H)1.10-1.19(m,2H)1.20-1.29(m,23H)1.32(br.s.,7H)1.58-
1.69(m,2H)1.69-1.79(m,2H)1.96-2.10(m,2H)2.35(t,J＝7.15Hz,2H)3.41(t,J＝5.07Hz,
2H)3.51-3.57(m,2H)3.58-3.62(m,2H)3.62-3.73(m,90H)7.46(br.s.,1H)；LCMS方法B Rt＝1.23min,[M+2]+2 740.9；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.83-0.96(m,3H)1.27(br.s.,
25H)1.29-1.37(m,7H)1.37-1.46(m,2H)1.53-1.73(m,4H)2.34(t,J＝7.21Hz,2H)3.41(t,J＝5.07Hz,2H)3.44-3.52(m,2H)3.55-3.60(m,2H)3.60-3.74(m,90H)6.19-6.30(m,1H)。
[1014] 或者，按照如下操作获得构建体6A：将中间体5(48mg,0.042mmol)在THF(1mL)中的溶液加入装有叠氮基-PEG23-胺(Quanta Biodesign,目录号10525)(46mg,0.042mmol)的小瓶中。将反应物振摇20分钟，然后加入DIPEA(11μL,0.063mmol)，然后维持过夜。加入叠氮基-PEG23-胺(23mg,0.021mmol)和DIPEA(5μL,0.029mmol)，将反应物振摇另外一天。蒸发溶剂，将残余物经HPLC(Xbridge C18 30x50mm,10-30％ACN/5mM NH4OH)纯化。将级分冷冻干燥，得到产物的混合物。将材料经HPLC(Sunfire C1830x50mm,45-70％ACN/水+0.1％TFA)纯化，得到标题中间体6A(30mg,0.020mmol,48％):LCMS方法B Rt＝0.81min,[M+H+H3O]+2 764.5；1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δppm 1.30(br.s.,28H)1.40-1.50(m,2H)1.50-1.62(m,
6H)2.14(t,J＝7.52Hz,2H)2.23-2.35(m,3H)3.32(q,J＝5.58Hz,2H)3.37-3.43(m,2H)
3.47-3.52(m,2H)3.53-3.68(m,90H)6.54(br.s.,1H)。
6H)2.14(t,J＝7.52Hz,2H)2.23-2.35(m,3H)3.32(q,J＝5.58Hz,2H)3.37-3.43(m,2H)
3.47-3.52(m,2H)3.53-3.68(m,90H)6.54(br.s.,1H)。
[1015] 中间体7:(((11-溴十一烷基)氧基)次甲基)三苯
[1016]
[1017] 在N2下将三苯甲基氯(2.49g,8.92mmol)、11-溴十一烷-1-醇(2.00g,7.96mmol)和DMAP(10mg,0.080mmol)溶于DCM(16mL)中。在搅拌下加入DIPEA(1.39mL,7.96mmol)，将反应物维持7天。将反应物在DCM(20mL)和水(10mL)之间分配。将有机相用水(20mL)萃取，经MgSO4干燥，浓缩。将浓缩物经快速柱纯化(二氧化硅120g,0-6％EtOAc/HEP)，得到中间体7(2.50g,5.07mmol,64％)，为无色油:1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.19-1.49(m,14H)1.58-1.69(m,2H)1.79(dt,J＝14.50,7.00Hz,1H)1.87(dt,J＝14.55,7.03Hz,1H)3.07(t,J＝6.66Hz,2H)3.43(t,J＝6.85Hz,1H)3.55(t,J＝6.79Hz,1H)7.18-7.36(m,10H)7.42-7.52(m,5H)。
[1018] 中间体8:2-(11-(三苯甲基氧基)十一烷基)丙二酸二苄基酯
[1019]
[1020] 于0℃在N2下将NaH(113mg,2.83mmol)混悬于DMF(6mL)中。将丙二酸二苄基酯缓慢加入搅拌的混悬液中。30分钟后，加入中间体7(1.26g,2.54mmol)在DMF(3mL)中的溶液。搅拌15分钟后，将所得混合物温热至室温。3天后，将反应物用Et2O(75mL)稀释，用水(40mL)萃取。水相用Et2O(75mL)萃取。合并的有机物经Na2SO4干燥，浓缩。将浓缩物经快速柱(二氧化硅80g,0-10％EtOAc/HEP)纯化，得到标题化合物，为无色油(815mg,1.17mmol,41％):HPLC方法B Rt＝1.68min；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.16-1.40(m,16H)1.58-1.69(m,2H)1.94(q,J＝7.38Hz,2H)3.06(t,J＝6.66Hz,2H)3.45(t,J＝7.52Hz,1H)5.16(s,4H)7.21-
7.28(m,3H)7.28-7.39(m,16H)7.42-7.51(m,6H)。
7.28(m,3H)7.28-7.39(m,16H)7.42-7.51(m,6H)。
[1021] 中间体9:22-(三苯甲基氧基)二十二烷-1,11,11-三甲酸三苄基酯
[1022]
[1023] 在N2下于0℃将中间体8(815mg,1.17mmol)在DMF(2mL)中的溶液加入NaH(56mg,1.40mmol溶液)在DMF(2mL)中的混悬液中。将混合物搅拌1小时。将在DMF(2mL)中的11-溴十一烷酸苄基酯(457mg,1.29mmol)加入反应物中。在加入后20分钟，使反应物温热至室温，搅拌过夜。将反应物用Et2O(75mL)稀释，用水(25mL)萃取。水相用Et2O(75mL)萃取，合并有机物。合并的有机物经Na2SO4干燥，蒸发。将残余物经快速柱(二氧化硅40g,0-10％EtOAc/HEP)纯化，得到标题化合物，为无色油(780mg,0.803mmol,69％):1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm
0.99-1.14(m,4H)1.15-1.41(m,26H)1.58-1.71(m,4H)1.82-1.96(m,4H)2.37(t,J＝
7.52Hz,2H)3.06(t,J＝6.66Hz,2H)5.12(s,4H)5.14(s,2H)7.28(s,24H)7.42-7.52(m,6H)。
0.99-1.14(m,4H)1.15-1.41(m,26H)1.58-1.71(m,4H)1.82-1.96(m,4H)2.37(t,J＝
7.52Hz,2H)3.06(t,J＝6.66Hz,2H)5.12(s,4H)5.14(s,2H)7.28(s,24H)7.42-7.52(m,6H)。
[1024] 中间体10:22-(三苯甲基氧基)二十二烷-1,11,11-三甲酸
[1025]
[1026] 将10％披钯碳(11mg,0.010mmol)在THF(2.5mL)中的混悬液加入中间体9(200mg,0.206mmol)在THF(2.5mL)中的溶液中。将经搅拌的混悬液经气囊放置在氢气下。2.25小时后，将反应物穿过滤膜，将固体用EtOAc冲洗。将滤液蒸发，得到中间体10(150mg,定量):1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.04-1.33(m,30H)1.45-1.62(m,4H)1.76-1.91(m,4H)2.21-
2.36(m,2H)2.97(t,J＝6.60Hz,2H)7.06-7.18(m,4H)7.19-7.24(m,5H)7.33-7.50(m,6H)。
2.36(m,2H)2.97(t,J＝6.60Hz,2H)7.06-7.18(m,4H)7.19-7.24(m,5H)7.33-7.50(m,6H)。
[1027] 中间体11:2-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)-2-(11-(三苯甲基氧基)十一烷基)十三烷二元酸(11)
[1028]
[1029] 将中间体10(150mg,0.214mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(25mg,0.214mmol)在DCM(4mL)中合并。加入溶于DCM(0.61mL)中的DCC(49mg,0.235mmol)，将反应物于室温搅拌7小时。蒸发溶剂，残余物经HPLC(Sunfire C18 30x50mm；65-95％ACN/水+0.1％TFA)、然后经SFC(Princeton 2-乙基吡啶柱20x100mm,25-35％MeOH/CO2)纯化，得到中间体11(34mg,0.043mmol,20％)，为无色油:LCMS方法B Rt＝1.47min,M-CO2H 752.7；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.13-1.42(m,30H)1.56-1.73(m,4H)1.94-2.14(m,4H)2.37(t,J＝7.21Hz,2H)
2.83(br.s.,4H)3.06(t,J＝6.66Hz,2H)7.15-7.28(m,3H)7.29-7.36(m,6H)7.41-7.50(m,
6H)。
2.83(br.s.,4H)3.06(t,J＝6.66Hz,2H)7.15-7.28(m,3H)7.29-7.36(m,6H)7.41-7.50(m,
6H)。
[1030] 中间体12:2-((叠氮基-PEG23)氨甲酰基)-2-(11-羟基十一烷基)十三烷二元酸构建体
[1031]
[1032] 在N2下将在THF(1.5mL)中的叠氮基-dPEG23-胺(Quanta Biodesign)42mg,0.038mmol)与中间体11(34mg,0.043mmol)合并。反应物放置在振摇盘上，振荡20min。加入DIPEA(7.44μL,0.043mmol)，反应物振荡2小时。加入DIPEA(4μL,0.023mmol)，反应物维持过夜。蒸发溶剂，残余物溶入DCM(3mL)和TFA(0.5mL)中。将溶液振摇1小时，此时溶剂被提出。
将残余物经HPLC(sunfire C1830x50mm,45-70％ACN/水+0.1％TFA)纯化，得到中间体12+2 1
(4mg,1.8μmol,4.2％):LCMS方法B Rt＝0.75min,[M+2H] 771.4；H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.05-1.39(m,30H)1.52-1.82(m,6H)1.97-2.09(m,2H)2.35(t,J＝7.21Hz,2H)3.41(t,J＝5.07Hz,2H)3.51-3.63(m,6H)3.63-3.75(m,90H)4.36(t,J＝6.72Hz,1H)7.49-7.65(m,
1H)。
将残余物经HPLC(sunfire C1830x50mm,45-70％ACN/水+0.1％TFA)纯化，得到中间体12+2 1
(4mg,1.8μmol,4.2％):LCMS方法B Rt＝0.75min,[M+2H] 771.4；H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.05-1.39(m,30H)1.52-1.82(m,6H)1.97-2.09(m,2H)2.35(t,J＝7.21Hz,2H)3.41(t,J＝5.07Hz,2H)3.51-3.63(m,6H)3.63-3.75(m,90H)4.36(t,J＝6.72Hz,1H)7.49-7.65(m,
1H)。
[1033] 中间体13:13-(苄基氧基)-12-((苄基氧基)羰基)-13-氧代十三烷酸
[1034]
[1035] 在N2下于0℃将在DMF(3mL)中的丙二酸二苄基酯(0.88mL,3.52mmol)缓慢加入NaH(274mg,6.86mmol)的混悬液中。将混合物搅拌1.5小时，然后温热至室温。加入在DMF(3mL)中的11-溴十一烷酸(933mg,3.52mmol)，反应物过夜。将反应物加热至80℃达3小时，然后冷却。反应物用EtOAc(50mL)和Et2O(50mL)稀释，用1M HCl(25mL)萃取。水相用EtOAc/Et2O(100mL)萃取。合并的有机物经Na2SO4干燥，蒸发溶剂。将残余物经快速柱(C1850g30-100％ACN/水+0.1TFA)纯化，得到中间体13(315mg,0.672mmol,19％)，为白色粉末:LCMS方法B Rt＝1.05min,M+H 469.5。
[1036] 中间体14:23-(苄基氧基)-12,12-双((苄基氧基)羰基)-23-氧代二十三烷酸[1037]
[1038] 于0℃在N2下将NaH(54mg,1.34mmol)混悬于DMF(1mL)中。以滴加方式向混合物中加入在DMF(3mL)中的中间体13(315mg,0.672mmol)。反应物搅拌1小时，然后加入在DMF(1mL)的中间体1(239mg,0.672mmol)。反应物于0℃维持另外45分钟，然后使其温热至室温。反应物搅拌过夜。反应物用1:1Et2O和EtOAc(75mL)稀释，用1M HCl(20mL)萃取。水相用1:
1Et2O和EtOAc(75mL)萃取。合并的有机物经Na2SO4干燥，蒸发。将所得残余物经HPLC(Xbridge C1830x50mm,45-70％ACN/水+5mM NH4OH)纯化，得到标题化合物(132mg,
0.178mmol,26％):LCMS方法B；Rt＝1.53min,M-H741.8。
1Et2O和EtOAc(75mL)萃取。合并的有机物经Na2SO4干燥，蒸发。将所得残余物经HPLC(Xbridge C1830x50mm,45-70％ACN/水+5mM NH4OH)纯化，得到标题化合物(132mg,
0.178mmol,26％):LCMS方法B；Rt＝1.53min,M-H741.8。
[1039] 中间体15:二十一烷-1,11,11,21-四甲酸1,11,11-三苄基酯21-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯
[1040]
[1041] 将在DCM(1mL)中的DCC(44mg,0.213mmol)加入中间体14(132mg,0.178mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(20mg,0.178mmol)在DCM(2.5mL)中的溶液中。将反应物在振摇盘上振荡17小时。将反应物过滤，固体用DCM冲洗。滤液浓缩，经快速柱(二氧化硅12g,0-40％EtOAc/HEP)纯化，得到中间体15(107mg,0.127mmol,72％):LCMS方法B Rt＝1.53min,M+Na 862.8。
[1042] 中间体16:22-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-22-氧代二十二烷-1,11,11-三甲酸
[1043]
[1044] 向中间体15(107mg,0.127mmol)在THF(2.5mL)中的溶液中加入10％披钯碳在THF(2.5mL)中的混悬液。将混合物放置在氢气氛围下达1.5小时。使反应物穿过滤膜，将固体用DCM和THF洗涤。滤液蒸发，得到无色油(95mg,定量)，其含有标题化合物:LCMS方法B Rt＝0.65min,M+H 570.5。
[1045] 中间体17:2-(11-(叠氮基-PEG23-氨基)-11-氧代十一烷基)十三烷二元酸构建体[1046]
[1047] 将中间体16(48mg,0.042mmol)在THF(1mL)中的溶液加入装有叠氮基-dPEG23-胺(Quanta Biodesign:46mg,0.042mmol)的小瓶中。将反应物振荡20min，然后加入DIPEA(11μL,0.063mmol)，然后维持过夜。加入叠氮基-PEG23-胺(23mg,0.021mmol)和DIPEA(5μL,0.029mmol)，将反应物搅拌另外一天。蒸发溶剂，残余物经HPLC(Xbridge C18 30x50mm,10-
30％ACN/5mM NH4OH)纯化。将级分冷冻干燥，得到产物混合物。将材料经HPLC(Sunfire C18
30x50mm,45-70％ACN/水+0.1％TFA)纯化，得到标题中间体17(30mg,0.020mmol,48％):
LCMS SQ4Rt＝0.81min,[M+H+H3O]+2764.5；1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δppm 1.30(br.s.,
28H)1.40-1.50(m,2H)1.50-1.62(m,6H)2.14(t,J＝7.52Hz,2H)2.23-2.35(m,3H)3.32(q,J＝5.58Hz,2H)3.37-3.43(m,2H)3.47-3.52(m,2H)3.53-3.68(m,90H)6.54(br.s.,1H).[1048] 中间体18:二十一烷-1,11,11,21-四甲酸四苄基酯
30％ACN/5mM NH4OH)纯化。将级分冷冻干燥，得到产物混合物。将材料经HPLC(Sunfire C18
30x50mm,45-70％ACN/水+0.1％TFA)纯化，得到标题中间体17(30mg,0.020mmol,48％):
LCMS SQ4Rt＝0.81min,[M+H+H3O]+2764.5；1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δppm 1.30(br.s.,
28H)1.40-1.50(m,2H)1.50-1.62(m,6H)2.14(t,J＝7.52Hz,2H)2.23-2.35(m,3H)3.32(q,J＝5.58Hz,2H)3.37-3.43(m,2H)3.47-3.52(m,2H)3.53-3.68(m,90H)6.54(br.s.,1H).[1048] 中间体18:二十一烷-1,11,11,21-四甲酸四苄基酯
[1049]
[1050] 于0℃在N2下向NaH(48mg,1.21mmol)在DMF(2mL)中的混悬液中缓慢加入在DMF(2mL)中的中间体2(337mg,0.603mmol)。混合物搅拌15min，然后加入在DMF(2mL)中的中间体1(429mg,1.21mmol)。反应物于0℃搅拌20min，然后使其温热至室温。反应物于室温搅拌维持3天。反应物用Et2O(75mL)稀释，用水(20mL)萃取。水相用Et2O(75mL)萃取。合并的有机物经Na2SO4干燥和蒸发。将残余物经快速柱(二氧化硅24g,0-15％EtOAc/HEP)纯化，得到标题化合物(315mg,0.378mmol,63％):LCMS方法B Rt＝1.70min,M+Na 855.8；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.95-1.13(m,4H)1.13-1.40(m,24H)1.59-1.72(m,4H)1.82-1.95(m,4H)2.37(t,J＝7.52Hz,4H)5.12(s,4H)5.14(s,4H)7.14-7.44(m,20H)。
[1051] 中间体19:二十一烷-1,11,11,21-四甲酸
[1052]
[1053] 将10％披钯碳(20mg,0.019mmol)在THF(4mL)中的混悬液加入中间体18(315mg,0.378mmol)在THF(6mL)中的溶液中，将反应物在氢气氛围下放置2小时。使用膜滤器以移出固体，将其用EtOAc洗涤。蒸发滤液，得到中间体19(179mg,定量)，为白色固体:LCMS方法A Rt＝1.24min,M+H 473.4；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.99-1.15(m,4H)1.24(br.s.,
24H)1.48(quin,J＝6.94Hz,4H)1.62-1.76(m,4H)2.18(t,J＝7.34Hz,4H)12.23(br.s,4H)。
24H)1.48(quin,J＝6.94Hz,4H)1.62-1.76(m,4H)2.18(t,J＝7.34Hz,4H)12.23(br.s,4H)。
[1054] 中间体20:11-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)二十一烷-1,11,21-三甲酸
[1055]
[1056] 将N-羟基琥珀酰亚胺(20mg,0.170mmol)和中间体19(90mg,0.190mmol)溶于DCM(3mL)和THF(0.3mL)中。加入DCC(39mg,0.190mmol)在DCM(0.5Ml)中的溶液，将反应物搅拌过夜。蒸发溶剂，残余物经HPLC(Sunfire C1830x50mm；35-60％ACN/水+0.1％TFA)纯化，得到标题化合物，为白色粉末(21mg,0.037mmol,19％):LCMS(方法C Rt＝1.01min,M+H 570.3。
[1057] 中间体21和21a:11-((叠氮基-PEG23)氨甲酰基)二十一烷-1,11,21-三甲酸(21)和12-((叠氮基-PEG23)氨甲酰基)二十三烷二元酸(21a)
[1058]
[1059] 将叠氮基-PEG23-胺(41mg,0.037mmol)和中间体20(21mg,0.037mmol)在THF(1mL)中合并，振荡10min。加入DIPEA(9.66μL,0.055mmol)，将反应物搅拌过夜。蒸发溶剂，残余物经HPLC(Sunfire C18 30x50mm,35-60％ACN/水+0.1％TFA)纯化，得到中间体21(22mg,0.014mmol,38％)和21a(4mg,2.6μmol,7％):LCMS方法B Rt＝0.69min,M+H 1555.3；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.27(br.s.,19H)1.29-1.41(m,9H)1.65(quin,J＝7.12Hz,4H)1.78(td,J＝12.13,4.22Hz,2H)1.95-2.08(m,2H)2.35(t,J＝7.21Hz,4H)3.41(t,J＝5.07Hz,
2H)3.54(q,J＝5.05Hz,2H)3.58-3.77(m,92H)7.60(t,J＝4.95Hz,1H)；LCMS方法B Rt＝
0.78min,M-H 1509.3；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.18(br.s.,19H)1.21-1.38(m,11H)
1.43-1.63(m,6H)1.91-2.04(m,1H)2.26(t,J＝7.15Hz,4H)3.31(t,J＝5.07Hz,2H)3.40(q,J＝5.14Hz,2H)3.46-3.50(m,2H)3.51-3.69(m,90H)6.23(t,J＝5.01Hz,1H)。
2H)3.54(q,J＝5.05Hz,2H)3.58-3.77(m,92H)7.60(t,J＝4.95Hz,1H)；LCMS方法B Rt＝
0.78min,M-H 1509.3；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.18(br.s.,19H)1.21-1.38(m,11H)
1.43-1.63(m,6H)1.91-2.04(m,1H)2.26(t,J＝7.15Hz,4H)3.31(t,J＝5.07Hz,2H)3.40(q,J＝5.14Hz,2H)3.46-3.50(m,2H)3.51-3.69(m,90H)6.23(t,J＝5.01Hz,1H)。
[1060] 中间体22:2-十一烷基丙二酸二苄基酯
[1061]
[1062] 在N2下于0℃将在DMF(1.5mL)中的丙二酸二苄基酯(0.88mL,3.52mmol)滴加至NaH(155mg,3.87mmol)在DMF(6mL)中的混悬液中。将混合物搅拌30min，然后将在DMF(1.5mL)中的1-溴十一烷(0.785mL,3.52mmol)加入反应物中。使反应物温热至室温，搅拌5天。反应物用Et2O(75mL)稀释，用水(20mL)萃取。水相用Et2O(75mL)萃取。合并的有机物经Na2SO4干燥和蒸发。将残余物经快速柱(二氧化硅80g,0-10％EtOAc/HEP)纯化，得到标题化合物(974mg,2.22mmol,63％)，为无色油:LCMS方法B Rt＝1.55min,M+H 439.5。
[1063] 中间体23:2-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)-2-十一烷基十三烷酸[1064]
[1065] 在N2下于0℃将在DMF(1mL)中的2-十一烷基丙二酸二苄基酯(中间体22:400mg,0.912mmol)滴加至NaH(44mg,1.09mmol)在DMF(2mL)中的混悬液中。混合物搅拌45min，然后将在DMF(1mL)中的1-溴十一烷(0.285mL,1.28mmol)加入反应物中。使反应物温热至室温，搅拌1天。反应物用Et2O(75mL)稀释，用水(20mL)萃取。水相用Et2O(75mL)萃取。合并的有机物经Na2SO4干燥和蒸发。将残余物经快速柱(二氧化硅40g,0-5％EtOAc/HEP)纯化，得到无色油(412mg)。将油溶于THF/MeOH中，通过具有10％Pd/C短柱的Thales Nano H-Cube(1mL/min,2bar H2,22C)。收集洗脱物并蒸发，得到蜡状固体(272mg)。将蜡状固体溶于3:1DCM/THF中，浓缩至油状物。在N2下将油状物重新溶于DCM(6mL)中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(68mg)、然后加入在DCM(3mL)中的DCC(136mg)。反应物搅拌1天。将反应物过滤，滤液浓缩。
将浓缩物经快速柱纯化(C1812g,25-100％ACN/水+0.1％甲酸)。所得物质进一步通过超临界流体色谱法(Princeton 2-乙基吡啶20x150mm；5-15％MeOH/CO2)纯化，得到中间体23(37mg,0.073mmol,8％):LCMS方法B Rt＝1.67min,M+NH4527.6；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.80-0.94(m,6H)1.18-1.42(m,36H)1.97-2.14(m,4H)2.87(br.s.,4H)。
将浓缩物经快速柱纯化(C1812g,25-100％ACN/水+0.1％甲酸)。所得物质进一步通过超临界流体色谱法(Princeton 2-乙基吡啶20x150mm；5-15％MeOH/CO2)纯化，得到中间体23(37mg,0.073mmol,8％):LCMS方法B Rt＝1.67min,M+NH4527.6；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.80-0.94(m,6H)1.18-1.42(m,36H)1.97-2.14(m,4H)2.87(br.s.,4H)。
[1066] 中间体24:2-((叠氮基-PEG23)氨甲酰基)-2-十一烷基十三烷酸
[1067]
[1068] 将中间体23(37mg,0.073mmol)在THF(1mL)中的溶液加入装有叠氮基-dPEG23-胺(Quanta Biodesign:80mg,0.073mmol)的小瓶中。将溶液在振荡板上搅拌，加入DIPEA(11μL,0.065mmol)。反应物搅拌过夜，然后加入另外部分的DIPEA(12μL,0.071mmol)，使反应物过夜。蒸发溶剂，残余物经超临界流体色谱法(Princeton氨基21x150mm；20-30％MeOH/CO2)纯化，得到标题化合物(45mg,0.030mmol,41％):LCMS方法B Rt＝1.50min,[M+2H]+2748.1；1H NMR(400MHz,氯仿-d)σppm 0.90(t,J＝6.85Hz,6H)1.09-1.38(m,30H)1.58(br.s.,12H)
1.64-1.76(m,2H)1.98-2.16(m,2H)3.41(t,J＝5.14Hz,2H)3.46-3.64(m,5H)3.64-3.91(m,
83H)。
1.64-1.76(m,2H)1.98-2.16(m,2H)3.41(t,J＝5.14Hz,2H)3.46-3.64(m,5H)3.64-3.91(m,
83H)。
[1069] 中间体25:2-十一烷基丙二酸二叔丁基酯
[1070]
[1071] 在N2下于0℃将在DMF(2mL)中的丙二酸二叔丁基酯(1.0g,4.62mmol)加入NaH(213mg,5.32mmol)在DMF(5mL)中的混悬液中。反应物搅拌30min，然后加入在DMF(2mL)中的1-溴十一烷。加入后，使反应物温热至室温，搅拌2天。反应物用Et2O(75mL)稀释，用水(25mL)萃取。水相用Et2O(75mL)萃取。合并的有机物经Na2SO4干燥和蒸发溶剂。将浓缩物经快速柱纯化(二氧化硅120g,0-40％Et2O/石油醚)，得到中间体25(0.998g,2.69mmol,
58％):LCMS方法B Rt＝1.64min,M+Na 393.5；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.85-0.94(m,
3H)1.24-1.36(m,18H)1.41-1.52(m,18H)1.74-1.86(m,2H)3.13(t,J＝7.58Hz,1H)。
58％):LCMS方法B Rt＝1.64min,M+Na 393.5；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.85-0.94(m,
3H)1.24-1.36(m,18H)1.41-1.52(m,18H)1.74-1.86(m,2H)3.13(t,J＝7.58Hz,1H)。
[1072] 中间体26:二十二烷-1,11,11-三甲酸1-苄基酯11,11-二-叔丁基酯
[1073]
[1074] 采用中间体25作为原料，以与中间体9相似的方式合成了标题化合物，得到无色油(980mg,1.52mmol,66％):1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm0.89(t,J＝6.91Hz,3H)1.06-1.20(m,4H)1.20-1.35(m,28H)1.45(s,18H)1.58-1.70(m,2H)1.72-1.83(m,4H)2.36(t,J＝7.52Hz,2H)5.12(s,2H)7.30-7.45(m,5H)。
[1075] 中间体27:12,12-双(叔丁氧羰基)二十三烷酸
[1076]
[1077] 采用中间体26，以与中间体19类似的方式合成了标题化合物(472mg,0.851mmol,100％):LCMS方法B Rt＝1.76min,M-H 553.6；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.84-0.95(m,
3H)1.07-1.21(m,4H)1.21-1.40(m,28H)1.46(s,18H)1.58-1.70(m,2H)1.72-1.84(m,4H)
2.37(t,J＝7.46Hz,2H)。
3H)1.07-1.21(m,4H)1.21-1.40(m,28H)1.46(s,18H)1.58-1.70(m,2H)1.72-1.84(m,4H)
2.37(t,J＝7.46Hz,2H)。
[1078] 中间体28:二十二烷-1,11,11-三甲酸11,11-二-叔丁基酯1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯
[1079]
[1080] 将中间体27(200mg,0.360mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(42mg,0.360mmol)溶于DCM(3mL)中。加入DCC(89mg,0.433mmol)在DCM(1.6mL)中的溶液，反应物搅拌4.5小时。反应物过滤，滤液浓缩。将浓缩物经快速柱纯化(二氧化硅24g,0-40％EtOAc/HEP)，得到标题化合物，为无色油(70mg,0.107mmol,30％):LCMS方法B Rt＝1.74min,M+Na 674.7。
[1081] 中间体29和29A:2-(11-((叠氮基-PEG23)-氨基)-11-氧代十一烷基)-2-十一烷基丙二酸(29)和13-((叠氮基-PEG23)-氨基)-13-氧代-2-十一烷基十三烷酸(29A)
[1082]
[1083] 将中间体28(35mg,0.054mmol)在THF(1mL)中的溶液加入装有叠氮基-PEG23-胺(59mg,0.054mmol)的小瓶中。加入DIPEA(14μL,0.081mmol)，反应物搅拌过夜。蒸发溶剂，残余物重新溶于DCM(1mL)和TFA(0.2mL)中。反应物振荡1.25小时，然后蒸发溶剂。将残余物经HPLC纯化(Sunfire30x50mm C18,55-80％ACN/水+0.1％TFA)，将所得物质重新溶于DCM(4mL)和TFA(2mL)中，振荡1.5小时。蒸发溶剂，残余物经HPLC纯化(Sunfire30x50mm C18,55-80％ACN/水+0.1％TFA)，得到中间体29(28mg,0.016mmol,29％)和中间体29A(1mg,0.6μmol,1％):LCMS方法B Rt＝1.08min,[M+H+H3O]+2771.5；1H NMR(400MHz,氯仿-d)σppm 0.90(t,J＝6.72Hz,3H)1.26(br.s.,24H)1.32-1.41(m,8H)1.62(quin,J＝7.64Hz,2H)1.88-
2.01(m,4H)2.31(t,J＝7.70Hz,2H)3.41(t,J＝5.07Hz,2H)3.46-3.56(m,3H)3.57-3.90(m,
91H)；LCMS方法B Rt＝1.29min,[M+2H]+2741.1。
2.01(m,4H)2.31(t,J＝7.70Hz,2H)3.41(t,J＝5.07Hz,2H)3.46-3.56(m,3H)3.57-3.90(m,
91H)；LCMS方法B Rt＝1.29min,[M+2H]+2741.1。
[1084] 中间体30:22-((叠氮基-PEG23)氨基)-22-氧代二十二烷-1,11,11-三甲酸
[1085]
[1086] 将中间体16(58mg,0.063mmol)在THF(1mL)中的溶液加入装有叠氮基-PEG23-胺(70mg,0.063mmol)的小瓶中。加入DIPEA(17μL,0.095mmol)，反应物在振荡板上搅拌过夜。反应物浓缩，经HPLC纯化(Sunfire C1830x50mm,35-60％ACN/水+0.1％TFA)，得到中间体30(57mg,0.036mmol,57％)，为蜡状白色固体:LCMS方法B Rt＝0.62min,M+H 1555.4；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.28(br.s.,18H)1.30-1.40(m,10H)1.63(m,J＝7.10,7.10,7.10,
7.10,7.10Hz,4H)1.88-2.02(m,4H)2.28(t,J＝8.10Hz,2H)2.35(t,J＝7.40Hz,2H)3.41(t,J＝5.07Hz,2H)3.50(dt,J＝9.20,4.39Hz,2H)3.57-3.63(m,2H)3.63-3.73(m,90H)
7.10,7.10Hz,4H)1.88-2.02(m,4H)2.28(t,J＝8.10Hz,2H)2.35(t,J＝7.40Hz,2H)3.41(t,J＝5.07Hz,2H)3.50(dt,J＝9.20,4.39Hz,2H)3.57-3.63(m,2H)3.63-3.73(m,90H)
[1087] 中间体31:2-十一烷基丙二酸1-苄基酯3-叔丁基酯
[1088]
[1089] 于0℃在N2下向NaH(160mg,4.0mmol)在DMF(8mL)中的混悬液中加入在DMF(2mL)中的丙二酸苄基酯叔丁基酯(1.0g,4.0mmol)。混合物搅拌50min，然后加入在DMF(2mL)中的1-溴十一烷。另外搅拌1小时后，使反应物温热至室温。反应物维持过夜。加入Et2O(100mL)和水(20mL)以分配反应物。水相用Et2O(100mL)萃取，合并的有机物经Na2SO4干燥。蒸发溶剂，残余物经快速柱纯化(C1812g,40-100％ACN/水+0.1％TFA)，得到标题化合物，为无色油(1.14g,2.82mmol,71％):LCMS方法A Rt＝1.58min,M+Na 427.4；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.84-0.96(m,3H)1.28(br.s,12H)1.31(m,J＝3.90Hz,6H)1.41(s,9H)1.88(q,J＝7.38Hz,2H)3.29(t,J＝7.58Hz,1H)5.19(q,J＝12.27Hz,2H)7.30-7.42(m,5H)。
[1090] 或者，丙二酸叔丁基酯的烷基化可以采用1-碘十一烷(1.2eq)在甲酸钾(2eq)的存在下在DMF中进行。
[1091] 中间体32:二十二烷-1,11,11-三甲酸1,11-二苄基酯11-叔丁基酯
[1092]
[1093] 采用中间体31(650mg,1.61mmol)作为原料，以与中间体9类似的方式合成了标题化合物，得到无色油(823mg,1.21mmol,75％):1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.84-0.94(m,3H)1.12(m,J＝6.60Hz,4H)1.19-1.33(m,28H)1.35(s,9H)1.66(quin,J＝7.40Hz,2H)1.85(t,J＝8.44Hz,4H)2.37(t,J＝7.52Hz,2H)5.14(s,2H)5.16(s,2H)7.30-7.42(m,10H)。
[1094] 中间体33:13-(苄基氧基)-2-((苄基氧基)羰基)-13-氧代-2-十一烷基十三烷酸[1095]
[1096] 向中间体32(200mg,0.295mmol)在DCM(3mL)中的溶液中加入TFA(0.6mL)，反应物于室温搅拌3小时。蒸发溶剂，残余物经快速柱纯化(二氧化硅12g,0-15％EtOAc/HEP)，得到标题化合物(177mg,0.284mmol,96％):1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.87-0.94(m,3H)0.94-1.05(m,2H)1.19(br.s.,14H)1.23-1.37(m,16H)1.65(quin,J＝7.40Hz,2H)1.78-
1.91(m,2H)1.93-2.05(m,2H)2.37(t,J＝7.52Hz,2H)5.14(s,2H)5.27(s,2H)7.31-7.44(m,
10H)。
1.91(m,2H)1.93-2.05(m,2H)2.37(t,J＝7.52Hz,2H)5.14(s,2H)5.27(s,2H)7.31-7.44(m,
10H)。
[1097] 中间体34:二十二烷-1,11,11-三甲酸1,11-二苄基酯11-(2,5-二氧代环戊基)酯[1098]
[1099] 采用中间体33(177mg,0.284mmol)作为原料，以与中间体15类似的方式合成了标题化合物，得到无色油(153mg,0.213mmol,75％):1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.86-0.93(m,3H)1.12-1.21(m,2H)1.21-1.37(m,30H)1.66(quin,J＝7.40Hz,2H)1.89-2.07(m,4H)2.37(t,J＝7.58Hz,2H)2.84(br.s.,4H)5.13(s,2H)5.25(s,2H)7.30-7.47(m,10H)。
[1100] 中间体35:
[1101]
[1102] 将中间体34(145mg,0.201mmol)在THF(1.5mL)和DCM(1.5mL)中的溶液加入装有氨基-PEG24-酸的小瓶中。加入DIPEA(88μL,0.504mmol)，反应物在振荡板上搅拌15小时。蒸发溶剂，残余物经超临界流体色谱法(Waters HILIC 20x150mm；15-25％MeOH/CO2)纯化，得到中间体35(151mg,0.086mmol,43％):LCMS方法D Rt＝1.30min,[M+2H]+2 876.4；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.86-0.93(m,3H)0.93-1.04(m,2H)1.19(br.s.,15H)1.23-1.37(m,15H)1.61-1.68(m,2H)1.78(td,J＝12.44,4.34Hz,2H)1.92-2.05(m,2H)2.37(t,J＝
7.58Hz,2H)2.62(t,J＝6.05Hz,2H)3.49(dd,J＝6.72,2.32Hz,2H)3.52-3.59(m,2H)3.59-
3.73(m,92H)3.80(t,J＝6.05Hz,2H)5.13(s,2H)5.18(s,2H)7.31-7.42(m,10H)8.09(t,J＝
5.26Hz,1H)。
7.58Hz,2H)2.62(t,J＝6.05Hz,2H)3.49(dd,J＝6.72,2.32Hz,2H)3.52-3.59(m,2H)3.59-
3.73(m,92H)3.80(t,J＝6.05Hz,2H)5.13(s,2H)5.18(s,2H)7.31-7.42(m,10H)8.09(t,J＝
5.26Hz,1H)。
[1103] 中间体36:
[1104]
[1105] 将在DCM(0.265mL)中的DCC(22mg,0.103mmol)加入中间体35(150mg,0.086mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺在DCM(1.5mL)中的溶液中。反应物搅拌1.5小时。加入另外的在THF(0.5mL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(10mg)和在DCM(0.265mL)中的DCC(22mg)，反应物搅拌过夜。蒸发溶剂，残余物经快速柱纯化(二氧化硅12,0-5％MeOH/DCM)，得到中间体36(159mg,定量)，为白色固体:LCMS方法B Rt＝1.55min,[M+H3O+H]+2 933.9。
[1106] 中间体37:
[1107]
[1108] 向中间体36(159mg,0.086mmol)在THF(5mL)中的溶液中加入10％披钯碳(4.6mg,4.3μmol)在THF(1mL)中的混悬液。反应物放置在氢气中，搅拌40min。再加入披钯碳(7mg,
6.5μmol)，在氢气下搅拌另外1小时。反应物穿过膜滤器，滤液蒸发。将残余物经HPLC纯化(Sunfire C18 30x50mm,45-70％ACN/水+0.1％TFA)，得到标题化合物(83mg,0.047mmol,
54％):LCMS方法B Rt＝1.03min,[M+2H]+2 835.2；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.84-
0.94(m,3H)1.17(br.s.,2H)1.21-1.39(m,30H)1.57-1.68(m,2H)1.69-1.80(m,2H)1.97-
2.10(m,2H)2.34(t,J＝7.21Hz,2H)2.86(s,4H)2.92(t,J＝6.48Hz,2H)3.51-3.73(m,96H)
3.87(t,J＝6.48Hz,2H)7.45(t,J＝4.46Hz,1H)
6.5μmol)，在氢气下搅拌另外1小时。反应物穿过膜滤器，滤液蒸发。将残余物经HPLC纯化(Sunfire C18 30x50mm,45-70％ACN/水+0.1％TFA)，得到标题化合物(83mg,0.047mmol,
54％):LCMS方法B Rt＝1.03min,[M+2H]+2 835.2；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.84-
0.94(m,3H)1.17(br.s.,2H)1.21-1.39(m,30H)1.57-1.68(m,2H)1.69-1.80(m,2H)1.97-
2.10(m,2H)2.34(t,J＝7.21Hz,2H)2.86(s,4H)2.92(t,J＝6.48Hz,2H)3.51-3.73(m,96H)
3.87(t,J＝6.48Hz,2H)7.45(t,J＝4.46Hz,1H)
[1109] 中间体38:11-溴十一碳-1-炔
[1110]
[1111] 在N2下于0℃向10-十一炔-1-醇(2.29mL,11.9mmol)和四溴化碳(4.34g,13.1mmol)在DCM(10mL)中的溶液中历经30分钟分批加入三苯膦(3.43g,13.1mmol)。加入完成后，使反应物温热至室温。1.5小时后，将反应物倒入搅拌的环己烷(75mL)中，收集沉淀。
将固体用环己烷洗涤，将合并的滤液蒸发。将残余物经快速柱纯化(二氧化硅80g,0-10％EtOAc/HEP)，得到标题化合物(1.75g,7.57mmol,64％):1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm
1.21-1.35(m,6H)1.35-1.48(m,4H)1.48-1.59(m,2H)1.80-1.91(m,2H)1.94(t,J＝2.63Hz,
1H)2.19(td,J＝7.09,2.69Hz,2H)3.41(t,J＝6.85Hz,2H)。
将固体用环己烷洗涤，将合并的滤液蒸发。将残余物经快速柱纯化(二氧化硅80g,0-10％EtOAc/HEP)，得到标题化合物(1.75g,7.57mmol,64％):1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm
1.21-1.35(m,6H)1.35-1.48(m,4H)1.48-1.59(m,2H)1.80-1.91(m,2H)1.94(t,J＝2.63Hz,
1H)2.19(td,J＝7.09,2.69Hz,2H)3.41(t,J＝6.85Hz,2H)。
[1112] 中间体39:2-(十一碳-10-炔-1-基)丙二酸二叔丁基酯
[1113]
[1114] 于0℃在N2下将丙二酸二叔丁基酯(800mg,3.70mmol)溶于DMF(9mL)中，加入NaH(148mg,3.70mmol)。反应物于0℃搅拌30分钟，缓慢滴加中间体38(770mg,3.33mmol)，产生黄色溶液。反应物于0℃搅拌2小时，然后温热至室温，搅拌16小时。将混合物加入EtOAc(75mL)中，用H2O(25mL)洗涤。将水层用EtOAc(75mL)萃取，合并的有机层经Na2SO4干燥、过滤和浓缩。混合物经快速柱纯化两次(12g二氧化硅短柱,0-20％EtOAc/庚烷)，将级分浓缩，得到162.1mg预期产品，为无色油(12％)。LCMS(Waters Acquity UPLC BEH C18, 1.7μm,2.1mm x 50mm,50℃,溶剂名称A:水+0.1％甲酸,溶剂名称B:乙腈+0.1％甲酸，历经2.20min 98％B):Rt＝1.37min,MS[M+H]实测值:366.0,计算值:366.535。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.29(s,10H)1.47(s,18H)1.52(dd,J＝14.78,7.20Hz,3H)1.48(d,J＝1.26Hz,
1H)1.75-1.83(m,2H)1.94(t,J＝2.65Hz,1H)2.18(td,J＝7.14,2.65Hz,2H)3.11(t,J＝
7.58Hz,1H)。
1H)1.75-1.83(m,2H)1.94(t,J＝2.65Hz,1H)2.18(td,J＝7.14,2.65Hz,2H)3.11(t,J＝
7.58Hz,1H)。
[1115] 中间体40:二十二碳-21-炔-1,11,11-三甲酸11,11-二-叔丁基酯1-乙基酯
[1116]
[1117] 于0℃将中间体39(162.1mg,0.442mmol)溶于DMF(2mL)中，加入NaH(21.23mg,0.531mmol)。反应物于0℃搅拌15分钟，缓慢滴加11-溴十一烷酸乙基酯(143mg,
0.486mmol)。反应物温热至室温，搅拌16小时。混合物用EtOAc(40mL)稀释，用H2O(20mL)洗涤一次。将水层用EtOAc(40mL)萃取一次，合并有机层，经Na2SO4干燥，过滤和浓缩，得到澄清黄色油状物。将样品溶于1mL DCM中，经快速柱纯化(12g二氧化硅柱,0-20％EtOAc/庚烷,
15min)。合并级分并浓缩，得到90.1mg预期产品(35％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.28(br.s.,24H)1.45(s,18H)1.48(s,3H)1.53(d,J＝7.58Hz,3H)1.51(s,1H)1.64(br.s.,1H)
1.61(d,J＝7.33Hz,1H)1.77(d,J＝16.93Hz,2H)1.74-1.80(m,2H)1.94(t,J＝2.65Hz,1H)
2.18(td,J＝7.07,2.53Hz,2H)2.29(t,J＝7.58Hz,2H)4.13(q,J＝7.24Hz,2H)。
0.486mmol)。反应物温热至室温，搅拌16小时。混合物用EtOAc(40mL)稀释，用H2O(20mL)洗涤一次。将水层用EtOAc(40mL)萃取一次，合并有机层，经Na2SO4干燥，过滤和浓缩，得到澄清黄色油状物。将样品溶于1mL DCM中，经快速柱纯化(12g二氧化硅柱,0-20％EtOAc/庚烷,
15min)。合并级分并浓缩，得到90.1mg预期产品(35％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.28(br.s.,24H)1.45(s,18H)1.48(s,3H)1.53(d,J＝7.58Hz,3H)1.51(s,1H)1.64(br.s.,1H)
1.61(d,J＝7.33Hz,1H)1.77(d,J＝16.93Hz,2H)1.74-1.80(m,2H)1.94(t,J＝2.65Hz,1H)
2.18(td,J＝7.07,2.53Hz,2H)2.29(t,J＝7.58Hz,2H)4.13(q,J＝7.24Hz,2H)。
[1118] 中间体41:12,12-双(叔丁氧羰基)二十三碳-22-炔酸
[1119]
[1120] 于30℃在N2下向中间体40(21.7mg,0.037mmol)在tBuOH(1mL)中的溶液中加入KOtBu(114mg,1.012mmol)在tBuOH(2mL)中的溶液。混合物于室温搅拌，通过TLC(1:1EtOAc/己烷,KMnO4,回流)监测。起始原料在3小时消耗掉，将反应混合物用1M HCl(20mL)淬灭，用EtOAc(25mL)萃取两次。合并有机层，经Na2SO4干燥、过滤和浓缩至澄清无色油状物(18mg,87％)。将材料未经进一步纯化用于下一步骤。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm1.27(br.s.,
22H)1.44(br.s.,18H)1.48(s,3H)1.52(s,3H)1.62(br.s.,2H)1.77(br.s.,4H)1.94(br.s.,1H)2.18(s,2H)2.35(s,2H)。
22H)1.44(br.s.,18H)1.48(s,3H)1.52(s,3H)1.62(br.s.,2H)1.77(br.s.,4H)1.94(br.s.,1H)2.18(s,2H)2.35(s,2H)。
[1121] 中间体42:二十二碳-21-炔-1,11,11-三甲酸
[1122]
[1123] 将TFA(2mL)加入中间体41(12mg,0.022mmol)中，反应物于室温搅拌1小时。混合物用DCM(10mL)稀释，浓缩两次，得到棕色油状物。将物质溶于EtOAc(10mL)中，用H2O(20mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥、过滤和浓缩至棕色油状物。粗物质溶于1mL MeOH中，经MS-触发的HPLC纯化(Sunfire 30x50mm 5um柱ACN/H2O w/0.1％TFA 75ml/min,1.5ml进样体积,45-70％ACN历经3.5min):Rt＝3.42min；MS[M+H+Na]实测值:461.00,计算值:461.597。汇集级分并冷冻干燥，得到5.3mg标题化合物，56％产率。
[1124] 中间体43:2-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)-2-(十一碳-10-炔-1-基)十三烷二元酸
[1125]
[1126] 向中间体42(5.3mg,0.012mmol)在THF(0.5mL)中的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.53mg,0.013mmol)。加入DCC(2.493mg,0.012mmol)在THF(0.5mL)中的溶液，混合物于室温在N2下搅拌4小时。通过LCMS观察起始物质的完全转化。将混合物浓缩，未经进一步纯化用于下一步骤。LCMS(Sunfire C18 3.5μm 3.0x30mm,40℃,酸性洗脱剂A:水+0.05％三氟乙酸,碱性洗脱剂A:水+5mM氢氧化铵,洗脱剂B:ACN,5-95％历经2min):Rt＝1.72min；MS[M+H+Na]观察值:558.0,计算值:558.67.
[1127] 中间体44:
[1128]
[1129] 向中间体43(3.2mg,5.97μmol)在DCM(0.5mL)中的溶液中加入叠氮基-dPEG23-胺(Quanta Biodesign,7.88mg,7.17μmol)在DCM(0.5mL)和DIPEA(2.09μl,0.012mmol)中的溶液，将混合物于室温搅拌16小时，此时通过LCMS观察起始物质的转化。将反应混合物浓缩，溶于1mL MeOH中，经MS-触发的HPLC纯化(Sunfire 30x50mm 5um柱ACN/H2O w/0.1％TFA 75ml/min,1.5ml进样体积,55-80％ACN 5min梯度,Rt＝1.92min)，汇集级分并冷冻干燥，得到1.7mg标题化合物，19％产率。LCMS(Acquity BEH 1.7μm 2.1x50mm-50℃,溶剂名称A:水+
0.1％甲酸，溶剂名称B:乙腈+0.1％甲酸，98％B历经2.20min):Rt＝1.89min；MS[M+H/2]实测值:760.0,计算值:759.5.
0.1％甲酸，溶剂名称B:乙腈+0.1％甲酸，98％B历经2.20min):Rt＝1.89min；MS[M+H/2]实测值:760.0,计算值:759.5.
[1130] 中间体45:二十二碳-21-烯-1,11,11-三甲酸
[1131]
[1132] 按照用于中间体39-42的方法，用11-溴-癸-1-烯代替11-溴-癸-1-炔，制备中间体45。
[1133] 中间体46:2-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)-2-(十一碳-10-烯-1-基)十三烷二元酸
[1134]
[1135] 将在DCM(2mL)中的DCC(187mg,0.908mmol)加入N-羟基琥珀酰亚胺(99mg,0.862mmol)和二十二碳-21-烯-1,11,11-三甲酸(中间体45:400mg,0.908mmol)在DCM(7mL)和THF(0.7mL)中的溶液中。反应物搅拌过夜，然后蒸发溶剂。将残余物经HPLC纯化(Sunfire C18 30x50mm；55-80％ACN/水+0.1％TFA)，得到标题化合物(155mg,0.288mmol,32％):LCMS方法C Rt＝1.51min,M+H 538.3；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 1.16-1.46(m,28H)1.60-
1.87(m,3H)1.91-2.17(m,5H)2.38(t,J＝7.03Hz,2H)2.86(br.s.,4H)3.68(dd,J＝11.25,
7.34Hz,1H)3.78(dd,J＝11.31,5.20Hz,1H)3.99-4.10(m,1H)。
1.87(m,3H)1.91-2.17(m,5H)2.38(t,J＝7.03Hz,2H)2.86(br.s.,4H)3.68(dd,J＝11.25,
7.34Hz,1H)3.78(dd,J＝11.31,5.20Hz,1H)3.99-4.10(m,1H)。
[1136] 中间体47和47A:
[1137]
[1138] 将叠氮基-dPEG23-胺(Quanta Biodesign:164mg,0.149mmol)和中间体46(80mg,0.149mmol)溶于THF(2.5mL)中。加入DIPEA(39μL,0.233mmol)，反应物搅拌过夜。蒸发溶剂，残余物经HPLC纯化(Sunfire C18 30x50mm；45-70％ACN/水+0.1％TFA)，得到化合物47(97mg,0.061mmol,41％)和47A(32mg,0.021mmol,14％):LCMS方法C Rt＝1.35min,[M+2H]+2
761.9；1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δppm 1.05-1.18(m,3H)1.19-1.32(m,20H)1.36(t,J＝
7.15Hz,1H)1.48-1.59(m,2H)1.65-1.75(m,2H)2.01-2.06(m,2H)2.25(t,J＝7.46Hz,2H)
3.33-3.39(m,2H)3.39-3.44(m,2H)3.50-3.67(m,98H)4.84-4.95(m,1H)4.95-5.06(m,1H)
5.83(ddt,J＝17.07,10.29,6.68,6.68Hz,1H)7.31(t,J＝5.44Hz,1H)；LCMS方法C Rt＝
1.50min,[M+2H]+2 739.9；1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δppm 1.16-1.42(m,30H)1.42-1.63(m,
5H)2.00-2.07(m,2H)2.22-2.28(m,2H)2.40-2.52(m,2H)3.25-3.33(m,2H)3.33-3.42(m,
2H)3.42-3.50(m,2H)3.50-3.68(m,88H)4.86-5.06(m,2H)5.83(ddt,J＝17.04,10.26,
6.71,6.71Hz,1H)6.40-6.74(m,1H)。
761.9；1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δppm 1.05-1.18(m,3H)1.19-1.32(m,20H)1.36(t,J＝
7.15Hz,1H)1.48-1.59(m,2H)1.65-1.75(m,2H)2.01-2.06(m,2H)2.25(t,J＝7.46Hz,2H)
3.33-3.39(m,2H)3.39-3.44(m,2H)3.50-3.67(m,98H)4.84-4.95(m,1H)4.95-5.06(m,1H)
5.83(ddt,J＝17.07,10.29,6.68,6.68Hz,1H)7.31(t,J＝5.44Hz,1H)；LCMS方法C Rt＝
1.50min,[M+2H]+2 739.9；1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δppm 1.16-1.42(m,30H)1.42-1.63(m,
5H)2.00-2.07(m,2H)2.22-2.28(m,2H)2.40-2.52(m,2H)3.25-3.33(m,2H)3.33-3.42(m,
2H)3.42-3.50(m,2H)3.50-3.68(m,88H)4.86-5.06(m,2H)5.83(ddt,J＝17.04,10.26,
6.71,6.71Hz,1H)6.40-6.74(m,1H)。
[1139] 中间体48:2-十一烷基丙二酸
[1140]
[1141] 采用中间体22(290mg,0.661mmol)，以与中间体19类似的方式合成了标题化合物(185mg,定量):LCMS方法B LCMS Rt＝0.82min,M-H 257.3
[1142] 中间体49:2-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)十三烷酸
[1143]
[1144] 将DCC(122mg,0.592mmol)加入中间体48(170mg,0.658mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(68mg,0.592mmol)在DCM(6mL)和THF(0.5mL)中的溶液中。将反应物搅拌16小时，然后再加入在DCM(0.5mL)中的DCC(30mg,0.145mmol)。反应物搅拌另外2天。蒸发溶剂，残余物经HPLC纯化(Sunfire C1830x50mm,45-70％ACN/水+0.1％TFA)，得到标题化合物，为白色粉末1
(46mg,0.129mg,20％):LCMS方法B Rt＝0.94min,M+H 356.3；H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm
0.89(t,J＝7.00Hz,3H)1.20-1.40(m,16H)1.43-1.55(m,2H)1.99-2.14(m,2H)2.86(s,4H)
3.71(t,J＝7.46Hz,1H)。
(46mg,0.129mg,20％):LCMS方法B Rt＝0.94min,M+H 356.3；H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm
0.89(t,J＝7.00Hz,3H)1.20-1.40(m,16H)1.43-1.55(m,2H)1.99-2.14(m,2H)2.86(s,4H)
3.71(t,J＝7.46Hz,1H)。
[1145] 中间体50和50A:
[1146]
[1147] 以与50和50A类似的方式，由中间体49(30mg,0.084mmol)合成了标题化合物，得到中间体50(18mg,0.013mmol,16％)和中间体50A(5mg,4μmol,5％):LCMS方法B Rt＝0.85min,M+H 1340.3；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.82-0.98(m,3H)1.20-1.36(m,16H)
1.36-1.51(m,2H)1.83-2.02(m,1H)2.11-2.27(m,1H)2.33(dd,J＝11.80,4.22Hz,1H)3.41(t,J＝5.14Hz,3H)3.49(d,J＝5.01Hz,1H)3.56-3.79(m,92H)；LCMS方法B Rt＝0.96min,M+H 1296.3。
1.36-1.51(m,2H)1.83-2.02(m,1H)2.11-2.27(m,1H)2.33(dd,J＝11.80,4.22Hz,1H)3.41(t,J＝5.14Hz,3H)3.49(d,J＝5.01Hz,1H)3.56-3.79(m,92H)；LCMS方法B Rt＝0.96min,M+H 1296.3。
[1148] 中间体51-57：GDF15蛋白质的突变体
[1149] 人GDF-15蛋白质在E.coli细胞中的表达
[1150] 将E.coli种属BL21(DE3)Gold(Stratagene)和Rosetta(DE3)pLysS细胞(Novagen)分别用构建体51至56和构建体MAHA-(200-308)-hGDF15(克隆入pET26b载体中)进行转化。使转化细胞在抗生素选择下首先在3ml和然后再50mL Luria Broth(细菌用胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 5/L,葡萄糖6g/L)中生长直至达到OD600为1.5。将预培养物用于接种两个装有Terrific肉汤培养基(NH4SO4 1.2g/L,H2PO4 0.041g/L,K2HPO4 0.052g/L,细菌用胰蛋白胨12g/L,酵母提取物24g/L)的1-L发酵罐。当pH升高至7.1以上时，通过自动添加1mM异丙基-β-D-半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG)引起培养。其它发酵参数为：温度＝37℃；pH
7.0+/-0.2，通过添加2N NaOH/H2SO4来调节；pO2>30％，具有搅拌子速度、气流流速和氧气添加的级联。引起后5小时，将培养物冷却至10℃，通过离心收集细胞。
7.0+/-0.2，通过添加2N NaOH/H2SO4来调节；pO2>30％，具有搅拌子速度、气流流速和氧气添加的级联。引起后5小时，将培养物冷却至10℃，通过离心收集细胞。
[1151] GDF15变体的纯化和重折叠
[1152] a)包涵体
[1153] 将表达感兴趣的蛋白质的重组细胞沉淀重新混悬于(5％w/v)50mM NaH2PO4/150mM NaCl/5mM苄脒.HCl/5mM DTT,pH8.0,4℃中，匀化，通过两次穿过弗细胞压碎器(800和80巴)进行溶解。通过于4℃以12‘000rpm离心60分钟分离包涵体(IBs)。
[1154] b)粗的展开蛋白质的纯化
[1155] 将IBs溶解在(5％w/v)6M胍/100mM NaH2PO4/10mM Tris/20mMβ-巯基乙醇pH 8.0中，于室温搅拌2小时。通过于12‘000rpm离心除去碎片。将溶解的IBs在Ni-NTA-Superflow(不具有His标签的构建体由于高组氨酸含量也与该树脂结合)上进一步纯化。用6M胍/100mM NaH2PO4/10mM Tris/5mMβ-巯基乙醇pH 8.0进行基线洗涤后，用调节至pH4.5的相同缓冲液洗脱出所结合的物质。将洗脱液调节至pH 8.0，加入100mM DTT，将溶液于4℃搅拌过夜。然后通过添加三氟乙酸(TFA,在水中的10％储备液)调节pH至2，将溶液用0.1％TFA水溶液进一步稀释1:1。将粗的蛋白质溶液通过RP-HPLC(Poros)、采用50min 0-50％乙腈的梯度进行进一步纯化。汇集含GDF-15的级分并冷冻干燥。
[1156] c)蛋白质折叠
[1157] 方法1：将冷冻干燥的物质以2mg/ml溶于100mM乙酸中，在折叠缓冲液(100mM CHES/1M NaCl/30mM CHAPS/5mM GSH/0.5mM GSSG/20％DMSO,pH 9.5,4℃)中稀释15-20倍，将溶液于4℃温和搅拌3天。3天后，加入3体积的100mM乙酸，将溶液经超滤浓缩(5kDa截留)至约100-200mL，用100mM乙酸稀释10倍，再次浓缩。将重折叠的物质经制备型RP-HPLC在于50℃运行的Vydac C4柱(缓冲液A:0.1％TFA水溶液；缓冲液B:0.05％TFA在乙腈中的溶液)上进一步纯化。上样后，将柱子用15％缓冲液B洗涤，用15％B至65％B 50min的梯度洗脱。将所收集的含有感兴趣蛋白质的级分用等体积的缓冲液A稀释，冷冻干燥。对于两种蛋白质而言，重折叠产率为约25％。
[1158] 方法2：按照方法1中的方案，采用折叠缓冲液:100mM CHES,pH 9.4,0.9M精氨酸,0.5M NaCl,1mM EDTA,2.5mM GSH,1mM GSSG(终浓度)。
[1159] 按照上述操作制备了如下GDF15突变体：
[1160] 中间体51:M-(His)6-hGDF15
[1161] MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGA CPSQF RAANM HAQIK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI(SEQ ID NO:1)
[1162] LCMS:计算质量:26462实测质量:26464
[1163] 中间体52:M-(His)6-M-hGDF15
[1164] MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTUPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHGI(SEQ ID NO.2)
[1165] LCMS:计算质量:26724实测质量:26725
[1166] 中间体53:His-dGDF15:
[1167] MHHHHHHAHARDGCPLGEGRCCRLQSLRASLQDLGWANWVVAPRELDVRMCVGACPSQFRSANTHAQMQARLHGLNPDAAPAPCCVPASYEPVVLMHQDSDGRVSLTPFDDLVAKDCHCV(SEQ ID NO:3)
[1168] LCMS:计算质量(二聚体):26368实测质量:26363
[1169] 中间体54:MH-(199-308)-hGDF15
[1170] MHNGDHCPLGPGRCCRLHTURASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:4)
[1171] LCMS:计算质量:24636实测质量:24638
[1172] 中间体55:AH-(199-308)-hGDF15
[1173] AHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:5)
[1174] 步骤1:构建体M-His6-TEV(ENLYFQ/A)-H-hsGDF15aa199-308的制备
[1175] 按照上述操作(步骤a、b和c)制备了构建体M-His6-TEV(ENLYFQ/A)-H-hsGDF15aa199-308。
[1176] 步骤2:来自步骤1的蛋白质的TEV切割
[1177] 将冷冻干燥的蛋白质溶解于水中至1.75mg/ml的终浓度。蛋白质通过在6M Guan/50mM Tris,pH8,0+50mM DTT中1:1稀释而再次展开，于室温搅拌1小时。将物质经制备型RP-HPLC在Vydac C4柱上再次纯化，冷冻干燥。将26mg冷冻干燥物溶解于26ml 50mM Tris/3M UREA,pH 7,5+3000Units AcTEV蛋白酶(Invitrogen,12575-023)中，温育4天。然后通过添加三氟乙酸(TFA,在水中的10％储备液)调节pH至2，将溶液用0.1％TFA水溶液进一步稀释至150mL。通过0.22um膜过滤后，将物质再次经制备型RP-HPLC在VydacC4柱上纯化，成功地分离出切割的蛋白质。手工收集级分；分离含目标蛋白质的级分并冷冻干燥。然后，切割的GDF15蛋白质重折叠和重折叠的蛋白质进行纯化，如上文所述。
[1178] LCMS:计算质量(二聚体):24516实测质量:24518
[1179] 按照上述操作可以制备如下GDF15突变体：
[1180] 中间体56:MHA-(200-308)-hGDF15
[1181] MHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:6)
[1182] LCMS:计算质量(二聚体):24752
[1183] 按照上述操作可以制备如下GDF15突变体：
[1184] 中间体57:AHA-(200-308)-hGDF15
[1185]AHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:7)
[1186] LCMS:计算质量(二聚体):24430:实测质量(二聚体):24432
[1187] 中间体58:His-hGDF15BCN缀合物
[1188]
[1189] His-hGDF15
[1190] Seq:MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
[1191] 将His-hGDF15的储备液(中间体52:0.6mL,4.8mg/mL)用30mM NaOAcpH4.5缓冲液(5.2mL)稀释至0.5mg/mL。缓慢加入碳酸(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(NHS-BCN)在DMSO(251μL)中的10mg/mL储备液，反应物在振摇盘上于24℃放置21小时。将反应物用30mM NaOAc pH4.5缓冲液稀释至30mL，采用10kDa MWCO超滤短柱(重复4x)浓缩至2mL，得到2.5mL的浓缩物。根据A280(ε＝29090M-1cm-1，26730g/mol)，浓缩物为0.93mg/mL(2.33mg,80％):LCMS QT2_15-60kDa_15min_polar(方法E)。将所得溶液通过MALDI进行分析，主要缀合物指示为+1和+2(单体和二聚体的N-末端标记)[1192]
标记度 计算值 实测值 ％TIC(MS+)强度
GDF15 26726 26726 26
GDF15+1BCN 26903 26904 43
GDF15+2BCN 27080 27080 23
GDF15+3BCN 27257 27256 9
标记度 计算值 实测值 ％TIC(MS+)强度
GDF15 26726 26726 26
GDF15+1BCN 26903 26904 43
GDF15+2BCN 27080 27080 23
GDF15+3BCN 27257 27256 9
[1193] His-hGDF15+1BCN(双环[6.1.0]壬-4-炔基)相应于在GDF15同二聚体的一个分子上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1194] His-hGDF15+2BCN相应于GDF15同二聚体的两个单体单元上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1195] His-hGDF15+3BCN相应于GDF15同二聚体的某个其它位置处的非选择性反应。
[1196] 中间体59:His-hGDF15BCN缀合物
[1197]
[1198] His-hGDF15 Seq:
[1199] MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL GWADW VLSPR EVQVT MCIGA CPSQF RAANM HAQIKTSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT DTGVS LQTYD DLLAK DCHCI[1200] 将His-hGDF15的储备液(中间体51:7.04mL,1.42mg/mL)用30mM NaOAc pH4.5缓冲液(12.95mL)稀释至0.5mg/mL。缓慢加入碳酸(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(NHS-BCN)在DMSO(0.88mL)中的10mg/mL储备液，反应物在振摇盘上于24℃放置24小时。加入另外部分的NHS-BCN储备液(176μL)，反应物于24℃维持24小时。将反应物用30mM NaOAc pH4.5缓冲液稀释至60mL，采用10kDa MWCO超滤短柱(重复
4x)浓缩至4mL，得到4.1mL浓缩物。根据A280(ε＝29090M-1cm-1,26700g/mol)，浓缩物为
2.19mg/mL(8.98mg,89％):LCMSQT2_15-60kDa_15min_polar(方法E)
4x)浓缩至4mL，得到4.1mL浓缩物。根据A280(ε＝29090M-1cm-1,26700g/mol)，浓缩物为
2.19mg/mL(8.98mg,89％):LCMSQT2_15-60kDa_15min_polar(方法E)
[1201]标记度 计算值 实测值 ％TIC(MS+)强度
GDF15 26468 26464 33
GDF15+1BCN 26645 26640 34
GDF15+2BCN 26822 26817 21
GDF15+3BCN 26999 26993 3
GDF15 26468 26464 33
GDF15+1BCN 26645 26640 34
GDF15+2BCN 26822 26817 21
GDF15+3BCN 26999 26993 3
[1202] His-hGDF15+1BCN(双环[6.1.0]壬-4-炔基)相应于在GDF15同二聚体的一个分子上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1203] His-hGDF15+2BCN相应于GDF15同二聚体的两个单体单元上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1204] His-hGDF15+3BCN相应于GDF15同二聚体的某个其它位置处的非选择性反应。
[1205] 中间体60:His-dog-GDF15-BCN
[1206]
[1207] 将100uL His-dGDF15(0.68mg/ml)、100uL pH4.5缓冲液、4uL的10mg/ml BCN-NHS溶液合并，于室温温育2天。将所得混合物用Amicon 10k洗涤4次，得到200uL溶液，将其用于下一步骤。产物作为粗品用于进一步转化为缀合物。
[1208] 本发明的实施例：
[1209] His-hGDF15+脂肪酸-PEG-N3点击的通用方法。将BCN标记的GDF15在30mM NaOAc pH4.5缓冲液中稀释至0.5mg/mL，同时制备FA-PEG-N3(脂肪酸-PEG23-叠氮化物)在水中的10mg/mL溶液。向GDF15溶液中加入10eq FA-PEG-N3，将反应物在振摇盘上于24℃放置过夜。
通过LCMS(QTOF方法15-60kDa_15min_polar)监测反应进程，加入另外的FA-PEG-N3，需要的话至50eq，直至没有观察到未反应的BCN标记的GDF15。然后将反应物用30mM NaOAc pH4缓冲液稀释5-10x，采用10kDa MWCO超滤短柱用新鲜缓冲液进行缓冲液交换(4个浓缩、然后稀释的循环)。将样品浓缩至～1mg/Ml(如通过A280测定)，将回收定量至34％。最终缀合物通过LCMS(QTOF方法15-60kDa_15min_polar)或Maldi进行分析。
通过LCMS(QTOF方法15-60kDa_15min_polar)监测反应进程，加入另外的FA-PEG-N3，需要的话至50eq，直至没有观察到未反应的BCN标记的GDF15。然后将反应物用30mM NaOAc pH4缓冲液稀释5-10x，采用10kDa MWCO超滤短柱用新鲜缓冲液进行缓冲液交换(4个浓缩、然后稀释的循环)。将样品浓缩至～1mg/Ml(如通过A280测定)，将回收定量至34％。最终缀合物通过LCMS(QTOF方法15-60kDa_15min_polar)或Maldi进行分析。
[1210] 实施例1:缀合至中间体21的His-hGDF15BCN(I-59):
[1211]
[1212]标记度 计算值 实测值 ％AUC@280nm
His-hGDF15 26468 26466 18
His-hGDF15+1FA 28198 28192 36
His-hGDF15+2FA 29928 29926 35
His-hGDF15+3FA 31658 31654 11
His-hGDF15 26468 26466 18
His-hGDF15+1FA 28198 28192 36
His-hGDF15+2FA 29928 29926 35
His-hGDF15+3FA 31658 31654 11
[1213] His-hGDF15+1FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的一个分子(一个单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1214] His-hGDF15+2FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的两个单体单元上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1215] His-hGDF15+3FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的某个其它位置处的非选择性反应。
[1216] 实施例2:缀合至中间体44的His-hGDF15BCN(I-59):
[1217]
[1218]标记度 计算值 实测值 ％AUC@280nm
His-hGDF15 26464 26464 38
His-hGDF15+1FA 28162 28162 33
His-hGDF15+2FA 29860 29860 21
His-hGDF15+3FA 31558 31558 9
His-hGDF15 26464 26464 38
His-hGDF15+1FA 28162 28162 33
His-hGDF15+2FA 29860 29860 21
His-hGDF15+3FA 31558 31558 9
[1219] His-hGDF15+1FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的一个分子(一个单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1220] His-hGDF15+2FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的两个单体单元上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1221] His-hGDF15+3FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的某个其它位置处的非选择性反应。
[1222] 实施例3:缀合至中间体29A的His-hGDF15BCN(I-59):
[1223]
[1224]标记度 计算值 实测值 ％AUC@280nm
His-hGDF15 26464 26466 50
His-hGDF15+1FA 28124 28120 28
His-hGDF15+2FA 29780 29776 16
His-hGDF15+3FA 31436 31432 7
His-hGDF15 26464 26466 50
His-hGDF15+1FA 28124 28120 28
His-hGDF15+2FA 29780 29776 16
His-hGDF15+3FA 31436 31432 7
[1225] His-hGDF15+1FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的一个分子(一个单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1226] His-hGDF15+2FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的两个单体单元上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1227] His-hGDF15+3FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的某个其它位置处的非选择性反应。
[1228] 实施例4:缀合至中间体24的His-hGDF15BCN(中间体58):
[1229]
[1230]标记度 计算值 实测值 ％AUC@280nm
His-hGDF15 26726 26728 27
His-hGDF15+1FA 28396 28398 42
His-hGDF15+2FA 30066 30068 24
His-hGDF15+3FA 31736 31738 7
His-hGDF15 26726 26728 27
His-hGDF15+1FA 28396 28398 42
His-hGDF15+2FA 30066 30068 24
His-hGDF15+3FA 31736 31738 7
[1231] His-hGDF15+1FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的一个分子(一个单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1232] His-hGDF15+2FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的两个单体单元上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1233] His-hGDF15+3FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的某个其它位置处的非选择性反应。
[1234] 实施例5:缀合至中间体29的His-hGDF15BCN(I-58):
[1235]
[1236]标记度 计算值 实测值 ％AUC@280nm
His-hGDF15 26726 26728 30
His-hGDF15+1FA 28425 28426 36
His-hGDF15+2FA 30125 30126 23
His-hGDF15+3FA 31825 31740 12
His-hGDF15 26726 26728 30
His-hGDF15+1FA 28425 28426 36
His-hGDF15+2FA 30125 30126 23
His-hGDF15+3FA 31825 31740 12
[1237] His-hGDF15+1FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的一个分子上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1238] His-hGDF15+2FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的两个单体单元上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1239] His-hGDF15+3FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的某个其它位置处的非选择性反应。
[1240] 实施例6:缀合至中间体55的His-hGDF15BCN(I-58):
[1241]
[1242]
[1243]
[1244] His-hGDF15+1FA(脂肪酸)相应于在GDF15同二聚体的一个分子上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1245] His-hGDF15+2FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的两个单体单元上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1246] His-hGDF15+3FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的某个其它位置处的非选择性反应。
[1247] 实施例7:缀合至中间体6A的His-hGDF15BCN(I-58):
[1248]
[1249]标记度 计算值 实测值 ％AUC@280nm
His-hGDF15 26726 26728 28
His-hGDF15+1FA 28382 28382 42
His-hGDF15+2FA 30038 30040 29
His-hGDF15+3FA 31916 n/a n/a
His-hGDF15 26726 26728 28
His-hGDF15+1FA 28382 28382 42
His-hGDF15+2FA 30038 30040 29
His-hGDF15+3FA 31916 n/a n/a
[1250] His-hGDF15+1FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的一个分子(一个单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1251] His-hGDF15+2FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的两个单体单元上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1252] His-hGDF15+3FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的某个其它位置处的非选择性反应。
[1253] 实施例9:缀合至中间体30的His-hGDF15BCN(I-58):
[1254]
[1255]标记度 计算值 实测值 ％AUC@280nm
His-hGDF15 26726 26728 21
His-hGDF15+1FA 28456 28456 47
His-hGDF15+2FA 30186 30188 32
His-hGDF15+3FA 31916 n/a n/a
His-hGDF15 26726 26728 21
His-hGDF15+1FA 28456 28456 47
His-hGDF15+2FA 30186 30188 32
His-hGDF15+3FA 31916 n/a n/a
[1256] His-hGDF15+1FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的一个分子(单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1257] His-hGDF15+2FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的两个分子(单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1258] His-hGDF15+3FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的某个其它位置处的非选择性反应。
[1259] 实施例10:缀合至中间体12的His-hGDF15BCN(I-58):
[1260]
[1261]标记度 计算值 实测值 ％AUC@280nm
His-hGDF15 26726 26729 17
His-hGDF15+1FA 28442 28445 37
His-hGDF15+2FA 30158 30158 32
His-hGDF15+3FA 31874 31877 13
His-hGDF15 26726 26729 17
His-hGDF15+1FA 28442 28445 37
His-hGDF15+2FA 30158 30158 32
His-hGDF15+3FA 31874 31877 13
[1262] His-hGDF15+1FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的一个分子(一个单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1263] His-hGDF15+2FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的两个分子(单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1264] His-hGDF15+3FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的某个其它位置处的非选择性反应。
[1265] 实施例13:缀合至中间体6的His-hGDF15BCN(I-59):
[1266]
[1267]标记度 计算值 实测值 ％AUC@280nm
His-hGDF15 26468 26464 28
His-hGDF15+1FA 28168 28164 42
His-hGDF15+2FA 29868 29864 21
His-hGDF15+3FA 31568 31564 10
His-hGDF15 26468 26464 28
His-hGDF15+1FA 28168 28164 42
His-hGDF15+2FA 29868 29864 21
His-hGDF15+3FA 31568 31564 10
[1268] His-hGDF15+1FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的一个分子(一个单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1269] His-hGDF15+2FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的两个分子(两个单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1270] His-hGDF15+3FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的某个其它位置处的非选择性反应。
[1271] 实施例14:缀合至中间体17的His-hGDF15BCN(I-58):
[1272]
[1273]负载度 计算值 实测值 ％AUC@280nm
His-hGDF15 26726 26728 18
His-hGDF15+1FA 28413 28414 34
His-hGDF15+2FA 30100 30054 35
His-hGDF15+3FA 31787 31726 13
His-hGDF15 26726 26728 18
His-hGDF15+1FA 28413 28414 34
His-hGDF15+2FA 30100 30054 35
His-hGDF15+3FA 31787 31726 13
[1274] His-hGDF15+1FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的一个分子(一个单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1275] His-hGDF15+2FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的两个分子(两个单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1276] His-hGDF15+3FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的某个其它位置处的非选择性反应。
[1277] 实施例15:
[1278] 步骤1:
[1279]
[1280] 向2,2,13,13-四甲基十四烷二元酸(Aldrich CPR,订单号PH002322)(100mg,0.318mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(40.3mg,0.35mmol)在THF(5mL)中的溶液中加入DCC(65.6mg,0.318mmol)在THF(5mL)中的溶液，将混合物于室温搅拌过夜。通过LC-MS分析观察向预期产品的部分转化。将混合物过滤，滤液浓缩。将残余物重新溶于DCM(40mL)中，用水洗涤，经Na2SO4干燥，经二氧化硅色谱法、用庚烷/EtOAc/DCC(10:1:1)洗脱进行纯化，得到混合物。将混合物进一步经MS触发的酸HPLC纯化[(55-80％ACN3.5min梯度):rt＝2.48min,质量计算值:314.46质量实测值:314.00]，得到干净的产物(50mg,38.2％产率)并回收原料。
[1281] 步骤2:
[1282]
[1283] 向NHS-2,2,13,13-四甲基十四烷二元酸(10mg,0.024mmol)在DCM(3mL)中的溶液中加入叠氮基-dPEG3-胺(10mg,0.049mmol)和DIPEA(9uL,0.049mmol)，将混合物于室温搅拌1小时。将混合物浓缩，重新溶于MeOH(3mL)中，经MS-触发的HPLC纯化(55-80％ACN 3.5min梯度rt＝2.35,质量预测值:514.70质量实测值:514.40)，得到7mg干净的产物，58％产率。
[1284] 步骤3:
[1285]
[1286] 向100μL BCN-dGDF15溶液(I-60:0.68mg/mL,在pH4.5缓冲液中)中加入pH4.5缓冲液(100μL)和叠氮化物(6μL在DMSO中,10mg/mL)，将混合物于室温孵育过夜。将混合物用Amicon 10k洗涤4次。所得溶液通过MALDI进行分析，主要缀合物指示为+1和+2。Maldi:计算质量:26546实测质量:26483；计算质量:27060实测质量:27128；计算质量:27574实测质量:27789。
[1287] 实施例16:缀合至中间体44的His-hGDF15BCN(I-58):
[1288]
[1289]标记度 计算值 实测值 ％AUC@280nm
His-hGDF15 26726 26728 45
His-hGDF15-BCN 26902 26904 21
His-hGDF15+1FA 28422 28360 25
His-hGDF15+2FA 29868 30012 9
His-hGDF15 26726 26728 45
His-hGDF15-BCN 26902 26904 21
His-hGDF15+1FA 28422 28360 25
His-hGDF15+2FA 29868 30012 9
[1290] His-hGDF15+1FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的一个分子(一个单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1291] His-hGDF15+2FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的两个分子(两个单体单元)上的N-末端氨基官能团处的反应。
[1292] 实施例17:缀合至中间体52的His-hGDF15-BCN
[1293]
[1294] 向3mL环辛炔GDF15(I-58:0.46mg/mL,0.051umol)在7mL pH4乙酸钠缓冲液中的溶液中加入脂肪酸peg叠氮化物(15uL,在35mg/ml DMSO中,0.36umol)，将混合物于室温温育过夜。通过MALDI分析观察到完全转化。将产物通过Amicon过滤10kD洗涤三次进行纯化，得到4.3mL 0.29mg/ml预期产品，90％产率。Maldi:环辛炔sm～5％预期质量:26902质量实测值:26997；+1脂肪酸～40％预期质量:28421实测质量:28525；+2脂肪酸～50％预期质量:29940实测质量:30191+3脂肪酸5％预期质量:31459实测质量:31874。
[1295] 实施例18:缀合至中间体37的MH-(199-308)GDF15(I-54)
[1296]
[1297] 将MH-(199-308)-GDF15(中间体54:0.393mL,0.028μmol,1.78mg/ml)加入1.5mL 30mM乙酸钠缓冲液中，NHS脂肪酸(474ug,0.284umol,10mg/ml)加入溶液中。5小时后，根据MALDI反应完全。将产物采用amicon超滤10kD洗涤5次进行纯化，得到575ug缀合物，73％产率。MALDI:sm(18％),预期质量:24638实测质量:24735；+1脂肪酸(38％)预期质量:26192实测质量:26268；+2脂肪酸(40％)预期质量:27746实测质量:27798；+3脂肪酸(4％)预期质量:29300实测质量:29333。
[1298] 实施例19A:缀合至中间体37的His-hGDF15(I-59)
[1299]
[1300] 将His-GDF15(0.493mL,0.026μmol,1.42mg/ml)加入1.5mL 30mM乙酸钠pH＝4缓冲液中，nhs脂肪酸(0.221mg,0.132umol,10mg/mL)加入溶液中。反应过夜未完全，所以再加入2.5当量的脂肪酸NHS(0.110mg,0.066umol,10mg/mL)，5小时后，Maldi显示+2缀合物为主要产物。产物采用amicon超滤10kD洗涤5次进行纯化，得到565ug缀合物，76％产率。MALDI:sm(18％),预期质量:26468实测质量:26553；+1脂肪酸(38％)预期质量:28022实测质量:
28099；+2脂肪酸(40％)预期质量:29576实测质量:29649；+3脂肪酸(4％)预期质量:31130实测质量:31201。
28099；+2脂肪酸(40％)预期质量:29576实测质量:29649；+3脂肪酸(4％)预期质量:31130实测质量:31201。
[1301] 实施例19B:与中间体37缀合的AHA-hGDF15
[1302]
[1303] 制备中间体37在分子生物学级水中的10mg/ml溶液。向AHA-hGDF15(中间体57,6.67mg/ml,在30mM NaOAc pH4.0中,5.247mL,1.433μmol)中加入30mM NaOAc pH4.6(可接受的范围4.5-5.0)，得到0.88mg/ml的最终蛋白质浓度。加入中间体37(10eq.,2.39mL,
0.014mmol)，将反应物于室温混合18小时。在反应小瓶中已经形成沉淀。将反应混合物通过
4x15mL 10kDa Amicon离心过滤器分离，每份用30mM NaOAc pH4.0稀释至15mL。将物质通过缓冲液更换4x进入30mM NaOAc pH4.0中，将样品合并，体积为25.6mL，在各洗涤之间用吸管尖端搅动滤器中的沉淀物。沉淀物保留在溶液中，所以将混合物于4℃静置过夜。浓度通过A280(30040cm-1M-1,27538g/mol)测定为1.62mg/ml(100％)。UPLC分析显示+1FA(保留时间:
4.88min)和+2FA产物(保留时间:5.80min)(方法J)的回收为60％。LCMS方法T显示出预期的质量。
0.014mmol)，将反应物于室温混合18小时。在反应小瓶中已经形成沉淀。将反应混合物通过
4x15mL 10kDa Amicon离心过滤器分离，每份用30mM NaOAc pH4.0稀释至15mL。将物质通过缓冲液更换4x进入30mM NaOAc pH4.0中，将样品合并，体积为25.6mL，在各洗涤之间用吸管尖端搅动滤器中的沉淀物。沉淀物保留在溶液中，所以将混合物于4℃静置过夜。浓度通过A280(30040cm-1M-1,27538g/mol)测定为1.62mg/ml(100％)。UPLC分析显示+1FA(保留时间:
4.88min)和+2FA产物(保留时间:5.80min)(方法J)的回收为60％。LCMS方法T显示出预期的质量。
[1304] 体内测试了实施例19B的粗混合物(下表给出了比例)并在表1中报道：
[1305]
[1306] AHA-hGDF15+1FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的多肽链之一上(单体单元上)的N-末端氨基官能团处的反应(如实施方案11B,式H中给出)。
[1307] AHA-hGDF15+2FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的两条多肽链上的N-末端氨基官能团处的反应(如实施方案11B,式G中给出)。
[1308] AHA-hGDF15+3FA(脂肪酸)相应于GDF15同二聚体的某个其它位置处的非选择性反应。
[1309] 纯化:
[1310] 在Waters BEH300 3.5μm,4.6mmX100mm流速2.5ml/min上将粗产物经反相色谱法纯化(缓冲液A 0.1％TFA水溶液；缓冲液B 0.1M TFA在CAN中的溶液；梯度99％-80％缓冲液A)。
[1311] 级分1:未反应的AHA-hGDF15:Rt＝17.33min
[1312] 级分2:(19B1):AHA-GDF15+1FA:Rt＝20.2min(约15％产率)(式H)
[1313] 级分3:(19B2):AHA-GDF15+2FA:Rt＝21.6min(约15％产率)(式G)
[1314] 级分4:(19B3):AHA-GDF15+3FA:Rt＝23.0min(约5％产率)
[1315] 制备了19B1和19B2的1:1比例混合物并进行了测试(19Bm)。
[1316] 或者，反应可以在10mM Na2HPO4-7H2O和30mM NaOAc中在pH4.73进行：制备中间体37在分子生物学级水中的10mg/ml溶液。向AHA-hGDF15(中间体57,12.04mg/ml,在30mM NaOAc pH4.0,4.15μl,0.002μmol)中加入30mM NaOAc 10mM Na2HPO4-7H2O pH4.73，得到
0.88mg/ml的最终蛋白质浓度。加入中间体37(20eq.,6.83μl,0.041μmol)，反应物于室温混合18小时。反应混合物随着沉淀变得浑浊。UPLC分析显示出58％+1和+2产物(方法J)。
0.88mg/ml的最终蛋白质浓度。加入中间体37(20eq.,6.83μl,0.041μmol)，反应物于室温混合18小时。反应混合物随着沉淀变得浑浊。UPLC分析显示出58％+1和+2产物(方法J)。
[1317]种类 计算值 ％实测值
AHA-GDF15 24430 0
AHA-GDF15+1FA 25984 11
AHA-GDF15+2FA 27538 47
AHA-GDF15+3FA 29092 34
AHA-GDF15+4FA 30646 7
AHA-GDF15 24430 0
AHA-GDF15+1FA 25984 11
AHA-GDF15+2FA 27538 47
AHA-GDF15+3FA 29092 34
AHA-GDF15+4FA 30646 7
[1318] 反应还可以在30mM NaOAc和10mM K2HPO4中在pH4.6进行：制备中间体37在分子生物学级水中的10mg/ml溶液。向AHA-hGDF15(中间体57,6.21mg/ml,在30mM NaOAc pH4.0中,5.261mL,1.337μmol)中加入30mM NaOAc 10mM K2HPO4pH4.6(可接受的范围4.5-5.0)，得到
0.88mg/ml的最终蛋白质浓度。加入中间体37(10eq.,68.3μl,0.409μmol)，反应物于室温混合7小时。反应混合物随着沉淀变得浑浊。在15mL 10kDa Amicon离心过滤器中将反应混合物分为四个9mL部分，用30mM NaOAc pH4.0稀释至15mL。将物质通过缓冲液更换4x进入30mM NaOAc pH4.0中，在各洗涤之间用吸管尖端搅动沉淀物。反应混合物浓缩至75mL的体积。沉淀物保留，所以将物质于4℃储存2天。浓度通过A280(30040cm-1M-1,27538g/mol)测定未
0.4mg/ml(97％)。UPLC分析显示+1和+2产物的回收为61％(方法J)。
0.88mg/ml的最终蛋白质浓度。加入中间体37(10eq.,68.3μl,0.409μmol)，反应物于室温混合7小时。反应混合物随着沉淀变得浑浊。在15mL 10kDa Amicon离心过滤器中将反应混合物分为四个9mL部分，用30mM NaOAc pH4.0稀释至15mL。将物质通过缓冲液更换4x进入30mM NaOAc pH4.0中，在各洗涤之间用吸管尖端搅动沉淀物。反应混合物浓缩至75mL的体积。沉淀物保留，所以将物质于4℃储存2天。浓度通过A280(30040cm-1M-1,27538g/mol)测定未
0.4mg/ml(97％)。UPLC分析显示+1和+2产物的回收为61％(方法J)。
[1319]
[1320] 参比实施例1:缀合至中间体PEG-肉豆蔻酸构建体的His-hGDF15BCN(I-58):
[1321] 步骤1:
[1322]
[1323] 向叠氮基-PEG23-胺(30mg,0.027mmol)和肉豆蔻酸NHS酯(Toronto Research Chemicals,cat#S69080)(12mg,0.037mmol)的混合物中加入DCM(1mL)和DIPEA(13uL)，将混合物于室温搅拌过夜。将混合物经二氧化硅色谱法、用EtOAc/庚烷(0-100％)、然后用MeOH/DCM(0-10％)洗脱纯化，得到在约5％MeOH/DCM中的干净的产物。LCMS:(梯度:从40至98％B,1.4min-流速1mL/min洗脱剂A:水+0.05％甲酸+3.75mM乙酸铵,洗脱剂B:乙腈+0.04％甲酸)LCMS:rt＝2.20(方法C)质量+H计算值:1354.71质量实测值:1354.4。
[1324] 步骤2:
[1325]
[1326] 向BCN-hGDF15溶液(I-52:800uL,0.25mg/ml)中加入(2mg/ml,在DMSO中,6.3uL,10eq)，混合物于室温搅拌过夜。1.1mL 0.20mg/ml定量产率。(Maldi:+1质量计算值:28223质量实测值:28640；+2质量计算值:29543；质量实测值:29962,+3质量计算值:30863质量实测值:31426,+4质量计算值:32183质量实测值:32911)。
[1327] 参比实施例2:his-hGDF15-PEG23
[1328]
[1329]标记度 计算值 实测值 ％
His-hGDF15 26468 26360.3 5
His-hGDF15-BCN 26644 n/a 0
His-hGDF15+1PEG23 27567 28178.6 15
His-hGDF15+2PEG23 28666 29385.1 46
His-hGDF15+3PEG23 29765 30547.2 28
His-hGDF15+4PEG23 30864 31731.8 5
His-hGDF15 26468 26360.3 5
His-hGDF15-BCN 26644 n/a 0
His-hGDF15+1PEG23 27567 28178.6 15
His-hGDF15+2PEG23 28666 29385.1 46
His-hGDF15+3PEG23 29765 30547.2 28
His-hGDF15+4PEG23 30864 31731.8 5
[1330] 向His-hGDF15BCN(I59:427μl,1.17mg/ml,0.019μmol)在30mM NaOAc pH4.0(427μL)中的溶液中加入叠氮基-dPEG23-胺(Quanta Biodesign,104μg,0.094μmol)。反应物于室温混合16小时，此时采用10kDa MWCO Amicon离心过滤器通过稀释和将样品浓缩五次至140μL体积而将混合物交换入30mM NaOAc pH4.0中。MALDI分析显示完全转化为+1至+4产物。浓度通过A280(29090M-1cm-1,27600g/mol)测定为2.099mg/ml(57％)。
[1331] 实施例20:缀合至中间体47的Apelin环肽BCN:
[1332] 步骤1:pE-R-P-C*-L-S-C*-K-G-P-(D-Nle)-NH(苯乙基)(二硫化物C4-C7)乙酸酯的合成
[1333]
[1334] ·中间体20a的制备
[1335] (具有Fmoc-D-Nle-OH的2-氯三苯甲基氯树脂的加载、Fmoc除去和树脂
[1336] 加载的确定)
[1337] 将2-氯三苯甲基氯树脂(50.0g,85.0mmol)混悬于DCM(400mL)中，将混悬液搅拌10min，然后倒出溶剂，将树脂用DCM(3x200mL)洗涤。然后将Fmoc-D-Nle-OH(24.0g,
68.0mmol)和DIPEA(96.5mL,552.5mmol)在DCM(120.0mL)中的溶液加入树脂中，将混悬液充氮气，于室温搅拌5min。加入另一份DIPEA(22.7mL,127.5mmol)，反应混合物于室温搅拌过夜。
68.0mmol)和DIPEA(96.5mL,552.5mmol)在DCM(120.0mL)中的溶液加入树脂中，将混悬液充氮气，于室温搅拌5min。加入另一份DIPEA(22.7mL,127.5mmol)，反应混合物于室温搅拌过夜。
[1338] 倒出反应混合物，将树脂用DCM(3x 250mL)洗涤，每次2分钟。将树脂用混合物DCM/MeOH/DIPEA(70:15:15)(2x 250mL)淬灭，每次10分钟。
[1339] Fmoc基团通过用哌啶/DMF(1:3)(1x 300mL)处理树脂5分钟而裂解。然后将树脂排液(1x 300mL)15min，然后进行洗涤步骤：DMF(6x 250mL,每次2min)、异丙醇(2x 250mL,每次2min)和TBME(6x 250mL,每次2min)。将树脂于35℃真空干燥24小时，得到中间体20a(57.8g,加载＝1.08mmol/g)。
[1340] ·中间体20b的制备
[1341] (线性肽的装配)
[1342] 中间体20a(18.5g,20.0mmol)在自动肽合成仪(CSBIO536TM)上进行固相肽合成。偶联循环如下所定义：
[1343] ·氨基酸偶联：AA(3.0eq.)、DIC(3.0eq.)、HOBt(3.0eq.)、DMF(见下表)
[1344] ·洗涤：DMF(4x 150mL,每次2min)。
[1345] ·Fmoc脱保护：哌啶/DMF(1:3)(150mL 5min，然后150mL 15min)。
[1346] ·洗涤：DMF(6x 150mL,每次2min)。
[1347]
[1348]
[1349] 在肽装配后，将树脂用DMF(6x 150mL,每次2min)、异丙醇(6x150mL,每次2min)和TBME(6x 150mL,每次2min)洗涤。将肽树脂在高真空下于35℃干燥过夜，得到中间体20b(57.6g,20.0mmol)。
[1350] ·中间体20c的制备
[1351] (从树脂裂解HFIP)
[1352] 将一部分中间体20b(27g,9.37mmol)混悬于DCM(300mL)中，搅拌15min。将树脂排液，然后用HFIP/DCM(3:7)处理(3x 270mL,每次15min)。滤出裂解溶液并收集。将树脂用DCM(3x 300mL)洗涤。将合并的裂解和洗涤溶液在真空中浓缩至干。将白色粉末在真空中于35℃干燥过夜，得到中间体20c-第1批(23.5g,9.37mmol)。
[1353] 用另一部分中间体20b(28.0g,9.72mmol)重复上述操作，得到中间体20c-第2批(26.1g,9.72mmol)。
[1354] ·中间体20d的制备
[1355] (苯乙基胺的溶液相偶联)
[1356] 将中间体20c-第2批(20.0g,7.44mmol,1.0eq)和HATU(5.23g,13.8mmol,1.85eq)溶于DMF(400mL)中。加入苯乙基胺(1.67g,13.8mmol,1.85eq)和DIPEA(3.56g,27.6mmol,3.71eq)在DMF(60mL)中的溶液。
[1357] 将反应混合物于室温搅拌30min，然后冷却至℃，然后加入盐水(460mL)。将混悬液搅拌10min，然后通过过滤分离产物。将滤饼用H2O(300mL)洗涤，然后将其小心移出，然后溶于DCM(300mL)中。将溶液经MgSO4干燥，然后在真空中浓缩至干。粗产物进行二氧化硅胶快速色谱法(洗脱剂:DCM和DCM/iPrOH(8:2))，得到中间体20d-第1批(14.4g,6.6mmol)。
[1358] 用中间体20c-第1批(23.4g,9.37mmol)重复相同操作，排除快速色谱法，得到中间体20d-第2批(28.0g,9.37mmol)。
[1359] ·中间体20e的制备
[1360] (保护基除去)
[1361] 将中间体20d-第2批(28.0g,9.37mmol)溶于TFA/DCM/EDT/TIS(90:5:2.5:2.5)(290mL)中，反应物于室温搅拌2小时。
[1362] 将裂解溶液滤出，倒在冷TBME(3L)(0-4℃)上。将浑浊混悬液在冰水浴中搅拌30min，然后经4孔玻璃滤器过滤。将由此获得的白色固体用TBME(2x 100mL)洗涤，然后于35℃真空干燥过夜，得到中间体20e-第1批(8.9g,5.9mmol)。
[1363] 采用中间体20d-第1批(14.4g,6.6mmol)重复相同的操作，得到中间体20e-第2批(9.6g,6.3mmol)。
[1364] ·pE-R-P-C*-L-S-C*-K-G-P-(D-Nle)-NH(苯乙基)(二硫化物C4-C7)乙酸酯的制备[1365] 1)环化
[1366] 将中间体20e(5.0g,3.3mmol)溶于水(500mL)中。一次性加入碘(1.18g,4.66mmol,1.41eq)在乙酸(93mL)中的溶液。将反应混合物于室温搅拌10min。加入抗坏血酸(1.03g,
5.83mmol,1.77eq)在水(5.8mL)中的溶液，将反应混合物搅拌10min，过滤，于4℃储存至纯化。
5.83mmol,1.77eq)在水(5.8mL)中的溶液，将反应混合物搅拌10min，过滤，于4℃储存至纯化。
[1367] 重复相同的环化操作直至已经加工了18.3g(12.1mmol)中间体20e。
[1368] 2)纯化
[1369] 将环肽溶液接受制备型HPLC，每次进样0.5-5.0g肽。汇集具有高于95％的纯度的级分，冷冻干燥，得到总量为4.89g(3.2mmol)的纯化肽(TFA盐)。
[1370] 3)通过离子交换进行的乙酸酯形成
[1371] 将75g(100mL)OH-形式的强阴离子交换树脂(Ion exchanger III,Merck)放在烧结玻璃漏斗(孔隙率3)中，然后加入乙酸/水(1:3)溶液(300mL)，将混悬液手工搅拌2分钟，然后将树脂排液。用另一份乙酸/水(1:3)(300mL)重复该操作。将树脂用去离子水洗涤，直至观察到中性排液。然后将树脂转移至装配有烧结玻璃漏斗(孔隙率3)的4x20cm柱。
[1372] 将4.8g纯化肽溶于去离子水(50mL)中，加到柱子上。将产物用去离子水(200mL)洗脱。通过TLC点样控制产物的洗脱，将富含的级分汇集并冷冻干燥，得到pE-R-P-C*-L-S-C*-K-G-P-(D-Nle)-NH(苯乙基)(二硫化物C4-C7)乙酸酯(4.1g,2.9mmol)。
[1373] 通过分析型HPLC(分析方法F；tR＝8.01min)和UPLC-HRMS(分析方法G；测定值:[M+2H]2+＝643.328；计算值:[M+2H]2+＝643.324)对纯产物进行分析。乙酸酯含量为7.99-
8.27％，水含量为1.94-1.96％。
8.27％，水含量为1.94-1.96％。
[1374] 步骤2:pE-R-P-C*-L-S-CP-N6-[[(1α,8α,9α)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基]羰基]-K-G-P-(D-Nle)-NH(苯乙基)[二硫化物C4-C7]的制备
[1375]
[1376] 将pE-R-P-C*-L-S-C*-K-G-P-(D-Nle)-NH(苯乙基)三乙酸酯[二硫化物C4-C7](100mg,0.068mmol)、碳酸氢钠(38mg,0.452mmol)和水(83uL)在DMF(1mL)中的混合物于室温搅拌10mins，然后加入碳酸(1R,8S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯琥珀酰亚氨基酯(Berry&associates,20mg,0.068mmol)。反应混合物于室温搅拌90mins。将1mL水加入混合物中，将所得溶液冷冻干燥，得到粉末，将其未经进一步纯化用于下一步骤。
[1377] 步骤3:实施例20的制备:
[1378]
[1379] 将pE-R-P-C*-L-S-C*-N6-[[(1α,8α,9α)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基]羰基]-K-G-P-(D-Nle)-NH(苯乙基)[二硫化物C4-C7](50mg,来自步骤2的产物,在1mL水中,0.034mmol)和中间体47(52mg,在268uL水中)的混合物于室温搅拌约3小时。然后将反应混合物经制备型HPLC纯化(Sunfire30x50mm 5um柱ACN/H2O w/0.1％TFA 75ml/min,15-40％ACN 5min梯度)。将产物级分冷冻干燥，得到标题产物，为TFA盐(24mg,21％)。LCMS(Waters Acquity UPLC BEH C18 1.7um 2.1x50mm,50℃,洗脱剂A:水+0.1％甲酸，洗脱剂B:乙腈+
0.1％甲酸,梯度2％至98％B/A,历经5.15mins):保留时间:2.77mins；MS[M+2]2+:实测值:
1491.8808,计算值:1491.8560。
0.1％甲酸,梯度2％至98％B/A,历经5.15mins):保留时间:2.77mins；MS[M+2]2+:实测值:
1491.8808,计算值:1491.8560。
[1380] 实施例21A:缀合至中间体47的Apelin环肽BCN
[1381] 步骤1:
[1382]
[1383] 将pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH(二硫化物C6-C12)50mg,0.033mmol,如美国专利号8,673848中制备)、碳酸氢钠(18mg,0.215mmol)和水(40uL)在DMF(0.5mL)中的混合物于室温搅拌10mins，然后加入然算(1R,8S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯琥珀酰亚氨基酯(Berry&associates,18mg,0.065mmol)。将反应混合物于室温搅拌90mins。通过LCMS观察+1和+2混合物添加，所有将混合物经质量触发的HPLC纯化(肽方法525-50％ACN 5min梯度:条件:Sunfire 30x50mm 5um柱ACN/H2O w/0.1％TFA75ml/min1.5ml进样体积):
rt 3.2min(+1),rt 4.65min,4.9min(+1和+2混合物)。LCMS证实了61％产率的预期+1产物和18％产率的+1,+2混合物。LCMS:(碱性洗脱剂A:水+5mM氢氧化铵洗脱剂B:CAN酸性柱子:
Sunfire C183.5μm 3.0x30mm-40℃碱性柱子:XBridge C183.5μm3.0x30mm-40℃)保留时间:0.98mins；MS[M+2]2+:实测值:856.0,计算值:865.0245。
rt 3.2min(+1),rt 4.65min,4.9min(+1和+2混合物)。LCMS证实了61％产率的预期+1产物和18％产率的+1,+2混合物。LCMS:(碱性洗脱剂A:水+5mM氢氧化铵洗脱剂B:CAN酸性柱子:
Sunfire C183.5μm 3.0x30mm-40℃碱性柱子:XBridge C183.5μm3.0x30mm-40℃)保留时间:0.98mins；MS[M+2]2+:实测值:856.0,计算值:865.0245。
[1384] 步骤2:
[1385]
[1386] 将pE-R-P-R-L-C*-H-N6-[[(1α,8α,9α)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基]羰基]-K-G-P-Nle-C*-F-OH(二硫化物C6-C12)(21.33mg,0.014mmol)和中间体47(24mg,0.014mmol)的混合物于室温搅拌约3小时。通过LCMS完成反应，将其冷冻干燥，得到标题产物(23mg,48％)。LCMS(Waters Acquity UPLC BEH C181.7um 2.1x50mm,50℃,洗脱剂A:水+
0.1％甲酸，洗脱剂B:乙腈+0.1％甲酸,梯度2％至98％B/A,历经5.15mins):保留时间:
2.22mins；MS[M+2]2+:实测值:1616.9464,计算值:1616.976。
0.1％甲酸，洗脱剂B:乙腈+0.1％甲酸,梯度2％至98％B/A,历经5.15mins):保留时间:
2.22mins；MS[M+2]2+:实测值:1616.9464,计算值:1616.976。
[1387] 实施例21B:缀合至脂肪酸-连接基构建体I-37的Apelin环肽
[1388] 步骤1:A-H-Q-R-P-C-L-S-C-K-G-P-Dnle-苯乙基胺中间体21B1的合成
[1389]
[1390] 使苯乙基胺-AMEBA树脂(Sigma Aldrich,0.1mmol,1.0mmol/g)在自动肽合成仪上接受固相肽合成(CEM Liberty Blue Microwave)，采用标准双Arg用于Arg残基和Dnle偶联双时间。将氨基酸制成在DMF中的0.2M溶液。标准偶联循环如下定义：
[1391] ·氨基酸偶联:AA(5eq.)/HATU(5eq.)/DIEA(25eq.)
[1392] ·洗涤：DMF(3X 7mL)
[1393] ·Fmoc脱保护：20％哌啶/0.1M HOBt(2x 7mL)
[1394] ·洗涤：DMF(4x 7mL，然后1x 5mL)
[1395]
[1396]
[1397] 在肽装配后，将树脂用DMF(2x 50mL)和DCM(2x 50mL)洗涤，然后真空干燥，得到中间体21B1(276mg,0.1mmol)。
[1398] 步骤2:中间体21B2的制备(从树脂裂解肽)
[1399]
[1400] 将中间体21B1(276mg,0.1mmol)与4mL TFA溶液(37mL TFA,1mL H2O,1mL TIPS,3.06g DTT)合并，于室温振摇3小时。将溶液从树脂除去，沉淀入40mL冷Et2O中。将溶液涡旋，在冰上静置10分钟，然后于4000rpm离心5分钟。除去溶剂，将白色固体用Et2O再洗涤两次(每次40mL)，离心(每次5分钟)，倾析。将固体真空干燥过夜，得到中间体21B2(17.4mg,
0.012mmol)。LCMS(SQ2ProductAnalysis-Acidic-Peptide-Polar,Acquity UPLC BEH C18柱, 1.7μm,2.1mM x 50mm,50℃):Rt＝1.83分钟,MS[M+H]1513.5。
0.012mmol)。LCMS(SQ2ProductAnalysis-Acidic-Peptide-Polar,Acquity UPLC BEH C18柱, 1.7μm,2.1mM x 50mm,50℃):Rt＝1.83分钟,MS[M+H]1513.5。
[1401]
[1402] 步骤3:中间体21B3的制备(半胱氨酸残基的环化)
[1403] 将中间体21B1(29.6mg,0.020mmol)溶于水(3mL)和10滴DMSO中，得到略微浑浊的溶液。缓慢滴加碘(50mM,在HOAc中,0.783mL,0.039mmol)，将反应物于室温混合过夜。对粗反应物进行LCMS分析显示起始物质完全转化。滴加0.5M抗坏血酸直至颜色消散。将物质经由MS-触发的HPLC纯化。将汇集的级分冷冻干燥，得到7mg预期产品，为白色粉末(4.63μmol,24％)。LCMS(SQ2ProductAnalysis-Acidic-Peptide,Acquity UPLC BEH C18柱,
1.7μm,2.1mM x 50mm,50℃):Rt＝0.90分钟,MS[M+H]1511.8。
1.7μm,2.1mM x 50mm,50℃):Rt＝0.90分钟,MS[M+H]1511.8。
[1404] 步骤4:制备包含Apelin A-H-Q-R-P-C-L-S-C-K-G-P-Dnle-苯乙基胺和中间体I-37的缀合物(N-末端缀合)-实施例21B
[1405]
[1406] 在H2O中制备NHS-脂肪酸的10mg/ml溶液。将中间体21B3(1.5mg,0.993μmol)溶于30mM pH4NaOAc缓冲液(672μL)中，加入NHS-脂肪酸(I-37:0.850mL,5.10μmol)。将反应物于室温混合16小时，此时加入另外的1.5mg NHS-脂肪酸(10mg/ml,在H2O中)，将反应物于室温混合16小时。加入8mg NHS-脂肪酸(10mg/ml,在H2O中)，将反应物于室温混合3天，加入
1.7mg NHS-脂肪酸(10mg/ml,在H2O中)。将混合物于室温振摇16小时，经M-触发的HPLC纯化，得到1.7mg标题化合物，为白色粉末(0.510μmol,51％)。LCMS(SQ2ProductAnalysis-Acidic-Peptide-Polar,Acquity UPLC BEH C18柱, 1.7μm,2.1mM x 50mm,50℃):Rt＝3.87分钟,MS[M+H+2/2]1533.1；[M+H+3/3]1022.9。
1.7mg NHS-脂肪酸(10mg/ml,在H2O中)。将混合物于室温振摇16小时，经M-触发的HPLC纯化，得到1.7mg标题化合物，为白色粉末(0.510μmol,51％)。LCMS(SQ2ProductAnalysis-Acidic-Peptide-Polar,Acquity UPLC BEH C18柱, 1.7μm,2.1mM x 50mm,50℃):Rt＝3.87分钟,MS[M+H+2/2]1533.1；[M+H+3/3]1022.9。
[1407] 实施例22至24涉及脂肪酸与siRNA的缀合物。
[1408] 用于siRNA合成的试剂盒可购买获得，例如购自New England Biolabs和Ambion。siRNA剂可以采用本领域已知的化学合成和酶连接反应来构建。例如，siRNA剂可以采用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸来化学合成，所述各种修饰的核苷酸被设计成降低脱靶作用和/或增加分子的生物稳定性或增加在反义和正义核苷酸之间形成的双链体的物理稳定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。“G”、“C”、“A”、“T”和“U”各自通常表示分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶作为碱的核苷酸。然而，术语“核糖核酸”,“脱氧核苷酸”或“核苷酸”可以指经修饰的核苷酸或替代的置换部分。
[1409] 本领域技术人员将理解，能够采用本领域已知的任意常规方法如期望那样合成和修饰siRNA(参见Henschel等人,2004DEQOR:a web-based tool for design and quality control of siRNAs.Nucleic Acids Research 32(Web Server Issue):W113-W120)。
[1410] 实施例22:式A3脂肪酸部分与siRNA的缀合
[1411]
[1412] 制备中间体22a:
[1413] 采用标准的寡核苷酸操作(例如与6-(4-单甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺(Glen Research目录号10-1906))，由TTR siRNA[siRNA至转甲状腺素蛋白(TTR),采用本领域已知的常规方法合成]转化为22a。
[1414]
[1415] TTR siRNA:
[1416] 反义链:Puagagcaagaacacugu*u*rX058，其中：
[1417] P是磷酸酯基，小写字母表示2’-OMe修饰的核苷酸，下划线字母表示2’-F修饰的核苷酸，斜体字母表示2’-MOE修饰的核苷酸，r是基础的核糖醇,*指硫代磷酸酯连接，且X058是下式的非核苷酸3’端帽：
[1418]
[1419] 正义链：aacaguguucuugcucuar-C6OH。
[1420] -指磷酸酯基；且C6OH(还已知为C6)是下式的非核苷酸3’端帽：
[1421]
[1422] 制备中间体22b：
[1423] 于0℃向siRNA 22a的0.556mL溶液(TTR siRNA 14.02mM,在H2O中,7.79μmol)中加入0.556ml DMF，温热至室温。然后加入208μl TEA(0.3M在DMF中,62μmol)，260μl BCN-NHS(碳酸(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯N-琥珀酰亚氨基酯)(0.15M,在DMF中,39μmol)。所得反应物于室温搅拌1小时。分析型HPLC显示起始物质22a的小时。将反应物用去离子H2O稀释至10ml，其变得浑浊。将上述混合物用乙酸乙酯萃取5次以除去小的有机分子。分离水层并冷冻干燥。原样使用干燥的产物固体(22b)。
[1424] 制备实施例22:
[1425] 混合80μl化合物22b(12.3mM,在H2O中,0.968μmol)和65μl双脂肪酸-N3(22c:实施例15的步骤2:44.7mM,在DMSO中,2.90μmol)。所得混合物是浑浊的，因此加入80μl 1:1DMF/THF，反应物仍然是略微浑浊的。加入另外80μl DMSO以得到澄清溶液。反应物于室温搅拌过夜。反应物用去离子H2O稀释，经HPLC纯化，得到5.6mg化合物22(65.9％产率)。HPLC纯化条件:柱子:Xselect Prep苯基己基5um OBD 19x50mm；有机溶剂:用100mM TEA.HOAc改性的ACN；水性溶剂:用100mM TEA.HOAc改性的H2O；梯度:5-60％AcCN/H2O；时间:10min。在LC-MS方法H下，产物显示出单峰，保留时间为5.44min，在去卷积后具有8778的预期MW。
[1426] 实施例23：式A1脂肪酸部分与siRNA的缀合物化合物4的制备
[1427]
[1428] 采用与实施例22相同的方法制备了实施例23。
[1429] 制备23a:
[1430] 向NHS-脂肪酸(20mg)在DCM(16mL)中的溶液中加入叠氮基-peg7-胺(QuantaBiodesign,cat#10523)(31mg)和DIPEA(52uL)，混合物于室温搅拌2小时。LC-MS分析观察到转化完全。将混合物浓缩，重新溶于MeOH(3mL)中，经MS触发的HPLC、用0.1％TFA(rt＝1.59min,预期质量(M+1):818.062质量实测值:817.9)纯化，得到干净的产物。由于HPLC MS系统的800Da截留设置损失一半物质。获得5-10mg(17-33％)干净的产物。
[1431] 混合80μl 22b(12.3mM,在H2O中,0.968μmol)和65μl三脂肪酸-N3(23a:44.7mM,在DMSO中,2.90μmol)。该反应得到5.2mg化合物23(58.0％产率)。在LC-MS方法H下，产物显示出单峰，保留时间为5.87min，在去卷积后具有9257的预期MW。
[1432] 实施例24：式A3脂肪酸与APOCIII siRNA的缀合
[1433]
[1434]
[1435] 制备24b
[1436] 向24a(1.244g,4.19mmol)在25ml DCM中的溶液中加入TEA(0.58ml,4.19mmol)，然后加入N3-戊酸(500mg,3.49mmol)。最后加入EDC(804mg,4.19mmol)。反应物于室温搅拌4小时。反应物在盐水和DCM之间萃取。合并所有有机物，干燥，浓缩，经SiO2胶用60％乙酸乙酯/庚烷纯化，得到1.20g化合物24b(89％产率)。1H NMR(氯仿-d,400NHz)d:5.88-6.37(m,1H),4.60(d,J＝4.8Hz,2H),3.77(s,3H),3.33(t,J＝6.7Hz,2H),3.13(d,J＝6.5Hz,2H),2.30(t,J＝7.2Hz,2H),1.81-1.95(m,1H),1.63-1.81(m,5H),1.48-1.57(m,2H),1.46(s,9H),
1.36(d,J＝6.8Hz,2H)
1.36(d,J＝6.8Hz,2H)
[1437] 制备24c
[1438] 向24b(860mg,2.23mmol)在12ml THF中的溶液中加入1N NaOH(5.58ml,5.58mmol)。反应物于室温搅拌0.5小时。反应物用盐水稀释，加入20ml DCM。将水层的pH用
1N HCl调节至pH～5，然后用DCM萃取。合并所有有机物，干燥，浓缩，粗固体重新溶于6ml DCM中。加入0.6ml TFA，反应物于室温搅拌2小时。反应物浓缩，得到粗的24c(400mg,54％)，将其未经进一步纯化直接使用。在LC-MS方法I下，产物在0.43min显示出主要的峰，质量为
272.5(M+H+)。
1N HCl调节至pH～5，然后用DCM萃取。合并所有有机物，干燥，浓缩，粗固体重新溶于6ml DCM中。加入0.6ml TFA，反应物于室温搅拌2小时。反应物浓缩，得到粗的24c(400mg,54％)，将其未经进一步纯化直接使用。在LC-MS方法I下，产物在0.43min显示出主要的峰，质量为
272.5(M+H+)。
[1439] 制备24e
[1440] 向24c(400mg,1.04mmol)在10ml DCM中的溶液中加入TEA(0.434ml,3.11mmol)，然后加入24d(538mg,1.35mmol)。反应物于室温搅拌3小时。反应物在H2O和DCM之间萃取。合并所有有机物，干燥，浓缩，经SiO2胶用8％MeOH/DCM纯化，得到475mg 24e(82％产率)。1H NMR(氯仿-d,400MHz)d:6.74-6.98(m,1H),5.95-6.13(m,1H),4.55(dd,J＝7.2,2.4Hz,2H),3.32(t,J＝6.7Hz,4H),3.11(d,J＝5.8Hz,2H),2.30-2.37(m,2H),2.20-2.26(m,2H),1.90(br.s.,2H),1.71-1.80(m,2H),1.59-1.71(m,4H),1.51-1.59(m,2H),1.35-1.51(m,13H),
1.20-1.35(m,13H)
1.20-1.35(m,13H)
[1441] 制备24f
[1442]
[1443] 制备中间体24f2
[1444] 向24f1(1.0g,4.97mmol)在MeOH(40ml)中的溶液中加入TEA(1.04ml,7.45mmol),然后加入焦碳酸二叔丁基酯(2.17g,9.94mmol)。反应物于60℃加热1.5小时。将反应物浓缩，经SiO2柱用5％MeOH/DCM纯化，得到1.2g化合物24f2(80％产率)。1H NMR(氯仿-d,400MHz)d:4.51(br.s,1H),3.00-3.22(m,2H),2.37(t,J＝7.4Hz,2H),1.59-1.71(m,2H),
1.46(s,11H),1.29(br.s.,12H)。
1.46(s,11H),1.29(br.s.,12H)。
[1445] 制备中间体24f3
[1446] 向24f2(1.2g,3.98mmol)在DCM(30ml)中的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.60g,5.18mmol)，然后加入EDC(1.0g,5.18mmol)。将溶液于室温搅拌过夜。将反应物浓缩，直接上样到SiO2柱上，用40％乙酸乙酯/庚烷纯化，得到1.46g化合物24f3(92％产率)。1H NMR(氯仿-d,400MHz)d:4.49(br.s,1H),3.04-3.19(m,2H),2.86(d,J＝4.5Hz,4H),2.62(t,J＝
7.4Hz,2H),1.70-1.82(m,2H),1.37-1.53(m,13H),1.30(br.s.,10H)
7.4Hz,2H),1.70-1.82(m,2H),1.37-1.53(m,13H),1.30(br.s.,10H)
[1447] 制备中间体24f
[1448] 向GalNAc3-NH2(300mg,0.16mmol)在DCM(1.5ml)中的溶液中加入TEA(0.11ml,0.79mmol)，然后加入24f3(188mg,0.47mmol)。反应物于室温搅拌过夜。然后加入三氟乙酸(1.0ml)。2小时后，LC-MS显示中间体消失。将反应物浓缩，经开放存取(open access)HPLC在酸性条件下以ELSD作为检测进行纯化。收集含有产物的HPLC级分，蒸发溶剂，得到220mg化合物24f(67％产率)。LC-MS显示，部分产物失去一个乙酰基基团。HPLC纯化条件:柱子:
Sunfire 30x100mm 5um柱；有机溶剂:ACN w/7.5％TFA；水性溶剂:H2O w/7.5％TFA；流速:
75ml/min.梯度:15-40％H2O/AcCN；时间:9.5min。检测:ELSD(蒸发激光散射检测器)作为检+
测。在LC-MS方法I下，产物在0.83min处显示出峰。质量为989.9(M/2+H)。
Sunfire 30x100mm 5um柱；有机溶剂:ACN w/7.5％TFA；水性溶剂:H2O w/7.5％TFA；流速:
75ml/min.梯度:15-40％H2O/AcCN；时间:9.5min。检测:ELSD(蒸发激光散射检测器)作为检+
测。在LC-MS方法I下，产物在0.83min处显示出峰。质量为989.9(M/2+H)。
[1449] 制备24g
[1450] 向24e(172mg,0.31mmol)在3ml DCM中的溶液中加入24f(250mg,0.12mmol)，然后加入TEA(0.069ml,0.50mmol)。最后加入EDC(95mg,0.5mmol)。反应物于室温搅拌过夜。将反应物浓缩，经SiO2柱用5％MeOH/DCM纯化，得到230mg 24g(74％产率)。在LC-MS方法I下，产物在1.30min处显示出峰。质量为1258.2(M/2+H+)。
[1451] 制备24h
[1452] 向24g(230mg,0.091mmol)在1ml THF中的溶液中加入0.457ml 4N HCl(在二噁烷中,1.83mmol)。反应物于室温搅拌1小时。反应物浓缩，经HPLC纯化，得到50mg 24h(23％产率)，其失去糖上的一个乙酰基基团。HPLC纯化条件:柱子:Sunfire 30x100mm 5um柱；有机溶剂:ACN w/7.5％TFA；水性溶剂:H2O w/7.5％TFA；流速:75ml/min.梯度:15-40％H2O/AcCN；时间:9.5min。检测:ELSD(蒸发激光散射检测器)作为检测。在LC-MS方法I下，产物在0.95min显示出峰。质量为1187.1(M/2+H+)。
[1453] 制备24i
[1454] 向2,2,13,13-四甲基十四烷二元酸(40mg,0.127mmol)在2ml DCM中的溶液中加入N-OH琥珀酰亚胺(9.81mg,0.085mmol)，然后加入EDC(16.34mg,0.085mmol)。反应物于室温搅拌过夜。反应物浓缩，经HPLC纯化，得到20mg 24i(38％产率)。HPLC纯化条件:柱子:Sunfire 30x100mm5um柱；有机溶剂:ACN w/7.5％TFA；水性溶剂:H2O w/7.5％TFA；流速:
75ml/min.梯度:45-70％H2O/AcCN；时间:9.5min。检测:ELSD(蒸发激光散射检测器)作为检测。在LC-MS方法I下，产物在1.55min显示出峰。质量为434.3(M+Na+)。
75ml/min.梯度:45-70％H2O/AcCN；时间:9.5min。检测:ELSD(蒸发激光散射检测器)作为检测。在LC-MS方法I下，产物在1.55min显示出峰。质量为434.3(M+Na+)。
[1455] 制备24j
[1456] 向24h(20mg,8.05μmol)在0.5ml DCM中的溶液中加入TEA(4.5μl,32μmol)，然后加入24i(6.62mg,16μmol)和DMAP(3.93mg,32μmol)。反应物于室温搅拌过夜。然后加入0.5ml 2N MeNH2/MeOH用于脱保护。反应物于室温搅拌再次过夜。反应物浓缩，加入丙酮以沉淀出产物和除去过量试剂和脂质，得到12mg 24j(64％产率)。在LC-MS方法I下，产物在0.69min+
显示出峰。质量为1166.9(M/2+H)。
显示出峰。质量为1166.9(M/2+H)。
[1457] 制备24K
[1458]
[1459] 步骤1:
[1460] APOCIII siRNA[siRNA至基因APOCIII(还称为APOC3或Apoc 3)，采用本领域已知的常规方法合成]：
[1461] 退火寡核苷酸
[1462] 通用操作
[1463] 在离心机中简单旋转每种寡核苷酸沉淀，以高浓度(每100mL缓冲液1-10OD260)溶于Duplex缓冲液(100mM乙酸钾；30mM HEPES,pH 7.5)中。可以使用加热(高至94℃)和涡旋以促进重新混悬。然后以等摩尔量一起加入正义链和反义链。然后将混合的寡核苷酸加热至94℃，逐渐冷却下来。对于具有显著的二级结构的序列，可以采用更逐渐的冷却/退火步骤。这容易地通过将寡溶液置于水浴或加热块中并拔下插座/关闭机器来进行。所得产物将是稳定的双链形式，可以于4℃储存或冷冻。
[1464] APOCIII siRNA的反义链包含APOCIII的序列，其中链的3’端终止于磷酸酯基并以5’至3’顺序进一步包含核糖醇、其它磷酸酯基和3’端帽X058、即下式的非核苷酸3’端帽：
[1465]
[1466] 正义链包含与反义链互补的APOCIII序列，其中链的3’端终止于磷酸酯基并以5’至3’顺序进一步包含核糖醇、其它磷酸酯基和3’端帽C6OH、即下式的非核苷酸3’端帽：
[1467]
[1468] APOCIII siRNA与2-二甲氧基三苯甲基氧基甲基-6-芴基甲氧基羰基氨基-己烷-1-琥珀酰基-长链烷基氨基-CPG(Glen Research目录号20-2957)反应，生成产物24k1。
[1469] 步骤2
[1470] 将APOCIII siRNA(24k1:401μl,11.2mM在H2O中,4.49μmol)与401μl DMF混合，得到澄清溶液。然后加入TEA(180μl,0.25M在DMF中,45μmol)，然后加入BCN-NHS(碳酸(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯N-琥珀酰亚氨基酯)(9.16mg,31μmol)。反应物于室温搅拌1小时。反应物用H2O稀释至10ml，用乙酸乙酯萃取3次。分离水层，浓缩至～5ml，经PD-10脱盐柱纯化(GE healthcare).
[1471] 制备24
[1472] 将24j(5.8mg,2.5μmol)加入105μl化合物24k(Apoc 3siRNA 9.5mM在H2O中,0.993μmol)中。1小时后，反应物变得粘稠。所以加入另外的60μl H2O，将反应物于室温搅拌过夜。反应物用H2O稀释，经HPLC纯化，得到5mg缀合物24(57％产率)。HPLC纯化条件:柱子:
Xselect Prep苯基己基5um OBD 19x50mm；有机溶剂:用100mM TEA.HOAc改性的AcCN；水性溶剂:用100mM TEA.HOAc改性的H2O；梯度:5-50％AcCN/H2O；时间:10min。在LC-MS方法H下，在去卷积后，产物在5.96min显示出峰，预期质量为8896。
Xselect Prep苯基己基5um OBD 19x50mm；有机溶剂:用100mM TEA.HOAc改性的AcCN；水性溶剂:用100mM TEA.HOAc改性的H2O；梯度:5-50％AcCN/H2O；时间:10min。在LC-MS方法H下，在去卷积后，产物在5.96min显示出峰，预期质量为8896。
[1473] 参比实施例3:与GalNAc缀合的siRNA
[1474]
[1475] 按照实施例24的方法制得参比实施例3(用GalNac3-N3(如下)代替24j)。
[1476] GalNac3-N3的制备
[1477]
[1478] 制备中间体2
[1479] 将化合物1(2.06g,1.07mmol)溶于20mL乙醇中，加入TFA(82ul,1.07mmol)，然后加入10％Pd/C(0.114g,0.11mmol)。将反应物在H2气囊下处理6小时。反应物过滤,用乙醇洗涤，浓缩，得到白色固体，将其直接用于下一步骤。在LC-MS方法I下，产物在0.81min显示出峰。质量为898.5(M/2+H+)。
[1480] 制备中间体3
[1481] 将化合物2(4.848g,0.479mmol)溶于10mL无水DMF中，加入4-叠氮基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基-酯(0.325g,1.436mmol)，然后加入DIPEA(0.418mL,2.394mmol)。使反应物于室温反应过夜。将反应物不经加热进行浓缩、直接上样到预平衡的SiO2柱和用0-20％甲醇/DCM不连续梯度进行纯化，得到2.383g化合物3(49.25％产率)。在LC-MS方法I下，产物在1.27min显示出峰。质量为953.7(M/2+H+)。
[1482] 制备中间体4
[1483] 将化合物3(1.33g,0.70mmol)与MeNH2(17.45ml,2.0M在甲醇中,34.9mmol)混合。反应物于室温搅拌2小时。LC-MS仅显示出产物峰。将反应物浓缩。然后将固体重新溶于乙醇中，用丙酮沉淀，得到1.0g化合物4(94％产率)。在LC-MS方法I下，产物在0.53min显示出峰。
质量为764.5(M/2+H+)。
质量为764.5(M/2+H+)。
[1484] 实施例25:载体蛋白(CRM197)与脂肪酸的缀合
[1485] 步骤1:2-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十二氧杂-5-氮杂四十烷-40-基)氨甲酰基)-2-十一烷基十三烷二元酸(25a)
[1486]
[1487] 将t-boc-N-酰氨基 胺(100mg,0.155mmol,Quanta Biodesign)和中间体5(80mg,0.148mmol)溶于THF(3mL)中，在氮气下于室温搅拌。30分钟后，加入DIPEA(0.05mL,0.286mmol)，将应混合物于室温搅拌过夜。通过LCMS观察到反应完全(酸性洗脱剂A:水+0.05％三氟乙酸,洗脱剂B:ACN,柱Sunfire C18 3.5μm 3.0x30mm-40℃,5-95％梯度2分钟,保留时间1.92min)。将反应混合物在减压下浓缩，然后溶于约1.5mL乙腈中。在MS-触发的HPLC上纯化(Sunfire 30x50mm 5um柱ACN/H2O w/0.1％TFA75ml/min 1.5ml进样体积,
65-95％ACN 3.5min梯度,保留时间3.23分钟)，汇集级分并冷冻干燥，得到85mg干净的产物，54％产率。澄清油LCMS:方法D Rt＝1.18min,M+H 1070.1；1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δppm
0.82-1.03(m,1H)1.11-1.37(m,10H)1.37-1.51(m,2H)1.51-1.64(m,1H)1.69-1.82(m,1H)
1.90-2.04(m,66H)2.05-2.21(m,8H)2.21-2.42(m,1H)3.17-3.28(m,1H)3.40-3.68(m,
13H)。
65-95％ACN 3.5min梯度,保留时间3.23分钟)，汇集级分并冷冻干燥，得到85mg干净的产物，54％产率。澄清油LCMS:方法D Rt＝1.18min,M+H 1070.1；1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δppm
0.82-1.03(m,1H)1.11-1.37(m,10H)1.37-1.51(m,2H)1.51-1.64(m,1H)1.69-1.82(m,1H)
1.90-2.04(m,66H)2.05-2.21(m,8H)2.21-2.42(m,1H)3.17-3.28(m,1H)3.40-3.68(m,
13H)。
[1488] 步骤2:2-((35-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂三十五烷基)氨甲酰基)-2-十一烷基十三烷二元酸(25b)。
[1489]
[1490] 将25a(5mg,4.68μmol)溶于DCM(体积:2mL)中，然后加入三氟乙酸(25μl,0.324mmol)。将反应混合物于室温在氮气氛围下搅拌约2小时。通过LCMS观察到转化完全(酸性洗脱剂A:水+0.05％三氟乙酸,洗脱剂B:ACN,柱Sunfire C18 3.5μm 3.0x30mm-40℃,
5-95％梯度2分钟,保留时间1.45min)。将反应混合物在减压下浓缩，然后用DCM冲洗，再次浓缩3次。溶于乙腈和DMSO的混合物中。在MS-触发的HPLC上纯化(Sunfire30x50mm 5um柱ACN/H2O w/0.1％TFA 75ml/min1.5ml进样体积,45-70％ACN 3.5min梯度,保留时间2.50分钟)，汇集级分并冷冻干燥，得到2.5mg干净的产物，55％产率。澄清油。
5-95％梯度2分钟,保留时间1.45min)。将反应混合物在减压下浓缩，然后用DCM冲洗，再次浓缩3次。溶于乙腈和DMSO的混合物中。在MS-触发的HPLC上纯化(Sunfire30x50mm 5um柱ACN/H2O w/0.1％TFA 75ml/min1.5ml进样体积,45-70％ACN 3.5min梯度,保留时间2.50分钟)，汇集级分并冷冻干燥，得到2.5mg干净的产物，55％产率。澄清油。
[1491] 方法A Rt＝1.45min,M+H 969.9；1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δppm 0.62-0.91(m,2H)0.91-1.10(m,3H)1.10-1.31(m,18H)1.46(quin,J＝7.21Hz,2H)1.59-1.89(m,35H)1.94-
2.09(m,1H)2.16(t,J＝7.40Hz,2H)2.97-3.11(m,1H)3.24-3.37(m,1H)3.37-3.61(m,28H)
3.61-3.89(m,2H)7.85(br.s.,1H)。
2.09(m,1H)2.16(t,J＝7.40Hz,2H)2.97-3.11(m,1H)3.24-3.37(m,1H)3.37-3.61(m,28H)
3.61-3.89(m,2H)7.85(br.s.,1H)。
[1492] 步骤3:2-(((S)-5-(3-氨基-3-氧代丙基)-3,6-二氧代-1-苯基-2,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧杂-4,7-二氮杂四十二烷-42-基)氨甲酰基)-2-十一烷基十三烷二元酸(25d)。
[1493]
[1494] 将25b(20mg,0.018mmol)在THF(体积:2mL)中的溶液加入Z-L-Gln-Osu 25c(Santa Cruz Biotechnology,CAS 34078-85-8,11mg,0.029mmol)中，然后加入DIPEA(75μl,0.429mmol)。于室温在氮气氛围下搅拌过周末。通过LCMS观察到转化完全(酸性洗脱剂A:水+0.05％三氟乙酸,洗脱剂B:ACN,柱Sunfire C183.5μm 3.0x30mm-40℃,5-95％梯度2分钟,保留时间1.77min)。将反应混合物在减压下浓缩，然后溶于乙腈中。在MS-触发的HPLC上纯化(Sunfire 30x50mm 5um柱ACN/H2O w/0.1％TFA 75ml/min1.5ml进样体积,55-80％ACN
3.5min梯度,保留时间2.70分钟)，汇集级分并冷冻干燥，得到10.5mg干净的产物，46％产率，为澄清无色油状物。方法C Rt＝1.60min,M+H 1232.4；1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δppm
0.67-0.93(m,2H)0.93-1.10(m,2H)1.10-1.32(m,15H)1.45(quin,J＝7.24Hz,1H)1.59-
1.69(m,1H)1.75-1.93(m,30H)1.94-2.21(m,20H)3.23(quin,J＝5.26Hz,1H)3.28-3.51(m,
23H)3.95(td,J＝7.73,5.44Hz,1H)4.92-5.22(m,1H)5.78(br.s.,1H)6.13-6.42(m,1H)
6.88(br.s.,1H)7.20-7.36(m,2H)7.42(t,J＝5.07Hz,1H)。
3.5min梯度,保留时间2.70分钟)，汇集级分并冷冻干燥，得到10.5mg干净的产物，46％产率，为澄清无色油状物。方法C Rt＝1.60min,M+H 1232.4；1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δppm
0.67-0.93(m,2H)0.93-1.10(m,2H)1.10-1.32(m,15H)1.45(quin,J＝7.24Hz,1H)1.59-
1.69(m,1H)1.75-1.93(m,30H)1.94-2.21(m,20H)3.23(quin,J＝5.26Hz,1H)3.28-3.51(m,
23H)3.95(td,J＝7.73,5.44Hz,1H)4.92-5.22(m,1H)5.78(br.s.,1H)6.13-6.42(m,1H)
6.88(br.s.,1H)7.20-7.36(m,2H)7.42(t,J＝5.07Hz,1H)。
[1495] 步骤4：具有脂肪酸的CRM197的TG酶介导的标记
[1496]
[1497] 向25d在100mM tris缓冲液pH8(8mg/ml,203μl,1.316μmol)中的溶液中加入CRM197(33mg/ml,1.515μl,0.00086μmol)，然后加入谷氨酰胺转移酶(Ajinomoto)在PBS(50mg/ml,0.455μl,0.00060μmol)中的溶液。反应物于室温搅拌16小时。采用10kDa MWCO Amicon离心过滤器通过稀释和离心反应物5次至100μL体积将反应混合物交换入100mM tris缓冲液pH8中。LCMS分析显示转化为+1,+2,+3和+4产物。LCMS QT2；蛋白质_35-70kDa_3min:Rt＝1.45min；MS[M+25d]:实测值:59625,计算值:59624；MS[M+(2x 25d)]:实测值:
60839,计算值:60838；MS[M+(3x 25d)]:实测值:62054,计算值:62052；MS[M+(4x 25d)]:实测值:63270,计算值:63266。
60839,计算值:60838；MS[M+(3x 25d)]:实测值:62054,计算值:62052；MS[M+(4x 25d)]:实测值:63270,计算值:63266。
[1498] CRM197序列:
[1499] GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH
[1500]标记度 计算值 实测值 ％ Rt(min)
CRM197 58410 n/a 0 n/a
CRM197+125d 59624 59625 14 1.45
CRM197+225d 60838 60839 23 1.45
CRM197+325d 62052 62054 35 1.45
CRM197+425d 63266 63270 28 1.45
CRM197 58410 n/a 0 n/a
CRM197+125d 59624 59625 14 1.45
CRM197+225d 60838 60839 23 1.45
CRM197+325d 62052 62054 35 1.45
CRM197+425d 63266 63270 28 1.45
[1501] 肽谱实验概述:
[1502] 肽谱消化：将5μg经修饰的CRM197和阳性对照CRM197样品用20mM DTT还原和用1/30(w/w)酶/蛋白质、用胰蛋白酶于26℃消化过夜。将等分试样的经胰蛋白酶消化的蛋白质进一步用GluC酶以1/20酶/蛋白质比例于26℃消化4小时；注，所有酶购自Roche
Diagnostics(Gmbh,德国)。
Diagnostics(Gmbh,德国)。
[1503] 反相LC-MS/MS分析：将所产生的经消化的肽通过液相色谱法电雾化串联质谱法(LC-ESI MS/MS)在与Agilent CapLC(Santa Clara,CA)偶联的Thermo LTQ Orbitrap Discovery(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA)上进行分析。在40℃柱子上装载～10-15pmole的CRM对照和经修饰的CRM197消化物(Waters Acuity BEH C18,1.7μm,1x100mM柱)。运行80min，总梯度为在0-1min开始10μL/min、4％B、在1.1min升至7％B、在
55min 45％B、然后在63min 95％B，然后洗涤和柱平衡。质谱仪参数包括采用FTMS分析仪在
30000分辨率从m/z 300-2000达30ms的全扫描事件。在离子收集分析仪中在7个最强的离子(包括1+离子)上进行了碰撞诱导解离MS/MS，于500(对于所有事件)信号强度阈值为30ms。
55min 45％B、然后在63min 95％B，然后洗涤和柱平衡。质谱仪参数包括采用FTMS分析仪在
30000分辨率从m/z 300-2000达30ms的全扫描事件。在离子收集分析仪中在7个最强的离子(包括1+离子)上进行了碰撞诱导解离MS/MS，于500(对于所有事件)信号强度阈值为30ms。
[1504] 数据分析和数据库检索:在Qual Browser V 2.0.7(Thermo Scientific)中进行所有质谱法。采用MS DeconTools(R.D.Smith Lab,PPNL)产生了Mascot generic文件(mgf)，采用Mascot V2.3.01(Matrix Science Inc.,Boston,MA)数据库检索针对加至内部惯例数据库的所提供的蛋白质和SwissProt数据库(具有513,877个序列的V57)用于污染蛋白质进行了检索。检索参数包括：酶：半胰蛋白酶或胰蛋白酶/Glu-C，允许一直到三个错切割；可变的修饰：将小分子的预期质量(362.147787Da和463.206698Da)加至称为“CRM Tg酶+炔362Da mod(CKR),CRM Tg酶+炔362Da mod(N-term),CRM Tg酶+叠氮化物463Da mod(CKR),CRM Tg酶+叠氮化物463Da mod(N-term)”的数据库；肽容许:±20ppm；MS/MS容许:±0.6Da。在离子评分>95％置信度上进行序列覆盖和小分子修饰评价。然后选择高评分的肽离子用于采用Qual Browser进行手工MS/MS分析。
[1505] 赖氨酸修饰发生的位置可以按照上述谱实验来确定。根据2014年7月11日提交的美国申请号2015/0017192(律师案卷号PAT055641-US-NP)中对CRM197记载的类似缀合物，我们外推出：修饰发生在Lys37或Lys39、Lys33和Lys440。
[1506] 实施例26A:催产素衍生物和脂肪酸的缀合
[1507]
[1508] 步骤1：在树脂上的被保护的催产素的制备
[1509]
[1510] 类似于实施例21B步骤1合成了在树脂上的催产素的被保护的形式(26a1)。
[1511] 步骤2：烯丙基脱保护、环化、从树脂上裂解
[1512]
[1513] 将被保护的中间体(26a1)(0.2mmol)加入6mL含苯基甲硅烷(1mmol)和Pd(PPh3)4(0.02mmol)的DCM中。将树脂在该溶液中搅拌15分钟，然后过滤。用苯基甲硅烷/Pd(PPh3)4在DCM中的溶液重复该过程两次。最后搅拌后，将树脂过滤，用NMP(3次)、DCM(3次)、0.5％DIEA/DCM(3次)和最后用NMP(3次)洗涤。将所得的经洗涤的树脂在真空下干燥。将一部分干燥的树脂(～0.1mmol)加入PyBOP(0.2mmol)、HOBt(0.4mmol)和DIEA(0.5mmol)在6mL NMP中的溶液中。将该反应物于室温搅拌20小时。将树脂过滤，用EtOAc(3次)和DCM(3次)洗涤。然后将树脂加入4mL 95/2.5/2.5TFA/TIPS/H2O中，振荡2小时、然后将TFA/TIPS/H2O溶液过滤溶入冷(<-20℃)Et2O中以沉淀出切割的肽。离心后，倾析出Et2O，将灰白色残余物用Et2O洗涤，再次离心。将所得灰白色固体在N2下干燥过夜。将该固体在质量触发的预备型HPLC上纯化(Waters Autopure HPLC System；Sunfire C1830x50mm 5um柱；流动相:7.5-20％ACN水溶液,5min梯度,75mL/min,用0.1％TFA改性)。将相应于中间体(26a2)的级分合并、冷冻和冷冻干燥至白色固体(13.5mg,14％).HRMS-分析方法G:Rt＝0.90mins,MS m/z 988.5225[M+H]+。
[1514] 步骤3:缀合至脂肪酸
[1515] 向中间体(26a2)(2.82μmol)在0.5mL pH＝6.40磷酸盐缓冲液中的溶液中加入I-37(8.39μmol)在0.5mL pH＝6.40磷酸盐缓冲液中的溶液。将反应物于室温搅拌18小时。然后经4.5μm frit过滤反应混合物，在质量触发的预备型HPLC上纯化(Waters Autopure HPLC System；Sunfire C18 30x50mm5um柱；流动相:45-70％ACN水溶液,5min梯度,75ml/min,用0.1％TFA改性)。将相应于催产素-FA缀合物(26A)的级分合并、冷冻和冷冻干燥至白色固体(1.71mg,24％).LCMS-分析方法G:Rt＝3.07mins,MS m/z 2540.5[M+H]+。
[1516]
[1517] 实施例26B:催产素衍生物和脂肪酸的缀合
[1518]
[1519] 按照上述实施例26A步骤3，通过如下反应可以制备上述实施例(26B)：使*丁酸酯-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys*-Gly(N-CH2CH2CH2NH2)-Leu-Gly-NH2*＝硫化物键(26b1):
[1520] (26b1)与中间体I-37反应。
[1522] 在1mmol Fmoc-Rink Amide AMS树脂上经由Fmoc化学手工合成了肽。用于氨基酸的保护基为：叔丁基基团用于Tyr，Trt基团用于Gln和Asn。使用了两种不寻常的氨基酸Fmoc-Cys(CH2CH2CH2CO2烯丙基)-OH和Fmoc-[Nα-CH2CH2CH2NH(Boc)]Gly-OH。在树脂上通过反复除去Fmoc保护基和在DMF中偶联被保护的氨基酸(3eq)装配了肽链。使用HBTU和HOBt(3eq:3eq)作为偶联试剂；N-甲基吗啉(NMM,6eq)用作碱。哌啶在DMF中的20％溶液(3倍于树脂体积)用作脱-Fmoc试剂。在每次偶联和脱-Fmoc后将树脂通过DMF洗涤(3倍于树脂体积)；在每次偶联后进行茚三酮试验以检测偶联效率。在除去最后的Fmoc保护基后，将树脂用乙醚洗涤，在真空下干燥。通过Pd(PPh3)4/5,5-二甲基-1,3-环己二酮(1eq/10eq)在DCM/THF(1/1,10倍于树脂体积)中在树脂上选择性地除去烯丙基酯保护基达3小时。将树脂用DMF(3x)洗涤，然后通过二乙基二硫代氨甲酸钠在DMF中的0.5％溶液(5x)洗涤。最后，通过HCTU/NMM(3eq/6eq)在DMF中进行树脂上环化。将树脂洗涤，在真空下干燥，得到3.2克肽树脂，将其于室温用32ml TFA/TIS/DOT/H2O(92.5/2.5/2.5/2.5,v/v)处理3小时以除去侧链保护基和从树脂上切割肽。从冷醚中沉淀出肽粗品，然后过滤收集，在高真空下干燥。产量：
1.15g(116％)。
1.15g(116％)。
[1523] 将所有肽粗品在2-英寸C18柱上用TFA缓冲液(缓冲液A,0.1％TFA水溶液；缓冲液B,乙腈)纯化。将所汇集的纯度>95％的级分冷冻干燥至干。获得84mg最终的肽(TFA盐)。MS:991.6[M+H]+,HPLC保留时间9.49min(方法:流速1.2mL/min；缓冲液A:0.1％TFA水溶液；缓冲液B:TFA在乙腈中的0.1％溶液；室温；柱:Discovery,C18,4.6mm x 250mm,5micro；梯度(线性)15％-35％缓冲液B,20mins；进样体积0.02mL)
[1524] 实施例27:野灰蛋白相关性蛋白(AgRP)-脂肪酸缀合物
[1525] AgRP(83-132)-FA缀合物：
[1526] 实施例27A：AgRP的单脂肪酸缀合物(AgRP+1FA)，其中脂肪酸经由连接基(PEG)连接至AgRP的N-末端。
[1527]
[1528] 其中AgRP(83-132)具有如下序列：
[1529] Ser-Ser-Arg-Arg-Cys-Val-Arg-Leu-His-Glu-Ser-Cys-Leu-Gly-Gln-Gln-Val-Pro-Cys-Cys-Asp-Pro-Cys-Ala-Thr-Cys-Tyr-Cys-Arg-Phe-Phe-Asn-Ala-Phe-Cys-Tyr-Cys-Arg-Lys-Leu-Gly-Thr-Ala-Met-Asn-Pro-Cys-Ser-Arg-Thr；其在位置C87&C102、C94&C108、C101&C119、C105&C129、C110&C117桥处含有5个二硫桥。
[1530] 实施例27B：AgRP(83-132)的二脂肪酸缀合物(AgRP+2FA)，其中一个脂肪酸经由连接基(PEG)连接至AgRP的N-末端(即丝氨酸83)和其它脂肪酸经由PEG连接基连接至121位的赖氨酸的侧链。
[1531] 向0.90mL AgRP(83-132)(可获自R&D SystemsTM)在pH4.5柠檬酸盐缓冲液(9mg,1.585μmol)中的10mg/ml溶液中加入0.80mL pH＝4.43乙酸盐缓冲液，然后加入1.30mL I-
37在H2O中的10mg/ml溶液(13mg,7.79μmol)。将反应物于室温搅拌16小时。HRMS(QT2)显示了存在AgRP+1FA,m/z 7226.3[M+H]+,1.89min和AgRP+2FA,m/z 8778.4[M+H]+,2.41min两者。将反应物经4.5μm frit过滤，与上述第二个反应物(0.881μmol AgRP,2.64μmol I-37)合并，在预备型HPLC上纯化(Waters Autopure HPLC System；Waters Protein BEH C4柱,
300埃,5um,10x250mm；流动相:20-80％ACN水溶液,11min梯度,10mL/min,用0.1％TFA改性；
运行时间:15min；级分收集:UV210nm)。分离相应于AgRP+1FA和AgRP+2FA的级分，冷冻和冷冻干燥，得到AgRP+1FA(27A)和AgRP+2FA(27B)的TFA盐，为白色固体(3.24mg,16％AgRP+
1FA；2.26mg,9％AgRP+2FA)。LCMS-分析方法G:(AgRP+1FA)Rt＝1.91mins,MS m/z 7226.4[M+H]+；(AgRP+2FA)Rt＝2.43mins,MS m/z8778.4[M+H]+。
37在H2O中的10mg/ml溶液(13mg,7.79μmol)。将反应物于室温搅拌16小时。HRMS(QT2)显示了存在AgRP+1FA,m/z 7226.3[M+H]+,1.89min和AgRP+2FA,m/z 8778.4[M+H]+,2.41min两者。将反应物经4.5μm frit过滤，与上述第二个反应物(0.881μmol AgRP,2.64μmol I-37)合并，在预备型HPLC上纯化(Waters Autopure HPLC System；Waters Protein BEH C4柱,
300埃,5um,10x250mm；流动相:20-80％ACN水溶液,11min梯度,10mL/min,用0.1％TFA改性；
运行时间:15min；级分收集:UV210nm)。分离相应于AgRP+1FA和AgRP+2FA的级分，冷冻和冷冻干燥，得到AgRP+1FA(27A)和AgRP+2FA(27B)的TFA盐，为白色固体(3.24mg,16％AgRP+
1FA；2.26mg,9％AgRP+2FA)。LCMS-分析方法G:(AgRP+1FA)Rt＝1.91mins,MS m/z 7226.4[M+H]+；(AgRP+2FA)Rt＝2.43mins,MS m/z8778.4[M+H]+。
[1532] 标记实验以确定脂肪酸的连接位置
[1533] 按照生产商的方案通过将反应混合物用Asp-N(Promega)消化确认了N-末端Ser残基的标记。采用偶联有Bruker Maxis Impact Q-TOF质谱仪的Thermo DionexuLtimate 3000LC进行了所有肽谱分析。分离在保持在40℃的ACQUITY UPLC BEH130C18柱
(2.1x150mm,1.7μm,Waters)上进行。流速为0.1mL/min，采用0.1％FA水溶液作为流动相A和FA在乙腈中的0.1％溶液作为流动相B。
(2.1x150mm,1.7μm,Waters)上进行。流速为0.1mL/min，采用0.1％FA水溶液作为流动相A和FA在乙腈中的0.1％溶液作为流动相B。
[1534] 将Asp-N溶液(Promega Part#V162A)用20uL HPLC/MS水(0.1μg/μL)重构。将约10μg样品在6M脲、10mM二硫苏糖醇、5mM EDTA和50mM Tris_HCl(pH＝8.0)中稀释至25μL的终体积。还原和烷基化后，将溶液用50mM Tris_HCl(pH＝8.0)稀释6次，然后用另外的1微克Asp-N进行蛋白酶解。消化于37℃进行过夜。LCMS分析表明，在野生型AgRP和在每个片段上具有一个另外的脂肪酸的经修饰的AgRP的N-末端D位置处已经发生了裂解，如下表所示。
[1535]
[1536] 实施例28(28A、28B和28C)涉及hFGF23变体的缀合物。
[1537] 所用的FGF23变体
[1538] 该实施例中使用的和称为“hFGF23(R179Q)”、““hFGF23R179””或简单地是“hFGF23”的人FGF23变体的序列在SEQ ID NO:10中提供。这种FGF23变体缺少信号肽，但是在1位具有恢复的M和在R179具有突变(R179Q)。采用这种FGF23肽(实施例28C)制备了包含本文所述的脂肪酸的缀合物，其显示出保留表8中的至少一种FGF23活性。
[1539] 在该实施例中还使用了人FGF23的两种其它变体(实施例28A和28B)以构建具有本文公开的脂肪酸的缀合物。像SEQ ID NO:10的肽一样，它们缺少FGF23信号肽和在R179处具有突变，但是还具有一个或多个另外的突变，但是还保留至少一种FGF23活性。在该实施例中使用了这两种FGF23变体，并且两者称为“hFGF23-变体”或“FGF23变体”等。
[1540] 可以采用其它FGF23肽、包括FGF23或其同系物、变体、片段或修饰形式使用产生本文所述的缀合物的方法。
[1541] FGF23变体生成的方案
[1542] 转化
[1543] 通过pET28c-hFGF23R179Q表达质粒瞬时转染入BL21(DE3)感受态细胞、在冰上孵育30分钟、于42℃热激45秒、添加SOC培养基和将细菌于37℃振荡器中孵育1小时制备了hFGF23(R179)多肽。然后，将细菌培养物铺在含有卡那霉素的LB板上并于37℃孵育过夜。将所分离的集落转移至含有卡那霉素的LB培养基中，在振摇下于37℃孵育过夜，将25mL等分试样转移至新的含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃振摇约2.5小时。当细胞具有足够的密度(OD为～0.6)时，向各培养物中加入1M IPTG并于37℃继续振摇以诱导多肽的表达。4小时后，将细胞通过于6000rpm离心10分钟沉淀，将沉淀物于-20℃冷冻下来。随后，将沉淀物重新混悬于溶解缓冲液(50mM Tris,pH8,100mM NaCl,0.1％Triton X-100)中，将细胞采用微流体化仪(microfluider)溶解。每100mL溶解混合料中加入10mg溶菌酶和10μL DNase(1单位/mL,Invitrogen)，于室温温育30min，然后于4℃以8000rpm旋转20min，三次更换100mL溶解缓冲液和旋转进行洗涤，四次使用溶解缓冲液且不使用Triton X-100。将来自最终旋转的沉淀物(包涵体的沉淀物)立即溶于50mM Tris,pH7.4,6M胍,10mM DTT中，测定蛋白质浓度，在重折叠前调整为1mg/ml。
[1544] 蛋白质重折叠:
[1545] 为了重折叠蛋白质，向每400mL溶解包涵体中加入368mg还原型谷胱甘肽(GSSH)和74mg氧化谷胱甘肽(GSSG)。将蛋白质于4℃用4L 50mM Tris,pH8.0和250mM精氨酸透析过夜。然后移除2L透析缓冲液，用2L水替换，继续透析另外8小时。然后将透析缓冲液换成20mM Tris,pH8.0,50mM NaCl,25mM精氨酸，继续透析过夜。
[1546] 蛋白质纯化:
[1547] 为了纯化蛋白质，将透析混合物于12000rpm旋转30min，将上清液上样到用最终透析缓冲液平衡的肝素-Sepharose柱子上，将柱子用20x床体积的1xPBS洗涤。将重折叠蛋白质用补充有0.5M NaCl的1xPBS洗脱，蛋白质纯度通过SDS-PAGE胶评价，蛋白质浓度通过在280nm波长的OD测定。
[1548] 实施例28A：hFGF23变体与脂肪酸的缀合
[1549]
[1550]
[1551] 其中hFGF23变体-NH2-中的-NH2指赖氨酸残基的氨基官能团。
[1552] 步骤1:中间体28a
[1553]
[1554] 将5-氨基-2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-5-氧代戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(0.5g,1.325mmol)溶于DMF(体积:9.96mL)中，加入(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨甲酸叔丁基酯(0.503mL,2.120mmol)。向混合物中加入DIPEA(0.274g,2.120mmol)，将反应物于室温搅拌2小时，此时LCMS分析显示形成预期产品和消耗ZQ-NHS起始物质(方法A,Rt＝0.98min,M+H511.4)。将反应混合物倒入DCM(100mL)中，用冰水(3x 50mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤和浓缩，得到1.14g黄色油状物。LCMS分析指示了预期产品的存在(方法M,Rt＝1.82min,M+H 511.4,1.14g)。将物质未经进一步纯化用于下一步骤。
[1555] 步骤2:中间体28b,(5-氨基-1-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-1,5-二氧代戊烷-2-基)氨甲酸苄基酯
[1556]
[1557] 将三氟乙酸(10mL,2.233mmol)加入中间体28a(1.14g,2.233mmol)中，于室温搅拌约1小时。LCMS分析显示起始物质完全转化为预期产品(方法A,Rt＝0.56min,M+H 411.3)。将反应混合物加入DCM(30mL)中，浓缩至油状物两次。将油状物用1mL ACN和1mL MeOH稀释，经MS-触发的HPLC纯化(方法N)。汇集具有预期质量的级分、冷冻并冷冻干燥，得到中间体
28b，为白色粉末(方法O,Rt＝0.22min,M+H 411.3,160mg,18％)
28b，为白色粉末(方法O,Rt＝0.22min,M+H 411.3,160mg,18％)
[1558] 步骤3:中间体28c
[1559] 将中间体28b(19.69mg,0.048mmol)溶于DMF(0.5mL)中，加入中间体37(50mg,0.030mmol)在DMF(1.0mL)中的溶液中。加入3滴DIPEA，将反应物于室温搅拌2小时，此时LCMS分析显示完全转化为产物(方法B,Rt＝1.22min,M+H+2/2 982.9)。将反应混合物上样到20g C-18柱用于反相色谱法。采用历经20分钟从100％水(0.1％TFA)至100％MeCN的溶剂梯度，收集级分并通过LCMS分析。合并具有预期质量的级分，冷冻并冷冻干燥过夜，得到中间体28c，为澄清无色油状物(方法C,Rt＝1.21min,M+H+2/2982.9,M+H+3/3 655.5,15.3mg,
26％)。暂时解释的1H-NMR指示了存在在6.29ppm(1H,br m)形成的酰胺键。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.52(s,1H),7.35(d,J＝3.3Hz,5H),5.10(s,2H),4.30(s,1H),3.77(t,J＝5.8Hz,
2H),3.69-3.49(m,94H),3.46(s,4H),2.59(s,3H),2.32(t,J＝7.2Hz,25H),2.08-1.94(m,
4H),1.79-1.65(m,2H),1.65-1.52(m,2H),1.40-1.06(m,31H),0.94-0.82(m,3H)。
26％)。暂时解释的1H-NMR指示了存在在6.29ppm(1H,br m)形成的酰胺键。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.52(s,1H),7.35(d,J＝3.3Hz,5H),5.10(s,2H),4.30(s,1H),3.77(t,J＝5.8Hz,
2H),3.69-3.49(m,94H),3.46(s,4H),2.59(s,3H),2.32(t,J＝7.2Hz,25H),2.08-1.94(m,
4H),1.79-1.65(m,2H),1.65-1.52(m,2H),1.40-1.06(m,31H),0.94-0.82(m,3H)。
[1560]
[1561] 步骤4：hFGF23-变体+中间体28c
[1562] 对于该步骤，使用了人FGF23(hFGF23)变体(“hFGF23-变体”)，其缺少信号肽，但是相对于SEQ ID NO:8具有一个或多个突变，但是保留至少一种FGF23活性，并且其中“FGF23-变体-NH2”中的“-NH2”指赖氨酸残基的氨基官能团。
[1563] 制备了TG酶在30mM MES pH6中的50mg/ml溶液和中间体28c在30mM MES pH6缓冲液中的8mg/ml溶液。脂肪酸溶液在MES pH 6中变得浑浊。向hFGF23-变体(0.3mg/ml,在30mM MES pH6中,7.5mL,0.088μmol)中加入中间体28c(217μl,0.883μmol)、然后加入TG酶(33.5μl,0.044μmol)。将反应物于室温混合18小时，加入另外217μl中间体28c。将反应物于室温混合18小时，加入另外的217μl中间体28c。反应物于室温混合18小时，加入另外的108.5μl中间体28c。反应物于室温混合4小时，此时LCMS分析显示起始物质完全转化(方法P,Rt＝1.55min,M+H 27432)。将反应混合物分在两个4mL 10kDa MWCO Amicon离心过滤器之间，用
30mM MES pH6缓冲液进行缓冲液更换3x，然后浓缩至1.5mL。将物质在冰箱中储存过夜。一些固体沉积在试管底。通过A280测定上清液浓度(18730cm-1M-1,25485g/mol)为0.43mg/ml(27％)。
30mM MES pH6缓冲液进行缓冲液更换3x，然后浓缩至1.5mL。将物质在冰箱中储存过夜。一些固体沉积在试管底。通过A280测定上清液浓度(18730cm-1M-1,25485g/mol)为0.43mg/ml(27％)。
[1564] 实施例28B：hFGF23-变体与ZQG-PEG11-脂肪酸的缀合
[1565] 对于该实施例，制备了包含脂肪酸和FGF23变体的缀合物，所述变体缺少信号肽和相对于SEQ ID NO:8具有一个或多个突变，但是所述变体保留至少一种FGF23活性。
[1566]
[1567] 其中hFGF23-变体-NH2中的-NH2指赖氨酸残基的氨基官能团。
[1568] 在100mM pH 8tris缓冲液中制备中间体25d的8mg/ml溶液。在H2O中制备TG酶的50mg/ml溶液。向hFGF23-变体的溶液(6.5mL,0.090μmol)中加入中间体25d(0.207mL,1.343μmol)、然后加入TG酶(0.136mL,0.179μmol)。将反应物于室温混合3天，观察到90％转化为+
1品种(LCMS方法Q,Rt＝7.24min,M+H 26616)。采用10kDa MWCO Amicon离心过滤器通过稀释和离心反应物6次至2mL体积将反应混合物交换入PBS 1X缓冲液中。通过A280(18730cm-
1M-1,26617g/mol)测定浓度为0.125mg/ml(LCMS方法Q,Rt＝7.24min,M+H 26616)。
1品种(LCMS方法Q,Rt＝7.24min,M+H 26616)。采用10kDa MWCO Amicon离心过滤器通过稀释和离心反应物6次至2mL体积将反应混合物交换入PBS 1X缓冲液中。通过A280(18730cm-
1M-1,26617g/mol)测定浓度为0.125mg/ml(LCMS方法Q,Rt＝7.24min,M+H 26616)。
[1569] 实施例28C：h-FGF23R179+ZQG-PEG11-脂肪酸的缀合
[1570] 对于该实施例，采用FGF23变体“hFGF23R179”制备了缀合物。其缺少信号肽和在R179具有突变。该序列提供为SEQ ID NO:10。
[1571] 计算质量:25463
[1572] 在100mM pH 8tris缓冲液中制备中间体25d的8mg/ml溶液。在H2O中制备TG酶的50mg/ml溶液。向hFGF23R179溶液(2.50E+04μl,0.393μmol)中加入中间体25d(750μl,4.87μmol)、然后加入TG酶(597μl,0.785μmol)。将反应物于室温混合2天，此时LCMS分析显示起始物质完全转化(方法P,Rt＝1.58min,M+H 26674)。将反应混合物经离子交换色谱法纯化，得到+1缀合物(方法R,Rt＝3.87min,M+H 26674):
[1573]
[1574] 其中hFGF23R179-NH2中的-NH2指赖氨酸残基的氨基官能团。
[1575] 实施例29A和29B涉及serelaxin的缀合物。
[1576] 实施例29A：Serelaxin-脂肪酸缀合物(+1脂肪酸缀合物)
[1577]
[1578] Serelaxin+ZQG-PEG11-脂肪酸(实施例25d):
[1579] Serelaxin序列:
[1580] DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSCFRALSRKTCGVHCCKNALASYLE和
[1581] “serelaxin-NH2”中的-NH2指如通过如下谱实验所显示的赖氨酸K17的侧链处的反应活性氨基官能团；MW 5963g/mol。
[1582] 在100mM tris pH 8缓冲液中制备ZQG-PEG11-脂肪酸(实施例25d)的8mg/ml溶液。在H2O中制备mTG酶的50mg/ml溶液。向serelaxin(211μL,0.168μmol)在100mM tris pH 8(1.018mL,0.5mg/ml反应物)中的溶液中加入实施例25d(516μl,3.35μmol)、然后加入mTG酶(Ajinomoto,255μl,0.335μmol)。将反应物于37℃混合3天，然后加入另外的100μl ZQG-PEG11-脂肪酸。将反应物于37℃混合18小时和然后采用10kDa MWCO Amicon离心过滤器通过稀释和离心反应物5次至0.7mL的体积交换入PBS 1X缓冲液中。将物质经方法K纯化，汇集含有预期物质的级分，冷冻并冷冻干燥，得到白色粉末。将物质溶于1mL 30mM NaOAc缓冲液pH5中，通过A280(5969cm-1M-1,7178g/mol)测定浓度为0.25mg/ml(25％)。LCMS方法L:Rt＝
1.65min；MS[M+1+1FA]:实测值:7180,计算值:7178。
1.65min；MS[M+1+1FA]:实测值:7180,计算值:7178。
[1583] Serelaxin谱的实验操作
[1584] 样品蛋白酶解
[1585] 在6M脲、10mM二硫苏糖醇、5mM EDTA和50mM Tris_HCl(pH＝8.0)中将约10μg蛋白质溶解至25μL的终体积，于37℃维持1小时以还原二硫键。加入碘乙酰胺(500mM,1uL)以使游离硫醇烷基化，使溶液于室温在暗处静置1小时。然后将溶液用50mM Tris_HCl(pH＝8.0)稀释6X，加入LysC(1ug,Promega V107A)，将溶液于37℃维持过夜以消化蛋白质。加入甲酸(98％,2uL)以淬灭蛋白酶解，将所得肽混合物通过LC-MS/MS进行分析。
[1586] LC-MS/MS分析
[1587] 采用偶联有Bruker Maxis Impact Q-TOF质谱仪的Thermo DionexuLtimate 3000HPLC进行了肽谱。MS采用Bruker Compass v.1.7和Bruker otofControl v.3.4软件进行控制，具有如下仪器参数设置：质量范围300-2,000Da；喷雾电压4.0kV；毛细柱温度200℃；干燥气体流速5.0L/min。采用维持于40℃的Waters Acquity UPLC BEH130C18柱(2.1x100mm,1.7μm)进行分馏。流动相为甲酸分别在水和乙腈中的0.1％溶液，流速为
100uL/min。所用梯度为0-2min,2％B；2-3min,2％-8％B；3-10min,8％-29％B；10-14min,
29％-33％B；14-16min,33％-37％B；16-20min,37％-73％B；20-22min,73％-95％B；22-
25min,95％B；25-26min,95％-2％B；26-30min,2％B。采用Bruker DataAnalysis v.4.2进行数据加工。
100uL/min。所用梯度为0-2min,2％B；2-3min,2％-8％B；3-10min,8％-29％B；10-14min,
29％-33％B；14-16min,33％-37％B；16-20min,37％-73％B；20-22min,73％-95％B；22-
25min,95％B；25-26min,95％-2％B；26-30min,2％B。采用Bruker DataAnalysis v.4.2进行数据加工。
[1588] 谱实验表明，基于指定为[CCHVGCTK17(fa)RSLARFC-2H2O]的肽，脂肪酸加成至serelaxin主要发生在赖氨酸K17，质量:3088.56Da,电荷:5,Rt＝13.4min,实测m/z 618.71,预期m/z 618.72。
[1589] 实施例29B：Serelaxin-脂肪酸缀合物(如下所示的+1FA、+2FA和+3FA缀合物的混合物)
[1590]
[1591] 其中“serelaxin-NH2”中的-NH2指赖氨酸侧链处的反应活性氨基官能团。
[1592] Serelaxin+中间体37：实施例29B作为如下混合物进行测试
[1593]标记度 计算值 实测值 ％
serelaxin 5963 5964 3
serelaxin+1FA 7517 7516 19
serelaxin+2FA 9071 9069 52
serelaxin+3FA 10625 10622 25
serelaxin 5963 5964 3
serelaxin+1FA 7517 7516 19
serelaxin+2FA 9071 9069 52
serelaxin+3FA 10625 10622 25
[1594] 序列：
[1595] DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSCFRALSRKTCGVHCCKNALASYLpE
[1596] 在H2O中制备了脂肪酸中间体37的10mg/ml溶液。向serelaxin(105μl,0.084μmol,4.75mg/ml)在30mM NaOAc缓冲液pH 4(755μL)中的溶液中加入脂肪酸中间体37(140μl,
0.839μmol)。反应物于室温混合16小时，此时LCMS分析显示起始物质90％转化。加入另外的
70μl中间体37，反应物于室温混合16小时，此时MALDI分析表明>95％转化。采用3kDa MWCO Amicon离心过滤器通过稀释和离心反应物4次至0.2mL体积将溶液交换至PBS 1x缓冲液中。
通过A280(5969M-1cm-1；9068g/mol)测定浓度为2.61mg/ml。LCMS方法L:Rt＝1.56min；MS[M+
1+1FA]:实测值:7516,计算值:7517；Rt＝1.65min；MS[M+1+2FA]:实测值:9069,计算值:
9071；Rt＝1.74min；MS[M+1+3FA]:实测值:10622,计算值:10625。
0.839μmol)。反应物于室温混合16小时，此时LCMS分析显示起始物质90％转化。加入另外的
70μl中间体37，反应物于室温混合16小时，此时MALDI分析表明>95％转化。采用3kDa MWCO Amicon离心过滤器通过稀释和离心反应物4次至0.2mL体积将溶液交换至PBS 1x缓冲液中。
通过A280(5969M-1cm-1；9068g/mol)测定浓度为2.61mg/ml。LCMS方法L:Rt＝1.56min；MS[M+
1+1FA]:实测值:7516,计算值:7517；Rt＝1.65min；MS[M+1+2FA]:实测值:9069,计算值:
9071；Rt＝1.74min；MS[M+1+3FA]:实测值:10622,计算值:10625。
[1597] 实施例30：M-His-hPIP与脂肪酸构建体(I-37)的缀合-(如上所示的+1FA
[1598] 缀合物和+2FA缀合物的混合物)
[1599] M-His-hPIP(29-146)序列:
[1600]MHHHHHHQDNTRKIIIKNFDIPKSVRPNDEVTAVLAVQTELKECMVVKTYLISSIPLQGAFNYKYTACLCDDNPKTFYWDFYTNRTVQIAAVVDVIRELGICPDDAAVIPIKNNRFYTIEILKVE(SEQ ID NO：13)
[1601] 表达形式
[1602] 表达蛋白质序列:
[1603] METDTLLLWVLLLWVPGSTGMHHHHHHQDNTRKIIIKNFDIPKSVRPNDEVTAVLAVQTELKECMVVKTYLISSIPLQGAFNYKYTACLCDDNPKTFYWDFYTNRTVQIAAVVDVIRELGICPDDAAVIPIKNNRFYTIEILKVE[1604] 核苷酸序列:
[1605] GCTAGCCACCATGGAGACTGATACTTTGTTGTTGTGGGTACTGTTGCTTTGGGTGCCCGGTAGTACCGGTATGCATCACCACCACCATCACCAGGACAACACCCGGAAGATCATCATCAAGAACTTCGACATCCCTAAGAGCGTGCGCCCAAACGATGAAGTCACCGCGGTGCTGGCAGTGCAGACTGAGCTGAAGGAGTGCATGGTGGTCAAGACGTACCTGATTTCGTCCATCCCGCTGCAAGGCGCCTTCAACTACAAGTACACTGCCTGCCTCTGTGACGACAACCCCAAGACCTTTTACTGGGACTTCTACACCAATAGAACTGTCCAGATTGCTGCCGTGGTGGATGTGATCAGGGAATTGGGAATTTGCCCCGACGATGCGGCCGTGATTCCGATCAAGAACAACCGCTTCTATACCATCGAGATCCTTAAAGTGGAATGAGAATTC[1606] PIP表达载体：
[1607] 通过标准克隆方法产生了编码人PIP的哺乳动物表达载体。对含有鼠Igκ链信号序列、继之以MHHHHH序列、然后是具有5’-NheI(继之以Kozak序列)和3’-EcoRI位点的成熟PIP的片段进行密码子优化和合成(DNA2.0)。然后将该序列克隆入CMV启动子的下游的基于pcDNA3.1(Invitrogen)的载体的独特5’-NheI和3’-EcoRI位点。
[1608] PIP表达和纯化:
[1609] 采用标准聚乙烯亚胺方法，以1x106个细胞/mL将PIP表达质粒DNA转染至HEK293T细胞中。然后将500mL培养物在3L烧瓶中在FreeStyle293Medium(Life Technologies)中于37℃、8％CO2的湿润气氛下生长。从澄清的条件培养基中纯化PIP蛋白质。
[1610]
[1611] 其中M-His-PIP具有SEQ ID NO:12且“M-his”是MHHHHHH。
[1612] 缀合物:
[1613] 在H2O中制备了脂肪酸-连接基构建体#1的10mg/ml溶液。将M-His-hPIP(0.700mL,0.048μmol)用30mM NaOAc缓冲液pH4(619μL,0.5mg/ml反应物)稀释，加入中间体37(0.081mL,0.484μmol)。将反应物于室温混合18小时，此时LCMS分析显示70％转化为+1(50％)和+2(20％)产物。然后采用3kDa MWCO Amicon离心过滤器通过稀释和离心反应物5次至350μL体积将物质交换至PBS 1X缓冲液中。通过A280(13850cm-1M-1,14472g/mol)测定浓度为1.7mg/ml(70％)。LCMS方法L,Rt＝1.46min；MS[M+1]:实测值:14472,计算值:
14476.Rt＝1.57min；MS[M+1+1FA去糖基化的]:实测值:16025,计算值:16030.Rt＝1.69min；
MS[M+1+2FA去糖基化的]:实测值:17578,计算值:17584。
14476.Rt＝1.57min；MS[M+1+1FA去糖基化的]:实测值:16025,计算值:16030.Rt＝1.69min；
MS[M+1+2FA去糖基化的]:实测值:17578,计算值:17584。
[1614] M-His-hPIP+脂肪酸-连接基构建体I-37：实施例30作为如下混合物进行测试[1615]
[1616]
[1617] PIP谱的实验操作
[1618] 样品蛋白酶解
[1619] 将约10μg蛋白质在6M脲、10mM二硫苏糖醇、5mM EDTA和50mM Tris_HCl(pH＝8.0)中溶解至25μL的终体积，于37℃维持1小时以还原二硫键。加入碘乙酰胺(500mM,1uL)以使游离硫醇烷基化，使溶液于室温在暗处静置1小时。然后将溶液用50mM Tris_HCl(pH＝8.0)稀释6X，加入LysC(1ug,Promega)或胰蛋白酶/Lys C混合料(1ug,Promega)，将溶液于37℃维持过夜以消化蛋白质。加入甲酸(98％,2uL)以淬灭蛋白酶解，将所得肽混合物通过LC-MS/MS进行分析。
[1620] LC-MS/MS分析
[1621] 采用偶联有Bruker Maxis Impact Q-TOF质谱仪的Thermo DionexuLtimate 3000HPLC进行了肽谱。MS采用Bruker Compass v.1.7和Bruker otofControl v.3.4软件进行控制，具有如下仪器参数设置：质量范围300-2,000Da；喷雾电压4.0kV；毛细柱温度200℃；干燥气体流速5.0L/min。采用维持于40℃的Waters Acquity UPLC BEH130C18柱(2.1x100mm,1.7μm)进行分馏。流动相为甲酸分别在水和乙腈中的0.1％溶液，流速为
100uL/min。所用梯度为0-2min,2％B；2-3min,2％-8％B；3-10min,8％-29％B；10-14min,
29％-33％B；14-16min,33％-37％B；16-20min,37％-73％B；20-22min,73％-95％B；22-
25min,95％B；25-26min,95％-2％B；26-30min,2％B。采用Bruker DataAnalysis v.4.2进行数据加工。
100uL/min。所用梯度为0-2min,2％B；2-3min,2％-8％B；3-10min,8％-29％B；10-14min,
29％-33％B；14-16min,33％-37％B；16-20min,37％-73％B；20-22min,73％-95％B；22-
25min,95％B；25-26min,95％-2％B；26-30min,2％B。采用Bruker DataAnalysis v.4.2进行数据加工。
[1622] 谱实验表明，脂肪酸加成至MH6-PIP优先发生在N-末端，如通过[fa-MHHHHHHQDNTRK]所证实,质量:3265.76Da,电荷:4,Rt＝23.4min,实测m/z:817.44,预期m/z:817.45。
[1623] 低程度的脂肪酸加成发生在赖氨酸K42，如通过肽片段[SVRPNDEVTAVLAVQTELK(fa)ECMVVK],质量:4366.45Da,电荷3,Rt＝23.5min,实测m/z:1456.49,预期m/z:1456.49。在K42处加成脂肪酸阻断了邻近该赖氨酸的胰蛋白酶裂解，用于证实了加成位置。
[1624] 实施例31：采用点击化学的NPFF与脂肪酸的缀合
[1625]
[1626] 步骤1：NPFF点击化学手柄(handle)的制备
[1627]
[1628] 计算MH+1258.8
[1629] 向NPFF(Alfa Aesar,J66509,5mg,3.82μmol)在DMSO(1mL)中的溶液中加入三乙胺(5.32μl,0.038mmol)，然后加入碳酸(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基酯(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(1.335mg,4.58μmol)。将反应混合物于室温搅拌。完成后，将反应混合物作为粗品用于下一反应步骤。
[1630] 步骤2：缀合
[1631] 向步骤1的粗反应混合物中加入中间体6(I-6)。将反应混合物于室温振摇。完成后，将反应混合物采用反相色谱法纯化(系统：Agilent Bioinert SystemDate；柱:Waters Protein BEH C4柱,300埃,5um,10x250mm；用于UPLC方法开发的柱子是BEH C4m,300A,1.7um,2.1x50mm；流动相:6min46-56％ACN梯度,用0.1％TFA改性,A:水,B:乙腈；流速:
2.0mL/min；运行时间:15min；级分收集:UV 210nm)，得到标题化合物，为白色固体，为TFA盐；
2.0mL/min；运行时间:15min；级分收集:UV 210nm)，得到标题化合物，为白色固体，为TFA盐；
[1632] LCMS:方法S:ELSD:Rt 1.46mins；MS m/z 928.3[(M/3)+H]+
[1633] 可以看出，本发明的缀合物与非缀合生物分子相比具有相似的或改善的效力，但是另外地，本发明的缀合物与非缀合生物分子相比具有改善的血浆稳定性。已经发现上述实施例中的缀合物具有高于5小时、高于10小时、高于20小时、高于30小时、高于40小时和在一些情况中高于50小时的血浆稳定性。
[1634] 已经如此描述了本发明的示例性实施方案，应当被本领域技术人员注意的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。
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