本发明涉及以一种单克隆抗体作为载体，偶联携带抗肿瘤药物进行抗肿瘤 治疗的方法。

单克隆抗体(单抗)3D6是以IV型胶原酶免疫BALB/c小鼠后取其脾细胞 与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合，经筛选，克隆后所得杂交瘤细胞株分泌的抗体。

据报道，恶性肿瘤细胞分泌多种基质金属蛋白酶，降解胞外基质，调节肿 瘤细胞的生长与转移。IV型胶原酶是基质金属蛋白酶家族的重要成员，可降解 细胞外基质主要成分IV型胶原，促进肿瘤细胞的生长与转移(Journal of the National Cancer Institute 1997，89：1260)。抑制基质金属蛋白酶产生及其活 性的小分子药物在体内有明显的抗肿瘤作用(Trends in Molecular Medicine 1999，31：34)。但针对基质金属蛋白酶的单克隆抗体及其与药物偶联物的研 究较少。力达霉素(Lidamycin，LDM又称C1027)是我国自行研制的一种抗肿 瘤抗生素，在体内外有明显的抗肿瘤作用(Journal of Antibiotics 1989，42： 1294)，其结构具有可拆分和重建的特点(药学学报1992，27：486)。力达 霉素与大鼠抗人肝癌BEL-7402细胞单抗3A5 Fab片段的偶联物(药学学报 1993，28：260)以及力达霉素与抗IV型胶原酶单抗3D6偶联物(国外医学肿 瘤学分册1998，5：68)在体内外均有明显抗肿瘤作用。但3D6的活性片段 及其与力达霉素偶联物尚未见报道。平阳霉素(Pingyangmycin，PYM)是临 床常用的一种抗肿瘤抗生素，平阳霉素与单抗3A5偶联物体外对肝癌BEL-7402 细胞具有选择性杀伤作用(中华微生物与免疫学杂志1991，11：230)。动物 实验表明该偶联物腔内给药可明显延长动物生存时间(药学学报1997，32： 669)，但平阳霉素与抗基质金属蛋白酶单克隆抗体及其活性片段偶联物未见报 道。综上所述，迄今为止，抗基质金属蛋白酶单克隆抗体活性片段及其与力达 霉素和平阳霉素偶联物国内外均未见报道。本项发明的研究表明，以适当的方 法可以获得有活性的小鼠抗IV型胶原酶单克隆抗体3D6 Fab′片段，其与力达 霉素和平阳霉素偶联物在体内外有显著抗肿瘤作用，有可能成为新的肿瘤治疗 药物。

本发明的目的是以合适的方法制备单抗3D6 Fab′片段，并将此片段与力达 霉素及平阳霉素偶联，获得偶联物，用于临床治疗肿瘤。 本发明的内容与要点是：

1.单抗3D6 Fab′的制备利用抗基质金属蛋白酶单抗3D6 Fab′片段作为 药物导向载体。首先以适当方法制备单抗3D6 Fab′片段。单抗3D6以0.05mol/L Tris-HCL缓冲液，pH7.2(含2mmol/L EDTA)充分透析后以相同缓冲液调整 为4mg/ml。按0.06单位酶/毫克抗体加入预先溶于相同缓冲液的无花果蛋白酶， 再以1mmol/L半胱氨酸激活反应，37℃反应6小时，产物经Sephadex G-150 层析纯化获得F(ab)′2。6-10mg/ml F(ab)′2在pH7.5时以β-巯基乙醇还原， 产物经0.05mol/L磷酸盐缓冲液(PB)，pH6.8充分透析后立即与力达霉素交 联或以N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEMI)封闭巯基后经Sephadex G-75层析纯 化获得Fab′用于与平阳霉素偶联。经酶联免疫吸附测定(ELISA)，Fab′保持

2. Fab′与力达霉素偶联物制备2毫克力达霉素与适量N-羟基琥珀酰亚 胺基-间-(N-马来酰亚胺基)苯甲酸酯(MBS)混合，室温避光反应40分钟， 以PD-10柱脱盐后立即与巯基化的3D6 Fab′混合，室温避光反应过夜。加入 N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEMI)，继续反应1小时。经Sephadex G-75层析纯 化获得Fab′-LDM直接偶联物。Fab′-LDM直接偶联物加倍量发色团，混合过夜 后以Sephadex G-25层析获得Fab′-LDM强化偶联物。

3. Fab′与平阳霉素偶联物制备将葡聚糖T-40(dextran T-40)以高碘 酸钠氧化，透析，冷冻干燥，得多醛基葡聚糖(PAD)。按重量比1∶2取PAD 与平阳霉素共溶于适量磷酸盐缓冲液(PBS)中，4℃避光反应12小时，加入 与PAD等摩尔数的3D6 Fab′，继续反应12小时。以适量硼氢化钠还原2小 时。产物经Sephadex G-100层析纯化，收集既有抗体活性又有抑菌活性部分， 即为偶联物。

4. Fab′-LDM及Fab′-PYM偶联物与肿瘤细胞的免疫反应性以ELISA 法进行。Fab′-LDM及Fab′-PYM偶联物保持了与IV型胶原酶、人口腔鳞癌KB 以及肺癌PG细胞免疫反应性，与人肝癌BEL-7402细胞无反应(图2，图3)。

5.偶联物对肿瘤细胞的杀伤作用用克隆形成法测定偶联物对体外培养的 人体肝癌细胞BEL-7402和口腔鳞癌KB细胞的杀伤作用，药物作用1小时。 结果力达霉素对两种细胞均有杀伤作用，抑制50％克隆形成的浓度(IC50)分 别为2.0×10-15mol/L和2.21×10-15mol/L；Fab′-LDM偶联物对两种细胞IC50 分别为1.04×10-13mol/L和1.99×10-15mol/L。表明Fab′-LDM对靶细胞KB 具有一定选择性杀伤作用。Fab′-LDM及力达霉素对肺癌PG细胞的杀伤作用以 四氮唑蓝法测定，力达霉素及Fab′-LDM对肺癌PG细胞的IC50分别为3.7× 10-10mol/L和4.2×10-10mol/L(图4，图5，表1)。与此相似，PYM对KB细 胞和BEL-7402细胞生长均有杀伤作用，抑制50％克隆形成的浓度(IC50)分 别为0.42μmol/L和0.17μmol/L；Fab′-PYM对两种细胞IC50分别为0.012μ mol/L和0.48μmol/L(图6，图7)。

表1MTT法测定力达霉素和Fab′-LDM在体外对肺癌PG细胞的杀伤作用

      药物       浓度(mol/L×10-10)    A560(％对照)

    力达霉素            88.16               21.97

                        8.816               34.89

                        0.882               67.95

                        0.088               77.00

                        0.009               101.82

     Fab′-LDM          88.16               22.30

                        8.816               39.09

                        0.882               75.64

                        0.088               79.39

                        0.009               93.41

6. Fab′-LDM偶联物静脉注射对小鼠肝癌22的疗效取体内传代的肝癌22 腹水，以生理盐水稀释成7.5×106细胞/ml，按0.2ml/只接种于昆明小鼠腋窝 皮下；接种24小时后静脉注射(iv)给药，对照组给予生理盐水，每3天给药 一次，共3次。实验第10天处死动物，取肿瘤称重，计算抑瘤率。结果表明， 3D6 Fab′-LDM对肝癌22有明显疗效，0.05mg/kg，0.1mg/kg和0.2mg/kg剂 量，抑瘤率分别为86％，89％和91％，而0.1mg/kg力达霉素抑瘤率为77％， 明显低于等剂量偶联物(表2)。

表2 3D6 Fab′-LDM静脉注射给药对小鼠肝癌22的抑制作用 药物         剂量           动物数      体重(g)    瘤重(mg)   抑瘤率

    (mg/kg×次数)     开始/结束    开始/结束    x±SD    (％) 对照                        10/10      19.4/27.4   1400±373 力达霉素    0.1×3          10/10      20.0/26.9    329±97    77** Fab′-LDM   0.05×3         10/10      19.7/27.3    203±56    86**，Δ

        0.1×3          10/10      18.8/26.9    155±34    89**，ΔΔ

        0.2×3          10/10      19.4/27.1    129±25    91**，ΔΔ 皮下接种肿瘤，静脉注射给药，三天一次； **P＜0.01与对照比较 ΔP＜0.05与力达霉素组比较 ΔΔP＜0.01与力达霉素组比较

7. Fab′-LDM偶联物静脉注射给药(iv)对小鼠Lewis癌肺转移的疗效取 C57/BL6小鼠皮下传代的Lewis癌组织，以1∶3加生理盐水制成匀浆，C57/BL6 小鼠按0.2ml/只腋窝皮下接种瘤液。接种第8天和第15天各静脉注射给药一 次。实验第21天处理动物，剥取皮下肿瘤称重，取肺脏，以Bouin氏液固定， 计数肺表面瘤结，计算肺转移抑制率。结果表明，3D6 Fab′-LDM对皮下瘤的 生长无明显影响，但对Lewis癌肺转移有明显抑制作用，0.05mg/kg和0.1mg/kg 剂量，抑制率分别为91％和94％，而0.1mg/kg力达霉素抑制率为88％，明 显低于等剂量偶联物(表3)。

表3偶联物静脉注射对皮下接种小鼠Lewis癌肺转移的抑制作用 组别        剂量        动物数      体重(g)    皮下瘤重(g)        肺转移灶

                                                           总数    抑制率

   (mg/kg×次数)  开始/结束    开始/结束      x±SD       x±SD    (％) 对照                    10/10      18.9/22.1    8.53±1.21    20.1±2.2 力达霉素   0.1×2       10/9       18.6/21.4    6.63±1.17    2.4±0.7  88** Fab′-LDM  0.05×2      10/9       18.5/20.9    7.71±1.41    1.9±0.7  91**

       0.1×2       10/10      18.2/22.0    7.53±0.63    1.2±0.4  94**，ΔΔ 皮下接种肿瘤，静脉给药，七天一次； **P＜0.01  与对照比较 ΔΔP＜0.01  与力达霉素组比较

本发明的优点与积极效果是：确定了抗基质金属蛋白酶单克隆抗体3D6 Fab′片段制备方法并为抗基质金属蛋白酶单抗与力达霉素及平阳霉素偶联物用 于治疗肿瘤提供了必要的依据。平阳霉素是临床常用的抗肿瘤抗生素，3D6 Fab′-PYM在体外对靶细胞有较平阳霉素更强的杀伤作用；力达霉素是一种迄 今为止报道的细胞毒作用最强并有明显体内抗肿瘤作用的肽类抗肿瘤抗生素， 作为抗肿瘤药物有极大的发展潜力，而力达霉素与3D6 Fab′偶联物对实验动物 肿瘤具有明显优于等剂量游离力达霉素的疗效，预计单抗3D6 Fab′片段与平 阳霉素及力达霉素偶联物将可能开发成为新型抗肿瘤导向药物用于临床肿瘤治 疗，并取得良好的效果。

附图说明： 图1单抗3D6 Fab′与IV型胶原酶、KB、PG、BEL-7402细胞免疫反应性 其中横坐标为抗体浓度(μg/ml) 纵坐标为490nm吸光值 1为IV型胶原酶 2为KB细胞 3为PG细胞 4为BEL-7402细胞 图2单抗3D6 Fab′-LDM与IV胶原酶、KB、PG、BEL-7402细胞免疫反应性 其中横坐标为抗体浓度(μg/ml) 纵坐标为490nm吸光值 1为IV型胶原酶 2为KB细胞 3为PG细胞 4为BEL-7402细胞 图3单抗3D6 Fab′-PYM与IV胶原酶、KB、PG、BEL-7402细胞免疫反应性 其中横坐标为抗体浓度(μg/ml) 纵坐标为490nm吸光值 1为IV型胶原酶 2为KB细胞 3为PG细胞 4为BEL-7402细胞 图4力达霉素及3D6 Fab′-LDM偶联物对KB细胞的杀伤作用 其中横坐标为药物浓度(mol/L) 纵坐标为克隆形成率(％) 1为力达霉素 2为3D6 Fab′-LDM偶联物 图5力达霉素及3D6 Fab′-LDM偶联物对BEL-7402细胞的杀伤作用 其中横坐标为药物浓度(mol/L) 纵坐标为克隆形成率(％) 1为力达霉素 2为3D6 Fab′-LDM偶联物 图6平阳霉素及3D6 Fab′-PYM偶联物对KB细胞的杀伤作用 其中横坐标为药物浓度(μmol/L) 纵坐标为克隆形成率(％) 1为平阳霉素 2为3D6 Fab′-PYM偶联物 图7平阳霉素及3D6 Fab′-PYM偶联物对BEL-7402细胞的杀伤作用 其中横坐标为药物浓度(μmol/L) 纵坐标为克隆形成率(％) 1为平阳霉素 2为3D6 Fab′-PYM偶联物