抗乙肝药物LQC-X的合成及其应用
阅读：1022发布：2020-07-26
专利汇可以提供抗乙肝药物LQC-X的合成及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及化学和 生物 科学领域，具体涉及到LQC-X结构通式I及其中间体的合成和应用，其中LQC-X6小鼠单日单次最大 给药 剂量2000mg/kg，连续观察7天，未出现毒性反应，表明该药物安全性非常高，药效学实验证明该类化合物有明显的抗乙肝病毒作用及保肝降酶作用。可用于制备 预防 和 治疗 乙型 肝炎 、慢性肝硬化等 疾病 的药物。LQC-X结构通式I，下面是抗乙肝药物LQC-X的合成及其应用专利的具体信息内容。
1.通式I化合物
LQC-X结构通式I
2.根据权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于化合物的制备包括如下步骤：
(1)将齐墩果酸(化合物1)溶于有机溶剂，一定温度下与溴代试剂在催化剂的催化下发生消除反应生成化合物LQC-X1；
(2)将上述生成的化合物LQC-X1溶于有机溶剂，一定温度下与Eosiy发生自由基反应生成化合物LQC-X2；
(3)将上述生成的化合物LQC-X1溶于有机溶剂，一定温度下与Eosiy发生自由基反应生成化合物LQC-X3；
(4)将上述生成的化合物LQC-X2溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成化合物LQC-X4；
(5)将上述生成的化合物LQC-X3溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成化合物LQC-X5；
(6)将上述生成的化合物LQC-X1溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成化合物LQC-X6；
(7)将齐墩果酸(化合物1)溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成化合物LQC-X7；
(8)将齐墩果酸(化合物1)溶于有机溶剂，一定温度下，与溴代川芎嗪发生反应生成化合物LQC-X8；
(9)将上述生成的化合物LQC-X1溶于有机溶剂，一定温度下，与溴代川芎嗪发生反应生成化合物LQC-X9；
(10)将上述生成的化合物LQC-X6溶于有机溶剂，一定温度下，与溴代川芎嗪发生反应生成LQC-X10；
上述方法中步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)的反应式为：
3.如权利要求1所述的化合物的用途，在制备预防和治疗乙型肝炎药物中的应用。
4.如权利要求2所述的化合物的用途，在制备预防和治疗肝硬化等疾病药物中的应用。
抗乙肝药物LQC-X的合成及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及化学和生物科学领域，具体涉及到LQC-X结构通式I及其中间体的合成和应用，其中LQC-X6小鼠单日单次最大给药剂量2000mg/kg，连续观察7天，未出现毒性反应，表明该药物安全性非常高，药效学实验证明该类化合物有明显的抗乙肝病毒作用及保肝降酶作用。可用于制备预防和治疗乙型肝炎、慢性肝硬化等疾病的药物。
[0002]
[0003] LQC-X结构通式I
[0004]
背景技术
[0005] 乙型病毒(Hepatitis B virus，HBV)性肝炎及由此所诱发的肝硬化、肝癌是威胁人类生命健康的重大疾病之一，目前尚未有有效的治疗手段，除疫苗外，干扰素、拉米夫定等广泛应用于临床，由于副作用大，价格贵，病毒反跳等受到了极大的限制，因此，寻找抗乙肝病毒药物，一直是广大生物学家、化学家面临的重大课题。
[0006] 齐墩果酸具有消炎、抗肿瘤和抗高血脂等多方面的药理作用，在多种中药及复方中均作为指标性成分，目前已作为常用保肝OTC药物用于治疗急性化学性肝损伤、慢性肝硬化和肝纤维化【席佳，等.齐墩果酸口服制剂及其体内药动学研究进展[J].中国新药杂志，2009，(06)：507-510】，以该化合物为活性先导进行结构修饰多以抗肿瘤为筛选指标【郑开波，等.齐墩果酸结构修饰及抗肿瘤活性的研究进展[J].黔南民族师范学院学报，2009，(06)：11-14】。
[0007] 本发明利用体内外抗乙肝病毒模型，从多种齐墩果酸结构修饰物中筛选出一类抗乙肝病毒作用较为明确的化合物，并命名为LQC-X。
发明内容
[0008] 本发明的目的之一是提供LQC-X的结构通式(式1)。
[0009] 本发明的目的之二是提供LQC-X结构通式I及其中间体的合成工艺路线。
[0010] 本发明的目的之三是提供LQC-X及其中间体在抗乙肝病毒、保肝降酶等方面的应用。
[0011]
[0012] 式1LQC-X结构通式I
[0013]
[0014] 本发明的目的可以通过下列措施来实现：
[0015] 一种合成LQC-X的方法，包括下列步骤：
[0017] (2)将上述生成的化合物LQC-X1溶于有机溶剂，一定温度下与Eosiy发生自由基反应生成化合物LQC-X2；
[0018] (3)将上述生成的化合物LQC-X1溶于有机溶剂，一定温度下与Eosiy发生自由基反应生成化合物LQC-X3；
[0020] (5)将上述生成的化合物LQC-X3溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成化合物LQC-X5；
[0021] (6)将上述生成的化合物LQC-X1溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成化合物LQC-X6；
[0022] (7)将齐墩果酸(化合物1)溶于有机溶剂，一定温度下，与氧化剂发生氧化反应生成化合物LQC-X7；
[0023] (8)将齐墩果酸(化合物1)溶于有机溶剂，一定温度下，与溴代川芎嗪发生反应生成化合物LQC-X8；
[0024] (9)将上述生成的化合物LQC-X1溶于有机溶剂，一定温度下，与溴代川芎嗪发生反应生成化合物LQC-X9；
[0025] (10)将上述生成的化合物LQC-X6溶于有机溶剂，一定温度下，与溴代川芎嗪发生反应生成LQC-X10；
[0026] 上述方法中步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)的反应式为：
[0027]
[0028] 所述合成LQC-X的方法，其中步骤(1)中使用的有机溶剂是含有2-20个碳原子的醚、醇、烷烃、芳香烃、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；溴代试剂为溴代丁二酰亚胺(NBS)、溴化氢、乙酰溴；温度为-20℃至250℃；催化剂是有机碱以吡啶和三乙胺为代表，或波长为290-800nm光源；化合物LQC-X1与溴代试剂的摩尔比为1∶1-20；
[0029] 所述合成LQC-X的方法，其中步骤(2)、步骤(3)中使用的有机溶剂是含有1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为-10℃至150℃；自由基反应试剂为Eosiy；催化剂是波长为290-800nm光源；化合物LQC-X2、LQC-X3与自由基试剂的摩尔比分别为1∶1-10；
[0030] 所述合成LQC-X的方法，其中步骤(4)-(7)中使用的有机溶剂是含有1-20个碳原子的芳香烃、烷烃、醚、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为-20℃至150℃；氧化剂以硫酸、铬酸和Jones试剂为代表；化合物LQC-X4、LQC-X5、LQC-X6和LQC-X7与氧化剂的摩尔比分别为1∶1-10；
[0031] 所述合成LQC-X的方法，其中步骤(8)-(10)中使用的有机溶剂是含有2-20个碳原子的醚、醇、烷烃、芳香烃、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；温度为-20℃至250℃；催化剂是各种碱类，无机碱以碳酸钾为代表；化合物LQC-X8、LQC-X9、LQC-X10与催化剂的摩尔比分别为1∶1-20；
[0032] (11)所述合成LQC-X，体外对HepG2.2.15细胞分泌上清液中的病毒抗原有明显抑制作用；
[0033] (12)所述合成LQC-X，体外对HepG2.2.15细胞病毒HBV-DNA有明显抑制作用；
[0034] (13)所述合成LQC-X6，在雏鸭体内能有效抑制鸭乙肝病毒的复制；
[0035] (14)所述合成LQC-X6，在保护四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤、大鼠慢性肝纤维化作用上，疗效明显，能延缓肝脏的损伤程度；
[0036] (15)所述合成LQC-X6，体内表现较低的毒性，小鼠注射LD50为785.05mg/kg，小鼠灌胃单次最大耐受量为2000mg/kg；
[0037] (16)所述合成LQC-X，可制成口服剂型、注射剂型和外用剂型等多种剂型，应用于乙型肝炎的预防和治疗方面。
具体实施方式
[0038] 以下为本发明化合物的实施例，但这些实施例并不意味着对本发明的限制。
[0039] 制备实施例1LQC-X1的合成
[0040] 将齐墩果酸9.12g(0.02mol)，400ml四氯化碳，4.27gN-溴代丁二酰亚胺(约0.024mol)置于500ml反应瓶中，光照，磁力搅拌加热至74℃回流4小时，反应至无原料，反应结束。回收反应液至干，将回收后的固体用200ml乙酸乙酯热溶，趁热过滤，室温放置24小时析晶，得到大量粗晶，乙酸乙酯重结晶一次，得到LQC-X1，白色片状结晶7.13g，反应产率为78.5％。m.p.276.7-278.4℃。
[0041] LQC-X1相关图谱数据：
[0042] ESI-MS：[M-1]-453
[0043] 1H-NMR(500MHZ，CDCl3)：083，0.93，0.97，1.00，1.05，1.06，1.20(3H，each，s，7×CH3)2.99(m，1H，3-OH)，3.28(m，1H，H-3)，5.58(d，1H，J＝5.5HZ，H-12)，5.62(d，1H，J＝
5.5HZ，H-11).1.000～2.500(24H，三帖母核结构中的亚甲基和次甲基氢信号)；
5.5HZ，H-11).1.000～2.500(24H，三帖母核结构中的亚甲基和次甲基氢信号)；
[0044] 13C-NMR(500MHZ，CDCl3)：38.9(C-1)，37.1(C-2)，78.7(C-3)，38.9(C-4)，51.2(C-5)，18.2(C-6)，33.8(C-7)，40.7(C-8)，154.7(C-9)，42.4(C-10)，120.7(C-11)，
115.6(C-12)，144.9(C-13)，45.9(C-14)，27.9(C-15)，23.6(C-16)，45.9(C-17)，
39.4(C-18)，25.1(C-19)，30.7(C-20)，32.2(C-21)，32.2(C-22)，28.3(C-23)，15.7(C-24)，
20.2(C-25)，20.4(C-26)，27.0(C-27)，183.5(C-28)，32.9(C-29)，23.6(C-30).[0045] 制备实施例2LQC-X2的合成
115.6(C-12)，144.9(C-13)，45.9(C-14)，27.9(C-15)，23.6(C-16)，45.9(C-17)，
39.4(C-18)，25.1(C-19)，30.7(C-20)，32.2(C-21)，32.2(C-22)，28.3(C-23)，15.7(C-24)，
20.2(C-25)，20.4(C-26)，27.0(C-27)，183.5(C-28)，32.9(C-29)，23.6(C-30).[0045] 制备实施例2LQC-X2的合成
[0046] 称取LQC-X1约4.54g(0.01mol)，溶于500ml二氯甲烷中，加入Eosiy(醇溶)200mg，通气，光照反应10h。反应结束后，用3倍量饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次，水洗至中性，无水硫酸钠除水，回收二氯甲烷，过硅胶柱，石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1洗脱。得LQC-X2，共2.05g，反应产率42.0％。
[0047] LQC-X2相关图谱数据：
[0048] ESI-MS[M-1]-487
[0049] 1H-NMR(500MHZ，CDCl3)：0.86，0.98，0.99，1.02，1.08，1.28，1.27(3H，each，s，7×CH3)，3.01(1H，m，H-3)，3.25(1H，m，3-OH)，6.02(1H，s，H-12)，1.000～2.500(24H，三帖母核结构中的亚甲基和次甲基氢信号)；
[0050] 13C-NMR(500MHZ，CDCl3)：36.7(C-1)，27.2(C-2)，77.9(C-3)，40.5(C-4)，50.3(C-5)，17.3(C-6)，34.0(C-7)，39.4(C-8)，87.8(C-9)，36.4(C-10)，192.4(C-11)，
121.6(C-12)，178.7(C-13)，41.8(C-14)，27.5(C-15)，20.2(C-16)，46.0(C-17)，
44.0(C-18)，43.6(C-19)，29.7(C-20)，31.6(C-21)，34.1(C-22)，28.1(C-23)，16.0(C-24)，
14.2(C-25)，23.2(C-26)，24.4(C-27)，184.0(C-28)，33.2(C-29)，23.8(C-30).[0051] 制备实施例3LQC-X3的合成
121.6(C-12)，178.7(C-13)，41.8(C-14)，27.5(C-15)，20.2(C-16)，46.0(C-17)，
44.0(C-18)，43.6(C-19)，29.7(C-20)，31.6(C-21)，34.1(C-22)，28.1(C-23)，16.0(C-24)，
14.2(C-25)，23.2(C-26)，24.4(C-27)，184.0(C-28)，33.2(C-29)，23.8(C-30).[0051] 制备实施例3LQC-X3的合成
[0052] 称取LQC-X1约4.54g(0.01mol)，溶于500ml二氯甲烷中，加入Eosiy(醇溶)200mg，通气，光照反应10h。反应结束后，用3倍量饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次，水洗至中性，无水硫酸钠除水，回收二氯甲烷，过硅胶柱，石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1洗脱。LQC-X3反应产率约为10％。
[0053] LQC-X3相关图谱数据：
[0054] 1H-NMR(500MHZ，CDCl3)：0.83，0.96，0.99，1.03，1.05，1.20，1.21(3H，each，s，7×CH3)，3.22(1H，m，H-3)，4.33(1H，d，J＝2.5HZ，H-11)，5.38(1H，d，J＝2.5HZ，H-12)，
1.000～2.500(24H，三帖母核结构中的亚甲基和次甲基氢信号)；
1.000～2.500(24H，三帖母核结构中的亚甲基和次甲基氢信号)；
[0055] 13C-NMR(500MHZ，CDCl3)：37.0(C-1)，27.2(C-2)，78.4(C-3)，39.3(C-4)，50.8(C-5)，17.6(C-6)，34.2(C-7)，37.7(C-8)，78.9(C-9)，37.2(C-10)，65.7(C-11)，
118.0(C-12)，119.2(C-13)，44.0(C-14)，27.7(C-15)，20.7(C-16)，47.7(C-17)，
51.4(C-18)，43.5(C-19)，29.7(C-20)，32.9(C-21)，34.2(C-22)，28.1(C-23)，15.5(C-24)，
15.4(C-25)，25.0(C-26)，24.6(C-27)，179.4(C-28)，33.3(C-29)，24.0(C-30).[0056] 制备实施例4LQC-X4的合成
118.0(C-12)，119.2(C-13)，44.0(C-14)，27.7(C-15)，20.7(C-16)，47.7(C-17)，
51.4(C-18)，43.5(C-19)，29.7(C-20)，32.9(C-21)，34.2(C-22)，28.1(C-23)，15.5(C-24)，
15.4(C-25)，25.0(C-26)，24.6(C-27)，179.4(C-28)，33.3(C-29)，24.0(C-30).[0056] 制备实施例4LQC-X4的合成
[0057] 称取LQC-X2约500mg，50ml丙酮溶解于100ml反应瓶中，在冰水浴下缓慢滴加4ml配制的铬酸溶液(1.6mmol)，5min内滴完。反应至无原料，反应结束。将反应液倒入600ml的冰水混合物里，搅拌，放置过夜，抽滤。滤饼用乙醇反复结晶，即得LQC-X4。反应产率为90％。
[0058] LQC-X4相关图谱数据：
[0059] 1H-NMR(600MHZ，CDCl3)：0.95，0.95，1.00，1.10，1.13，1.37，1.49(3H，each，s，7×CH3)，6.02(1H，s，H-12)，1.000～2.500(24H，三帖母核结构中的亚甲基和次甲基氢信号)；
[0060] 13C-NMR(600MHZ，CDCl3)：36.7(C-1)，33.1(C-2)，215.4(C-3)，37.0(C-4)，50.8(C-5)，18.3(C-6)，34.0(C-7)，39.8(C-8)，87.8(C-9)，47.6(C-10)，192.0(C-11)，
122.8(C-12)，178.5(C-13)，41.7(C-14)，25.8(C-15)，20.2(C-16)，46.1(C-17)，
44.0(C-18)，43.5(C-19)，33.1(C-20)，31.6(C-21)，34.0(C-22)，29.9(C-23)，21.4(C-24)，
23.0(C-25)，24.3(C-26)，26.3(C-27)，182.1(C-28)，33.1(C-29)，23.8(C-30).[0061] 制备实施例5LQC-X5的合成
122.8(C-12)，178.5(C-13)，41.7(C-14)，25.8(C-15)，20.2(C-16)，46.1(C-17)，
44.0(C-18)，43.5(C-19)，33.1(C-20)，31.6(C-21)，34.0(C-22)，29.9(C-23)，21.4(C-24)，
23.0(C-25)，24.3(C-26)，26.3(C-27)，182.1(C-28)，33.1(C-29)，23.8(C-30).[0061] 制备实施例5LQC-X5的合成
[0062] 称取LQC-X3约500mg，50ml丙酮溶解于100ml反应瓶中，在冰水浴下缓慢滴加4ml配制的铬酸溶液(1.6mmol)，5min内滴完。反应至无原料，反应结束。将反应液倒入600ml的冰水混合物里，搅拌，放置过夜，抽滤。滤饼用乙醇反复结晶，即得LQC-X5。反应产率为95％。
[0063] LQC-X5相关图谱数据：
[0064] 1H-NMR(500MHZ，CDCl3)：0.86，0.96，1.11，1.16，1.20，1.21，1.26(3H，each，s，7×CH3)，3.20(1H，d，J＝2.5HZ，H-11)，5.29(1H，d，J＝2.5HZ，H-12)，1.000～2.500(24H，三帖母核结构中的亚甲基和次甲基氢信号)；
[0065] 13C-NMR(500MHZ，CDCl3)：34.0(C-1)，33.8(C-2)，215.4(C-3)，47.1(C-4)，48.9(C-5)，19.1(C-6)，30.9(C-7)，43.0(C-8)，78.4(C-9)，34.0(C-10)，50.0(C-11)，
121.5(C-12)，144.2(C-13)，38.1(C-14)，28.8(C-15)，27.1(C-16)，49.2(C-17)，
41.6(C-18)，46.4(C-19)，31.0(C-20)，40.7(C-21)，29.7(C-22)，21.8(C-23)，20.8(C-24)，
17.3(C-25)，14.8(C-26)，20.7(C-27)，180.3(C-28)，27.7(C-29)，24.7(C-30).[0066] 制备实施例6LQC-X6的合成
121.5(C-12)，144.2(C-13)，38.1(C-14)，28.8(C-15)，27.1(C-16)，49.2(C-17)，
41.6(C-18)，46.4(C-19)，31.0(C-20)，40.7(C-21)，29.7(C-22)，21.8(C-23)，20.8(C-24)，
17.3(C-25)，14.8(C-26)，20.7(C-27)，180.3(C-28)，27.7(C-29)，24.7(C-30).[0066] 制备实施例6LQC-X6的合成
[0067] 称取LQC-X1约0.62g(约1.5mmol)，50ml丙酮溶解于100ml反应瓶中，在冰水浴下缓慢滴加4ml配制的铬酸溶液(1.6mmol)，5min内滴完。反应至无原料，反应结束。将反应液倒入600ml的冰水混合物里，搅拌，抽滤。滤饼拌样，过硅胶柱。石油醚∶乙酸乙酯＝100∶1洗脱，即得0.46g LQC-X6。反应产率67.3％，m.p.154.2-155.1℃。
[0068] LQC-X6相关图谱数据：
[0069] 1H-NMR(500MHZ，CDCl3)：0.93，0.97，1.03，1.06，1.08，1.13，1.26(3H，each，s，7×CH3)5.61(d，1H，J＝6.0HZ，H-12)，5.67(d，1H，J＝5.5HZ，H-11).
[0070] 13C-NMR(500MHZ，CDCl3)：38.3(C-1)，37.7(C-2)，217.1(C-3)，47.3(C-4)，51.8(C-5)，19.5(C-6)，33.7(C-7)，40.7(C-8)，152.7(C-9)，42.6(C-10)，120.7(C-11)，
117.4(C-12)，145.4(C-13)，45.9(C-14)，27.0(C-15)，23.6(C-16)，45.8(C-17)，
39.5(C-18)，26.0(C-19)，30.7(C-20)，34.5(C-21)，32.1(C-22)，31.3(C-23)，21.3(C-24)，
20.0(C-25)，20.1(C-26)，26.0(C-27)，182.7(C-28)，32.9(C-29)，23.6(C-30).[0071] 制备实施例7LQC-X7的合成
117.4(C-12)，145.4(C-13)，45.9(C-14)，27.0(C-15)，23.6(C-16)，45.8(C-17)，
39.5(C-18)，26.0(C-19)，30.7(C-20)，34.5(C-21)，32.1(C-22)，31.3(C-23)，21.3(C-24)，
20.0(C-25)，20.1(C-26)，26.0(C-27)，182.7(C-28)，32.9(C-29)，23.6(C-30).[0071] 制备实施例7LQC-X7的合成
[0072] 称取化合物1约0.62g(约1.5mmol)，50ml丙酮溶解于100ml反应瓶中，在冰水浴下缓慢滴加4ml配制的铬酸溶液(1.6mmol)，5min内滴完。反应至无原料，反应结束。将反应液倒入600ml的冰水混合物里，搅拌，抽滤。滤饼拌样，过硅胶柱。石油醚∶乙酸乙酯＝50∶1洗脱，即得0.50g LQC-X7。反应产率73.15％，m.p.211.8-212.7℃。
[0073] LQC-X7相关图谱数据：
[0074] 1H-NMR(500MHZ，CDCl3)：0.82，0.93，0.96，1.01，1.05，1.08，1.19(s，3H，each，7×CH3)，3.22(m，1H，3，β-CH)，5.24(brs，1H，12-CH)，1.000～2.500(24H，三帖母核结构中的亚甲基和次甲基氢信号)；
[0075] 13C-NMR(500MHZ，CDCl3)：38.5(C-1)，27.3(C-2)，219.0(C-3)，38.8(C-4)，54.2(C-5)，18.3(C-6)，33.3(C-7)，38.8(C-8)，47.6(C-9)，37.6(C-10)，24.7(C-11)，
122.5(C-12)，144.6(C-13)，41.5(C-14)，27.7(C-15)，23.2(C-16)，45.9(C-17)，
41.8(C-18)，45.7(C-19)，30.6(C-20)，32.9(C-21)，32.3(C-22)，28.1(C-23)，15.6(C-24)，
15.3(C-25)，16.8(C-26)，25.9(C-27)，177.3(C-28)，32.5(C-29)，24.4(C-30).[0076] 制备实施例8LQC-X8的合成
122.5(C-12)，144.6(C-13)，41.5(C-14)，27.7(C-15)，23.2(C-16)，45.9(C-17)，
41.8(C-18)，45.7(C-19)，30.6(C-20)，32.9(C-21)，32.3(C-22)，28.1(C-23)，15.6(C-24)，
15.3(C-25)，16.8(C-26)，25.9(C-27)，177.3(C-28)，32.5(C-29)，24.4(C-30).[0076] 制备实施例8LQC-X8的合成
[0077] 将脱水川芎嗪10g溶于60mlCCl4中，再按照摩尔比川芎嗪∶NBS＝1∶0.7投入NBS 9.17g(可以加入微量的过氧化苯甲酰为自由基引发剂)，在白炽灯照射下，回流反应10～12h，冷却，浓缩，于60～70℃水浴中减压情况下抽走过量的川芎嗪，残余物至冰箱中静置。得到淡红色半油状物7.75g，产率70％。
[0078] 2-溴代甲基-3，5，6-三甲基吡嗪3.26mmol、齐墩果酸3.26mmol置于150ml三颈瓶中，加入80ml四氢呋喃溶剂，加入9mmol的碳酸钾，加热回流2.5h，TLC监测反应原料基本消失，停止反应，过滤除去碳酸钾，滤液浓缩至少量四氢呋喃，加入4g硅胶减压蒸干拌样，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶2洗脱，得到LQC-X8，白色粉末状物1.26g，产率65.6％，熔点133.8～134.4℃，
[0079] LQC-X8氢谱和碳谱数据如下：
[0080] 1H-NMR(500MHZ，CDCl3)：0.552，0.799，0.895，0.907，0.927，1.002，1.127(s，3H，each，7×CH3)，3.225(m，1H，3，β-CH)，5.257(brs，1H，12-CH)，5.257(q，2H，O-CH2)，
2.575(s，3H，6-CH3)，2.536(s，3H，5-CH3)，2.516(s，3H，3-CH3)，1.000～2.500(24H，三帖母核结构中的亚甲基和次甲基氢信号)；
2.575(s，3H，6-CH3)，2.536(s，3H，5-CH3)，2.516(s，3H，3-CH3)，1.000～2.500(24H，三帖母核结构中的亚甲基和次甲基氢信号)；
[0081] 13C-NMR(500MHZ，CDCl3)：38.4(C-1)，27.2(C-2)，79.0(C-3)，38.8(C-4)，55.2(C-5)，18.3(C-6)，33.1(C-7)，39.2(C-8)，47.6(C-9)，37.0(C-10)，23.7(C-11)，
122.5(C-12)，143.6(C-13)，41.7(C-14)，27.6(C-15)，23.1(C-16)，46.9(C-17)，
41.3(C-18)，45.9(C-19)，30.7(C-20)，33.9(C-21)，32.7(C-22)，28.1(C-23)，15.6(C-24)，
15.3(C-25)，16.8(C-26)，25.9(C-27)，177.2(C-28)，32.4(C-29)，23.4(C-30)，
64.9(O-CH2-)；吡 嗪 环 上 δC：150.9(C-2)，145.5(C-3)，148.9(C-5)，149.1(C-6)，
21.6(6-CH3)，21.4(5-CH3)，20.5(3-CH3)；
122.5(C-12)，143.6(C-13)，41.7(C-14)，27.6(C-15)，23.1(C-16)，46.9(C-17)，
41.3(C-18)，45.9(C-19)，30.7(C-20)，33.9(C-21)，32.7(C-22)，28.1(C-23)，15.6(C-24)，
15.3(C-25)，16.8(C-26)，25.9(C-27)，177.2(C-28)，32.4(C-29)，23.4(C-30)，
64.9(O-CH2-)；吡 嗪 环 上 δC：150.9(C-2)，145.5(C-3)，148.9(C-5)，149.1(C-6)，
21.6(6-CH3)，21.4(5-CH3)，20.5(3-CH3)；
[0082] 制备实施例9LQC-X9的合成
[0083] 2-溴代甲基-3，5，6-三甲基吡嗪0.15mol、0.15mol LQC-X1置于500ml三颈瓶中，加入300ml四氢呋喃待混合物溶解后，加入50g的碳酸钾，加热回流2.5h，TLC监测反应原料基本消失，停止反应，反应液中加入5倍量乙酸乙酯，以饱和NaCl水液洗涤3次，分取有机层蒸干，适量丙酮复溶，硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1或石油醚∶丙酮＝10∶1，得到白色粉末状物LQC-X9，产率70％，熔点220.8～221.5℃。
[0084] LQC-X9氢谱和碳谱数据如下：
[0085] 1H-NMR(500MHZ，CDCl3)：0.799，0.837，0.927，1.007，1.032，1.089，1.185(s，3H，each，7×CH3)，3.032(m，1H，H-3)，5.573(d，1H，J＝5.5HZ，H-12)，5.585(d，1H，J＝5.5HZ，H-12)，5.199(q，2H，O-CH2)，2.579(s，3H，6-CH3)，2.538(s，3H，5-CH3)，2.512(s，3H，3-CH3)，1.000～2.500(24H，三帖母核结构中的亚甲基和次甲基氢信号)；
[0086] 13C-NMR(500MHZ，CDCl3)：38.8(C-1)，37(C-2)，78.5(C-3)，38.7(C-4)，51.0(C-5)，18.2(C-6)，33.8(C-7)，39.5(C-8)，154.6(C-9)，42.3(C-10)，120.5(C-11)，115.7(C-12)，
144.6(C-13)，45.8(C-14)，27.8(C-15)，23.7(C-16)，45.9(C-17)，39.5(C-18)，
25.2(C-19)，30.7(C-20)，33.0(C-21)，32.7(C-22)，28.1(C-23)，15.3(C-24)，20.1(C-25)，
20.2(C-26)，26.9(C-27)，177.3(C-28)，32.8(C-29)，23.5(C-30)，64.8(O-CH2-)；吡 嗪 环上 δC：150.9(C-2)，145.6(C-3)，148.8(C-5)，150.9(C-6)，21.7(6-CH3)，21.5(5-CH3)，
20.3(3-CH3)；
144.6(C-13)，45.8(C-14)，27.8(C-15)，23.7(C-16)，45.9(C-17)，39.5(C-18)，
25.2(C-19)，30.7(C-20)，33.0(C-21)，32.7(C-22)，28.1(C-23)，15.3(C-24)，20.1(C-25)，
20.2(C-26)，26.9(C-27)，177.3(C-28)，32.8(C-29)，23.5(C-30)，64.8(O-CH2-)；吡 嗪 环上 δC：150.9(C-2)，145.6(C-3)，148.8(C-5)，150.9(C-6)，21.7(6-CH3)，21.5(5-CH3)，
20.3(3-CH3)；
[0087] 制备实施例10LQC-X10的合成
[0088] 2-溴代甲基-3，5，6-三甲基吡嗪0.15mol、0.15mol LQC-X6置于500ml三颈瓶中，加入300ml四氢呋喃待混合物溶解后，加入50g的碳酸钾，加热回流2.5h，TLC监测反应原料基本消失，停止反应，反应液中加入5倍量乙酸乙酯，以饱和NaCl水液洗涤3次，分取有机层蒸干，适量丙酮复溶，硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1或石油醚∶丙酮＝10∶1，得到白色粉末状物LQC-X10，产率65％，熔点119.2～120.8℃。
[0089] LQC-X10氢谱和碳谱数据如下：
[0090] 1H-NMR(500MHZ，CDCl3)：0.821，0.903，0.946，1.033，1.056，1.105，1.235(s，3H，each，7×CH3)，5.578(d，1H，J＝6.0HZ，H-12)，5.589(d，1H，J＝5.5HZ，H-12)，5.197(q，2H，O-CH2)，2.582(s，3H，6-CH3)，2.560(s，3H，5-CH3)，2.512(s，3H，3-CH3)，1.000～2.500(24H，三帖母核结构中的亚甲基和次甲基氢信号)；
[0091] 13C-NMR(500MHZ，CDCl3)：38.3(C-1)，37.7(C-2)，217.6(C-3)，47.3(C-4)，51.8(C-5)，19.5(C-6)，33.8(C-7)，40.7(C-8)，152.8(C-9)，42.5(C-10)，120.3(C-11)，
117.5(C-12)，145.2(C-13)，45.9(C-14)，27.6(C-15)，23.6(C-16)，45.9(C-17)，
39.2(C-18)，25.7(C-19)，30.7(C-20)，33.9(C-21)，32.6(C-22)，31.4(C-23)，21.3(C-24)，
20.4(C-25)，20.8(C-26)，26.4(C-27)，177.0(C-28)，32.9(C-29)，23.7(C-30)，
64.8(O-CH2-)；吡 嗪 环 上 δC：150.8(C-2)，145.4(C-3)，148.7(C-5)，148.9(C-6)，
21.5(6-CH3)，21.4(5-CH3)，20.4(3-CH3)；
117.5(C-12)，145.2(C-13)，45.9(C-14)，27.6(C-15)，23.6(C-16)，45.9(C-17)，
39.2(C-18)，25.7(C-19)，30.7(C-20)，33.9(C-21)，32.6(C-22)，31.4(C-23)，21.3(C-24)，
20.4(C-25)，20.8(C-26)，26.4(C-27)，177.0(C-28)，32.9(C-29)，23.7(C-30)，
64.8(O-CH2-)；吡 嗪 环 上 δC：150.8(C-2)，145.4(C-3)，148.7(C-5)，148.9(C-6)，
21.5(6-CH3)，21.4(5-CH3)，20.4(3-CH3)；
[0092] 效果实施例1LQC-X对HepG2.2.15细胞乙肝病毒标志物的影响
[0093] 1.材料
[0094] 1.1细胞
[0095] HepG2.2.15细胞株由解放军302医院传染病研究所传代保种。
[0096] 1.2实验药物
[0097] LQC-X系列化合物(自制)，液相色谱(HPLC)分析进行纯度鉴定，纯度≥98％，符合实验要求。粉末密封好保存于4℃。用无水乙醇溶解为5ml/mg的储存液备用。
[0098] 2.方法
[0099] 2.1细胞培养：
[0100] 将HepG2.2.15细胞复苏，进行传代培养，待细胞生长稳定，进行下步实验。用胰酶消化细胞，制成细胞悬液。用细胞板计数，计算细胞量，加完全培养液，配置一定细胞浓度。
[0101] 2.2细胞增殖抑制实验
[0102] 取对数生长期的细胞，以1×105/ml密度接种于96孔板，每孔100μl。于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。吸弃培养液，加入200μl不同浓度的LQC-X溶液(以含10％小牛血清DMEM培养液配制不同的终浓度)，每一浓度设4个平行孔。培养144h后，小心吸弃孔内培养上清，每孔加入5％小牛血清DMEM培养液100μl，每孔再加MTS 20μl，混匀，于
37℃5％CO2培养箱孵育3h，用酶标定量测试仪，490nm处测吸光度。实验重复3次。计算抑制率。
37℃5％CO2培养箱孵育3h，用酶标定量测试仪，490nm处测吸光度。实验重复3次。计算抑制率。
[0103] 细胞生长抑制率(％)＝[(对照组平均OD值-用药组平均OD值)/对照组平均OD值]×100％
[0104] 2.3LQC-X对HepG2.2.15细胞分泌上清中抗原的抑制实验
[0105] 按实验设计将试验药物配成无毒浓度以下四个浓度，分别加入96孔板，每浓度复孔4孔，同时设不加药的纯培养液孔为阴性对照组。以拉米夫定为阳性对照。设四个浓度，每浓度复孔4孔。用药4天后收上清，置-20℃保存待测。
[0106] 将-20℃保存的细胞上清液置37℃水浴融化，通过ELISA法检测，用公式分别计算抑制率。
[0107] 抑制率＝[对照孔OD值-实验孔OD值]/对照孔OD值×100％
[0108] ELISA实验过程：
[0109] (1)每孔加入待测化合物100μl，设阴、阳性对照孔，并设空白对照孔1孔。置37℃孵育1小时。
[0110] (2)手工洗板：弃去孔内液体，PBS洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复3次后拍干。
[0111] (3)除空白对照孔外，每孔加入酶结合物100μl，充分混匀封板，置37℃孵育30分钟。
[0112] (4)手工洗板：弃去孔内液体，PBS洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复4次后拍干。
[0113] (5)每孔加显色剂A液，B液各一滴，充分混匀，封板，置37℃孵育15分钟。
[0114] (5)每孔加入终止液一滴混匀。
[0115] (6)酶标450nm处检测OD值，选用空白孔调零，然后读取各孔的值。
[0116] 2.4LQC-X对HepG2.2.15细胞分泌上清中抗原的抑制实验
[0117] 收集几种化合物处理HepG2.2.15细胞后第4d、8d的培养液，按乙肝病毒核酸定量检测试剂盒中操作说明，检测上清液中HBV-DNA含量。
[0118] 3.结果
[0119] 3.1细胞增殖抑制实验结果
[0120] LQC-X系列10个化合物中有8个对体外培养的HepG2.2.15细胞具有呈剂量依赖性的增殖抑制作用，结果如表1-1。其中LQC-X6、LQC-X7、LQC-X8、LQC-X9尤为明显，当药物浓度为12.5μg/ml时，对细胞的抑制率基本超过50％，随着药物浓度的增加，抑制率逐渐上升，当药物浓度为50μg/ml时，对细胞的抑制率分别达到96.15％、95.83％、94.85％和94.28％。实验结果表明LQC-X系列化合物对细胞的抑制作用有较好的选择性，其效果与药物浓度和作用时间呈正相关。化合物LQC-X6、LQC-X7、LQC-X8、LQC-X9由于有显著的抑制细胞增殖作用，初步推断其在抗肿瘤方面具有一定的疗效。
[0121] 表1-1LQC-X对HepG2.2.15的增殖抑制作用
[0122]
[0123] 3.2LQC-X对HepG2.2.15细胞分泌上清中抗原的抑制结果
[0124] 由表1-2、1-3可知，LQC-X系列化合物对HepG2.2.15细胞分泌的乙肝病毒抗原均有一定的抑制作用。LQC-X6在无毒浓度以下对表面抗原(HBsAg)具有显著的抑制作用，较其他化合物和阳性药为优，且有一定的剂量依赖性。LQC-X6、LQC-X7、LQC-X8和LQC-X9在无毒浓度以下对e抗原(HBeAg)具有显著的抑制作用，作用较阳性药为优。
[0125] 表1-2LQC-X对HepG2.2.15细胞分泌上清中表面抗原的抑制作用
[0126]
[0127]
[0128]
[0129] 表1-3LQC-X对HepG2.2.15细胞分泌上清中e抗原的抑制作用
[0130]
[0131]
[0132]
[0133]
[0134] 3.3LQC-X对HepG2.2.15细胞HBV-DNA的抑制结果
[0135] LQC-X7在4d及8d时，对HBV-DNA的增殖均有一定的抑制作用，LQC-X6在8天时有显著的抑制HBV-DNA的增殖作用，结果如表1-4。
[0136] 表1-4LQC-X对HepG2.2.15细胞HBV-DNA的抑制结果
[0137]
[0138]
[0139]
[0140]
[0141] 4.结论
[0142] LQC-X系列化合物，对细胞分泌的乙肝抗原均有一定的抑制作用。其中，LQC-X6可显著抑制HepG2.2.15细胞分泌上清中分泌的HBsAg和HBeAg，在细胞给药8天时，对乙肝病毒HBV-DNA的抑制较为明显。因此，LQC-X6具有较为显著的体外抗乙肝病毒活性。
[0143] 效果实施例2LQC-X6体内抗鸭乙肝病毒的研究
[0144] 1.材料
[0145] 1.1动物
[0146] 1日龄北京鸭30只，雄性，体重约60g。
[0147] 1.2实验药物
[0148] LQC-X6(自制)，拉米夫定，由生物技术所提供。粉末密封好保存于4℃。
[0149] 1.3病毒
[0150] 鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)强阳性血清，测定其DHBV滴度，根据与定量克隆DHBV-DNA比较，计算每毫升血清所含的病毒颗粒数，一70℃保存；或DHBV质粒。
[0151] 2.方法
[0152] 2.1复制鸭乙型肝炎病毒感染模型
[0153] 取1日龄北京鸭30只，随机分成5组：模型对照组、阳性对照组、化合物高、中、低剂量组。每组6只。1～3d内，每只经腿胫静脉注射0.2ml DHBV-DNA强阳性鸭血清，接种7 9
病毒量在7.5×10 ～5×10。
病毒量在7.5×10 ～5×10。
[0154] 2.2药物治疗
[0155] 在感染后7d自鸭腿胫静脉取血，分离血清，为治疗前样本(T0)，一70℃保存待检。DHBV感染雏鸭7d后进行药物治疗试验，化合物高、中、低剂量组每天分别给予100、50和
25mg/kg，阳性对照组每天给予拉米夫定50mg/kg，模型对照组给予生理盐水。按体重给药
2ml/kg，灌胃给药，每日2次，连续10d，在用药第5天(T5)，第10天(T10)和停药后第3天(P3)，自鸭腿胫静脉取血，分离血清，一70℃保存待检。
25mg/kg，阳性对照组每天给予拉米夫定50mg/kg，模型对照组给予生理盐水。按体重给药
2ml/kg，灌胃给药，每日2次，连续10d，在用药第5天(T5)，第10天(T10)和停药后第3天(P3)，自鸭腿胫静脉取血，分离血清，一70℃保存待检。
[0156] 2.3鸭血清DHBV-DNA的检测
[0157] 采用DHBV-DNA Dot Blot法测定。取上述鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中32
DHBV-DNA水平，观察其动态变化。按缺口翻译试剂盒说明书方法，用 P标记DHBV-DNA探针，将40μl血清点于硝酸纤维膜上，然后杂交，放射自显影，在酶标检测仪上测定OD值(波长为490nm)。计算血清DHBV-DNA密度，以杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值。
DHBV-DNA水平，观察其动态变化。按缺口翻译试剂盒说明书方法，用 P标记DHBV-DNA探针，将40μl血清点于硝酸纤维膜上，然后杂交，放射自显影，在酶标检测仪上测定OD值(波长为490nm)。计算血清DHBV-DNA密度，以杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值。
[0158] 2.4药效计算
[0159] 计算每组不同时间点血清DHBV-DNA水平的 各组用药前后比较采用配对t检验，计算DHBV-DNA抑制率，比较各组鸭血清DHBV-DNA抑制率的动态变化。给药组与病毒对照组比较，采用成组t检验。
[0160] DHBV-DNA抑制率＝(给药前OD值一给药后OD值)/给药前OD值×100％
[0161] 3.实验结果
[0162] LQC-X6中、高剂量组分别与感染前病毒滴度比较，均有一定差异，随治疗天数的增加，疗效增加，且呈剂量依赖性。停药三天后，LQC-X6高剂量组对病毒的抑制作用强于拉米夫定的作用，说明LQC-X6在对抗乙肝药物治疗后的反跳现象上，具有优越性。结果见表2-2。表明该化合物对鸭乙肝病毒有一定的抑制作用。
[0163] 表2-1 LQC-X6治疗组与病毒感染对照组鸭血清
[0164] DHBV-DNA OD值比较
[0165]
[0166] 统计处理：t1，p1：给药组不同时间(T5、T10，P3)鸭血清DHBV-DNAOD值与感染前(T0)OD值比较(配对t检验)。*p1＜0.05，**p1＜0.01。
[0167] 表2-2 药物治疗组与病毒感染对照组鸭血清
[0168] DHBV-DNA水平仰制率的比较.
[0169]
[0170] 统计处理：t2，p2：给药组不同时间(T5、T10，P3)鸭血清DHBV-DNA水平与感染前(T0)比较的抑制％与病毒对照组抑制％比较(成组t检验)。*p＜0.05，**p2＜0.01。
[0171] 4.结论
[0172] LQC-X6在雏鸭体内具有显著抑制鸭乙肝病毒作用，且呈一定量效关系。
[0173] 效果实施例3LQC-X6对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用
[0174] 1.材料
[0175] 1.1实验动物
[0176] 健康昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄各半，维通利华实验动物中心提供。
[0177] 1.2实验药物
[0178] LQC-X6(由本实验室自行合成)，批号20100315，液相色谱(HPLC)分析进行纯度鉴定，纯度≥98％，符合实验要求，实验时用生理盐水配制；四氯化碳，北京市化学试剂厂，批号20021113。
[0179] 2.方法
[0180] 2.1分组与给药
[0181] 小鼠被随机分为3组，每组10只：样品组(LQC-X6，40mg/kg)，空白对照组及模型组(等体积生理盐水)，灌胃给药1次/d，连续给药14d。期间，每日观察小鼠的一般活动、皮毛、粪便等情况。
[0182] 2.2复制急性肝损伤模型
[0183] 第7、14天给药1h后，除空白对照组外其余各组均腹腔注射0.2％CCl4橄榄油溶液10ml/kg，禁食24h，称量体重，摘眼球取血，3000r/min离心，取上清，并快速取出肝脏、脾脏称重。
[0184] 2.3生化指标测定
[0185] 血清ALT、AST的活性，由北京中医药大学第三附属医院检测。
[0186] 2.4病理学检查
[0188] 2.5统计学方法
[0190] 3.实验结果
[0191] 3.1生化指标
[0192] 模型组与空白对照组比较，血清ALT、AST活性明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，LQC-X6组血清AL T、AST水平均显著降低(P＜0.01)。结果见表1。
[0193] 表3-1各组小鼠血清检查指标
[0194]
[0195] 注：与空白组比较△△P＜0.01；与模型组比较**P＜0.01。
[0196] 3.2肝脏形态学变化
[0197] 肉眼所见：空白对照组肝脏呈现红褐色，质地软而富有弹性；模型组的肝脏体积明显增大，质脆，表面呈微黄色，且附有油性物质；LQC-X6组肝脏大小及颜色均界于模型组与空白对照组之间。
[0198] 光镜所见：空白对照组小鼠肝小叶结构正常、清晰，细胞排列整齐，大小均匀，细胞核位于细胞中央，圆而边界清楚；模型组小鼠肝细胞明显水肿、气球样变，肝细胞排列紊乱、拥挤，可见肝细胞索解离，肝小叶内点状坏死，汇管区有大量炎细胞浸润；而LQC-X6给药组大部分肝细胞结构完整，排列整齐，肝细胞水肿、气球样变及炎细胞浸润均明显减轻。
[0199] 4.结论
[0200] 4.1LQC-X6可显著降低四氯化碳所致肝损伤小鼠的生化指标。
[0201] 4.2LQC-X6可显著减缓四氯化碳所致肝损伤小鼠的肝脏损伤程度，阻滞肝脏损伤过程。
[0202] 效果实施例4LQC-X6对四氯化碳所致大鼠慢性肝纤维化的保护作用
[0203] 1.实验材料
[0204] 1.1实验动物
[0205] SPF级SD大鼠，体重180～220g，雌雄各半，维通利华实验动物中心提供。
[0206] 1.2实验药物
[0207] 受试药物：LQC-X6，北京中医药大学中药化学实验室合成，批号20100315；阳性对照药：联苯双酯(BPD)，广州星群(药业)股份有限公司生产。
[0208] 1.3试剂
[0209] 四氯化碳(CCl4)，北京市化学试剂厂(分析纯)；橄榄油。
[0210] 1.4仪器
[0211] BP211D万分之一克电子天平，德国赛多利斯；微量加样器，德国；LG一16一W型离心机，北京医用离心机厂；高速低温离心机。
[0212] 2.实验方法
[0213] 2.1给药分组
[0214] 选用SD大鼠，雌雄各半，体重(200±30)g，将动物随机分为6组，即空白对照组，CCl4模型组，联苯双酯阳性组(BPD)，LQC-X6高、低剂量治疗组，LQC-X6高剂量不造模对照组。
[0215] 2.2造模与给药
[0216] 除空白组和LQC-X6高剂量不造模对照组外，模型组与治疗组均造模。将CCl4与橄榄油按2∶3比例配成40％CCl4油溶液用于造模。除了空白组和药物对照组外，其余4组大鼠均腹腔注射2ml/kg 40％CCl4油溶液，每周两次(首次5ml/kg)，空白组和高剂量对照组同法注射2ml/kg的橄榄油，共9周。试验药物组给药剂量根据鸭乙肝药效的测定结果，结合其临床用药量按体表面积折算，阳性药组按临床给药有效剂量，结合人鼠之间剂量换算，给药组均按体重10ml/kg剂量，每天灌胃给药1次。隔天称重，按实际体重调整给药与造模剂量，空白组和LQC-X6高剂量对照组灌胃给予同等剂量的生理盐水，阳性组灌胃给予BPD(10.5mg/kg)、试验用药LQC-X6高(28mg/kg)、低(14mg/kg)剂量。
[0217] 2.3标本采集
[0219] 2.4检测指标及方法
[0220] ①血清生化学检查：送北京中医药大学第三附属医院检测血清ALT、AST活性。②肝脏组织生化检查：取新鲜肝左叶，用4％多聚甲醛溶液固定，制作病理石蜡切片，作HE染色，于显微镜下观察肝组织结构及纤维组织增生情况。
[0221] 2.5统计方法
[0222] 各组数据以 表示，采用SAS 8.0软件进行组间方差分析。
[0223] 3.实验结果
[0224] 3.1生化指标
[0225] 大鼠股动脉取血，离心取血清，检测ALT、AST。结果见表4-1。由表4-1可见，腹腔注射CCl4 9周后模型组大鼠肝功能各项指标(ALT、AST)较空白对照组明显升高，阳性组对ALT、AST的抑制作用比较显著，LQC-X6高、低剂量组对ALT、AST均有一定的抑制作用。
[0226] 表4-1药物对慢性肝损伤大鼠肝功能的影响
[0227]△ △△
[0228] 与空白组比较：P＜0.01， P＜0.05；与模型组比较：*P＜0.01，**P＜0.05。
[0229] 3.2动物体重
[0230] 由表4-2、4-3可见，实验结束后，模型组体重较空白组明显下降，LQC-X6治疗组与空白组比体重下降明显，但LQC-X6不造模对照组较空白组体重也有显著下降，推测LQC-X6可能对动物有体重减轻的作用。由于雌、雄动物体重差异较大，故不作一起统计。
[0231] 表4-2药物对慢性肝损伤大鼠(雄性)体重的影响
[0232]
[0233] 表4-3药物对慢性肝损伤大鼠(雌性)体重的影响
[0234]
[0235] 3.3脏器系数
[0236] 由表4-4可见，实验结束后，模型组大鼠肝脏脏器系数较空白组明显增高(P＜0.01)，LQC-X6治疗组低、高剂量均较模型组有降低，其中LQC-X6高剂量组有明显降低，且效果优于阳性药组。
[0237] 表4-4药对物慢性肝损伤大鼠肝脾系数的影响
[0238]
[0239] 与空白组比较：△P＜0.01，△△P＜0.05；与模型组比较：*P＜0.01，**P＜0.05[0240] 3.4肝脏病理组织学检查结果
[0241] 肉眼观察：试验结束时，对肝进行检查，发现除空白组和LQC-X6不造模对照组外，其余各组肝脏均可见不同程度的体积增大、颜色变浅、硬化和边缘变钝；组织学检查发现，亦可见不同程度的肝损伤，包括肝组织的急性损伤和慢性损伤。急性损伤包括细胞的气球样变、脂肪变性和坏死，其中脂肪变性在各组均为少量细胞轻度的脂肪变性，组间无差异，而气球样变和坏死程度的组间差异较大；慢性纤维化包括局部的网状纤维支架塌陷，网状纤维增生，且融合成胶原纤维，轻者增生的纤维组织形成小的间隔，重者肝脏分区不明显，增生的纤维间隔相互连接，形成假小叶。
[0242] 镜检发现空白对照组和LQC-X6不造模对照组，大鼠肝小叶、汇管区结构正常；模型组肝细胞重度水肿脂变，窦旁细胞增生明显，纤维间隔宽，90％以上肝标本有弥漫假小叶形成，汇管区及纤维间隔中有少量慢性炎细胞浸润，与空白组比较差异有显著性；LQC-X6高、低剂量治疗组纤维问隔细假小叶形成减少，病变程度较模型组明显减轻，且有一定的剂量依赖性。
[0243] 4.结论
[0244] 4.1LQC-X6可显著降低四氯化碳所致肝纤维化大鼠的生化指标。
[0245] 4.2LQC-X6在实验结束后对大鼠有一定的体重减轻作用，具体原因需进一步探讨。
[0246] 4.3LQC-X6治疗组可抑制肝损伤大鼠脏器系数的升高，有一定的保护脏器作用。
[0247] 4.4LQC-X6可显著减缓四氯化碳所致肝纤维化大鼠的肝脏损伤程度，阻滞肝脏损伤过程。
[0248] 毒性实施例1
[0249] 实验项目：LQC-X6小鼠经腹腔注射LD50(Bliss法)
[0250] 一、实验材料：
[0251] KM小白鼠【雌雄各半，18-22g】，购自维通利华实验动物中心。
[0252] LQC-X6，白色粉末(自制)，用色拉油稀释，现用现配。
[0253] 二、实验方法：
[0254] 采用KM种小鼠，体重范围18-22g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(SPF级)。实验剂量以1000mg/kg为最高剂量组，将小鼠随机分组，每组6只，雌雄各半，腹腔注射0.2ml/10g。观察7天，记录动物各种反应及各组死亡的只数。根据各组动物的死亡率，用Bliss法算出LD50和可信限。
[0255] 三、实验结果：
[0256] 在给药后12小时内，未见死亡，7天内各组小鼠死亡情况见下表1：
[0257] 表1-1用LQC-X6小鼠经腹腔注射LD50(Bliss法)
[0258]
[0259] 回归方程y(Probit)＝-23.294+9.7738Log(D)
[0260] 半数致死量LD50＝785.05mg/kg
[0261] LD50(Feiller校正)95％的可信限＝650.58--929.07mg/kg
[0262] LD5＝532.84mg/kg
[0263] LD95＝1156.6mg/kg
[0264] 四、结论：
[0265] LQC-X6小鼠经腹腔注射LD50(Bliss法)为785.05mg/kg，95％的可信区间为650.58--929.07mg/kg。
[0266] 五.小结：LQC-X6安全性较高。
[0267] 毒性实施例2
[0268] 一、实验项目：LQC-X6小鼠口服急性毒性试验
[0269] 二、实验材料：
[0270] ICR小白鼠【雌雄各半，18-22g，动物许可证编号：SCXK(京)2006-0009】[0271] LQC-X6，白色粉末(自制)，将5000mg该药物溶于100ml 0.5％羧甲基纤维素钠中，超声混悬，现用现配。
[0272] 三、实验方法：
[0273] 检疫合格动物，给药前称体重，根据体重进行随机分组，采用小鼠灌胃器灌胃给药。小鼠给药前，禁食不禁水过夜(连续14小时)，于给药当日上午9:00开始单次最大剂量给药(2000mg/kg)，连续观察1小时后给食。
[0274] 四、实验结果：
[0275] 在给药后12小时内，未见死亡，7天内各组小鼠死亡情况见下表：
[0276] 表7LQC-X6小鼠口服急性毒性试验一般观察结果汇总表
[0277]
[0278] 注：√表示正常状态
[0279] 五、小结：
[0280] 在本次LQC-X6小鼠口服急性毒性试验中，小鼠给予单次最大灌胃剂量2000mg/kg，连续观察7天内，未出现毒性反应，表明该药物的安全性非常高。
[0281] 毒性实施例3
[0282] 一、实验项目：LQC-X6保肝作用的治疗指数
[0283] 二、实验材料：(见效果实施例3，毒性实施例2)
[0284] 三、实验方法：(见效果实施例3，毒性实施例2)
[0285] 四、实验结果：(见效果实施例3，毒性实施例2)
[0286] 由效果实施例3可知，LQC-X6剂量为40mg/kg时，可显著降低四氯化碳所致肝损伤小鼠的生化指标，可显著减缓四氯化碳所致肝损伤小鼠的肝脏损伤程度，阻滞肝脏损伤过程；结合毒性实施例2可知，LQC-X6小鼠单次最大灌胃剂量为2000mg/kg mg/kg，其治疗指数TI应不低于50。
[0287] 五、小结：
[0288] LQC-X6治疗指数TI大于50，说明LQC-X6安全性较高，保肝作用明显。
[0289] 制剂实施例1
[0290] 取LQC-X 10g，加入注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)适当辅料，按注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)工艺制备成抗乙肝药注射剂。
[0291] 制剂实施例2
[0292] 取LQC-X 10g，加入片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)适当辅料，按片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)工艺制备成抗乙肝药片剂。
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