抗金黄色葡萄球菌LUKGH(LUKAB)毒素的抗体和抗体序列
阅读：325发布：2021-07-13
专利汇可以提供抗金黄色葡萄球菌LUKGH(LUKAB)毒素的抗体和抗体序列专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 抗体 ，包括至少一个特异性结合至LukGH复合物的结合位点，该抗体包括至少一抗体重链可变区(VH)，其包括列于表1的CDR1至CDR3序列中的任何序列，或它的功能活性CDR变体。，下面是抗金黄色葡萄球菌LUKGH(LUKAB)毒素的抗体和抗体序列专利的具体信息内容。
1.一种抗体，包括至少一个特异性结合至LukGH复合物的结合位点，该抗体包括至少一个抗体重链可变区(VH)，其包括列于表1的CDR1至CDR3序列中的任何序列，或它的功能活性CDR变体。
2.根据权利要求1所述的抗体，其选自由组员i)至viii)组成的组，其中
i)
A)是一抗体，包括
a)一CDR1，包括或由SEQ ID 2或SEQ ID 15的氨基酸序列组成；及
b)一CDR2，包括或由SEQ ID 4的氨基酸序列组成；及
c)一CDR3，包括或由SEQ ID 6的氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR1，由SEQ ID 2或SEQ ID 15的氨基酸序列组成；或
b)亲本CDR2，由SEQ ID 4的氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR3，由SEQ ID 6的氨基酸序列组成；
ii)
A)是一抗体，包括
a)一CDR1，包括或由SEQ ID 26、SEQ ID 36或SEQ ID 38中的任何氨基酸序列组成；及b)一CDR2，包括或由SEQ ID 28、SEQ ID 37、SEQ ID 39或SEQ ID 40中的任何氨基酸序列组成；及
c)一CDR3，包括或由氨基酸序列SEQ ID 30组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR1，由SEQ ID 26、SEQ ID 36或SEQ ID 38中的任何氨基酸序列组成；或b)亲本CDR2，由SEQ ID 28、SEQ ID 37、SEQ ID 39或SEQ ID 40中的任何氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR3，由SEQ ID 30的氨基酸序列组成；
iii)
A)是一抗体，包括
a)一CDR1，包括或由SEQ ID 47、SEQ ID 55、SEQ ID 57、SEQ ID 59、SEQ ID 61、SEQ ID
63或SEQ ID 64中的任何氨基酸序列组成；及
b)一CDR2，包括或由SEQ ID 49、SEQ ID 56、SEQ ID 58、SEQ ID 60、SEQ ID 62、SEQ ID
65或SEQ ID 66中的任何氨基酸序列组成；及
c)一CDR3，包括或由SEQ ID 51的氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR1，由SEQ ID 47、SEQ ID 55、SEQ ID 57、SEQ ID 59、SEQ ID 61、SEQ ID 63或SEQ ID 64中的任何氨基酸序列组成；或
b)亲本CDR2，由SEQ ID 49、SEQ ID 56、SEQ ID 58、SEQ ID 60、SEQ ID 62、SEQ ID 65或SEQ ID 66中的任何氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR3，由SEQ ID 51的氨基酸序列组成；
iv)
A)是一抗体，包括
a)一CDR1，包括或由SEQ ID 71、SEQ ID 77、SEQ ID 79、SEQ ID 81、SEQ ID 83或SEQ ID 85中的任何氨基酸序列组成；及
b)一CDR2，包括或由SEQ ID 72、SEQ ID 78、SEQ ID 84或SEQ ID 4中的任何氨基酸序列组成；及
c)一CDR3，包括或由SEQ ID 73的氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR1，由SEQ ID 71、SEQ ID 77、SEQ ID 79、SEQ ID 81、SEQ ID 83或SEQ ID 85中的任何氨基酸序列组成；或
b)亲本CDR2，由SEQ ID 72、SEQ ID 78、SEQ ID 84或SEQ ID 4中的任何氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR3，由SEQ ID 73的氨基酸序列组成；
v)
A)是一抗体，包括
a)一CDR1，包括或由SEQ ID 87、SEQ ID 97、SEQ ID 99或SEQ ID 101中的任何氨基酸序列组成；及
b)一CDR2，包括或由SEQ ID 88、SEQ ID 98、SEQ ID 100或SEQ ID 102中的任何氨基酸序列组成；及
c)一CDR3，包括或由SEQ ID 89的氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下结构的功能活性CDR变体a)亲本CDR1，由SEQ ID 87、SEQ ID 97、SEQ ID 99或SEQ ID 101中的任何氨基酸序列组成；或
b)亲本CDR2，由SEQ ID 88、SEQ ID 98、SEQ ID 100或SEQ ID 102中的任何氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR3，由SEQ ID 89的氨基酸序列组成；
vi)
A)是一抗体，包括
a)一CDR1，包括或由SEQ ID 104、SEQ ID 110、SEQ ID 112、SEQ ID 38、SEQ ID 114、SEQ ID 119或SEQ ID 120中的任何氨基酸序列组成；及
b)一CDR2，包括或由SEQ ID 105、SEQ ID 109、SEQ ID 111、SEQ ID 113、SEQ ID 102、SEQ ID 115或SEQ ID 121中的任何氨基酸序列组成；及
c)一CDR3，包括或由SEQ ID 106的氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR1，由SEQ ID 104、SEQ ID 110、SEQ ID 112、SEQ ID 38、SEQ ID 114、SEQ ID
119或SEQ ID 120的氨基酸序列组成；或
b)亲本CDR2，由SEQ ID 105、SEQ ID 109、SEQ ID 111、SEQ ID 113、SEQ ID 102、SEQ ID 115或SEQ ID 121的氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR3，由SEQ ID 106的氨基酸序列组成；
vii)
A)是一抗体，包括
a)一CDR1，包括或由SEQ ID 125的氨基酸序列组成；及
b)一CDR2，包括或由SEQ ID 126的氨基酸序列组成；及
c)一CDR3，包括或由SEQ ID 127的氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR1，由SEQ ID 125的氨基酸序列组成；或
b)亲本CDR2，由SEQ ID 126的氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR3，由SEQ ID 127的氨基酸序列组成；
及viii)
A)是一抗体，包括
a)一CDR1，包括或由SEQ ID 134的氨基酸序列组成；及
b)一CDR2，包括或由SEQ ID 135的氨基酸序列组成；及
c)一CDR3，包括或由SEQ ID 137的氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR1，由SEQ ID 134的氨基酸序列组成；或
b)亲本CDR2，由SEQ ID 135的氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR3，由SEQ ID 137的氨基酸序列组成；
其中任何功能活性CDR变体包括至少一个位于亲本CDR序列的点突变，和包括或由与亲本CDR序列具有至少60％的序列一致性的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求2所述的抗体，其是组员iv)的抗体或它的功能活性变体，其中
a)在VH CDR1的7位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是E、F、H、I、K、L、M、R、V、W或Y中的任何一个，及更优选的是E、F、M、W或Y中的任何一个；
b)在VH CDR2的1位，氨基酸残基选自N、A、D、E、F、H、L、S、T、V和Y，优选是F、H或Y中的任何一个；
c)在VH CDR2的3位，氨基酸残基选自Y、H、T和W；
d)在VH CDR2的5位，氨基酸残基选自S、A、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是N、R或W中的任何一个，及更优选的是N或W；
e)在VH CDR2的7位，氨基酸残基选自S、D、F、H、K、L、M、N、R和W；
f)在VH CDR2的9位，氨基酸残基选自Y、D、E、F、N、S和W，优选是D或H，及更优选的是H；
g)在VH CDR3的4位，氨基酸残基选自R、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V和W，优选是D或H；
h)在VH CDR3的5位，氨基酸残基选自G、A、F和Y；
i)在VH CDR3的6位，氨基酸残基选自M、E、F、H和Q，优选是F或H；和/或
j)在VH CDR3的7位，氨基酸残基选自H、A、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、W和Y，优选是E、K、Q、R、W或Y中的任何一个，及更优选的是W或Y。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体，其中，功能活性CDR变体包括以下的至少一个
a)1、2或3个点突变，该点突变在亲本CDR序列上；或
b)1或2个点突变，该点突变在亲本CDR序列的4个C-端或4个N-端或4个中心氨基酸位置上的任一处。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其选自由以下组成的组：
a)一抗体，包括
a.SEQ ID 38的CDR1序列；及
b.SEQ ID 39的CDR2序列；及
c.SEQ ID 30的CDR3序列；
b)一抗体，包括
a.SEQ ID 47的CDR1序列；及
b.SEQ ID 49的CDR2序列；及
c.SEQ ID 51的CDR3序列；
c)一抗体，包括
a.SEQ ID 83的CDR1序列；及
b.SEQ ID 84的CDR2序列；及
c.SEQ ID 73的CDR3序列；
d)一抗体，包括
a.SEQ ID 104的CDR1序列；及
b.SEQ ID 105的CDR2序列；及
c.SEQ ID 106的CDR3序列；
和
e)一抗体，包括
a.SEQ ID 114的CDR1序列；及
b.SEQ ID 115的CDR2序列；及
c.SEQ ID 106的CDR3序列。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，包括
a)一VH氨基酸序列，选自如图2中所描述的任何VH序列；
b)一抗体重链(HC)氨基酸序列，选自由SEQ ID 147、SEQ ID 149、SEQ ID 151、SEQ ID
153、SEQ ID 155、SEQ ID 157、SEQ ID 159、SEQ ID 161、SEQ ID 163、SEQ ID 165、SEQ ID
167、SEQ ID 169和SEQ ID 171组成的组；
c)一抗体重链(HC)氨基酸序列，选自由SEQ ID 147、SEQ ID 149、SEQ ID 151、SEQ ID
153、SEQ ID 155、SEQ ID 157、SEQ ID 159、SEQ ID 161、SEQ ID 163、SEQ ID 165、SEQ ID
167、SEQ ID 169和SEQ ID 171组成的组，进一步包括C-端氨基酸的删除和/或Q1E点突变，如果VH序列的第一氨基酸是Q。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，该抗体进一步包括抗体轻链可变区(VL)，其包括列于表1中的CDR4至CDR6序列中的任何一个序列或它的功能活性CDR变体。
8.根据权利要求7所述的抗体，其选自由组员i)至viii)组成的组，其中
i)
A)是一抗体，包括
a)一CDR4，包括或由SEQ ID 9或SEQ ID 19的氨基酸序列组成；及
b)一CDR5，包括或由SEQ ID 11、SEQ ID 16或SEQ ID 21中的任何氨基酸序列组成；及c)一CDR6，包括或由SEQ ID 13、SEQ ID 17、SEQ ID 23或SEQ ID 24中的任何氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR4，由SEQ ID 9或SEQ ID 19的氨基酸序列组成；或
b)亲本CDR5，由SEQ ID 11、SEQ ID 16或SEQ ID 21中的任何氨基酸序列组成；或c)亲本CDR6，由SEQ ID 13、SEQ ID 17、SEQ ID 23或SEQ ID 24中的任何氨基酸序列组成；
ii)
A)是一抗体，包括
a)一CDR4，包括或由SEQ ID 32的氨基酸序列组成；及
b)一CDR5，包括或由SEQ ID 33或SEQ ID 41的氨基酸序列组成；及
c)一CDR6，包括或由SEQ ID 35、SEQ ID 42、SEQ ID 43或SEQ ID 45中的任何氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR4，由SEQ ID 32的氨基酸序列组成；或
b)亲本CDR5，由SEQ ID 33或SEQ ID 41的氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR6，由SEQ ID 35、SEQ ID 42、SEQ ID 43或SEQ ID 45中的任何氨基酸序列组成；
iii)
A)是一抗体，包括
a)一CDR4，包括或由SEQ ID 53、SEQ ID 67或SEQ ID 19中的任何氨基酸序列组成；及b)一CDR5，包括或由SEQ ID 21的氨基酸序列组成；及
c)一CDR6，包括或由SEQ ID 54、SEQ ID 68、SEQ ID 69或SEQ ID 70中的任何氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR4，由SEQ ID 53、SEQ ID 67或SEQ ID 19中的任何氨基酸序列组成；或b)亲本CDR5，由SEQ ID 21的氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR6，由SEQ ID 54、SEQ ID 68、SEQ ID 69和/或SEQ ID 70中的任何氨基酸序列组成；
iv)
A)是一抗体，包括
a)一CDR4，包括或由SEQ ID 75或SEQ ID 32的氨基酸序列组成；及
b)一CDR5，包括或由SEQ ID 41的氨基酸序列组成；及
c)一CDR6，包括或由SEQ ID 76或SEQ ID 86的氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR4，由SEQ ID 75或SEQ ID 32的氨基酸序列组成；或
b)亲本CDR5，由SEQ ID 41的氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR6，由SEQ ID 76或SEQ ID 86的氨基酸序列组成；
v)
A)是一抗体，包括
a)一CDR4，包括或由SEQ ID 92的氨基酸序列组成；及
b)一CDR5，包括或由SEQ ID 94的任何氨基酸序列组成；及
c)一CDR6，包括或由SEQ ID 96或SEQ ID 103的氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR4，由SEQ ID 92的氨基酸序列组成；或
b)亲本CDR5，由SEQ ID 94的氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR6，由SEQ ID 96或SEQ ID 103的氨基酸序列组成；
vi)
A)是一抗体，包括
a)一CDR4，包括或由SEQ ID 92或SEQ ID 116的氨基酸序列组成；及
b)一CDR5，包括或由SEQ ID 94或SEQ ID 117的氨基酸序列组成；及
c)一CDR6，包括或由SEQ ID 108、SEQ ID 118或SEQ ID 123中的任何氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR4，由SEQ ID 92或SEQ ID 116的氨基酸序列组成；或
b)亲本CDR5，由SEQ ID 94或SEQ ID 117的氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR6，由SEQ ID 108、SEQ ID 118或SEQ ID 123中的任何氨基酸序列组成；
vii)
A)是一抗体，包括
a)一CDR4，包括或由SEQ ID 32的氨基酸序列组成；及
b)一CDR5，包括或由SEQ ID 41的氨基酸序列组成；及
c)一CDR6，包括或由SEQ ID 129、SEQ ID 130、SEQ ID 131或SEQ ID 132中的任何氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR4，由SEQ ID 32的氨基酸序列组成；或
b)亲本CDR5，由SEQ ID 41的氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR6，由SEQ ID 129、SEQ ID 130、SEQ ID 131或SEQ ID 132中的任何氨基酸序列组成；
及viii)
A)是一抗体，包括
a)一CDR4，包括或由SEQ ID 92或SEQ ID 116的氨基酸序列组成；及
b)一CDR5，包括或由SEQ ID 94的氨基酸序列组成；及
c)一CDR6，包括或由SEQ ID 140、SEQ ID 96、SEQ ID 142或SEQ ID 143中的任何氨基酸序列组成；
或
B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体a)亲本CDR4，由SEQ ID 92或SEQ ID 116的氨基酸序列组成；或
b)亲本CDR5，由SEQ ID 94的氨基酸序列组成；或
c)亲本CDR6，由SEQ ID 140、SEQ ID 96、SEQ ID 142或SEQ ID 143中的任何氨基酸序列组成；
其中任何功能活性CDR变体包括至少一个位于亲本CDR序列的点突变，和包括或由与亲本CDR序列具有至少60％的序列一致性的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求8所述的抗体，抗体是组员iv)的抗体或它的功能活性变体，其中
a)在VL CDR4的7位，氨基酸残基选自N、A、D、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、W和Y，优选是F、L、W或Y中的任何一个，及更优选的是L或W；
b)在VL CDR4的8位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是I或W；
c)在VL CDR4的9位，氨基酸残基选自Y、F、R和W，优选是R或W；
d)在VL CDR5的1位，氨基酸残基选自A、G、S、W和Y，优选是G；
e)在VL CDR6的4位，氨基酸残基选自F、H、M、W和Y；
f)在VL CDR6的5位，氨基酸残基选自D、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；和/或
g)在VL CDR6的8位，氨基酸残基选自F、H、R和W。
10.根据权利要求7或8所述的抗体，抗体包括一VL氨基酸序列或抗体轻链(LC)氨基酸序列，所述VL氨基酸序列选自如图2描述的任何VL序列，所述抗体轻链(LC)氨基酸序列选自由SEQ ID 148、SEQ ID 150、SEQ ID 152、SEQ ID 154、SEQ ID 156、SEQ ID 158、SEQ ID
160、SEQ ID 162、SEQ ID 164、SEQ ID 166、SEQ ID 168、SEQ ID 170和SEQ ID 172组成的-8
组，或任何上述序列的功能活性CDR变体，抗体结合LukGH复合物的亲和力的Kd小于10 M，优选小于10-9M。
11.根据权利要求10所述的抗体，其中，抗体或它的功能活性变体包括选自如图2的组4描述的任何VL序列的一VL氨基酸序列，或选自由SEQ ID 158、SEQ ID 160、SEQ ID 162组成的组的抗体轻链(LC)氨基酸序列，其中
a)在VL CDR4的7位，氨基酸残基选自N、A、D、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、W和Y，优选是F、L、W或Y中的任何一个，及更优选的是L或W；
b)在VL CDR4的8位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是I或W；
c)在VL CDR4的9位，氨基酸残基选自Y、F、R和W，优选是R或W；
d)在VL CDR5的1位，氨基酸残基选自A、G、S、W和Y，优选是G；
e)在VL CDR6的4位，氨基酸残基选自F、H、M、W和Y；
f)在VL CDR6的5位，氨基酸残基选自D、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；和/或
g)在VL CDR6的8位，氨基酸残基选自F、H、R和W。
12.根据权利要求1-11中任何一项所述的抗体，抗体选自由以下组成的组：
a)一抗体，其包括
a.SEQ ID 38的CDR1序列；和
b.SEQ ID 39的CDR2序列；和
c.SEQ ID 30的CDR3序列；和
d.SEQ ID 32的CDR4序列；和
e.SEQ ID 33的CDR5序列；和
f.SEQ ID 35的CDR6序列；
b)一抗体，其包括
a.SEQ ID 47的CDR1序列；和
b.SEQ ID 49的CDR2序列；和
c.SEQ ID 51的CDR3序列；和
d.SEQ ID 53的CDR4序列；和
e.SEQ ID 21的CDR5序列；和
f.SEQ ID 54的CDR6序列；
c)一抗体，其包括
a.SEQ ID 83的CDR1序列；和
b.SEQ ID 84的CDR2序列；和
c.SEQ ID 73的CDR3序列；和
d.SEQ ID 75的CDR4序列；和
e.SEQ ID 41的CDR5序列；和
f.SEQ ID 76的CDR6序列；
d)一抗体，包括
a.SEQ ID 104的CDR1序列；和
b.SEQ ID 105的CDR2序列；和
c.SEQ ID 106的CDR3序列；和
d.SEQ ID 92的CDR4序列；和
e.SEQ ID 94的CDR5序列；和
f.SEQ ID 108的CDR6序列；
和
e)一抗体，其包括
a.SEQ ID 114的CDR1序列；和
b.SEQ ID 115的CDR2序列；和
c.SEQ ID 106的CDR3序列；和
d.SEQ ID 116的CDR4序列；和
e.SEQ ID 117的CDR5序列；和
f.SEQ ID 118的CDR6序列；
或任何上述抗体的功能活性CDR变体，其结合LukGH复合物的亲和力的Kd小于10-8M，优-9
选小于10 M。
13.根据权利要求12所述的抗体，抗体是组员c)的抗体或它的功能活性变体，其中：
a)在VH CDR1的7位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是E、F、H、I、K、L、M、R、V、W或Y中的任何一个，及更优选的是E、F、M、W或Y中的任何一个；
b)在VH CDR2的1位，氨基酸残基选自N、A、D、E、F、H、L、S、T、V和Y，优选是F、H或Y中的任何一个；
c)在VH CDR2的3位，氨基酸残基选自Y、H、T和W；
d)在VH CDR2的5位，氨基酸残基选自S、A、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是N、R或W中的任何一个，及更优选的是N或W；
e)在VH CDR2的7位，氨基酸残基选自S、D、F、H、K、L、M、N、R和W；
f)在VH CDR2的9位，氨基酸残基选自Y、D、E、F、N、S和W，优选是D或H，及更优选的是H；
g)在VH CDR3的4位，氨基酸残基选自R、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V和W，优选是D或H；
h)在VH CDR3的5位，氨基酸残基选自G、A、F和Y；
i)在VH CDR3的6位，氨基酸残基选自M、E、F、H和Q，优选是F或H；
j)在VH CDR3的7位，氨基酸残基选自H、A、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、W和Y，优选是E、K、Q、R、W或Y中的任何一个，及更优选是W或Y；
k)在VL CDR4的7位，氨基酸残基选自由N、A、D、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、W和Y组成的组，优选是F、L、W或Y中的任何一个，及更优选是L或W；
l)在VL CDR4的8位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是I或W；
m)在VL CDR4的9位，氨基酸残基选自Y、F、R和W，优选是R或W；
n)在VL CDR5的1位，氨基酸残基选自A、G、S、W和Y，优选是G；
o)在VL CDR6的4位，氨基酸残基选自F、H、M、W和Y；
p)在VL CDR6的5位，氨基酸残基选自D、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；和/或
q)在VL CDR6的8位，氨基酸残基选自F、H、R和W。
14.根据权利要求12或13所述的抗体，抗体包括一框架，所述框架包括列于表1中的VH和/或VL的任何框架域，其可选地包括一Q1E点突变，如果VH框架域(VH FR1)的第一个氨基酸是Q。
15.根据权利要求12-14任一项所述的抗体，抗体包括如图2所描述的HC氨基酸序列。
16.根据权利要求1-11任一项所述的抗体，抗体选自由以下组成的组：
a)一抗体，其包括
a.SEQ ID 147的HC氨基酸序列；和
b.SEQ ID 148的LC氨基酸序列；
b)一抗体，其包括
a.SEQ ID 149的HC氨基酸序列；和
b.SEQ ID 150的LC氨基酸序列；
c)一抗体，包括
a.SEQ ID 151的HC氨基酸序列；和
b.SEQ ID 152的LC氨基酸序列；
d)一抗体，包括
a.SEQ ID 153的HC氨基酸序列；和
b.SEQ ID 154的LC氨基酸序列；
e)一抗体，包括
a.SEQ ID 155的HC氨基酸序列；和
b.SEQ ID 156的LC氨基酸序列；
f)一抗体，包括
a.SEQ ID 157的HC氨基酸序列；和
b.SEQ ID 158的LC氨基酸序列；
g)一抗体，其包括
a.SEQ ID 159的HC氨基酸序列；和
b.SEQ ID 160的LC氨基酸序列；
h)一抗体，其包括
a.SEQ ID 161的HC氨基酸序列；和
b.SEQ ID 162的LC氨基酸序列；
i)一抗体，其包括
a.SEQ ID 163的HC氨基酸序列；和
b.SEQ ID 164的LC氨基酸序列；
j)一抗体，其包括
a.SEQ ID 165的HC氨基酸序列；和
b.SEQ ID 166的LC氨基酸序列；
k)一抗体，其包括
a.SEQ ID 167的HC氨基酸序列；和
b.SEQ ID 168的LC氨基酸序列；
l)一抗体，其包括
a.SEQ ID 169的HC氨基酸序列；和
b.SEQ ID 170的LC氨基酸序列；
及
m)一抗体，其包括
a.SEQ ID 171的HC氨基酸序列；和
b.SEQ ID 172的LC氨基酸序列；
或任何上述抗体的功能活性CDR变体，其结合LukGH复合物的亲和力的Kd小于10-8M，优选小于10-9M。
17.根据权利要求16所述的抗体，抗体是组员f)、g)和h)中的任一抗体或它的功能活性变体，其中：
a)在VH CDR1的7位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是E、F、H、I、K、L、M、R、V、W或Y中的任何一个，及更优选的是E、F、M、W或Y中的任何一个；
b)在VH CDR2的1位，氨基酸残基选自N、A、D、E、F、H、L、S、T、V和Y，优选是F、H或Y中的任何一个；
c)在VH CDR2的3位，氨基酸残基选自Y、H、T和W；
d)在VH CDR2的5位，氨基酸残基选自S、A、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是N、R或W中的任何一个，及更优选的是N或W；
e)在VH CDR2的7位，氨基酸残基选自S、D、F、H、K、L、M、N、R和W；
f)在VH CDR2的9位，氨基酸残基选自Y、D、E、F、N、S和W，优选是D或H，及更优选的是H；
g)在VH CDR3的4位，氨基酸残基选自R、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V和W，优选是D或H；
h)在VH CDR3的5位，氨基酸残基选自G、A、F和Y；
i)在VH CDR3的6位，氨基酸残基选自M、E、F、H和Q，优选是F或H；
j)在VH CDR3的7位，氨基酸残基选自H、A、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、W和Y，优选是E、K、Q、R、W或Y中的任何一个，及更优选是W或Y；
k)在VL CDR4的7位，氨基酸残基选自由N、A、D、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、W和Y组成的组，优选是F、L、W或Y中的任何一个，及更优选是L或W；
l)在VL CDR4的8位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是I或W；
m)在VL CDR4的9位，氨基酸残基选自Y、F、R和W，优选是R或W；
n)在VL CDR5的1位，氨基酸残基选自A、G、S、W和Y，优选是G；
o)在VL CDR6的4位，氨基酸残基选自F、H、M、W和Y；
p)在VL CDR6的5位，氨基酸残基选自D、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；和/或
q)在VL CDR6的8位，氨基酸残基选自F、H、R和W。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的抗体，抗体具有结合LukGH复合物的亲和力的Kd小于10-8M，优选小于10-9M。
19.根据权利要求18所述的抗体，抗体具有结合单独的LukG和/或LukH抗原的亲和力，该亲和力小于结合LukGH复合物的亲和力，优选具有的Kd大于10-7M，优选大于10-6M。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的抗体，该抗体是全长的单克隆抗体、其抗体片段或融合蛋白，所述抗体片段包括至少一个含有结合位点的抗体域，所述融合蛋白包括至少一个含有结合位点的抗体域。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的抗体，该抗体用于治疗具有患金黄色葡萄球菌感染风险或患有金黄色葡萄球菌感染的主体，包括给予主体施用一治疗有效量的该抗体以限制在主体中的感染、以减轻由所述感染引起的病状，或以抑制金黄色葡萄球菌的发病，例如，肺炎、败血症、菌血症、伤口感染、脓肿、手术部位感染、眼内炎、疖病、痈病、心内膜炎、腹膜炎、骨髓炎或关节感染。
22.一种包括权利要求1-20中任一项所述的抗体的药物制剂，优选包括胃肠外的或黏膜的剂型，可选地，包含药学上可接受的载体或赋形剂。
23.根据权利要求1-20中任一项所述的抗体，用于诊断用途，以检测任何的金黄色葡萄球菌感染，包括产生高毒的MRSA感染，例如，坏死性肺炎，以及疖病和痈病中的毒素产生。
24.根据权利要求1-20中任一项所述的抗体的诊断制剂，可选地包含带有标签的抗体和/或带有标签的其它诊断试剂。
25.编码权利要求1-20中任一项所述的抗体的分离的核酸。
26.根据权利要求1-20中任一项所述的抗体的分离的互补位，或包括所述互补位的结合分子。
27.一种由权利要求1-20中任一项所述的抗体识别的分离的构象表位，其特征在于a)金黄色葡萄球菌的LukGH复合物的三维结构，包括LukG的边缘域和接触氨基酸残基的坐标结构，所述的接触氨基酸残基是Asn71、Tyr73、Trp74、Asn206、Leu207、Trp208、Lys210、Asp211、Trp262和Phe267；或
b)a)的同系物的三维结构，其中所述同系物包括一结合位点，所述结合位点与接触氨基酸残基的骨架原子的均方根偏差在0.00A和2.00A之间。
28.根据权利要求27所述的表位，所述表位由结合分子结合。
29.一种特异性识别权利要求27或28所述的表位的结合分子，优选地选自由蛋白质、肽、模拟肽、核酸、碳水化合物、脂质、寡肽、适配体和小分子化合物组成的组，优选是抗体、它的抗体片段，该抗体片段包括至少一个含有结合位点的抗体域，其中，所述结合分子是识别金黄色葡萄球菌的LukGH复合物的特异性结合物。
30.一种鉴定结合物的筛选方法或试验，所述结合物特异性识别权利要求27或28所述的表位，包括以下步骤：
-将候选化合物与权利要求27所定义的的三维结构接触；及
-评估候选化合物与三维结构间的结合，其中候选化合物与三维结构之间的结合鉴定候选化合物为识别金黄色葡萄球菌的LukGH复合物的特异性结合物。
31.一种免疫原，包括：
a)权利要求27或28所述的表位，及
b)载体，优选是药学上可接受的载体，优选包含缓冲物质和/或佐剂物质。
32.根据权利要求31所述的免疫原，其以疫苗制剂提供，优选用于肠胃外用途。
33.根据权利要求31或32所述的免疫原，用于治疗主体，通过施用有效量的所述免疫原以防止主体受金黄色葡萄球菌感染、防止所述感染引发的病症，或抑制金黄色葡萄球菌肺炎发病。
34.根据权利要求33使用的免疫原，用于引发保护性免疫应答。
抗金黄色葡萄球菌LUKGH(LUKAB)毒素的抗体和抗体序列
背景技术
[0002] 金黄色葡萄球菌(S.aureus)是最重要的人类病原体之一，引发人类从无症状定植和轻度皮肤感染到严重的深度组织感染、肺炎、血液感染和败血症(sepsis)等范围广泛的各种感染。这种病原体利用多种致病机制引发疾病和干扰宿主防御。它最有效的毒力因子之一是专门杀死白细胞特别是吞噬细胞的杀白细胞素。LukGH(也称为LukAB)是最近被鉴定出来的杀白细胞素，其能够溶解多形核细胞(PMN)、单核细胞和树突状细胞(Dumont et al,2011,Feb；79(3):814-25；Ventura et al.PLoS One.2010Jul 16；5(7):e11634)，及还可以激活它们，产生促炎细胞因子。
[0003] LukGH是一种类似于HlgAB、HlgCB、LukED和LukSF(PVL)的双组分溶细胞素。LukH(S-组分)和LukG(F-组分)分别与上文提到的双组分杀白细胞素的S组分和F组分具有大约30％和40％的氨基酸同源性。
[0004] LukGH是最多变的双组分金黄色葡萄球菌毒素。虽然LukSF、LukED和HlgABC在不同的金黄色葡萄球菌菌株中高度保守，但是，LukGH具有高达14％的氨基酸变化。这种氨基酸差异水平几乎接近在两种不同毒素(如HlgC相对于LukS或LukS相对于HlgAC或LukE)之间观察到的水平(～16％差异性)。关于LukGH的作用的数据很少，而且数据都是采用彼此几乎相同的来自Newman菌株和LAC菌株(USA300)的两个序列得到的。人们不知道其它变体对人体细胞是否有活性，特别是来自两种金黄色葡萄球菌基因组的两个序列，即MRSA252(EMR SA16)和MSHR1132(“银”金黄色葡萄球菌)，它们被认为与USA300和其它金黄色葡萄球菌克隆复合物是最不相同。
[0005] 根据金黄色葡萄球菌培养上清液的PMN溶解活性，LukGH似乎是人类天生细胞最有效的白细胞毒素之一(Dumont et al,Infect Immun.2013May；81(5):1830-41；Malachowa et al.J Infect Dis.2012Oct；206(8):1185-93)。因此，有理由认为，在金黄色葡萄球菌疾病期间，通过中和抗体抑制LukGH的毒素作用具有积极的效果，并且通过减少迁移到感染部位的吞噬细胞支持宿主防御。我们的目的是利用能中和LukGH毒素的单克隆抗体，开发出预防和治疗人类金黄色葡萄球菌感染的人类治疗剂。
[0006] 根据文献，双组分杀白细胞素中的S组分识别细胞表面受体，及这种相互作用诱导构象变化，导致F组分结合和LukSF和HlgAB的八聚体跨膜孔隙结构的形成(Colin,Infect Immun,1994:3184；Meunier,Biochim Biophys Acta,1997:275)。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种抗金黄色葡萄球菌细胞毒素LukGH(也称为LukAB)的抗体，这种抗体与这种毒素的不同变体可交叉反应，并提供交叉中和效力。特别地，本发明目的指的是，与特异性结合单独的LukG或LukH抗原但结合LukGH复合物程度较低的抗体相比，对体外的LukGH具有高的中和效力和改进的保护的抗体。
[0008] 本发明的目的通过本发明的主题达到。
[0009] 本发明提供类了一种包括至少一个结合位点(特别是结合至LukGH复合物)的抗体，该抗体包括至少一抗体重链可变区(VH)，其包括列于表1的任何CDR1至CDR3序列，或它们的功能活性CDR变体。
[0010] 具体地，抗体是单克隆抗体。
[0011] 具体地，抗体选自由组员i)至viii)组成的组，其中
[0012] i)
[0013] A)是一抗体，其包括
[0014] a)一CDR1，包括或由SEQ ID 2或SEQ ID 15的氨基酸序列组成；及
[0015] b)一CDR2，包括或由SEQ ID 4的氨基酸序列组成；及
[0016] c)一CDR3，包括或由SEQ ID 6的氨基酸序列组成；
[0017] 或
[0018] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0019] a)亲本CDR1，由SEQ ID 2或SEQ ID 15的氨基酸序列组成；和/或
[0020] b)亲本CDR2，由SEQ ID 4的氨基酸序列组成；和/或
[0021] c)亲本CDR3，由SEQ ID 6的氨基酸序列组成；
[0022] ii)
[0023] A)是一抗体，包括
[0024] a)一CDR1，包括或由SEQ ID 26、SEQ ID 36或SEQ ID 38中的任何氨基酸序列组成；及
[0025] b)一CDR2，包括或由SEQ ID 28、SEQ ID 37、SEQ ID 39或SEQ ID 40中的任何氨基酸序列组成；及
[0026] c)一CDR3，包括或由氨基酸序列SEQ ID 30组成；
[0027] 或
[0028] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0029] a)亲本CDR1，由SEQ ID 26、SEQ ID 36或SEQ ID 38中的任何氨基酸序列组成；和/或
[0030] b)亲本CDR2，由SEQ ID 28、SEQ ID 37、SEQ ID 39或SEQ ID 40种的任何氨基酸序列组成；和/或
[0031] c)亲本CDR3，由SEQ ID 30的氨基酸序列组成；
[0032] iii)
[0033] A)是一抗体，包括
[0034] a)一CDR1，包括或由SEQ ID 47、SEQ ID 55、SEQ ID 57、SEQ ID 59、SEQ ID 61、SEQ ID 63或SEQ ID 64中的任何氨基酸序列组成；及
[0035] b)一CDR2，包括或由SEQ ID 49、SEQ ID 56、SEQ ID 58、SEQ ID 60、SEQ ID 62、SEQ ID 65或SEQ ID 66中的任何氨基酸序列组成；及
[0036] c)一CDR3，包括或由SEQ ID 51的氨基酸序列组成；
[0037] 或
[0038] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0039] a)亲本CDR1，由SEQ ID 47、SEQ ID 55、SEQ ID 57、SEQ ID 59、SEQ ID 61、SEQ ID 63或SEQ ID 64中的任何氨基酸序列组成；和/或
[0040] b)亲本CDR2，由SEQ ID 49、SEQ ID 56、SEQ ID 58、SEQ ID 60、SEQ ID 62、SEQ ID 65或SEQ ID 66中的任何氨基酸序列组成；和/或
[0041] c)亲本CDR3，由SEQ ID 51的氨基酸序列组成；
[0042] iv)
[0043] A)是一抗体，包括
[0044] a)一CDR1，包括或由SEQ ID 71、SEQ ID 77、SEQ ID 79、SEQ ID 81、SEQ ID 83或SEQ ID 85中的任何氨基酸序列组成；及
[0045] b)一CDR2，包括或由SEQ ID 72、SEQ ID 78、SEQ ID 84或SEQ ID 4中的任何氨基酸序列组成；及
[0046] c)一CDR3，包括或由SEQ ID 73的氨基酸序列组成；
[0047] 或
[0048] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0049] a)亲本CDR1，由SEQ ID 71、SEQ ID 77、SEQ ID 79、SEQ ID 81、SEQ ID 83或SEQ ID 85中的任何氨基酸序列组成；和/或
[0050] b)亲本CDR2，由SEQ ID 72、SEQ ID 78、SEQ ID 84或SEQ ID 4中的任何氨基酸序列组成；和/或
[0051] c)亲本CDR3，由SEQ ID 73的氨基酸序列组成；
[0052] v)
[0053] A)是一抗体，包括
[0054] a)一CDR1，包括或由SEQ ID 87、SEQ ID 97、SEQ ID 99或SEQ ID 101中的任何氨基酸序列组成；及
[0055] b)一CDR2，包括或由SEQ ID 88、SEQ ID 98、SEQ ID 100或SEQ ID 102中的任何氨基酸序列组成；及
[0056] c)一CDR3，包括或由SEQ ID 89的氨基酸序列组成；
[0057] 或
[0058] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0059] a)亲本CDR1，由SEQ ID 87、SEQ ID 97、SEQ ID 99或SEQ ID 101中的任何氨基酸序列组成；和/或
[0060] b)亲本CDR2，由SEQ ID 88、SEQ ID 98、SEQ ID 100或SEQ ID 102中的任何氨基酸序列组成；和/或
[0061] c)亲本CDR3，由SEQ ID 89的氨基酸序列组成；
[0062] vi)
[0063] A)是一抗体，包括
[0064] a)一CDR1，包括或由SEQ ID 104、SEQ ID 110、SEQ ID 112、SEQ ID 38、SEQ ID 114、SEQ ID 119或SEQ ID 120中的任何氨基酸序列组成；及
[0065] b)一CDR2，包括或由SEQ ID 105、SEQ ID 109、SEQ ID 111、SEQ ID 113、SEQ ID 102、SEQ ID 115或SEQ ID 121中的任何氨基酸序列组成；及
[0066] c)一CDR3，包括或由SEQ ID 106的氨基酸序列组成；
[0067] 或
[0068] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0069] a)亲本CDR1，由SEQ ID 104、SEQ ID 110、SEQ ID 112、SEQ ID 38、SEQ ID 114、SEQ ID 119或SEQ ID 120的氨基酸序列组成；和/或
[0070] b)亲本CDR2，由SEQ ID 105、SEQ ID 109、SEQ ID 111、SEQ ID 113、SEQ ID 102、SEQ ID 115或SEQ ID 121的氨基酸序列组成；和/或
[0071] c)亲本CDR3，由SEQ ID 106的氨基酸序列组成；
[0072] vii)
[0073] A)是一抗体，包括
[0074] a)一CDR1，包括或由SEQ ID 125的氨基酸序列组成；及
[0075] b)一CDR2，包括或由SEQ ID 126的氨基酸序列组成；及
[0076] c)一CDR3，包括或由SEQ ID 127的氨基酸序列组成；
[0077] 或
[0078] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0079] a)亲本CDR1，由SEQ ID 125的氨基酸序列组成；和/或
[0080] b)亲本CDR2，由SEQ ID 126的氨基酸序列组成；和/或
[0081] c)亲本CDR3，由SEQ ID 127的氨基酸序列组成；
[0082] 及viii)
[0083] A)是一抗体，包括
[0084] a)一CDR1，包括或由SEQ ID 134的氨基酸序列组成；及
[0085] b)一CDR2，包括或由SEQ ID 135的氨基酸序列组成；及
[0086] c)一CDR3，包括或由SEQ ID 137的氨基酸序列组成；
[0087] 或
[0088] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0089] a)亲本CDR1，由SEQ ID 134的氨基酸序列组成；和/或
[0090] b)亲本CDR2，由SEQ ID 135的氨基酸序列组成；和/或
[0091] c)亲本CDR3，由SEQ ID 137的氨基酸序列组成；
[0092] 其中任何功能活性CDR变体(特别是上面的组员i)至viii)之一指出的)包括至少一个位于亲本CDR序列的点突变，和包括或由其组成的与亲本CDR序列具有至少60％的序列一致性的氨基酸序列，优选是至少70％、至少80％、至少90％的序列一致性。
[0093] 特别地，抗体是组员iv)(参考上文)的抗体或它的功能活性变体，其中
[0094] a)在VH CDR1的7位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是E、F、H、I、K、L、M、R、V、W或Y中的任何一个，及更优选的是E、F、M、W或Y中的任何一个；和/或
[0095] b)在VH CDR2的1位，氨基酸残基选自N、A、D、E、F、H、L、S、T、V和Y，优选是F、H或Y中的任何一个；和/或
[0096] c)在VH CDR2的3位，氨基酸残基选自Y、H、T和W；和/或
[0097] d)在VH CDR2的5位，氨基酸残基选自S、A、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是N、R或W中的任何一个，及更优选的是N或W；和/或
[0098] e)在VH CDR2的7位，氨基酸残基选自S、D、F、H、K、L、M、N、R和W；和/或[0099] f)在VH CDR2的9位，氨基酸残基选自Y、D、E、F、N、S和W，优选是D或H，及更优选的是H；和/或
[0100] g)在VH CDR3的4位，氨基酸残基选自R、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V和W，优选是D或H；和/或
[0101] h)在VH CDR3的5位，氨基酸残基选自G、A、F和Y；和/或
[0102] i)在VH CDR3的6位，氨基酸残基选自M、E、F、H和Q，优选是F或H；和/或
[0103] j)在VH CDR3的7位，氨基酸残基选自H、A、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、W和Y，优选是E、K、Q、R、W或Y中的任何一个，及更优选的是W或Y。
[0104] 具体地，功能活性CDR变体包括以下至少一个
[0105] a)1、2或3个在亲本CDR序列上的点突变；或
[0106] b)1或2个在亲本CDR序列的4个C-端或4个N-端或4个中心氨基酸位置上的点突变。
[0107] 具体地，功能活性变体抗体包括至少一种本发明的功能活性CDR变体。
[0108] 具体地，功能活性变体区别于亲本抗体，例如，列于图1(表1)或图2中的任何一种抗体，区别之处在于在氨基酸序列中的至少一个点突变，优选是在CDR中，例如以获得来源于亲本CDR的CDR变体，其中，在每条CDR氨基酸序列中的点突变的数量是0、1、2或3。
[0109] 具体地，抗体衍生自此类抗体，采用各CDR序列或CDR突变体，包括功能活性CDR变体，例如，在一个CDR环内带有1、2或3个点突变，例如，在5-18个氨基酸的CDR长度内，例如，在5-15个氨基酸或5-10个氨基酸的CDR区域内带有1、2或3个点突变。或者，在一个CDR环内，例如，在少于5个氨基酸的CDR长度内，可以有1至2个点突变，以提供包括功能活性CDR变体的抗体。特定的CDR序列可以是短的，例如，CDR2序列或CDR5序列。根据具体的实施例，功能活性CDR变体包括1或2个位于任何一条由少于4或5个氨基酸组成的CDR序列上的点突变。
[0110] 根据一具体方面，本发明的抗体包括CDR和框架序列，其中，CDR和框架序列中的至少之一包括人、人源化、嵌合、鼠源或亲和成熟序列，优选的，其中框架序列是IgG抗体的序列，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，或IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体的序列。
[0111] 提供特异性抗体作为框架突变的抗体，例如，以改善亲本抗体的可制造性或耐受性，例如，以提供一改良(突变)抗体，其具有低的免疫原性潜力，例如，与亲本抗体相比，在任何一个CDR序列和/或框架序列上具有突变的人源化抗体。
[0112] 进一步的，提供特异性抗体作为CDR突变的抗体，例如，以改善抗体的亲和力和/或以靶向相同表位或靠近被亲本抗体靶向的表位(表位漂移)。
[0113] 因此，列于图1或图2的任何一种抗体都可以用作亲本抗体，以制造改良的版本。
[0114] 具体地，功能活性变体抗体具有结合与亲本抗体相同表位的特异性。
[0115] 根据具体方面，至少一个点突变是一个或多个氨基酸的替换、删除和/或插入中的任何一种。
[0116] 具体地，功能活性变体抗体具有结合与亲本抗体相同表位的特异性。
[0117] 根据具体方面，至少一个点突变是一个或多个氨基酸的氨基酸的替换、删除和/或插入中的任何一种。
[0118] 具体地，抗体选自由以下组成的组
[0119] a)一抗体，包括
[0120] a.SEQ ID 38的CDR1序列；及
[0121] b.SEQ ID 39的CDR2序列；及
[0122] c.SEQ ID 30的CDR3序列；
[0123] b)一抗体，包括
[0124] a.SEQ ID 47的CDR1序列；及
[0125] b.SEQ ID 49的CDR2序列；及
[0126] c.SEQ ID 51的CDR3序列；
[0127] c)一抗体，包括
[0128] a.SEQ ID 83的CDR1序列；及
[0129] b.SEQ ID 84的CDR2序列；及
[0130] c.SEQ ID 73的CDR3序列；
[0131] d)一抗体，包括
[0132] a.SEQ ID 104的CDR1序列；及
[0133] b.SEQ ID 105的CDR2序列；及
[0134] c.SEQ ID 106的CDR3序列；
[0135] 和
[0136] e)一抗体，包括
[0137] a.SEQ ID 114的CDR1序列；及
[0138] b.SEQ ID 115的CDR2序列；及
[0139] c.SEQ ID 106的CDR3序列。
[0140] 具体地，该抗体包括
[0141] a)一VH氨基酸序列，选自如图2中所描述的任何VH序列；
[0142] b)一抗体重链(HC)氨基酸序列，选自由SEQ ID 147、SEQ ID 149、SEQ ID 151、SEQ ID 153、SEQ ID 155、SEQ ID 157、SEQ ID 159、SEQ ID 161、SEQ ID 163、SEQ ID 165、SEQ ID 167、SEQ ID 169和SEQ ID 171组成的组；
[0143] c)一抗体重链(HC)氨基酸序列，选自由SEQ ID 147、SEQ ID 149、SEQ ID 151、SEQ ID 153、SEQ ID 155、SEQ ID 157、SEQ ID 159、SEQ ID 161、SEQ ID 163、SEQ ID 165、SEQ ID 167、SEQ ID 169和SEQ ID 171组成的组，进一步包括C-端氨基酸的删除和/或Q1E点突变，如果VH序列的第一个氨基酸是Q。
[0145] 根据一个具体方面，每个HC序列可以是末端延伸的或在恒定区有删除的，如一个或多个或C-端氨基酸的删除。
[0146] 具体地，包括C-端赖氨酸残基的每个HC序列，优选采用此类C-端赖氨酸残基的删除。
[0147] 根据一个具体实施例，抗体进一步包括抗体轻链可变区(VL)的至少3个互补决定区(CDR4至CDR6)。
[0148] 具体地，本发明的抗体进一步包括抗体轻链可变区(VL)，其包括列于表1中的CDR4至CDR6序列中的任何一个或它们的功能活性CDR变体。
[0149] 具体地，抗体包括列于表1中的至少一CDR4序列，或至少一CDR4和一CDR5序列，或至少一CDR4、CDR5和一CDR6序列。
[0150] 根据一个具体方面，本发明的抗体包括列于表1中的CDR组合。根据一个具体方面，本发明的抗体包括列于表1中的CDR组合，尤其是，抗体仍然是功能活性的。
[0151] 具体地，本发明的抗体包括列于表1中的任何一个抗体的CDR1-6。然而，根据一个可选择的实施例，抗体可以包括不同的CDR组合，例如，其中列于表1中的抗体包括至少一个CDR序列(例如，一个抗体的1、2、3、4、5或6CDR序列)和列于表1中的任何一个抗体的不同抗体的至少一个其它CDR序列。根据一个具体实施例，抗体包括1、2、3、4、5或6CDR序列，其中，CDR序列是超过1个抗体的CDR组合，例如，2个、3个、4个、5个或6个不同的抗体。例如，CDR序列可以组合以优选包括列于表1中的任何抗体的CDR1-3中的1、2或全部3个，和列于表1中的相同或任何其它抗体的CDR4-6中的1、2或全部3个。
[0152] 特别应该理解的是，编号为CDR1、2和3的CDR代表VH域的结合区，及CDR4、5和6代表VL域的结合区。
[0153] 例如，CDR序列可以组合以优选包括列于表1中的任何抗体的CDR1-3，例如，指定为#AB-29、#AB-30、#AB-31、#AB-32、#AB-33、#AB-34、#AB-35或#AB-36的任何抗体，或指定为#AB-30-3、#AB-31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-15的任何抗体，和/或列于表1中的任何抗体的至少CDR4-6，例如，指定为#AB-29、#AB-
30、#AB-31、#AB-32、#AB-33、#AB-34、#AB-35或#AB-36的任何抗体，或指定为#AB-30-3、#AB-
31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-15的任何抗体。
根据一个具体实施例，本发明的抗体包括列于表1中的任何抗体的CDR1-6，例如，指定为#AB-29、#AB-30、#AB-31、#AB-32、#AB-33、#AB-34、#AB-35或#AB-36的任何抗体，或指定为#AB-30-3、#AB-31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-
15的任何抗体。然而，根据进一步的具体方面，抗体可以包括不同的CDR组合，例如，其中列于表1中的抗体，例如，指定为#AB-29、#AB-30、#AB-31、#AB-32、#AB-33、#AB-34、#AB-35或#AB-36的任何抗体，或指定为#AB-30-3、#AB-31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-15的任何抗体，包括至少一个CDR序列，例如不同抗体的1、2、
3、4、5或6个CDR序列，例如，列于表1中的任何抗体的任何不同抗体的CDR序列，例如，指定为#AB-29、#AB-30、#AB-31、#AB-32、#AB-33、#AB-34、#AB-35或#AB-36的任何抗体的任何不同抗体，或指定为#AB-30-3、#AB-31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-15的任何抗体的任何不同抗体。例如，抗体包括1、2、3、4、5或6个CDR序列，其中CDR序列是超过1个抗体，如2、3、4、5或6个不同抗体的的CDR组合。
30、#AB-31、#AB-32、#AB-33、#AB-34、#AB-35或#AB-36的任何抗体，或指定为#AB-30-3、#AB-
31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-15的任何抗体。
根据一个具体实施例，本发明的抗体包括列于表1中的任何抗体的CDR1-6，例如，指定为#AB-29、#AB-30、#AB-31、#AB-32、#AB-33、#AB-34、#AB-35或#AB-36的任何抗体，或指定为#AB-30-3、#AB-31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-
15的任何抗体。然而，根据进一步的具体方面，抗体可以包括不同的CDR组合，例如，其中列于表1中的抗体，例如，指定为#AB-29、#AB-30、#AB-31、#AB-32、#AB-33、#AB-34、#AB-35或#AB-36的任何抗体，或指定为#AB-30-3、#AB-31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-15的任何抗体，包括至少一个CDR序列，例如不同抗体的1、2、
3、4、5或6个CDR序列，例如，列于表1中的任何抗体的任何不同抗体的CDR序列，例如，指定为#AB-29、#AB-30、#AB-31、#AB-32、#AB-33、#AB-34、#AB-35或#AB-36的任何抗体的任何不同抗体，或指定为#AB-30-3、#AB-31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-15的任何抗体的任何不同抗体。例如，抗体包括1、2、3、4、5或6个CDR序列，其中CDR序列是超过1个抗体，如2、3、4、5或6个不同抗体的的CDR组合。
[0154] 根据一个具体方面，本发明的抗体包括图1或图2中所描述的任何HC和LC氨基酸序列组合或由此HC和LC氨基酸序列组合形成的结合位点。或者，可以使用两种不同的抗体的免疫球蛋白链的组合，前提是抗体仍然具有功能活性。例如，一个抗体的HC序列可以与另一个抗体的LC序列组合。根据进一步的具体实施例，图1或图2中的任何框架区域可以作为在此描述的任何CDR序列和/或VH/VL组合的框架。
[0155] 图1示出了8组抗体，其特征是，不同的HC和/或LC序列在每组内的任何CDR具有相似性，且支持任何HC/LC组合，特别是相同组的HC和LC的组合。根据一个HC的CDR1-3中的其中一个的具体方面，例如，CDR1与第二HC和可选的第三HC的任何其它CDR序列组合，例如，分别是第二HC和第三HC的CDR2和CDR3，特别是相同组的CDR1-3序列的组合。根据一个LC的CDR4-6中的其中一个的具体方面，例如，CDR4与第二LC和可选的第三LC的任何其它CDR序列组合，例如，分别是第二LC和第三LC的CDR5和CDR6，特别是其中相同组的CDR4-6序列的组合。
[0156] 特别地，抗体选自由组员i)至viii)组成的组，其中
[0157] i)
[0158] A)是一抗体，包括
[0159] a)一CDR4，包括或由SEQ ID 9或SEQ ID 19的氨基酸序列组成；及
[0160] b)一CDR5，包括或由SEQ ID 11、SEQ ID 16或SEQ ID 21中的任何氨基酸序列组成；及
[0161] c)一CDR6，包括或由SEQ ID 13、SEQ ID 17、SEQ ID 23或SEQ ID 24中的任何氨基酸序列组成；
[0162] 或
[0163] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0164] a)亲本CDR4，由SEQ ID 9或SEQ ID 19的氨基酸序列组成；和/或
[0165] b)亲本CDR5，由SEQ ID 11、SEQ ID 16或SEQ ID 21中的任何氨基酸序列组成；和/或
[0166] c)亲本CDR6，由SEQ ID 13、SEQ ID 17、SEQ ID 23或SEQ ID 24中的任何氨基酸序列组成；
[0167] ii)
[0168] A)是一抗体，包括
[0169] a)一CDR4，包括或由SEQ ID 32的氨基酸序列组成；及
[0170] b)一CDR5，包括或由SEQ ID 33或SEQ ID 41的氨基酸序列组成；及
[0171] c)一CDR6，包括或由SEQ ID 35、SEQ ID 42、SEQ ID 43或SEQ ID 45中的任何氨基酸序列组成；
[0172] 或
[0173] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0174] a)亲本CDR4，由SEQ ID 32的氨基酸序列组成；和/或
[0175] b)亲本CDR5，由SEQ ID 33或SEQ ID 41的氨基酸序列组成；和/或
[0176] c)亲本CDR6，由SEQ ID 35、SEQ ID 42、SEQ ID 43和/或SEQ ID 45中的任何氨基酸序列组成；
[0177] iii)
[0178] A)是一抗体，包括
[0179] a)一CDR4，包括或由SEQ ID 53、SEQ ID 67或SEQ ID 19中的任何氨基酸序列组成；及
[0180] b)一CDR5，包括或由SEQ ID 21的氨基酸序列组成；及
[0181] c)一CDR6，包括或由SEQ ID 54、SEQ ID 68、SEQ ID 69或SEQ ID 70中的任何氨基酸序列组成；
[0182] 或
[0183] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0184] a)亲本CDR4，由SEQ ID 53、SEQ ID 67或SEQ ID 19中的任何氨基酸序列组成；和/或
[0185] b)亲本CDR5，由SEQ ID 21的氨基酸序列组成；和/或
[0186] c)亲本CDR6，由SEQ ID 54、SEQ ID 68、SEQ ID 69和/或SEQ ID 70中的任何氨基酸序列组成；
[0187] iv)
[0188] A)是一抗体，包括
[0189] a)一CDR4，包括或由SEQ ID 75或SEQ ID 32的氨基酸序列组成；及
[0190] b)一CDR5，包括或由SEQ ID 41的氨基酸序列组成；及
[0191] c)一CDR6，包括或由SEQ ID 76或SEQ ID 86的氨基酸序列组成；
[0192] 或
[0193] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0194] a)亲本CDR4，由SEQ ID 75或SEQ ID 32的氨基酸序列组成；和/或
[0195] b)亲本CDR5，由SEQ ID 41的氨基酸序列组成；和/或
[0196] c)亲本CDR6，由SEQ ID 76或SEQ ID 86的氨基酸序列组成；
[0197] v)
[0198] A)是一抗体，包括
[0199] a)一CDR4，包括或由SEQ ID 92的氨基酸序列组成；及
[0200] b)一CDR5，包括或由SEQ ID 94的任何氨基酸序列组成；及
[0201] c)一CDR6，包括或由SEQ ID 96或SEQ ID 103的氨基酸序列组成；
[0202] 或
[0203] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0204] a)亲本CDR4，由SEQ ID 92的氨基酸序列组成；和/或
[0205] b)亲本CDR5，由SEQ ID 94的氨基酸序列组成；和/或
[0206] c)亲本CDR6，由SEQ ID 96或SEQ ID 103的氨基酸序列组成；
[0207] vi)
[0208] A)是一抗体，包括
[0209] a)一CDR4，包括或由SEQ ID 92或SEQ ID 116的氨基酸序列组成；及
[0210] b)一CDR5，包括或由SEQ ID 94或SEQ ID 117的氨基酸序列组成；及
[0211] c)一CDR6，包括或由SEQ ID 108、SEQ ID 118或SEQ ID 123中的任何氨基酸序列组成；
[0212] 或
[0213] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0214] a)亲本CDR4，由SEQ ID 92或SEQ ID 116的氨基酸序列组成；和/或
[0215] b)亲本CDR5，由SEQ ID 94或SEQ ID 117的氨基酸序列组成；和/或
[0216] c)亲本CDR6，由SEQ ID 108、SEQ ID 118或SEQ ID 123中的任何氨基酸序列组成；
[0217] vii)
[0218] A)是一抗体，包括
[0219] a)一CDR4，包括或由SEQ ID 32的氨基酸序列组成；及
[0220] b)一CDR5，包括或由SEQ ID 41的氨基酸序列组成；及
[0221] c)一CDR6，包括或由SEQ ID 129、SEQ ID 130、SEQ ID 131或SEQ ID 132中的任何氨基酸序列组成；
[0222] 或
[0223] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0224] a)亲本CDR4，由SEQ ID 32的氨基酸序列组成；和/或
[0225] b)亲本CDR5，由SEQ ID 41的氨基酸序列组成；和/或
[0226] c)亲本CDR6，由SEQ ID 129、SEQ ID 130、SEQ ID 131或SEQ ID 132中的任何氨基酸序列组成；
[0227] viii)
[0228] A)是一抗体，包括
[0229] a)一CDR4，包括或由SEQ ID 92或SEQ ID 116的氨基酸序列组成；及
[0230] b)一CDR5，包括或由SEQ ID 94的氨基酸序列组成；及
[0231] c)一CDR6，包括或由SEQ ID 140、SEQ ID 96、SEQ ID 142或SEQ ID 143中的任何氨基酸序列组成；
[0232] 或
[0233] B)是一抗体，其是抗体A的功能活性变体，包括至少一种以下构造的功能活性CDR变体
[0234] a)亲本CDR4，由SEQ ID 92或SEQ ID 116的氨基酸序列组成；和/或
[0235] b)亲本CDR5，由SEQ ID 94的氨基酸序列组成；和/或
[0236] c)亲本CDR6，由SEQ ID 140、SEQ ID 96、SEQ ID 142或SEQ ID 143中的任何氨基酸序列组成；
[0237] 其中任何功能活性CDR变体(特别是上面的组员i)至viii)之一指出的)包括至少一个位于亲本CDR序列的点突变，和包括或由与亲本CDR序列具有至少60％的序列一致性的氨基酸序列组成，优选是至少70％、至少80％、至少90％的序列一致性。
[0238] 具体地，抗体是组员iv)(参考上文)的抗体或它的功能活性变体，其中
[0239] a)在VL CDR4的7位，氨基酸残基选自N、A、D、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、W和Y，优选是F、L、W或Y中的任何一个，及更优选的是L或W；和/或
[0240] b)在VL CDR4的8位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是I或W；和/或
[0241] c)在VL CDR4的9位，氨基酸残基选自Y、F、R和W，优选是R或W；和/或
[0242] d)在VL CDR5的1位，氨基酸残基选自A、G、S、W和Y，优选是G；和/或
[0243] e)在VL CDR6的4位，氨基酸残基选自F、H、M、W和Y；和/或
[0244] f)在VL CDR6的5位，氨基酸残基选自D、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；和/或
[0245] g)在VL CDR6的8位，氨基酸残基选自F、H、R和W。
[0246] 具体地，抗体包括选自如图2描述的任何VL序列的VL氨基酸序列或选自由SEQID 148、SEQ ID 150、SEQ ID 152、SEQ ID 154、SEQ ID 156、SEQ ID 158、SEQ ID 160、SEQ ID
162、SEQ ID 164、SEQ ID 166、SEQ ID 168、SEQ ID 170和SEQ ID 172组成的组的抗体轻链(LC)氨基酸序列，或任何上述序列的功能活性CDR变体，其结合LukGH复合物的亲和力的Kd小于10-8M，优选小于10-9M，优选小于10-10M，优选小于10-11M，例如，具有皮摩尔范围的亲和力。
162、SEQ ID 164、SEQ ID 166、SEQ ID 168、SEQ ID 170和SEQ ID 172组成的组的抗体轻链(LC)氨基酸序列，或任何上述序列的功能活性CDR变体，其结合LukGH复合物的亲和力的Kd小于10-8M，优选小于10-9M，优选小于10-10M，优选小于10-11M，例如，具有皮摩尔范围的亲和力。
[0247] 特别地，抗体或它的功能活性变体包括选自如图2组4描述的任何VL序列的VL氨基酸序列或选自由SEQ ID 158、SEQ ID 160、SEQ ID 162组成的组的抗体轻链(LC)氨基酸序列，其中
[0248] a)在VL CDR4的7位，氨基酸残基选自N、A、D、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、W和Y，优选是F、L、W或Y中的任何一个，及更优选的是L或W；和/或
[0249] b)在VL CDR4的8位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是I或W；和/或
[0250] c)在VL CDR4的9位，氨基酸残基选自Y、F、R和W，优选是R或W；和/或
[0251] d)在VL CDR5的1位，氨基酸残基选自A、G、S、W和Y，优选是G；和/或
[0252] e)在VL CDR6的4位，氨基酸残基选自F、H、M、W和Y；和/或
[0253] f)在VL CDR6的5位，氨基酸残基选自D、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；和/或
[0254] g)在VL CDR6的8位，氨基酸残基选自F、H、R和W。
[0255] 具体地，抗体选自由以下组成的组：
[0256] a)一抗体，其包括
[0257] a.SEQ ID 38的CDR1序列；和
[0258] b.SEQ ID 39的CDR2序列；和
[0259] c.SEQ ID 30的CDR3序列；和
[0260] d.SEQ ID 32的CDR4序列；和
[0261] e.SEQ ID 33的CDR5序列；和
[0262] f.SEQ ID 35的CDR6序列；
[0263] b)一抗体，其包括
[0264] a.SEQ ID 47的CDR1序列；和
[0265] b.SEQ ID 49的CDR2序列；和
[0266] c.SEQ ID 51的CDR3序列；和
[0267] d.SEQ ID 53的CDR4序列；和
[0268] e.SEQ ID 21的CDR5序列；和
[0269] f.SEQ ID 54的CDR6序列；
[0270] c)一抗体，其包括
[0271] a.SEQ ID 83的CDR1序列；和
[0272] b.SEQ ID 84的CDR2序列；和
[0273] c.SEQ ID 73的CDR3序列；和
[0274] d.SEQ ID 75的CDR4序列；和
[0275] e.SEQ ID 41的CDR5序列；和
[0276] f.SEQ ID 76的CDR6序列；
[0277] d)一抗体，其包括
[0278] a.SEQ ID 104的CDR1序列；和
[0279] b.SEQ ID 105的CDR2序列；和
[0280] c.SEQ ID 106的CDR3序列；和
[0281] d.SEQ ID 92的CDR4序列；和
[0282] e.SEQ ID 94的CDR5序列；和
[0283] f.SEQ ID 108的CDR6序列；
[0284] e)和一抗体，其包括
[0285] a.SEQ ID 114的CDR1序列；和
[0286] b.SEQ ID 115的CDR2序列；和
[0287] c.SEQ ID 106的CDR3序列；和
[0288] d.SEQ ID 116的CDR4序列；和
[0289] e.SEQ ID 117的CDR5序列；和
[0290] f.SEQ ID 118的CDR6序列；
[0291] 或任何上述一个的功能活性CDR变体(特别是，正如上述组员a)至e)中的其中一个-8 -9所规定的抗体的)，其结合LukGH复合物的亲和力的Kd小于10 M，优选小于10 M，优选小于
10-10M，优选小于10-11M，例如，具有皮摩尔范围的亲和力。
10-10M，优选小于10-11M，例如，具有皮摩尔范围的亲和力。
[0292] 具体地，抗体是组员c)的抗体(见上文，以SEQ ID 83的CDR1序列、SEQ ID 84的CDR2序列、SEQ ID 73的CDR3序列、SEQ ID 75的CDR4序列、SEQ ID 41的CDR5序列和SEQ ID 76的CDR6序列为特征)或它的功能活性变体，其中：
[0293] a)在VH CDR1的7位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是E、F、H、I、K、L、M、R、V、W或Y中的任何一个，及更优选的是E、F、M、W或Y中的任何一个；和/或
[0294] b)在VH CDR2的1位，氨基酸残基选自N、A、D、E、F、H、L、S、T、V和Y，优选是F、H或Y中的任何一个；和/或
[0295] c)在VH CDR2的3位，氨基酸残基选自Y、H、T和W；和/或
[0296] d)在VH CDR2的5位，氨基酸残基选自S、A、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是N、R或W中的任何一个，及更优选的是N或W；和/或
[0297] e)在VH CDR2的7位，氨基酸残基选自S、D、F、H、K、L、M、N、R和W；和/或[0298] f)在VH CDR2的9位，氨基酸残基选自Y、D、E、F、N、S和W，优选是D或H，及更优选的是H；和/或
[0299] g)在VH CDR3的4位，氨基酸残基选自R、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V和W，优选是D或H；和/或
[0300] h)在VH CDR3的5位，氨基酸残基选自G、A、F和Y；和/或
[0301] i)在VH CDR3的6位，氨基酸残基选自M、E、F、H和Q，优选是F或H；和/或
[0302] j)在VH CDR3的7位，氨基酸残基选自H、A、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、W和Y，优选是E、K、Q、R、W或Y中的任何一个，及更优选是W或Y；和/或
[0303] k)在VL CDR4的7位，氨基酸残基选自由N、A、D、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、W和Y组成的组，优选是F、L、W或Y中的任何一个，及更优选是L或W；和/或
[0304] l)在VL CDR4的8位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是I或W；和/或
[0305] m)在VL CDR4的9位，氨基酸残基选自Y、F、R和W，优选是R或W；和/或
[0306] n)在VL CDR5的1位，氨基酸残基选自A、G、S、W和Y，优选是G；和/或
[0307] o)在VL CDR6的4位，氨基酸残基选自F、H、M、W和Y；和/或
[0308] p)在VL CDR6的5位，氨基酸残基选自D、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；和/或
[0309] q)在VL CDR6的8位，氨基酸残基选自F、H、R和W。
[0310] 具体地，抗体包括一框架，比如由免疫球蛋白恒定区或恒定域组成的免疫球蛋白框架，包括列于表1中的VH和/或VL的任何框架区，可选地包括一Q1E点突变，如果VH框架区(VH FR1)的第一氨基酸是Q。
[0311] 具体地，抗体包括如图2所示的HC氨基酸序列。
[0312] 具体地，抗体选自由以下组成的组：
[0313] a)一抗体，包括
[0314] a.SEQ ID 147的HC氨基酸序列；和
[0315] b.SEQ ID 148的LC氨基酸序列；
[0316] b)一抗体，包括
[0317] a.SEQ ID 149的HC氨基酸序列；和
[0318] b.SEQ ID 150的LC氨基酸序列；
[0319] c)一抗体，包括
[0320] a.SEQ ID 151的HC氨基酸序列；和
[0321] b.SEQ ID 152的LC氨基酸序列；
[0322] d)一抗体，包括
[0323] a.SEQ ID 153的HC氨基酸序列；和
[0324] b.SEQ ID 154的LC氨基酸序列；
[0325] e)一抗体，包括
[0326] a.SEQ ID 155的HC氨基酸序列；和
[0327] b.SEQ ID 156的LC氨基酸序列；
[0328] f)一抗体，包括
[0329] a.SEQ ID 157的HC氨基酸序列；和
[0330] b.SEQ ID 158的LC氨基酸序列；
[0331] g)一抗体，包括
[0332] a.SEQ ID 159的HC氨基酸序列；和
[0333] b.SEQ ID 160的LC氨基酸序列；
[0334] h)一抗体，包括
[0335] a.SEQ ID 161的HC氨基酸序列；和
[0336] b.SEQ ID 162的LC氨基酸序列；
[0337] i)一抗体，包括
[0338] a.SEQ ID 163的HC氨基酸序列；和
[0339] b.SEQ ID 164的LC氨基酸序列；
[0340] j)一抗体，包括
[0341] a.SEQ ID 165的HC氨基酸序列；和
[0342] b.SEQ ID 166的LC氨基酸序列；
[0343] k)一抗体，包括
[0344] a.SEQ ID 167的HC氨基酸序列；和
[0345] b.SEQ ID 168的LC氨基酸序列；
[0346] l)一抗体，包括
[0347] a.SEQ ID 169的HC氨基酸序列；和
[0348] b.SEQ ID 170的LC氨基酸序列；
[0349] 和
[0350] m)一抗体，包括
[0351] a.SEQ ID 171的HC氨基酸序列；和
[0352] b.SEQ ID 172的LC氨基酸序列；
[0353] 或任何上述一个的功能活性CDR变体(特别是，正如上述组员a)至m)中的其中一个-8 -9所规定的抗体的)，其结合LukGH复合物的亲和力的Kd小于10 M，优选小于10 M，优选小于
10-10M，优选小于10-11M，例如，具有皮摩尔范围的亲和力。
10-10M，优选小于10-11M，例如，具有皮摩尔范围的亲和力。
[0354] 具体地，抗体是组员f)(见上文，以SEQ ID 157的HC氨基酸序列、SEQ ID 158的LC氨基酸序列为特征)、g)(以SEQ ID 159的HC氨基酸序列和SEQ ID 160的LC氨基酸序列为特征)和h)(以SEQ ID 161的HC氨基酸序列和SEQ ID 162的LC氨基酸序列为特征)的任何抗体或任何上述一个的功能活性变体，其中：
[0355] a)在VH CDR1的7位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是E、F、H、I、K、L、M、R、V、W或Y中的任何一个，及更优选的是E、F、M、W或Y中的任何一个；和/或
[0356] b)在VH CDR2的1位，氨基酸残基选自N、A、D、E、F、H、L、S、T、V和Y，优选是F、H或Y中的任何一个；和/或
[0357] c)在VH CDR2的3位，氨基酸残基选自Y、H、T和W；和/或
[0358] d)在VH CDR2的5位，氨基酸残基选自S、A、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是N、R或W中的任何一个，及更优选的是N或W；和/或
[0359] e)在VH CDR2的7位，氨基酸残基选自S、D、F、H、K、L、M、N、R和W；和/或[0360] f)在VH CDR2的9位，氨基酸残基选自Y、D、E、F、N、S和W，优选是D或H，及更优选的是H；和/或
[0361] g)在VH CDR3的4位，氨基酸残基选自R、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V和W，优选是D或H；和/或
[0362] h)在VH CDR3的5位，氨基酸残基选自G、A、F和Y；和/或
[0363] i)在VH CDR3的6位，氨基酸残基选自M、E、F、H和Q，优选是F或H；和/或
[0364] j)在VH CDR3的7位，氨基酸残基选自H、A、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、W和Y，优选是E、K、Q、R、W或Y中的任何一个，及更优选是W或Y；和/或
[0365] k)在VL CDR4的7位，氨基酸残基选自由N、A、D、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、W和Y组成的组，优选是F、L、W或Y中的任何一个，及更优选是L或W；和/或
[0366] l)在VL CDR4的8位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是I或W；和/或
[0367] m)在VL CDR4的9位，氨基酸残基选自Y、F、R和W，优选是R或W；和/或
[0368] n)在VL CDR5的1位，氨基酸残基选自A、G、S、W和Y，优选是G；和/或
[0369] o)在VL CDR6的4位，氨基酸残基选自F、H、M、W和Y；和/或
[0370] p)在VL CDR6的5位，氨基酸残基选自D、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；和/或
[0371] q)在VL CDR6的8位，氨基酸残基选自F、H、R和W。
[0372] 根据一个具体的方面，本发明的抗体包括如图2中描述的任何HC和LC氨基酸序列组合或由此HC和LC氨基酸序列组合形成的结合位点。
[0373] 具体地，抗体结合LukGH复合物的亲和力的Kd小于10-8M，优选小于10-9M，优选小于10-10M，优选小于10-11M，例如，具有皮摩尔范围的亲和力。
[0374] 具体地，抗体具有结合单个LukGH和/或LukH抗原的亲和力，该亲和力小于结合LukGH复合物的亲和力，优选具有的Kd大于10-7M，优选大于10-6M。
[0375] 具体地，相对于单独的LukGH和/或LukH抗原，优先结合LukGH复合物的Kd差异是至少2log，优选是至少3log。
[0376] 本发明进一步提供了本发明的任何抗体的亲本抗体的功能活性抗体变体的制备方法，本发明的抗体包括如图2中描述的任何HC和LC氨基酸序列组合，或由此HC和LC氨基酸序列组合形成的结合位点，该方法包括改造任何框架区(FR)或恒定域，或互补决定区(CDR1至CDR6)内的至少一个点突变，以获得变体抗体，和通过结合LukGH复合物的亲和力确定变体抗体的功能活性，结合LukGH复合物的亲和力的Kd小于10-8M，优选小于10-9M，优选小于10-10M，优选小于10-11M，例如，具有皮摩尔范围的亲和力，其中，一旦确定功能活性，功能活性变体就被挑选出来，通过重组生产方法用于生产。
[0377] 具体地，LukGH复合物是以溶液中的单独的LukG和LukH抗原的组装得到的抗原结构为特征。
[0378] 具体地，LukGH复合物提供作为分离的和可选的纯化的复合抗原。
[0379] 具体地，LukGH复合物包括LukG和LukH组分作为异源二聚体或异源低聚体。
[0380] 具体地，LukGH复合物由重组蛋白和/或衍生自金黄色葡萄球菌的蛋白质组成。
[0381] 具体地，LukG和LukH组分由重组宿主细胞共表达、纯化自天然来源和/或共-重折叠。
[0382] 具体地，抗原以可溶形式的蛋白复合物提供。
[0384] 具体地，该抗体能够中和LukGH复合物。
[0385] 具体地，本发明的抗体在不同的LukGH变体间是可交叉反应的。
[0386] 具体地，抗体交叉中和LukGH复合物和LukGH复合物变体。
[0387] 具体地，抗体结合至衍生自USA300克隆(优选是来源于TCH1516菌株)的LukGH复合物，和至少一个LukGH复合物变体。
[0388] 具体地，LukGH复合物变体具有在任何LukG或LukH组分的氨基酸序列中的至少一个点突变，当与衍生自USA300克隆的LukGH复合物比较时，例如，序列中的一个或多个氨基酸残基改变。甚至衍生自MRSA252和MSHR1132菌株的迥然不同的LukGH复合物变体都可以通过本发明的抗体交叉特异性结合和交叉中和。
[0389] 具体地，本发明的抗体是交叉中和抗体，包括至少一个结合位点，该结合位点结合至来自USA300克隆(例如，菌株TCH_1516)的LukGH和至少一个LukGH变体。具体地，LukGH毒素选自由以EMRSA16、MRSA252菌株或MSHR1132菌株表达的基因组成的组。
[0390] 根据一具体的方面，该抗体在基于细胞的试验中展现出体外中和的效力，IC50小于100:1的mAb:毒素比(mol/mol)，优选小于50:1，优选小于25:1，优选小于10:1，更优选小于1:1。
[0391] 根据进一步的具体的方面，该抗体中和动物中的目标LukGH复合物，包括两种，人和非人动物，且在体内抑制金黄色葡萄球菌的致病性，优选地，任何类型的肺炎、菌血症、败血症、脓肿、皮肤感染、腹膜炎、导管和假体器械相关的感染和骨髓炎。
[0392] 具体地，该抗体是全长的单克隆抗体、它的包括具有结合位点的至少一个抗体域的抗体片段，或包括具有结合位点的至少一个抗体域的融合蛋白。优选的，该抗体选自鼠源、嵌合、人源化或人抗体、重链抗体、Fab、Fd、scFv和单域抗体，如VH、VHH或VL，优选是一人IgG1抗体。
[0393] 本发明进一步提供一表达盒或一质粒，其包括表达本发明的抗体的轻链和/或重链的一编码序列。
[0394] 本发明进一步提供一宿主细胞，其包括本发明的表达盒或质粒。
[0395] 特别优选的是一宿主细胞和使用此宿主细胞的生产方法，此宿主细胞包括：
[0396] -本发明的质粒或表达盒，其包含有表达抗体轻链的编码序列；以及
[0397] -本发明的质粒或表达盒，其包含有表达抗体重链的编码序列。
[0398] 本发明进一步提供了产生本发明的抗体的方法，其中，本发明的宿主细胞在产生所述抗体的条件下培养或维持。
[0399] 本发明进一步提供产生本发明的任何抗体的亲本抗体的功能活性抗体变体的方法，例如，列于图1或图2的抗体，或包括如图1或图2所描述的任何HC和LC氨基酸序列的组合，或包括由这些HC和LC氨基酸序列的组合形成的结合位点，该方法包括在任何框架区(FR)或恒定域，或互补决定区(CDR1至CDR6)内制造至少一个点突变，以获得变体抗体，并通过以下任何一种来确定变体抗体的功能活性：
[0400] -结合LukGH复合物的亲和力的Kd小于10-8M，优选小于10-9M，优选小于10-10M，优选小于10-11M，例如，具有皮摩尔范围的亲和力，和/或
[0401] -变体抗体与亲本抗体竞争结合LukGH复合物；
[0402] 其中，在确定功能活性时，挑选出功能活性变体，通过重组生产方法用于生产。
[0403] 功能活性变体抗体可在任何VH或VL序列不同，或共享相同的VH和VL序列，及包括在各自FR的修饰。通过突变衍生自亲本抗体的变体抗体可以用本领域中已知的方法产生。
[0404] 示例性亲本抗体在以下实施例部分和图1和图2中描述。具体地，该抗体是如列于图1或图2中的亲本抗体的功能活性衍生物。具有一个或多个修饰的CDR序列，和/或一个或多个修饰的FR序列(例如FR1、FR2、FR3或FR4序列)，或修饰的恒定域序列的变体可以被制造。
[0405] 本发明进一步提供生产本发明抗体的方法，包括：
[0406] (a)采用如此处定义的表位的三维结构对非人动物进行免疫；
[0407] (b)从分离的B-细胞形成永生化细胞系；
[0408] (c)筛选细胞系以鉴定产生单克隆抗体的细胞系，该单克隆抗体与金黄色葡萄球菌的LukGH复合物和可选的至少一种LukGH复合物变体结合；以及
[0409] (d)生产单克隆抗体，或人源化或人形式的抗体，或与单克隆抗体具有相同的表位结合特异性的它们的衍生物。
[0410] 根据一进一步的方面，本发明提供了生产本发明抗体的方法，包括：
[0411] (a)采用金黄色葡萄球菌的LukGH复合物对非人动物进行免疫并分离产生抗体的B-细胞；
[0412] (b)从分离的B-细胞形成永生化细胞系；
[0413] ()筛选细胞系以鉴定产生单克隆抗体的细胞系，该单克隆抗体与金黄色葡萄球菌的LukGH复合物和可选的至少一种LukGH复合物变体结合；以及
[0414] (d)生产单克隆抗体，或人源化或人形式的抗体，或与单克隆抗体具有相同的表位结合特异性的它们的衍生物。
[0415] 根据一具体方面，本发明的抗体提供用于医疗用途，特别是用于治疗具有患金黄色葡萄球菌感染危险或患有金黄色葡萄球菌感染的主体，包括给予主体一治疗有效量的该抗体以限制在主体中的感染、以减轻由所述感染引起的病状，或以抑制金黄色葡萄球菌的发病，例如，肺炎、败血症、菌血症、伤口感染、脓肿、手术部位感染、眼内炎、疖病、痈病、心内膜炎、腹膜炎、骨髓炎或关节感染。
[0416] 具体地，该抗体提供用于防范金黄色葡萄球菌感染。
[0417] 根据进一步的方面，进一步提供一种治疗的方法，其中，用有效量的本发明的抗体治疗具有金黄色葡萄球菌感染或由所述感染引起的病状的风险或患有金黄色葡萄球菌感染或由所述感染引起的病状的主体，以限制在主体中的感染、以减轻由所述感染引起的病状，或以抑制金黄色葡萄球菌的疾病的发病，例如，肺炎、败血症、菌血症、伤口感染、脓肿、手术部位感染、眼内炎、疖病、痈病、心内膜炎、腹膜炎、骨髓炎或关节感染。
[0418] 具体地，该治疗方法提供用于防范致病的金黄色葡萄球菌。
[0419] 根据进一步的方面，进一步提供一药物制剂，其包括本发明的抗体，优选包括胃肠外的或黏膜的剂型，可选地，包含药学上可接受的载体或赋形剂。
[0420] 此药物组合物可以包含抗体作为唯一的活性物质，或与其它活性物质组合，或活性物质的混合物，例如，至少两种或三种不同抗体的组合或混合，例如，其中，其它活性物质进一步靶定金黄色葡萄球菌，如OPK抗体或靶定至少一种其它毒素的抗体。特别地，抗体的混合物包括一种或多种本发明的抗体，每个都靶定毒素，且与混合物中的仅一种抗体相比，该组合靶定更多不同的表位或毒素。
[0421] 根据进一步的方面，本发明的抗体提供用于诊断用途，以检测任何的金黄色葡萄球菌感染，包括产生高毒的MRSA感染，例如，坏死性肺炎，以及疖病和痈病中的毒素产生。
[0422] 根据进一步的方面，进一步提供本发明的抗体的诊断制剂，可选包含带有标签的抗体和/或带有标签的其它诊断试剂。
[0423] 具体地，根据本发明，该抗体提供用于诊断用途，其中通过将所述主体的体液样品与该抗体接触，离体确定主体内的金黄色葡萄球菌的系统性感染，其中，该抗体的特异性免疫反应确定了该感染。
[0424] 因此，本发明进一步涉及主体内金黄色葡萄球菌感染的相应诊断方法，尤其是其中主体内的金黄色葡萄球菌的系统性感染被确定。
[0425] 根据进一步的方面，进一步提供一种编码本发明抗体的分离的核酸。
[0426] 根据进一步的方面，提供本发明的抗体的分离的互补位，或包括所述互补位的结合分子。
[0427] 根据进一步的方面，提供本发明的抗体识别的分离构象表位，此种表位由单一表位或表位(包括表位变体)混合物组成，每个都被本发明的抗体识别。
[0428] 该表位具体的特征为：
[0429] a)金黄色葡萄球菌的LukGH复合物的三维结构，包括LukG的边缘域和接触氨基酸残基Asn71、Tyr73、Trp74、Asn206、Leu207、Trp208、Lys210、Asp211、Trp262和Phe267的结构坐标(structure coordinate)；或
[0430] b)a)的同系物的三维结构，其中所述同系物包括与接触氨基酸残基的骨架原子的均方根偏差在0.00A和2.00A之间的结合位点。
[0431] 特别地，该表位由结合分子结合或识别。
[0432] 根据进一步的方面，提供了一种特异性识别如此处描述的表位的结合分子，优选地选自由蛋白质、肽、模拟肽、核酸、碳水化合物、脂质、寡肽、适配体和小分子化合物组成的组，优选是抗体、它的抗体片段，该抗体片段包括至少一个含有结合位点的抗体域，或一融合蛋白，该融合蛋白包括至少一个含有结合位点的抗体域。特别地，该结合分子是识别金黄色葡萄球菌的LukGH复合物的特异性结合物。特别地，该结合物防止LukGH结合至靶细胞和与本发明的抗体竞争。
[0433] 根据进一步的方面，提供了一种鉴定结合物的筛选方法或试验，该结合物特异性识别此处所描述的表位，包括以下步骤：
[0434] -将候选化合物与如此处所描述的三维结构(具体表征构象表位)接触；及
[0435] -评估候选化合物与三维结构的结合，其中候选化合物与三维结构之间的结合鉴定候选化合物为识别金黄色葡萄球菌的LukGH复合物的特异性结合物。例如，候选化合物与三维结构或该表位之间的阳性功能结合反应鉴定该化合物为保护性结合物。
[0436] 根据进一步的方面，提供了一种免疫原，其包括：
[0437] a)如此处描述的表位，及
[0438] b)载体，优选是药学上可接受的载体，优选包含缓冲物质和/或佐剂物质。
[0439] 具体地，免疫原以疫苗制剂提供，优选用于肠胃外用途。
[0440] 具体地，此处描述的免疫原提供用于治疗主体，通过施用有效量的所述免疫原以保护主体免受金黄色葡萄球菌感染，或防止所述感染引发的病状，或抑制金黄色葡萄球菌肺炎发病。
[0441] 具体地，该免疫原用于引发保护性免疫应答。
[0442] 根据具体的方面，进一步提供一种治疗方法，其中存在金黄色葡萄球菌感染风险的主体被治疗，所述方法包括给主体施用有效量的免疫原，以防止主体感染，尤其是防范病原性金黄色葡萄球菌感染。
[0444] 图1：
[0445] 表1：LukGH特异性mAb的氨基酸序列
[0446] 图例：栏
[0447] A…SEQ ID VH FR1
[0448] B…SEQ ID VH CDR1
[0449] C…SEQ ID VH FR2
[0450] D…SEQ ID VH CDR2
[0451] E…SEQ ID VH FR3
[0452] F…SEQ ID VH CDR3
[0453] G…SEQ ID VH FR4
[0454] H…SEQ ID VL FR1
[0455] I…SEQ ID VL CDR4
[0456] J…SEQ ID VL FR2
[0457] K…SEQ ID VLCDR5
[0458] L…SEQ ID VL FR3
[0459] M…SEQ ID VLCDR6
[0460] N…SEQ ID VL FR4
[0461] 图1中使用的命名应具有以下意思：
[0462] VH CDR1＝CDR1
[0463] VH CDR2＝CDR2
[0464] VH CDR3＝CDR3
[0465] VL CDR4＝CDR4＝VL CDR1
[0466] VL CDR5＝CDR5＝VL CDR2
[0467] VL CDR6＝CDR6＝VL CDR3
[0468] 表1分成八部分(用于组1-8的抗体)：表1.1–1.8。
[0469] 表1.1a示出了组1抗体的VH FR和CDR序列；
[0470] 表1.1b示出了组1抗体的VL FR和CDR序列；
[0471] 表1.2a示出了组2抗体的VH FR和CDR序列；
[0472] 表1.2b示出了组2抗体的VL FR和CDR序列；
[0473] 表1.3a示出了组3抗体的VH FR和CDR序列；
[0474] 表1.3b示出了组3抗体的VL FR和CDR序列；
[0475] 表1.4a示出了组4抗体的VH FR和CDR序列；
[0476] 表1.4b示出了组4抗体的VL FR和CDR序列；
[0477] 表1.5a示出了组5抗体的VH FR和CDR序列；
[0478] 表1.5b示出了组5抗体的VL FR和CDR序列；
[0479] 表1.6a示出了组6抗体的VH FR和CDR序列；
[0480] 表1.6b示出了组6抗体的VL FR和CDR序列；
[0481] 表1.7a示出了组7抗体的VH FR和CDR序列；
[0482] 表1.7b示出了组7抗体的VL FR和CDR序列；
[0483] 表1.8a示出了组8抗体的VH FR和CDR序列；
[0484] 表1.8b示出了组8抗体的VL FR和CDR序列；
[0485] 表2：AB-32-9接触残基突变时对LukGH结合能(ΔΔG)的改变；
[0487] 图3：金黄色葡萄球菌LukG和LukH毒素序列
[0488] USA300TCH1516菌株(Genbank，登记号CP000730)的LukH核苷酸序列，SEQ ID 173；
[0489] USA300TCH1516菌株的LukH氨基酸序列，SEQ ID 174；
[0490] USA300TCH1516菌株的LukG核苷酸序列，SEQ ID 175；
[0491] USA300TCH1516菌株的LukG氨基酸序列，SEQ ID 176；
[0492] MRSA252菌株(Genbank，登记号BX571856)的LukH核苷酸序列，SEQ ID 177；
[0493] MRSA252菌株的LukH氨基酸序列，SEQ ID 178；
[0494] MRSA252菌株的LukG核苷酸序列，SEQ ID 179；
[0495] MRSA252菌株的LukG氨基酸序列，SEQ ID 180；
[0496] MSHR1132菌株(Genbank，登记号FR821777)的LukH核苷酸序列，SEQ ID 181；
[0497] MSHR1132菌株的LukH氨基酸序列，SEQ ID 182；
[0498] MSHR1132菌株的LukG核苷酸序列，SEQ ID 183；
[0499] MSHR1132菌株的LukG氨基酸序列，SEQ ID 184；
[0500] H19菌株(Patric，基因组ID 72956；Genbank，登记号ACSS01000001至ACSS01000063)的LukH核苷酸序列，SEQ ID 185；
[0501] H19菌株的LukH氨基酸序列，SEQ ID 186；
[0502] H19菌株的LukG核苷酸序列，SEQ ID 187；
[0503] H19菌株的LukG氨基酸序列，SEQ ID 188。
[0504] 图4：选定的LukGH mAb的结合亲和力
[0505] 图5：LukGH mAb的体外中和能力：在人嗜中性粒细胞样分化的HL-60细胞(A，B)或人嗜中性粒细胞(C)中毒前，将mAb在试验培养基中连续稀释并与重组LukGH_TCH1516(A)、LukGH_MRSA252(B)和LukGH_MSHR1132(C)预培养。培养4小时之后，采用细胞ATP水平的发光测量确定细胞活力。％毒素抑制采用以下公式计算：％抑制＝[(正常活性-抑制的活性)/(正常活性)]×100。对不相干抗原产生的人IgG1对照mAb被包括作为对照。
[0506] 图6：LukGH:AB-32-9复合物的结构，LukGH表示为灰色球体，接触残基为黑色球体，及AB-32-9的Fab片段的轻链为黑色的卡通，和重链为灰色卡通。
具体实施方式
[0507] 本发明中使用的词语“抗体”指的是由抗体域组成或包括抗体域的多肽或蛋白质，所述抗体域理解为具有或不具有连接序列的免疫球蛋白的重链与/或轻链的恒定域与/或可变域。如果多肽包含β-桶状结构，所述β-桶状结构由环序列连接的抗体域结构的至少两条β条带组成，则多肽理解为抗体域。抗体域可能具有天然结构或通过突变或衍生修饰，例如，修饰抗原的结合性质或任何其它性质，如稳定性或功能性，例如，与Fc受体FcRn与/或Fcγ受体结合。
[0508] 本发明使用的抗体具有结合一个或多个抗原或这些抗原的一个或多个表位的特异性结合位点，特别是包括单一可变抗体域如VH、VL或VHH的CDR结合位点，或可变抗体域对如VL/VH对的结合位点，包含VL/VH域对和恒定抗体域的抗体，如Fab、F(ab')、(Fab)2、scFv、Fv或全长抗体。
[0509] 本发明所使用的术语“抗体”特别指的是包含或由以下组成的抗体形式：单一可变抗体域，如VH、VL或VHH，或可变与/或恒定抗体域的组合，带或不带连接序列或铰链区，包括可变抗体域对，如VL/VH对，包含VL/VH域对和恒定抗体域或由VL/VH域对和恒定抗体域组成的抗体，如重链抗体、Fab、F(ab')、(Fab)2、scFv、Fd、Fv或全长抗体，例如IgG型的(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。词语“全长抗体”可用于指包含Fc域及其它天然抗体单体中通常发现的其它域的至少大部分的任何抗体分子。本发明使用此术语用于强调特定的抗体分子并非抗体片段。
[0510] 术语“抗体”应特别包括分离形式的抗体，其基本上无其它针对不同靶抗原的抗体或包含抗体域的不同结构安排。但是，分离抗体可能包含在组合制剂中，所述组合制剂包含分离抗体，例如，与至少一种其它抗体(如具有不同特异性的单克隆抗体或抗体片段)的组合。
[0512] 术语“抗体”进一步适用于具有不同物种来源序列(如鼠科动物和人源序列)的嵌合抗体。
[0513] 谈到抗体时使用的术语“嵌合”指的是那些抗体，其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分，与源自特定物种的抗体或属于特定类别的抗体中的对应序列同源，而该链的其余片段与另一物种或类别的对应序列同源。一般说来，轻链和重链的可变区都模拟源自一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定部分与源自另一种哺乳动物的抗体序列同源。例如，可变区利用来自非人宿主有机体的容易获得的B-细胞或杂交瘤，从目前已知的来源获得，与恒定区组合，所述恒定区源自，例如，人细胞制备物。
[0514] 术语“抗体”进一步适用于人源化抗体。
[0515] 谈及抗体时的术语“人源化”指的是具有抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点基本上源自非人类物种的免疫球蛋白，其中所述分子的其余免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构与/或序列。抗原结合位点可以包括融合到恒定域上的完整可变域或仅为接枝到可变域合适框架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或经修饰的，例如，被一个或多个氨基酸替换修饰，优选经修饰后更接近人免疫球蛋白。人源化抗体的某些形式保留了所有CDR序列(例如，人源化小鼠抗体包含了来自小鼠抗体的所有六个CDR)。其它形式相对于原抗体有一个或多个CDR被更改。
[0516] 术语“抗体”进一步适用于人抗体。
[0517] 谈及抗体时使用的术语“人”理解为包括具有源自人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不是人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，体外随机或定点突变或体内体细胞突变引入的突变)，例如，在CDR中。人抗体包括从人免疫球蛋白文库中分离的抗体或包括从动物转基因得到的一个或多个人免疫球蛋白的分离的抗体。
[0518] 术语“抗体”特别适用于任何类别或子类别的抗体。根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体可以分为抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的大类，这些中的几个可以进一步分为子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
[0519] 该术语进一步适用于单克隆或多克隆抗体，特别是重组抗体，该术语包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有抗体和抗体结构，例如，源自动物的抗体，所述动物如哺乳动物，包括人，包括来自不同来源的基因或序列，例如，嵌合、人源化抗体或杂交瘤衍生抗体。进一步的实例涉及从经转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，或从重组体、抗体或抗体域组合文库分离的抗体，或通过任何其它涉及将抗体基因序列剪接到其它DNA序列上的方法制备、表达、产生或分离的抗体。
[0520] 应该理解的是，术语“抗体”还指的是抗体的衍生物，尤其是功能活性衍生物。抗体衍生物理解为一种或多种抗体域或抗体与/或融合蛋白的任何组合，其中抗体的任何域可在一种或多种其它蛋白，如其它抗体的任何位置融合，如包含CDR环的结合结构、受体多肽，还有配体、支架蛋白、酶、毒素等。抗体的衍生物可通过各种化学方法，如共价偶联、静电相互作用、二硫键连接等与其它物质联合或结合而获得。与抗体结合的其它物质可以是脂类、糖类、核酸、有机和无机分子或它们的任何组合(例如PEG、前体药物或药物)。在具体实施例中，抗体是包含能够与生物学上可接受的化合物特异性相互作用的附加标记的衍生物。本发明可以使用的标记并没有特别的限制，只要其对抗体与它的目标的结合没有不良影响或不良影响可以忍受即可。合适的标记实例包括His-标记、Myc-标记、FLAG-标记、Strep-标记、钙调蛋白-标记、GST-标记、MBP-标记和S-标记。在本发明的另一个具体实施例中，抗体是包含标签的衍生物。此处使用的词语“标签”指的是可以检测到的化合物或组合物，其与抗体直接或间接缀合，从而产生“带标签”的抗体。标签可以是本身可以检测到的标签，例如，放射性同位素标签或荧光标签，或者，在酶标签的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物发生化学变化。
[0521] 本发明所描述的优选衍生物在抗原结合方面是功能活性的，及与非衍生的抗体相似，优选具有中和金黄色葡萄球菌的效力和/或是保护性抗体。
[0522] 衍生自亲本抗体或抗体序列的抗体，如亲本CDR或FR序列，在此处应特别理解为由例如在计算机模拟中或重组工程或由化学衍生或合成而获得的突变体或变体。
[0523] 具体地，衍生自本发明抗体的抗体可包括至少一种或多种CDR域或它的CDR变体，例如，重链可变域的至少3个CDR，和/或轻链可变域的至少3个CDR，在至少一个CDR或FR域至少有一个点突变，或在HC或LC的恒定域存在功能活性，例如，特异性结合由单独的LukG和LukH毒素组装形成的表位，从而，结合LukGH二聚体的表位。
[0524] 应当理解的是，术语“抗体”还指的是抗体的变体，包括具有亲本CDR序列的功能活性CDR变体的抗体，和亲本抗体的功能活性的变体抗体。
[0525] 术语“变体”应尤其指的是，例如，通过突变方法得到的抗体，如突变抗体或抗体片段，尤其是删除、交换、引入插入到特定抗体氨基酸序列中或区域中或化学衍生氨基酸序列，如在恒定区中，从而改造抗体稳定性、效应子功能或半衰期，或在可变域中，从而改善抗原结合性质，如通过本领域可以实现的亲和力成熟技术。可以采用本领域熟悉的任何突变方法，包括在期望位置处的点突变，如通过随机化技术获得。在某些情况下，位置是随机选择的，例如，采用任何可能的氨基酸或选择优选的氨基酸来随机化抗体序列。词语“突变”指的是本技术领域认可的改变多核苷酸或多肽序列的任何技术。优选的突变类型包括易错PCR突变、饱和突变或其它定点突变。
[0526] 术语“变体”应特别包括功能活性变体。
[0527] 本发明所使用的术语CDR序列的“功能活性变体”理解为“功能活性CDR变体”，本发明所使用的抗体的术语“功能活性变体”理解为“功能活性抗体变体”。功能活性变体指的是从该序列(亲本抗体或亲本序列)的修饰获得的序列，通过插入、删除或替换一个或多个氨基酸，或化学衍生氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，或核苷酸序列内的核苷酸，或在序列的任一远端或两个远端处的，例如，在CDR序列的N-端和/或C-端的1、2、3或4氨基酸，和/或中心的1、2、3或4氨基酸(即在CDR序列的中间)，所述修饰并不影响(尤其是不损害)此序列的活性。在对选定的靶抗原具有特异性的结合位点的情况下，抗体的功能活性变体将仍然具有预定的结合特异性，虽然这可能会改变，例如，以改变特定表位的优异特异性、亲和力、亲合力、Kon或Koff率等。例如，亲和力成熟的抗体被特别理解为功能活性变体抗体。因此，亲和力成熟的抗体内的修饰的CDR序列被理解为功能活性CDR变体。进一步的修饰可通过突变发生，例如，拓宽交叉-特异性以靶向LukGH复合物或LukGH二聚物的更多变体，或进一步的毒素或毒素组分大过亲本抗体，或提高它的反应性。
[0528] 特别的，本发明抗体的功能活性变体具有结合至LukGH复合物或LukGH二聚物的结合位点，这将在此进一步描述。功能活性的其它指示应是LukG、LukH或LukGH复合物中任一个与细胞膜尤其是与磷酸胆碱的竞争性结合。
[0529] 功能活性优选在试验中确定，该试验用于确定抗体抵抗溶细胞毒素的中和效力，例如，通过在标准试验中测量对所给毒素敏感的细胞的增强的活力或功能性来确定。例如，如果抗体在基于细胞的试验中具有体外的中和效力，IC50小于100:1mAb:毒素比例(mol/mol)，优选是小于50:1，优选是小于25:1，优选是小于10:1，更优选是小于1:1，那么，功能活性被确定。中和通常能够通过有抗体或无抗体的活细胞的百分率表示。对于高效抗体，表达中和效力的优选的方式是抗体:毒素摩尔比，其中较低的数值对应于较高的效力。低于10的值定义为高功能活性。可选地，在最严格的试验中，数值是在1和10之间。
[0530] 功能活性变体可以通过以下方法得到：例如通过改变亲本抗体的序列，例如，列于表1(图1)或图2中的抗体，包括结合位点，即结合位点由CDR域形成，或由VH和VL域形成，其亲本抗体或序列的特征是特异性结合至LukGH，但除结合位点之外在抗体区内进行修饰，或源自这样的亲本抗体，通过在结合位点内的不损害抗原结合的修饰，并且优选具有与亲本抗体类似的生物活性，包括结合金黄色葡萄球菌毒素的能力和/或中和金黄色葡萄球菌的特异性效力，例如，具有基本上相同的生物活性，如采用靶向金黄色葡萄球菌或金黄色葡萄球菌毒素的特异性结合试验或功能性测试所确定的。
[0531] 具体地，将以下CDR序列中的任何一个，或一个或多个以下的CDR序列进行修饰，以包括以下：
[0532] a)在VH CDR1的7位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是E、F、H、I、K、L、M、R、V、W或Y中的任何一个，及更优选的是E、F、M、W或Y中的任何一个；和/或
[0533] b)在VH CDR2的1位，氨基酸残基选自N、A、D、E、F、H、L、S、T、V和Y，优选是F、H或Y中的任何一个；和/或
[0534] c)在VH CDR2的3位，氨基酸残基选自Y、H、T和W；和/或
[0535] d)在VH CDR2的5位，氨基酸残基选自S、A、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是N、R或W中的任何一个；及更优选的是N或W；和/或
[0536] e)在VH CDR2的7位，氨基酸残基选自S、D、F、H、K、L、M、N、R和W；和/或[0537] f)在VH CDR2的9位，氨基酸残基选自Y、D、E、F、N、S和W，优选是D或H，及更优选的是H；和/或
[0538] g)在VH CDR3的4位，氨基酸残基选自R、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V和W，优选是D或H；和/或
[0539] h)在VH CDR3的5位，氨基酸残基选自G、A、F和Y；和/或
[0540] i)在VH CDR3的6位，氨基酸残基选自M、E、F、H和Q，优选是F或H；和/或
[0541] j)在VH CDR3的7位，氨基酸残基选自H、A、D、E、F、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、W和Y，优选是E、K、Q、R、W或Y中的任何一个，及更优选是W或Y；和/或
[0542] k)在VL CDR4的7位，氨基酸残基选自由N、A、D、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、W和Y组成的组，优选是F、L、W或Y中的任何一个，及更优选是L或W；和/或
[0543] l)在VL CDR4的8位，氨基酸残基选自S、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W和Y，优选是I或W；和/或
[0544] m)在VL CDR4的9位，氨基酸残基选自Y、F、R和W，及优选是R或W；和/或
[0545] n)在VL CDR5的1位，氨基酸残基选自A、G、S、W和Y，及优选是G；和/或
[0546] o)在VL CDR6的4位，氨基酸残基选自F、H、M、W和Y；和/或
[0547] p)在VL CDR6的5位，氨基酸残基选自D、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；和/或
[0548] q)在VL CDR6的8位，氨基酸残基选自F、H、R和W。
[0549] 本文使用的术语“基本上相同的生物活性”指的是基本上相同的生物活性显示为相当的或亲本抗体确定的活性的至少20％、至少50％、至少75％、至少90％，例如，至少100％，或至少125％，或至少150％，或至少175％，或如达到200％。
[0550] 本文中所描述的优选的变体或衍生物是关于抗原结合的功能活性，优选是具有特异性结合单个毒素的效力，且不显著结合至非目标毒素的其它抗原，例如，具有的Kd值差异是至少2log，优选是至少3log。通过功能活性变体结合的抗原是通常不受损的，相当于与亲本抗体或序列或包括序列变体的抗体大约基本上相同的亲和力，例如，具有的Kd值差异小于2log，优选小于3log，然而，具有甚至改良的亲和力的可能，例如，具有的Kd值差异是至少1log，优选是至少2log。
[0551] 由LukGH复合物的特异性靶定确定的功能活性特别地进一步的特征是LukGH复合物的优先结合超过单个毒素LukG和LukH。可以明确地证明，与结合至任何一个或两个的分开的(单体的)LukG或LukH相比，本发明抗体对异源二聚体或低聚LukGH抗原的结合大大提高，例如，特点是至少1或2log差异的差分亲和力或Kd。
[0552] 在一个优选的实施例中，亲本抗体的功能活性变体：
[0553] a)是抗体的生物活性片段，所述片段包括该分子序列的至少50％，优选至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或至少95％，及最优选至少97％、98％或99％；
[0554] b)源自至少一个氨基酸替换、增加和/或删除的抗体，其中功能活性变体与该分子或分子的一部分具有序列一致性，例如抗体一致性为至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，及最优选至少97％、98％或
99％；和/或
99％；和/或
[0555] c)由抗体或它的功能活性变体及另外至少一个与多肽或核苷酸序列异源的氨基酸或核苷酸组成。
[0556] 在本发明一个优选的实施例中，根据本发明抗体的功能活性变体基本上与上面描述的变体相同，但是，与它的多肽或核苷酸序列分别不同，不同之处在于它是源自不同物种的同源序列。这些都称为天然变体或类似物。
[0557] 词语“功能活性变体”还包括天然存在的等位变体，以及突变体或任何其它非天然存在的变体。正如本技术领域熟悉的那样，等位变体是一种(多)肽替代形式，其特征在于替换、删除或增加一个或多个氨基酸，这些氨基酸基本上不改变多肽的生物功能。
[0558] 功能活性变体可通过多肽或核苷酸序列中的序列改变而得到，例如，通过一个或多个点突变，其中，当与本发明结合使用时，所述序列改变保留或改善了未改变多肽或核苷酸序列的功能。此种序列改变包括但不限于，(保守)替换、增加、删除、突变和插入。
[0559] 具体的功能活性变体是CDR变体。CDR变体包括CDR区中被至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是氨基酸序列的化学或部分改变，所述修饰使变体保留未修饰序列的生物学特性。CDR氨基酸序列的部分改变可以是删除或替换一个至几个氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸，或增加或插入一个至几个氨基酸，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或通过化学衍生一个至几个氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸，或它们的组合。氨基酸残基的替换可以是保守替换，例如，以一个疏水氨基酸替换另一个疏水氨基酸。
[0560] 保守替换是那些在与它们的侧链和化学性质方面相关的氨基酸家族内发生的替换。这些氨基酸家族的实例有具有碱性侧链的、具有酸性侧链的、具有非极性脂肪族侧链的、具有非极性芳香族铡链的、具有不带电极性侧链的、具有小侧链的及具有大侧链的氨基酸等。
[0561] 点突变尤其理解为多核苷酸改造，其导致不同于非改造氨基酸序列的氨基酸序列的表达，不同之处在于一个或多个单(不连续)或双联氨基酸替换或交换、删除或插入成为不同的氨基酸。
[0562] 优选的点突变指的是相同极性和/或电荷的氨基酸的交换。在这方面，氨基酸指的是由六十四个三联体密码子编码的20种天然氨基酸。这20种氨基酸可以分成具有中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸：
[0563] “中性”氨基酸及其它们各自的三字母和单字母的代码和极性如下所，：
[0564] 丙氨酸：(Ala，A)非极性，中性；
[0565] 天冬酰胺：(Asn，N)极性，中性；
[0566] 半胱氨酸：(Cys，C)非极性，中性；
[0567] 谷氨酰胺：(Gln，Q)极性，中性；
[0568] 甘氨酸：(Gly，G)非极性，中性；
[0569] 异亮氨酸：(Ile，I)非极性，中性；
[0570] 亮氨酸：(Leu，L)非极性，中性；
[0571] 蛋氨酸：(Met，M)非极性，中性；
[0572] 苯丙氨酸：(Phe，F)非极性，中性；
[0573] 脯氨酸：(Pro，P)非极性，中性；
[0574] 丝氨酸：(Ser，S)极性，中性；
[0575] 苏氨酸：(Thr，T)极性，中性；
[0576] 色氨酸：(Trp，W)非极性，中性；
[0577] 酪氨酸：(Tyr，Y)极性，中性；
[0578] 缬氨酸：(Val，V)非极性，中性；及
[0579] 组氨酸：(His，H)极性，正电荷(10％)，中性(90％)。
[0580] 带“正”电荷的氨基酸有：
[0581] 精氨酸：(Arg，R)极性，带正电荷；及
[0582] 赖氨酸：(Lys，K)极性，带正电荷。
[0583] 带“负”电荷的氨基酸有：
[0584] 天冬氨酸：(Asp，D)极性，带负电荷；及
[0585] 谷氨酸：(Glu，E)极性，带负电荷。
[0586] 关于本文描述的抗体序列和同系物的“氨基酸序列一致性的百分数(％)”被定义为，为了得到最大的序列一致性百分数，在比对序列和引入缺口后(如果需要的话)，候选序列中与特定多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数，不考虑将任何保守替换作为序列一致性的一部分。熟悉本领域的技术人员能够确定衡量比对的合适参数，包括相对于被比较的全长序列实现最大比对所需的任何算法。
[0587] 抗体变体特别理解为包括同系物、类似物、片段、具有特定糖基化形式的修饰或变体，例如，通过糖工程产生的，其是功能性的和可以作为功能等同物，例如，与特定靶标结合和具有功能性质。本发明所描述的优选变体在抗原结合方面是功能活性的，优选具有中和金黄色葡萄球菌的效力和/或是保护性抗体。
[0588] 本发明的抗体可以具有或不具有Fc效应子功能。虽然作用模式主要是通过中和抗体调节，并没有Fc效应子功能，但是，Fc可以募集补体，通过形成免疫复合物，帮助从循环内消除靶抗原，如毒素。
[0589] 特异性抗体可以缺少活性Fc部分，因此，由不含抗体Fc部分或不包含Fcγ受体结合位点的抗体域组成，或包括缺乏Fc效应子功能的抗体域，例如，通过修饰以减少Fc效应子功能，特别是，消除或降低ADCC与/或CDC活性。可以通过改造替代抗体，掺入修饰，以增加Fc效应子功能，尤其是增强ADCC和/或CDC活性。
[0590] 这种修饰受到突变的影响，例如，Fcγ受体结合位点中的突变，或通过衍生物或试剂干扰抗体形式的ADCC和/或CDC活性，从而实现减少或增加Fc效应子功能。
[0591] Fc效应子功能的显著降低通常理解为指的是通过ADCC与/或CDC活性测定的Fc效应子功能低于未修饰(野生型)形式的10％，优选低于5％。
[0592] Fc效应子功能的显著增加通常理解为指的是通过ADCC和/或CDC活性测定的Fc效应子功能的增加是未修饰(野生型)形式的至少10％，优选至少是20％、30％、40％或50％。
[0593] 关于抗体序列的术语“糖基化改造”变体应指的是糖基化变体，因糖基化改造而具有改进的免疫原性或免疫调节(如抗炎)性能、ADCC和/或CDC。所有抗体在重链恒定区的保守位置处含有糖类结构，每个同种型具有N-连接糖类结构的不同排列，可变地影响蛋白质组装、分泌或功能活性。IgG1型抗体是在每个CH2域中Asn297处具有保守的N-连接糖基化位点的糖蛋白。与Asn297连接的两个复合双头低聚糖埋藏在CH2域之间，与多肽骨架形成广泛的接触，它们的存在对抗体调节效应子功能是必不可少的，例如，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。通过突变N297，例如，突变为A，或突变T299，脱除在N297处的N-聚糖，通常得到ADCC下降的无糖基化抗体形式。特别的，本发明的抗体是糖基化的或糖基化改造的，或无糖基化抗体。
[0594] 抗体糖基化的主要区别存在于细胞系之间，甚至在不同培养条件下培养的给定细胞系也会出现小的区别。菌细胞中的表达通常提供无糖基化抗体。具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)(催化平分型GlcNAc形成的糖基转移酶)的四环素调节表达的CHO细胞，，据报道具有改善的ADCC活性(Umana et al.,1999,Nature Biotech.17:176-180)。除宿主细胞的选择之外，影响重组产生抗体期间糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养密度、氧合作用、pH、纯化方案等。
[0595] 术语“抗原结合位点”或“结合位点”指的是抗体参与抗原结合的部分。抗原结合位点是由重链(“H”)与/或轻链(“L”)N-端可变(“V”)区或其可变域的氨基酸残基形成的。重链和轻链V区内的三个高度不同的延伸，被称为“高变区”，插在较保守的侧翼延伸(被称为框架区)之间。抗原结合位点提供与结合的表位或抗原的三维表面互补的表面，高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。并入CDR中的结合位点在本发明中亦称为“CDR结合位点”。
[0596] 具体地，本文提及到的CDR序列被理解为根据Kabat命名法所确定的抗体的那些氨基酸序列。(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,U.S.Department of Health and Human Services.(1991))。
[0597] 本发明所用术语“抗原”可与术语“靶标”或“靶抗原”互换，指的是由抗体结合位点识别的整个靶分子或此类分子的片段。具体地，抗原的子结构，例如，多肽或糖类结构，通常称为“表位”，例如，B-细胞表位或T-细胞表位，这些表位是与免疫相关的，可由这样的结合位点识别。
[0598] 本发明所用的术语“表位”应特别指的是完全构成抗体结合位点的特异性结合伴侣或特异性结合伴侣一部分的分子结构。表位可以是由糖类、肽结构、脂肪酸、有机物质、生化物质或无机物质组成或是它们的衍生物和它们的任何组合。如果表位包括在肽结构中，如肽、多肽或蛋白质中，它通常包括至少3个氨基酸，优选是5至40个氨基酸，更优选是大约10-20个氨基酸。表位可以是线性或构象表位。线性表位由多肽或糖链的一级序列的单片段组成。线性表位可以是连续的或重叠的。
[0599] 构象表位由氨基酸或糖类组成，这些氨基酸或糖类通过折叠多肽形成三级结构而聚集在一起，且在线性序列中，氨基酸不必彼此相邻。特别是，相对于多肽抗原，构象或非连续表位的特征在于存在两个或多个在一级序列中被分开的两个或多个离散氨基酸残基，但是，当多肽折叠成天然蛋白质/抗原时，离散氨基酸残基在分子表面上组装形成一致的结构。特别的，构象表位是由一系列氨基酸残基组成的表位，这些氨基酸残基在排列中是非线性的，也就是残基沿着多肽序列的长度以非连续的方式隔开或分组。此类构象表位的特征在于，通过接触氨基酸残基和/或结晶分析所确定的具有特定结构坐标的三维结构，所述结晶分析如由特异性抗体或Fab片段结合的表位的免疫复合物形成的晶体的分析。
[0600] 具体地，对表位有贡献的结合残基在本发明中理解为接触氨基酸残基。
[0601] 结构坐标通常理解为源于与模型相关的数学方程的笛卡尔原子坐标，该模型由晶型的抗原或免疫复合物的原子(即散射中心)的X射线的单色光束的衍射获得，。衍射数据被用来计算晶体的重复单元的电子密度图。然后使用电子密度图建立表位的单独的原子，如由特异性抗体或Fab结合的。应该理解的是，抗原的一组结构坐标是一组相对点，其限定了三维形状。单独坐标的微小变化将对整体形状影响甚微。对于本发明的目的，当叠加在由抗原的结构坐标描述的相关骨架原子上时，任何三维结构具有保守的残留骨架原子的均方根偏差在0.00A和2.00A之间时，视为相同或实质上是相同的。对于本发明的目的，即使在单独的坐标中出现细微变化，但如果这些细微变化不影响由结构坐标限定的整体形状，结构坐标被认为是相同或基本相同。
[0602] 本发明所描述的抗体能特异性识别LukG毒素的边缘域，尤其是LukG复合LukH毒素形成的LukGH复合物。边缘域理解为并列至宿主细胞质膜的外叶的毒素的域，该边缘域包含于细胞膜结合中。因此，边缘域充当膜固着点。位于边缘地区或边缘域的本发明抗原靶定的表位，从而有成为与免疫相关(immuneorelevant)的可能，即通过主动或被动免疫疗法与保护相关。
[0603] 基于本发明的鉴定的表位，另外提供相应互补位是可行的，如本发明抗体的互补位，如识别表位的全长抗体的一部分、抗体的抗原结合位点。抗体的Fv区的15-22个氨基酸通常是小区。这种互补位可以并入合适的支架中，以获得支架型分子，如融合蛋白或人工支架，以获得具有所需的交叉反应结合特性的特异性结合物或结合分子。
[0604] 本发明使用的术语“结合分子”理解为特异性识别靶标，特别是对靶毒素具有交叉特异性的表位-结合分子或抗原-结合分子。结合分子的具体的例子选自由蛋白质、肽、模拟肽(peptidomimetic)、核酸、糖、脂质、寡肽、适配体和小分子化合物组成的组，优选是抗体、它的抗体片段，该抗体片段包括至少一个纳入结合位点的抗体域，或一融合蛋白，该融合蛋白包括至少一个纳入结合位点的抗体域。
[0605] 例如，结合分子可以选自合适的结合物库，如抗体库，或其他化合物或支架的库，如DARPins、热重复蛋白质、ARM重复蛋白质、三十四肽重复蛋白质和基于天然重复蛋白的其它支架，采用合适的筛选方法选择以获得候选化合物，其进一步以它的结合特性为特征。
[0606] 术语“表达”应按下述方式理解。含有如本发明抗体的表达产物的期望的编码序列和控制序列(如可操作连接的启动子)的核酸分子可用于表达目的。利用这些序列转化或转染的宿主能够产生编码的蛋白质。为了引发转化，表达系统可以包括在载体中；然而，相关DNA也可以整合至宿主染色体内。特别是，该词语指的是宿主细胞和相容的载体在合适条件下，例如，通过载体携带的外源DNA且引入到宿主细胞内，表达编码的蛋白质。
[0607] 编码DNA是一种DNA序列，其编码特定多肽或蛋白质(如抗体)的特定氨基酸序列。启动子DNA是引发、调节，或者介导或控制编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以来自同一基因或不同基因，可以来自同一有机体或不同有机体。重组克隆载体通常包括一种或多种用于克隆或表达的复制系统、一种或多种用于在宿主中选择的标记(如抗生素抗性)，及一种或多种表达盒。
[0608] 此处使用的词语“载体”被定义为用于在合适的宿主有机体中转录克隆重组核苷酸序列(即，重组基因)和翻译它们的mRNA所必需的DNA序列。
[0609] “表达盒”指的是对在规定限制位点处可插入到载体内的表达产物进行编码的DNA编码序列或DNA片段。表达盒限制位点设计用于确保表达盒插在合适的阅读框内。通常，外源DNA在载体DNA的一个或多个限制位点处插入，然后，随同可转移载体DNA一起由载体携带进入到宿主细胞内。具有插入或增加DNA(如表达载体)的DNA片段或序列也可以称为“DNA构建体”。
[0610] 表达载体包括表达盒和另外通常包括宿主细胞内的自主复制起始点或基因组整合位点、一个或多个可选择标记(例如，氨基酸合成基因或抗生素(如博来霉素、卡那霉素、G418或潮霉素)抗性基因)、若干个限制性酶切位点、合适的启动子序列和转录终止子，这些组分是可操作地连接在一起的。本发明所用术语“载体”包括自主复制核苷酸序列以及基因组整合核苷酸序列。载体的常见类型是“质粒”，其通常是双链DNA的自包含分子，容易接受额外的(外源)DNA和容易被引入到合适的宿主细胞内。质粒载体通常包含编码DNA和启动子DNA，及具有一个或多个适合插入外源DNA的限制位点。具体地，术语“载体”或“质粒”指的是一种媒介物，DNA或RNA序列(例如，外源基因)通过该媒介物可以被引入到宿主细胞内，以转化宿主并促进引入序列的表达(例如，转录和翻译)。
[0611] 本发明所使用的术语“宿主细胞”应指的是经转化产生特定重组蛋白质(如本发明所述的抗体)的原代主体细胞，及其任何子代。应该理解的是，并非所有子代都与亲本细胞完全相同(由于有意或无意的突变或环境差异)，然而，只要子代保留了与原转化细胞相同的功能，这些改变的子代包含于这些术语中。术语“宿主细胞系”指的是用于表达重组基因以产生重组多肽如重组抗体的宿主细胞的细胞系。此处使用的术语“细胞系”指的是已经获得了长期增殖能力的特定细胞类型的已建立的克隆。这种宿主细胞或宿主细胞系可以维持在细胞培养物中和/或经培养以产生重组多肽。
[0612] 对组合物(例如免疫原组合物)的“免疫应答”在本发明中也称为“免疫原”(包含此处描述的抗原或表位，或疫苗)，该“免疫应答”是在宿主或主体中引发针对目标组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，这种应答由主体产生的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞组成，特异性地针对包括在目标组合物或疫苗中的一种或多种抗原。
[0613] “保护性免疫应答”理解为与未免疫群体相比，提供显著较好的诱导或自然感染或毒素挑战结果的免疫应答。针对毒素的保护性免疫应答主要通过具有高亲和力的中和抗体介导，例如，Kd小于10-8M。毒素中和的好处是靶细胞的保护和炎症的防止。通过从循环中(通过RES细胞)清除毒素，Fc介导的免疫复合物形成也有一些贡献。
[0614] 免疫原或免疫原组合物通常包括抗原或表位和载体，其特别是可以包含佐剂。术语“佐剂”指的是一化合物，当其与抗原一起施用时增强和/或重新定向对抗原的免疫应答，但当单独施用时，对抗原并不会产生免疫应答。佐剂可以通过几种机制增强免疫应答，包括淋巴细胞募集、刺激B细胞和/或T细胞及刺激巨噬细胞。示例性载体有脂质体或阳离子肽；示例性佐剂有磷酸铝或氢氧化铝、MF59或CpG寡核苷酸。
[0615] 本发明中使用的关于核酸、抗体或其它化合物的术语“分离的”或“分离”应指的是已经与其自然相关的环境充分分离，从而以“基本上纯”的形式存在的化合物。“分离的”并不一定排斥与其它化合物或材料的人工或合成混合物，或不干扰基本活性的杂质的存在，及例如由于不完全纯化可能存在的杂质。具体地，本发明的分离核酸分子也有意包括那些非天然的，例如，密码子优化的核酸或cDNA，或化学合成的核酸分子。
[0616] 同样地，本发明的分离的抗体特别地是非天然的，例如，以与另一抗体组合制备提供的，该组合在自然界中不存在(如与一个或多个单特异性抗体和/或识别至少两种不同靶标的交叉特异性抗体的组合)或天然抗体的优化或亲和力-成熟的变体，或具有被改造以提高抗体可制造性的框架区的抗体。
[0617] 关于本发明的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。该术语应用于DNA时，指的是在其起源有机体的天然基因组中从与其紧邻的序列分离的DNA分子。例如，一“分离的核酸”可包括插入到载体内的DNA分子，如质粒或病毒载体，或整合到原核或真核细胞或宿主有机体的基因组DNA内的DNA分子。当应用于RNA时，术语“分离的核酸”主要指的是由上文定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。或者，该术语指的是在它的自然状态(即在细胞中或组织中)从与其缔合的其它核酸充分分离的RNA分子。“分离的核酸”(DNA或RNA)进一步指的是采用生物或合成手段直接产生并在其生产期间从其它组分分离的分子。
[0618] 关于多肽或蛋白质，如本发明的分离抗体或表位，术语“分离的”特别指的是不含或基本不含与它们自然相关的材料，如在其自然环境中，或其制备环境(如细胞培养)中发现的其它化合物，当这种制备是采用重组DNA技术在体外或体内进行时。分离的化合物可以采用稀释剂或佐剂配制，但对于实际用途仍然是分离的–例如，当用于诊断或疗法时，多肽或多核苷酸可以与药学上可接受的载体或赋形剂混合。
[0619] 本发明使用的术语“LukGH复合物”应指的是二聚体或低聚体，包括LukG和LukH组分1:1的二聚体，或任何其它比例的LukG和LukH组分，优选包括至少1LukG组分和至少1LukH组分的复合物，或至少2、或至少3或至少4的任一LukG或LukH组分或LukG和LukH两种组分。本发明中的LukGH二聚体理解为一分子LukG和一分子LukH的异源二聚体，特别是通过静电或亲水/疏水相互作用在溶液中聚集。出人意料地发现，LukH和LukG在溶液中形成复合物，不需与靶细胞相接触。
[0620] 本发明所用术语“中和”或“中和作用”在广义上使用，指的是抑制病原体的任何分子，不考虑实现中和的机制，如抑制金黄色葡萄球菌感染主体，或抑制病原体通过产生有效的蛋白质毒素促进感染，或抑制毒素损害主体的靶细胞。中和可以例如通过抑制金黄色葡萄球菌毒素与其同源受体在靶细胞上的结合与/或相互作用的抗体而实现。在某些实施例中，此处描述的抗体可以中和毒素活性，其中毒素和靶细胞(如红血细胞)之间相互作用的体内和体外效果被降低或消除。中和可以通过抑制活性毒素的形成而进一步发生，例如，在金黄色葡萄球菌LukGH复合物的情况下，通过抑制LukG和LukF抗原的相互结合，或抑制LukGH二聚体或低聚体与靶细胞结合，或抑制细胞膜内的低聚物细孔的形成。
[0621] 抗体抗溶细胞毒素的中和效力通常采用标准试验确定，通过测量对给定毒素敏感的细胞的活力或功能性的增加确定。中和可以以有抗体和无抗体时活细胞的百分数表示。对于高效抗体，优选的表示中和效力的方式是抗体:毒素摩尔比，其中数值越低相当于效力越高。数值在10以下表明效力高，然而数值在1以下表明效力非常高。
[0622] 本发明使用的术语“交叉中和”应指的是中和若干毒素，例如，纳入LukGH复合物的表位的毒素，所述LukGH复合物是表达不同的LukGH变体的至少2种，优选至少3种，或至少4种或至少3种不同的金黄色葡萄球菌菌株的LukGH复合物，该表位被本发明的抗体识别。这样的表位流行于不同的LukGH复合物变体中，也称为“可交叉反应性”的表位。
[0623] 术语“金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)”或“金黄色葡萄球菌(S.aureus)”或“病原性金黄色葡萄球菌”应按下述方式理解。金黄色葡萄球菌通常在人和动物的皮肤上或鼻子内发现。这种细菌通常是无害的，除非它们通过切口或其它伤口进入体内。一般说来，在健康的人中，感染是微小的皮肤问题。过去，感染采用广谱抗生素治疗，如甲氧西林。然而，现在，已经出现了一些耐甲氧西林和其它β-内酰胺抗生素如青霉素和头孢菌素的菌株。它们被称为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(也称为多重耐药性金黄色葡萄球菌，或“MRSA”)。
[0624] 金黄色葡萄球菌，一种重要的人类病原体，表达多种分泌毒素(外毒素)。这些毒素可以攻击各种宿主细胞类型，包括红细胞、中性粒细胞和其它免疫细胞，以及肺或皮肤的上皮细胞。金黄色葡萄球菌毒素的主要成员是α溶血素(Hla)，其对淋巴细胞、巨噬细胞、肺上皮细胞和肺内皮细胞有溶细胞的功能。
[0625] 金黄色葡萄球菌感染，包括MRSA，通常一开始是出现与丘疹、疖子或蜘蛛咬伤类似的红色小肿块。这些肿块或疤痕会迅速转为需要手术引流的痛苦的深度脓肿。有时候，细菌停留只限于皮肤上。有时候，它们会深入到体内，在广泛的人体组织，包括皮肤、软组织、骨、关节、手术伤口、血流、心瓣膜、肺或其它器官中引发可能威胁生命的感染。因此，金黄色葡萄球菌感染会引起与其有关的病症，这些病症可能是致命的疾病，如坏死性筋膜炎、心内膜炎、败血症、菌血症、腹膜炎和中毒性休克综合症，及各种形式的肺炎，包括坏死性肺炎，及疖病和痈病中的毒素产生。MRSA感染在医院或疗养院环境中尤其麻烦，在那里的病人存在开放性伤口、侵入器械及免疫系统弱化的风险或倾向于发生这些情况，因此，比普通大众存在更大的感染风险。
[0626] 中和金黄色葡萄球菌毒素的抗体干扰病原体和致病性反应，因此能够限制或防止感染和/或减轻由这种感染引起的病症，或抑制金黄色葡萄球菌发病，特别是肺炎、腹膜炎、骨髓炎、菌血症和败血症发病。在这一点上，此处的“保护性抗体”理解为负责在主动或被动免疫中对观察到的传染物免疫的中和抗体。特别是，此处描述的保护性抗体能够中和分泌的毒力因子(外毒素)的毒性效应(如溶细胞、靶细胞的促炎性细胞因子表达的诱导)并因此干扰金黄色葡萄球菌的致病潜力。
[0627] 本发明使用的术语“重组”应指的是“由基因工程制备或基因工程的结果”。重组宿主特别包括表达载体或克隆载体，或其已经通过基因改造而包含重组核酸序列，尤其是采用对宿主是外源的核苷酸序列。重组蛋白通过在宿主内表达相应的重组核酸产生。本发明使用的术语“重组抗体”包括采用重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，如(a)从转基因或染色体转移得到人免疫球蛋白基因的动物(如小鼠)分离的抗体，或从其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞(如来自转染瘤)分离的抗体，(c)从重组体、组合人抗体库分离的抗体，及(d)采用包括剪接人免疫球蛋白基因序列到其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。这种重组抗体包括经改造而包括例如在抗体成熟期间发生的重排和突变的抗体。
[0628] 本发明使用的术语“特异性”或“特异性结合”指的是分子异质群体中目标同源配体的决定性的结合反应。因此，在指定条件下(例如，免疫试验条件下)，抗体特异性结合至其特定靶，并不以显著量与样本中存在的其它分子结合。特异性结合指的是，在靶标身份方面，结合是选择性的，根据选择，具有高、中或低的结合亲和力或亲合力。与其它抗原相比，如果结合常数或结合动力学相差至少10倍(理解为至少1log差异)，优选相差至少100倍(理解为至少2log差异)，更优选相差至少1000倍(理解为至少3log差异)，通常达到选择性结合。
[0629] 术语“特异性”或“特异性结合”也理解为应用于结合至一个或多个分子的结合物，例如交叉特异性结合物。优选交叉特异性(也称为多特异性或交叉反应性)结合物靶向至少两种不同的抗原或靶向在至少两种不同的抗原上的交叉反应性表位，尤其是以大体上相似的结合亲和力结合抗原，例如，结合亲和力至少相差100倍，或甚至相差少于10倍。
[0630] 例如，交叉特异性抗体能够与携带交叉反应性表位的各种抗原结合。抗体的此类结合位点或及具有结合至少两种不同的抗原或至少两种不同抗原的交叉反应性表位的特异性的抗体也分别称为多特异性或交叉特异性结合位点和抗体。例如，抗体可以具有多特异性结合位点，与交叉反应多个不同抗原的表位特异性结合，这些不同抗原在表位内具有序列同源性与/或结构类似性，以提供结构基本上相同的构象表位，例如，交叉反应至少两种不同LukGH复合物变体。
[0631] 抗体的免疫特异性、其结合能力和抗体对交叉反应性结合序列表现出的的伴随亲和力，由与抗体发生免疫反应(结合)的交叉反应性结合序列决定。交叉反应性结合序列特异性(至少部分)可以由免疫球蛋白重链可变区的氨基酸残基、抗体与/或轻链可变区氨基酸残基序列定义。
[0632] 术语“具有相同的特异性”、“具有相同的结合位点”或“结合相同的表位”指的是相当的单克隆抗体表现出相同的或基本相同的，即类似的免疫反应(结合)特性，竞争结合预先选定的靶结合序列。用于特定靶标的抗体分子的相对特异性可以通过竞争试验相对确定，例如，在Harlow,et al.,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988中所描述的试验。
[0633] 本发明使用的术语“主体”应指的是温血哺乳动物，特别是人类或非人动物。MRSA是至关重要的人病原体，其在兽医中也引起了人们的关注。它广泛存在于非人动物物种中。因此，术语“主体”还特别指的是包括狗、猫、兔子、马、牛、猪和家禽的动物。尤其是，本发明的医学用途或各种处理方法应用于需要预防或治疗与金黄色葡萄球菌感染相关的病症的主体。主体可以是存在金黄色葡萄球菌感染风险的患者或患有疾病(包括早期或晚期疾病)的患者。术语“患者”包括接受预防性或治疗性疗法的人和其它哺乳动物主体。因此，术语“治疗”指包括预防性和治疗性治疗。
[0634] 对主体例如进行治疗，以预防或治疗金黄色葡萄球菌病症。特别是，对处于感染风险或发展出此类疾病或疾病复发的主体，或患有此类感染和/或与此类感染有关疾病的主体进行治疗。
[0635] 具体地，术语“预防”指的是包括防止发病的开始的防止措施或降低发病风险的预防措施。
[0636] 具体地，本发明所描述的治疗、防止或延迟主体疾病状况的方法，是通过干扰作为所述状况的致病因子的金黄色葡萄球菌发病，其中发病包括在主体细胞膜上形成孔的步骤，例如，通过特定毒力因子或毒素。
[0637] 本发明使用的术语“毒素”应指α-毒素(Hla)和金黄色葡萄球菌的双组分毒素。应该明确理解的是，由本发明抗体靶定的毒素是这样的毒素，例如可溶性单体毒素或如金黄色葡萄球菌表达的成孔毒素的形式，或毒素组分，如双组分毒素的组分。因此，此处使用的术语“毒素”应指具有免疫相关表位的毒素或毒素组分两者。
[0638] 金黄色葡萄球菌的毒力是多种毒力因子组合的结果，包括使细菌粘附到真核细胞膜上的表面相关蛋白质、防止其调理吞噬的荚膜多糖，及几种外毒素。金黄色葡萄球菌主要通过产生分泌的毒力因子，如溶血素、肠毒素和中毒性休克综合征毒素引发疾病。这些分泌的毒力因子通过钝化宿主体内的许多免疫机制而抑制免疫应答，并引起组织破坏和帮助建立感染。后者由一组成孔毒素完成，其中最重要的是Hla，这是金黄色葡萄球菌肺炎的关键毒力因子。
[0639] 金黄色葡萄球菌产生多种其它毒力因子和毒素，这些毒力因子和毒素可以使这种细菌能够抵消及经受不同种免疫细胞的攻击，特别是构成体内主要防御系统的白细胞亚群的攻击。这些毒力因子和毒素的产生使金黄色葡萄球菌能够维持感染状态。在这些毒力因子中，金黄色葡萄球菌产生LukG和LukH杀白细胞素抗原。
[0640] 杀白细胞素对哺乳动物细胞的毒性包括两种组分的作用。第一种亚基被称为S类组分，第二种亚基被称为F类组分。S亚基和F亚基协同作用，以在白细胞上形成孔，所述白细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞(统称为吞噬细胞)。γ-溶血素，尤其是HlgAB和HlgA-LukD也作用于红细胞以及LukED作用于T细胞上。已知金黄色葡萄球菌产生的双组分白细胞毒素的库包括F组分和S组分的同源和非同源对，例如，γ-溶血素、PVL毒素和类PVL毒素，包括HIgAB、HIgCB、LukSF、LukED、LukGH、LukS-HlgB、LukSD、HIgA-LukD、HIgA-LukF、LukG-HlgA、LukEF、LukE-HlgB、HIgC-LukD或HIgC-LukF。
[0641] 本发明使用的术语“基本上纯”或“纯的”应指的是包含至少50％(w/w)，优选至少60％、70％、80％、90％或95％的化合物(如核酸分子或抗体)的制备物。纯度采用适合于该化合物的方法测定(例如，色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、HPLC分析等)。
[0642] 化合物例如本发明的抗体或免疫原所使用的术语“治疗有效量”与术语“有效量”或“足量”可以互换，它是施用于主体时足够产生有益或预期结果(包括临床结果)的量或活性，因此，有效量或它的同义词取决于其使用的语境。
[0643] 有效量意指足以治疗、预防或抑制此类疾病或紊乱的化合物的量。在疾病语境中，此处所描述抗体的治疗有效量特别用以治疗、调节、减弱、逆转或影响疾病或状况，该疾病或状况得益于金黄色葡萄球菌或金黄色葡萄球菌发病机理的抑制。
[0644] 与这种有效量对应的化合物的量将根据各种因素而变化，例如给定的药物或化合物、药物配方、给药途径、疾病或紊乱类型、被治疗的主体或宿主的身份等，但是，还是熟悉本领域的技术人员可常规确定的。
[0645] 本发明的抗体或免疫原可预防性地使用于抑制金黄色葡萄球菌感染发作，或治疗性地用于治疗金黄色葡萄球菌感染，特别是例如众所周知难治的MRSA等金黄色葡萄球菌感染，或在特定主体情况下，已证明用其它传统抗生素疗法难治的金黄色葡萄球菌感染。
[0646] 本发明所描述抗体的治疗有效量，例如提供给需要它的人患者的，可以特别是在0.5-50mg/kg的范围内，优选是5-40mg/kg，甚至更优选是多达20mg/kg、多达10mg/kg、多达
5mg/kg，虽然，例如治疗急性病症时，可能指示较高的剂量。
5mg/kg，虽然，例如治疗急性病症时，可能指示较高的剂量。
[0647] 此外，具有治疗有效量的本发明抗体的主体的治疗或预防方案可由单次施用组成或包括一系列应用。例如，抗体可以至少每年施用一次，至少半年施用一次或至少一个月施用一次。但是，在另一个实施例中，对于给定处理，主体从大约每周一次至大约每天一次施用抗体。处理期的长短取决于各种因素，例如，疾病的严重程度、是急性还是慢性疾病、患者的年龄、抗体形式的浓度和活性。还应该领会的是，在特定治疗或预防方案期间，用于治疗或预防的有效剂量可以增加或减少。剂量的变化可以由本领域熟知的标准诊断试验导致和变得明显。在某些情况下，需要长期给药。
[0648] 本发明所描述的免疫原的有效量，例如提供给存在患上与金黄色葡萄球菌感染有关病症风险的患者的，可特别是1-20mg/kg每剂量的范围。
[0649] 例如，根据初免-加强免疫方案，免疫原可作为第一剂施用，然后在某一时间框内施用一次或多次加强剂量，以诱导对金黄色葡萄球菌感染的持久的、有效的免疫应答。优选的接种疫苗计划将包括施用三剂，例如，第0天施用第1剂，在第5-40天施用第2剂，在第10-100天施用第3剂，优选是在第0天、28天和90天施用。根据优选的加快计划，可在第0天、7天和14天进行施用。加快计划可用于预防，例如，对于面临择期手术的患者。通常明矾被作为佐剂使用，例如，作为磷酸盐或氢氧化物。
[0650] 根据一个具体的方面，本发明在此提供了如附图中详细说明的示例性抗体，和进一步的抗体变体，特别是包括结合至基本上相同的表位的变体，作为亲本抗体，其特点是由VH和VL氨基酸序列，或由图2中的HC和LC氨基酸序列形成的特异性结合位点，或由此类VH/VL域形成的结合位点。这些抗体可以是例如通过修饰亲本抗体各CDR或抗体序列获得的功能活性变体抗体。应该理解的是，此处描述的任何抗体序列被认为是接受变动的“亲本”序列，例如通过点突变。
[0651] 示例性亲本抗体在以下实施例部分和图1和图2中有描述。指定为#AB-29、#AB-30、#AB-31、#AB-32、#AB-33、#AB-34、#AB-35和#AB-36的抗体被例如用作亲本抗体，以产生具有一个或多个修饰的CDR序列的功能活性CDR变体，和具有一个或多个修饰的FR序列的功能活性抗体变体，例如，FR1、FR2、FR3或FR4序列，或恒定区序列，和/或具有一个或多个修饰的CDR序列。通过突变衍生自亲本抗体的变体抗体示例如下(见图1)。这些变体抗体结合至靶抗原，因此，被认为是功能活性的。变体VH或VL域或变体HC或LC链也是可行的，例如，在各FR或CDR序列中具有修饰的可被使用，其是功能活性的。此处描述的抗体的一些FR或CDR序列可以与其它抗体的那些FR或CDR序列交换，这也是可行的，例如，列于图1中的抗体。
[0652] 具体地，任何指定为#AB-30-3、#AB-31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-15的抗体，或其任何功能活性变体，可以采用此处提供的序列通过重组手段产生，任选地采用进一步的免疫球蛋白序列，例如，以产生IgG抗体。
[0653] 其它抗体变体是可行的，其包含相同的结合位点。具体地，提供了一抗体，该抗体包括图2抗体的可变区，或至少一个CDR序列，优选是至少2个，至少3个，至少4个，至少5个或至少6个CDR序列，或其功能活性CDR变体。更具体地说，提供了指定为#AB-30-3、#AB-31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-15的抗体，其特点是提供的序列如图2所示。这些抗体对改造功能活性抗体变体特别有用，例如，以改善他们的亲和力、稳定性和可制造性。
[0654] 在某些方面，本发明提供了这样的功能活性变体抗体，优选是单克隆抗体，最优选是人抗体，包括重链和轻链，其中重链或VH可变区或各CDR中的任何一个包含衍生自亲本抗体的氨基酸序列，其是指定为#AB-30-3、#AB-31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-15的抗体的其中一个，通过修饰至少一个FR或CDR序列。
[0655] 在某些方面，本发明提供了这样的功能活性变体抗体，优选是单克隆抗体，最优选是人抗体，包括重链和轻链，其中轻链或VL可变区或各CDR中的任何一个包含衍生自亲本抗体的氨基酸序列，其是指定为#AB-30-3、#AB-31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-15的抗体的其中一个，通过修饰至少一个FR或CDR序列。
[0656] 在某些方面，本发明提供了这样的功能活性变体抗体，优选是单克隆抗体，最优选是人抗体，包括重链和轻链，其中重链和轻链的任一或VH/VL可变区或各CDR包含衍生自亲本抗体的氨基酸序列，其是指定为#AB-30-3、#AB-31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-15的抗体的其中一个，通过修饰至少一个FR或CDR序列。
[0657] 在某些方面，本发明还提供了这样的功能活性变体抗体，包括衍生自上述亲本抗体的各结合序列，如可变序列和/或CDR序列，其中，该结合序列或该CDR包含的序列与衍生自亲本抗体的氨基酸序列有至少60％，优选至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％，或至少99％一致性，及其中，变体是功能活性变体。
[0658] 特别地，功能活性由结合至LukGH复合体的特异性和亲和力所决定，任选地相对于单独的LukG或LukH抗原中任何一个的结合，优先结合LukGH复合体，例如，通过结合至与各亲本抗体相同的表位或基本相同的表位。
[0659] 抗体被认为是“结合到相同表位”或“包含相同结合位点”或具有“本质上相同的结合”特性，如果抗体交叉竞争，使得在给定的时间点，只有一个抗体能结合到表位，即，一个抗体防止其他抗体的结合或调节作用。
[0660] 本文关于抗体所使用的术语“竞争”或“交叉竞争”指的是第一抗体或其抗原结合部分结合到表位的方式，与第二抗体或其抗原结合部分结合的方式充分相似，使得在第二抗体存在的情况下，第一抗体与其同源表位的结合结果比不存在第二抗体时第一抗体的结合可检测地下降。或者，在第一抗体存在时，第二抗体对其表位的结合也是可检测地下降，可能是这情况，但不一定是这情况。就是说，第一抗体能抑制第二抗体结合到其表位，而第二抗体不会抑制第一抗体结合到其各表位。然而，当每个抗体可检测地抑制其它抗体结合到其同源表位时，不论是抑制到相同、更大或更低程度，这些抗体都被称为是，为了结合到它们的各表位而相互“交叉竞争”的。竞争和交叉竞争抗体都包含在本发明中。
[0661] 本发明的竞争指的是通过竞争ELISA分析或ForteBio分析确定，例如在具体实施例部分中描述的，相对抑制大于大约30％。设定更高的相对抑制阀值，作为在特定环境下竞争的合适水平的标准是理想的，例如，当竞争分析是用于选择或筛选新抗体时，该新抗体被设计成具有结合金黄色葡萄球菌额外的或其它的毒素的预期功能。因此，例如，可以为竞争性结合设定标准，其中在抗体被认为是充分的竞争前，检测到至少40％的相对抑制，或至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或甚至至少100％的相对抑制。
[0662] 正如本发明中所描述的，在一方面，本发明提供了抗体分子，其特征是，例如，有能力与指定为#AB-30-3、#AB-31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-15抗体中的任何一个竞争结合LukGH复合物或异源二聚体。
[0663] 本发明优选的抗体以高亲和力结合所述单独抗原，特别是具有高的结合速率和/或低的解离速度，或高的结合亲合力。抗体的结合亲和力通常以抗体的浓度为特征，在该浓度下，一半的抗原结合位点被占据，被称为解离常数(Kd或KD)。通常，Kd＜10-8M，优选地，Kd＜10-9M，甚至更优选地，Kd＜10-10M，结合物被认为是高亲和力的结合物。
[0664] 但是，在一具体优选的实施例中，单独抗原结合亲和力是中等亲和力，例如，当与至少两个抗原结合时，例如，Kd小于10-6M而高达10-8M。
[0665] 根据本发明，可以提供中等亲和力的结合物，优选地，如果需要，连同亲和力成熟过程。
[0666] 亲和力成熟是产生对目标抗原具有增加的亲和力的抗体的过程。为了根据本发明公开的不同实施例而产生亲和力成熟的抗体，可以采用任何一种或多种方法来制备和/或使用本领域可获得的亲和力成熟库。典型的这类亲和力成熟的方法和使用，例如随机突变、细菌增变株传代、定点诱变、突变热点靶标、简约突变(parsimonious mutagenesis)、抗体改组、轻链改组、重链改组、CDR1和/或CDR1突变，以及适合于实施根据本发明此处公开的不同实施例的方法和用途的产生和使用亲和力成熟文库的方法，包括，例如，那些在以下文献中有公开的：Prassler et al.(2009)；Immunotherapy,Vol.1(4),pp.571-583；Sheedy et al.(2007),Biotechnol.Adv.,Vol.25(4),pp.333-352；WO2012/009568；WO2009/036379；WO2010/105256；US2002/0177170；WO2003/074679。
[0667] 随着抗体结构的变化，包括氨基酸突变或作为免疫球蛋白基因片段体细胞突变的结果，产生和选择出较大亲和力的抗原结合位点的变体。亲和力成熟的抗体的亲和力比亲本抗体大几个对数倍。单一亲本抗体可经历亲和力成熟。或者，与靶抗原具有类似结合亲和力的抗体池可以被看作亲本结构，该亲本结构经过变化以获得亲和力成熟的单一抗体或这些抗体的亲和力成熟的池。
[0668] 根据本发明，优选的亲和力成熟的抗体变体展示出增加至少2倍的结合亲和力，优选至少增加5倍，优选至少增加10倍，优选至少增加50倍，或优选至少增加100倍。
[0669] 在采用各亲本分子文库的筛选活动过程中，可以采用具有中等亲和力的抗体的亲和力成熟，以获得本发明具有结合亲和力Kd<10-8M的特异性靶结合性质的抗体。或者，通过依据本发明的抗体的亲和力成熟，亲和力甚至可以得到更大的提高，以获得对应于Kd小于10-9M的高值，优选小于10-10M，或甚至小于10-11M，最优选处于皮摩尔范围。
[0670] 在某些实施例中，结合亲和力由一亲和力ELISA分析确定。在某些实施例中，结合亲和力由BIAcore、ForteBio或MSD分析确定。在某些实施例中，结合亲和力由动力学方法确定。在某些实施例中，结合亲和力由平衡/溶液法确定。
[0671] 吞噬效应细胞可以通过采用补体活化的另一种途径活化。与微生物表面抗原结合的抗体利用它们的Fc区吸引补体级联的第一组分，并启动“经典”补体系统的活化。这导致刺激吞噬效应细胞，通过补体依赖的细胞毒性(CDC)，吞噬效应细胞最终杀灭靶标。
[0672] 根据一具体实施例，采用标准ADCC或CDC试验确定，在免疫效应细胞存在下，本发明的抗体具有细胞毒活性。与对照相比，如果细菌溶解百分数明显增加，这表明本发明抗体具有ADCC或CDC试验确定的细胞毒活性。与ADCC或CDC相关的细胞毒活性优选测定为绝对百分数增加，优选高于5％，更优选高于10％，甚至更优选高于20％。补体结合可能是特定相关的，这个机制通过移除形成的免疫复合体，可以消除来自感染位点或血液中的毒素。
[0673] 根据一具体实施例，本发明的抗体具有由IgG的Fc部分发挥的免疫调节功能。增加例如在终端半乳糖残基上的唾液酸化作用含量的改造的糖基化，通过DC-SIGN信号传导可能有抗炎作用。相对于Ia、IIa和III Fcγ受体，对Fcγ受体IIb的优先结合(抑制的)，可能提供了抗炎作用。
[0674] 本发明具体提供了交叉反应抗体，该交叉反应抗体通过鉴定具有多重特异性的中和抗体过程获得，例如，通过交叉反应发现选择方案(cross-reactive discovery selection scheme)。因此，包括能与两个靶标(靶标A和B)反应的抗体的抗体库，可首先对与靶标中的一个(如，靶标A)的反应性进行选择，然后，对与其它靶标(如，靶标B)的反应性进行选择。每个连续选择的循环加强了所得池对两个靶标的反应强度。因此，这个方法对鉴定具有针对两种不同靶标的交叉反应性，并且具有交叉中和病原体潜能的抗体特别有用。
通过包括对额外靶标的富集的额外循环，这个方法可以延伸至鉴定对其它靶标具有反应性的抗体。
通过包括对额外靶标的富集的额外循环，这个方法可以延伸至鉴定对其它靶标具有反应性的抗体。
[0675] 在一些情况下，交叉反应抗体通过针对单个抗原的筛选出现。为了增加分离交叉反应性克隆的可能性，人们会通过针对多个抗原的进展性筛选以采用多重选择压力。具体的mAb选择策略是以交替的方式采用不同的毒素组分。例如，测试中和LukGH mAb用于与从不同的菌株获得的LukGH复合物结合。
[0676] 采用图3中各序列通过重组技术产生的重组毒素或从金黄色葡萄球菌培养上清液中分离的毒素可以用于从抗体库中筛选抗体，例如，酵母展示抗体库，例如：Blaise L、Wehnert A、Steukers MP、van den Beucken T、Hoogenboom HR、Hufton SE.Construction and diversification of yeast cell surface displayed libraries by yeast mating：application to the affinity maturation of Fab antibody
fragments.Gene.2004Nov 24；342(2):211-8；Boder ET,Wittrup KD.Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries.Nat
Biotechnol.1997Jun；15(6):553-7；Kuroda K,Ueda M.Cell surface engineering of yeast for applications in white biotechnology.Biotechnol Lett.2011Jan；33(1):
1-9.doi:10.1007/s10529-010-0403-9.Review；Lauer TM,Agrawal NJ,Chennamsetty N,Egodage K,Helk B,Trout BL.Developability index:a rapid in silico tool for the screening of antibody aggregation propensity.J Pharm Sci.2012Jan；101(1):102-
15；Orcutt K.D.and Wittrup K.D.(2010),207-233doi:10.1007/978-3-642-01144-3_15；
Rakestraw JA,Aird D,Aha PM,Baynes BM,Lipovsek D.Secretion-and-capture cell-surface display for selection of target-binding proteins.Protein Eng Des Sel.2011Jun；24(6):525-30；美国专利No.6,423,538；美国专利No.6,696,251；美国专利No.6,699,658；已发布的PCT申请公布No.WO2008118476。
fragments.Gene.2004Nov 24；342(2):211-8；Boder ET,Wittrup KD.Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries.Nat
Biotechnol.1997Jun；15(6):553-7；Kuroda K,Ueda M.Cell surface engineering of yeast for applications in white biotechnology.Biotechnol Lett.2011Jan；33(1):
1-9.doi:10.1007/s10529-010-0403-9.Review；Lauer TM,Agrawal NJ,Chennamsetty N,Egodage K,Helk B,Trout BL.Developability index:a rapid in silico tool for the screening of antibody aggregation propensity.J Pharm Sci.2012Jan；101(1):102-
15；Orcutt K.D.and Wittrup K.D.(2010),207-233doi:10.1007/978-3-642-01144-3_15；
Rakestraw JA,Aird D,Aha PM,Baynes BM,Lipovsek D.Secretion-and-capture cell-surface display for selection of target-binding proteins.Protein Eng Des Sel.2011Jun；24(6):525-30；美国专利No.6,423,538；美国专利No.6,696,251；美国专利No.6,699,658；已发布的PCT申请公布No.WO2008118476。
[0677] 在任一情况下，采用本领域已知的抗体优化方法可以进一步改善交叉反应性。例如，本发明描述的免疫球蛋白链的可变区的某些区域可接受一种或多种优化策略，包括轻链改组、目的诱变(destinational mutagenesis)、CDR融合以及选定CDR和/或框架区的定向突变。
[0678] 鉴定具有所需的中和特性的抗体的筛选方法可以是抑制毒素结合到靶细胞、抑制二聚体或低聚物的形成、抑制孔的形成、抑制细胞溶解、抑制细胞因子、淋巴因子和任何促炎信号的诱导，和/或抑制动物的体内作用(死亡、溶血、过度炎症、器官功能障碍)。可基于直接结合至所需的毒素来评估反应性，例如，采用标准试验。
[0679] 具有所需的特性的中和或交叉中和抗体一经鉴定，抗体识别的优势表位或多表位就可确定。表位作图的方法在本领域中是已知的，并且已公开，例如，在Epitope Mapping:A Practical Approach,Westwood and Hay,eds.,Oxford University Press,2001中。
[0680] 表位作图涉及抗体结合的表位的鉴定。本领域技术人员已知用于确定蛋白上表位位置的许多方法，包括抗体-抗原复合物的晶体学分析、竞争试验、基因片段表达试验和基于合成肽的试验。“结合相同表位”的抗体作为参照抗体在此处应以如下方式理解。当两个抗体识别的表位是相同的或空间上重叠的表位时，这些抗体被称为结合相同的或本质上相同的或基本上相同的表位。确定两个抗体是否结合到相同的或空间上重叠的表位，常用的方法是竞争试验，其可以配置成许多不同的形式，采用标记的抗原或标记的抗体。通常，抗原是固定在96-孔板上的，且采用放射性标记或酶标记来测量未标记抗体阻断标记抗体结合的能力。
[0681] 一旦鉴定了具有所需的中和或交叉中和特性的抗体，这些抗体，包括抗体片段都可通过本领域已知的方法产生，包括，例如，杂交瘤技术或重组DNA技术。
[0682] 在杂交瘤方法中，小鼠或其它合适的宿主动物，如仓鼠，经免疫以诱发淋巴细胞，该淋巴细胞产生或能够产生能特异性结合至用于免疫的蛋白质的抗体。或者，淋巴细胞可以体外免疫。然后，采用合适的融合剂，如聚乙二醇，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
[0683] 对杂交瘤细胞生长的培养基进行分析，测定针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀法或通过体外结合试验如放射免疫法(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)进行确定。
[0684] 重组单克隆抗体可以，例如，通过分离编码所需抗体链的DNA并转染具有用于表达的编码序列的重组宿主细胞而产生，可以采用已知的重组表达载体，例如，本发明的质粒或包括编码抗体序列的核苷酸序列的表达盒。重组宿主细胞可以是原核细胞和真核细胞，如前文所述的那些细胞。
[0685] 根据具体的方面，核苷酸序列可用于基因操作，以对抗体进行人源化或改善亲和力，或抗体的其它特点。例如，恒定区可以经改造，使其与人恒定区更类似，如果抗体在临床试验中使用和治疗人类时，这样可以避免免疫应答。基因操作抗体序列，以获得对靶毒素更大的亲和力及抗金黄色葡萄球菌的更大效力，这是令人满意的。对于本领域技术人员来说，对抗体作出一种或多种多核苷酸改变，却仍然保持其对靶毒素的结合能力，这是显而易见的。
[0686] 采用各种方法产生抗体分子，通常是人们易于理解的。例如，美国专利6331415(Cabilly et al.)描述了一种抗体的重组产生的方法，其中重链和轻链从单一载体或从单一细胞中两个独立的载体同时表达。Wibbenmeyer et al.,(1999,Biochim Biophys Acta1430(2):191-202)和Lee and Kwak(2003,J.Biotechnology 101:189-198)描述了采用大肠杆菌分离培养物中表达的质粒，从分开产生的重链和轻链生产单克隆抗体。与抗体产生有关的其它各种技术在，例如，Harlow,et al.,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)中有提供。
[0687] 如果需要，本发明的抗体，例如指定为#AB-30-3、#AB-31、#AB-32-6、#AB-34、#AB-34-6、#AB-30-8、#AB-32-9、#AB-34-14或#AB-34-15的任一抗体可以测序，及接着将多核苷酸序列克隆到载体中表达或增殖。编码抗体的序列可保留在宿主细胞的载体内，然后将宿主细胞扩增并冷冻起来备用。通过本领域已知的手段，可以通过将B细胞的抗体基因进行克隆，实现在细胞培养中产生重组单克隆抗体。
[0688] 另一方面，本发明提供一种分离核酸，所述分离核酸包括编码产生本发明重组抗体的序列。
[0689] 另一方面，本发明提供一种分离核酸，该核酸包括编码产生本发明重组表位或包括本发明这种表位的分子的序列。但是，本发明的表位也可以合成产生，例如，采用本领域已知的合成方法的任何一种产生。
[0690] 抗体或表位编码核酸可以具有任何合适的特性和包括任何合适的特点或其组合。因此，例如，抗体或表位编码核酸可以是DNA、RNA或它们的杂合物的形式，并可以包括非天然碱、修饰骨架，例如，促进核酸稳定性的硫代磷酸酯骨架，或它们两者。核酸有利地可掺入到本发明的表达盒、载体或质粒中，包括促进靶宿主细胞内期望的表达、复制和/或选择的特点。这些特点的实例包括复制起始点组分、选择基因组分、启动子组分、增强子元件组分、聚腺苷酸化序列组分、终止组分等众多已知的合适的实例。
[0691] 本发明进一步提供了重组DNA构建体，该重组DNA构建体包括此处描述的一种或多种核苷酸序列。这些重组构建体与载体一同使用，例如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体，编码任何公开的抗体的DNA分子插入其中。
[0692] 通过培养基中的连续细胞系，采用产生抗体分子的任何方法产生单克隆抗体。制备单克隆抗体的合适方法的实例包括Kohler等人的杂交瘤方法(1975,Nature 256:495-497)和人B细胞杂交瘤方法(Kozbor,1984,J.Immunol.133:3001；以及Brodeur et al.,
1987,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,(Marcel
Dekker,Inc.,New York),pp.51-63)。
1987,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,(Marcel
Dekker,Inc.,New York),pp.51-63)。
[0693] 此外，本发明提供药物组合物，该药物组合物包括本发明所描述的抗体或免疫原及药学上可接受的载体或赋形剂。这些药物组合物可以依照本发明以推注或输液或持续输液的方式施用。适合辅助这些施用手段的药物载体是本领域所熟知的。
[0694] 药学上可接受的载体通常包括与本发明提供的抗体或相关组合物或组合在生理学上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的其它实例包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，也可以是它们的任何组合。
[0695] 在这一方面，抗体可与适合要求给药途径的一种或多种载体组合，抗体可以，例如，与任何的乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯树胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和任选进一步的片剂化或胶囊化用于传统给药。或者，抗体可以溶于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧基甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黄蓍胶和/或各种缓冲剂。其它载体、佐剂和给药方式是药学领域所熟知的。载体可以包括控释材料或时间延迟材料，如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯单独使用或与蜡一起使用，或本领域熟悉的其它材料。
[0696] 其它药学上可接受的载体是本领域所熟知的，而且，例如，在REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES中有描述。液体配方可以是溶液、乳液或悬浮液，并可以包括赋形剂，如悬浮剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。
[0697] 药物组合物是预期的，其中配制了本发明的抗体或免疫原及一种或多种治疗活性剂。将具所需纯度的所述免疫球蛋白与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，配制本发明抗体或免疫原的稳定制剂，以冻干制剂或水溶液的形式贮存。体内给药使用的配方特别地是无菌的，优选是无菌水溶液形式。通过无菌过滤膜或其它方法过滤，很容易完成。本发明公开的抗体和其它治疗活性剂也可以配制为免疫脂质体，和/或装在微胶囊中。
[0698] 包含本发明抗体或免疫原的药物组合物可以采用各种方式进行给药，包括口服、皮下、静脉内、鼻内、囊内(intraotically)、经皮、粘膜、局部给药，例如，凝胶、软膏、洗液、乳膏等，腹膜内、肌肉内、肺内给药，例如，采用可吸入技术或肺部递送系统，阴道、肠胃外、直肠或眼内给药。
[0699] 用于肠胃外给药的示例性配方包括那些适合皮下、肌肉内或静脉注射的配方，例如，无菌溶液、乳液或悬浮液。
[0700] 在一个实施例中，本发明的抗体或免疫原是给主体施用的唯一的治疗活性剂，例如，作为疾病改善或预防单药治疗。
[0701] 在另一个实施例中，本发明的抗体或免疫原与其它混合的抗体或免疫原组合，例如，组合成混合物或各部分的试剂盒，以靶向金黄色葡萄球菌，使得这样的混合物含有多于一种施用于主体的治疗活性剂，例如，作为疾病改善或预防组合治疗。
[0702] 或者，本发明的抗体或免疫原与一种或多种其它治疗剂或预防剂组合施用，包括但不限于标准处理，例如，抗生素、炎症的类固醇和非类固醇抑制剂，和/或基于其它抗体的疗法，如采用抗菌剂或消炎剂。
[0703] 一种组合疗法特别地采用标准方案，例如，用于治疗MRSA感染。这种方案可包括抗生素，例如替加环素(tygecycline)、利奈唑胺、甲氧西林和/或万古霉素。
[0704] 在组合疗法中，抗体作为混合物施用，或伴随一种或多种其它治疗方案施用，例如，在伴随疗法之前、同时或之后施用。
[0705] 在某些情况下，免疫原的预防性给药可以采用包括本发明免疫原的疫苗，即单价疫苗。然而，可以采用包括不同免疫原的多价疫苗，以诱导针对相同或不同靶标病原体的免疫应答。
[0706] 本发明抗体、免疫原或各药物制剂的生物学特性可以在细胞、组织和整个有机体的离体实验中进行表征。正如本领域熟知的，药物通常在动物体内测试，包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪和猴子，以测量药物对治疗疾病或疾病模型的效力，或测量药物的药代动力学、药效动力学、毒性和其它特性。动物可被称为疾病模型。治疗通常在小鼠中测试，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲入和敲除)。此类实验可以为抗体作为治疗或预防潜力的确定提供有意义的数据，包括合适的半衰期、效应子功能、(交叉-)中和活性和/或基于主动或被动免疫疗法的免疫应答。任何有机体，优选哺乳动物，可用于测试。例如，由于与人的遗传相似性，灵长类动物、猴子可以是合适的治疗模型，从而可用于测试主题试剂或组合物的效力、毒性、药代动力学、药效动力学、半衰期或其它特性。作为药物，在人体内的测试最终需要获得批准，因此，当然需要计划这些实验。因此，本发明的抗体、免疫原和各药物组合物可以在人体内测试，以确定它们的治疗效力或预防效力、毒性、免疫原性、药代动力学与/或其它临床特性。
[0707] 本发明还提供本发明的主题抗体用于诊断目的，例如，在检测和定量确定生物流体样本内的毒素或作为免疫试剂的抗体或靶标的浓度的方法中使用。
[0708] 本发明还提供检测生物样本(如体液)内的毒素水平或金黄色葡萄球菌感染程度的方法，包括将样本与本发明的抗体接触的步骤。本发明的抗体可以在任何已知的试验方法中使用，如竞争结合试验、直接和间接夹心试验、免疫沉淀反应试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)。
[0709] 根据本发明，所使用的体液包括主体的生物样本，如组织提取物、尿、血、血清、粪便和痰。
[0710] 在一个实施例中，所述方法包括在允许抗体附着到固体支持物表面的条件下，采用与靶标(如由本发明抗体靶向的至少一种毒素)特异性形成复合物的过量的某种类型的抗体片段接触固体支持物。然后，将得到的抗体附着其上的固体支持物与生物流体样本接触，从而使生物流体中的靶标与抗体结合，形成靶标-抗体复合物。该复合物可以采用可检测的标记作标签。或者，靶标或抗体可以在形成复合物之前加标签。例如，可以检测的标记(标签)可以与抗体缀合。接着，可以检测和定量确定该复合物，从而检测和定量确定生物流体样本中靶标的浓度。
[0711] 针对具体应用，本发明的抗体与标签或报告分子缀合，该标签或报告分子选自由有机分子、酶标记、放射性标记、有色标记、荧光标记、显色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、金属络合物、金属、胶体金以及它们的混合物组成的组。与标签或报告分子缀合的抗体可用于，例如，试验系统或诊断方法，例如，用于诊断金黄色葡萄球菌感染或与其有关的病症。
[0712] 本发明的抗体可以与其它分子缀合，可以在，例如，结合试验(如ELISA)和结合研究中简单检测出所述缀合。
[0713] 本发明的另一个方面提供一种包括抗体的试剂盒，所述试剂盒除包括一种或多种抗体之外，还包括各种诊断剂或治疗剂。试剂盒也可以包括诊断方法或治疗方法的使用说明书。这样的说明书可以，例如，提供在包含于试剂盒的器械上，例如，工具或器械，以制备用于诊断目的的生物样本，如在确定各毒素以诊断疾病之前分离包含细胞和/或蛋白质的部分。有利地，这种试剂盒包括抗体和诊断剂或可在本发明所描述的一种或多种诊断方法中使用的试剂。在另一个优选的实施例中，试剂盒包括抗体，例如，冻干形式的抗体，与药学上可接受的载体的组合，可在使用之前将它们混合，以形成用于短期给药的注射组合物。
[0714] 具体地，指定为#AB-29的抗体的特征在于具有如图1所示的氨基酸序列，及进一步的特征在于具有图2中所列的HC和LC序列，其中，HC序列被鉴定为SEQ ID 147，及LC序列被鉴定为SEQ ID 148。特别地，VH CDR序列被鉴定为CDR1SEQ ID 2、CDR2SEQ ID 4和CDR3SEQ ID 6，及VH FR序列被鉴定为FR1SEQ ID 1、FR2SEQ ID 3、FR3SEQ ID 5和FR4SEQ ID 7。VL CDR序列被鉴定为CDR4SEQ ID 9、CDR5SEQ ID 11和CDR6SEQ ID 13，及VL FR序列被鉴定为FR1SEQ ID 8、FR2SEQ ID 10、FR3SEQ ID 12、和FR4SEQ ID 14。
[0715] 具体地，指定为#AB-30的抗体的特征在于具有如图1所示的氨基酸序列，及进一步的特征在于具有图2中所列的HC和LC序列，其中，HC序列被鉴定为SEQ ID 149，及LC序列被鉴定为SEQ ID 150。特别地，VH CDR序列被鉴定为CDR1SEQ ID 26、CDR2SEQ ID 28和CDR3SEQ ID 30，及VH FR序列被鉴定为FR1SEQ ID 25、FR2SEQ ID 27、FR3SEQ ID 29和FR4SEQ ID 31。VL CDR序列被鉴定为CDR4SEQ ID 32、CDR5SEQ ID 33和CDR6SEQ ID 35，及VL FR序列被鉴定为FR1SEQ ID 18、FR2SEQ ID 20、FR3SEQ ID 34和FR4SEQ ID 14。
[0716] 指定为#AB-30-3和#AB-30-8的抗体变体是#AB-30的功能活性变体，其特征在于具有如图1所示的氨基酸序列，特别地各VH或HC序列，及进一步的VL或LC序列，包括如图1所描述的FR和CDR序列，及进一步的特征在于，具有如图2所列HC和LC序列。
[0717] 指定为#AB-31的抗体，其特征在于具有如图1所示的氨基酸序列，及进一步的特征在于，具有如图2所列HC和LC序列，其中HC序列被鉴定为SEQ ID 155，及LC序列被鉴定为SEQ ID 156。特别地，VH CDR序列被鉴定为CDR1SEQ ID 47、CDR2SEQ ID 49和CDR3SEQ ID 51，及VH FR序列被鉴定为FR1SEQ ID 46、FR2SEQ ID 48、FR3SEQ ID 50和FR4SEQ ID 52。VL CDR序列被鉴定为CDR4SEQ ID 53、CDR5SEQ ID 21、和CDR6SEQ ID 54，及VL FR序列被鉴定为FR1SEQ ID 18、FR2SEQ ID 20、FR3SEQ ID 22和FR4SEQ ID 14。
[0718] 具体地，指定为#AB-32的抗体的特征在于具有如图1所示的氨基酸序列，及进一步的特征在于，具有如图2所列HC和LC序列，其中HC序列被鉴定为SEQ ID 157，及LC序列被鉴定为SEQ ID 158。具体地，VH CDR序列被鉴定为CDR1SEQ ID 71、CDR2SEQ ID 72和CDR3SEQ ID 73，及VH FR序列被鉴定为FR1SEQ ID 1、FR2SEQ ID 3、FR3SEQ ID 5和FR4SEQ ID 74。VL CDR序列被鉴定为CDR4SEQ ID 75、CDR5SEQ ID 41、和CDR6SEQ ID 76，及VL FR序列被鉴定为FR1SEQ ID 18、FR2SEQ ID 20、FR3SEQ ID 34和FR4SEQ ID 14。
[0719] 指定为#AB-32-6和#AB-32-9的抗体变体是#AB-32的功能活性变体，其特征在于具有如图1所示的氨基酸序列，特别地各VH或HC序列，及进一步的VL或LC序列，包括如图1所描述的FR和CDR序列，及进一步的特征在于，具有如图2所列HC和LC序列。
[0720] 具体地，指定为#AB-33的抗体的特征在于具有如图1所示的氨基酸序列，及进一步的特征在于，具有如图2所列HC和LC序列，其中HC序列被鉴定为SEQ ID 163，及LC序列被鉴定为SEQ ID 164。具体地，VH CDR序列被鉴定为CDR1SEQ ID 87、CDR2SEQ ID 88和CDR3SEQ ID 89，及VH FR序列被鉴定为FR1SEQ ID 25、FR2SEQ ID 27、FR3SEQ ID 29和FR4SEQ ID 90。VL CDR序列被鉴定为CDR4SEQ ID 92、CDR5SEQ ID 94和CDR6SEQ ID 96，及VL FR序列被鉴定为FR1SEQ ID 91、FR2SEQ ID 93、FR3SEQ ID 95和FR4SEQ ID 14。
[0721] 具体地，指定为#AB-34的抗体的特征在于具有如图1所示的氨基酸序列，及进一步的特征在于，具有如图2所列HC和LC序列，其中HC序列被鉴定为SEQ ID 165，及LC序列被鉴定为SEQ ID 166。具体地，VH CDR序列被鉴定为CDR1SEQ ID 104、CDR2SEQ ID 105和CDR3SEQ ID 106，及VH FR序列被鉴定为FR1SEQ ID 125、FR2SEQ ID 27、FR3SEQ ID 29和FR4SEQ ID 107。VL CDR序列被鉴定为CDR4SEQ ID 92、CDR5SEQ ID 94和CDR6SEQ ID 108，及VL FR序列被鉴定为FR1SEQ ID 91、FR2SEQ ID 93、FR3SEQ ID 95和FR4SEQ ID 14。
[0722] 指定为#AB-34-14、#AB-34-6和#AB-34-15的抗体变体是#AB-34的功能活性变体，其特征在于具有如图1所示的氨基酸序列，特别地各VH或HC序列，及进一步的VL或LC序列，包括如图1所描述的FR和CDR序列，及进一步的特征在于，具有如图2所列HC和LC序列。
[0723] 图1或图2中鉴定的任何抗体的其它变体是预期的，例如，在任何CDR或FR序列具有突变的CDR变体和/或变体，特别是基于亲本抗体序列和含有一个或多个点突变的变体。
[0724] 参考下述实施例能更充分地理解上述说明。但是，这些的例子仅仅是代表本发明的一个或更多的实施例的实施方法，而不应被理解为限制本发明范围。
[0725] 实施例
[0726] 实施例1：以高亲和力进行结合的LukGH mAb的产生
[0727] 重组毒素的产生：
[0728] 方法：在大肠杆菌Tuner DE3内重组产生了八种金黄色葡萄球菌毒素—LukH_TCH1516、LukH_MRSA252、LukH_MSHR1132、LukH_H19、LukG_TCH1516、LukG_MRSA252、LukG_MSHR1132和LukG_H19，或单独的或作为LukGH复合物。成熟蛋白质的毒素基因(采用SignalP 4.1Server确定；http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)经密码子优化用于大肠杆菌表达，并通过基于公开的金黄色葡萄球菌菌株USA300_TCH1516、MRSA252、MSHR1132和H19的基因组序列，通过基因合成产生。单独的LukH和LukG蛋白质(对于USA300_TCH1516、MRSA252和MSHR1132变体)以无标记的不溶形式表达，从包涵体分离，折叠并纯化。重折叠的LukH蛋白质通过体积排阻色谱法和阳离子交换色谱法纯化，而变性的LukG蛋白质通过阳离子交换色谱法纯化，随后进行重折叠，重折叠蛋白质通过阴离子交换(pH 10.2-11.0)进一步纯化。四种LukGH复合物(USA300_TCH1516、MRSA252、MSHR1132和H19变体)用含有不同抗生素抗性标记、携带lukH或lukG基因的2种质粒共转染大肠杆菌而产生。LukG被表达为在N-端具有NusA/His6的融合蛋白，以允许复合物的金属亲和纯化，而LukH表达为未标记形式。
两种蛋白质在可溶性部分被发现，并经固定化金属亲和色谱法(IMAC)共-纯化。
两种蛋白质在可溶性部分被发现，并经固定化金属亲和色谱法(IMAC)共-纯化。
[0729] NusA/His6标签经肠激酶的蛋白水解作用而去除，得到的未标记的成熟的LukGH复合物由阳离子交换色谱法进一步纯化。蛋白质纯度采用SDS-PAGE测定，单体状态采用体积排阻色谱法测定，及功能性在体外毒素效力试验中测定。
[0730] 共表达稳定了单独蛋白质。虽然单独组分总是表达在大肠杆菌的不溶性部分，但共表达的LukGH在可溶性部分被发现。
[0731] SDS-PAGE表明复合物内的LukG:LukH的化学计量是1:1。我们采用配置有静态光散射检测器的DynoProNanoStar(Wyatt)仪器，采用动态光散射(DLS)测量法，以确定溶液中的复合物的大小。采用静态光散射检测器(MW-S)测量的分子量与异源二聚体的计算分子量73kDa达成良好的一致。
[0732] 对于抗体选择，根据制造商的说明，用氨基反应试剂Sulfo-NHS-LC生物素(Thermo-Scientific)标记蛋白质，得到的生物素的水平为1-2.5生物素/蛋白质。
[0733] 单克隆抗体的选择：
[0734] 使用体外酵母选择系统和相关的方法，从全长人IgG1抗体库(WO2009/036379A2；WO2010105256；WO2012009568)分离毒素特异性抗体。在不同浓度下，采用抗体表达酵母细胞与生物素标记的LukGH_TCH1516一起孵育，然后，通过磁珠分选法(Miltenyi,Biotec)和荧光激活细胞分选法(FACS,FACSAria II,BD Biosciences)，采用链霉亲和素二级试剂，在几次连续筛选循环中富集毒素结合mAb。在富集的最后一个循环之后，将酵母分类，涂布在琼脂板上，选择克隆分离物，用于测序和生产IgG。采用较低浓度的毒素饵剂，在连续的筛选循环中，优化抗体以获得较高亲和力，亚库由轻链改组和重链的CDR1和CDR2的靶向突变产生。
[0735] 接着，抗体由选出的酵母克隆产生，并通过蛋白A亲和色谱法纯化。
[0736] 采用ForteBio Octet Red仪器(Pall Life Sciences)，通过干涉测量，证实了mAb与不同毒素的结合。生物素化抗原或抗体被固定在传感器上，并分别测量了溶液中抗体Fab片段或抗原的缔合和解离(通常是70-270nM)。Fab Kd亲和力使用Sector Imager(扇形成像)2400仪器(Meso Scale Discovery)通过MSD方法测定。通常，20pM生物素化抗原与不同浓度的Fab一起孵育，在室温下孵育16小时，未结合的抗原被固定的IgG捕获。同样请参阅例如Estep et al.,“High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning”,MAbs,Vol.5(2),pp.270-278(2013)。
[0737] 结果：
[0738] LukGH mAb在连续筛选循环中被发现，该循环使用LukGH_TCH1516，作为抗原，从表达在酵母表面的全长人IgG1库(多样性大约～10-10)发现。来自最终优化循环的抗体对LukGH_TCH1516显示出高的亲和力(通过Fab MSD Kd测定，<5pM)，采用MSD Fab Kd和ForteBio测量法测定时，对LukG_TCH1516，显示出至少低两个数量级的亲和力，及不与LukH_TCH1516结合(图4)。正如ForteBio测定(图4)，抗体在所研究的LukGH变体之间，也是交叉反应的，对LukGH_TCH1516、LukGH_MRSA252、LukGH_MSHR1132和LukGH_H19显示出相似的亲和力。
[0739] 实施例2：人mAb的LukGH中和活性分析。
[0740] 使用从人全血分离的或已分化的(“类嗜中性粒细胞”)人PMN，在活力试验中，评估人mAb抗USA300LukGH毒素和MRSA252和MSHR1132的变体毒素的中和活性。HL60细胞(ATCC CCL-240TM)用DMF(N,N-二甲基甲酰胺，100mM)分化3-5天，如Romero-Steiner,Clin Diagn Lab Immunol,1997:415所描述的。根据文献中(如，Collado-Escobar,Biochem J,1994:553；Trayner,Leuk Res,1998:537；Watanabe,J Leuk Biol,1993:40)描述的标准方法，采用Brilliant Violet 421缀合的抗-CD11b(clone ICRF44,BioLegend,USA)和PE-缀合的抗-CD71单克隆抗体(clone OKT9,eBioscience,USA)，通过CD71颜色消失和CD11b出现颜色确定分化。为了进行活力试验，将细胞重悬于补充有10％FCS、L-谷氨酰胺和Pen/Strep(＝嗜中性粒细胞介质)的RPMI 1640(PAA Laboratories,Austria)中。将单克隆抗体在嗜中性粒细胞介质中连续稀释，并与固定浓度的毒素混合，该固定浓度降低细胞活力>80％[0.69–
4.11nM，取决于所使用的细胞类型和LukGH变体]。活力试验在预孵育步骤30分钟后开始，让抗体与LukGH结合。每孔加入25000个细胞，接着，在37℃，5％CO2加湿环境中孵育4小时。根据生产商的说明，通过测量细胞ATP水平( Luminescent Cell Viability
Assay；Promega,USA)评估细胞活力。采用下述公式，计算毒素活性的％抑制：％抑制＝[(正常活性–抑制的活性)/(正常活性)]×100。所有试验中都包括对照mAb(针对不相关抗原产生的)。
4.11nM，取决于所使用的细胞类型和LukGH变体]。活力试验在预孵育步骤30分钟后开始，让抗体与LukGH结合。每孔加入25000个细胞，接着，在37℃，5％CO2加湿环境中孵育4小时。根据生产商的说明，通过测量细胞ATP水平( Luminescent Cell Viability
Assay；Promega,USA)评估细胞活力。采用下述公式，计算毒素活性的％抑制：％抑制＝[(正常活性–抑制的活性)/(正常活性)]×100。所有试验中都包括对照mAb(针对不相关抗原产生的)。
[0741] 结果：
[0742] 在与固定浓度(2.74nM,200ng/ml)、诱导大于>80％细胞溶解的重组LukGH_TCH1516预孵育之后，LukGH mAb的毒素中和活性在0.03-208nM mAb浓度范围的类嗜中性粒细胞HL60细胞上测定。筛选出的抗体证实，其在抑制LukGH细胞毒素方面具有高的效力。最有效的mAb在半数最高溶解浓度(IC50)时达到≤1的抗体/毒素摩尔比例。实例(AB-31、AB-
32-6、AB-32-9、AB-34、AB-34-14、AB-34-6和AB-34-15在图5A中示出)。
32-6、AB-32-9、AB-34、AB-34-14、AB-34-6和AB-34-15在图5A中示出)。
[0743] 为了测试对其它LukGH序列变体的交叉反应性，筛选出的抗体也用于测试对菌株MRSA252(实例AB-29-2、AB-30-3、AB-31、AB-32-6、AB-33、AB-34和AB-34-15在图5B中示出)和菌株MSHR1132(实例AB-29-2、AB-30-3、AB-31、AB-32-6、AB-33、AB-34和AB-34-15在图5C中示出)的LukGH变体的中和作用。如对于LukGH_TCH1516观察到的，最有效的mAb在中和MSH1132和MRSA252序列变体中是高效力的。
[0744] 实施例6.使用LukGH:AB-32-9复合物的晶体结构的抗体表位作图/结合
[0745] 从LukGH与AB-32-9的Fab片段的混合晶体结构中鉴定在LukGH分子中的AB-32-9抗体的表位残基。表位定义为在Fab-毒素界面的毒素残基，该Fab-毒素界面与特定结合物接触，例如，Fab残基，即，用Pymol(PyMOL Molecular Graphics System,Version 1.5.0.4LLC)测定，它们的任何非氢原子之间的距离小于或等于
[0746] 描述于图6中的LukGH表位，在LukG的边缘域(球体表示)发现，且与来自AB-32-9Fab的可变域的轻链(黑色卡通)和重链(灰色卡通)的残基结合。从晶体结构确定的LukG接触残基(图6，黑色球体)是氨基酸：Asn71、Tyr73、Trp74、Asn206、Leu207、Trp208、Lys210、Asp211、Trp262、Phe267。所有这些氨基酸在LukGH变体之间充分保守。
[0747] 实施例7.使用LukGH:Fab AB-32-9复合物的晶体结构的变体氨基酸的计算机模拟分析
[0748] 与LukGH复合的AB-32-9Fab片段的晶体结构被用于计算所有接触位置的结合能，也用于Fab接触残基的计算机模拟突变，以预测对LukGH具有改善的结合的变体。
[0749] 使用YASARA制备该结构(Krieger E,Koraimann G,Vriend G.Increasing the precision of comparative models with YASARA NOVA--a self-parameterizing force field.
[0750] Proteins.2002；47(3):393-402)、脱去离子和水分子，添加和优化氢，使用最速下降最小化。使用Rosetta score 12函数计算每个残基对整体结合能的贡献(Kaufmann KW,Lemmon GH,Deluca SL,Sheehan JH,Meiler J.Practically useful:what the Rosetta protein modeling suite can do for you.Biochemistry.2010Apr 13；49(14):2987-98)，没有进一步的优化。选出的接触位置突变成除了Cys和Pro之外的所有氨基酸，每次突变的结合能量的改变在下面的表2给出。
[0751] 计算机模拟突变表明，改变几个AB-32-9接触残基可以改善与LukGH的结合，即，VL CDR4上的N7F、N7Y、S8I、Y9R，VL CDR2上的A1G，VH CDR1上的S1E、S1F、S1H、S1I、S1K、S1L、S1M、S1R、S1V、S1W、S1Y，VH CDR2上的S5R、S5W、S7D、S7M、S7N、S7R、Y9D、Y9H，VH CDR3上的R4D、R4H、M6F、M6H、H7E、H7K、H7Q和H7R。也存在不影响与LukGH结合(ΔΔG值<0.5)的相对比较多的突变，因此，这些变体被预期具有与AB-32-9(表2)相似的结合特性(profiles)。
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