本发明的目的是提供一种与造血细胞周期调控相关的基因及其编码的蛋白质。
一种与造血细胞周期调控相关的基因,它是下列核苷酸序列之一:1)
序列表中序列1的DNA序列;2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
所述与造血细胞周期调控相关基因的完整开放读码框为序列表中序列1的第1至507共507个
碱基。
一种与造血细胞周期调控相关的蛋白质,它具有序列表中序列2的
氨基酸序列或将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
利用NCBI的Genbank
数据库对本发明基因进行检索,结果表明数据库中没有基因与此基因序列完全相同。应用GDB的数据库进行进一步的检索,结果表明,本发明基因应
定位于11号
染色体的长臂1区2至3带(11q12-13)。
由于本发明所提供的基因在造血系统正常细胞(包括造血干/祖细胞)及肿瘤细胞中呈特异表达,在人体其他正常细胞及肿瘤细胞系中无表达,因此本发明的基因及其编码的蛋白质有望成为造血干/祖细胞基因修饰的靶点,或药物靶标以及蛋白类药物,为拓展造血干/祖细胞的细胞治疗和基因治疗等研究提供足够的能长期维持、可调控细胞周期进程的理想靶细胞,并促使造血细胞相关的基因治疗更加有效和广泛地应用于临床,从而创造巨大的社会效益和经济效益。而且,对于基因不同研究阶段开发的不同产品,包括新
抗体、
生物芯片的靶基因、筛选出的新药等,也将促进形成新兴的人类基因产业。
附图说明
图1为本发明基因在COS7细胞中的免疫组化定位结果。
图2为本发明基因在COS7细胞中的激光共聚焦定位结果。
图3为本发明基因在人造血等组织细胞中的半定量反转录PCR结果图4为本发明基因在维持因子FRIL和FL体外长期维持的脐血造血干/祖细胞中的半定量PCR结果表1本发明基因对人红白血病K562细胞的细胞周期调控具体实施方式
实施例1、本发明基因的克隆本发明的基因cDNA克隆自人骨髓的cDNA文库,引物序列及其多聚酶链式反应(PCR)的条件如下:primer 1:5’CATATGCCAATGGCCTCCCACGA 3’primer 2:5’TCTAGATTACACAGAATTGGGAGGTGAGGAAA 3’50μl反应体系包括:1ul cDNA(100ng/ul),1μl primer1(20μM)和1μl primer2(20μM),4μl dNTP(2.5mM),1μl Ex Taq DNA聚合酶(TakaRa公司,5u/μl),5μl10×PCR Buffer,37μl灭菌
水。反应条件为:94℃变性3min;94℃ 30s,56℃ 45s,72℃ 1min,28个循环;72℃ 7min。反应产物克隆至pGEM-T eassy载体(Promega公司,美国)。用常规方法测序,结果表明本发明所克隆到的基因为序列表中序列1的DNA序列。通过BLAST比较分析显示,该基因是HTm4基因的一种全新剪接模式,将其命名为HTm4S。
实施例2、本发明基因的亚细胞定位利用免疫组化和激光共聚焦技术对本发明基因进行亚细胞定位。构建pCDNA3.1(-)/myc-his-HTm4S和pEGFP-N1-HTm4S重组载体,同时构建与本发明基因相关的HTm4全长基因重组表达载体pCDNA3.1(-)/myc-his-HTm4和pEGFP-N1-HTm4作为对照。利用脂质体Lipofactamine 2000(Promega公司)将以上4种融合表达载体分别瞬时
转染COS7细胞。转染36小时后,收取细胞进行免疫组化染色和激光共聚焦观察。实验结果显示,HTm4S蛋白主要定位于COS7细胞的整个胞浆中,细胞核内则没有目的蛋白的分布(图2A);而HTm4则主要定位于核周部分(图2B),图2C为空载体转染对照组。
实施例3、用反转录PCR方法检测本发明基因在人体造血组织及其他组织细胞中的表达利用半定量反转录PCR方法检测本发明基因在人体造血和其他组织正常细胞及肿瘤细胞中的表达,以β-actin1(β-肌动蛋白)为对照。检测结果如图3所示,其中A组为急性单核细胞白血病U937,人髓系白血病细胞HL60,人白血病细胞Daudi,人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat,脐血CD34+:造血干/祖细胞,成人骨髓BM,人红白血病细胞HEL,人髓系白血病细胞KG1a,人B淋巴细胞白血病Raji,急性原始粒细胞白血病KG1,慢性粒细胞白血病急变期K562细胞中本发明基因及β-actin1的表达;B组为膀胱癌细胞EJ1,
前列腺癌细胞HK,肝癌细胞HepG2,
乳腺癌细胞MCF-7,人
宫颈癌细胞Hela,人胚肾细胞HEK 293,人肝永生化细胞L02,间充质干细胞MSC和人骨髓基质细胞HFCL中本发明基因及β-actin1的表达。C组为
胎儿脑、心脏、胰腺、肾及成人骨髓cDNA中本发明基因及β-actin1的表达。结果表明,本发明基因特异表达于造血系统,在人急性单核细胞白血病U937,慢性粒细胞白血病急变期K562细胞和人红白血病细胞HEL中呈高表达;而在除造血组织外的其他组织细胞中没有检测到表达。另外,从图3可以看出,与该基因相关的全长基因HTm4的表达方式与其相近,但表达水平存在差异。
实施例4、用反转录PCR方法检测本发明基因在维持因子FRIL及FL体外长期维持的脐血造血干/祖细胞中的表达利用半定量反转录PCR方法检测本发明基因在维持因子FRIL及FL体外长期维持的脐血造血干/祖细胞中的表达。以β-actin1(β-肌动蛋白)为对照,检测结果如图4所示,其中A组为FRIL和FL维持培养0d,3d,7d,14d的脐血造血干/祖细胞中本发明基因的表达,B组为β-actin1的表达。从实验结果可以看出,在利用FRIL和FL进行体外长期培养的过程中,脐血造血干/祖细胞中本发明基因的表达随着细胞因子和培养时间的不同而表现出显著变化。培养0天至14天,FL组本发明基因表达水平呈现先升高后降低再升高的复杂变化;而FRIL组本发明基因的表达水平在第1天有所下降,但3天后其表达水平上调,之后一直维持在较高水平。结果提示,本发明基因参与了不同维持因子作用下脐血造血干/祖细胞的维持、增殖与分化过程。
实施例5、本发明基因对人红白血病K562细胞的细胞周期调控作用利用Tet-Off调控表达系统(美国Clontech公司)对本发明基因调控造血K562细胞于G0/G1期的作用进行研究,并以全长基因HTm4作为对照。由表1可见,本发明基因HTm4S和HTm4的诱导表达均使克隆细胞的细胞周期发生显著变化。G0/G1期细胞均明显增高,而S/G2/M期细胞减少。其中G0/G1细胞所占比例分别为57.01%(K-HTm4S)和63.91%(K-HTm4),与空载体对照相比分别增加了20.37%和27.27%,具有显著差别(P<0.05)。而去掉本发明基因C端的22个氨基酸后,该基因调控K562细胞于G0/G1期的作用与对照组相比差别不显著,以上结果提示,本发明基因具有调控造血K562细胞于G0/G1期的作用,并推测本发明基因的C端22个氨基酸是其调控细胞周期的功能域部分。
序列表<160>2<210>1<211>507<212>DNA<213>人属人种(Homo sapiens)<400>1atggcctccc acgaagttga taatgcagag ctggggtcag cctctgccca 50tggtacccca ggcagtgagg cgggaccaga agagctgaat acttctgtct 100accagcccat agatggatca ccagattatc agaaagcaaa attacaagtt 150cttgggttct gtagttcagg aaccttgtct gttgtagcag ggataaaacc 200cacaagaaca tggatacaga acagttttgg aatgaacatt gccagtgcta 250caattgcact agtggggact gcttttctct cactaaatat agcagttaat 300atccagtcat taaggagttg tcactcttca tcagagtcac cggacctatg 350caattacatg ggctccatat caaatggcat ggtgtctcta ctgctgattc 400tcaccttgct ggaattatgc gtaaccatct ctaccatagc catgtggtgc 450aatgcaaact gctgtaattc aagagaggaa atttcctcac ctcccaattc 500tgtgtaa 507<210>2<211>237<212>PRT<213>人属人种(Homo sapiens)<400>2Met Ala Ser His Glu Val Asp Asn Ala Glu Leu Gly Ser Ala Ser1 5 10 15Ala His Gly Thr Pro Gly Ser Glu Ala Gly Pro Glu Glu Leu Asn20 25 30 35Thr Ser Val Tyr Gln Pro Ile Asp Gly Ser Pro Asp Tyr Gln Lys
40 45 50 55Ala Cys Leu Gln Val Leu Gly Phe Cys Ser Ser Gly Thr Leu Ser60 65 70 75Val Val Ala Gly Ile Lys Pro Thr Arg Thr Trp Ile Gln Asn Ser80 85 90 95Phe Gly Met Asn Ile Ala Ser Ala Thr Ile Ala Leu Val Gly Thr100 105 110 115Ala Phe Leu Ser Leu Asn Ile Ala Val Asn Ile Gln Ser Leu Arg120 125 130 135Ser Cys His Ser Ser Ser Glu Ser Pro Asp Leu Cys Asn Tyr Met140 145 150 155Gly Ser Ile Ser Asn Gly Met Val Ser Leu Leu Leu Ile Leu Thr160 165 170 175Leu Leu Glu Leu Cys Val Thr Ile Ser Thr Ile Ala Met Trp Cys180 185 190 195Asn Ala Asn Cys Cys Asn Ser Arg Glu Glu Ile Ser Ser Pro Pro200 205 210 215Asn Ser Val216 218