本发明涉及增强细胞特异性目的基因表达的方法。

利用细胞或肿瘤特异性启动子控制治疗基因(目的基因)的表达在基 因治疗中受到广泛的重视与研究。特别是在应用细胞毒基因进行肿瘤或 其他疾病的治疗时，将治疗基因的表达限制在靶细胞中是减少副作用， 提高疗效的唯一有效手段。迄今已证明一些启动子在某些细胞中活性较 强，而在另一些细胞中活性很弱或无活性。这些启动子已用于控制治疗 基因在特定的靶细胞中的表达，以减少其在非靶细胞中的表达。例如， 酪氨酸酶基因的启动子用于控制治疗基因在黑色素瘤中的表达(Vile，R.G. and Hart，I.R.Cancer Res.，53：962-967，1993)，癌胚抗原基因的启动子 用于控制治疗基因在结肠癌与肺癌中的表达(Osaki，T.，Tanio，Y.， Tachibana，I.，Hosoe，S.，Kumagai，T.，Kawase，I.，Oikawa，S.，and Kishimoto， T.Cancer Res.，54：5258-61，1994)，粘液蛋白基因的启动子用于控制治疗 基因在乳腺癌中的表达(Chen，L.，Chen，D.，Manome，Y.，Dong，Y.，Fine， H.A.，and Kufe，D.W.Journal of Clinical Investigation，96：2775-82，1995)， 前列腺特异抗原基因的启动子用于控制治疗基因在前列腺癌中的表达 (Gotoh，A.，Ko，S.C.，Shirakawa，T.，Cheon，J.，Kao，C.，Miyamoto，T.， Gardner，T.A.，Ho，L.J.，Cleutjens，C.B.，Trapman，J.，Graham，F.L.，and Chung，L.W.Journal of Urology，160：220-9，1998)，甲胚蛋白基因的启动 子用于控制治疗基因在肝癌中的表达(Arbuthnot，P.B.，Bralet，M.P.，Le Jossic，C.，Dedieu，J.F.，Perricaudet，M.，Brechot，C.，and Ferry，N.Human Gene Therapy，7：1503-14，1996；Bui，L.A.，Butterfield，L.H.，Kim，J.Y.， Ribas，A.，Seu，P.，Lau，R.，Glaspy，J.A.，McBride，W.H.，and Economou，J.S. Human Gene Therapy，8：2173-82，1997；Kaneko，S.，Hallenbeck，P.，Kotani， T.，Nakabayashi，H.，McGarrity，G.，Tamaoki，T.，Anderson，W.F.，and Chiang， Y.L.Cancer Res.，55：5283-7，1995)，E2F因子基因的启动子用于控制治疗 基因含视网膜母细胞瘤基因缺陷的肿瘤细胞中的表达(Parr，M.J.， Manome，Y.，Tanaka，T.，Wen，P.，Kufe，D.W.，Kaelin，W.G.，Jr.，and Fine， H.A.Nature Medicine，3：1145-9，1997)，热休克蛋白基因的启动子与热 疗法联合用于控制治疗基因在特定的靶细胞中的表达(Halfon，M.S.， Kose，H.，Chiba，A.，and Keshishian，H.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，94：6255- 6260，1997；Pelham，H.R.and Bienz，M.EMBO Journal，1：1473-7，1982)。 上述研究虽然都证明应用细胞或肿瘤特异性启动子将治疗基因限制在靶 细胞中表达是可行的，但同时也显示了这些启动子的共同弱点，即在靶 细胞中，它们的转录活性远低于常用的病毒类强启动子。在多数情况下， 治疗基因在靶细胞中表达水平太低，难以达到治疗效果。

为了解决这一难题，日本几家大学实验室最近应用Cre/loxP系统放 大弱启动子的转录活性，并证明这一系统可增强甲胚蛋白，甲状腺球蛋 白，癌胚抗原等基因启动子的转录活性(Kijima，T.，Osaki，T.，Nishino，K.， Kumagai，T.，Funakoshi，T.，Goto，H.，Tachibana，I.，Tanio，Y.，and Kishimoto， T.Cancer Res.，59：4906-4911，1999；Nagayama，Y.，Nishihara，E.，Iitaka，M.， Namba，H.，Yamashita，S.，and Niwa，M.Cancer Res.，59：3049-3052，1999； Ueda，K.，Iwahashi，M.，Nakamori，M.，Nakamura，M.，Yamaue，H.，and Tanimura，H.Oncology，59：255-265，2000)。在他们的系统中，将两端含 loxP的无活性DNA插入到一病毒类强启动子与治疗基因之间，以阻止治 疗基因的表达。同时，应用甲胚蛋白，甲状腺球蛋白，癌胚抗原等基因 启动子控制Cre的表达。当表达治疗基因的载体与表达Cre基因的载 体同时转染靶细胞时，上述组织特异性基因启动子启动Cre基 因的表达。Cre蛋白则催化loxP特异的DNA重组，将 两端含loxP的无活性DNA切除，这样，病毒类强启动子即可启动治疗基 因的表达。而在非靶细胞中，上述组织特异性基因启动子活性太低，由 Cre催化的loxP特异的DNA重组很少，治疗基因的表达也比靶 细胞中的少。应用这一方法，可将甲胚蛋白，甲状腺球蛋白，癌胚抗原 等基因启动子的转录活性增强5-50倍。但这一技术有其不足之处。第一， 遗传载体必须发生loxP特异的重组。第二，病毒类强启动子可能在一些 靶细胞中活性较弱。

德国马堡大学Mueller实验室则设计了一正反馈技术来解决这一难题 (Jerome，V.and Muller，R.Human Gene Therapy，9：2653-2659，1998. Nettelbeck，D.M.，Jerome，V.，and Muller，R.Gene Ther.，5：1656-1664， 1998)。在他们的系统中，在细胞或组织特异的起动子之上游加一转录蛋 白识别序列，同时，将报告基因或目的基因与该转录蛋白基因通过核糖 体内部识别序列(IRES)进行连接。当细胞或组织特异的起动子启动报告 基因或目的基因时，转录蛋白基因亦同时得到表达。表达的转录蛋白进 而结合到细胞或组织特异的起动子之上游的转录蛋白识别序列，再次激 活其下游的启动子。通过这样的正反馈，使得目的基因的表达增大。但 转录激活蛋白基因的表达也同时增大。

本发明所含技术则联合应用转录激活蛋白基因与一人工合成的，本 身并无活性的启动子来解决上述难题。一方面避免遗传载体重组的必要 性，同时避免转录激话基因本身的大量表达。

本发明的目的是提供一种增强细胞特异性目的基因表达的方 法。

本发明提供了一种增强细胞特异性目的基因表达的方法，包括：(a) 将细胞、组织或肿瘤特异性启动子与转录激活蛋白的基因相连；(b)将 能够被所述的转录激活蛋白激活的启动子与目的基因相连；(c)将步骤 (a)中得到的与细胞、组织或肿瘤特异性启动子相连的转录激活蛋白的 基因和步骤(b)中得到的与能够被所述的转录激活蛋白激活的启动子相 连的目的基因同时导入靶细胞；(d)使所述的转录激活蛋白的基因和目 的基因在靶细胞中表达。

在本发明的方法中，细胞、组织或肿瘤特异性启动子与转录激活蛋 白基因的相连连接方式应使转录激活蛋白基因在细胞、组织或肿瘤特异 性启动子的控制之下进行表达；能够被所述的转录激活蛋白激活的启动 子与目的基因的表达方式应使目的基因在所述的转录激活蛋白激活的启 动子的控制之下进行表达。

也就是说，本发明的核心是应用细胞、组织或肿瘤特异性启动子控 制转录激活蛋白的基因的表达，同时应用能被该转录激活蛋白激活的启 动子控制治疗基因(或称目的基因)的表达。当两者同时转入到靶细胞时， 细胞、组织或肿瘤特异性启动子驱动转录激活蛋白的表达，而该转录激 活蛋白又激活治疗基因的表达。通过这一连锁反应，达到治疗基因在靶 细胞，靶组织，或肿瘤中大量表达的目的。这样，既保留了细胞、组织 或肿瘤特异性启动子的细胞，组织或肿瘤特异性，又克服了这些启动子 活性低的弱点。这一技术既可增强治疗基因在肿瘤组织或靶组织中的表 达，提高其疗效，又避免治疗基因在非靶细胞中的表达，减少其毒性或 副作用。

本发明所述的细胞、组织或肿瘤特异性启动子是指在某些细胞中有 较强的转录活性，而在另一些细胞中转录活性很低或无转录活性的核心 启动子序列。这种核心启动子序列也可包括其周围的增强子序列。启动 子位于蛋白质编码基因的上游，是能被转录蛋白(包括转录激活蛋白及转 录抑制蛋白)识别的DNA序列，包括核心启动子序列及其周围的调节序 列，增强子序列等(Herman，J.G.and Baylin，S.B.Current.Topics.in Microbiology.&Immunology，249：35-54，2000；Fickett，J.W.and Wasserman，W.W.Current.Opinion.in Biotechnology，11：19-24，2000； Struhl，K.Cell，98：1-4，1999；Werner，T.Mammalian.Genome，10：168-175， 1999)。多数启动子在转录起始部位(通常含CA序列)上游25-30bp处有一 TATAA序列。但也有一些启动子不含TATAA序列。那些不含TATAA序 列的启动子常含能被SP1转录蛋白识别的，CG富有序列。在核心启动子 周围还有一些能影响启动子活性的序列，称增强子。增强子可在核心启 动子的上游或下游。这些序列与各种转录蛋白的综合作用，控制基因的 表达水平。所有基因都有其自己的启动子。一些启动子在各种细胞中都 有活性。如巨细胞病毒早期基因的启动子(CMV)，Rous肉瘤病毒基因的 启动子(RSV)(Guo，Z.S.，Wang，L.H.，Eisensmith，R.C.，and Woo，S.L. Gene Ther.，3：802-810，1996)，SV40病毒基因的启动子，一些与糖代谢 有关的酶的基因的启动子(如3-磷酸甘油酸激酶基因启动子(PGK)) (McBurney，M.W.，Sutherland，L.C.，Adra，C.N.，Leclair，B.，Rudnicki，M.A.， and Jardine，K.Nucleic Acids Res.，19：5755-5761，1992)等。而另一些启 动子则在某些特定的细胞中有活性，如在肌细胞，表皮细胞或肿瘤细胞 中有较强的活性，而在其他细胞中活性很弱或无活性。这些启动子即本 发明所指的细胞、组织或肿瘤特异性启动子。它们中的代表如，酪氨酸 酶基因的启动子在黑色素瘤细胞中活性较强(Vile，R.G.and Hart，I.R. Cancer Res.，53：962-967，1993)，癌胚抗原基因的启动子在一些结肠癌 与肺癌细胞中活性较强(Osaki，T.，Tanio，Y.，Tachibana，I.，Hosoe，S.， Kumagai，T.，Kawase，I.，Oikawa，S.，and Kishimoto，T.Cancer Res.，54： 5258-61，1994)，粘液蛋白基因(MUC1)的启动子在一些乳腺癌细胞中活 性较强(Chen，L.，Chen，D.，Manome，Y.，Dong，Y.，Fine，H.A.，and Kufe， D.W.Journal of Clinical Investigation，96：2775-82，1995)，前列腺特异抗 原基因的启动子在一小前列腺癌细胞中活性较强(Chung，L.W.，Kao，C.， Sikes，R.A.，and Zhau，H.E.Hinyokika Kiyo-Acta Urologica Japonica，43： 815-820，1997；Gotoh，A.，Ko，S.C.，Shirakawa，T.，Cheon，J.，Kao，C.， Miyamoto，T.，Gardner，T.A.，Ho，L.J.，Cleutjens，C.B.，Trapman，J.，Graham， F.L.，and Chung，L.W.Journal of Urology，160：220-9，1998)，甲胚蛋白基 因的启动子在肝癌或新生的肝细胞中活性较强(Bui，L.A.，Butterfield，L.H.， Kim，J.Y.，Ribas，A.，Seu，P.，Lau，R.，Glaspy，J.A.，McBride，W.H.，and Economou，J.S.Human Gene Therapy，8：2173-82，1997；Hasse，A.and Schulz，W.A.Journal of Biological Chemistry，269：1821-6，1994；Kaneko，S.， Hallenbeck，P.，Kotani，T.，Nakabayashi，H.，McGarrity，G.，Tamaoki，T.， Anderson，W.F.，and Chiang，Y.L.Cancer Res.，55：5283-7，1995)，E2F 因子基因的启动子在含视网膜母细胞瘤基因缺陷的肿瘤细胞活性较强 (Parr，M.J.，Manome，Y.，Tanaka，T.，Wen，P.，Kufe，D.W.，Kaelin，W.G.，Jr.， and Fine，H.A.Nature Medicine，3：1145-9，1997)，端粒酶(又称端粒反转 录酶，简称TERT)基因在各种癌细胞及干细胞中活性较强(Gu，J.，Kagawa， S.，Takakura，M.，Kyo，S.，Inoue，M.，Roth，J.A.，and Fang，B.Cancer Res.， 60：5359-5364，2000；Kyo，S.，Kanaya，T.，Takakura，M.，Tanaka，M.，and Inoue，M.International Journal of Cancer，80：60-63，1999)。一启动子在 某一细胞中是否有活性取决于该启动子及其周围增强子的序列，以及该 细胞是否有能识别这些序列的转录蛋白及其种类。启动子的活性强弱又 与识别该启动子的转录蛋白在细胞中的含量多少，活性强弱有关。

细胞、组织或肿瘤特异性启动子也可由来自两个或两个以上的启动 子序列组合而成。如将低氧诱导启动子与甲胚蛋白基因的启动子相连接 而得到的组合启动子既可被低氧诱导(实体瘤中常有低氧存在)，又在肝癌 细胞中活性较强(Ido，A.，Uto，H.，Moriuchi，A.，Nagata，K.，Onaga，Y.， Onaga，M.，Hori，T.，Hirotsu，T.，Hayashi，K.，Tamaoki，T.，and Tsuchida，A. Cancer Res，61：3016-3021，2001)。又如在甲胚蛋白基因的启动子或前列 腺特异抗原基因的启动子与别的启动子的增强子(如SV40增强子)序列相 连接得到的组合启动子在它们的靶细胞中活性更高。

本发明所述的转录激活蛋白是一类天然或人工融合基因编码的，能 直接与DNA相结合并促进转录的蛋白。它们是一类转录因子。转录因子 是一类能直接作用于转录的蛋白质。它们的作用可以是激活转录或抑制 转录，可以直接与DNA相结合或通过与其他转录因子相结合而影响基因 的转录。能与DNA结合的转录因子多能识别特定的DNA序列。如SP1蛋 白能识别10-bp GC富有序列。AP-1族转录因子的识别序列为TGANTCA 或TGANNTCA。STAT蛋白质的结合序列为TTCCNGGAA。CCAAT增强 子结合蛋白(C/EBP)族转录因子的保守序列为RTTGCGYAAY(Y＝C或T， R＝A或G)。NF-kapaB/Rel族转录因子的保守序列为GGGAATTCCC或 GGGAATCCCC。Myc-Max-Mad族转录因子的保守序列为E-合子序列 CACGTG。酵母的GAL4蛋白能识别5’-CGGAGTACTGTCCTCCG-3’或 5’-CGGAGGACTGTCCTCCG-3’的17-bp序列(称GAL4识别序列)(Giniger， E.，Varnum，S.M.，and Ptashne，M.Cell，40：767-774，1985；Sadowski，I. Genetic Engineering，17：119-148，1995)。细菌LexA蛋白的识别序为5’- GTCGAGTACTGTATGTACATACAGTAC3’(Schnarr，M.，Oertel-Buchheit， P.，Kazmaier，M.，and Granger-Schnarr，M.Biochimie，73：423-431，1991)， 四环素抑制子(tetR)蛋白的识别序列为TCCCTATCAGTGATAGAGA (Gossen，M.and Bujard，H.Proceedings.of the National.Academy.of Sciences.of the United.States.of America.，89：5547-5551，1992)。这些直接 与DNA结合的转录因子除含有DNA结合区外还其他的功能区。如转录激 活区，调节区或转录抑制区等。本发明所述的天然转录激活蛋白，如p53 蛋白，Myc蛋白，酵母GAL4蛋白等。这些蛋白至少含有两个功能区，即 DNA结合区与转录激活区。但它们也可含有其他功能区，如转录调节区， 抑制区，配体结合区等。如GAL4蛋白有881个氨基酸残基。其N-端1-147 氨基酸为DNA识别区，能识别GAL4识别序列。两个激活区分别位于第 148-238与767-881氨基酸残基处。239-600氨基酸区域为转录抑制区。 600-768氨基酸区域为葡萄糖调节区(Sadowski，I.Genetic Engineering，17： 119-148，1995)。

本发明所述的人工融合基因编码的转录激活蛋白是指将编码一转录 因子的DNA结合区的基因片段与编码一转录因子的转录激活区的基因片 段相组合，组合后的基因即编码含DNA结合区与转录激活区的融合蛋 白。其中DNA结合区与转录激活区可来自同一转录因子或来自不同的转 录因子。例如，将GAL4蛋白的DNA结合区与其转录激活区融合即得 GAL4-GAL4融合蛋白，将GAL4蛋白的DNA结合区与泡疹病毒VP16蛋白 的转录激活区融合即得GAL4-VP16融合蛋白(Oligino，T.，Poliani，P.L.， Marconi，P.，Bender，M.A.，Schmidt，M.C.，Fink，D.J.，and Glorioso，J.C.Gene Ther.，3：892-9，1996；Sadowski，I.，Ma，J.，Triezenberg，S.，and Ptashne，M. Nature，335：563-564，1988)，GAL4蛋白的DNA结合区与Myc蛋白的转 录激活区融合即得GAL4-Myc融合蛋白，LexA蛋白的DNA结合区与泡疹 病毒VP16蛋白的转录激活区融合即得LexA-VP16融合蛋白(Brent，R.and Ptashne，M.Cell，43：729-736，1985；Nettelbeck，D.M.，Jerome，V.，and Muller，R.Gene Ther.，5：1656-1664，1998)，四环素抑制子蛋白的DNA 结合区与泡疹病毒VP16蛋白的转录激活区融合即得四环素控制的转录激 活蛋白(tTA)(Gossen，M.and Bujard，H.Proceedings.of the National.Academy.of Sciences.of the United.States.of America.，89：5547- 5551，1992)。这些融合的转录激活蛋白除含有最基本的DNA结合区与 转录激活区外，还可有或加入其他功能区。例如，四环素控制的转录激 活蛋白还含有四环素结合区，以调节该蛋白与DNA靶序列的结合。在 GAL4-VP16融合蛋白上可加激素受体蛋白的激素结合区，即可通过激素 调节该蛋白与其靶DNA的结合。

编码天然的或人工融合的转录激活蛋白的基因可以含有/或不含有 内含子(MacCumber，M.and Ornstein，R.L.Science，224：402-5，1984； Waring，R.B.and Davies，R.W.Gene，28：277-91，1984)。内含子是真核细 胞基因内不编码蛋白的序列。这些序列也存在于转录后的mRNA前体， 经编辑加工而被去除。因此，成熟的mRAN中不含内含子。细胞、组织 或肿瘤特异性启动子与转录激活蛋白的基因之间的连接可以是直接连 接，也可在两者之间加内含子。但是启动子的序列必须在转录激活蛋白 的基因的上游(即5’端)。在转录激活蛋白的基因下游(即3’端)还必须有一 多聚A信号序列。多聚A信号序列是真核细胞蛋白编码基因下游的DNA序 列，与转录终止及在mRNA上加多聚A序列有关(Shatkin，A.J.and Manley， J.L.Nature Structural.Biology.，7：838-842，2000；Minvielle-Sebastia，L.and Keller，W.Current.Opinion.in Cell Biology.，11：352-357，1999)。本发明 对多聚A信号序列没有特别的要求。它们可以是任何基因的多聚A信号序 列，如SV40病毒基因的多聚A信号序列，牛或人生长激素基因的多聚A 序列等。因此，细胞、组织或肿瘤特异性启动子与转录激活蛋白的基因 之间优选的连接方式是：细胞或组织或肿瘤特异性启动子--转录激活蛋 白基因--多聚A信号序列。

本发明直接控制目的基因(或治疗基因)表达的启动子是能被特定 的转录激活蛋白激活的组合启动子。它们有如下特点：1)含有能被特定 的转录激活蛋白识别的序列，如含有能被GAL4蛋白识别的序列5’- CGGAGTACTGTCCTCCG-3’或5’-CGGAGGACTGTCCTCCG-3’，或含有 四环素抑制子(tetR)蛋白的识别序列TCCCTATCAGTGATAGAGA，或 含有LexA蛋白的识别序5’-GTCGAGTACTGTATGTACATACAGTAC-3’ 等。2)含有TATAA序列或其他基本的启动子成份。理想的组合启动子在 极大多数细胞中其本身的活性很低或无活性。只有当能识别他们的特定 的转录激活蛋白存在时它们才有活性。因此，治疗基因或目的基因在极 大多数非靶细胞中并不表达。只有当细胞、组织或肿瘤特异性启动子在 靶细胞中启动其特异的转录激活蛋白表达后，治疗基因才在该转录蛋白 的作用下表达。例如，高等真核细胞并无识别GAL4识别序列的转录激活 蛋白。由GAL4识别序列5’-CGGAGGACTGTCCTCCG-3’(或5’- CGGAGTACTGTCCTCCG-3’)与TATAA序列组合而成的组合启动子在高 等真核细胞(如植物或哺乳类动物细胞)中并无活性。但将GAL4基因转入 到植物或哺乳类动物细胞后，GAL4即可激活含GAL4识别序列的组合启 动子，导致其下游的基因的表达。若GAL4蛋白受细胞、组织或肿瘤特异 性启动子控制，则组合启动子下游的基因的表达也受这些细胞、组织或 肿瘤特异性启动子的控制。在GAL4启动子中含一个拷贝的GAL4识别序 列即足以被GAL4所激活。但当启动子中含两个或两个以上拷贝的GAL4 识别序列时，其活性(被GAL4激活的能力)则更强。如含5个拷贝的GAL4 识别序列与一个拷贝的TATAA序列的组合启动子有如下序列：

cggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggag tactgtcctccgagcggagtactgtcctccg(N)ntatataa

其中N可以是a，t，c或g，n是大于或等于零的整数，酵母GAL4蛋白 的识别序列5’-CGGAGTACTGTCCTCCG-3’或5’- CGGAGGACTGTCCTCCG-3的拷贝数可以是一个，两个，三个，四个， 五个，六个，七个，八个，九个，十个或更多个。TATAA序列与GAL4 识别序列之间的序列可以有变化(N)n。本发明将这些仅含有GAL4识别序 列及TATAA序列的组合启动子称GT启动子。

本发明所述的治疗基因或目的基因是指任何可用于疾病治疗，生物 制品开发的基因。如用于肿瘤(癌症)治疗的基因(包括各种致死基因，细 胞凋亡基因，细胞毒性基因，毒性药物激活蛋白基因，免疫调节蛋白或 免疫因子基因，血管生长抑制蛋白基因等)，用于治疗心血管疾病的基因， 用于治疗传染性疾病的基因，用于治疗代谢性疾病的基因，用于治疗遗 传性疾病的基因，用于治疗肝脏疾病，肾脏疾病，自身免疫性疾病的基 因等。例如用于治疗糖尿病的胰岛素基因。用于肿瘤治疗的泡疹病毒胸 腺嘧啶激酶基因，胞嘧啶脱氨酶基因。细胞凋亡基因如Bax，Bik，Bak，Bid， TRAIL，Fas，Fas配体等基因。各类细菌或病毒的毒素基因如白喉杆菌类 毒素基因等。治疗基因或目的基因也可以是融合基因。融合基因是指将 两个或两个以上的基因(或基因片段)相连接，使它们拥有共同的启始码 (ATG)及共同的终止码(TAA，TAG，TGA)。但各基因片段编码的氨基酸 序列不变。如Bax，Bik，Bak，Bid，TRAIL，Fas，Fas配体等基因与荧光蛋白 基因融合而成的融合基因，Bax，Bik，Bak，Bid，TRAIL，Fas，Fas配体等基 因与免疫调节蛋白或免疫因子基因融合而成的融合基因，或者白介素 (interleukin)-2，白介素-4，白介素-12，GM-CSF，肿瘤坏死因子，干扰 素等基因。

治疗基因或目的基因也可以含有/或不含有内含子。组合启动子与治 疗基因之间的连接可以是直接连接，也可在两者之间加内含子。但是组 合启动子的序列必须在治疗基因的上游(即5’端)。在治疗基因的下游(即3’ 端)还必须有一多聚A信号序列。多聚A信号序列是真核细胞蛋白编码基 因下游的DNA序列，与转录终止及在mRNA上加多聚A序列有关。本发 明对多聚A信号序列没有特别的要求。它们可以是任何基因的多聚A信 号序列，如SV40病毒基因的多聚A信号序列，牛或人生长激素基因的多 聚A序列等。因此组合启动子与治疗基因或目的基因之间的连接方式是： 组合启动子--治疗基因--多聚A信号序列。

控制转录激活蛋白基因表达的各种成份(细胞或组织或肿瘤特异性 启动子，转录激活蛋白基因，及多聚A信号序列)与控制治疗基因的各种 成份(组合启动子，治疗基因，及多聚A信号序列)可以在同一遗传载体中， 也可以在两个不同的遗传载体中。当它们在同一遗传载体中时，它们作 为两个整体，连接顺序可前可后。它们之间也可插入其他序列。即它们 可以是：细胞或组织或肿瘤特异性启动子--转录激活蛋白基因--多聚A信 号序列--组合启动子--治疗基因--多聚A信号序列。也可以是：组合启动 子一治疗基因--多聚A信号序列--细胞或组织或肿瘤特异性启动子--转录激 活蛋白基因--多聚A信号序列。其中多聚A信号序列可以是同一来源(例 如都来自SV40基因的多聚A信号序列)或不同的来源(例如一个来自SV40 基因的多聚A信号序列，另一个来自生长激素基因的多聚A信号序列)。

本发明所述的靶细胞即病态细胞或需要治疗的细胞。如癌症患者的 癌细胞，传染病患者中被微生物感染的细胞，治疗肌营养不良患者时的 肌细胞，治疗糖尿病时用来表达胰岛素的细胞。因此在不同的疾病中， 靶细胞可以不同。

本发明所述的遗传载体是指能将基因转入细胞的各类制剂，可以是 DNA，质粒DNA，DNA/脂质体复合物，DNA/蛋白质复合物，DNA/多 聚物复合物，各种病毒载体(例如腺病毒载体，逆转录病毒载体，免疫缺 陷病毒(HIV)载体，泡疹病毒载体，牛痘病毒载体，腺病毒相关病毒(AAV) 载体)等(Cristiano，R.J.and Roth，J.A.Journal of Molecular Medicine，73： 479-86，1995)。当病毒作为载体应用时，部份或全部病毒基因被删除， 但含有病毒基因组复制及病毒颗粒包装所必须的序列。例如，逆转录病 毒载体，免疫缺陷病毒(HIV)载体，及腺病毒相关病毒(AAV)载体仅有与 复制，包装或整合有关的病毒序列。而所有病毒基因序列都被删除。多 数腺病毒载体是将腺病毒的E1基因删除，并在原E1基因处插入治疗基 因。有些腺病毒载体还删除腺病毒的E3，E4，E2或其他所有的病毒基 因(Kremer，E.J.and Perricaudet，M.British Medical Bulletin，51：31-44， 1995；Tuting，T.，Storkus，W.J.，and Lotze，M.T.Journal of Molecular Medicine，75：478-91，1997；Yeh，P.and Perricaudet，M.FASEB Journal， 11：615-23，1997)。因为病毒复制所必须的基因已被删除，当这些病毒 载体感染细胞(如靶细胞或其他正常细胞)时，它们不能再复制成新的载 体颗粒。因此，这些病毒载体也称复制缺陷型病毒。但在包装细胞中， 被删除的病毒基得到补充，病毒载体可以扩增并包装。例如，包装腺病 毒载体的293细胞或911细胞中含有被删除的腺病毒E1基因。E1缺陷的 腺病毒可以在293细胞或911细胞中复制。E3基因与腺病毒复制无关， 其缺陷并不影响病毒复制。复制E4，E2或其他腺病毒基因缺陷的载体 时，需在293细胞或911细胞中再加其相应的缺陷基因，这些腺病毒载 体才能得到复制(Kremer，E.J.and Perricaudet，M.British Medical Bulletin， 51：31-44，1995；Kovesdi，I.，Brough，D.E.，Bruder，J.T.，and Wickham，T.J. Current Opinion in Biotechnology，8：583-589，1997)。

有些病毒载体是条件复制型载体，即能在特定的细胞中(如肿瘤细胞) 复制。这些条件复制型病毒载体可以含有或不含有治疗基因(Kirn，D.H. and McCormick，F.Molecular Medicine Today，2：519-527，1996)。本发明 所述技术也可用来制备条件复制型病毒载体。以条件复制型腺病毒载体 为例，用端粒酶的逆转录酶(TERT)启动子控制GAL4-VP16融合基因的表 达，再以GAL4/TATA启动子(也称GT启动子，见上文)控制腺病毒的E1A 基因的表达。这样，腺病毒的E1A基因只能在TERT启动子有活性的细胞(如 癌细胞)中表达。因为E1A基因产物是腺病毒复制所必须，按上述方法改 建的条件复制型腺病毒载体亦只能在癌细胞中复制，将癌细胞杀死，以 达到治疗肿瘤的目的。但在正常细胞中TERT启动子无活性，这些条件复 制型腺病毒载体不能复制。所以，正常细胞不受影响。

附图简要说明

图1，报告基因LacZ在肿瘤中的表达。将1×106CEA阳性的肺癌细胞 A549细胞注入裸鼠皮下，当肿瘤长到直径0.5厘米时，直接往肿瘤注入总 量为5×1010腺病毒载体颗粒(约在100微升溶液中)的各种腺病毒载体。当注 入两种腺病毒载体时，其总两量不变，两载体的比例为1∶1。两天后取出 肿瘤，用组织化学方法分析LacZ基因产物--半乳糖甘酶的活性。a)磷酸 缓冲液；b)AD/GT-LacZ；c)AD/CEA-GV16；d)AD/CEA-LacZ；e)AD/GT- LacZ加AD/CEA-GV16；f)AD/CMV-LacZ。

图2，应用CEA启动子经GAL4/VP16融合基因间接驱动Bax基因对细 胞的杀伤作用。CEA阳性的人结肠癌细胞Lovo和人肺癌细胞A549，以 及CEA阴性的人成纤维细胞经相同总剂量(1000病毒颗粒/细胞)的腺病毒 载体处理(当应用两种腺病毒载体时它们的比例为1∶1)。Y轴表示细胞处理 后的存活率。X轴表示处理后的时间(0-72小时)。经磷酸缓冲液处理的细 胞的成活率定为1.0，并作为其他组的细胞成活率参照。图中的数值为三 次实验的平均值+/-标准差。菱形号＝磷酸缓冲液处理，星号＝腺病毒载体 AD/GT-LacZ加腺病毒载体AD/PGK-GV16，圆形＝腺病毒载体AD/GT-Bax 加腺病毒载体AD/CMV-GFP，三角形＝腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载 体AD/CEA-GV16，正方形＝腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体 AD/PGK-GV16。经腺病毒载体处理48小时后，腺病毒载体AD/GT-Bax加 腺病毒载体AD/PGK-GV16对三种细胞都有明显的杀伤作用。而腺病毒载 体AD/GT-Bax加腺病毒载体AD/CEA-GV16仅对CEA阳性的癌细胞有杀伤 作用(p＜0.01)。

图3，应用CEA启动子经GAL4/VP16融合基因间接驱动Bax基因对实 体动物瘤的生长抑制作用。将CEA阳性的人结肠癌细胞Lovo注入裸鼠皮 下，建立实体瘤。当肿瘤生长到直径0.4-0.5厘米时，对肿瘤进行三次治 疗(箭头所示)。每次总量为5×1010病毒颗粒/肿瘤。当应用两种腺病毒载体 时它们的比例为1∶1。Y轴表示肿瘤体积。X轴表示肿瘤细胞接种后的时间 (天)。图中的数值为每组五只以上动物的平均值+/-标准差。圆形＝磷酸缓 冲液处理，正方形＝腺病毒载体AD/CEA-GV16加对照腺病毒载体AD/E1-， 三角形＝腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体AD/PGK-GV16，星号＝腺病 毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体AD/CEA-GV16。经腺病毒载体AD/GT- Bax加腺病毒载体AD/CEA-GV16或腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体 AD/PGK-GV16后肿瘤生长明显抑制(p＜0.01)。

图4，在培养的细胞中应用TERT启动子直接驱动LacZ基因与应用 TERT启动子经GAL4/VP16融合基因间接驱动LacZ基因之比较。

H1299，A549，H460为人肺癌细胞，Lovo为人结肠癌细胞，NHFB为 人成纤维细胞。细胞在经相同总剂量腺病毒载体处理48小时后，用组织 化学方法检测半乳糖甘酶活性。图上方列出所用的腺病毒载体。 AD/TERT-LacZ＝直接驱动，AD/TERT-GV16加AD/GT-LacZ(1∶1)＝间接驱 动。AD/CMV-LaxZ＝阳性对照。

图5，应用TERT启动子经GAL4/VP16融合基因间接驱动Bax基因时 Bax基因在细胞中的表达。人肺癌细胞A549(1-4例)与正常人成纤维细胞 (5-8例)经磷酸缓冲液(例1、5)，腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体 AD/CMV-GFP(例2、6)，腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体AD/TERT- GV16(例3、7)，或腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体AD/PGK-GV16(例 4、8)等处理后48小时，用西方印迹法分析Bax表达。腺病毒载体的总剂 量为1000病毒颗粒/细胞。两病毒载体的比例为1∶1。以肌动蛋白(beta-actin) 为内对照，以经磷酸缓冲液处理组的Bax/肌动蛋白之比为1，计算出各组 的Bax蛋白的相对含量(见每例之下方)。应用PGK启动子间接驱动Bax基 因时，Bax在两种细胞中都表达，而应用TERT启动子间接驱动Bax基因时， Bax基因仅在癌细胞中表达。

图6，应用TERT启动子经GAL4/VP16融合基因间接驱动Bax基因对 细胞的杀伤作用。人肺癌细胞H1299与A549，以及正常人成纤维细胞 (NHFB)与正常人支气管上皮细胞(NHBE)经相同总剂量(1000病毒颗粒/细 胞)的腺病毒载体处理(当应用两种腺病毒载体时它们的比例为1∶1)。Y轴 表示细胞处理后的存活率。X轴表示处理后的时间(0-72小时)。经磷酸缓 冲液处理的细胞的成活率定为1.0，并作为其他组的细胞成活率参照。图 中的数值为三次实验的平均值+/-标准差。菱形号＝磷酸缓冲液处理，星号 ＝腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体AD/PGK-GV16，圆形＝腺病毒载体 AD/GT-Bax加腺病毒载体AD/TERT-GV16，三角形＝腺病毒载体AD/GT- Bax加腺病毒载体AD/CMV-GFP，正方形＝腺病毒载体AD/CMV-GFP加腺 病毒载体AD/PGK-GV16。经腺病毒载体处理48小时后，腺病毒载体 AD/GT-Bax加腺病毒载体AD/PGK-GV16对四种细胞都有明显的杀伤作 用。而腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体AD/TERT-GV16仅对癌细胞 有杀伤作用(p＜0.01)。

图7，应用TERT启动子经GAL4/VP16融合基因间接驱动Bax基因对 实体动物瘤的生长抑制作用。将人肺癌细胞H1299注入裸鼠皮下，建立实 体瘤。当肿瘤生长到直径0.4-0.5厘米时，对肿瘤进行三次治疗(箭头所示)。 每次总量为5×1010病毒颗粒/肿瘤。当应用两种腺病毒载体时它们的比例 为1∶1。Y轴表示肿瘤体积。X轴表示肿瘤细胞接种后的时间(天)。图中的 数值为每组五只以上动物的平均值+/-标准差。菱形＝磷酸缓冲液处理，黑 色正方形＝对照腺病毒载体AD/E1-，三角形＝腺病毒载体AD/GT-LacZ加 腺病毒载体AD/TERT-GV16，白色正方形＝腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病 毒载体AD/TERT-GV16，白色圆形＝腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体 AD/PGK-GV16。经腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体AD/TERT-GV16 或腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体AD/PGK-GV16治疗后肿瘤生长明 显抑制(p＜0.01)。

图8，Bax基因的肝脏毒性实验。将总量为5×1010的腺病毒载体颗粒 经尾静脉注入小鼠体内，两天后取出肝脏进行组织学分析。a)经磷酸缓冲 液处理，b)经腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体AD/CMV-GFP处理，c) 经腺病毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体AD/TERT-GV16处理，d)经腺病 毒载体AD/GT-Bax加腺病毒载体AD/PGK-GV16处理。应用腺病毒载体 AD/PGK-GV16可诱导腺病毒载体AD/GT-Bax中的Bax基因表达，而导致 肝脏细胞大面积凋亡。但腺病毒载体AD/TERT-GV16则不能诱导腺病毒 载体AD/GT-Bax中的Bax基因表达，对肝脏也无毒性。

图9，腺病毒载体AD/gTRAIL示意图。图上方的数字表示腺病毒基 因组的图距单位。人第五型腺病毒共有35935碱基对，将其分成100份， 每份为一个单位。其中1.3至9.3单位处的碱基被删除并被治疗基因的成份 取代。下方示治疗基因在这一载体中的结构。从右到左依次为GT启动子， GFP/TRAIL融合基因，SV40多聚A信号，人TERT启动子，GAL4/VP16融 合基因，牛生长素基因多聚A信号序列。

图10，应用流式细胞分析法检测基因表达与细胞凋亡。上排，检测 GFP基因或GFP-TRAIL融合基因的表达。下排，检测细胞凋亡。人肺癌 细胞H460用总剂量为2000载体颗粒/细胞的腺病毒载体感染，48小时后收 获细胞，并将其分成两分，一份检测GFP阳性细胞(上排，每图中的M2部 份)，另一分检测凋亡细胞(下排，每图中的M4部份)。所用的腺病毒载体 标在每图中。

图11，腺病毒载体AD/gTRAIL对实体动物瘤的生长抑制作用。将人 结肠癌细胞DLD癌注入裸鼠皮下，建立实体瘤。当肿瘤生长到直径0.4-0.5 厘米时，对肿瘤进行三次治疗(箭头所示)。每次总量为5×1010病毒颗粒/肿 瘤。当应用两种腺病毒载体时它们的比例为1∶1。Y轴表示肿瘤体积。X轴 表示肿瘤细胞接种后的时间(天)。图中的数值为每组十只以上动物的平均 值+/-标准差。方形＝磷酸缓冲液处理，三角形＝对照腺病毒载体AD/CMV- GFP，圆形＝腺病毒载体AD/GT-TRAIL加腺病毒载体AD/PGK-GV16，星 号＝腺病毒载体AD/gTRAIL。经腺病毒载体AD/GT-TRAIL加腺病毒载体 AD/PGK-GV16或腺病毒载体AD/gTRAIL治疗后肿瘤生长明显抑制 (p＜0.01)。

实施例

本发明描述的技术方案可以通过下述实施例证明其目的与效果。但 是本发明并不限于下述实施例。本发明描述的技术方案中许多细节与成 份可以改变，仍可达到同样的目的与效果。因此，那些细节与成份的改 变并不脱离本发明权利要求范畴。

实施例一 CEA启动子经GAL4/VP16融合蛋白基因间接驱动目的基因，可提高目的 基因(或治疗基因)在靶细胞中的表达水平。

癌胚抗原是一细胞膜糖蛋白，在一些正常组织，如肠上皮细胞等， 有少量表达。但在许多癌症细胞中(如结肠癌，肺癌等)它的表达水平明 显提高(Paxton，R.J.，Mooser，G.，Pande，H.，Lee，T.D.，and Shively，J.E.， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：920-924，1987；Thompson，J.A.，Grunert，F.， and Zimmermann，W.，Journal of Clinical Laboratory Analysis，5：344-66， 1991.)。一些研究表明，癌胚抗原基因的核心启动子是该基因转录起始 点上游的约400硷基对(Hauck，W.and Stanners，C.P.，Journal of Biological Chemistry，270：3602-10，1995；Schrewe，H.，Thompson，J.，Bona，M.， Hefta，L.J.，Maruya，A.，Hassauer，M.，Shively，J.E.，von Kleist，S.，and Zimmermann，W.，Molecular & Cellular Biology，10：2738-48，1990)。 这一核心启动子(也称CEA启动子)在癌胚抗原阳性的肿瘤细胞中活性较 强。因此，CEA启动子也用来表达治疗癌症的治疗基因，如单纯泡疹病 毒的胸嘧啶激酶(HSV/TK)基因，胞嘧啶脱氨酶(CD)基因等，以减少治疗 基因在正常细胞中表达，避免治疗基因的毒性。但是CEA启动子的应用 应其转录活性低而受到限制。为解决这一难题，Kijima等人应用Cre/loxP 系统来提高CEA启动子的转录活性。在他们的系统中，用一强启动子(如 巨细胞病毒早期基因启动子，简称CMV启动子)驱动治疗基因，但在CMV 启动子与治疗基因之间插入一无活性DNA片段，以阻止来自CMV启动子 的治疗基因表达。在这一无活性DNA片段的两端又加loxP序列。同时在 另一遗传载体中，用CEA启动子驱动Cre基因的表达。当表达治疗基因的 载体与表达Cre基因的载体同时转入细胞时，Cre基因在癌胚抗原阳性的 细胞中表达，其产物特异地识别loxP序列，使其发生重组，切除无活性 的DNA片段，治疗基因可以由CMV启动子表达。与直接用CEA启动子驱 动治疗基因相比，这方法可将治疗基因的表达水平提高5-50倍。

而我们则用本发明发明的技术来提高CEA启动子的表达水平。即用 CEA启动子驱动GAL4/VP16融合蛋白基因的表达，而以含GAL4识别序 列及TATAA序列的组合启动子(下称GT启动子)驱动治疗基因或目的基因 的表达。我们也将GAL4/VP16基因与治疗基因(目的基因)分别放入两个 遗传载体中。在此，我们应用E1缺失的腺病毒载体。我们将表达 GAL4/VP16基因的腺病毒载体称AD/CEA-GV16，而将表达治疗基因或目 的基因的腺病毒载体称AD/GT-Bax(表达人Bax基因)，或AD/GT-LacZ(表 达报告基因LacZ)。由于正常人体细胞不含能识别GAL4识别序列的转录 激活蛋白，GT启动子在正常人体细胞中并无活性。将AD/GT-Bax或 AD/GT-LacZ单独转入人体细胞，或将AD/GT-Bax或AD/GT-LacZ与不含 GAL4/VP16基因的对照腺病毒载体同时转入人体细胞，Bax基因或LacZ 基因都不表达。而将AD/GT-Bax或AD/GT-LacZ与AD/CEA-GV16载体同 时转入人体细胞时，就出现两种不同的情况。在癌胚抗原阳性的细胞中， CEA启动子驱动GAL4/VP16基因的表达，其产物GAL4/VP16蛋白又激活 GT启动子，使其驱动Bax基因或LacZ基因的表达。Bax基因或LacZ基因 的表达水平又与CEA启动子在细胞中的活性强弱有关。在一些CEA阳性 的癌细胞中，CEA启动子活性较强，GAL4/VP16表达较多，结果Bax基 因或LacZ基因的表达也较高。而在癌胚抗原阴性的细胞中，CEA启动子 无活性，GAL4/VP16基因不表达，GT启动子仍无活性，结果Bax基因或 LacZ基因也不表达，或表达很低。

LacZ基因是一常用的报告基因，可以通过检测细胞内半乳糖甘酶的 活性而得到基因的表达水平。为比较目的基因由CEA启动子直接驱动， 或由CEA启动子经GAL4/VP16--GT启动子间接驱动的基因表达水平，我 们也构建了由CEA启动子直接驱动LacZ基因的腺病毒载体(AD/CEA- LacZ)。当用相同的总载体剂量转染细胞时，在体外培养的癌胚抗原阳 性的细胞中(如肺细胞A549，结肠癌细胞DLD1和Lovo细胞)，用AD/GT- LacZ加AD/CEA-GV16转染细胞组的半乳糖甘酶的活性比用AD/CEA-LacZ 转染细胞组的半乳糖甘酶的活性高27-45倍(表1)。统计学检验表明两组处 理之间有显著差别(p＜0.005)。证明应用本发明所述的技术可大大提高由 CEA启动子控制的目的基因的表达水平。 表1，腺病毒载体感染细胞后半乳糖甘酶的活性 细胞株 CEA   半乳糖甘酶的活性(3组实验的平均值) 增强 倍数 AD/CEA-LacZ  AD/CEA-GV16+  AD/GT-LacZ  DLD1 阳性 3.0×106  9.9×107  33  Lovo 阳性 1.8×106  4.9×107  27  A549 阳性 2.0×106  9.1×107  45  HeLa 阴性 9.5×104  6.2×105  6.5  成纤维细胞 阴性 4.1×104  3.4×105  8.3

在癌胚抗原阴性的细胞中，尽管报告基因的表达水平也有增 加，但增加幅度远低于癌胚抗原阳性的细胞。说明应用这一技术在 提高CEA启动子驱动的目的基因表达水平的同时并不丧失CEA启动 子本身的特异性。

上述结果也在体内的实体瘤中得到证实。将人肺癌细胞(A549) 注入裸鼠皮下，建立实体瘤动物模型，再将同样总剂量(5×1010病毒 颗粒/裸鼠)而不的腺病毒载体直接注入实体瘤内，两天后取出肿瘤， 用组织化学或生物化学的方法分析半乳糖甘酶活性(图1)。结果表 明，注入腺病毒载体AD/GT-LacZ，或注入腺病毒载体AD/CEA- GV16，与注入生理盐水组的结果一样，都只有本底水平的LacZ基因 表达(约2×102酶活性单位/微克细胞蛋白)。当注入腺病毒载体 AD/CEA-LacZ时，LacZ基因表达水平为1.9×105酶活性单位/微克细 胞蛋白，而当注入腺病毒载体AD/CEA-GV16加AD/GT-LacZ时，LacZ 基因表达水平为(2.0×107酶活性单位/微克细胞蛋白。两者差别为100 多倍。阳性对照组注入腺病毒载体AD/CMV-LacZ，其LacZ基因表达 水平为7.02×106酶活性单位/微克细胞蛋白。这一结果也说明，应用 CEA启动子经GAL4/VP16间接驱动LacZ基因时，该基因的表达水平 也超过应用强启动子(如CMV启动子)驱动时的表达水平。 实施例二 应用CEA启动子经GAL4/VP16融合蛋白基因间接驱动治疗基因(人 Bax基因)，以达到选择性杀死CEA阳性癌细胞的目的。

人Bax基因是一与细胞凋亡有关的基因(Brady，H.J.and Gil-Gomez， G.，International Journal of Biochemistry & Cell Biology，30：647-650， 1998；Jurgensmeier，J.M.，Xie，Z.，Deveraux，Q.，Ellerby，L.，Bredesen， D.，and Reed，J.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，95：4997-5002，1998)。 当其蛋白产物Bax含量在细胞中增高时，可直接引导线粒体释放细胞色素 C。细胞色素C释放到胞浆后可激活一系列细胞内蛋白裂解酶原，引起各 种细胞蛋白的裂解，导致细胞死亡，细胞核碎裂。这一过程也称细胞凋 亡(Brady，H.J.and Gil-Gomez，G.，Intenrational Journal of Biochemistry & Cell Biology，30：647-650，1998；Jurgensmeier，J.M.，Xie，Z.，Deveraux， Q.，Ellerby，L.，Bredesen，D.，and Reed，J.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.， 95：4997-5002，1998)。许多证据表明，癌症的发生也与细胞凋亡功能紊 乱有关。我们在最近的一些实验中证明，直接将表达Bax基因的腺病毒感 染癌症细胞或注入实验动物瘤中，可提高Bax基因在癌细胞中的表达水 平，诱导癌细胞凋亡，抑制实体瘤生长(Chresta，C.M.，Arriola， E.L.，and Hickman，J.A.，Behring Institute Mitteilungen，97：232-40，1996； Miyashita，T.，Krajewski，S.，Krajewska，M.，Wang，H.G.，Lin，H.K.， Liebermann，D.A.，Hoffman，B.，and Reed，J.C.，Oncogene，9：1799-805， 1994)。而且，Bax基因能杀死p53基因敏感与不敏感的细胞，说明Bax 基因的应用范围比p53基因大(Kagawa，S.，Gu，J.，Swisher，S.G.，Lin，J.， Roth，J.A.，Lai，D.，Stephens，L.C.，and Fang，B.，Cancer Res，60：1157- 1161，2000)。但是，将Bax基因的载体加到正常细胞中时也引起正常细 胞的凋亡，造成毒性副作用(Kagawa，S.，Pearson，S.A.，Ji，L.，Xu，K.， McDonnell，T.J.，Swisher，S.，Roth，J.A.，and Fang，B.，Gene Ther，7：75- 79，2000)。因此，应用细胞、组织或肿瘤特异性启动子将Bax基因的表 达限制在特定的靶细胞中是应用Bax基因治疗肿瘤的关键。

为检测能否应用CEA启动子经GAL4/VP16间接驱动Bax基因在CEA 阳性的细胞中表达，我们比较了CEA启动子经GAL4/VP16间接驱动Bax 基因表达与PGK(3-磷酸甘油酸激酶)基因启动子经GAL4/VP16间接驱动 Bax基因表达对细胞的杀伤作用(Koch，P.，Guo，Z.S.，Kagawa，S.，Gu，J.， Roth，J.A.，and Fang，B.，Molecular Therapy：the Journal of the American Society of Gene Therapy，3：278-283，2001)。PKG启动子在极大多数细胞 中都有活性。我们最近的研究表明，用腺病毒作载体应用PGK启动子经 GAL4/VP16间接驱动Bax基因表达(即用腺病毒载体AD/PGK-GV16与 AD/GT-Bax同时感染细胞)，可杀死p53基因敏感与不敏感的癌细胞。但 因PGK启动子在大多数正常细胞中也有活性，将AD/PGK-GV16与 AD/GT-Bax同时注入小鼠尾静脉时，就导致小鼠肝脏的大面积细胞死亡 (Kagawa，S.，Gu，J.，Swisher，S.G.，Lin，J.，Roth，J.A.，Lai，D.，Stephens， L.C.，and Fang，B.，Cancer Res，60：1157-1161，2000；Kagawa，S.，Pearson， S.A.，Ji，L.，Xu，K.，McDonnell，T.J.，Swisher，S.，Roth，J.A.，and Fang，B.， Gene Ther，7：75-79，2000)。实验组动物肝脏60％以上的细胞发生凋亡， 而注入相同剂量的对照腺病毒载体仅引起＜1％的肝细胞凋亡。

为比较腺病毒载体AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax，与AD/CEA-GV16 加AD/GT-Bax对CEA阳性癌细胞与正常细胞的杀伤作用，我们应用同样 剂量与比例的AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax，与AD/CEA-GV16加AD/GT- Bax处理CEA阳性的人结肠癌细胞Lovo，肺癌细胞A549，及CEA阴性的 正常成纤维细胞(NHFB)，然后检测细胞的存活率。上述细胞同时也用对 照腺病毒载体AD/GT-LacZ加AD/PGK-GV16，或AD/GT-Bax加AD/CMV- GFP进行处理，最后与经磷酸缓冲液处理的细胞存活率进行比较，获得 各组细胞的相对存活率。如图2所示，应用对照腺病毒载体处理上述三 种细胞时，并不影响细胞的存活率。而当细胞经AD/PGK-GV16加 AD/GT-Bax处理后48小时，上述三种细胞的存活率都明显降低，与经磷 酸缓冲液处理的细胞或经对照腺病毒载体处理的细胞相比有显著差异 (p＜0.001)。说明应用PGK启动子经GAL4-VP16间接驱动Bax基因表达对 CEA阳性的癌细胞与CEA阴性的正常细多有杀伤作用。但当细胞经 AD/CEA-GV16加AD/GT-Bax处理后48小时，只有Lovo细胞及A549细胞 的存活率有明显降低，与经磷酸缓冲液处理的细胞或经对照腺病毒载体 处理的细胞相比有显著差异(p＜0.001)。而在正常成纤维细胞中，应用 AD/CEA-GV16加AD/GT-Bax处理并不影响细胞的存活率，说明应用CEA 启动子经GAL4/VP16间接驱动Bax基因的表达，可选择性地杀死CEA阳 性的癌细胞。

应用CEA启动子经GAL4/VP16间接驱动Bax基因的表达对CEA阳性 癌细胞的杀伤作用也在体内实验动物瘤中得到证实。将CEA阳性的人结 肠癌Lovo细胞注入裸鼠皮下建立实验动物瘤模型，再将各种腺病毒载体 注入肿瘤内，我们发现，应用腺病毒载体AD/CEA-GV16加AD/GT-Bax治 疗，与应用腺病毒载体AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax治疗，所得的效果 一样。两者都能明显地抑制实验动物瘤生长。与经磷酸缓冲液或对照腺 病毒载体治疗组相比，它们的抑制作用非常显著(p＜0.01)(图3)。

实施例三 应用GAL4/VP16融合蛋白基因提高由端粒酶(TERT)启动子驱动的目的基 因在靶细胞中的表达水平

端粒酶(telomerase)是真核细胞复制染色体末端(也称端粒)所需要的 酶(Kim，N.W.，Piatyszek，M.A.，Prowse，K.R.，Harley，C.B.，West，M.D.，Ho， P.L.，Coviello，G.M.，Wright，W.E.，Weinrich，S.L.，and Shay，J.W.，Science， 266：2011-2015，1994；Shay，J.W.，Werbin，H.，and Wright，W.E.，Ciba Foundation Symposium，211：148-55，1997)。它由多种成份组成，包括端 粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，简称TERT)，各种端粒酶相 关蛋白，相关RNA(端粒模板RNA)等。端粒酶在人体的生殖细胞，干细 胞，及胚胎早期的细胞中活性较高。而在人的绝大多数体细胞中，端粒 酶并无活性。但是，在绝大多的癌症细胞中，端粒酶活性明显增高(Kim， N.W.，Piatyszek，M.A.，Prowse，K.R.，Harley，C.B.，West，M.D.，Ho，P.L.， Coviello，G.M.，Wright，W.E.，Weinrich，S.L.，and Shay，J.W.，Science，266： 2011-2015，1994；Shay，J.W.，Werbin，H.，and Wright，W.E.，Ciba Foundation Symposium，211：148-55，1997)。现有的研究表明，端粒酶活 性与细胞中端粒酶逆转录酶的水平直接相关。端粒酶的其他各种成份在 端粒酶阳性或阴性的细胞中都存在，但端粒酶逆转录酶仅存在于端粒酶 阳性的细胞中(Meyerson，M.，Counter，C.M.，Eaton，E.N.，Ellisen，L.W.， Steiner，P.，Caddle，S.D.，Ziaugra，L.，Beijersbergen，R.L.，Davidofff，M.J.，Liu， Q.，Bacchetti，S.，Haber，D.A.，and Weinberg，R.A.，Cell，90：785-795， 1997；Nakamura，T.M.，Morin，G.B.，Chapman，K.B.，Weinrich，S.L.，Andrews， W.H.，Lingner，J.，Harley，C.B.，and Cech，T.R.，Science，277：955-9， 1997)。本发明中所述的端粒酶即指端粒酶逆转录酶。本发明中所述的 端粒酶启动子也是指端粒酶逆转录酶启动子(下称TERT启动子)。

日本Kyo教授的实验室首先报道了对人TERT启动子测序与功能分析 (Takakura M，Kyo S，Kanaya T，Hirano H，Takeda J，Yutsudo M，and Inoue M，Cancer Res.，59：551-557，1999)。TERT启动子的核心成份位于转 录起始部位上游约200-400硷基对处。该启动子富含GC序列，但不含TATA 及CAAT序列。该启动子也能被Myc蛋白所激活。

以腺病毒为载体，LacZ基因为报告基因，我们分析了TERT启动子在 五种不同来源的人癌细胞及两种正常人细胞(正常人成纤维细胞及支气管 上皮细胞)中的活性，并与CMV启动子比较(Gu，J.，Kagawa，S.，Takakura， M.，Kyo，S.，Inoue，M.，Roth，J.A.，and Fang，B.，Cancer Res.，60：5359- 5364，2000)。我们发现，TERT启动子在五种癌细胞中都有较高的活性， 而在正常细胞中活性极低。在癌细胞中，TERT启动子活性约低于CMV启 动子活性2-10倍。而在正常细胞中，TERT启动子活性比CMV启动子低500 多倍。将由人TERT启动子驱动的，表达LacZ基因的腺病毒载体 (AD/TERT-LacZ)，或由CMV启动子驱动的，表达LacZ基因的腺病毒载体 (AD/CMV-LacZ)分别注入小鼠尾静脉，再分析LacZ基因在各脏器中的表 达，我们发现，注入腺病毒载体(AD/CMV-LacZ)的小鼠的大多数肝脏细 胞(＞90％)及一脾脏细胞(约10％)有较高的LacZ基因表达。而注入腺病毒载 体(AD/TERT-LacZ)的小鼠的肝脏细胞及脾脏细胞中并无LacZ基因表达， 报告基因的表达水平与用磷酸缓冲液或对照腺病毒载体治疗的小鼠相 同。说明TERT启动子在体内的正常细胞中也无活性。因为经静脉注入的 腺病毒在小鼠中很少感染除肝脏，脾脏以外的器官，在其他各脏器中， 无论注入哪种腺病毒载体，报告基因的表达水平都与用磷酸缓冲液治疗 的小鼠相同。

为检验能否用本发明所述的技术提高TERT启动子的表达水平而不失 去其肿瘤特异性，我们构建了腺病毒载体AD/TERT-GV16(由TERT启动 子驱动GAL4-VP16基因的表达)，并比较了由TERT启动子直接驱动报告 基因LacZ，或由TERT启动子经GAL4/VP16间接驱动报告基因LacZ时， LacZ基因在细胞中的表达水平。人肺癌细胞A549，H460和H1299，人结 肠癌细胞Lovo，及正常人成纤维细胞(NHFB)分别用腺病毒载体 AD/TERT-LacZ，或AD/TERT-GV16加AD/GT-LacZ处理，48小时后分析 LacZ基因产物半乳糖甘酶的活性。当应用相同总载体剂量时，在各种癌 细胞中，应用AD/TERT-GV16加AD/GT-LacZ处理后的半乳糖甘酶的活性 比应用AD/TERT-LacZ处理后的半乳糖甘酶的活性高170-380倍，尽管前 者TERT与LacZ的基因剂量是后者的一半(表2，图4)。应用AD/TERT-GV16 加AD/GT-LacZ处理也提高半乳糖甘酶在正常人成纤维细胞中的水平，但 提高幅度远低于癌细胞(表2)。说明本发明所述的技术可以大大提高TERT 启动子的活性而不影响其肿瘤特异性。 表2，腺病毒载体感染细胞后半乳糖甘酶的活性 细胞株 半乳糖甘酶的活性(3组实验的平均值) 增强倍 数  AD/TERT-LacZ  AD/TERT-GV16 加AD/GT-LacZ  A549  6.3×104 2.2×107 349  H460  3.4×104 1.3×107 382  H1299  1.5×105 2.7×107 180  Lovo  1.3×105 2.3×107 177  NHFB  2.9×102 1.1×104 38

实施例四 应用TERT启动子经GAL4/VP16融合蛋白基因间接驱动治疗基因(人Bax基 因)，以达到选择性杀死癌细胞的目的

我们也检测了应用TERT启动子经GAL4/VP16间接驱动Bax基因时， Bax基因在癌细胞或正常细胞中的表达水平及对癌细胞或正常细胞的杀伤 作用。并与应用PGK启动子经GAL4/VP16间接驱动Bax基因相比较。当 应用同样剂量与比例的AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax，或AD/TERT-GV16 加AD/GT-Bax处理者人肺癌细胞A549，H1299，正常成纤维细胞(NHFB)， 或正常人支气管上皮细胞时，因PKG启动子在极大多数细胞中都有活性， AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax组Bax基因在癌细胞及正常细胞中都表达(图 5)，该组处理将癌细胞与正常细胞都杀死(图6)。但如图5-6所示，当细胞 经AD/TERT-GV16加AD/GT-Bax处理，只有癌细胞的Bax基因表达有明显 增高，正常细胞的Bax基因表达并不提高。AD/TERT-GV16加AD/GT-Bax 处理也只能杀死癌细胞，对正常细胞的活性无影响。说明应用TERT启 动子经GAL4/VP16间接驱动Bax基因的表达，可选择性地杀死癌细胞。

应用TERT启动子经GAL4/VP16间接驱动Bax基因的表达对癌细胞的 杀伤作用也在体内实验动物瘤中得到证实。将人肺癌H1299细胞注入裸 鼠皮下建立实验动物瘤模型，再将各种腺病毒载体注入肿瘤内，我们发 现，应用腺病毒载体AD/TERT-GV16加AD/GT-Bax治疗，与应用腺病毒 载体AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax治疗，所得的效果一样。两者都能明显 地抑制实验动物瘤生长。与经磷酸缓冲液或对照腺病毒载体治疗组相比， 它们的抑制作用非常显著(p＜0.01)(图7)。

为检验能否应用TERT启动子减少Bax基因在体内治疗时的毒性作 用，我们比较了经尾静脉注入腺病毒载体AD/TERT-GV16加AD/GT-Bax， 或腺病毒载体AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax对肝脏的损伤作用。当注入 AD/PGK-GV16加AD/GT-Bax(总量为5×1010病毒颗粒/小鼠，两载体的比 例为1∶1)时，小鼠的肝脏细胞发生大面积(＞60％)的死亡(图8)，血清谷丙 转氨酶，谷草转氨酶活性比正常高出100多倍，说明肝脏有严重损伤。多 数小鼠在2-3天内死亡。而当注入相同总量与比例的腺病毒载体 AD/TERT-GV16加AD/GT-Bax时，小鼠的肝脏与注入磷酸缓冲液或对照 腺病毒载体组相同，肝组织并无明显的变化(图8)。血清谷丙转氨酶，谷 草转氨酶活性也在正常范围。这一结果表明，应用TERT启动子可以防止 Bax基因对正常细胞的毒性作用。

实施例五 应用TERT启动子经GAL4/VP16融合蛋白基因间接驱动人TRAIL基因，以 达到肿瘤特异性表达及肿瘤治疗的目的。

在上述实施例中，表达GAL4/VP16融合蛋白基因的各种成份(启动 子、基因及多聚A信号序列)与表达治疗基因(或报告基因)的各种成份分别 置于两个不同的遗传载体中。当两个载体同时感染靶细胞时，治疗基因(或 报告基因)才得以表达。但是，表达GAL4/VP16融合蛋白基因的各种成份 与表达治疗基因(或报告基因)的各种成份也可放在同一载体中。例如，我 们构建的由TERT启动子经GAL4间接表达人TRAIL基因与碌色荧光蛋白 (green fluorescent protein，简称GFP)基因的融合基因的载体就是将两组基 因的表达成份放在同一载体上。

TRAIL基因又称肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，简称TRAIL)基因(Ashkenazi，A.，Pai，R.C.，Fong， S.，Leung，S.，Lawrence，D.A.，Marsters，S.A.，Blackie，C.，Chang，L.， McMurtrey，A.E.，Hebert，A.，DeForge，L.，Koumenis，I.L.，Lewis，D.，Harris， L.，Bussiere，J.，Koeppen，H.，Shahrokh，Z.，and Schwall，R.H.，Journal of Clinical Investigation，104：155-162，1999；Degli-Esposti，M.To die or not to die--the quest of the TRAIL receptors.，Journal of Leukocyte Biology，65： 535-542，1999；Griffith，T.S.and Lynch，D.H.，Current Opinion in Immunology，10：559-563，1998)。TRAIL与肿瘤坏死因子有很大的同源 性，两者都是细胞膜蛋白，两者都能引起肿瘤细胞的死亡。但与肿瘤坏 死因子不同，TRAIL在多数正常细胞中(肝、脑、睾丸细胞除外)都表达， 并且对正常细胞无毒性作用(Ashkenazi，A.，Pai，R.C.，Fong，S.，Leung，S.， Lawrence，D.A.，Marsters，S.A.，Blackie，C.，Chang，L.，McMurtrey，A.E.， Hebert，A.，DeForge，L.，Koumenis，I.L.，Lewis，D.，Harris，L.，Bussiere，J.， Koeppen，H.，Shahrokh，Z.，and Schwall，R.H.，Journal of Clinical Investigation，104：155-162，1999)。然而，最近的研究表明，TRAIL蛋白 可能对人的肝脏细胞有毒性(Jo，M.，Kim，T.H.，Seol，D.W.，Esplen，J.E.， Dorko，K.，Billiar，T.R.，and Strom，S.C.，Nature Medicine，6：564-567， 2000)。我们在最近的研究中证明，将TRAIL基因或GFP/TRAIL融合基 因直接转入癌细胞，可诱导癌细胞凋亡并抑制肿瘤生长。不仅如此，将 TRAIL基因或GFP/TRAIL融合基因转入癌细胞后还可引起转染细胞周围 的癌细胞凋亡，此现象也称旁观者效应(bystander effect)。动物实验证明， 人TRAIL基因对小鼠的肝脏无毒性作用(Kagawa，S.，He，C.，Gu，J.，Koch， P.，Rha，S.J.，Roth，J.A.，Curley，S.A.，Stephens，L.C.，and Fang，B.，Cancer Res，61：3330-3338，2000)。但体外培养的细胞实验证明，人TRAIL基因 对正常人肝细胞有杀伤作用。为防止肝细胞毒性作用，我们构建了由TERT 启动子经GAL4/VP16间接表达GFP/TRAIL融合基因的腺病毒载体(称 AD/gTRAIL)。在这一载体中，表达GAL4/VP16融合蛋白基因的各种成份 与表达治疗基因(GFP/TRAIL融合基因)的各种成份都放在同一载体中(图 9)。

在腺病毒载体AD/gTRAIL中，治疗基因为GFP/TRAIL融合蛋白，其 表达水平可通过流式细胞分析检测GFP阳性的细胞进行测量。如图10所 示，用相同总量的腺病毒载体感染人肺癌细胞H460(1500病毒颗粒/细 胞)，两天后收获细胞并将样品分成两份，一份经流式细胞分析检测GFP 阳性的细胞，另一份用DNA染料染色后分析凋亡细胞，即分别得到GFP 阳性细胞百分比及凋亡细胞百分比。当细胞用磷酸缓冲液治疗时，即得 本底GFP阳性细胞为0.88％，本底凋亡细胞为4.42％。而当细胞用表达GFP 蛋白的对照腺病毒载体AD/CMV-GFP治疗时，即得GFP阳性细胞为 71.1％，凋亡细胞为4.0％。说明

AD/CMV-GFP可导致GFP在细胞内表达，但GFP的表达对细胞无杀 伤作用。当细胞用腺病毒载体AD/gTRAIL治疗时，GFP阳性细胞为 61.3％，凋亡细胞为32.4％。说明用AD/gTRAIL感染细胞时，GFP/TRAIL 融合蛋白在癌细胞种表达，并将癌细胞杀死。当细胞用腺病毒载体 AD/GT-TRAIL加腺病毒载体AD/PGK-GV16治疗时，GFP阳性细胞为 3.7％，凋亡细胞为34.3％。说明当癌细胞表达TRAIL基因时，因无GFP 成份存在，细胞仍然是GFP阴性，但TRAIL基因的表达即可将癌细胞杀 死。用同样的方法，我们可检测上述的治疗方法对不同来源的癌细胞或 正常细胞进行分析。所得结果见表3。 表3治疗后GFP阳性与凋亡细胞数 细胞 磷酸缓冲液 AD/CMV-GFP  AD/gTRAIL  AD/GT-TRAIL +AD/PGK- GV16 GFP +％ 凋亡 ％ GFP+ ％ 凋亡 ％ GFP+ ％ 凋亡 ％ GFP+ ％ 凋亡 ％  Lovo  0.8  1.7  54.2  2.5  64.7  67.2  3.7  70.8  A549  0.3  1.9  91.1  5.6  87.4  30.2  1.9  53.8  DLD1  1.1  8.9  72.2  3.6  56.5  77.5  2.2  72.8  H460  0.9  4.4  71.1  4.0  61.3  32.3  3.7  34.3  NHPH  0.2  2.4  50.2  2.4  0.2  2.8  0.2  30.6  NHFB  0.4  0.7  37.0  0.4  0.5  2.0  0.3  3.5

表3中Lovo与DLD1为人结肠癌细胞，A549与H460为人肺癌细 胞，NHPH为正常人原代肝细胞，NHFB为正常人成纤维细胞。上表 说明，TRAIL基因对癌细胞Lovo，DLD1，A549，H460以及正常人 原代肝细胞有杀伤作用，而对正常人成纤维细胞无毒性作用。当用 TERT启动子经GAL4/VP16间接驱动GFP/TRAIL融合基因时，该融 合基因在癌细胞中表达较高，并将癌细胞杀死。但在正常人原代肝 细胞及正常人成纤维细胞中，该基因不表达，腺病毒载体AD/gTRAIL 对这两种正常细胞都无毒性作用。

实施例六 腺病毒载体AD/gTRAIL对实体瘤的抑制作用

为检验腺病毒载体AD/gTRAIL在肿瘤治疗上可用性，我们检测了 它在实验动物瘤中对肿瘤生长的抑制作用。将人结肠癌细胞DLD1注入 裸鼠皮下建立实验动物瘤模型。当肿瘤生长到直径为0.5厘米时，再将 5×1010腺病毒载体颗粒注入肿瘤内，每四天一次，共三次。然后跟宗肿 瘤大小的变化。我们发现，应用腺病毒载体AD/PGK-GV16加AD/GT- TRAIL治疗，与应用腺病毒载体AD/gTRAIL治疗，所得的效果一样。 两者都能明显地抑制实验动物瘤生长。与经磷酸缓冲液或对照腺病毒载 体AD/CMV-GFP治疗组相比，它们的抑制作用非常显著(p＜0.01)(图11)。 说明应用腺病毒载体AD/gTRAIL治疗与应用表达TRAIL基因的双腺病毒 载体AD/PGK-GV16加AD/GT-TRAIL治疗一样，都能达到抑制肿瘤生长 的效果。