在
治疗恶性
疾病中使用的两组主要的药物是烷化剂和抗代谢 物。异环磷酰胺是广泛应用的抗
肿瘤药物之一,其属于烷化剂。
异环磷酰胺的化学名为3-(2-氯乙基)-2-[(2-氯乙基)
氨基]-四 氢-2H-1,3,2-
氧氮杂酰胺(oxazaphosphorin)-2-氧化物,表示为式:
异环磷酰胺是白色结晶的吸湿性粉末,具有40℃的低熔点。该粉 末具有约100mg/ml的
水溶性。
异环磷酰胺被用于治疗多种实体瘤和Burkitt淋巴瘤,所述实体 瘤包括子
宫颈瘤、子宫内膜瘤、
肺瘤、卵巢瘤、睾丸瘤、胸腺瘤和 肉瘤。
使用异环磷酰胺的治疗伴有严重的
副作用,所述副作
用例如出血 性膀胱炎、骨髓抑制、心脏
心律失常、CNS障碍、肾毒性、血液学和 胃肠反应。据报道,小鼠静脉内给药的LD50为338mg/kg体重。与泌 尿系统保护剂(uroprotective agent)巯乙磺酸钠(mesna)联合降 低了出血性膀胱炎的发生率。因此,巯乙磺酸钠通常以异环磷酰胺 剂量的20%在零时(异环磷酰胺给药时)、和之后的4小时和8小时 静脉给药。
异环磷酰胺可以以含有小于4%w/v的异环磷酰胺的稀释液通过 注射或输注静脉给药。异环磷酰胺非常易于
水解,因而,通常需要 即时给药这样的溶液。因此,市售的主要是干燥的形式,其以无菌
包装的干粉末形式供应,在给药前溶于水中用于注射。然而,异环 磷酰胺的低熔点和吸湿性使得粉末需要在正确控制的
温度和湿度下 小心地装填以获得无菌产品。而且,干粉末长时间的贮藏也导致板 结(sintering)和变黄,其依次导致溶解速率的降低而增加了重构需 要的时间。
为了克服与热敏性和易水解性有关的难题,已尝试了冻干药物。 然而,冻干的过程相当费时且需要特定的设备。在冻干粉末的重构 过程中发生的人员暴露于强细胞毒性的异环磷酰胺是不受欢迎的。
因此,已尝试制备可用于肠胃外给药的澄清的液体异环磷酰胺组 合物,其将在一段时期内稳定。
US4952575公开了含有96%至100%的
乙醇的异环磷酰胺的乙醇 溶液。尽管异环磷酰胺的降解已显示出为最小,但是这样高浓度溶 剂的使用导致其它的问题,如挥发性、制备过程中的操作性、给药 时与血液的混溶性。由于该醇是药理学活性的,其可影响给予了异 环磷酰胺的醇溶液的患者。
有两个
专利使用了多元醇制备了氧氮杂酰胺类化合物的稳定的 液体组合物,即
US4879286公开了这样的发明:其中环磷酰胺被制备成易于稀释 的溶液。该发明使用有机多元醇即丙二醇和聚乙二醇及他们的混合 物作为
溶剂,也可含有0至50%的水。所述水可以被10%至30%的乙 醇部分地代替。
WO0202125公开了含有异环磷酰胺、溶剂和任选地常规药用载 体和赋形剂的肠胃外给药的液体药物组合物。根据该发明,溶剂含 有35-75%的低级醇和25-65%的多元醇。当低级醇溶剂通常为乙醇 时,多元醇溶剂为丙二醇、丙三醇和/或聚乙二醇。
在专利US4879286和WO0202125中,更大量多元醇和醇的肠胃 外给药导致了其它的问题,例如注射时的
疼痛和刺激、溶血、
耳毒 性、心血管作用、CNS作用和
癫痫发作。其在患有肾衰的患者中也可 导致容积渗摩尔浓度过高(hyperosmolarity)和乳酸中毒。
WO9918073公开了稳定的、使用
氯化钠作为稳定剂的即用型异 环磷酰胺的水溶液。该发明还公开了含有尿素、氯化钠和
磷酸二氢 钠的10-500mg/ml的异环磷酰胺组合物。据说该发明的组合物是稳 定的,但是没有提及所述组合物的安全性和毒性。在制剂中,高浓 度的尿素可导致并发症,比如
注射部位的溶血、刺激、静脉炎&血栓 形成,和患有肝脏和肾功能衰竭的患者中提高的血氨和尿浓度。
WO03/051297A2公开了在可药用缓冲剂中含有40-400mM(10- 100mg/ml)的异环磷酰胺的即用型异环磷酰胺的含水组合物。该专 利建议优选使用选自Na2HPO4&NaH2PO4和K2HPO4&KH2PO4的缓冲剂。尚 没有关于该专利中公开的异环磷酰胺组合物的毒性的报道。
因此,仍需要稳定的、浓缩的异环磷酰胺溶液,以便于在给药过 程中进行处理。另外,仍需要能表现出比当前可获得的组合物更低 毒性的异环磷酰胺组合物。
因而,本发明的主要目的是提供可用于肠胃外给予人类或其它哺 乳动物的稳定的、澄清的具有降低的毒性的含水异环磷酰胺组合 物。
本发明的另一个目的是提供制备该组合物的方法。
发明概述
因此,本发明提供用于肠胃外给药的稳定的、澄清的具有降低的 毒性的含水异环磷酰胺组合物,其含有:
组合物中最多1100mg/ml的异环磷酰胺 和2-羟丙基-β-环糊精。
本发明还提供制备用于肠胃外给药的具有降低的毒性的异环磷 酰胺组合物的方法,其包括以下步骤:
i使异环磷酰胺、2-羟丙基-β-环糊精和水密切
接触;
ii对步骤(i)结束时所获得的组合物进行灭菌。
在本发明的方法中,在使异环磷酰胺、2-羟丙基-β-环糊精和水 密切接触时可加入需要量的可药用添加剂。
密切接触可通过各种方法如搅拌、混合、超声处理、加热、均质 化实施。优选在无菌条件下和在惰性气体气氛中于低于40℃下实 施。
本发明还提供加入一种或多种可药用缓冲剂、张
力剂(tonicity agent)、
防腐剂、螯合剂、抗
氧化剂、抗结晶剂。
本发明还涉及进行组合物灭菌,优选通过无菌的0.2μm灭菌分 级
过滤器灭菌,并将灭菌的组合物在无菌操作下转移到灭菌的容器 中,然后用惰性气体清除容器顶部的空气并密封容器,所述惰性气 体如氮气。
表发明实施方案的详述
在本发明描述的组合物中,异环磷酰胺含量最多1100mg/ml,优 选为1mg/ml至200mg/ml,更优选为10mg/ml至100mg/ml,最 优选40mg/ml至50mg/ml。在本发明描述的组合物中,异环磷酰胺 含量的其它优选的范围为200mg/ml至500mg/ml和500mg/ml至 1000mg/ml。
在浓缩的异环磷酰胺组合物中,异环磷酰胺含量为200mg/ml至 1100mg/ml,优选200mg/ml至1000mg/ml,更优选为500mg/ml 和1000mg/ml。
2-羟丙基-β-环糊精(HPBCD)是β-环糊精的部分取代的聚(羟丙 基)醚。所述羟丙基为随机地在环糊精的羟基上取代的,取代量被 报道为取代的平均程度或每个环糊精上羟丙基的数量。或者取代量 被报道为摩尔取代(MS)或环糊精的环上每葡糖酐单元取代的平均 数量。摩尔取代对客体分子与HPBCD的结合可能具有作用。在低取 代度下,结合与未修饰的β环糊精的结合类似。由于空间位阻 (stearic hindrance),增加摩尔取代可导致结合变弱。具有摩尔 取代为0.05至约2的HPBCD在本发明中是有用的。具有摩尔取代为 0.3至约1.5的HPBCD是优选的,具有摩尔取代为0.5至约1.2的 HPBCD是更优选的。
在组合物中,HPBCD可以以异环磷酰胺与HPBCD的摩尔比率为 100∶0.1至1∶300存在,优选100∶0.25至1∶100,更优选100∶1至 1∶20。其它优选的异环磷酰胺与HPBCD的摩尔比率为100∶3.3至 1∶2.5。
在制备浓缩的异环磷酰胺组合物时,HPBCD的需要量依异环磷酰 胺的浓度而变化。最初它随着异环磷酰胺的浓度而增加。但是在异 环磷酰胺浓度较高时,由于体积的限制,HPBCD和水的含量受到限 制。因此,异环磷酰胺与HPBCD的比率应当进行正确的选择。
本发明的组合物的pH可以为3.0-9.0。本发明优选的pH为 5.0-8.0。
本发明的组合物还可包括用于pH稳定化目的的可药用添加剂、 防腐剂、等渗调节剂、抗氧化稳定剂、螯合剂、抗结晶剂和其它适 宜的添加剂。某些可药用添加剂可存在于含水溶液中,异环磷酰胺 与HPBCD将被加入到该含水溶液中,和/或某些可药用添加剂可以在 补足最终组合物的体积之前,以水溶液的形式另行被加入。
本发明的组合物可能需要适宜的缓冲剂以调整或稳定pH。用于 本发明的组合物的适宜的缓冲剂包括,但不限于含有任何通常使用 的化合物或化合物的混合物的
磷酸盐缓冲剂、
柠檬酸盐缓冲剂、甘 氨酸缓冲剂、组氨酸缓冲剂,所述化合物例如磷酸二氢钠、磷酸氢 二钠、磷酸二氢
钾、
磷酸氢二钾、
盐酸组氨酸、氢氧化钠、磷酸、 柠檬酸钠、柠檬酸、甘氨酸、
柠檬酸钾、盐酸和氢氧化钾。优选的 缓冲剂是磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合物。
在其他可药用的添加剂中,用于本发明组合物的适宜的
张力剂选 自化合物例如甘油、氯化钠、麦芽糖、甘露糖醇、
葡萄糖及它们的 混合物。
类似地,用于本发明组合物的适宜防腐剂包括但不限于甲基羟基 苯
甲酸、丙基羟基
苯甲酸、
苯酚、苄醇和苯甲酸钠。
本发明的组合物可含有适宜的螯合剂,所述螯合剂例如乙二胺四 乙酸(EDTA)&其盐和去
铁胺甲烷磺酸(Desferoximine methane sulfonate)(Desferal)。
本发明的组合物也可以含有适宜的抗氧化剂,所述抗氧化剂例如
抗坏血酸、亚
硫酸氢钠(sodium bisulfite)、偏亚硫酸氢钠、丁 基化羟基苯甲醚和丁基化羟基
甲苯。
本发明的组合物还可以含有物质例如甘油作为抗结晶剂。
所述含有异环磷酰胺和HPBCD的含水溶液通过下述方法密切接 触,所述方法例如搅拌、混合、超声、加热、均质化。肠胃外剂型 所需要的可药用添加剂例如缓冲剂、张力剂、防腐剂、螯合剂、抗 氧化剂、抗结晶剂可存在于含水的溶液中,所述溶液中加入了异环 磷酰胺和HPBCD。或者,他们可以在定容体积前以水溶液的形式分别 加入。在制备浓缩的异环磷酰胺组合物中,为了掺入更大量的异环 磷酰胺,将HPBCD溶于最少量水中,异环磷酰胺通过密切搅拌溶解。 如果需要,可药用添加剂可以以自身加入或以溶液形式加入到异环 磷酰胺-HPBCD溶液中。最后,剩余量的水被加入补足到需要的体积, 接着混合得到均质化溶液,然后进行灭菌所得到的组合物。如果需 要的话,可以在灭菌前通过
切向流过滤系统(TFF)使该组合物变为 非热源性的。
所述组合物通常通过灭菌分级过滤器进行灭菌。优选地,可使用 0.2μm的灭菌分级过滤器。
本发明的灭菌组合物可在无菌操作下装入灭菌容器如小瓶、安 瓿、玻璃容器,给容器的顶部充入惰性气体如氮气清除空气并密封 填充容器。
不受理论的约束,我们相信异环磷酰胺、HPBCD和水的三组分系 统是稳定的含水组合物。目前已经从不同方面例如溶解性、络合性 和胶囊化性经过不同的温度和时间段研究了该系统。其他添加剂对 该系统
稳定性的另外的作用也在研究之中。
众所周知,用异环磷酰胺的治疗伴有严重的副作用,例如出血性 膀胱炎,为了抵消该副作用,巯乙磺酸钠通常与异环磷酰胺注射剂 一起给药。然而,还存在其它的副作用,例如骨髓抑制、心脏心律 失常、中枢神经系统(CNS)障碍、肾毒性、血液病学和胃肠道反应, 目前市售的异环磷酰胺组合物不能解决这些副作用。
本发明的组合物的毒性采用对照市售的常规剂型(Holoxan)评 估。当采用瑞士albino小鼠研究时,本发明的组合物显示出较小的 毒副作用,例如惊厥、骨髓抑制、肝毒性。发现与常规市售的产品 相比,采用本发明的组合物处理的动物的死亡率显著降低。所研究 的组合物LD50值在
实施例中描述。
不受理论的约束,我们认为在水溶液中异环磷酰胺全部或其部分 与HPBCD腔络合。在系统给药时,药物从腔中释放进入血流。游离 的药物和药物-HPBCD络合物处于平衡,游离的异环磷酰胺的代谢转 移了平衡,导致游离药物的释放。血液中的以络合形式存在的异环 磷酰胺和最佳水平的游离药物可阻止异环磷酰胺与健康组织和器官 的相互作用,从而防止了不想要的副作用。
在本发明中,异环磷酰胺和HPBCD可以形成协同组合物,获得在 存在或不存在巯乙磺酸钠时降低的毒性,其是通过在小鼠中的LD50 值和在大鼠中的出血性膀胱炎研究表明的。具有降低的毒性的本发 明的异环磷酰胺组合物在治疗多种实体瘤和治疗Burkitts淋巴瘤中 是有效的,所述实体瘤包括那些子宫颈瘤、子宫内膜瘤、肺瘤、卵 巢瘤、睾丸瘤和胸腺瘤以及肉瘤。
异环磷酰胺在水中的
溶解度为约100mg/ml。本发明的方法使获 得含有异环磷酰胺浓度大于100mg/ml的组合物成为可能。含有 100mg/ml至1100mg/ml的浓缩溶液提供了另外的优点,所述优点例 如安全性,该安全性是由于减少了处理,从而临床医师在给药过程 中暴露于细胞毒性异环磷酰胺的机会更少并增加了无菌的保险系 数。
实施例
本发明将通过实施例进行阐述。实施例仅仅是用于阐述,并不以 任何方式限制本发明的范围。
在这些实施例中使用的异环磷酰胺符合美国药典规定的肠胃外 级别。使用的2-羟丙基-β-环糊精(HPBCD)是由Wacker Chemie制 备的,每葡糖苷单元上羟基丙基的摩尔取代为0.5至1.2。使用的设 备是常规性能的;整个过程是在受控环境的区域内进行的。在这些 实施例中,使用的水是符合“注射用水”规定的肠胃外级别。在这 些实施例中,使用的所有其它的添加剂是肠胃外级别的。
实施例I:在水中含有20%HPBCD的异环磷酰胺50mg/ml组合物 的制备
下述的组合物是通过下面给出的步骤制备的
i异环磷酰胺 10gm.
iHPBCD 40gm.
ii水 适量至200ml.
将所称重量的HPBCD溶于150ml水中。加入所称重量的异环磷 酰胺,并混合3小时。用水将体积补足200ml并混合。通过0.2μ过 滤器过滤获得的溶液,并在无菌操作下装入无菌的玻璃瓶中。在无 菌条件下用灭菌的TeflonTM包衣的
橡胶盖封闭玻璃瓶,并使用flip off封铅密封。
通过高压液相色谱(High Pressure Liquid Chromatography,HPLC)方法分析在该实施例中获得的组合物中异环 磷酰胺的含量,发现含有51.73mg/ml的异环磷酰胺。该组合物具有 的pH为6.5。
实施例II:实施例I的组合物的稳定性
实施例I获得的组合物用于2-8℃下的长期稳定性研究。24个月 结束时的稳定性数据显示在表1中。
表1:实施例I的组合物的稳定性数据 异环磷酰胺 mg/ml HPBCD% 缓冲剂 最初的%异 环磷酰胺含 量 在2-8℃下24个 月 %异环磷酰胺含 量 50 20% -- 103.46 99.12
上述数据表明了异环磷酰胺的含量的微小降低,显示出良好的稳 定性。
实施例III:实施例I的组合物的毒性研究
实施例I中获得的组合物在小鼠中进行急性毒性研究
试验详述如下:
使用的动物:任意性别的瑞士albino小鼠
动物的体重范围:20-22gm.
组数:10
每组动物数:10
环境适应性:在测试条件下在受控温度和湿度下一周
测试物质:异环磷酰胺注射剂
物质(Identity):实施例I的组合物
描述:澄清无色溶液
给药途径:静脉给药
对比物质:HoloxanTM(重构)
物质:异环磷酰胺注射液U.S.P.
批号:G220
生产日期:2001年10月
有效期:2003年9月
描述:干燥粉末,可与水重构用于注射
强度:与水重构时40mg/ml
生产商:德国Remedies Limited
给药途径:静脉给药
两种药物溶液都用5%的葡萄糖注射液适量稀释,静脉内给药。 异环磷酰胺以400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg和800 mg/kg体重的剂量给予10组不同的动物,每组包括10只动物。
动物被持续观察14天,在第7天末记录死亡率。LD50剂量,即导 致50%的动物死亡的剂量在表2中列出。
表2
实施例I的组合物和HoloxanTM的LD50剂量 组合物 LD50(mg/kg体重) 实施例I 648.04 HoloxanTM 562.16
上述数据清楚地表明实施例I的组合物比常规制剂的毒性小。
实施例IV:在磷酸缓冲液中的含有10%HPBCD的异环磷酰胺组合物的 制备
通过下面给出的步骤制备下述组合物
i异环磷酰胺 10g
iiHPBCD 20g
iii磷酸氢二钠 0.1g
iv磷酸二氢钠 0.06g
v水 适量至200ml
将所称重量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶于160ml水中。将所称 重量的HPBCD加入该缓冲液中并在搅拌下慢慢溶解。将所称重量的 异环磷酰胺在搅拌下逐渐加入缓冲的HPBCD溶液中,并混合3小时。 用水将体积补足200ml并混合。通过0.2μ过滤器过滤获得的溶液, 并在无菌操作下装入无菌的玻璃瓶中。用氮气清除瓶子顶部的空 气,在无菌条件下用灭菌的TeflonTM包衣的橡胶盖封闭玻璃瓶,并 使用flip off封铅密封。
通过高压液相色谱方法(HPLC)分析在该实施例中获得的组合物 的异环磷酰胺的含量,发现含有50.23mg/ml的异环磷酰胺。该组合 物具有的pH为7.2。
对比实施例V:在缓冲液中的异环磷酰胺50mg/ml组合物的制备
为了通过毒性研究确定HPBCD降低毒性的性质,通过下述过程 制备在缓冲液中含有异环磷酰胺的对比组合物
i异环磷酰胺 10g
ii磷酸氢二钠 0.1g
iii磷酸二氢钠 0.06g
iv水 适量至200ml
将所称重量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶于180ml水中。将所称 重量的异环磷酰胺在搅拌下逐渐加入到缓冲液中并混合3小时。用 水将体积补足200ml并混合。通过0.2μ过滤器过滤获得的溶液,并 在无菌操作下装入无菌的玻璃瓶中。用氮气清除瓶子顶部的空气, 在无菌条件下用灭菌的TeflonTM包衣的橡胶盖封闭玻璃瓶,并使用 filp off封铅密封。
通过高压液相色谱方法(HPLC)分析在该实施例中获得的组合物 中异环磷酰胺的含量,发现含有50.1mg/ml的异环磷酰胺。该组合 物具有的pH为6.5。
实施例VI:实施例IV和V的急性毒性研究
试验详述如下:
使用的动物:任意性别的瑞士albino小鼠
动物的体重范围:20-22gm.
组数:25
每组动物数:8
环境适应性:在测试条件下在受控的温度和湿度下一周
测试物质:异环磷酰胺注射剂
物质:实施例IV的组合物
描述:澄清无色溶液
给药途径:静脉给药
对比物质1.:异环磷酰胺注射液
物质:实施例V的组合物
描述:澄清无色溶液
给药途径:静脉给药
对比物质2:HoloxanTM(重构)
(HoloxanTM的详述在实施例III中显示)
泌尿系统保护物质:UromitexanTM
物质:巯乙磺酸钠注射液
批号:G168
生产日期:2001年10月
有效期:2004年9月
描述:澄清&无色溶液,用于静脉注射
强度:100mg/ml
生产商:德国Remedies Limited.
给药途径:静脉给药
实施例IV和V中获得的组合物都用于小鼠的急性毒性研究。常规 制剂HoloxanTM根据生产商的建议重构,并用作对照。选择用于研究 的异环磷酰胺的剂量为400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、 和800mg/kg体重。实施例IV、实施例V和HoloxanTM的组合物的异 环磷酰胺溶液都用5%的葡萄糖注射液本身适量稀释,并且也用20% 的异环磷酰胺剂量的巯乙磺酸钠适量稀释,静脉内给药,给予25组 不同的动物,每组包括8只动物。
动物被持续观察14天,在第7天末记录死亡率。实施例IV、实 施例V和HoloxanTM的组合物的LD50值显示在表3中。
表3:实施例IV、实施例5和HOLOVXANTM的组合物的LD50值 组合物 HPBCD浓度 缓冲剂 占异环磷酰 胺剂量%的 巯乙磺酸钠 剂量 LD50 (mg/kg体重) 实施例IV 10% 磷酸盐 -- 661.57 HoloxanTM Nil nil -- 562.16 实施例V nil 磷酸盐 -- 566.00 实施例IV 10% 磷酸盐 20 669.54 HoloxanTM nil nil 20 580.00
上述数据清楚的表明实施例IV的组合物在存在或不存在巯乙磺 酸钠时比常规制剂和缓冲液中的异环磷酰胺的的毒性低。
实施例VII:实施例IV的组合物的重复剂量毒性研究
实施例IV中获得的组合物和常规制剂HoloxanTM用于小鼠重复剂 量毒性研究以评估异环磷酰胺组合物对血液学和
生物化学参数的作 用。
试验详述如下:
使用的动物:任意性别的瑞士albino小鼠
动物的体重范围:20-22gm
组数:7
每组动物数:10
环境适应性:在测试条件下在受控温度和湿度下一周
测试物质:实施例IV的组合物
对照物质:HoloxanTM(重构)
泌尿系统保护物质:UromitexanTM
(HoloxanTM和UromitexanTM的详述已经在实施例VI中给出)
给所述动物以80mg/kg、100mg/kg和120mg/kg的每日剂量静脉 注射异环磷酰胺和巯乙磺酸钠(异环磷酰胺剂量的20%)7天。未处 理组作为对照组使用。在14天研究期间观察动物的死亡率、血液学 和生物化学改变。用实施例IV的组合物和HoloxanTM处理之前和之后 进行总WBC计数。数值显示在表4中。
表4:用实施例IV的组合物和HoloxanTM处理的动物的总WBC计数 剂量 (mg/kg体重) 总WBC(细胞/微升)±SEM 实施例IV HoloxanTM 对照 异环 磷酰 胺 巯乙 磺酸 钠 处理前 处理后 处理前 处理后 处理前 处理后 80 16 6220.00 ±631.73 3170.00 ±478.21 4870.00 ±310.94 1840.00 ±131.83 7920.00 ±539.93 10980.0 ±666.65 100 20 5760.00 ±435.44 6440.00 ±1764.2 5980.00 ±806.77 2220.00 ±237.02 120 24 5900.00 ±481.91 4420.00 ±1102.0 8150.00 ±904.61 1362.50 ±301.15
用实施例IV和HoloxanTM处理的动物表现出总WBC计数的减少。 然而,与实施例IV的组合物相比,用HoloxanTM处理的动物显示出严 重的白血球减少。这表明实施例IV的组合物具有较小的毒性。
为了研究实施例IV的组合物和HoloxanTM对肾功能的效果,分析 处理的和未处理的对照组的血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶(SGOT)水 平。处理组和未处理对照组的SGOT水平显示在表5中。
表5:用实施例IV的组合物、HoloxanTM处理的动物和未处理对照 组的平均SGOT水平。 异环磷酰胺剂 量(mg/kg体重) 巯乙磺酸钠剂 量(mg/kg体重) SGOT水平(U/L) 实施例 IV HoloxanTM 对照 80 16 129.15 158.50 136.4 100 20 147.8 299.65 120 24 164.25 309.15
按照上述数据,用实施例IV处理的动物中SGOT水平的上升略微 高于对照组,然而,在用HoloxanTM处理的动物中SGOT值的增长非常 显著。这表明降低了实施例IV的组合物的肝毒性。
实施例VIII:组合物IV的出血性膀胱炎研究
实施例IV中获得的组合物和常规制剂HoloxanTM一起用于大鼠出 血性膀胱炎研究以评价它们的膀胱毒性(BLADDERTOXICITY)
试验详述如下:
使用的动物:任意性别的Wistar大鼠
动物的体重范围:100-150gm
组数:9
每组动物数:2
环境适应性:在测试条件下在受控温度和湿度下一周
测试物质:实施例IV的组合物
对照物质:HoloxanTM(重构)
泌尿系统保护物质:UromitexanTM
(HoloxanTM和UromitexanTM的详述已经在实施例VI中给出)
研究设计
将动物分成9组,每组包括两只动物。异环磷酰胺单独和与巯乙 磺酸钠一起经过静脉途径以400mg/kg和500mg/kg体重的剂量给 药。用葡萄糖注射剂处理的组作为对照使用。
动物在注射24小时后处死。收集所有动物的膀胱,并用10%福 尔
马林溶液固定48小时。制备器官的
组织病理学切片,并经过显微 镜检查。
观察
表6描述了异环磷酰胺的两种制剂对出血性膀胱炎的评价结果
表6:出血性膀胱炎的评分 S1编号 异环磷酰 胺剂量 巯乙磺酸钠 剂量 得分 实施例IV HoloxanTM 1 400 - 1+ 2+ 2 400 - N 3+ 3 500 - 1+ 3+ 4 500 - 1+ 1+ 5 400 80 N 1+ 6 400 80 N 1+ 7 500 100 N 1+ 8 500 100 N 2+
N:正常
1+:轻度出血性膀胱炎
2+:中度出血性膀胱炎,伴有或不伴有上皮细胞异型
3+:重度出血性膀胱炎,伴有或不伴有上皮细胞异型
结果:
Holoxan:中度至重度出血性膀胱炎
Holoxan和巯乙磺酸钠:轻度至中度出血性膀胱炎
实施例IV:轻度至中度出血性膀胱炎
实施例IV和巯乙磺酸钠:没有出血性膀胱炎
结论:
上述结果最终证实实施例IV的组合物比常规的制剂HoloxanTM具 有更低的膀胱毒性。
实施例IX:实施例IV的组合物的稳定性研究
在实施例IV中获得的组合物用于2-8℃的稳定性研究。在第6和 第12个月末,通过HPLC方法分析样品。数据显示在表7中。
表7:实施例IV的组合物的稳定性数据 贮存条件 描述 %异环磷酰胺含量 最初 澄清、无色液体 50.2mg/ml 2℃-8℃-6个月 澄清、无色液体 50.9mg/ml 2℃-8℃-12个月 澄清、无色液体 49.1mg/ml
上述数据显示在2℃-8℃下异环磷酰胺含量的不明显降低,表明 超过12个月时期的良好稳定性。
包括不同浓度的异环磷酰胺和HPBCD的本发明的其他组合物显 示在表8中
表8:本发明的其它组合物 成分 实施例 X XI XII XIII XIV XV XVI 异环磷酰胺 10.0g 10.0g 10.0g 20.0g 100g 100g 200g HPBCD 40.0g 80.0g 20.0g 40.0g 40.0g 80.0v 10.0g 磷酸氢二钠 0.1g 0.1g - 0.1g - - - 磷酸二氢钠 0.06g 0.06g - 0.06g - - - 用水补足体 积 适量至 200ml 适量至 200ml 适量至 200ml 适量至 200ml 适量至 200ml 适量至 200ml 适量至 200ml 异环磷酰胺 的浓度 50mg/ml 50mg/ml 50mg/ml 100mg/ml 500mg/m 1 500mg/ ml 1000mg/ ml
根据下列的步骤制备表8列出的组合物。
实施例X
将异环磷酰胺(10g)和HPBCD(40g)、磷酸氢二钠(0.1g)和磷 酸氢钠(0.06g)置入量瓶中。慢慢加入注射用水并间歇性混合得到 200ml澄清均一的溶液。通过无菌的0.2μm过滤器过滤获得的溶液, 并在无菌操作下装入无菌的10ml玻璃瓶中。用氮气清除瓶子顶部的 空气,在无菌条件下用灭菌的TeflonTM包衣的橡胶盖封闭玻璃瓶, 并使用flip off封铅密封。
实施例XI
将异环磷酰胺(10g)和HPBCD(80g)、磷酸氢二钠(0.1g溶于 10ml水中)和磷酸氢钠(0.06g溶于10ml水中)置入量瓶中。慢慢 加入注射用水并间歇性混合得到200ml澄清均一的溶液。通过无菌 的0.2μm过滤器过滤获得的溶液,并在无菌操作下装入灭菌的10ml 玻璃瓶中。用氮气清除瓶子顶部的空气,在无菌条件下用灭菌的 TeflonTM包衣的橡胶盖封闭玻璃瓶,并使用flip off封铅密封。
实施例XII:
将HPBCD(20g)溶于40ml水中。将异环磷酰胺(10g)逐渐加 入到浓缩的HPBCD溶液中,以中等速度搅拌混合物1小时。然后用 水稀释澄清溶液至200ml。通过0.2μm过滤器过滤获得的溶液,并 在无菌操作下装入无菌的10ml玻璃瓶中。用氮气清除瓶子顶部的空 气,在无菌条件下用灭菌的TeflonTM包衣的橡胶盖封闭玻璃瓶,并 使用flip off封铅密封。
实施例XIII
按照实施例IV的制备过程使用表8中提到的成分的含量制备组 合物。
实施例XIV
将HPBCD(40g)溶于80ml水中。将异环磷酰胺(100g)逐渐加 入到浓缩的HPBCD溶液中,搅拌溶解。用水补足体积至200ml并混 合。通过0.2μm过滤器过滤获得的溶液,并在无菌操作下装入无菌 的10ml玻璃瓶中。用氮气清除瓶子顶部的空气,在无菌条件下用灭 菌的TeflonTM包衣的橡胶盖封闭玻璃瓶,并使用flip off封铅密封。 通过HPLC分析该实施例的组合物的异环磷酰胺含量,发现含有 500.3mg/ml的异环磷酰胺。
实施例XV:
按照实施例XIV的制备过程使用表8中提到的成分的含量制备组 合物。通过HPLC分析该实施例的组合物的异环磷酰胺含量,发现含 有500.28mg/ml的异环磷酰胺。
实施例XVI:
将异环磷酰胺(200g)和HPBCD(10g)置入量瓶中。慢慢加入 注射用水并间歇性混合得到200ml澄清均一的溶液。通过无菌0.2 μm过滤器过滤获得的溶液,并在无菌操作下装入无菌的10ml玻璃 瓶中。用氮气清除瓶子顶部的空气,在无菌条件下用灭菌的TeflonTM 包衣的橡胶盖封闭玻璃瓶,并使用flip off封铅密封。通过HPLC 分析该实施例的组合物中的异环磷酰胺含量,发现含有1025.5mg/ml 的异环磷酰胺。