发明领域

本发明涉及取代的咪唑化合物及其药学上可接受的盐、酯或前药，这些化合 物与药学上可接受的载体的组合物，以及这些化合物的应用。

本领域状况

驱动蛋白是一种动力蛋白，利用三磷酸腺苷结合微管并产生机械力。驱动蛋 白的特征在于约350个氨基酸残基的动力域。已解析了几种驱动蛋白动力域的晶体 结构。

目前，已鉴别了约100种驱动蛋白-相关蛋白(KRP)。驱动蛋白与许多细胞生 物学过程有关，包括细胞器和囊泡的转运及内质网的维护。一些KRP与有丝分裂 纺锤体的微管相互作用或与染色体直接作用，表现为在细胞周期的有丝分裂阶段中 发挥重要作用。这些有丝分裂KRP是癌症治疗学的发展尤其感兴趣的。

驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)(也称为Eg5、HsEg5、KNSL1或KIF11)是几种类 似驱动蛋白的动力蛋白之一，位于有丝分裂纺锤体中，已知是两级有丝分裂纺锤体 的形成和/或发挥功能所必需的。

1995年，采用导向KSP羧基端的抗体耗竭KSP显示能使HeLa细胞停滞在带 有单星微管阵列的有丝分裂阶段(Blangy等，Cell 83：1159-1169，1995)。作为KSP 同源物的bimC和cut7基因突变将导致构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(Enos，A.P. 和N.R.Morris，Cell 60：1019-1027，1990)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces pombe) (Hagan，I.，and M.Yanagida，Nature 347：563-566，1990)中心体分离失败。用能够 在蛋白水平降低KSP表达的ATRA(全反式视黄酸)处理细胞或使用反义寡核苷酸 耗竭KSP，揭示了DAN-G胰腺癌细胞中的显著生长抑制，提示KSP可能与全反 式视黄酸的抗增殖作用有关(Kaiser，A.等，J.Biol.Chem.274，18925-18931，1999)。 有趣的是，显示爪蟾极光(×enopus laevis Aurora)-相关蛋白激酶pEg2可结合并磷酸 化X1Eg5(Giet，R.等，J.Biol.Chem.274：15005-15013，1999)。极光相关激酶的蛋 白质底物是癌症药物研发领域尤其感兴趣的。例如，结肠癌患者中极光1和2激酶 在蛋白水平和RNA水平过度表达并且发生基因扩增。

显示第一种可渗透细胞的小分子KSP抑制剂“单星(monastrol)”能使单极纺 锤体细胞停滞而不影响微管聚合作用，而诸如紫杉烷和长春花生物碱的常规化疗将 影响微管聚合(Mayer，T.U.等，Science 286：971-974，1999)。在基于表型的筛选中 已鉴定单星是一种抑制剂，提示该化合物可用作抗癌药物开发的前导物质。抑制作 用确定为相对于三磷酸腺苷是非竞争性的，并且快速可逆(DeBonis，S.等， Biochemistry，42：338-349，2003；Kapoor，T.M.等，J.Cell Biol.，150：975-988，2000)。

由于改善化疗的重要性，需要能够在体内有效抑制KSP和KSP-相关蛋白的 KSP抑制剂。

发明概述

本发明涉及通式I所表示的取代的咪唑化合物或其药学上可接受的盐、酯 或前药：

式中：

R1选自：氨基酰基、酰基氨基、羧基、羧基酯、烷基和取代的烷基，前提 是取代的烷基没有被芳基或取代芳基取代；

R2选自：氢、烷基和芳基；

R3和R4独立地选自：氢、羟基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环 烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环，条件 是R3或R4中只有一个是羟基；

或R3和R4与其结合的氮原子连接在一起形成杂环或取代的杂环；

R5选自：氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、 环烷基、取代的环烷基、杂环、取代的杂环、芳基、取代的芳基、杂芳基和取 代的杂芳基；

或R1和R5与其各自结合的碳原子和氮原子连接在一起形成杂环或取代的 杂环基团；

或者当R1和R5与其各自结合的碳原子和氮原子不形成杂环基团时，则R4 和R5与其结合的原子形成杂环或取代的杂环基团；

R8选自：L-A1，其中L选自-S(O)q-，其中q为1或2，以及任选地被羟基、 卤素或酰基氨基取代的C1-C5的亚烷基；和

A1选自：芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、取代的杂环、 环烷基和取代的环烷基；和

R6或R7中的任一个选自：环烷基、杂环、芳基和杂芳基，这些基团都可 任选地被-(R9)m所取代的，其中R9如本文所述，m是1-4的整数，和

R6或R7中的另一个选自：氢、卤素和烷基；

R9选自：氰基、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔 基、-CF3、烷氧基、取代的烷氧基、卤素和羟基；

当m是2-4的整数时，各个R9可相同或不同。

发明详述

A.本发明的化合物

如上所述，本发明化合物包括通式I的化合物或其药学上可接受的盐、酯 或前药：

式中：

R1选自：氨基酰基、酰基氨基、羧基、羧基酯、烷基和取代的烷基，前提 是取代的烷基没有被芳基或取代芳基取代；

R2选自：氢、烷基和芳基；

R3和R4独立地选自：氢、羟基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环 烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环，条件 是R3或R4中只有一个是羟基；

或R3和R4与其结合的氮原子连接在一起形成杂环或取代的杂环；

R5选自：氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、 环烷基、取代的环烷基、杂环、取代的杂环、芳基、取代的芳基、杂芳基和取 代的杂芳基；

或R1和R5与其各自结合的碳原子和氮原子连接在一起形成杂环或取代的 杂环基团；

或者当R1和R5与其各自结合的碳原子和氮原子不形成杂环基团时，则R4 和R5与其结合的原子形成杂环或取代的杂环基团；

R8选自：L-A1，其中L选自-S(O)q-，其中q为1或2，以及任选地被羟基、 卤素或酰基氨基取代的C1-C5的亚烷基；和

A1选自：芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、取代的杂环、 环烷基和取代的环烷基；

R6或R7中的任一个选自：环烷基、杂环、芳基和杂芳基，这些基团都可 任选地被-(R9)m所取代的，其中R9如本文所述，m是1-4的整数，和

R6或R7中的另一个选自：氢、卤素和烷基；

R9选自：氰基、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔 基、-CF3、烷氧基、取代的烷氧基、卤素和羟基；

当m是2-4的整数时，各个R9可相同或不同。

在一个本发明实施方式中，本发明化合物是通式II的化合物或其药学上可 接受的盐、酯或前药：

式中：

n是1、2或3；

p是0、1、2、3或4；

R3和R4独立地选自：氢、羟基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环 烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环，条件 是R3或R4中只有一个是羟基；

或者R3和R4与其结合的氮原子连接在一起形成杂环或取代的杂环；

R10选自：氢、任选地被选自下组的取代基所取代的烷基：羟基、烷氧基、 取代的烷氧基、氨基、取代的氨基、酰基氨基、卤素、含氮杂环、取代的含氮 杂环、含氮杂芳基和取代的含氮杂芳基；

R11选自：氰基、烷基、烯基、炔基、-CF3、烷氧基、卤素和羟基；当p 为2、3或4时，各个R11可相同或不同；

R12是烷基，

R13是氢或烷基，

R14选自：氢、卤素和烷基；

或R10和R12与其结合的碳原子或氮原子连接在一起形成杂环或取代的杂 环基团；

或者当R10和R12与其各自结合的碳原子和氮原子不形成杂环基团时，R4 和R10与其结合的原子形成杂环或取代的杂环基团；

A2选自：芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、取代的杂环、 环烷基和取代的环烷基。

在一个实施方式中，R1是烷基。在另一个实施方式中，R1选自：异丙基、 叔丁基和丙基。

在另一个实施方式中，R2是氢。

在一个实施方式中，R3和/或R4选自：烷基、取代的烷基和环烷基，所述烷基、 取代的烷基和环烷基选自：甲基、甲氧基乙基、呋喃-2-基甲基、2-羟乙基、环丙基 和异丙基。

在一个实施方式中，R3和/或R4是芳基或取代的芳基，所述芳基或取代的芳基 选自：4-氰基苯基、3，4-二氟苯基、2，3，5-三氟苯基、3，5-二硝基苯基和苯基。

在一个实施方式中，R3和/或R4是杂芳基或取代的杂芳基，所述杂芳基或取代 的杂芳基选自：噻吩-2-基、3，5-二甲基异噁唑-4-基和2，6-二氯代吡啶-4-基。

在一个实施方式中，R3和/或R4是杂环基团或取代的杂环基团，所述杂环或取 代的杂环基团是四氢吡喃-4-基或4-(乙氧基羰基)哌啶-4-基。

在一个实施方式中，R3或R4中任一个或R3和R4都是氢。在另一个实施方式 中，R3或R4之一是羟基。

在一个实施方式中，R3和R4与其结合的氮原子环化形成杂环或取代的杂环， 选自：1，1-二噁噻吗啉(dioxothiamorpholin)-N-基、1-噁噻吗啉-1-基、2-(氨基亚甲基) 吡咯烷-N-基、2-(甲氧基羰基)吡咯烷-N-基、2，6-二甲基吗啉-N-基、3-羟基哌啶-N- 基、3-羟基吡咯烷-N-基、4-(丁基磺酰基)哌嗪-N-基、4-(环丙基磺酰基)哌嗪-N-基、 4-(二甲基氨基)哌啶-N-基、4-(乙氧基羰基)哌嗪-N-基、4-(乙基磺酰基)哌嗪-N-基、 4-(异丙基磺酰基)哌嗪-N-基、4-(甲基羰基)哌嗪-N-基、4-(甲基磺酰基)哌啶-N-基、 4-(甲基磺酰基)哌嗪-N-基、4-(吗啉-N-基)哌啶-N-基、4-(哌啶-N-基)哌啶-N-基、4-(丙 基磺酰基)哌嗪-N-基、4-环己基哌嗪-N-基、4-羟基哌啶-N-基、4-异丙基哌嗪-4-基、 4-甲基哌啶-N-基、异噁唑烷-2-基、吗啉-N-基、哌嗪-N-基、哌啶-N-基、2-(肼基羰 基)吡咯烷-N-基和吡咯烷-N-基。

在一些实施方式中，R5是取代的烷基。在一个实施方式中，R5(或R10)选 自：-(CH2)3NH2、-(CH2)2CH(CH2OH)NH2、-CH2CH(F)CH2NH2、-CH2-[2-(CH2OH) 吡咯烷-3-基]、-CH2-[4-(OH)吡咯烷-3-基]、-CH2-C(F)(螺环吡咯烷-3-基)、 -(CH2)2CH(CH2F)NH2、-(CH2)2C(CH3)2NH2、-(CH2)2CH(CH3)NH2、-(CH2)CH(CH2 OCH3)NH2、-(CH2)2CH(CH2F)NHC(O)-[(2-CH3NHC(O))苯]和-(CH2)2CH(CH2F)-1，3- 二氧代-1，3-二氢异吲哚。

在一个实施方式中，R1和R5与其结合的原子一起形成杂环或取代的杂环基团， 该杂环基团是2-氧代-四氢嘧啶基。

在一个实施方式中，R6或R7中的一个是芳基或取代的芳基，所述芳基或取代 的芳基选自：苯基、3-氯苯基、3-氟苯基、2，5-二氟苯基和2，3，5-三氟苯基。

在一个实施方式中，R6或R7中的另一个(或R14)是氢。

在一个实施方式中，L是亚烷基，A1(或A2)是芳基或取代的芳基。

在一个实施方式中，L是亚甲基，A1(或A2)选自：苯基、3-氟苯基或3-羟基苯 基。

在一个实施方式中，R1是叔丁基，R2是氢，R3是氢，L是亚甲基，A1是苯基、 R6是苯基或取代的苯基，R7是氢。在另一个实施方式中，R1是叔丁基，R2和R3 是氢，L是亚甲基，A1是苯基，R6是被1-2个卤素取代基如氯或氟所取代的苯基。 在一个实施方式中，R1是叔丁基，R2和R3是氢，L是亚甲基，A1是苯基，R5是取 代的烷基，例如-(CH2)3NH2、-CH2CH(F)CH2NH2、-(CH2)2CH(CH2F)NH2、 -(CH2)2CH(CH2OCH3)NH2、-(CH2)2CH(CH3)NH2、-(CH2)2C(CH3)2NH2和 -(CH2)2CH(CH2OH)NH2。在一些实施方式中，R1是叔丁基，R2是氢，R3是氢，L 是亚甲基，A1是苯基，R6是苯基或取代的苯基，R7是氢，R4是烷基。在一个实施 方式中，R1是叔丁基，R6是氟取代的苯基，可以是3-氟苯基或二氟苯基。在其它 实施方式中，R1是异丙基，R6是氯取代的苯基，可以是3-氯苯基。

本发明代表性化合物

本发明范围内的具体化合物在实验部分的表1、2和3中阐述。

本发明方法和组合物

还提供了包含通式I和II所示化合物(包括其混合物和/或盐)与药学上可接受 的赋形剂或载体的组合物。

另一方面，本发明提供了在哺乳动物患者中治疗患有至少部分地由KSP介导 的疾病的方法。因此，本发明提供了治疗需要这种治疗的哺乳动物患者的方法，该 方法包括单独或与其它抗癌药联合给予所述患者治疗有效量的通式I和II的化合物 (包括其混合物)。

B.定义与综述

如上所述，本发明涉及新型取代的咪唑化合物。

应理解，本文所用术语是仅仅为了描述具体实施方式的目的，而不是限制本 发明的范围。必须注意，说明书和权利要求书中所用单数形式“一个”和“这个” 包括复数涵义，除非另外清楚指出。在以下说明书和权利要求书中，将参考一系列 限定为具有以下含义的术语。

本文所用术语“烷基“是指具有1-6个碳原子，更优选1-3个碳原子的单价饱 和脂族烃基基团。该术语的示例有甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、 正戊基等。

“取代的烷基”是指具有1-3个，优选1-2个选自下组的取代基的烷基基团： 烷氧基、取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、 芳基、取代的芳基、芳氧基、取代的芳氧基、氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、羧 基酯、环烷基、取代的环烷基、螺环环烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、取代 的杂环、-SO2-烷基和-SO2-取代的烷基。

“亚烷基”是指优选具有1-5个，更优选1-3个碳原子的直链或支链的二价饱 和脂族烃基基团。该术语的示例有：亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、正-亚丙 基(-CH2CH2CH2-)、异-亚丙基(-CH2CH(CH3)-)或(-CH(CH3)CH2-)等。

“烷氧基”是指“烷基-O-”，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、异 -丙氧基、正-丁氧基、叔-丁氧基、仲-丁氧基、正-戊氧基等。

“取代的烷氧基”是指“取代的烷基-O-”基团。

“酰基”是指H-C(O)-、烷基-C(O)-、取代的烷基-C(O)-、烯基-C(O)-、取代的 烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、取代的炔基-C(O)-环烷基-C(O)-、取代的环烷基-C(O)-、 芳基-C(O)-、取代的芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-、取代的杂芳基-C(O)-、杂环-C(O)-和 取代的杂环-C(O)-，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔 基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和 取代的杂环如本文所定义。

“氨基酰基”是指-C(O)NRR基团，其中每个R独立地选自：氢、烷基、取代 的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、取 代的环烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、取代的杂环，其中每个R与氮原子 连接到一起形成杂环或取代的杂环，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、 炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的 杂芳基、杂环和取代的杂环如本文所定义。

“酰氧基”是指烷基-C(O)O-、取代的烷基-C(O)O-、烯基-C(O)O-、取代的烯 基-C(O)O-、炔基-C(O)O-、取代的炔基-C(O)O-、芳基-C(O)O-、取代的芳基-C(O)O-、 环烷基-C(O)O-、取代的环烷基-C(O)O-、杂芳基-C(O)O-、取代的杂芳基-C(O)O-、 杂环-C(O)O-和取代的杂环-C(O)O-，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、 炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的 杂芳基、杂环和取代的杂环如本文所定义。

“氧酰基”或“羧基酯”是指-C(O)O-烷基、-C(O)O-取代的烷基、-C(O)O-烯 基、-C(O)O-取代的烯基、-C(O)O-炔基、-C(O)O-取代的炔基、-C(O)O-芳 基、-C(O)O-取代的芳基、-C(O)O-环烷基、-C(O)O-取代的环烷基、-C(O)O-杂芳 基、-C(O)O-取代的杂芳基、-C(O)O-杂环和-C(O)O-取代的杂环，其中烷基、取代 的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、芳基、 取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环如本文所定义。

“烯基”是指具有至少一个、优选1-2个烯键不饱和位点的2-6个碳原子、优 选2-4个碳原子的烯基基团。这些基团的示例有乙烯基、烯丙基、丁-3-烯-1-基等。

“取代的烯基”是指具有1-3个，优选1-2个选自下组的取代基的烯基基团： 烷氧基、取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、 芳基、取代的芳基、芳氧基、取代的芳氧基、氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、羧 基酯、环烷基、取代的环烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环，前提 是任意羟基取代基不是连接于乙烯基(不饱和)碳原子。

“炔基”是指具有至少一个、优选1-2个炔基不饱和位点的2-6个碳原子、优 选2-3个碳原子的炔基基团。

“取代的炔基”是指具有1-3个、优选1-2个选自下组的取代基的炔基基团： 烷氧基、取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、 芳基、取代的芳基、芳氧基、取代的芳氧基、氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、羧 基酯、环烷基、取代的环烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环，前提 是任意羟基取代基不是连接于炔键碳原子。

“氨基”是指-NH2基团。

“氰基”是指-CN基团。

“取代的氨基”是指-NR′R″基团，其中R′和R″独立地选自：氢、烷基、取 代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、环烷基、 取代的环烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、取代的杂环、-SO2-烷基、-SO2-取 代的烷基，其中R′和R″与其结合的氮原子连接在一起形成杂环或取代的杂环基团， 条件是R′和R″不全是氢。当R′是氢，R″是烷基时，有时取代的氨基基团是指烷基 氨基。当R′和R″都是烷基时，取代的氨基基团有时称为二烷基氨基。单取代的氨 基是指R′或R″之一是氢但不都是氢。双取代的氨基是指R′或R″都不是氢。

“酰基氨基”是指-NRC(O)烷基、-NRC(O)取代的烷基、-NRC(O)环烷基、 -NRC(O)取代的环烷基、-NRC(O)烯基、-NRC(O)取代的烯基、-NRC(O)炔基、 -NRC(O)取代的炔基、-NRC(O)芳基、-NRC(O)取代的芳基、-NRC(O)杂芳 基、-NRC(O)取代的杂芳基、-NRC(O)杂环和-NRC(O)取代的杂环，其中R是氢或 烷基，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷 基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的 杂环如本文所定义。

“硝基”是指-NO2基团。

“芳基”或“Ar”是指单环(例如苯基)或多个稠合环(例如萘基或蒽基)的6-14 个碳原子的单价芳族碳环基团，其中稠合环可以是芳族或不是芳族(例如，2-苯并 噁唑烷酮(benzoxazolinone)、2H-1，4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等)，条件是连接点在 芳族碳原子上。优选的芳基包括苯基和萘基。

“取代的芳基”是指被1-3个，优选1-2个选自下组的取代基取代的芳基基团： 羟基、酰基、酰基氨基、酰氧基、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烯 基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、芳基、取代 的芳基、芳氧基、取代的芳氧基、羧基、羧基酯、氰基、巯基、硫烷基、取代的硫 烷基、硫芳基、取代的硫芳基、硫代杂芳基、取代的硫代杂芳基、硫代环烷基、取 代的硫代环烷基、硫代杂环、取代的硫代杂环、环烷基、取代的环烷基、卤素、硝 基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环、取代的杂环、杂芳氧基、取代的杂芳氧基、杂 环氧基、取代的杂环氧基、氨基磺酰基(NH2-SO2-)和取代的氨基磺酰基。

“芳氧基”是指芳基-O-基团，包括但不限于苯氧基、萘氧基等。

“取代的芳氧基”是指取代的芳基-O-基团。

“羧基”是指-COOH或其盐。

“环烷基”是指具有单环或多环的3-10个碳原子的环状烷基基团，包括但不 限于：金刚烷基(adamantly)、环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等。

“螺环环烷基”是指环烷基环与螺环联合的3-10个碳原子的环状基团(单个原 子形成联合，所述单个原子是环中唯一共用原子)，例如以下结构：

“取代的环烷基”是指被1-5个选自下组的取代基取代的环烷基基团：烷基、 取代的烷基、氧代(＝O)、硫代(＝S)、烷氧基、取代的烷氧基、酰基、酰基氨基、酰 氧基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、芳基、取代的芳基、芳氧基、取代的芳氧基、 氰基、卤素、羟基、硝基、羧基、羧基酯、环烷基、取代的环烷基、杂芳基、取代 的杂芳基、杂环、取代的杂环、-SO2-烷基和-SO2-环烷基。

“卤代”或″卤素“是指氟代、氯代、溴代和碘代，优选氟代或氯代。

“羟基”是指-OH基团。

“杂芳基”是指环内具有1-10碳原子及1-4个选自氧、氮和硫的杂原子的芳 族基团。杂芳基可具有单环(例如，吡啶基或呋喃基)或多个稠合环(例如，吲嗪或苯 并噻吩基(benzothienyl))，其中稠合环可以是或者不是芳族和/或含有杂原子，只要 连接点通过芳族杂芳基基团的原子。在一个实施方式中，杂芳基的氮和/或硫环原 子任选地氧化形成N-氧化物(N→O)、亚硫酰基或磺酰基部分。优选的杂芳基包括 吡啶基、吡咯基、吲哚基、硫苯基和呋喃基。

“取代的杂芳基”是指被1-3个选自取代的芳基中所定义的相同基团取代的杂 芳基基团。

“含氮杂芳基”和“含氮取代的杂芳基”是指包含至少一个环上氮原子并且 任选地包含其它环上非氮杂原子如硫、氧等的杂芳基基团和取代的杂芳基基团。

“杂芳氧基”是指-O-杂芳基，“取代的杂芳氧基”是指-O-取代的杂芳基基团， 其中杂芳基和取代的杂芳基如本文所定义。

“杂环”或“杂环状”或“杂环烷基”或“杂环基”是指环内具有1-10个碳 原子及1-4个选自氮、硫或氧的杂原子的单环或多个稠合环的饱和或不饱和(但非 芳族)基团，包括稠合的桥接螺环系统，稠合环系统中，一个或多个环可以是环烷 基、芳基或杂芳基，只要连接点通过杂环。在一个实施方式中，杂环基团的氮和/ 或硫原子任选地氧化形成N-氧化物、亚硫酰基和磺酰基部分。

“取代的杂环”或“取代的杂环烷基”或“取代的杂环基”是指被1-3个如取 代的环烷基中所述相同的取代基取代的杂环基。

杂环基和杂芳基的例子包括但不限于：氮杂环丁烷、吡咯、咪唑、吡唑、吡 啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异 喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹噁啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、 吖啶、菲哕啉、异噻唑、吩嗪、异噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷(imidazolidine)、 咪唑啉、哌啶、哌嗪、二氢吲哚、酞酰亚胺、1，2，3，4-四氢异喹啉、4，5，6，7-四氢苯 并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫代吗啉基(也称为硫 吗啉基)、1，1-二氧代硫代吗啉基、哌啶基、吡咯烷、四氢呋喃基等。

“含氮杂环”和“含氮取代的杂环”是指包含至少一个氮环原子并且任选地 包含其它非氮杂环原子如硫、氧等的杂环基团和取代的杂环基团。

“巯基”是指-SH。

“硫烷基”或“硫代烷氧基”是指-S-烷基基团。

“取代的硫烷基”或“取代的硫代烷氧基”是指-S-取代的烷基基团。

“硫芳基”是指-S-芳基基团，其中的芳基如上所述。

“取代的硫芳基”是指-S-取代的芳基基团，其中取代的芳基如上所述。

“硫代杂芳基”是指-S-杂芳基基团，其中杂芳基如上所述。

“取代的硫代杂芳基”是指-S-取代的杂芳基基团，其中取代的杂芳基如上所 述。

“硫代杂环”是指-S-杂环基团，“取代的硫代杂环”是指-S-取代的杂环基团， 其中杂环和取代的杂环如上所述。

“杂环氧基”是指杂环基-O-基团，“取代的杂环氧基”是指取代的杂环基-O- 基团，其中杂环基和取代的杂环基如上所述。

“硫代环烷基”是指-S-环烷基，“取代的硫代环烷基”是指-S-取代的环烷基 基团，其中环烷基和取代的环烷基如上所述。

本文所用“生物活性”是指在实施例13-15的任一个中列出的至少一种分析试 验中测定的抑制浓度。

本文所用“药学上可接受的盐”是指通式I和II的化合物的无毒酸盐或碱 土金属盐。这些盐可以在通式I和II的化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或 单独将碱或酸官能团分别与合适的有机或无机酸或碱反应来制备。代表性的盐包括 但不限于：乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、 苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、环戊烷 丙酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、葡庚酸盐(glucoheptanoate)、甘油磷酸盐 (glycerophosphate)、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、延胡索酸盐、盐酸盐、氢溴 酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、 2-萘磺酸盐、草酸盐、双氢萘酸盐、果胶酯酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基 丙酸盐(proionate)、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石 酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。也可用以下试剂季铵化碱性含 氮基团：烷基卤，例如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物； 硫酸二烷基酯，例如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯和硫酸二戊酯；长 链卤化物，例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰基的氯化物、溴化物和碘化 物；芳烷基卤，例如苄基溴和苯乙基溴等。因而获得水或油可溶或可分散的产 物。

可用于形成药学上可接受的酸加成盐的酸的例子包括无机酸，例如盐酸、硫 酸和磷酸；有机酸，例如草酸、马来酸、甲磺酸、琥珀酸和柠檬酸。可以在最终分 离和纯化通式I和II的化合物期间原位制备碱加成盐，或单独将羧酸部分与合适的 碱，例如药学上可接受金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，或与铵或有机 伯胺、仲胺或叔胺反应来制备。药学上可接受的盐包括但不限于：基于碱金属和碱 土金属的阳离子，例如钠、锂、钾、钙、镁、铝盐等，以及无毒的铵、季铵和胺阳 离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺 等。其它用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇 胺、哌嗪等。

本文所用术语“药学上可接受的酯”是指在体内水解的酯，包括在人体内裂 解形成母体化合物、其盐或药学活性代谢物的酯。合适的酯基团包括但不限于：来 源于药学上可接受的脂族羧酸的酯，尤其是烷酸、烯酸、环烷酸和烷二酸，其中每 个烷基或烯基部分宜不超过6个碳原子。具体酯的代表性例子包括但不限于：甲酸 酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和琥珀酸乙酯。

本文所用的术语“药学上可接受的前药”指那些在合理的医学判断范围内的 本发明化合物的前药，它们适合用于与人和较低级动物组织接触而无过度的毒性、 刺激性、过敏反应等，与合理的利益/风险比率相匹配，并且能有效进行预定应用， 也指本发明化合物的两性形式(可能的话)。术语“前药”指能在体内快速转化，例 如通过在血液中水解从而产生上述通式所示母体化合物或其药学活性代谢物的化 合物。详细的讨论见Higuchi，T.和V.Stella，“Pro-drugs as Novel Delivery Systems”(《作为新型递送系统的前药》)，A.C.S.论坛丛书14，和“Bioreversible Carriers in Drug Design”(《药物设计中的生物可逆载体》)，Edward B.Roche(编)， American Pharmaceutical Association，Pergamon Press，1987，二者均纳入本文 作为参考。

本文所用术语“抗癌药”或“治疗癌症的药物”是指以下试剂，包括但不 限于：诱导凋亡的试剂；多聚核苷酸(例如，核酶)；多肽(例如，酶)；药 物；生物学拟似物(mimetics)；生物碱；烷化剂；抗癌抗生素；抗代谢物； 激素；铂化合物；与抗癌药物、毒素和/或放射性核素偶联的单克隆抗体；生物学 应答修饰剂(例如，干扰素和白介素等)；过继性免疫治疗药物；造血生长因子； 诱导肿瘤细胞分化的药物(如全反式视黄酸等)；基因治疗试剂；反义治疗试剂和 核苷酸；肿瘤疫苗；血管生成抑制剂；等等。许多其它试剂在本领域技术人员熟知 的能力范围内。

应理解，上述所有取代基团中，用进一步的取代基限定取代基本身得到的聚 合物(例如，具有取代的芳基(该取代基本身被取代的芳基取代)作为取代基的取 代的芳基，等)不包括在本文内容范围内。因此，这种取代基的最大数量为3。就 是说每个上述定义具有以下限制，例如，取代的芳基限于-取代的芳基-(取代的芳 基)-取代的芳基。

类似地，应理解上述定义不包括不被允许的取代模式(例如用5个氟基团或α 羟基基团取代甲基以形成烯键或炔键式不饱和)。这些不被允许的取代模式是本领 域技术人员熟知的。

本发明化合物可利用化合物中一个或多个不对称或手性中心的存在而显示立 体异构性。本发明考虑了各种立体异构体及其混合物。通式I和II的化合物的描述 包括其立体异构体。本发明的某些化合物包含不对称取代的碳原子。这种不对称取 代的碳原子可造成本发明化合物包含在特定的不对称取代碳原子处的立体异构体 混合物或单一立体异构体。因此，本发明化合物的外消旋混合物、非对映体混合物、 单一对映体以及单一非对映体都包括在本发明范围内。本文所用的术语“S”和“R” 构型如IUPAC1974“RECOMMENDATIONS FOR SECTIONE，FUNDAMENTAL STEREOCHEMISTRY(基础立体化学，E部分的建议)”，Pure Appl.Chem.45：13-30， 1976所定义。所需的对映体可通过市售手性起始物质经本领域公知方法手性合成 得到，或者可采用已知技术从对映体混合物通过分离所需的对映体得到。

本发明化合物还显示几何异构现象。几何异构体包括具有烯基或炔基 (alkenylenyl)部分的本发明化合物的顺式或反式形式。本发明包括各种几何异构体 及其立体异构体和混合物。

C.化合物制备

本发明化合物可通过容易获得的起始物质经以下一般方法和过程制备。除非 另有说明，起始物质是市售的并且是本领域众所周知的。应理解，当给出典型的或 优选的过程条件(即反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力)时，除非另 有声明，也可采用其它过程条件。最佳反应条件可根据具体反应物或所用溶剂不同， 但该条件可由本领域技术人员经常规优化方法确定。

此外，本领域技术人员应明白，常规保护基团可能是防止某些官能团经历不 需要的反应所必需的。各种官能团合适的保护基团以及保护和去保护特定官能团的 合适的条件在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，《有机合成中的保护基团》(Protecting Groups in Organic Synthesis)，第二版，Wiley，纽约，1991中描述，参考包括在 此。

而且，本发明化合物可含有一个或多个手性中心。因此，需要时这些化合物 可以纯的立体异构体的形式，即以各种对映体或非对映体、或者以富含立体异构体 的混合物的形式制备和分离。除非另有声明，所有这些立体异构体(及富含的混合 物)都包括在本发明的范围内。纯的立体异构体(或富含的混合物)可采用(例如)本 领域公知的光学活性起始物质或立体选择性反应物来制备。或者，这些化合物的外 消旋混合物可使用手性柱色谱、手性拆分剂等分离。

通过以下合成方案可更好地理解本发明化合物，这些方案显示了本发明的合 成方法。除非另有说明，以下实施例中采用的反应物是市售可得的，可从经销商如 西格玛公司(Sigma-Aldrich Company，Inc.，Milwaukee，WI，USA)购买获得。

如上所述，本发明化合物具有以下结构：

式中，R1、R2、R3、R4、R6、R7和R8如本文所定义，R5’是-CH2-R5(条件是， R5不是氢)，其中R5如本文所定义。

步骤A：酮-酯合成

PG是指合适的氮保护基团如BOC。

具体地说，在步骤A中，将适当保护的(PG)氨基酸1a溶解在适当量的惰性溶 剂如甲醇或乙醇中。应理解，氨基酸1a通常以α，α-二取代的氨基酸 (PG-NH-C(R1)(R2)-COOH)形式市售获得。在其中加入化学计量的一价阳离子，例 如碳酸铯(Cs2CO3)或碳酸钾(K2CO3)，形成羧酸盐(未示出)。一旦反应基本完成，通 常约需15分钟到约2小时，减压条件下蒸发去除过量溶剂。然后将残留的铯或钾 盐重新溶解在合适的溶剂如DMF中，然后用1-4当量合适的α-卤代-酮1b(1当量)， 例如2-溴代苯乙酮处理，室温下搅拌直到反应基本完全。

然后通过常规方法如提取、过滤、蒸发等回收产物1c。纯度大致足以在下一 步骤中直接使用。

步骤B：形成咪唑

在步骤A酮-酯在适当量惰性溶剂如二甲苯的搅拌的溶液中，加入过量乙酸铵， 通常约2-20当量，优选约5当量。在一个实施方式中，加入迪安-斯达克榻分水器 (Dean-Stark trap)并将反应混合物加热至约120℃-160℃直到反应基本完全。在 另一个实施方式中，反应物在甲苯中回流。一旦反应大致完全，使混合物冷却至室 温。然后通过常规方法如提取、过滤、蒸发等回收产物咪唑1d。纯度大致足以在 下一步骤中直接使用。

步骤C：咪唑的N-烷基化

然后，咪唑1d与合适的芳基或杂芳基-取代的烷基卤化物如苄基溴反应。典型 过程如下：搅拌咪唑1d与过量碳酸钾和DMF，然后加入至少等摩尔量的芳基或杂 芳基-取代的烷基卤化物。一旦反应基本完全，通过常规方法如提取、过滤、蒸发、 重结晶等回收N-烷基咪唑1e。

采用合适的磺酰氯可合成本发明化合物，其中R8是L-A1，L是-S(O)q-。各种 磺酰氯的描述例如参见美国专利6,489,300，其内容通过引用包括在此。

任一情况下，在以下步骤D中使用咪唑1e。

步骤D：游离胺去保护

然后，通过常规技术除去保护基团PG以形成胺1f，胺1f任选地通过常规方 法如提取、过滤、蒸发等方法纯化。胺1f在下一步骤中直接使用。

步骤E：还原胺化

然后，胺1f与合适的醛1g经历常规还原胺化反应，产生取代的胺1h，然后 回收胺1h并任选地通过常规方法如提取、过滤、蒸发、色谱法等方法纯化。

在R5是氢的实施方式中，可跳过步骤D和E。在这些实施方式中，咪唑1e 在步骤F中用于制备合适的氨基甲酸酯。

步骤F：形成氨基甲酸酯

然后将来自步骤E的取代的胺1h加入到含有合适的溶剂如二氯甲烷和过量合 适的碱如三乙胺的溶液中。然后，加入合适的形成氨基甲酸酯的试剂例如所示三光 气(triphosgene)，以形成氨基甲酸酯li。一旦反应完全，通过常规方法如提取、过 滤、蒸发等方法回收氨基甲酸酯li。氨基甲酸酯li在下一步骤中直接使用或者可 任选地通过常规技术纯化。

步骤G：形成脲

然后，来自步骤F的氨基甲酸酯li与稍微过量的合适的胺1p混合，以形成脲 1j。一旦反应完全，通过常规方法如提取、过滤、蒸发等方法回收产物1j。

进一步改进上述制备过程以合成其它本发明化合物在本领域技术人员的能力 范围内。例如，合适的异氰酸酯与胺1h反应产生所示的脲化合物，例如参见实施 例3。

D.药学制剂

作为药物使用时，本发明化合物通常以药物组合物的形式给予。这些组合物 可通过各种途径给予，包括口服、胃肠外、经皮、局部、直肠和鼻腔内途径。这些 化合物作为(例如)注射和口服组合物是有效的。这些组合物以药学领域技术人员 公知的方式制备并且包含至少一种活性化合物。

本发明还包括药物组合物，其包含一种或多种上述本发明化合物作为活性成 分以及药学上可接受的载体。在本发明组合物的制备过程中，活性成分通常与赋形 剂混合，被赋形剂稀释或包封在合适的载体内，例如胶囊、药囊、纸或其它容器内。 所用赋形剂通常是适合给予人体或其它哺乳动物的赋形剂。当赋形剂用作稀释剂 时，它可以是固体、半固体或液体物质，用作活性成分的运载体、载体或介质。因 此，组合物可以是片剂、小丸、粉末、锭剂、药囊，、扁胶囊、酏剂、混悬剂、乳 剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、例如包含最高达10重 量％活性化合物的软膏剂、软明胶和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液及无菌包装 粉末。

在制备制剂的过程中，在与其它成分混合之前可能需要研磨活性化合物以提 供合适的粒径。如果活性化合物基本上不可溶，通常研磨至粒径小于200目。如果 活性化合物基本上是水溶性的，一般通过研磨调节粒径以实现在制剂中大致均一分 布，例如约40目。

一些合适的赋形剂的例子包括：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、 淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚 乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。制剂还可包含：润滑剂如滑 石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和助悬剂；防腐剂如甲基-和丙基羟基- 苯甲酸酯；甜味剂；和芳香剂。可采用本领域已知的方法配制本发明组合物以在给 药后提供活性成分的快速、持久或延迟释放。

药物组合物中活性成分(即本发明化合物)的量及其单位剂量形式可根据具体 应用、具体化合物的效力以及所需的浓度而变化或调节。

优选将组合物配制成单位剂量形式，每个剂量包含约1-500毫克，通常约5-100 毫克，有时约10-30毫克的活性成分。术语“单位剂量形式”是指适合用作人体或 其它哺乳动物的单一剂量的物理离散单位，每个单位包括预定量的经计算能够产生 所需治疗效果的活性成分与合适的药学赋形剂。优选地，本发明化合物的用量不超 过约20重量％的药物组合物，更优选不超过约15重量％，余量是药学惰性载体。

活性化合物在广泛的剂量范围内有效，通常以药学上或治疗学上有效量给予。 然而应理解，化合物的实际用量可通过内科医生根据相关情况确定，包括治疗状态、 待治疗疾病的严重性、给药途径的选择、给予的实际化合物、个体患者的年龄、体 重和响应、以及患者症状的严重性等等。

在治疗或对抗哺乳动物癌症的治疗性应用中，化合物或其药物组合物可通过 任意合适的途径给予，例如口服、局部、经皮和/或胃肠外给予，给药剂量为能够 在经历治疗的哺乳动物中获得和维持活性成分的治疗有效浓度，即治疗有效量，或 治疗有效的血液浓度。通常，活性成分的治疗有效剂量(即有效剂量)约为0.1-100， 更优选约1.0-50毫克/千克体重/天。

为制备固体组合物如片剂，将主要活性成分与药学赋形剂混合，形成包含本 发明化合物的均一混合物的处方前组合物。表示这些处方前组合物均一时，是指活 性成分均匀地分散在组合物中，使得组合物可容易地细分成等量有效单位剂量形式 如片剂、小丸和胶囊。然后，固体处方前混合物可再细分成上述类型的包含0.1- 约500毫克本发明活性成分的单位剂量形式。

本发明片剂或小丸可包衣或另外复合以提供具有持久作用优点的剂型。例如， 片剂或小丸可包含内剂量和外剂量组分，后者包封前者。两种组分通过肠衣隔离， 肠衣可抵抗胃中降解并使内部组分完整通过(然后)进入十二指肠或者延迟释放。 许多材料可用作肠衣，这些材料包括各种聚合物酸及聚合物酸与诸如虫胶、十六醇 和醋酸纤维素等物质的混合物。

口服或注射给予的包含本发明新型组合物的液体剂型包括水性溶液，适当矫 味的糖浆剂、水性或油性混悬剂、用食用油如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油、 或花生油适当矫味的乳剂、以及酏剂和类似的药学运载体。

用于吸入或吹入的组合物包括在药学上可接受的水溶液或有机溶剂、或其混 合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可包含合适的药学上可接受 的赋形剂，如上所述。优选地，组合物可通过口服或鼻腔吸入途径给予以发挥局部 或全身效果。优选在药学上可接受的溶剂中的组合物可采用惰性气体喷雾。喷射的 溶液可从喷雾装置直接吸入或者喷雾装置可连接有面罩塞条(face mask tent)或间歇 性正压呼吸机。溶液、混悬液或粉末组合物优选通过能够以合适的方式递送制剂的 装置经口服或鼻腔给予。

下面的制剂实施例显示了本发明代表性的药物组合物。

制剂实施例1

制备包含以下成分的硬明胶胶囊：

含量

成分        (毫克/胶囊)

活性成分    30.0

淀粉        305.0

硬脂酸镁    5.0

混合上述成分并以340毫克的量填充到硬明胶胶囊中。

制剂实施例2

采用以下成分制备片剂处方：

含量

成分            (毫克/片)

活性成分        25.0

纤维素，微晶    200.0

胶体二氧化硅    10.0

硬脂酸          5.0

将各组分混合并压制成片，片重240毫克。

制剂实施例3

制备包含以下处方的干粉吸入制剂：

成分        重量％

活性成分    5

乳糖        95

将活性成分与乳糖混合并将混合物加入到粉末吸入施加器中。

制剂实施例4

制备各自包含30毫克活性成分的片剂：

含量

成分              (毫克/片)

活性成分          30.0毫克

淀粉              45.0毫克

微晶纤维素        35.0毫克

聚乙烯吡咯烷酮    4.0毫克

(10％无菌水的溶液)

羧甲基淀粉钠      4.5毫克

硬脂酸镁          0.5毫克

滑石粉    1.0毫克

总量      120毫克

使活性成分、淀粉和纤维素通过第20号U.S.筛网并充分混合。将聚乙烯吡咯 烷酮溶液与所得粉末混合，然后通过16号U.S.筛网。将上述制备的颗粒在50-60℃ 下干燥并通过16号U.S.筛网。使前述羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石粉通过30 号U.S.筛网，然后加入到颗粒中，混合后在压片机上压制得到片重120毫克的片剂。

制剂实施例5

制备各自含有40毫克药物的胶囊：

含量

成分        (毫克/胶囊)

活性成分    40.0毫克

淀粉        109.0毫克

硬脂酸镁    1.0毫克

总量        150.0毫克

将活性成分、淀粉和硬脂酸镁混合，通过20号U.S.筛网，然后以150毫克的 量填充到硬明胶胶囊中。

制剂实施例6

制备各自含有25毫克活性成分的栓剂：

成分                    量

活性成分                25毫克

饱和脂肪酸甘油酯至      2,000毫克

使活性成分通过60号U.S.筛网并悬浮在用最少所需热量熔化的上述饱和脂肪 酸甘油酯中。然后将混合物倾倒到标称2.0克容量的栓剂模具中并冷却。

制剂实施例7

制备每5.0毫升剂量分别含有50毫克药物的栓剂：

成分         量

活性成分     50.0毫克

黄原酸胶     4.0毫克

羧甲基纤维素钠(11％)

微晶纤维素(89％)    50.0毫克

蔗糖                1.75克

苯甲酸钠            10.0毫克

矫味剂和着色剂      q.v.

纯化水至            5.0毫升

使活性成分、蔗糖和黄原酸胶混合后通过10号U.S.筛网，然后与前述制备的 微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的水溶液混合。用一些水稀释苯甲酸钠、矫味剂和着 色剂，搅拌下加入。然后加入足量的水至所需体积。

制剂实施例8

含量

成分            (毫克/胶囊)

活性成分        15.0毫克

淀粉            407.0毫克

硬脂酸镁        3.0毫克

总量            425.0毫克

使活性成分、淀粉和硬脂酸镁混合后通过20号U.S.筛网，并以425.0毫克的 量填充到硬明胶胶囊中。

制剂实施例9

制备以下皮下制剂：

成分         含量

活性成分     5.0毫克

玉米油       1.0毫升

制剂实施例10

制备以下局部制剂：

成分        含量

活性成分    1-10克

乳化蜡      30克

液状石蜡    20克

白软石蜡    至100克

加热白软石蜡直到熔化。加入液状石蜡和乳化蜡，搅拌直到溶解。加入活性 成分，继续搅拌直到分散。然后冷却混合物直到形成固体。

制剂实施例11

制备以下静脉内制剂：

成分        含量

活性成分    250毫克

等渗盐水    1000毫升

本发明方法中采用的另一优选制剂使用经皮递送装置(“贴片”)。这种经皮贴 片可用于实现以受控量连续或不连续输递本发明化合物。用于递送药物的经皮贴片 的结构和使用是本领域公知的。例如参见1991年6月11日公布的美国专利 5,023,252，其内容参考包括在此。这种贴片可被构造成连续、脉冲式或根据需要递 送药物

一般，希望或需要将药物组合物直接或间接引入大脑。直接技术通常涉及将 药物递送导管插入宿主脑室系统以绕过血脑屏障。一种此类的用于将生物因子输送 至体内特定解剖学区域的植入式递送系统在美国专利5,011,472中描述，其内容参 考包括在此。

通常优选的间接技术一般涉及配制组合物，通过将亲水性药物转化为脂溶性 药物以实现药物潜伏作用。潜伏作用通常通过以下方式实现：封闭药物上存在的羟 基、羰基、硫酸根和伯胺基团以提高药物脂溶性从而能够转运通过血脑屏障。或者， 可通过动脉内输递高渗溶液以暂时打开血脑屏障来提高亲水性药物的递送。

适用于本发明的其它合适的制剂参见《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，Mack出版公司，费城，PA，第17版(1985)。

E.剂量与用法

如上所述，本文所述的化合物适用于上述各种药物递送系统。此外，为了提 高所给予化合物的体内血清半衰期，可将化合物包封、引入脂质体内腔，制备成胶 体、或采用其它常规技术以延长化合物的血清半衰期。存在许多制备脂质体的方法， 例如参见Szoka等的美国专利4,235,871、4,501,728和4,837,028，其各自的内容参 考包括在此。

本发明化合物适用于抑制或治疗至少部分地由KSP活性介导的病症。一方面， 至少部分地由KSP介导的病症是细胞增殖疾病。术语“细胞增殖疾病”是指包括 癌症、肿瘤、增生、再狭窄、心脏肥大、免疫疾病和炎症等的疾病。本发明提供了 在需要治疗的人或哺乳动物对象中的治疗方法，该方法包括单独给予或与其它抗癌 剂联合给予所述对象治疗有效量的通式I或II的化合物。

本发明化合物适用于在体内或体外抑制癌细胞生长。术语“癌症”是指癌症 疾病，例如包括肺癌和支气管癌；前列腺癌；乳腺癌；胰腺癌；结肠和直肠癌；甲 状腺癌；胃癌；肝癌和肝内胆管癌；肾癌和肾盂癌；膀胱癌；子宫癌；宫颈癌；卵 巢癌；多发性骨髓瘤；食道癌；急性骨髓性白血病；慢性骨髓性白血病；淋巴细胞 性白血病；髓细胞性白血病；脑癌；口腔和咽癌；喉癌；小肠癌；非霍奇金淋巴瘤； 黑色素瘤；和绒毛状结肠腺瘤。

癌症还包括选自下组的肿瘤或赘生物：癌、腺癌、肉瘤和血液恶性肿瘤。

此外，癌症类型可选自：实体瘤/恶性肿瘤的生长、粘液性和圆形细胞癌、局 部晚期肿瘤、人软组织癌、癌症转移、鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、口腔癌、皮 肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肾上腺皮质癌症、产生ACTH 的肿瘤、非小细胞癌、乳腺癌、胃肠癌症、泌尿外科癌症、女性生殖道的恶性肿瘤、 男性生殖道的恶性肿瘤、肾癌、脑癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、视网膜母细胞瘤、 成神经细胞瘤、腹膜腔积液、恶性肿瘤性胸腔积液、间皮瘤、韦尔姆斯氏(Wilms’s) 肿瘤、胆囊癌、滋养层赘生物、血管外皮细胞瘤和卡波济氏(Kaposi’s)肉瘤。

本发明化合物或组合物可通过合适的途径，如口服、静脉内、胃肠外、经皮、 局部、直肠或鼻腔内给予哺乳动物。

哺乳动物包括例如人和其它灵长类、宠物或陪伴动物如狗和猫、实验室动物 如大鼠、小鼠和兔子以及农场动物如马、猪、羊和牛。

肿瘤或赘生物包括细胞倍增不受控制且进行性的组织细胞生长。一些生长是 良性的，但另一些称为“恶性”，可导致机体死亡。恶性赘生物或“癌症”与良性 生长的区别在于，除显示攻击性细胞增生外，还可侵入周围组织并转移。而且，恶 性赘生物的特征在于，相互间和相对于周围组织的分化和机体组成丧失程度更大 (“去分化”程度更大)。这种性质称为“间变”。

可根据需要修饰具有所需生物学活性的化合物以提供所需性质如改善的药学 性质(例如，体内稳定性、生物利用度)，或诊断应用中的被检测能力。可以多种方 式分析稳定性，例如通过测量与肽酶或人血浆或血清孵育期间化合物的半衰期。

对于诊断目的，可将多种标记物连接于化合物，直接或间接提供可检测的信 号。因此，可以多种方式修饰本发明化合物和/或组合物以实现各种终端目的，同 时仍然保持其生物学活性。此外，可引入多个反应位点，用于连接颗粒、固体物质、 大分子等。

标记的化合物可用于多种体内或体外应用。可采用许多标记物，例如放射性 核素(例如，发射γ射线的放射性同位素如锝-99或铟-111)、荧光剂(例如，荧光素)、 酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、化学发光化合物、生物发光化合物等。本领域 普通技术人员将知道用于结合复合物的其它合适的标记物，或者能够通过常规实验 确定。采用本领域普通技术人员公知的标准技术来实现这些标记物的结合。

本发明药物组合物适用于多种药物递送系统。适用于本发明的合适的制剂参 见《雷明顿药物科学》，Mace出版公司，费城，Pa.，第17版(1985)。

患者给药量根据给予的药物、给药目的(例如预防或治疗)、患者状态、给药方 式等而变化。在治疗性应用中，给予已患有疾病的患者足以治愈或至少部分地阻止 疾病及其并发症的进程或症状的组合物。足以实现上述目的的剂量称为“治疗有效 剂量”。实现该应用的有效剂量将取决于所治疗的疾病状态以及住院医生根据诸如 疾病、病症或状态的严重性、患者年龄、体重和一般状态等因素作出的判断。

给予患者的化合物典型地是上述药物组合物的形式。这些组合物可通过常规 灭菌技术灭菌，或者可过滤除菌。所得水性溶液经包装后使用，或者冻干，冻干制 剂与无菌水性载体组合后给药。化合物制剂的pH通常约为3-11，更优选约5-9， 最优选约7-8。应理解，使用某些前述赋形剂、载体或稳定性将导致药物盐的形成。

本发明化合物和/或组合物的治疗剂量将根据进行治疗的具体应用、化合物的 给药方式、患者的健康和状况以及处方医师的判断而变化。例如，对于口服给药， 剂量通常约为5微克到约50毫克/千克体重/天，优选约1毫克到约10毫克/千克体 重/天。或者，对于静脉内给药，剂量通常约为5微克到约50毫克/千克体重，优 选约500微克到约5000微克/千克体重。考虑的可选的给药途径包括但不限于：鼻 腔内、经皮、吸入、皮下和肌内。有效剂量可由体外或动物模型测试系统所得剂量 -反应曲线推知。

一般，本发明化合物和/或组合物可通过产生类似用途的试剂的已接受的给药 方式给予治疗有效剂量。化合物的毒性和治疗效果可通过细胞培养或实验动物中的 标准药学操作来确定，例如确定LD50(导致50％群体死亡的剂量)和ED50(在50％ 群体中治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果间的剂量比即治疗指数，以LD50/ED50 表示。优选治疗指数大的化合物。

由细胞培养试验和动物研究获得的数据可用于制定人体应用剂量范围。化合 物的剂量优选落在包括几乎没有或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。根据采用 的剂量形式和给药途径，剂量可在该范围内变化。对于本发明方法中所使用的任何 化合物和/或组合物，治疗有效剂量最初由细胞培养试验估算得到。在动物模型中 制定剂量以实现包括细胞培养所确定的IC50(试验化合物实现最大抑制活性的一半 时的浓度)的循环血浆浓度范围。这些信息可用于更精确地确定人体有用剂量。例 如可通过高效液相色谱法测定血浆水平。

提供以下合成和生物学实施例以阐明本发明，并且不应解释为以任何方式限 制本发明的范围。

实施例

参考以下实施例，采用本文所述方法或本领域熟知的其它方法合成本发明化 合物。

通过高效液相色谱(HPLC)，利用装有2690分离模块的WM(Waters Millenium) 色谱系统(Milford，MA)表征这些化合物和/或中间体。分析柱是全面科技 (Alltech，Deerfield，IL)的奥替玛(Alltima)C-18反向柱，4.6×250mm。采用梯度洗 脱，通常是在40分钟期间从5％乙腈/95％水开始，逐步增加至100％乙腈。所有溶 剂均含有0.1％三氟乙酸(TFA)。通过220或254nm处的紫外光(UV)吸光度检测 这些化合物。HPLC溶剂购自BJ公司(Burdick and Jackson，Muskegan，MI)或费式 科技(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)。在一些情况中，通过利用玻璃或塑料背衬 的硅胶板，例如Baker-Flex硅胶1B2-F柔性片的薄层层析(TLC)评估纯度。在紫外 光下，或利用熟知的碘蒸气和其它各种染色技术不难目测TLC结果。

利用两台LC/MS仪器之一进行质谱分析：沃特(Waters)系统(Alliance HT HPLC和Micromass ZQ质谱仪；柱：Eclipse XDB-C18，2.1×50mm；溶剂系统： 含0.05％TFA的水配制的5-95％(或35-95％、或65-95％或95-95％)乙腈；流速： 0.8毫升/分钟；分子量范围：500-1500；锥孔电压(cone Voltage)：20V；柱温： 40℃)或HP(Hewlett Packard)系统(1100系列HPLC；柱：Eclipse XDB-C18， 2.1×50mm；溶剂系统：含0.05％TFA的水配制的1-95％乙腈；流速：0.4毫升 /分钟；分子量范围：150-850；锥孔电压：50V；柱温：30℃)。所有质量报道 为质子化的母离子质量。

利用HP(Hewlett Packard)仪器(装有质量选择性检测器5973的HP6890系列 气相色谱仪；注射器体积：1毫升；初始柱温：50℃；最终柱温：250℃；梯 度时间(ramp time)：20分钟；气体流速：1毫升/分钟；柱：5％苯基甲基硅氧 烷，型号：HP 190915-443；尺寸：30.0m×25m×0.25m)进行GC/MS分析。

用Varian 300MHz NMR(Palo Alto，CA)对一些化合物进行核磁共振(NMR) 分析。图谱参考是TMS或溶剂的已知化学位移。一些化合物样品在高温进行(例如， 75℃)以促进样品溶解。

可通过元素分析(Desert Analytics，Tucson，AZ)评估一些本发明化合物的纯 度。

利用实验室装置熔化温度设备(Laboratory Devices Mel-Temp apparatus) (Holliston，MA)测定熔点。

利用快速40色谱系统和KP-Sil，60A(Biotage，Charlottesville，VA)，或 通过利用硅胶(230-400目)装填物质的快速柱层析，或通过利用C-18反相柱的 HPLC进行制备型分离。快速40拜特(Biotage)系统和快速柱层析所用的典型溶剂 是二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、己烷、丙酮、水性羟胺和三乙胺。反相HPLC 所用的典型溶剂是含有0.1％三氟乙酸的不同浓度的乙腈和水。

除非另有说明，所有温度是摄氏度。并且，在这些实施例及其它内容中，缩 写具有以下含义：

AcOH    ＝    乙酸

aq.     ＝    水性

ATP     ＝    三磷酸腺苷

Boc     ＝    叔丁氧基羰基

BSA     ＝    牛血清白蛋白

CAM     ＝    钼酸铈铵

DCM     ＝    二氯甲烷

DIAD    ＝    偶氮二羧酸二异丙酯

DIBAL   ＝    氢化二异丁基铝

DIEA    ＝    二异丙基乙胺

DIPEA   ＝    二异丙基乙胺

DMAP    ＝    二甲基氨基吡啶

DMF     ＝    二甲基甲酰胺

DMSO    ＝    二甲亚砜

DTT     ＝    二硫苏糖醇

eq.     ＝    当量

Et2O          二乙醚

Et3N    ＝    三乙胺

EtOAc   ＝    乙酸乙酯

EtOH    ＝    乙醇

g       ＝    克

h       ＝    小时

HPLC    ＝    高效液相色谱

L       ＝    升

LC/MS   ＝    液相色谱/质谱

M       ＝    摩尔

m       ＝    米

m/z     ＝    质量/电荷比

MeNH2   ＝    甲基胺

mg      ＝    毫克

min     ＝    分钟

mL      ＝    毫升

mm      ＝    毫米

mM      ＝    毫摩尔/升(millimolar)

mmol    ＝    毫摩尔

mol     ＝    摩尔

N       ＝    正常

nm      ＝    纳米

nM      ＝    纳摩尔的

NMR     ＝    核磁共振

PPh3    ＝    三苯膦

PhCF3   ＝    三氟甲基苯

psi     ＝    磅/平方英寸

RT      ＝    室温

sat.    ＝    饱和

TEA     ＝    三乙胺

THF     ＝    四氢呋喃

TFA     ＝    三氟乙酸

TLC     ＝    薄层色谱

TMS     ＝    三甲基甲硅烷基

TMSCl   ＝    三甲基甲硅烷基氯

μg     ＝    微克

μL     ＝    微升

μM     ＝    微摩尔/升(micromolar)

实施例1

N-[(1R)-1-(1-苄基-4-苯基-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙基]-N-{[(3S)-3-氟代吡咯烷 -3-基]甲基}-1，4′-联哌啶(bipiperidine)-1′-羧酰胺(carboxamide)(76)和N-[(1R)-1-(1-苄 基-4-苯基-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙基]-N-{[(3R)-3-氟代吡咯烷-3-基]甲基}-1，4′-

联哌啶-1′-羧酰胺(77)的制备

步骤A：酮酯合成

用Cs2CO3(0.5当量)处理搅拌的0.4M合适的N-Boc-酸(1当量)，例如叔丁基 亮氨酸1-1在EtOH中的溶液。45分钟后，减压蒸发除去EtOH。将残留的铯盐重 新溶解在DMF中(1.5×反应中使用的DMF的体积)，然后用合适的α-卤代-酮，例 如2-溴代苯乙酮(1当量)处理，室温下搅拌直到反应完全。然后使反应混合物在 EtOAc和H2O间分配，分离有机相，用H2O(×3)、盐水(×3)洗涤，然后干燥(Na2SO4)， 过滤，减压蒸发得到酮酯1-2，其纯度足以在下一步骤中直接使用。

步骤B：苯基咪唑的形成

在搅拌的0.1M酮-酯1-2(1当量)在二甲苯中溶液中加入乙酸铵(5当量)。加 入迪安-斯达克榻分水器，反应加热至140℃。一旦反应完全，使混合物冷却至室 温，然后在EtOAc与饱和NaHCO3水溶液间分配。分离有机相，然后用饱和NaHCO3 (×2)、H2O(×3)、盐水(×3)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发得到苯基咪唑 1-3，其纯度足以在下一步骤中直接使用。

步骤C：苯基咪唑的苄基化

在搅拌的0.4M咪唑1-3(1当量)在DMF中的溶液/悬浮液中加入K2CO3(2当 量)和苄基化试剂，例如苄基溴(1.1当量)。一旦反应完全，使混合物在EtOAc和 H2O之间分配。分离有机相并用H2O(×3)、盐水(×3)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过 滤，减压蒸发得到粗的苄基化苯基咪唑。然后使粗反应物质结晶(EtOAc，己烷)得 到纯的产物1-4。

步骤D：游离胺的脱保护

用10％的TFA的DCM溶液处理Boc-保护的胺1-4。一旦反应完全，真空浓 缩反应混合物，然后在EtOAc和饱和NaHCO3水溶液间分配。分离有机相，然后 用饱和NaHCO3水溶液(×2)、H2O(×2)、盐水(×2)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤， 减压蒸发得到苯基咪唑游离胺1-5，其纯度足以在下一步骤中直接使用。

步骤E：外消旋醛1-8的制备

将0.83M的N-Boc-3-甲酰基吡咯烷1-6(1当量)在DMF、TMSCl(2.5当量) 和Et3N(5当量)中的混合液加热6小时。然后用己烷稀释混合液并过滤(硅藻土 (Celite))。然后减压蒸发滤液，得到E和Z同分异构体的混合物形式的TMS烯醇 醚1-7，可在下一步骤中直接使用。

在0.1M的TMS烯醇醚1-7(1当量)的CH3CN溶液中加入SelectFluor(1.1当 量，得自西格玛-阿尔德瑞奇公司(Sigma-Aldrich))。一旦反应完全，减压蒸发混合 物，用Et2O(×5)萃取剩余的固体/油。减压蒸发醚萃取物，得到粗品醛。硅胶色谱 纯化得到所需的醛1-8。

步骤F：还原胺化

在搅拌的0.1M的来自步骤D的(R)-胺1-5(1当量)在DCM中的溶液中，加入 醛1-8(1.1当量)，然后是AcOH(1当量)，再是三乙酰氧基硼氢化钠(1.5当量)。19 小时后，加入其它的三乙酰氧基硼氢化钠(0.5当量)。一旦反应完全，真空浓缩混 合液，在EtOAc和1M NaOH间分配。分离有机相，然后用1M NaOH(×2)、H2O(×1)、 盐水(×2)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发得到粗品。硅胶色谱纯化得到 (R，R)和(R，S)非对映体混合物形式的胺1-9。

步骤G：三氯代氨基甲酸酯的形成

在0.08M的来自步骤F的(R)胺1-9(1当量)在DCM的溶液中加入Et3N(4当 量)，然后是三光气(1.2当量)。一旦反应完全，真空浓缩反应混合物，在EtOAc与 饱和NaHCO3水溶液间分配。分离有机相，然后用饱和NaHCO3水溶液(×2)、H2O (×1)、盐水(×2)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发得到粗的三氯代氨基甲 酸酯1-10，可在下一步骤中直接使用。

步骤H：脲的形成

在搅拌的0.16M的来自步骤G的三氯代氨基甲酸酯1-10(1当量)在DCM中 的溶液中加入DIPEA(5当量)，然后是4-哌啶并哌啶(3当量)。一旦反应完全，真 空浓缩混合物，在EtOAc与饱和NaHCO3水溶液间分配。分离有机相，然后用饱 和NaHCO3水溶液(×2)、H2O(×1)、盐水(×2)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤，减压 蒸发得到1-11和1-12的混合物形式的粗品。反相制备型HPLC纯化分离(R，R)和(R，S) 非对映体1-11和1-12。

步骤I：化合物76和77的最终脱保护

用10％TFA/DCM处理Boc-保护的胺1-11。一旦反应完全，减压蒸发反应混 合物，得到标题化合物，反相制备型HPLC纯化得到纯的76。化合物77(这里未 示出)则采用步骤H的另一异构体1-12合成。

实施例2

N-[(2R)-3-氨基-2-氟丙基]-N-[(1R)-1-(1-苄基-4-苯基-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙基]

哌嗪-1-羧酰胺(26)的制备

步骤A：还原胺化

将实施例1步骤D的苯基咪唑1-5(当量，2.0克)与醛(1.3当量，1.56克)和三 乙酰氧基硼氢化钠(2当量，2.65克)在30毫升二氯甲烷中组合。然后加入乙酸(2 当量，0.72毫升)，氮气室温下搅拌反应物过夜。用水、饱和碳酸氢钠、再是饱和 氯化钠后处理(work up)反应。有机层用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。柱色谱纯化物质， 得到2.15克白色固体状所需产物2-1。

步骤B：三氯代氨基甲酸酯的形成

将苯基咪唑胺2-1(1当量，100毫克)溶解在4毫升四氢呋喃中，冷却至0℃。 溶液中加入三光气(1.7当量，102毫克)然后是三乙胺(6当量，169毫升)。将反应 物搅拌2小时并升高至室温。蒸发溶剂，将物质溶解在EtOAc中，如下进行后处 理：水，饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠。使有机层用硫酸镁干燥，过滤，干燥得到 133毫克三氯代氨基甲酸酯2-2。

步骤C：脲的形成

通过在室温下在4毫升四氢呋喃中搅拌2小时，使上述步骤B的三氯代氨基 甲酸酯2-2(1当量，133毫克)与哌嗪(10当量，175毫克)反应。蒸发溶剂，将物质 重新溶解在EtOAc中，用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤。有机层用硫酸镁干燥， 过滤，浓缩得到115毫克两种异构体的化合物形式的脲。纯化分离异构体，这里仅 显示了异构体2-3。

步骤D：25和26的最终脱保护

在室温下，用1毫升20％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液处理上述步骤C的Boc 保护的脲2-3(1当量，18毫克)2小时。蒸发溶剂得到最终产物26。使用步骤C的 另一异构体合成化合物25。

实施例3

 N-[(2R)-3-氨基-2-氟丙基]-N-[(1R)-1-(1-苄基-4-苯基-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙 基]-N′-(4-氰基苯基)脲(64)的制备

步骤A：脲的形成

使实施例2步骤A的苯基咪唑胺2-1(1当量，15毫克)与4-氰基苯基异氰酸酯 (10当量，44毫克)在1毫升四氢呋喃中于60℃反应过夜。蒸发溶剂，将物质溶解 在EtOAc中，用水、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过 滤并干燥。根据实施例2的步骤D，对Boc进行脱保护。

实施例4

1-[(1R)-1-(1-苄基-4-苯基-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙基]四氢嘧啶-2(1H)-酮(52)的

制备

步骤A：还原胺化

在搅拌的来自实施例1步骤D的胺1-5(1.0当量)在DCM中的溶液中，加入合 适的醛(1.0当量)。将混合物搅拌5分钟，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(1.0当量)。 一旦反应完全，真空浓缩混合液，在EtOAc和2M Na2CO3水溶液间分配。分离有 机相，然后用2M Na2CO3水溶液(×2)、H2O(×2)、盐水(×2)洗涤，然后干燥(Na2SO4)， 过滤，减压蒸发得到产物4-1，产物4-1可在下一步骤中直接使用。

步骤B：氨甲酰氯的形成

在50毫升烧瓶中，加入1.97毫升20％的光气的甲苯溶液(10当量)。加入在 无水DCM(3毫升)和三乙胺(0.517毫升，10当量)中的来自步骤A的产物4-1的溶 液。室温下将该反应混合物搅拌约10分钟。反应完全后，将混合液稀释在DCM 中，用水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发。硅胶纯化得到180毫克白 色固体状氨甲酰氯4-2。

步骤C：脲的形成

在搅拌的来自步骤B的氨甲酰氯4-2(1当量)在DMF中的溶液中，加入3-氨 基-1，2，4-三唑(2当量)、Et3N(2当量)和DMAP(1当量)。室温下搅拌反应物，LC/MS 监测反应进程。反应完全后，减压蒸发溶剂。将粗品溶解在乙醇中，加入肼。室温 下搅拌反应。反应完全后，减压蒸发溶剂，并在EtOAc和水之间分配。分离有机 相，然后用2M Na2CO3水溶液(×2)、H2O(×2)、盐水(×2)洗涤，然后干燥(Na2SO4)， 过滤，减压蒸发。反相制备型HPLC纯化得到52。MS：m/z 403.2

实施例5

N-[(1R)-1-(1-苄基-4-苯基-1H-咪唑-2-基)-2，2-二甲基丙基]-N-{[(3R，4R)-4-羟基吡咯 烷-3-基]甲基}-1，4′-联哌啶-1′-羧酰胺(83)和N-[(1R)-1-(1-苄基-4-苯基-1H-咪唑-2- 基)-2，2-二甲基丙基]-N-{[(3S，4S)-4-羟基吡咯烷-3-基]甲基}-1，4′-联哌啶-1′-羧酰胺

(84)的制备

步骤A：环氧化

在100毫升圆底烧瓶中加入5.0克(29.5毫摩尔)2，5-二氢吡咯-1-羧酸叔丁酯、 11.7克(67.9毫摩尔)3-氯代过氧苯甲酸和70毫升DCM。将混合物在环境温度、氮 气下搅拌20小时。然后加入过量1N NaOH，用DCM(×3)萃取反应混合物。采用 茚三酮显色，由薄层色谱法(4∶1的己烷∶EtOAc)确定产物。合并有机层，用MgSO4 干燥，真空除去溶剂，得到5.1974克(28.1毫摩尔，95％)黄色油状产物5-1。

步骤B：乙烯化

在干燥的200毫升圆底烧瓶中加入4.31克(23.3毫摩尔)来自步骤A的产物5-1， 0.21克(2.33毫摩尔)氰化铜和50毫升无水THF，将所得溶液冷却至-78℃。然后 在反应混合物中逐滴加入73.3毫升(73.3毫摩尔)乙烯基溴化镁，氮气下、在7小时 的时间内使所得溶液缓慢升温至环境温度。用饱和NH4Cl淬灭反应混合物并用 EtOAc(×3)萃取。采用茚三酮显色，用薄层色谱法(2∶1的己烷∶EtOAc)确定产物。合 并有机层，用MgSO4干燥，真空除去溶剂，得到4.75克黄褐色油状产物5-2。

步骤C：氧化

在2.0克(9.4毫摩尔)来自步骤B的产物5-2在30毫升THF和15毫升H2O中 的溶液中，加入3.5克(16.4毫摩尔)NaIO4和0.23毫升(0.94毫摩尔)OsO4。大约30 分钟后观察到形成白色沉淀。采用茚三酮显色，用薄层色谱法(1∶1的己烷∶EtOAc) 监测反应。在氮气、室温下继续搅拌额外的7小时，然后用H2O淬灭反应并用 EtOAc(×3)萃取。合并有机层，用饱和NaHCO3和盐水洗涤，用MgSO4干燥，真空 除去溶剂，得到1.35克(6.3毫摩尔，67％)黄褐色泡沫状产物5-3。

步骤D：还原胺化

在干燥的100毫升圆底烧瓶中加入1.6克(5.0毫摩尔)来自实施例1步骤D的 苯基咪唑游离胺1-5、1.35克(6.26毫摩尔)来自上述步骤C的产物5-3、1.38克(6.5 毫摩尔)三乙酰氧基硼氢化钠、25毫升无水DCM和0.37毫升(6.5毫摩尔)乙酸。将 所得溶液在氮气、环境温度下搅拌2小时。然后将过量的DCM加入到反应混合物 中。用H2O、饱和NaHCO3(×2)和盐水(×2)洗涤有机层。将合并有机层用MgSO4 干燥，真空除去溶剂。对所得粗品进行快速柱色谱，用己烷、20％EtOAc的己烷 溶液、50％EtOAc的己烷溶液以及10％甲醇和0.3％氨的DCM溶液的梯度洗脱产 物，得到1.56克(3.0毫摩尔，60％)黄褐色泡沫状产物5-4。产物5-4以非对映体混 合物的形式提供。

MH+＝519.3

步骤E：保护

在25毫升圆底烧瓶中加入0.2克(0.39毫摩尔)步骤D的产物5-4、0.04克(0.56 毫摩尔)咪唑、0.08克(0.56毫摩尔)叔丁基氯代二甲基甲硅烷、0.005克(0.04毫摩尔) DMAP和3毫升DMF。将所得溶液在氮气、环境温度下搅拌24小时。用H2O淬 灭反应并用EtOAc(×3)萃取。将合并的有机层用饱和NaHCO3和盐水洗涤，用 MgSO4干燥，真空除去溶剂得到0.28克(0.44毫摩尔，113％)粗品黄褐色油状产物 5-5。MH+＝633.3

步骤F：三氯代氨基甲酸酯的形成

0℃下，在0.05克(0.08亳摩尔)步骤E的产物在1毫升无水THF中的溶液中， 加入0.04克(0.14毫摩尔)三光气和0.07毫升(0.48毫摩尔)三乙胺。0℃下将混合液 搅拌1小时。TLC(4∶1的己烷∶EtOAc)监测反应。反应完全后，加入H2O并用 EtOAc(×2)萃取。将合并的有机层用饱和NaHCO3和盐水洗涤，MgSO4干燥，真空 除去溶剂，得到0.08克(0.10毫摩尔，125％)粗品黄褐色油状产物5-6。

步骤G：脲的形成

在干燥的反应管中加入0.08克(0.1毫摩尔)步骤F的产物5-6，0.17克(1.0毫 摩尔)4-哌啶并哌啶和1.5毫升无水THF。将所得溶液在环境温度下搅拌20小时。 然后用H2O淬灭反应，用EtOAc(×3)萃取。将合并的有机层用H2O、饱和NaHCO3 和盐水洗涤，MgSO4干燥，真空除去溶剂得到0.06克(0.07毫摩尔，73％)粗品黄褐 色油状产物5-7。MH+＝827.5

步骤H：脱保护

在反应管中加入0.028克(0.03毫摩尔)步骤G的产物5-7和0.5毫升THF，所 得溶液冷却至0℃。然后在该反应混合液中加入0.05克(0.17毫摩尔)四丁基氟化铵， 使反应在1小时内升温至环境温度。然后用饱和NH4Cl淬灭反应，用EtOAc(×3) 萃取，将合并的有机层用MgSO4干燥，真空除去溶剂得到0.05克(0.07毫摩尔，213％) 粗品黄褐色/黄色泡沫状产物5-8。MH+＝713.4

步骤I：脱保护

在反应管中加入0.05克(0.07毫摩尔)来自步骤H的产物5-8、1.0毫升DCM 和0.1毫升TFA，环境温度下将所得溶液震摇2小时。然后真空除去溶剂，用反相 HPLC纯化粗品反应物质，得到3.8毫克(0.006毫摩尔，9％)白色TFA盐形式的83 和4.6毫克(0.008毫摩尔，11％)白色TFA盐形式的84(这里未示出的其它非对映体)。 83的MH+＝613.4，84的MH+＝613.3

实施例6

β-氟代醛侧链(6-7)的中间体的制备

步骤A：胺保护

在搅拌的无水K2CO3(46.53克，0.3371摩尔)在DMF(500毫升)中的溶液中， 一次性加入D-丝氨酸甲酯盐酸盐(35.0克，0.2250摩尔)、KI(18.66克，0.1124摩 尔)和苄基溴(96.18克，0.5623摩尔)。将反应混合物在室温下剧烈搅拌5小时。反 应完全后，将内容物倾倒到冰水中，用EtOAc萃取。将合并的有机层用水、盐水 洗涤，Na2SO4干燥，浓缩得到粗产物6-2。柱色谱纯化得到淡黄色油状纯品(61.7 克，91.7％)。

步骤B：氟化

在搅拌的二乙胺三氟化硫(32.3毫升，0.2006摩尔)在THF(400毫升)中的溶液 中，室温下于3小时的时间跨度内加入化合物6-2。完成加入之后，再继续搅拌1 小时。用乙酸乙酯萃取混合液，将合并的有机相用NaHCO3饱和溶液洗涤。真空除 去溶剂，得到粗产物，采用己烷到3％EtOAc的己烷溶液的梯度通过柱色谱纯化， 得到淡黄色油状产物6-3(70.4克，69.9％)。

步骤C：还原

在机械搅拌的LiBH4(230.8毫升，0.4651摩尔)在THF(2.0L)中的溶液中，于 N2下、-15℃时，在3小时的时间跨度内经加料漏斗逐滴加入甲酯6-3(100.0克， 0.3322摩尔)在THF(1.0L)中的溶液。完成加入之后，室温下继续搅拌4小时。在 上述混合液中逐滴加入NH4Cl饱和溶液(500毫升)，用EtOAc萃取。将合并的有机 相用水、盐水洗涤，Na2SO4干燥，真空下浓缩。将残留的油溶解在1N HCl(200 毫升)中，用二乙醚萃取，并在NH4OH(50％，300毫升)的帮助下将水层pH调节至 10。用EtOAc萃取所得物质，真空浓缩合并的萃取物，得到淡褐色油状产物6-4(86.2 克，95.0％)。

步骤D：脱保护

将醇6-4(50克，0.18315摩尔)和碳载Pd(OH)2(20％，6.26克，0.04395摩尔) 在无水乙醇(500毫升)中的混合液于50-60psi的氢气压力下搅拌7小时。反应之后， 过滤除去木炭，在旋转蒸发仪上浓缩残留物，得到淡褐色油状产物6-5(15.8克， 92.7％)。

步骤E：Boc-保护

0℃下，在搅拌的氨基醇6-5(15.0克，0.16129摩尔)和K2CO3(33.39克，0.24195 摩尔)在二烷水溶液(约25％，375毫升二烷在125毫升水中)中的混合液中，逐 滴加入(Boc)2O(38.66克，0.17733摩尔)。加入后将反应混合液在室温下搅拌过夜。 在上述混合液中加入KHSO4饱和溶液以调节pH 3-4，并用EtOAc萃取。真空浓缩 有机相，得到淡褐色油状纯产物6-6(27.7克，89.0％)。

步骤F：氧化成醛

在冷却(-78℃)、搅拌的草酰氯(84毫摩尔)的CH2Cl2(180毫升)溶液中，加入 DMSO(168毫摩尔)在CH2Cl2(90毫升)中的溶液。1小时后，加入醇6-6(56毫摩 尔)在CH2Cl2(90毫升)中的溶液。1小时后，加入三乙胺(281毫摩尔)，再搅拌1小 时。然后加入NH4Cl饱和水溶液，使其升高至室温。分离有机相，用H2O(×2)、 饱和盐水(×2)洗涤，然后干燥，过滤，减压蒸发，得到粗品醛。柱色谱纯化得到纯 的(S)-醛6-7。

从另一对映体(L)-丝氨酸甲酯出发，可形成(R)对映体(6-8)。

实施例7-A带有β-氟代甲基侧链的中间体的制备

步骤A：(S)-3-((苄氧基)羰基)-2-(1，3-二氧代异二氢氮杂茚-2-基(isoindolin-2-y1))丙酸 的形成

在搅拌的化合物7-1(10.0毫摩尔)在20毫升DCM中的溶液中加入10毫升 TFA。将混合液在室温下搅拌24小时。用LC/MS跟踪反应进程。完全后，减压蒸 发除去溶剂和TFA，冻干得到TFA盐形式的白色固体。将粗品固体悬浮在50毫升 THF和N-羧乙氧基(carboethoxy)邻苯二甲酰亚胺(10.5毫摩尔)中，加入Et3N(10毫 摩尔)。将混合液在N2下回流18小时。冷却反应，蒸发溶剂。加入DCM，并用水、 盐水洗涤，硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱色谱(己烷/EtOAc)纯化，得到2.68 克无色油状的化合物7-2。

步骤B：(S)-4-羟基-3-(1，3-二氧代异二氢氮杂茚-2-基)丁酸苄基酯的形成

-15℃下，在搅拌的(S)-3-((苄氧基)羰基)-2-(1，3-二氧代异二氢氮杂茚-2-基)丙 酸(化合物7-2，6.07毫摩尔)在30毫升无水THF中的溶液中，相继加入N-甲基吗 啉(6.07毫摩尔)、氯甲酸异丁酯(6.07毫摩尔)。-15℃下搅拌5分钟后，立即加入 NaBH4(689毫克，18.21毫摩尔)在2.73毫升水中的溶液。-15℃下搅拌反应2分 钟，然后用水(30毫升)水解。用EtOAc(×3)萃取，用水(×3)、盐水(×1)洗涤，硫酸 钠干燥，过滤，浓缩。硅胶柱色谱(己烷/EtOAc)纯化，得到1.9克无色油状化合物 7-3。

步骤C：(S)-4-氟代-3-(1，3-二氧代异二氢氮杂茚-2-基)丁酸苄基酯的形成

在搅拌的(S)-4-羟基-3-(1，3-二氧代异二氢氮杂茚-2-基)丁酸苄基酯(7-3，5.6毫 摩尔)在乙腈(28毫升)中的溶液中加入全氟代-1-丁磺酰氟(44.8毫摩尔)、二异丙基 乙胺(44.8毫摩尔)和二异丙基乙胺三氢氟化物(trihydrofluoride)(134毫摩尔)。将混 合液在50℃下搅拌过夜。用LC/MS跟踪反应进程。完成之后，将反应冷却至室 温，然后减压蒸发。然后将混合液用DCM分配，用水(×3)、盐水(×2)洗涤，硫酸 钠干燥，过滤，浓缩。硅胶柱色谱(己烷/EtOAc)纯化，得到淡黄色油状化合物7-4。

步骤D：(S)-4-氟代-3-(1，3-二氧代异二氢氮杂茚-2-基)丁醛的形成

-78℃下，在搅拌的(S)-4-氟代-3-(1，3-二氧代异二氢氮杂茚-2-基)丁酸苄基酯 (化合物7-4，0.5毫摩尔)在无水醚(5毫升)中的溶液中，逐滴加入二异丁基氢化铝(1.0 M的甲苯溶液，1.5毫摩尔)。将反应在-78℃下搅拌约30分钟，同时通过LC/MS 监测。完成之后，-78℃下加入水(10毫升)以淬灭反应。乙酸乙酯萃取，水(×3)、 盐水(×2)洗涤，硫酸钠干燥，过滤并浓缩。粗产物化合物7-5可用于下一反应步骤 中。

实施例7-B

制备7-5的可选途径

步骤A：化合物7-6的制备

为了制备(S)-4-氟代-3-(1，3-二氧代异二氢氮杂茚-2-基)丁酸，将化合物7-4(0.20 毫摩尔)溶解在乙醇(5毫升)中。用氮气吹扫该溶液10分钟，然后在氮气环境下加 入10％的钯碳(0.02毫摩尔钯)。然后用氢气向溶液中快速鼓泡，同时搅拌约1小时。

用LC/MS跟踪反应进程。

将反应混合物通过硅藻土(celite)过滤以除去钯。用二氯甲烷淋洗硅藻土两次。 然后浓缩滤液，得到粗产物化合物7-6。该粗产物可用于下一反应步骤中。

步骤B：(S)-S-4-氟代-3-(1，3-二氧代异二氢氮杂茚-2-基)硫代丁酸(butanethioate)乙 酯的形成

将化合物7-5(0.20毫摩尔)、1，3二环己基碳二亚胺(0.30毫摩尔)、乙硫醇(0.6 毫摩尔)和4-二甲基氨基吡啶(0.10毫摩尔)溶解在DMF(5毫升)中。将化合物在室 温下搅拌过夜。用LC/MS监测反应。

将EtOAc加入到反应混合液中。然后用水(2×)和盐水(2×)洗涤。将EtOAc层 用硫酸钠干燥，过滤，并浓缩。然后用快速色谱法纯化粗产物化合物7-7。

步骤C：(S)-4-氟代-3-(1，3-二氧代异二氢氮杂茚-2-基)丁醛的形成

将化合物7-7(0.20毫摩尔)溶解在无水丙酮(10毫升)中。然后在氮气氛下加 入10％的钯碳(0.02毫摩尔)。然后加入三乙基甲硅烷(0.5毫摩尔)。发泡约10秒后， 继续搅拌反应直到发泡停止(30分钟)。用LC/MS监测反应。

将反应混合液通过硅藻土栓塞过滤。用二氯甲烷洗涤栓塞两次，然后浓缩滤 液得到粗产物化合物7-5。该粗产物可用于下一反应中。

从其它(R)对映体，(R)-3-((苄氧基)羰基)-2-(1，3-二氧代异二氢氮杂茚-2-基)丙酸 可形成具有以下化学结构的(R)对映体(7-8)：

7-8.

实施例7-C

带有β-氟代甲基醛侧链的中间体的可选制备方式

方案1

步骤A：化合物7-10的制备

在1000毫升圆底烧瓶中装入甲醇(300毫升)，并用冰浴冷却该系统。15分钟 的时间内逐滴加入乙酰氯(89.3毫升；1251毫摩尔)。将所得溶液升高至环境温度， 一次性加入(S)-2-氨基-4-戊烯酸(7-9)(6.0克；139毫摩尔)。将反应混合液加热回流 2小时，然后冷却至环境温度。然后真空浓缩混合液，得到淡黄色油。将该产物分 散在乙酸乙酯(150毫升)中，再次真空浓缩。重复上述顺序4次。产物7-10是油状 物，真空下静置过夜可固化。1H NMR分析显示，产物具有足够的纯度而无需进一 步纯化。

TLC：Rf＝7.1(二氧化硅；洗脱液5∶3∶1的CHCl3∶MeOH∶(7∶3 H2O∶AcOH)；茚 三酮显色观察)。

1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ5.84-5.73(m，1H)，5.32-5.26(m，2H)， 4.17(dd，1H，J＝7.0，1.6MHz)，3.84(s，3H)，2.73-2.65(m，2H)；(400MHz， d6-DMSO)：δ8.7(br s，3H)，5.81-5.73(m，1H)，5.21-5.14(m，2H)，4.11(t， 1H，J＝6.1Hz)，3.72(s，3H)，2.60(dd，2H，J＝7.1，0.9Hz).

13C NMR(101MHz，d6-DMSO)：δ169.33，131.37，119.88，52.65，51.65， 34.22.

步骤B：化合物7-11的制备

温和升温下，将来自前一步骤的粗品(S)-2-氨基-4-戊烯酸甲酯盐酸盐(7-10)溶 解在THF(190毫升)中。将所得溶液逐滴加入到LiAlH4在THF(280毫升1.0M的 溶液)中的溶液中，加入的速率使得内部温度保持在约5℃。周期性地，稍微加热 以升高含有(S)-2-氨基-4-戊烯酸甲酯盐酸盐溶液的加液漏斗的温度，以溶解结晶的 氨基酯。加入完成后，用额外的20毫升THF淋洗加液漏斗。然后将混合液用二乙 醚(500毫升)稀释，依次加入H2O(11毫升)、15％(w/v)NaOH水溶液(11毫升)和 H2O(33毫升)以破坏过量LiAlH4，加入的速率使得内部温度保持在低于10℃。过 滤混合液，用额外的二乙醚洗涤滤饼。将滤液用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩， 得到黄色液体(7-11；13.4克；基于139.0毫摩尔的(S)-2-氨基-4-戊烯酸，95％质量 回收)。氨基醇(7-11)可通过蒸馏(110℃；20托)纯化。然后，在后续步骤中观察到 最小的改善，因而通常使用该粗品而无需进一步的纯化。

1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ5.87-5.77(m，1H)，5.05-4.97(m，2H)， 3.26(dd，1H，J＝10.3，5.1Hz)，3.14(dd，1H，J＝10.3，6.7Hz)，2.69-2.63(m， 1H)，2.15-2.09(m，1H)，1.92-1.86(m，1H).

13C NMR(101MHz，d6-DMSO)：δ136.49，116.31，66.13，52.53，38.51.

步骤C：化合物7-12的制备

将(S)-2-氨基-4-戊烯醇(7-11；13.4克；132.5毫摩尔)和Na2CO3(70.8克；668.0 毫摩尔)溶解在H2O(400毫升)中。加入CH3CN(700毫升)和2-[(琥珀酰亚胺氧基) 羰基]苯甲酸甲酯(33.1克；119.4毫摩尔)，环境温度下剧烈搅拌所得混合液。2小 时后，TLC分析显示2-[(琥珀酰亚胺氧基)羰基]苯甲酸甲酯的消耗。在旋转蒸发仪 上除去大部分的CH3CN，将剩余的物质转移到分液漏斗中，用EtOAc萃取(3×100 毫升)。将合并的EtOAc萃取物用0.5M HCl(2×250毫升)和盐水(250毫升)洗涤。 将EtOAc相用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩，得到黄色油状物(7-12；19.3克；70％)， 可用于下一步骤中而无需进一步纯化。

1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ7.90-7.83(m，4H)，5.74-5.64(m，1H)， 4.99-4.91(m，3H)，4.27-4.20(m，1H)，3.90-3.84(m，1H)，3.63-3.58(m，1H)， 2.64-2.44(m，2H).

13C NMR(101MHz，d6-DMSO)：δ168.25，134.86，134.42，131.37， 122.94，117.41，60.63，53.47，32.59.

步骤D：化合物7-13的制备

将N，N-二异丙基乙基胺(215毫升；1240毫摩尔)，三乙基胺三氢氟化物(81毫 升；496毫摩尔)和全氟代-1-丁磺酰氟(15.0毫升；83.5毫摩尔)加入到7-12(19.1克； 82.7毫摩尔)在PhCF3(310毫升)中的溶液中，室温下搅拌所得混合液。分别在60、 90、120、150和180分钟后加入额外的全氟代-1-丁磺酰氟(7.5毫升；41.8毫摩尔)。 总共18小时之后，将反应混合液转移到分液漏斗中，用1.0N HCl淋洗两次，用 饱和NaHCO3水溶液淋洗两次，用H2O淋洗一次。将有机相用Na2SO4干燥，过滤， 浓缩得到橙色油状物。将该粗品装载到二氧化硅垫中，用4∶1的己烷∶EtOAc洗脱， 得到黄色油状产物(7-13)(15.4克；80％)。

1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ7.88-7.81(m，4H)，5.77-5.66(m，1H)， 5.04-4.88(m，2.5H)，4.80-4.73(m，1H)，4.65-4.61(m，0.5H)，4.60-4.49(m， 1H)，2.68-2.47(m，2H).

13C NMR(101MHz，d6-DMSO)：δ167.87，134.79，133.77，130.94， 123.26，118.21，81.82(d，J＝170Hz)，50.47(d，J＝19Hz)，31.40(d，J＝6Hz).

步骤E：化合物7-8的制备

将化合物7-13(15.3毫摩尔)溶解在2∶1的CH3OH∶H2O(1500毫升)中，加入 OsO4在H2O(29.3毫升4％w/v的溶液)中的溶液。然后一次性加入NaIO4(42.2克； 197.2毫摩尔)，环境温度下搅拌所得混合液。3小时后，过滤混合液以除去沉淀的 固体，并用EtOAc洗涤滤饼。真空浓缩滤液以除去大部分的有机溶剂。将残留物 用EtOAc萃取三次，将合并的EtOAc萃取物用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残 留物溶解在CHCl2中，装入硅胶垫中，相继用20％、30％、40％、50％和100％EtOAc 的己烷溶液洗脱。30％-50％馏分中存在化合物7-8但被极性较强的杂质污染。合并 该馏分并进行浓缩，将残留物装入第二个硅胶垫中，用30％EtOAc的己烷溶液洗 脱，得到淡黄色固体状化合物7-8(11.1克；72％)。

1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ9.61(s，1H)，7.91-7.83(m，4H)， 4.97-4.94(m，1H)，4.78(t，0.5H，J＝9.3Hz)，4.69-4.64(m，1H)，4.57-4.53(m， 0.5H)，3.28-3.02(m，2H).

13C NMR(101MHz，d6-DMSO)：δ200.14，167.65，134.73，131.15， 123.24，81.80(d，J＝171Hz)，44.81(d，J＝21Hz)，40.64(d，J＝6Hz).

实施例7-C

化合物7-12的可选合成方式

方案2

步骤A：化合物7-14的制备

在2.2当量三乙胺的存在下，将化合物7-9与2.2当量的邻苯二甲酸酐在乙酸 乙酯中回流，直到反应完全。一定压力下除去溶剂。将残留物溶解在pH为4的水 中，然后用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用pH为4的水洗涤两次。然后，用硫 酸钠干燥有机相。除去溶剂，得到白色固体7-14。

步骤B：化合物7-12的制备

室温下将化合物7-14与1.2当量的DIEA和1.1当量的BOP在THF中搅拌直 到形成澄清溶液。将溶液冷却至0℃，然后加入1.0当量的NaBH4。将反应混合液 在0℃于氮气下搅拌直到反应完全。溶剂换成DCM并用水洗涤反应一次。将DCM 相装入硅胶栓塞，用15％EtOAc的己烷溶液冲洗，得到无色油状化合物7-12。

实施例8

中间体(S)-4-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯

将(S)-3-(叔丁氧基羰基氨基)丁酸乙酯8-1(1当量)和甲苯(x＝3)的共沸混合物 溶解在二氯甲烷中，冷却至-78℃。然后在氮气环境下逐滴加入1M的DIBAL在甲 苯(2当量)中的溶液，-78℃下搅拌2小时。

用甲醇淬灭反应并浓缩。0℃下在浓缩的残留物中加入2M酒石酸钾钠，室温 下剧烈搅拌30分钟。将反应混合液在乙酸乙酯和水之间分配。用盐水洗涤有机层， 硫酸钠干燥，过滤，蒸发，减压干燥，得到淡黄色粘稠液体状化合物8-2。

MS：MH+＝188.2

实施例9

(R)-4-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯的合成

步骤A：(R)-3-(叔丁氧基羰基氨基)丁酸苄基酯的合成

在(R)-3-氨基丁酸苄基酯硫酸盐9-1(1当量)的THF溶液中加入Boc-酸酐(2当 量)和二异丙基乙基胺(4当量)。将反应混合液在室温下搅拌72小时。反应混合液 进行浓缩并在乙酸乙酯和水之间分配。分离有机层，用水和盐水洗涤，硫酸钠干燥， 过滤，蒸发，减压干燥，得到白色固体状化合物9-2。

MS：MH+＝294.0

步骤B：(R)-4-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯

将(R)-3-(叔丁氧基羰基氨基)丁酸苄基酯9-2(1当量)和甲苯(x＝3)的共沸混合 物溶解在二氯甲烷中并冷却至-78℃。氮气环境下逐滴加入1M的DIBAL在甲苯(2 当量)中的溶液，-78℃下搅拌2小时。用甲醇淬灭反应，然后浓缩。0℃下在浓缩 的残留物中加入2M酒石酸钾钠溶液，室温下剧烈搅拌30分钟。将反应混合液在 乙酸乙酯与水之间分配。将有机层用盐水洗涤，硫酸钠干燥，过滤，蒸发，减压干 燥，得到无色粘稠液体状化合物9-3。

MS：MH+＝188.2

实施例10

2-甲基-4-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯的合成

步骤A：3-氨基-3-甲基丁酸甲酯的合成

0℃下，在3-氨基-3-甲基-丁酸10-1(1当量)的甲醇溶液中加入2当量的亚硫酰 氯。将反应混合液升高至室温，搅拌过夜。蒸发溶剂，得到10-2和甲苯(x＝3)的共 沸混合物，用于步骤B中。

MS：MH+＝132.1

步骤B：3-(叔丁氧基羰基氨基)-3-甲基丁酸甲酯的合成

在3-氨基-3-甲基丁酸甲酯盐酸盐10-2(1当量)的THF溶液中加入Boc-酸酐(2 当量)和二异丙基乙基胺(4当量)。将该反应混合液在室温下搅拌48小时。反应混 合液进行浓缩并在乙酸乙酯和水之间分配。分离有机层，用水和盐水洗涤，硫酸钠 干燥，过滤，蒸发，减压干燥，得到白色固体状化合物10-3。

MS：MH+＝232.1

步骤C：2-甲基-4-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯的合成

将3-(叔丁氧基羰基氨基)-3-甲基丁酸甲酯10-3(1当量)和甲苯(x＝3)的共沸混 合物溶解在二氯甲烷中并冷却至-78℃。氮气环境下在该溶液中逐滴加入1M的 DIBAL在甲苯(2当量)中的溶液，-78℃下搅拌2小时。用甲醇淬灭反应并浓缩。0 ℃下在浓缩的残留物中加入2M的酒石酸钾钠溶液，室温下剧烈搅拌30分钟。使 混合物在乙酸乙酯和水之间分配。将有机层用盐水洗涤，硫酸钠干燥，过滤，蒸发， 减压干燥，得到无色粘稠液体状产物10-4。

MS：MH+＝202.1

实施例11

苯基咪唑游离胺中间体的合成

方案3

步骤A：化合物11-3的制备

在含有1当量化合物11-1的5-颈烧瓶中加入0.7当量K2CO3，得到0.25M K2CO3在丙酮中的溶液。氮气下搅拌45分钟后，加入1.0当量化合物11-2在1M 丙酮中的溶液，再加入0.2当量KI在5M丙酮中的溶液。反应完全时(约3小时)， 用冰浴冷却反应混合液。通过加液漏斗加入冰水(等于反应中使用的丙酮的体积约 2.5倍)，加入的速率能使温度不超过15℃。冰浴中搅拌1小时后，真空过滤收集 产物。滤饼用20％丙酮洗涤3次，用水洗涤3次。将滤饼空气干燥并在烘箱中50℃/5 托下进一步干燥，直到重量不再变化。产率96％，HPLC纯度：99％。

步骤B：化合物11-4的制备

在含有0.19M的11-3的甲苯溶液的反应烧瓶中，加入20当量NH4OAc。回 流下搅拌混合液直到反应完全(约8小时)。冷却至室温，然后加入水(等于反应中使 用的甲苯体积的约四分之一)。分离有机相，用水、饱和NaHCO3洗涤，MgSO4干 燥。真空除去溶剂，得到11-4。产率99.6％，HPLC纯度：91.4％。

步骤C：化合物11-5的制备

将含有0.5M的11-4在DMF和K2CO3中的溶液的烧瓶在0-5℃、于氮气下搅 拌30分钟，然后加入1.1当量的PhCH2Br。将混合液在室温下搅拌过夜。然后在 冰浴上搅拌，期间逐滴加入冰水(约等于反应中使用的DMF的体积)。真空过滤收 集产物，用50％DMF洗涤两次，用25％DMF洗涤两次，用水洗涤三次。将固体 在烘箱中50℃/5托下干燥。产率95％，HPLC纯度：94％。

步骤D：化合物11-6的制备

将MeOH加入烧瓶中并置于冰浴中。30分钟内向其中逐滴加入9.85当量的 CH3COCl，然后加入1当量11-5以形成0.25M 11-5在MeOH中的溶液。室温下 搅拌混合液直到反应完全(约12小时)。减压除去溶剂后，将所得固体悬浮在MeOH (等于约反应中使用的MeOH体积的一半)中并在0-5℃下搅拌。在该混合液中逐 滴加入2.5M NaOH/MeOH溶液直到pH达到约10，然后加入水。0-5℃下搅拌1 小时后，过滤收集产物。在烘箱中50℃/5托下干燥。产率90.5％，HPLC纯度： 97.0％。测定光学纯度＞99％(对映体过量(ee))。

实施例12

β-甲氧基甲基侧链中间体的制备

方案4

步骤A：化合物12-2的制备

在500毫升圆底烧瓶中加入化合物12-1(7.95克；25.7毫摩尔)、16.0克2，6- 二-叔丁基-4-甲基吡啶(16.0克；77.9毫摩尔)和100毫升无水DCM。接着，加入 11.36克三氟甲烷磺酸甲酯。将反应混合液在氮气、室温下搅拌，HPLC监测。HPLC 监测显示，t＝17小时时存在76.0％的化合物12-2、9.9％的化合物12-1、14.1％的副 产物；t＝20小时时，存在76.4％的化合物12-2、16.2％的副产物、7.4％的化合物12-1。 通过滤出固体来停止反应。固体用CH2Cl2洗涤。将合并的滤液用0.5N HCl(2×100 毫升)洗涤，Na2SO4干燥并浓缩。快速柱色谱(200克硅胶，20％EtOAc的己烷溶液) 得到5.28克褐色油状物12-2。HPLC纯度＝93.9％，用于下一步骤。

步骤B：化合物12-3的制备

将化合物12-2(1.10克，3.6毫摩尔)在无水DCM(22毫升)中的溶液冷却至-78 ℃。加入DIBAL(7.12毫升1.0M在CH2Cl2中的溶液)。将反应混合液在-120℃±3 ℃(外部温度)下搅拌，HPLC监测。-120℃下在预冷MeOH中立即淬灭过程对照 (in process control，IPC)样品，制备HPLC中t＝0时的读数。内部温度维持在 -118℃±3℃。所有IPC样品(t＝0，t＝1小时，t＝2小时)表明，反应混合液中不存 在化合物12-2。t＝3时认为反应完全，用甲醇淬灭。整个淬灭过程期间维持-120℃ ±2℃的温度。HPLC表明，反应混合液中包含醛∶醇比95.1∶4.9。将反应混合液浓 缩至干，然后重新溶解在CH2Cl2中，用Na2CO3(2×50毫升)和盐水(2×50毫升)洗 涤，Na2SO4干燥，浓缩得到淡黄色油状物。HPLC测定表明化合物12-3的纯度为 82％。

采用上述实施例与方法中叙述的方法制备下表中的化合物。下表还包括实验 部分描述的化合物。合成中采用的起始材料是本领域技术人员已知的，市售可得或 可采用已知方法制备。表1中的化合物采用ACD/批量命名法5.04版(先进化学品 开发公司(Advanced Chemistry Development Inc.)；多伦多，安大略湖； www.acdlabs.com)命名)。表2和表3中的化合物采用ISIS/基础(ISIS/Base)的 AutoNom 2000(自动命名(Automatic Nomenclature))命名，执行IUPAC标准命名法。 在一个实施方式中，假设是表1、2或3中化合物的任一种的立体异构体。一方面， 立体异构体是对映体。另一方面，立体异构体是是非对映体。

表1

表3

实施例13

确定KSP活性的试验

本实施例提供了体外确定KSP活性的代表性体外试验。来自牛脑的经纯化的 微管从细胞骨架公司(Cytoskeleton Inc.)(丹佛，科罗拉多州，美国)购得。将人KSP(Eg 5，KNSL1)的动力域克隆，表达，并纯化至大于95％同质性。活质分子绿(Biomol Green)从亲和力研究产品有限公司(Affinity Research Products Ltd.，Matford Court， 埃克塞特，德文郡，英国)购得。微管和KSP动力蛋白(即，KSP动力域)稀释在试 验缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM MgCl2，10mM DTT和0.25毫克/毫升 BSA)中，最终浓度35微克/毫升微管和45nM KSP。然后将微管/KSP混合物在37 ℃下预先孵育10分钟以促进KSP与微管的结合。

在含有1.25微升抑制剂或试验化合物的DMSO溶液(或在对照中，仅有DMSO) 的试验板(384-孔板)的每个孔中加入25微升ATP溶液(ATP在试验缓冲液中稀释至 浓度300μM)和25微升上述微管/KSP溶液。将板在室温下孵育1小时。孵育后， 每个孔中加入65微升活质分子绿(基于孔雀石绿的染料，用于检测无机磷酸盐的释 放)。将板再孵育5-10分钟，然后采用维克多II读板仪(Victor II plate reader)在630nm 下测定吸光度。630nm下吸光度数据对应于样品中的KSP活性。然后，基于每个 浓度下630nm处吸光度的降低，采用Excel的XL拟合(XLFit)或图形软件公司 (GraphPad Software Inc)的Prism数据分析系统通过非线性回归，测定每种抑制剂或 试验化合物的IC50。

本发明优选化合物的生物学活性表现为在实施例13所述的分析方案中IC50小 于约1mM，优选实施方式的生物学活性小于约25μM，尤其优选实施方式的生物 学活性小于约1000nM，最优选实施方式的生物学活性小于约100nM。

实施例14

在用KSP抑制剂处理的肿瘤细胞株中细胞增殖的抑制

将细胞以500个细胞/孔的密度接种到96-孔板中，使细胞生长24小时。然后 用各种浓度的化合物处理细胞72小时。接着，加入100微升CellTiter Glo。CellTiter Glo是一种利用反应试剂3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-硫苯 基)-2H-四唑盐(MTS)的四唑盐基试验(美国专利5,185,450)(参见Promega产品编号 #G3580，CeIITiter 96水性单溶液细胞增殖分析)。然后使细胞在黑暗中孵育30分 钟。采用Walloc Trilux读板仪测定每孔发光程度，对应于每孔细胞数。仅接受DMSO (0.5％)的孔中活细胞的数量用作0％抑制，而无细胞孔用作100％细胞生长抑制。由 连续接触化合物72小时时对数-转换的剂量值对(vs)细胞计数(对照的百分数) 的S形剂量-反应曲线图确定导致50％生长抑制(GI50)的化合物浓度。

所用细胞株如下所述。

如上所述进行细胞增殖试验。

癌症细胞株

Colo 205-结肠癌

RPMI 1640+10％FBS+1％L-谷氨酰胺+1％P/S

+1％NaPyr.+Hepes

+4.5g/L葡萄糖+1％NaBicarb.

MDA 435-乳腺癌-高符合(high met)

EMEM+10％FBS+1％P/S+1％L-谷氨酰胺+1％NEAA

+1％NaPyr+1％维生素

HCT-15和HCT116-结肠癌

RPMI 1640+10％FBS+1％L-谷氨酰胺+1％P/S

耐药细胞株

KB3.1-结肠表皮癌；亲代细胞株

Iscove’s+10％FBS+1％L-谷氨酰胺+1％P/S

KBV1-p-糖蛋白结合多药耐药细胞株

RPMI 1640+10％FBS+1％L-谷氨酰胺+1％P/S+0.2ug/mL

长春碱

KB85-p-糖蛋白结合多药耐药细胞株

DMEM+10％FBS+1％L-谷氨酰胺+1％P/S+10ng/mL秋

水仙碱

本发明优选化合物的生物学活性在一些实施例所述的分析方案中GI50小于约 1mM，生物学活性小于约25μM，其它优选实施方式的生物学活性小于约1000nM， 另一些实施方式的GI50小于约100nM。

实施例15

克隆原性软琼脂试验方案

将人癌细胞以3×105细胞/孔的密度接种到6-孔板中。第二天，将感兴趣化合 物以一定浓度加入到各个孔中。孵育24和48小时之后，收集细胞，洗涤并计数。 采用万用96机器(Multimek 96 robot)进行以下步骤。然后，以500个活细胞/孔接种 到96-孔板中，所述96-孔板涂覆有PolyHema以防止细胞与孔底部粘连。熔化琼脂 糖(3％储液)，在温热介质中稀释，加入到细胞中以使最终浓度为0.5％。软琼脂固 化后，将板在37℃下孵育6天。将Alamar蓝染料加入到细胞中，培养板再孵育 6小时。在Tecan读板仪上测定光密度变化，认为其与软琼脂中形成的克隆数量相 关。癌细胞能够在琼脂上生长，因而光密度增加。光密度降低表示癌细胞受到抑制。 认为本发明将降低光密度。

发明背景