一种禽腺病毒亚单位疫苗
阅读：35发布：2020-05-15
专利汇可以提供一种禽腺病毒亚单位疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种禽腺病毒亚单位 疫苗 ，包括 抗原 和疫苗佐剂，所用的抗原为灭活的禽腺病毒Hexon蛋白，其中禽腺病毒Hexon蛋白的 氨 基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明所提供的疫苗，其中所使用的Hexon蛋白为一个新型的Hexon蛋白，利用该Hexon蛋白制备的禽腺病毒 亚单位疫苗 具有抗原 稳定性 高，纯度高，特异性强，对禽腺病毒具有显著的免疫效果。，下面是一种禽腺病毒亚单位疫苗专利的具体信息内容。
1.一种亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗是以禽腺病毒Hexon蛋白作为抗原制备的；其中禽腺病毒Hexon蛋白，包含有：
1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白，
2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白。
2.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的禽腺病毒Hexon蛋白，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的禽腺病毒Hexon蛋白进行了灭活处理。
4.如权利要求3所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的禽腺病毒Hexon蛋白经过甲醛溶液灭活。
5.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的禽腺病毒Hexon蛋白的含量不低于100μg/ml。
一种禽腺病毒亚单位疫苗
技术领域
背景技术
[0002] 禽腺病毒(Fowl Adenoviridae，FAV)是一种病原多样的病原体，可引起人和动物等多种疾病。许多腺病毒可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不表现感染症状，但有其它一些因素，特别是并发感染时，腺病毒可成为条件性病原，从而影响禽类宿主的健康。
[0004] 研究表明禽腺病毒的病毒粒外形呈立体对称的二十面体，直径70～90纳米，无包膜，外层由252个壳粒组成衣壳腺病毒结构(图1)。其中240个壳粒是六邻体(Hexon蛋白)，既具有共同的群特异性抗原，也具有型特异性抗原。另12个壳粒称五邻体，位于病毒粒的12个顶端，具有弱的群特异性抗原和一种使受感染细胞发生早期病变的毒性物质。
[0005] 而Hexon蛋白是禽腺病毒主要结构蛋白，带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，与保护性免疫反应有关。禽腺病毒Hexon在病毒颗粒表面处于易接近的位置。己对Hexon蛋白的结构和功能进行了广泛的研究。Hexon蛋白是大于900个残基的复杂蛋白。三聚体的分子包括两个非常保守的基座区P1和P2和四个高变环loop1、loop2、loop3、loop4。Loop1-Loop3所对应的氨基酸残基存在7个独特的超变区HVRs，这些HVRs在不同血清型之间的长度不同，变化范围再2-38个氨基酸之间。这些HVRs会导致Hexon蛋白的抗原性发生或多或少的变异。
[0006] 现有的禽腺病毒疫苗是使用完整的病原体作为制苗用抗原，但目前制造疫苗使用的毒株与临床流行毒株的抗原性存在较大差异，从而影响了攻毒保护效果，制约灭活疫苗的应用。弱毒疫苗的另一个问题是可能出现毒力返强的问题，存在接种疫苗后发病的情况，生物安全不能完全保证。而且，I群禽腺病毒作为原发病原的作用尚不清楚。有迹象表明，不同血清型，甚至相同血清型的不同毒株，其致病力和感染力差异很大。当通过自然途径或直接接触感染时，很多分离物都不能引起临床疾病的发生，仅以隐性感染的方式存在。但是鸡群感染FAV-I后，能够引起免疫抑制，造成机体对疫苗的免疫应答失败，给肉鸡养殖业带来严重的危害。使用全病毒抗原制备的传统疫苗免疫后产生的抗体，在临床上无法区分野毒感染或是疫苗免疫产生，干扰疫情的监测。这是目前传统疫苗存在的不足。为解决传统疫苗的问题，就需要筛选新的毒株或者开发新的亚单位疫苗以克服现有疫苗的问题。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种禽腺病毒亚单位疫苗，是在筛选获得了一种新型的禽腺病毒Hexon蛋白的基础上提供的亚单位疫苗。
[0008] 本发明所提供的亚单位疫苗，是以禽腺病毒Hexon蛋白作为抗原制备的；其中禽腺病毒Hexon蛋白，包含有：
[0009] 1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白，
[0010] 2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白；
[0011] 编码上述禽腺病毒Hexon蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
[0012] 亚单位疫苗中的禽腺病毒Hexon蛋白经过甲醛溶液灭活；
[0013] 所述的亚单位疫苗中，禽腺病毒Hexon蛋白的含量不低于1000μg/ml。
[0014] 本发明所提供的疫苗，其中所使用的Hexon蛋白为一个新型的Hexon蛋白，利用该Hexon蛋白制备的禽腺病毒亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，对禽腺病毒具有显著的免疫效果。附图说明
[0015] 图1：禽腺病毒的结构图，
[0016] 图2：Hexon蛋白扩增图，其中m为DNA ladder marker，1-3为扩增的平行样品；
具体实施方式
[0018] DNA疫苗是将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。该疫苗既具有减毒疫苗的优点，同时又无逆转的危险，因此越来越受到人们的重视，被看做是继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。但制备亚单位疫苗，其基础就是筛选获得新型的抗原基因。
[0019] 申请人在筛选获得了一种发生变异的禽腺病毒的基础上，通过研究其抗原蛋白，从而促成了本发明。
[0020] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细的说明。
[0021] 实施例1：病毒的筛选及Hexon基因的扩增
[0022] 2015年在山东某已经注射过禽腺病毒疫苗的养鸡场的鸡群中出现了典型的Ⅰ群禽腺病毒导致的病症，对病鸡剖检可见主要病变为肝炎，肝色浅质脆，肿大，肝和骨骼肌有出血斑点。在肝细胞中有大而圆或不规则形的嗜酸性或嗜碱性核内包涵体。为了确定是否致病的禽腺病毒发生了突变，从发病死鸡肝脏进行病毒分离；然后扩增Hexon蛋白基因。
[0023] 具体步骤如下：
[0024] 1、病毒尿囊液的分离
[0025] 取病鸡的病变肝脏组织，研碎后用灭菌生理盐水制成悬液，然后在4000rpm/min离心30min，在离心的上清液中加入链霉素和青霉素各15000IU/ml，经0.22μm滤膜过滤后，滤液以0.1ml/鸡胚的剂量，经尿囊绒毛膜接种9-11日龄的SPF鸡胚，取接种48h-72h未死亡的鸡胚放于4℃冰箱保存5h后收取尿囊液。在盲传3代后，收取第三代的尿囊液。其中就包含有所要分离的病毒。
[0026] 2、分离病毒核酸
[0027] 1)取2.5ml保存的尿囊液冻融后，4℃下8000rpm离心20min，取上清液备用；
[0028] 2)在上清液中加入添加了1％SDS的蛋白酶K消化液进行消化，56℃水浴消化3h；
[0029] 3)加入等体积的苯酚，充分混均后，12000rpm离心10min；
[0030] 4)取上清加等体积的酚：氯仿抽提，至中间层无蛋白；上清液再用等量的氯仿抽提，12000rpm离心10min；
[0031] 5)取上清，加入预冷的1/10体积的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，-20℃静置1h，然后12000rpm离心15min；
[0033] 3Hexon基因的扩增
[0034] 根据NCBI中发表的Hexon基因序列，设计并合成了引物,其中上游引物的序列信息如下：
[0035] 上游引物：5′-TTAGCTCACCGGTTGTCT-3′，
[0036] 下游引物的信息如下：5′-TTACACAGCGTTGCCT-3′。
[0037] 提取分离的病毒的核酸作为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增目的片段(图2)。片段回收后进行测序，扩增的基因,其编码区的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:1)：
[0038]atgactgcgcttactcccgacctgaccacggcgacgccgcggctgcagtactttcatatcgcgggccctggcacccgagagtatctatccgaggatctccagcagttttcgtacctgtcccacacgatcgccgggacgagctactttgacttgaaaaacaaattcaggcagacggtcgtagctcccactcgcaatgtcaccaccaaggaagcacaccgcctgcagatcagattctacccgatccagacagatgacccagacaacagctatcgcgtgcgctacagcgtcaacgttggggacagctgggtgttggacatgggggcggacatgttcgacataaagggtgtgctggaccgcggaccttccttcaagccgaatccccttgcgccaagagaagctattttcaacacctgggtggagagcactggtcctcagaccaatgtggtgggacagatgaccgtgaactacacatacacaaatcagaccaggaacgacaagacggccacgcttcagcaggtcaatagcatctccggggtggttcccaacgtcaacctgggacccggcctcagtcaactagcatcccgggccgacgtggataatattggcgtggtgggacgtttcgccaaggtagactcagcgggcgtgaaggtggcggtgggagcctatgtcaagcccgtgaaggacgacgggtctcagtctctgaaccagacctctctgtggctgatggacaacggaggtaccaactatctgggtgccctggctgtggaagactacactcagaccctgagttaccccgataccgtgctcgtgacccctcccaccgcttaccagcaagtcaaatctggcaccatgcgggcatgcaggcccaactacatcggcttctacatcaactttatctacatcctgtaccacgactcgggcgtctgcagcggaaccgtcaactccgagcgctccggcatgaacgtggtcgtggaactccaggacagaaacacagaactgagttaccagtacatgctggcggacatgatgtcccgtcatcactacttcgcgctgtggaaccaggccgtcgaccagtacgaccacgacgtgcgcgtcttcaacaacgacggctacgaagagggcgtgcctacttaggctttgctggaccccgggcacggggcgggcgaagacaacggtcccgacgtttccacacagctcatttacaccaacggacagcaagataagggcaacgtggtggccggaacggtttccacacagctcaatttcggtaccattccctcctacgagatcgacattgctgctgccaccaggcgcaacttcatcatgagcaacattgccgactacctgcccgacaaatacaagtttagcattcgcggtttcgaccctgttacagacaacatcgaccctaccacctacttttacatgaatcgcagggttcccttgaccaacgtggtagacctgtttaccaacattggtgccagatggtccgtggaccagatggacaacgtcaatcccttcaaccaccaccgtaactgggggttgaagtacaggtctcagctgctcggaaacagcagatactgccgtttccatattcaggtgccgcagaaatacaaatacatcaagaatctgctcctgttgcccggcacctacacttacgagtgggtcctcagaaagcccaacaacatgattctgcagtccagccttggcaacgacttgcgcgcggacggcgcgcagatcgtgtataccgaggtgaaccttatggccaatttcatgcccatggaccacaataccagcaaccagaacgctaccaacgaccagaccttcgcggactacttgggcgccaagaacgctctctacaacgttccggccggctccacgctgctgaccatcaatattcccgccagaacatgggagggtatgcggggctggtcttttacccgcctcaaggcctcggagacgccccagctgggcgctcagtacgacgtcggtttcaagtattcaggctccattccctattcggatggcaccttttacctgtcccacacgttccgcagtatgagcgtgttgtttgatacctctatcaactggcctggcaacgaccgtctgctcacaaacaacctgctggagatcctgaggccagtggccaccgacagcgaaggcttcactatgtcgcagtgcgacatgaccaaggactggttcctcgtgcagatggccaccaactacaactacgtgtacaacggttataggttctggcctgacagacactacttccactatgacttcctacgcaacttcgaccccatgtcgcgtcagggccccaacttcctggacaccacgctgtacgacctggtgtccagcactcccgttgttaacgacaccggctcacagccgtctcaggacaacgtgcgtaacaactccggctttatcgccaactccggctggcccgtatggaccgcacagcagggcgaagcctggcccgctaactggccgtacccgctgatcgggaacgacgccatcagttccaaccaaaccgtcaactacaagaagttcctgtgcgataactacctctggaccgtgccgttcagctcggactttatgtatcttacagatgtgggtcagaaccccatgtacacaaacaactcccatagcatggttatcaactttgagttggatgagatggatgagaatacttacgtgtacatgctgtacggggtatttgataccgttcgcgtgaaccagcccgagcgtaacgtgctagccatggcttacttccgtacgcctttcgccacaggcaacgctgtgtaa；
[0039] 其翻译的蛋白序列如下(SEQ ID NO:2)：
[0040]LAHRLSPEGVMTALTPDLTTATPRLQYFHIAGPGTREYLSEDLQQFSYLSHTIAGTSYFDLKNKFRQTVVAPTRNVTTKEAHRLQIRFYPIQTDDPDNSYRVRYSVNVGDSWVLDMGADMFDIKGVLDRGPSFKPNPLAPREAIFNTWVESTGPQTNVVGQMTVNYTYTNQTRNDKTATLQQVNSISGVVPNVNLGPGLSQLASRADVDNIGVVGRFAKVDSAGVKVAVGAYVKPVKDDGSQSLNQTSLWLMDNGGTNYLGALAVEDYTQTLSYPDTVLVTPPTAYQQVKSGTMRACRPNYIGFYINFIYILYHDSGVCSGTVNSERSGMNVVVELQDRNTELSYQYMLADMMSRHHYFALWNQAVDQYDHDVRVFNNDGYEEGVPT.ALLDPGHGAGEDNGPDVSTQLIYTNGQQDKGNVVAGTVSTQLNFGTIPSYEIDIAAATRRNFIMSNIADYLPDKYKFSIRGFDPVTDNIDPTTYFYMNRRVPLTNVVDLFTNIGARWSVDQMDNVNPFNHHRNWGLKYRSQLLGNSRYCRFHIQVPQKYKYIKNLLLLPGTYTYEWVLRKPNNMILQSSLGNDLRADGAQIVYTEVNLMANFMPMDHNTSNQNATNDQTFADYLGAKNALYNVPAGSTLLTINIPARTWEGMRGWSFTRLKASETPQLGAQYDVGFKYSGSIPYSDGTFYLSHTFRSMSVLFDTSINWPGNDRLLTNNLLEILRPVATDSEGFTMSQCDMTKDWFLVQMATNYNYVYNGYRFWPDRHYFHYDFLRNFDPMSRQGPNFLDTTLYDLVSSTPVVNDTGSQPSQDNVRNNSGFIANSGWPVWTAQQGEAWPANWPYPLIGNDAISSNQTVNYKKFLCDNYLWTVPFSSDFMYLTDVGQNPMYTNNSHSMVINFELDEMDENTYVYMLYGVFDTVRVNQPERNVLAMAYFRTPFATGNAV。
[0041] 与NCBI中已公布的禽腺病毒的HEXON基因进行核苷酸序列比对分析，结果发现与NCBI中已登记的禽腺病毒的对应基因相比，其最高同源性为93％(944个氨基酸，存在不少于60个aa的差异)。对N端和C末端的比较可以看出，除了氨基酸残基的取代/替换外，本发明所筛选获得病毒株的HEXON基因的N端和C端存在着插入/缺失突变；结果表明，分离的病毒为发生遗传变异的禽腺病毒，其含有新型的Hexon基因。
[0042] 实施例2：Hexon蛋白的重组表达
[0043] 1、目的片段与载体连接
[0044] 将Hexon基因扩增的片段(SEQ ID NO:1)与pMD18-T载体以T4连接，获得重组表达载体。
[0045] 2、转化
[0046] 取50μLDH5α感受态于1.5mL离心管中，加3μL的重组表达载体连接产物，冰浴30min，42℃热孵90s，冰浴2-3min后加970μL在37℃预热的LB培养液，170rpm/min摇床上37℃摇1h。5000rpm离心1min，弃上清，只保留有100μL用于吸打吹匀涂板。涂LB平板后37℃培养10h-16h。挑取单菌落至LB培养基(含Kana50μg/mL)中37℃继续培养约12h后，菌液生长至浑浊状态，取300μL菌液用于PCR鉴定。
[0047] 3、质粒提取
[0048] 加6mL LB培养液(含Kana50μg/mL)于小试管中，挑单克隆菌落，摇菌。转化的感受态细胞移液到EP管中10000rpm离心1min，将上清倒掉重复3-5次。加200μL SolutionⅠ/RNAase轻轻来回颠倒混匀。加200μLSolutionⅡ来回颠倒混匀。加300μL SolutionⅢ来回颠倒混匀直到有白色沉淀。室温13000rpm离心15min。将上清转移到结合柱中2次10000rpm离心1min。加500μL Buffer HB，10000rpm离心1min。加700μL洗涤缓冲液DNA wash Buffer 10000rpm离心1min。重复上一步。13000rpm离心2min，干燥洗脱柱。将洗脱柱放在一个新灭菌后的EP管中，加30-50μL洗脱缓冲液Elution Buffer或无菌水室温孵育2min，13000rpm离心1min收集质粒。电泳验证菌液PCR鉴定为阳性重组质粒。
[0049] 4、重组Hexon蛋白的诱导和提取纯化：
[0050] 将阳性重组菌株分别转接到含30mL BMGY培养基的250mL培养瓶中，30℃摇床培养至OD600约为5～6时，3000r/min离心5min收取菌体沉淀，用BMMY培养基悬浮并稀释至OD600约为1.0，30℃摇床诱导培养，每24h补加甲醇至终浓度0.5％，30℃诱导培养96h。4℃,9000rpm离心5min，保留上清液，收集的上清加入30％的硫酸铵沉淀、浓缩后，用PBS重溶蛋白。加入蛋白电泳上样缓冲液，沸水煮8分钟后，用12％的分离胶进行SDS-PAGE鉴定(图3)。
[0051] 实施例3：对病毒株的中和效果检测
[0052] 将重组Hexon蛋白作为免疫抗原来免疫SPF鸡来制备抗体血清，并将血清进行中和实验来检测免疫性能。
[0053] 将纯化好的重组蛋白用分光光度法按照以下步骤进行绝对定量：
[0055] (2)加测蛋白用PBS 0.14ml、加待测蛋白溶液0.01ml和蛋白定量用考马斯亮蓝染液2.85ml于比色皿中测出吸光度值y，通过公式y＝0.0142x+0.0658得出蛋白浓度。
[0056] 取21日龄的SPF鸡3-5只，用纯化后的重组表达的Hexon蛋白加入弗氏完全佐剂进行注射免疫。首次免疫每只SPF鸡注射重组蛋白量为15-30μg；每隔一周免疫一次，共免疫三次，其中最后一次时加入弗氏不完全佐剂进行免疫。30d后进行血清的收集。其中本发明Hexon蛋白免疫制备的作为阳性抗体血清，而目前市售的禽腺病毒灭活疫苗作为阳性对照血清；阴性对照血清为只注射免疫佐剂的获得的血清；每个血清有3个或以上的平行样。
[0057] 其中待检测的病毒为目前使用的禽腺病毒CELO标准株和本发明所获得的病毒的尿囊液；
[0058] 血清中和检测：
[0059] 将收集的血清放在37℃培养箱中充分析出，在3000rpm离心5min，将血清吸出。然后将血清55℃灭活后用于病毒血清交叉中和筛选。
[0060] 采用基础营养液DMEM将处理好的血清进行倍比稀释后，将待筛选的病毒株分别稀释到200TCID50/0.1ml，然后分别与不同稀释度的血清等体积混合。将混合液放入培养箱中进行孵育60min获得血清和待筛选病毒的混合液。
[0061] 弃掉长满鸡胚肝细胞的单层细胞的96孔板中的营养液，用纯DMEM洗涤后，再将上面制备的血清和待筛选病毒的混合液分别加入到96孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养3-4d后，观察细胞病变，记录病变孔数目。按照Reed-Muench法计算中和抗体效价R。结果表明，本发明筛选的Hexon蛋白作为抗原制备的阳性抗体血清对本发明筛选的病毒的中和能力明显好于阳性对照血清(p＜0.05)；而对于CELO标准株的中和效果，阳性抗体血清相比于阳性对照血清没有明显的区别。
[0062] 上述的结果表明本发明获得的Hexon蛋白具有抗原的变异性，从而导致已有的疫苗的免疫效果降低。
[0063] 实施例4：制备亚单位疫苗
[0064] 1、制备Hexon蛋白
[0065] 将重组表达的Hexon蛋白置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％；37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。
[0066] 2、油相制备：
[0068] 3、水相制备
[0069] 将灭活的禽腺病毒Hexon蛋白使用生理盐水稀释成500μg/ml，再加入灭菌后的吐温-80，搅拌使吐温-80完全溶解。
[0070] 取制备好的油相放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟；制备好的疫苗中禽腺病毒Hexon蛋白的含量不低于200μg/ml。
[0071] 实施例5：疫苗的效果
[0072] 1)最小免疫剂量的测定：
[0073] 用制备的Hexon蛋白灭活疫苗以不同剂量分别颈部皮下接种SPF鸡，免疫剂量分别为0.5ml/只、0.25ml/只、0.125ml/只、0.06ml/只，免疫后30日攻毒实施例。结果表明，免疫0.06ml/只的灭活疫苗即能达到完全的保护，即每只鸡注射12μg的Hexon蛋白就能起到免疫效果。
[0074] 2)疫苗对SPF鸡免疫反应及抗体水平检测
[0075] 用制备的Hexon蛋白灭活疫苗以不同剂量分别颈部皮下接种SPF鸡，以0.06ml/只的剂量注射，免疫3次，每隔10天重复免疫一次。在最后一次免疫10d、30d、40d、50d采集的血清用ELISA标准试剂盒进行检测。ELISA试验检测结果的S/P值＞0.4判为阳性。
[0076] 结果表明用制备的疫苗最后一次免疫后10d，ELISA ALV-Ab检测试剂盒测得免疫血清的S/P值([待检样品孔读数-已知阴性对照孔读数]/[标准阳性对照孔读数-已知阴性对照孔读数])都大于0.4，呈强阳性。上述的结果表明Hexon蛋白制备的疫苗能有效的诱导鸡体内产生中和抗体。
[0077] 3)对地方流行毒株的攻毒保护
[0078] 取28日龄SPF鸡30只，每只颈部皮下注射禽腺病毒Hexon蛋白灭活疫苗0.2ml/只作为实验组，另取30只同日龄SPF鸡注射不添加灭活蛋白的疫苗佐剂作为对照组。于免疫后30d，免疫组和对照组均肌肉注射攻毒各地方分离株，病毒含量均≥106.0TCID50/ml，每只
0.3ml，攻毒后观察记录发病死亡情况。结果表明，禽腺病毒Hexon蛋白制备的灭活疫苗，能抵御各地方禽腺病毒分离株的攻击，表明本发明制备的Hexon蛋白亚单位疫苗具有良好的免疫效果，可以保护免疫鸡抵抗禽腺病毒的攻击。并且，用目前市场上出售的禽腺病毒疫苗进行免疫，再用本发明的Hexon蛋白的出发病毒进行攻毒实验，结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明Hexon蛋白制成的亚单位疫苗的免疫效果。
0.3ml，攻毒后观察记录发病死亡情况。结果表明，禽腺病毒Hexon蛋白制备的灭活疫苗，能抵御各地方禽腺病毒分离株的攻击，表明本发明制备的Hexon蛋白亚单位疫苗具有良好的免疫效果，可以保护免疫鸡抵抗禽腺病毒的攻击。并且，用目前市场上出售的禽腺病毒疫苗进行免疫，再用本发明的Hexon蛋白的出发病毒进行攻毒实验，结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明Hexon蛋白制成的亚单位疫苗的免疫效果。
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