一种食管癌化学预防研究模式的构建方法
阅读：731发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种食管癌化学预防研究模式的构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 属于 癌症 治疗 和 预防 技术领域，涉及一种食管癌 化学预防 研究模式的构建方法。该方法包括药剂用量的评价、实验动物的选择、食管癌的化学诱导、化学药剂作用效果的评价等步骤。本申请设计思路为：在诱导大鼠食管癌变过程中，通过影响癌前病变的发生率、多样性，以及通过酶联 免疫 吸附 测定方法对与食管癌变相关指标分子表达情况进行评价，从而准确评价相关化学预防药剂的化学预防效果。以NMBA诱导食管癌变模型为例， 发明 人 对异鼠李醇在食管癌化学预防中的作用进行了具体评价，结果表明，这种评价方法较为客观和全面，为异鼠李醇在食管癌化学预防中的进一步应用奠定了良好 基础 ；也为其他相关癌症预防和治疗的标准化提供了借鉴和参考。，下面是一种食管癌化学预防研究模式的构建方法专利的具体信息内容。
1.一种食管癌化学预防研究模式的构建方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：
（1）首先，对化学预防药剂的细胞毒性、对细胞增殖和转化的抑制作用进行评价，以确定化学药剂的最适用量范围；
（2）其次，选择合适的实验动物，在实验动物应环境后，随机分为若干组，其中至少包括空白对照组、食管癌诱导组和实验组；
（3）按照食管癌的化学诱导过程进行诱导，实验组在进行食管癌诱导的同时，根据需要使用化学预防药剂；诱导实验过程中，实验动物自由进食、饮水；
（4）对化学预防药剂的作用效果进行具体评价，评价标准包：
各组实验动物的饮食、饮水、体重方面的形态学特征；
食管上皮细胞癌变过程的组织形态变化方面的评价；
与食管癌细胞病变相关的分子学层次方面的评价。
2.如权利要求1所述食管癌化学预防研究模式的构建方法，其特征在于，步骤（1）中所述细胞采用永生化的食管上皮细胞。
3.如权利要求1所述食管癌化学预防研究模式的构建方法，其特征在于，步骤（2）中所述实验动物为F344大鼠。
4.如权利要求1所述食管癌化学预防研究模式的构建方法，其特征在于，步骤（3）中所述食管癌的化学诱导采用NMBA诱导，按0.25~0.5 mg/kg的量，皮下注射，3次/周、连续5周，或者1次/周、连续15周。
5.如权利要求1所述食管癌化学预防研究模式的构建方法，其特征在于，步骤（4）中所述食管癌细胞的组织形态变化方面的评价标准为，将食管黏膜上皮分为正常、增生、黏膜白斑、不典型增生4种类型，具体界定标准为：
正常，正常食管鳞状上皮，无变化；
增生，增生型病变分为基底细胞增生、上皮细胞（棘细胞）增生；
黏膜白斑，基底细胞和棘细胞均显著增多，增生的基底细胞形成3-6层以上，可占全层的1/2；
不典型增生，基底层细胞增生活跃，层次紊乱且较多，向基底部突出，可超过上皮全层的2/3；细胞增大，大小和形态不一致，排列不整。
一种食管癌化学预防研究模式的构建方法
技术领域
背景技术
[0002] 食管癌在世界上是最常见的恶性肿瘤之一，在导致癌症死亡最常见的肿瘤中，位居第六位，预后差，五年生存率仅为8~12%。食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）是食管癌的两个主要组织学类型。ESCC是发展中国家最常见的亚型，但在美国和其他西方国家食管癌主要是EAC。近年来，尽管食管癌早期筛查、早期诊断技术有了进步，标准的化疗和放疗已在临床上应用了几十年，但大多数临床中晚期病人的生存率仍无明显改善，提示了仅强调肿瘤早期发现和治疗而忽视肿瘤预防，结果收效甚微。
[0003] 一些癌症是可以预防的，早在20世纪80年代中期，世界卫生组织（WHO）就已经明确地提出了3个1/3的观点，即1/3的癌症可以预防，1/3的癌症患者可以治愈，1/3的患者积极治疗后可以提高生活质量，延长生存期。现有研究发现食管癌变是一个多阶段进行性发展过程(正常－基底细胞增生－不典型增生－原位癌－食管鳞状细胞癌），并确立了癌前病变的概念。食管癌前病变呈现明显的双向发展的不稳定特性，即这些病变可向癌的方向发展，也可逆转到较轻度的病变，或维持同一状态多年不变。食管癌癌前病变的这一特点提示如果在早期介入干预，癌前病变可能被逆转或发展过程被阻断，从而抑制食管癌的发生和发展。更好地了解食管癌癌前病变的基因和/或癌前病变会对确定癌前病变发展的关键分子起决定作用，因此，需要开发针对这些关键基因的安全、有效的靶向药物，进而逆转，抑制，或停止癌前病变进一步进展为癌症。因此构建能够模拟食管癌发生发展过程的动物模型可以为食管癌化学预防提供一个好的思路。
[0004] 食管癌发生发展是环境因素和基因相互作用的结果。通过对河南地区食管癌高发区人群的流行病学调查研究，发现甲基苄基亚硝胺（N-nitrosomethylbenzylamine，NMBA）与食管癌的发生具有密切的正相关性。目前NMBA诱导的大鼠食管鳞状细胞癌模型，广泛地用于评估食管癌发生的病理生理学过程，以确认化学预防药物在人类试验中的应用前景。大鼠从正常的食管上皮发展为鳞状细胞癌经历了增生、粘膜白斑、不典型增生、乳头状瘤，这种应变反应与人类病变过程极为相似，可以充分模拟人食管上皮癌变的过程，采用该动物模型可以进一步探讨食管癌变过程的分子机制，从而为寻找分子靶标，并为进一步筛选干预或者延缓食管癌发生发展的癌症化学预防药物提供了一个平台。
[0005] 食管癌肿瘤化学预防研究中，除了维生素和多种微量元素外，多种化合物也被用来尝试进行食管癌的化学预防研究，如茶多酚、冻干草莓、没食子酸、抗氧化类及非甾体类抗炎药物等，这些化合物通过不同的靶向分子预防食管癌的发生和发展，但其作用机制还需要更深入地研究。但根据预先确定的食管癌预防靶点，筛选安全性好、效率好、低毒的化合物是开展食管癌预防的基础设计目标。但总体而言，由于缺乏一种较为标准的化学预防研究模型和化学预防模型的构建方法，因而基于不同方法评价时，相同药剂的作用效果可能存在一定差别，一定程度影响了食管癌的化学预防的发展。发明内容
[0006] 本申请目的在于提供一种食管癌化学预防研究模式的构建方法，从而为食管癌的化学预防的动物模式的标准化和相关药剂作用效果的准确评价奠定基础。
[0007] 本申请所采取的技术方案详述如下。
[0008] 一种食管癌化学预防研究模式的构建方法，该方法主要用于评价特定药剂在食管癌化学预防中的作用效果，具体包括如下步骤：（1）首先对化学预防药剂的细胞毒性、对细胞增殖和转化的抑制作用进行初步评价，以确定化学药剂的最适用量范围；所述细胞具体例如采用SHEE细胞；
（2）其次，为获得良好的食管癌变模型，选择合适的实验动物，具体如选择F344大鼠，然后在实验动物适应环境后，随机分为若干组，其中至少包括空白对照组（即，正常饲喂）、食管癌诱导组（如采用NMBA诱导的食管癌变组）和实验组（即在食管癌诱导过程中，同时加入化学预防药剂，以对药剂的化学预防效果进行评价）；
（3）按照食管癌的化学诱导过程进行诱导，以NMBA诱导的食管癌变模型为例，针对F344大鼠，按照NMBA 0.25~ 0.5 mg/kg的量皮下注射，3次/周、连续5周（或者1次/周、连续15周）；实验组在进行食管癌诱导的同时，根据需要适时使用化学预防药剂，如提前一周饲喂化学预防药剂，然后再按照正常诱导程序进行食管癌变的诱导，诱导结束时间同NMBA诱导组；
诱导实验过程中，实验动物自由进食、饮水；
（4）对化学预防药剂的作用效果进行具体评价，评价标准包括：
各组实验动物的饮食、饮水、体重等形态学特征；
食管癌细胞的组织形态变化方面的评价，如将食管黏膜上皮分为正常、增生、黏膜白斑、不典型增生4种类型，然后对几种组织类型的变化情况进行统计；4种变化类型的具体界定标准为：
正常，正常食管鳞状上皮，无变化；
增生，增生型病变分为基底细胞增生、上皮细胞（棘细胞）增生；
黏膜白斑，基底细胞和棘细胞均显著增多，增生的基底细胞形成3-6层以上，可占全层的1/2；
不典型增生，基底层细胞增生活跃，层次紊乱且较多，向基底部突出，可超过上皮全层的2/3；细胞增大，大小和形态不一致，排列不整；
与食管癌细胞病变相关的分子学层次方面的评价，如COX-2指标表达情况的变化进行评价。
（2）其次，为获得良好的食管癌变模型，选择合适的实验动物，具体如选择F344大鼠，然后在实验动物适应环境后，随机分为若干组，其中至少包括空白对照组（即，正常饲喂）、食管癌诱导组（如采用NMBA诱导的食管癌变组）和实验组（即在食管癌诱导过程中，同时加入化学预防药剂，以对药剂的化学预防效果进行评价）；
（3）按照食管癌的化学诱导过程进行诱导，以NMBA诱导的食管癌变模型为例，针对F344大鼠，按照NMBA 0.25~ 0.5 mg/kg的量皮下注射，3次/周、连续5周（或者1次/周、连续15周）；实验组在进行食管癌诱导的同时，根据需要适时使用化学预防药剂，如提前一周饲喂化学预防药剂，然后再按照正常诱导程序进行食管癌变的诱导，诱导结束时间同NMBA诱导组；
诱导实验过程中，实验动物自由进食、饮水；
（4）对化学预防药剂的作用效果进行具体评价，评价标准包括：
各组实验动物的饮食、饮水、体重等形态学特征；
食管癌细胞的组织形态变化方面的评价，如将食管黏膜上皮分为正常、增生、黏膜白斑、不典型增生4种类型，然后对几种组织类型的变化情况进行统计；4种变化类型的具体界定标准为：
正常，正常食管鳞状上皮，无变化；
增生，增生型病变分为基底细胞增生、上皮细胞（棘细胞）增生；
黏膜白斑，基底细胞和棘细胞均显著增多，增生的基底细胞形成3-6层以上，可占全层的1/2；
不典型增生，基底层细胞增生活跃，层次紊乱且较多，向基底部突出，可超过上皮全层的2/3；细胞增大，大小和形态不一致，排列不整；
与食管癌细胞病变相关的分子学层次方面的评价，如COX-2指标表达情况的变化进行评价。
[0009] 本申请的总体设计思路为：利用构建促癌剂诱导的食管上皮细胞转化模型和在致癌剂诱导大鼠食管癌变模型，通过计算癌前病变的发生率、多样性，以及通过酶联免疫吸附测定方法对与食管癌变相关指标分子表达情况进行评价，从而准确评价相关化学预防药剂的化学预防效果。
[0010] 按照上述方法，发明人提供了一种NMBA诱导的食管癌变动物模型的化学预防研究模式，并对异鼠李醇在食管癌化学预防中的作用进行了具体评价，结果表明，这种评价方法较为客观和全面，为异鼠李醇在食管癌化学预防中的进一步应用奠定了良好基础；同时本申请也为其他相关癌症预防和治疗的标准化提供了借鉴和参考。附图说明
[0011] 图1为异鼠李醇对SHEE细胞增殖及转化的影响结果，其中A为通过CCK8试剂盒检测异鼠李醇对人食管永生化细胞SHEE细胞毒性的实验结果，图中10μM异鼠李醇细胞的存活率在80%左右；B为异鼠李醇对SHEE细胞生长抑制作用结果，其结果表明，在0~10μM时，异鼠李醇对SHEE细胞的抑制作用具有时间和剂量依赖性；C为异鼠李醇对SHEE 细胞转化能力的影响结果，其结果表明，随着异鼠李醇浓度的升高，细胞转化能力和克隆数量下降，异鼠李醇能够抑制EGF诱导SHEE 细胞的转化；图2为实验期间，大鼠一般生理学统计指标情况，其中A为各组大鼠体重情况，各组相比差异无统计学意义；B为各组大鼠食物摄入情况，各组相比差异无统计学意义，C为各组大鼠饮水情况，各组相比差异无统计学意义；
图3为大鼠食管黏膜染色病理分级标准参考图，其中 A为NMBA组大鼠食管中段样品形态观察图；B中a为正常食管黏膜， b为食管黏膜增生性病变，c为食管黏膜白斑性病变，d为食管黏膜不典型增生（×400）；
图4 为15周、25周、35周时，大鼠食管粘膜病变统计结果；
图5为15周、25周、35周时，大鼠血清COX2统计结果；
图6为35周时各组大鼠血清COX2含量测定结果。
图3为大鼠食管黏膜染色病理分级标准参考图，其中 A为NMBA组大鼠食管中段样品形态观察图；B中a为正常食管黏膜， b为食管黏膜增生性病变，c为食管黏膜白斑性病变，d为食管黏膜不典型增生（×400）；
图4 为15周、25周、35周时，大鼠食管粘膜病变统计结果；
图5为15周、25周、35周时，大鼠血清COX2统计结果；
图6为35周时各组大鼠血清COX2含量测定结果。
具体实施方式
[0012] 下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细的介绍，在介绍实施例前，首先对本发明中所用部分实验材料及动物模型构建简要介绍如下。
[0013] 细胞株：SHEE细胞株（Shantou human embryonic esophageal epithelial cell line），人胚食管上皮细胞汕头株，也称永生化食管上皮细胞株，由汕头大学医学院肿瘤病理研究室李恩民教授惠赠，细胞株采用10% FBS/DMEM培养基，培养箱内37℃恒温、5% CO2条件下培养、备用。
[0014] NMBA诱导的大鼠食管癌变模型的构建：动物模型构建过程中所用大鼠为：雄性、4~5周龄的F344大鼠（购自北京维通利华）；模型构建过程中，大鼠按5只/笼标准条件饲养，恒温（22～25℃），恒湿（40～60%），每 12 小时光/暗循环一次，经高压灭菌的清洁级动物饲料和水供动物自由食用；两周更换一次鼠笼，并定期清洁动物房；
NMBA诱导的大鼠食管癌变模型构建过程为：
按皮下注射NMBA 0.5mg/kg的量，3次/周、连续5周（也可根据需要修改为：1次/周、连续
15周）方式来构建大鼠食管癌动物模型，并在15周、25周和35周分别处死一批大鼠，从而分阶段对大鼠食管癌前病变过程进行分类和量化（细化），以利于寻找每个阶段发生改变的基因，通过分析癌前病变的分子机制，从而为不同阶段选用化学预防靶点提供理论依据；
同时下述实施例中，进行化合物预防食管癌变实验时，在给予NMBA皮下注射前一周给予药物灌胃，进行药物的化学预防。
实施例
NMBA诱导的大鼠食管癌变模型构建过程为：
按皮下注射NMBA 0.5mg/kg的量，3次/周、连续5周（也可根据需要修改为：1次/周、连续
15周）方式来构建大鼠食管癌动物模型，并在15周、25周和35周分别处死一批大鼠，从而分阶段对大鼠食管癌前病变过程进行分类和量化（细化），以利于寻找每个阶段发生改变的基因，通过分析癌前病变的分子机制，从而为不同阶段选用化学预防靶点提供理论依据；
同时下述实施例中，进行化合物预防食管癌变实验时，在给予NMBA皮下注射前一周给予药物灌胃，进行药物的化学预防。
实施例
[0015] 以NMBA诱导的大鼠食管癌变模型和以对异鼠李醇在食管癌的化学预防中的作用为例，对本申请所提供的食管癌化学预防动物模式的构建方法简要介绍如下。
[0016] 本申请所提供的食管癌化学预防动物模式的构建方法，具体构建步骤如下所述。
[0017] （1）首先，对化学预防药剂的细胞毒性、对细胞增殖和转化的抑制作用进行初步评价，以确定化学药剂的最适用量范围；本实施例主要是以对异鼠李醇在食管癌化学预防中的效用评价为例，因而首先对异鼠李醇对SHEE细胞的细胞毒性、细胞增殖的抑制作用和细胞转化的抑制作用了初步评价，相关实验简要介绍如下。
[0018] 细胞毒性实验实验过程为：SHEE细胞以1×104个/每孔接种于96孔板进行培养（10% FBS/DMEM，37℃，
5% CO2），12小时后，更换新鲜培养基并加入不同浓度的异鼠李醇（0 μM、1μM、 2.5μM、 5μM、
10μM、20μM），分别培养24和48小时后，每孔加入10 μL CCK-8（cell counting kit-8，日本同仁），继续培养2小时，最后在酶标仪上 450nm进行吸光度检测。
5% CO2），12小时后，更换新鲜培养基并加入不同浓度的异鼠李醇（0 μM、1μM、 2.5μM、 5μM、
10μM、20μM），分别培养24和48小时后，每孔加入10 μL CCK-8（cell counting kit-8，日本同仁），继续培养2小时，最后在酶标仪上 450nm进行吸光度检测。
[0019] 实验结果如图1A所示。从图1A中可以看出，通过CCK8试剂盒的检测，可以发现0~10μM的异鼠李醇对细胞的毒性非常小，但是20μM的异鼠李醇表现出一定的细胞毒性。因而在后续实验中选择10μM作为实验最高剂量。
[0020] 细胞增殖实验实验过程为：SHEE细胞以5×103个/每孔接种于96孔板进行培养（10% FBS/DMEM，37℃，
5% CO2），12小时后，更换新鲜培养基并加入不同浓度的异鼠李醇（0 μM、1μM、2.5μM、5μM、10μM），分别在培养0、24、48、72和 96小时后，每孔加入10μL的CCK8，继续培养2小时，最后在酶标仪上 450nm 波长条件下进行吸光度检测。
5% CO2），12小时后，更换新鲜培养基并加入不同浓度的异鼠李醇（0 μM、1μM、2.5μM、5μM、10μM），分别在培养0、24、48、72和 96小时后，每孔加入10μL的CCK8，继续培养2小时，最后在酶标仪上 450nm 波长条件下进行吸光度检测。
[0021] 实验结果如图1B所示。
[0022] 从图1B中可以看出，1μM 、2.5μM浓度的异鼠李醇作用SHEE细胞24、48、72和96小时后，对SHEE细胞没有抑制作用，5μM、10μM浓度的异鼠李醇对SHEE细胞具有抑制作用，并且呈现时间和剂量依赖性。
[0023] 锚定非依赖性生长实验实验过程为：在6孔板上每孔铺入3 ml BME培养基（含10% FBS和 0.5%琼脂），待凝固后铺入混悬有8×103个 SHEE细胞的上层胶（1 mL BME培养基，含 10% FBS 和0.33% 琼脂），在培养箱（37℃，5% CO2）培养7天后，待克隆形成，利用显微镜进行克隆计数。
[0024] 实验结果如图1C所示。
[0025] 从图1C中可以看出，和EGF（表皮细胞生长因子）组相比，DMSO（二甲基亚砜）溶剂对照组的SHEE细胞没有克隆形成能力；SHEE细胞受 EGF 诱导后，细胞形成克隆，但加入异鼠李醇可以抑制EGF诱导的SHEE细胞克隆形成，并且随着异鼠李醇浓度的升高，克隆数量逐渐下降，说明在低毒性浓度的情况下，异鼠李醇能够抑制 EGF 诱导的 SHEE 细胞克隆形成能力。
[0026] 综上细胞毒性、细胞增殖、锚定实验等结论，可以认定，10μM以下浓度的异鼠李醇对SHEE细胞的毒性是在可接受范围的，而且在此浓度范围内，异鼠李醇对SHEE细胞具有增殖抑制作用；并且由于异鼠李醇对EGF诱导的SHEE细胞的转化具有抑制作用，因而可初步认定，异鼠李醇在低浓度条件下具有抑制正常细胞向肿瘤细胞转化的作用，或者说，在安全的异鼠李醇药物浓度范围基础上（10μM以下时），可以有效的抑制SHEE细胞的增殖和恶性转化。
[0027] （2）选择合适的实验动物，本申请以NMBA诱导的食管癌前病变为例，采用了F344大鼠，在大鼠适应实验环境后，将其随机分为若干组；本实施例中，基于异鼠李醇用量差异及辅料影响因素的考量，共设置了5个组别，具体为：
第一组：溶剂对照组（大鼠数量n=20），常规饲养，皮下注射无菌水，每周三次，共五周；
同时按大鼠体重1mL/100g 的剂量灌胃0.5%的羧甲基纤维素，每天一次，共35周；
第二组：NMBA模型组（大鼠数量n=33），常规饲养，皮下注射NMBA，每周三次，共五周；
第三组：增生平组（大鼠数量n=8），在NMBA注射基础上，同时用增生平给大鼠灌胃（4g/kg），每天一次，共35周；
第四组：异鼠李醇低剂量组（大鼠数量n=10），在NMBA注射基础上，按10mg/kg剂量将异鼠李醇混悬于0.5%羧甲基纤维素中进行灌胃，每天一次，共进行35周；
第五组：异鼠李醇高剂量组（大鼠数量n=10），在NMBA注射基础上，按50mg/kg剂量将异鼠李醇混悬于0.5%羧甲基纤维素中进行灌胃，每天一次，共进行35周。
第一组：溶剂对照组（大鼠数量n=20），常规饲养，皮下注射无菌水，每周三次，共五周；
同时按大鼠体重1mL/100g 的剂量灌胃0.5%的羧甲基纤维素，每天一次，共35周；
第二组：NMBA模型组（大鼠数量n=33），常规饲养，皮下注射NMBA，每周三次，共五周；
第三组：增生平组（大鼠数量n=8），在NMBA注射基础上，同时用增生平给大鼠灌胃（4g/kg），每天一次，共35周；
第四组：异鼠李醇低剂量组（大鼠数量n=10），在NMBA注射基础上，按10mg/kg剂量将异鼠李醇混悬于0.5%羧甲基纤维素中进行灌胃，每天一次，共进行35周；
第五组：异鼠李醇高剂量组（大鼠数量n=10），在NMBA注射基础上，按50mg/kg剂量将异鼠李醇混悬于0.5%羧甲基纤维素中进行灌胃，每天一次，共进行35周。
[0028] 需要解释的是，实验设计时，可根据需要对实验组别适当调整，但一般至少应包括空白对照组、食管癌诱导组和实验组三个组别，已对特定化学药剂在食管癌化学预防中的效果进行初步评价。
[0029] （3）按照食管癌的化学诱导过程进行诱导，按照上述NMBA诱导方法，对步骤（2）中不同组别的实验动物进行食管癌变的诱导；各组别均进行35周时长诱导实验过程中，实验动物自由进食、饮水。
[0030] （4）对化学预防药剂的作用效果进行具体评价，评价标准共包括3个层次，即，形态学层次的、细胞学层次的和分子结构层次的，详细介绍如下。
[0031] 首先，对各组实验动物的饮食、饮水、体重等形态学特征进行统计和分析。实验结果如图2所示。
[0032] 从图中可以看出，各组大鼠在体重和食物摄取、饮水量方面没有明显差异。此结果表明，化学预防药剂对于实验动物的正常生长没有影响，具有较好的应用基础。
[0033] 其次，对食管上皮细胞的组织形态变化方面进行评价。本实施例中，将食管黏膜上皮分为正常、增生、黏膜白斑、不典型增生4种类型，然后对不同组别中几种组织类型的变化情况进行统计；4种变化类型的具体界定标准为：
正常，正常食管鳞状上皮，无变化；
增生，增生型病变分为基底细胞增生、上皮细胞（棘细胞）增生；
黏膜白斑，基底细胞和棘细胞均显著增多，增生的基底细胞形成3-6层以上，可占全层的1/2；
不典型增生，基底层细胞增生活跃，层次紊乱且较多，向基底部突出，可超过上皮全层的2/3；细胞增大，大小和形态不一致，排列不整；
食管粘膜样品中典型的4种组织变化类型如图3所示，以此作为对照和参考，对不同组别中4种类型的组织变化情况进行统计，具体各组别中F344大鼠食管癌变组织变化情况结果如下表所示（表中数据为均数±标准差）：
异鼠李醇对F344大鼠食管癌变程度以及数量的影响：
注：a表示与NMBA组相比，差异有统计学意义（P <0.05），b表示与NMBA组相比，差异有统计学意义（P <0.01）， c表示与NMBA组相比，差异有统计学意义（P <0.001）。
正常，正常食管鳞状上皮，无变化；
增生，增生型病变分为基底细胞增生、上皮细胞（棘细胞）增生；
黏膜白斑，基底细胞和棘细胞均显著增多，增生的基底细胞形成3-6层以上，可占全层的1/2；
不典型增生，基底层细胞增生活跃，层次紊乱且较多，向基底部突出，可超过上皮全层的2/3；细胞增大，大小和形态不一致，排列不整；
食管粘膜样品中典型的4种组织变化类型如图3所示，以此作为对照和参考，对不同组别中4种类型的组织变化情况进行统计，具体各组别中F344大鼠食管癌变组织变化情况结果如下表所示（表中数据为均数±标准差）：
异鼠李醇对F344大鼠食管癌变程度以及数量的影响：
注：a表示与NMBA组相比，差异有统计学意义（P <0.05），b表示与NMBA组相比，差异有统计学意义（P <0.01）， c表示与NMBA组相比，差异有统计学意义（P <0.001）。
[0034] 进一步地，分别对15周、25周、35周时NMBA组大鼠食管粘膜病变情况进行统计，结果如图4所示，从图4中可以看出，与对照组相比，NMBA组在15周、25周、35周时增生、粘膜白斑和不典型增生病变明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)。具体而言：
增生性改变，35周食管粘膜明显增生，病变增多，与15周、25周相比有差异，差异有统计学意义(P<0.001)；
粘膜白斑，35周大鼠食管病变与15周相比，粘膜白斑增多，差异有统计学意义(P<
0.05)；
不典型增生，35周与15周相比病变程度严重，差异有统计学意义(P<0.05)。
增生性改变，35周食管粘膜明显增生，病变增多，与15周、25周相比有差异，差异有统计学意义(P<0.001)；
粘膜白斑，35周大鼠食管病变与15周相比，粘膜白斑增多，差异有统计学意义(P<
0.05)；
不典型增生，35周与15周相比病变程度严重，差异有统计学意义(P<0.05)。
[0035] 综合上述组织形态学方面的评价结果可以看出，通过NMBA的诱导，可成功构建标准化的食管癌变模式动物，而通过对食管组织癌变程度的定量标准化，可以看出，异鼠李醇在阻止食管癌变过程中具有较好的干预作用，可为食管癌的化学预防提供较好地参考借鉴作用。
[0036] 最后，通过与食管癌细胞病变相关的分子学层次方面的评价，如对血清COX2变化情况进行评价，从而深入了解化学预防药剂的作用机理，同时也为相关化学药剂更好、更有效的预防食管癌变奠定基础。
[0037] 分别对15周、25周、35周时NMBA组大鼠血清COX2含量进行测定，结果如图5所示。从图中可以看出，与对照组相比，NMBA组在35周时大鼠血清COX2含量明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)。35周NMBA组与15周、25周NMBA组相比，大鼠血清COX2含量明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)并且对35w时各组大鼠血清COX2含量进行测定，结果如图6所示。从图中可以看出，与NMBA组相比，增生平组和异鼠李醇高剂量在35周时大鼠血清COX2含量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。
[0038] 综上所述，本申请通过结合食管癌变过程动物模型的构建过程，提供了一种食管癌化学预防动物模式的构建方法，并以F344大鼠为例，构建了一种较为标准化的NMBA诱导的异鼠李醇化学预防动物模型，通过不同层次评价体系的建立，可较为全面和准确的评价异鼠李醇在食管癌变中的化学预防作用，同时也为其他药剂在相关癌症中的化学预防作用提供了参考和借鉴。
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