筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器及其构建方法
专利汇可以提供筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器及其构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种筛选化学 预防 剂的双 信号 转基因细胞 传感器 及其构建方法。该双信号转基因细胞传感器带有抗 氧 化反应元件ARE、TK启动子、增强绿色 荧光 蛋白EGFP以及红色荧光蛋白DsRed。EGFP的表达受ARE的调控。其构建方法是：先构建由TK启动子启动以及上游有4个ARE重复序列调控的真核报告载体；再将DsRed及其启动子 片段 插入该载体构建双信号报告载体；然后将报告载体 转染 HepG2细胞，得到的转基因细胞即本发明的双信号转基因细胞传感器。本发明以EGFP为报告基因，以DsRed为内参照所构建的双信号转基因细胞传感器，不需要添加任何底物和辅助 试剂 ，安全，对环境无污染，且操作方便、时间短， 费用 低。，下面是筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器及其构建方法专利的具体信息内容。
1.一种筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器，其特征在于，是一种转基因细胞，该转基因细胞带有抗氧化反应元件ARE、TK启动子、增强绿色荧光蛋白EGFP以及红色荧光蛋白DsRed，EGFP的表达受ARE的调控。
2.如权利要求1所说的筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器，其特征在于，所说的转基因细胞是HepG2-4ARE-TK-GFP/DsRed，即在HepG2细胞中重组整合有ARE、TK、EGFP和DsRed，且EGFP的表达受ARE的调控。
3.权利要求1所说的筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器的构建方法，是：
1）利用基因工程技术构建由TK启动子启动以及上游有4个ARE重复序列调控的EGFP报告载体；
2）将红色荧光蛋白DsRed及其启动子片段插入步骤1）的报告载体，构建双信号报告载体；
3）将步骤2）的报告载体转染HepG2细胞，得到的转基因细胞即本发明的双信号转基因细胞传感器。
筛选化学预防剂的双信号转基因细胞传感器及其构建方法
技术领域
背景技术
发明内容
2）将红色荧光蛋白DsRed及其启动子片段插入步骤1）的报告载体，构建双信号报告载体；
3）将步骤2）的报告载体转染HepG2细胞，得到的转基因细胞即本发明的双信号转基因细胞传感器。
具体实施方式
1） pMD-DsRed载体的构建：
用PCR方法从质粒pDsRed2-N1（Clontech公司）扩增红色荧光蛋白及其启动子序列，上游引物为5’-CGCCCTTAAGTAGTTATTAATAGTAATCAATT -3’（SEQ ID NO：1），下游引物为5’-GAGCACGTAGTGCTACAGGAACAGGTGGTGGCGG -3’（SEQ ID NO：2）。在引物的5’端分别设计BspT I和Ade I两酶切位点（黑体字所示），并增加3~4个保护碱基。PCR扩增产物经纯化试剂盒纯化回收后与pMD18-T载体（TaKaRa公司）相连，阳性克隆载体经常规酶切鉴定、测序，命名为pMD-DsRed；
2）p4ARE-TK-GFP/DsRed/neo报告载体的构建：用Ade I和BspT I酶分别对载体pMD-DsRed和p4ARE-TK-GFP/neo进行双酶切，产物经常规切胶回收后用T4连接酶连接，阳性克隆载体经常规酶切鉴定、测序，命名为p4ARE-TK-GFP/DsRed/neo。
其工作原理如图2所示，当化学预防剂作用于双信号转基因细胞时，EGFP基因的表达量与化学预防剂的作用强度具有一定的剂量效应关系，通过测定EGFP和DsRed发光强度获得的相对发光强度可以反映化学预防剂的作用强度或快速筛选某些化学预防剂。
HepG2-4ARE-TK-GFP/DsRed接种入黑色96孔培养板，每孔细胞数为5×10 个，培养24 h后加入用二甲基亚砜（DMSO）配制的不同浓度的受试物吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）和叔丁基对苯二酚（tBHQ），受试物终浓度设计为：0(对照)、12.5、25、50、100和
200 μM，每一浓度组有3个重复，37℃，5% CO2培养箱中作用24~48 h，用PBS洗涤后每孔再加入200 ??L PBS，用多功能荧光酶标仪检测细胞的GFP和DsRed荧光强度，其激发波长/发射波长分别为485 nm/530 nm(GFP)和558 nm/ 583 nm(DsRed)，求其相对发光度。 [0021] 结果如表1，图6。
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