技术领域
[0001] 本
发明涉及一种分子标记及其应用，具体涉及一种与棉花的两套细胞质雄性不育三系材料恢复系恢复基因连
锁的InDel分子标记及应用，因此可建立简单可行的可同时鉴定两套棉花恢复基因类型和杂交种的纯度体系。
背景技术
[0002] 棉花是世界上重要的经济作物也是重要的
纤维能源作物，在农业生产中具有重要的地位和意义。育种家已经利用棉花的
杂种优势显著提高棉花产量、改良品质、提高抗性。杂交制种是利用杂种优势的有效方式，棉花杂交品种比常规品种增产约15％。在生产实践中，棉花杂交制种的常用方法为人工去雄
授粉法、化学杀雄法和“三系配套”法。人工去雄授粉法由于人工
费用逐年增高成本越来越高，且杂交种纯度低，无法保证
种子质量；化学杀雄法，可减少人工去雄的人
力物力投入，但杀雄效果不稳定且易造成环境污染；利用细胞质雄性不育三系配套法制种程序简便，人力投入小、减少物力消耗、种子纯度较高、成本较低等优点，适合大面积制种，这将成为杂交棉商业化制种最优途径之一。推广三系杂交棉花，对于增加植棉效益，提高棉农收入，稳定杂交棉种植面积，发展棉花加工业等都具有重要意义。
[0003] 目前研究较多的两套细胞质雄性不育材料为三裂棉细胞质雄性不育(CMS-D8)和哈克尼西棉细胞质雄性不育(CMS-D2)。选育强优势三系杂交组合的过程缓慢，棉花综合农艺性状优良恢复力强的恢复系很难获得，优良恢复系亲本种质资源匮乏的原因如下：棉花细胞质雄性不育恢复基因来源狭窄，恢复能力受限制，质核互作机理还未清晰，育性恢复的相关生理机制还未研究清楚，棉花的恢复基因来源于哈克尼西棉和三裂棉难以
定位和克隆。因此，现在三系杂交棉品种选育的长期目标及重要任务是选育和改良强恢复力的优良恢复系和扩充三系杂交育种亲本的种质资源，丰富棉花三系制种的亲本组合。开发与棉花恢复基因紧密连锁稳定遗传的InDel标记用于优良恢复系的选育和杂交种的生产，为分子辅助选择育种提供与目标基因共分离的标记，借助分子标记辅助育种
加速恢复基因的积累。
[0004] 目前，育种家通常采用常规杂交技术与分子标记辅助育种相结合的方法对优良恢复系进行选育和改良，弥补了传统育种的选育周期长，占地面积大，田间工作量大，效率较低等缺点。而且，在三系杂交制种过程中的关键是保证恢复系的纯度，杂交种是恢复系与不育系杂交获得的F1代，一旦混杂，将会造成杂交种出现不育的后果，降低杂交种纯度，杂交种检验不合格，造成制种农户和制种公司的经济损失。分子标记不受植株发育阶段、生长环境因素以及基因是否表达的影响，具有数量非常丰富，稳定遗传等特点可以从DNA
水平反映出核苷酸序列的差异。因此，开发稳定准确易检测的共显性InDel分子标记运用于分子标记辅助选择技术，能够解决传统常规育种过程中田间性状鉴定的耗时、费力、准确性差等缺点，可在种子和植株任何生育时期鉴定单株含有恢复基因的类型和基因型，提高效率，保证恢复系种子的纯度，缩减育种时间，以满足生产实践需求。
发明内容
[0005] 本发明提供了一种与棉花细胞质雄性不育恢复基因共分离的InDel分子标记与该InDel分子标记的引物，来解决传统常规育种方法选育恢复系和改良恢复系所存在的问题。本发明利用同一标记能够同时区分棉花的两套细胞质雄性不育恢复系的恢复基因，且可以鉴定不同三系配套的杂交种，还可以检测杂交种的纯度。本发明构建了一个鉴定棉花是否含有恢复基因且能区分恢复基因类型(Rf1/Rf2)，保证杂交种纯度的体系。
[0006] 本发明提供的一种InDel标记，不仅与哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复基因Rf1连锁而且与三裂棉细胞质雄性不育恢复基因Rf2连锁，该核苷酸序列的插入/缺失长度多态性呈现在琼脂糖凝胶
电泳图上可鉴定棉花单株是否含有恢复基因且能判定含有恢复基因的类型。
[0007] 本发明还提供了一对InDel分子标记的引物，其特征是，上游引物为：5’-ACTCAACTGTCTTCCTCTTCTCA-3’(SEQ ID NO .1)；下游引物为：5’-TGGGAGCCTAATATATGTAATGGTG-3’(SEQ ID NO.2)。
[0008] 本发明还提供了上述的InDel分子标记引物在鉴定哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系基因Rf1与三裂棉细胞质雄性不育恢复系基因Rf2中的应用。
[0009] 本发明还提供了上述的InDel分子标记引物在对不同恢复基因(Rf1/Rf2)的棉花新恢复系材料的选育方面的应用。
[0010] 本发明还阐述了一种采用上述的InDel分子标记引物鉴定哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系基因Rf1与三裂棉细胞质雄性不育恢复系基因Rf2的可行方法，其特征是：
[0011] 1)以待测的两套三系棉花材料的基因组DNA为模板，用上述的InDel分子标记引物进行PCR扩增。
[0012] 2)对上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；
[0013] PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示出现两条带，如果在376bp和408bp处显示特异扩增条带，则为含三裂棉细胞质雄性不育恢复基因Rf2杂合位点的材料；如果在376bp和562bp处显示特异扩增条带，则为含哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复基因Rf1杂合位点和的材料；
[0014] PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示一条带，如果只在376bp处显示特异扩增条带，则为不含恢复基因位点的材料；如果只在408bp处显示特异扩增条带，则为含三裂棉细胞质雄性不育恢复基因Rf2纯合位点的恢复系材料；如果只在562bp处显示特异扩增条带，则为含哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复基因Rf1纯合位点的恢复系材料。
[0015] 本发明提供的鉴定方法，用于棉花的两类细胞质雄性不育相配套的恢复系的种质资源的恢复基因的鉴定，可以显著减少田间材料的鉴定工作量，提高准确性，确保恢复系材料和棉花恢复系种子的纯度。该方法用于恢复系的选育和改良，可以加速选育
进程，降低育种成本，提高鉴定效率。该方法用于三系杂交制种，可以保证三系杂交种种子纯度，且明确材料所包含的恢复基因的类型以及基因型。
[0016] 与
现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0017] 1)多效：本InDel标记可以鉴定棉花的两套细胞质雄性不育的不同的恢复基因类型，还可以鉴定是否含有恢复基因位点以及恢复基因位点是否纯合，因此比单独检测一套细胞质雄性不育，其适用范围更广(尤其适用于两套细胞质雄性不育相配套的杂交的情况)，实用性更好(使用前不用区分是哪一套细胞质雄性不育材料，鉴定结果可区分细胞质雄性不育恢复系)。
[0018] 2)准确率高：InDel标记具有简单可靠、可重复、易辨别等优点，只需要经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳即可检测。本发明利用一对InDel标记引物，能够从分子水平上区分出恢复系材料所含恢复基因类型(Rf1/Rf2)、三系杂交种以及不含恢复基因的材料，且不受植株生育时期和环境因素的影响，提高了恢复基因鉴定的准确性与高效性。
[0019] 3)操作简单，鉴定快速：InDel标记对不同恢复基因(Rf1/Rf2)的棉花新恢复系材料的选育和保证三系杂交种种子纯度方面具有重要作用。与常规育种相比，InDel标记节约了大量人力、物力。在恢复系改良、构建新的恢复系以及三系杂交制种过程中，可以适量减少田间性状调查以及多带回交试验的工作量，只需要提取棉花DNA后，用InDel引物特异性扩增后通过琼脂糖凝胶电泳就可鉴定，整个鉴定检测的过程仅需约3小时，短时，高效且鉴定结果比田间性状调查更准确。
[0020] 4)简单实用：与SSR标记和CAPS标记相比，InDel标记具有分布
密度大、准确性较高、重演性较好、易鉴定等特点，用本发明的InDel标记引物进行PCR扩增时，没有非特异性条带扩增。本发明的InDel分子标记应用于棉花含有不同恢复基因的恢复系的分子辅助选择育种研究中有良好前景，本发明用于棉花杂交种商业制种的种子纯度鉴定工作中有很大实用价值。
附图说明
[0021] 图1为：三裂棉细胞质雄性不育的三系材料、哈克尼西棉细胞质雄性不育的三系材料及参考基因组的序列比对结果，其中TM-1为陆地棉参考基因组序列；A8、B8、R8、A2、B2、和R2分别为三裂棉细胞质雄性不育相配套的不育系、保持系、恢复系，和哈克尼西棉细胞质雄性不育相配套的不育系、保持系和恢复系材料中对应的D05
染色体上差异
片段的序列；
[0022] 图2为：InDel标记对棉花的两套细胞质雄性不育三系配套的亲本以及杂合子，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果。1-8泳道分别为三裂棉细胞质雄性不育的不育系、保持系、恢复系和含有Rf2恢复基因的杂合子，和哈克尼西棉细胞质雄性不育的不育系、保持系、恢复系和含有Rf1恢复基因的杂合子。
[0023] 图3为：InDel标记对随机抽样的24份三裂棉雄性不育恢复系回交一代群体材料(BCF1)的鉴定结果，其中2泳道为恢复基因Rf2杂合单株；1泳道为不含恢复基因Rf2单株。
[0024] 图4为：InDel标记对随机抽样的24份哈克尼西细胞质雄性不育恢复系的F2群体材料的鉴定结果，其中a泳道为恢复基因Rf1纯合单株；b泳道为恢复基因Rf1杂合单株，c泳道为不含恢复基因Rf1单株。
具体实施方式
[0025] 下面结合具体
实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0026] 实施例1：
[0027] 三裂棉细胞质雄性不育的三系材料、哈克尼西棉细胞质雄性不育的三系材料及参考基因组的序列比对结果如图1所示，从图1可以看出：在三裂棉细胞质雄性不育恢复系(R8)中具有插入缺失变异的核酸序列，其序列长度408bp；在哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系(R2)中具有插入缺失变异的核酸序列，其序列长度562bp；其中不育系和保持系的序列长度均为376bp。
[0028] 根据该InDel位点、序列和PCR引物设计原则，在其上下游设计引物，成功将其转化为InDel标记引物，扩增该InDel分子标记的引物对如表1：
[0029] 表1：InDel分子标记引物
[0030]
[0031] 在三裂棉细胞质雄性不育恢复系纯合恢复基因Rf2位点基因组中特异性扩增出发生插入缺失变异的核酸序列为408bp的条带，在Rf2基因杂合材料的基因组中扩增376bp和408bp的条带。在哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系纯合基因Rf1基因组中特异扩增出发生插入缺失序列的562bp的条带，在Rf1杂合材料的基因组中扩增出562bp和376bpbp的条带。
不含恢复基因的材料中扩增出没有发生插入缺失序列的376bp的条带。
[0032] 实施例2
[0033] 1、三裂棉雄性不育(CMS-D8)三系构建的回交一代群体(BC1F1)与哈克尼西棉雄性不育(CMS-D2)三系的恢复系与保持系(不育系)杂交F2群体的种子DNA的提取(CTAB法)。
[0034] 2、利用该InDel分子标记引物对，对提取的DNA进行PCR扩增。PCR反应体系如表2。
[0035] 表2 20μl PCR反应体系
[0036]
[0037] PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃
退火30s，72℃延伸20s，35个循环；然后72℃终延伸2min，4℃保存。
[0038] 对PCR产物进行琼脂糖凝胶(2.5％)电泳，用凝胶成像系统拍照保存，并对电泳结果进行条带分析。
[0039] 3、检测结果
[0040] 判断标准：
[0041] 三裂棉细胞质雄性不育材料：统计中凡是仅出现408bp条带的为含有纯和的恢复基因Rf2即三裂棉细胞质雄性不育的恢复系；若同时出现376bp和408bp条带，则为含有恢复基因Rf2杂合的材料或者杂交种；仅出现376bp条带即为不含有恢复基因Rf2的材料(保持系或者不育系)。
[0042] 哈克尼西棉雄性不育材料：统计中凡是仅出现562bp条带的为含有纯合的恢复基因Rf1即哈克尼西棉细胞质雄性不育的恢复系；若同时出现376bp和562bp条带，则为含有恢复基因Rf1的杂合材料或者杂交种；仅出现376bp条带即为不含有恢复基因Rf1的材料(保持系或者不育系)。
[0043] InDel标记对棉花的两套细胞质雄性不育三系配套的亲本以及杂合子，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，图2验证了上述的判断标准。
[0044] 采用InDel标记对随机抽样的24份三裂棉细胞质雄性不育BCF1材料进行鉴定的结果如图3所示。从图3可以看出：标号为1的泳道为不含恢复基因的单株，在376bp
位置出现特异条带；标号为2的泳道为恢复基因位点杂合的单株，同时出现408bp和376bp的目标条带。
[0045] 采用InDel标记对随机抽样的24份哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系和保持系获得的F2群体单株进行鉴定的结果如图4所示。从图4可以看出：a泳道为恢复基因Rf1纯合单株；b泳道为恢复基因Rf1杂合单株，c泳道为不含恢复基因Rf1单株。
[0046] 通过上述步骤即可简单快速的鉴定恢复基因，辨别恢复基因(Rf2/Rf1)类型，区分材料的基因型。能够在三系杂交种制种过程中保证恢复系的纯度，可以显著降低田间材料鉴定的工作量，加快常规杂交育种的工作进程，极大地提高育种效率和保证三系杂交种种子纯度，提高棉花产量。
[0047] 以上所述，仅为本发明最佳的实施方式，任何熟悉该技术领域的科技人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地获得的技术方案的简易变化或等效替换均属于本发明的保护范围。
