一种抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系及其构建和应用
专利汇可以提供一种抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系及其构建和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种重组质粒及其构建方法，所述重组质粒含有抗 氧 化反应元件， 荧光 素酶基因和新霉素抗性基因。本发明还公开了一种抗 氧化剂 或化学 预防 剂筛选细胞系及其构建方法，所述细胞系为整合有上述的重组质粒的细胞。本发明提供的细胞系，已将重组质粒载体pARE-Luc-Neo中的ARE基因，荧光素酶基因，新霉素抗性基因整合到了宿主细胞Hek293的基因组中，随着细胞的传代培养（10代以上），对荧光素酶表达的检测依旧稳定，与瞬时 转染 的方法相比，更加方便，灵敏，可靠。，下面是一种抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系及其构建和应用专利的具体信息内容。
1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有抗氧化反应元件，荧光素酶基因和新霉素抗性基因。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述抗氧化反应元件为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述荧光素酶基因为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列和所述新霉素抗性基因为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
3.权利要求1或2所述的重组质粒的构建方法，将所述抗氧化反应元件连接到pHTS-MCS载体上，将连接产物转化大肠杆菌，挑取单菌落扩增后，提取质粒DNA，即得重组质粒pARE-Luc-Neo。
4.权利要求3所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）据pHTS-MCS载体多克隆酶切位点图谱，在抗氧化反应元件基因序列5´端和3´端分别设计Bgl Ⅱ和Sal Ⅰ酶切位点以便与pHTS-MCS载体连接；
2）设计用于阳性克隆PCR鉴定的引物：
上游引物：5´-AGTCAAGTCAGATCTCGGCCGCAATAAAATATCTTT-3´，
下游引物：5´-ATACAATCTCTCGAGGATTCTGCTGAGTCACTGTGAC-3´；
3）用DNA 连接试剂，将所述抗氧化反应元件基因插入到pHTS-MCS载体的Bgl Ⅱ和Sal Ⅰ酶切位点，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落扩增后，提取质粒DNA，即得重组质粒。
5.一种抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系，其特征在于，所述细胞系为整合有权利要求1或2所述的重组质粒的细胞。
6.根据权利要求5所述的抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系，其特征在于，所述细胞为Hek293。
7.权利要求5或6所述的抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系的构建方法，将所述重组质粒转染的体外培养的受体细胞，经培养、筛选后，即得。
8.权利要求7所述的抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）抗生素最佳筛选浓度的确定：
将体外培养的受体细胞铺于多个培养板孔中，每孔加入G418使其终浓度分别为100 µg/mL~1000 µg/mL，培养7-15天后，检测细胞活性，确定G418致细胞全部死亡的最低致死浓度，确定筛选浓度为在致细胞全部死亡的最低致死浓度基础上提高一个浓度梯度；
2）细胞系的构建：
将所述重组质粒转染受体细胞，5%CO2，37℃培养24h后，更换含有的G418的选择性培养基，G418在选择性培养基中的浓度为步骤1）所述的筛选浓度，5~9天后，存活的细胞开始成簇生长，此时的细胞为已经整合了所述重组质粒的细胞，将存活下来的细胞进行单克隆化，开始进行阳性单克隆细胞筛选，将培养板中的孔内只有1-2个细胞的孔进行标记，时时观察生长情况，待这些细胞生长成簇后，扩大培养，冻存保种；
TBHQ刺激诱导：将冻存保种的细胞铺于培养板的孔中，每孔加入含有TBHQ的培养基，对筛选得到的单克隆细胞刺激诱导，5%CO2，37℃培养24h后，每孔换新鲜的培养基，并加入荧光素酶检测试剂，室温下反应10min后，检测荧光素酶活性，选出一株对TBHQ诱导响应最高的阳性克隆细胞进行二次单克隆化操作；
将二次单克隆化得到的细胞再次进行TBHQ刺激诱导，筛选最高响应TBHQ诱导的一株单克隆细胞，即为抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系。
9.根据权利要求8所述的抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系的构建方法，其特征在于，步骤2）中所述含有TBHQ的培养基中TBHQ的浓度为20µmol/L。
10.应用权利要求5或6细胞系筛选抗氧化剂或化学预防剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将所述抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系铺入培养板的孔中，同时加入待筛选的药物，5%CO2，37℃培养24h后，更换培养基，并加入荧光素酶检测试剂，室温下反应10min后，检测荧光素酶的相对活性，若随待筛选的药物浓度增加，荧光素酶的相对活性也增加，说明该药物为抗氧化剂或化学预防剂。
一种抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系及其构建和应用
技术领域
背景技术
发明内容
2）设计用于阳性克隆PCR鉴定的引物：
上游引物：5´-AGTCAAGTCAGATCTCGGCCGCAATAAAATATCTTT-3´，
下游引物：5´-ATACAATCTCTCGAGGATTCTGCTGAGTCACTGTGAC-3´；
3）用DNA 连接试剂，将所述抗氧化反应元件基因插入到pHTS-MCS载体的Bgl Ⅱ和Sal Ⅰ酶切位点，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落扩增后，提取质粒DNA，即得重组质粒。
将体外培养的受体细胞铺于多个培养板孔中，每孔加入G418使其终浓度分别为100 µg/mL~1000 µg/mL，培养7-15天后，检测细胞活性，确定G418致细胞全部死亡的最低致死浓度，确定筛选浓度为在致细胞全部死亡的最低致死浓度基础上提高一个浓度梯度；
2）细胞系的构建：
将所述重组质粒转染受体细胞，5%CO2，37℃培养24h后，更换含有的G418的选择性培养基，G418在选择性培养基中的浓度为步骤1）所述的筛选浓度，5~9天后，存活的细胞开始成簇生长，此时的细胞为已经整合了所述重组质粒的细胞，将存活下来的细胞进行单克隆化，开始进行阳性单克隆细胞筛选，将培养板中的孔内只有1-2个细胞的孔进行标记，时时观察生长情况，待这些细胞生长成簇后，扩大培养，冻存保种；
TBHQ刺激诱导：将冻存保种的细胞铺于培养板的孔中，每孔加入含有TBHQ的培养基，对筛选得到的单克隆细胞刺激诱导，5%CO2，37℃培养24h后，每孔换新鲜的培养基，并加入荧光素酶检测试剂，室温下反应10min后，检测荧光素酶活性，选出一株对TBHQ诱导响应最高的阳性克隆细胞进行二次单克隆化操作；
将二次单克隆化得到的细胞再次进行TBHQ刺激诱导，筛选最高响应TBHQ诱导的一株单克隆细胞，即为抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系。
4：pARE-Luc-neo重组质粒。
具体实施方式
下游引物：5´-ATACAATCTCTCGAGGATTCTGCTGAGTCACTGTGAC-3´
3) 用Ligation high DNA 连接试剂，将双链的ARE基因插入到pHTS-MCS载体的Bgl Ⅱ和Sal Ⅰ酶切位点。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落扩增后，提取质粒DNA，经过Bgl Ⅱ和Sal Ⅰ双酶切、PCR及基因测序鉴定阳性克隆，结果如图1所示,结果鉴定正确，可用于转染细胞，重组质粒载体命名为pARE-Luc-Neo。图谱结构如图2所示。
将Hek293细胞铺于96孔板中，每孔约200个细胞左右，加入G418使其终浓度分别为
100 µg/mL-1000 µg/mL，每个浓度设3个重复，并设有空白对照。培养7-15天后，用MTT法检测细胞活性，确定G418致细胞全部死亡的最低致死浓度。最佳筛选浓度为在致细胞全部死亡的最低致死浓度基础上提高一个浓度梯度（即一个数量级）。筛选结果如图3所示，最佳筛选浓度为700µg/mL。
大量制备pARE-Luc-Neo并纯化后，使用FuGENEHD Transfection Reagent试剂将pARE-Luc-Neo质粒转染Hek293细胞， 5%CO2，37℃培养24h后（DMEM培养基）， 加入含有
20µmol/L 的叔丁基对苯二酚（TBHQ）的培养基，刺激诱导24h后，萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，与对照1（未被pARE-Luc-Neo质粒转染的Hek293细胞）、对照2（pARE-Luc-Neo质粒转染Hek293细胞，未经TBHQ刺激诱导）相比可检测到荧光素酶，鉴定pARE-Luc-Neo质粒具有筛选抗氧化剂或化学预防剂的作用。
2
中逐步扩大培养，直至15cm 培养瓶中，冻存保种。
将Hek293-ARE细胞铺于白色96孔培养板中，每孔细胞0.5×10 个，实验组同时加入不同浓度的姜黄素和白藜芦醇，每个浓度设5个平行孔，另设5个不加诱导剂的细胞孔为阴性对照。5%CO2，37℃培养24h后，每孔换新鲜的培养基，并加入100μL荧光素酶检测试剂，室温下反应10min后，使用全波长扫描式多功全功能酶标仪Luminometric进行检测，结果见图
5、图6，从图5和图6的结果可以看出，随着姜黄素和白藜芦醇浓度的增加，荧光素酶的相对活性也随之增加，二者有一定的剂量关系，说明抗氧化剂筛选细胞系Hek293-ARE建立成功。
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