用于在婴儿中引发针对RSV和百日咳博德特氏菌的免疫应答的方法
阅读：560发布：2021-05-19
专利汇可以提供用于在婴儿中引发针对RSV和百日咳博德特氏菌的免疫应答的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开提供了通过使用重组 呼吸道 合胞病毒(RSV)和百日咳博德特氏菌 抗原 的母体免疫保护婴儿免于由呼吸道合胞病毒(RSV)和百日咳博德特氏菌引起的 疾病 以降低年幼婴儿中RSV和百日咳感染的发病率或严重度的方法。，下面是用于在婴儿中引发针对RSV和百日咳博德特氏菌的免疫应答的方法专利的具体信息内容。
1.用于保护婴儿免于由呼吸道合胞病毒(RSV)和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis) (百日咳)引起的感染或疾病的接种方案，所述接种方案包括：
向具有妊娠期婴儿的怀孕雌性施用能够加强对于RSV和百日咳博德特氏菌两者特异性的体液免疫应答的至少一种免疫原性组合物，所述至少一种免疫原性组合物包含含有F蛋白类似物的重组RSV抗原和至少一种百日咳抗原，
其中由所述至少一种免疫原性组合物在怀孕雌性中引发或增加的RSV特异性抗体的至少一种亚型和百日咳特异性抗体的至少一种亚型经由胎盘转移到妊娠期婴儿，由此保护婴儿免于由RSV和百日咳两者引起的感染或疾病。
2.用于保护婴儿免于由呼吸道合胞病毒(RSV)和百日咳博德特氏菌(百日咳)引起的感染或疾病的方法，所述方法包括：
向具有妊娠期婴儿的怀孕雌性施用能够加强对于RSV和百日咳博德特氏菌两者特异性的体液免疫应答的至少一种免疫原性组合物，所述至少一种免疫原性组合物包含含有F蛋白类似物的重组RSV抗原和至少一种百日咳抗原，
其中由至少一种免疫原性组合物在怀孕雌性中引发或增加的RSV特异性抗体的至少一种亚型和百日咳特异性抗体的至少一种亚型经由胎盘转移到妊娠期婴儿，由此保护婴儿免于由RSV和百日咳两者引起的感染或疾病。
3.一种免疫原性组合物或多种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含含有F蛋白类似物的重组RSV抗原和至少一种百日咳抗原，其用于保护婴儿免于由呼吸道合胞病毒(RSV)和百日咳博德特氏菌(百日咳)引起的感染或疾病，其中所述一种或多种免疫原性组合物配制用于施用于怀孕雌性，并且其中所述一种或多种免疫原性组合物能够加强对于RSV和百日咳博德特氏菌两者特异性的体液免疫应答，且其中由所述一种或多种免疫原性组合物在怀孕雌性中加强的RSV特异性抗体的至少一种亚型和百日咳特异性抗体的至少一种亚型经由胎盘转移到妊娠期婴儿，由此保护婴儿免于由RSV和百日咳两者引起的感染或疾病。
4.试剂盒，其包含配制用于施用于怀孕雌性的多种免疫原性组合物，其中所述试剂盒包含：
(a) 第一免疫原性组合物，其包含能够诱导、引发或加强对于RSV特异性的体液免疫应答的F蛋白类似物；和
(b) 第二免疫原性组合物，其包含能够诱导、引发或加强对于百日咳博德特氏菌特异性的体液应答的至少一种百日咳抗原，
其中在施用于怀孕雌性后，所述第一和第二免疫原性组合物诱导、引发或加强RSV特异性抗体的至少一种亚型和百日咳特异性抗体的至少一种亚型，所述抗体经由胎盘转移到怀孕雌性孕育的婴儿，由此保护婴儿免于由RSV和百日咳引起的感染或疾病。
5.权利要求1的接种方案、权利要求2的方法、权利要求3的用途或权利要求4的试剂盒，其中所述怀孕雌性是人。
6.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述婴儿是免疫未成熟的。
7.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述婴儿小于六个月龄。
8.权利要求7的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述婴儿小于两个月龄，例如小于一个月龄，例如是新生儿。
9.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述RSV特异性抗体和/或百日咳特异性抗体的至少一种亚型包含IgG抗体。
10.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中经由胎盘转移的所述RSV特异性抗体和/或百日咳特异性抗体的至少一种亚型包含IgG1抗体。
11.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述包含F蛋白类似物的重组RSV抗原和至少一种百日咳抗原共同配制在相同的免疫原性组合物中。
12.权利要求1-10中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述包含F蛋白类似物的重组RSV抗原和至少一种百日咳抗原配制在两种不同的免疫原性组合物中。
13.权利要求12的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述两种不同的免疫原性组合物在同一天施用(共同施用)。
14.权利要求12的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述两种不同的免疫原性组合物在不同天施用。
15.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中经由胎盘转移的所述RSV特异性抗体的至少一种亚型是中和抗体。
16.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述RSV特异性抗体的至少一种亚型在出生时的婴儿血清中以等于或大于30 mcg/ml的水平可检测到。
17.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述百日咳特异性抗体的至少一种亚型在出生时的婴儿血清中以等于或大于10 Elisa单位/ml (EU)的水平可检测到。
18.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述RSV特异性抗体的至少一种亚型和百日咳特异性抗体的至少一种亚型以一定水平存在于婴儿血清中，所述水平赋予针对由RSV和百日咳引起的感染或疾病的保护，而不损害婴儿对主动免疫RSV抗原或百日咳抗原或暴露于RSV或百日咳博德特氏菌的响应。
19.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中经由胎盘转移的所述RSV特异性抗体的至少一种亚型包含IgG1中和抗体。
20.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其进一步包括向婴儿施用引发或诱导婴儿中针对RSV的主动免疫应答的至少一种组合物。
21.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其进一步包括向婴儿施用引发或诱导婴儿中针对百日咳的主动免疫应答的至少一种组合物。
22.权利要求20或21的接种方案、方法、用途或试剂盒，其包括向婴儿施用引发或诱导针对RSV的主动免疫应答的至少一种组合物和引发或诱导针对百日咳的主动免疫应答的至少一种组合物。
23.权利要求22的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中引发或诱导针对RSV的主动免疫应答的至少一种组合物和引发或诱导针对百日咳的主动免疫应答的至少一种组合物是相同的组合物。
24.权利要求22的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中引发或诱导针对RSV的主动免疫应答的至少一种组合物和引发或诱导针对百日咳的主动免疫应答的至少一种组合物是不同的组合物。
25.权利要求24的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述不同组合物在同一天或不同天施用。
26.权利要求20-6中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中施用于婴儿的至少一种组合物包含含有F蛋白类似物的RSV抗原。
27.权利要求20-6中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中施用于婴儿的至少一种组合物包含核酸、重组病毒载体或病毒复制子颗粒，所述核酸、重组病毒载体或病毒复制子颗粒编码至少一种RSV蛋白抗原或抗原类似物。
28.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述至少一种百日咳博德特氏菌抗原是选自以下的至少一种无细胞百日咳抗原：百日咳类毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)、百日咳杆菌粘附素(PRN)、2型菌毛蛋白(FIM2)、3型菌毛蛋白(FIM3)和BrkA。
29.权利要求28的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述PT是化学类毒素化的，或例如通过以下突变中的一者或两者基因类毒素化的：R9K和E129G。
30.权利要求29的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述至少一种百日咳抗原包含：PT和FHA；PT、FHA和PRN；或PT、FHA、PRN以及FIM2和FIM3中的任一者或两者。
31.权利要30的接种方案、方法、用途或试剂盒，其包含：
i. 10-30ug，例如精确地或近似地25ug PT；
ii. 10-30ug，例如精确地或近似地25ug FHA。
32.权利要30的接种方案、方法、用途或试剂盒，其进一步包含：
2-10ug，例如精确地或近似地8ug PRN。
33.权利要30的接种方案、方法、用途或试剂盒，其包含：
i. 10-30ug，例如精确地或近似地20ug PT；
ii. 10-30ug，例如精确地或近似地20ug FHA；
iii. 2-10ug，例如精确地或近似地3ug PRN；和
iv. 1-10ug，例如精确地或近似地5ug总量的FIM2和FIM3。
34.权利要30的接种方案、方法、用途或试剂盒，其包含：
i. 2-10ug，例如精确地或近似地8ug PT；
ii. 2-10ug，例如精确地或近似地8ug FHA；和
iii. 0.5-4ug，例如精确地或近似地2.5ug PRN。
35.权利要30的接种方案、方法、用途或试剂盒，其包含：
i. 2-10ug，例如精确地或近似地2.5ug PT；
ii. 2-10ug，例如精确地或近似地5ug FHA；
iii. 0.5-4ug，例如精确地或近似地3ug PRN；和
iv. 1-10ug，例如精确地或近似地5ug总量的FIM2和FIM3。
36.权利要30的接种方案、方法、用途或试剂盒，其包含：
i. 2-5 ug，例如精确地或近似地3.2ug PT；
ii. 25-40ug，例如精确地或近似地34.4ug FHA；
iii. 0.5-3ug，例如精确地或近似地1.6ug PRN；和
iv. 0.5-1ug，例如精确地或近似地0.8ug FIM2。
37.权利要30的接种方案、方法、用途或试剂盒，其包含：
i. 2-10ug，例如精确地或近似地8ug PT；
ii. 1-4ug，例如精确地或近似地2.5ug FHA；和
iii. 1-4ug，例如精确地或近似地2.5ug PRN。
38.权利要求1-27中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述至少一种百日咳抗原是全细胞(Pw)百日咳。
39.权利要求38的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述Pw疫苗具有降低的内毒素含量。
40.权利要求39的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述降低的内毒素含量通过脂寡糖(LOS)的化学提取，或通过内毒素产生的遗传操作，例如以诱导3-O-脱酰酶的过表达或异源表达，来实现。
41.权利要求38的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述Pw疫苗包含含有至少部分
3-O-脱酰化的LOS的百日咳博德特氏菌细胞。
42.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述F蛋白类似物是可溶性F蛋白类似物。
43.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述F蛋白类似物是包括稳定F蛋白的融合前构象的至少一个修饰的PreF抗原。
44.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述婴儿小于六个月龄。
45.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中保护婴儿包括降低由RSV引起的感染或疾病的发病率或严重度和降低由百日咳引起的感染或疾病的发病率或严重度。
46.权利要求45的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中降低感染或疾病的发病率或严重度包括抑制RSV的感染。
47.权利要求45的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中降低感染或疾病的发病率或严重度包括抑制百日咳的感染。
48.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中降低由RSV引起的感染或疾病的发病率或严重度包括降低下呼吸道感染(LRTI)的发病率和/或严重度。
49.权利要求52的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中由RSV引起的严重LRTI减少50％或更多，如在接种母亲的婴儿组群中的严重LRTI率相比于未接种母亲的婴儿减少
50％或更多所测量。
50.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述至少一种免疫原性组合物在妊娠的26周或更晚施用于怀孕雌性。
51.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述怀孕雌性为妊娠26至38周，例如妊娠28至34周。
52.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述F蛋白类似物在N-末端至C-末端方向包含：RSV F蛋白多肽的F2结构域和F1结构域，和异源三聚化结构域，其中F2结构域和F1结构域之间不存在弗林蛋白酶切割位点。
53.权利要求52的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述F蛋白类似物包含选自以下的至少一种修饰：
(i) 改变糖基化的修饰；
(ii) 消除至少一个非弗林蛋白酶切割位点的修饰；
(iii) 缺失pep27结构域的一个或多个氨基酸的修饰；和
(iv) F蛋白胞外结构域的疏水结构域中取代或添加亲水性氨基酸的修饰。
54.权利要求52的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述F2结构域包含对应于SEQ ID NO:2的参考F蛋白前体多肽(F0)的氨基酸26-105的至少部分或全部的RSV F蛋白多肽和/或其中所述F1结构域包含对应于SEQ ID NO:2的参考F蛋白前体多肽(F0)的氨基酸137-516的至少部分或全部的RSV F蛋白多肽。
55.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述F蛋白类似物选自：
a) 包含选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22的多肽的多肽；
b) 由选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的多核苷酸、或由在严格条件下在实质上其整个长度与选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的多核苷酸杂交的多核苷酸序列编码的多肽，所述多肽包含至少部分对应于天然存在的RSV毒株的氨基酸序列；
c) 与选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22的多肽具有至少95％序列同一性的多肽，所述多肽包含不对应于天然存在的RSV毒株的氨基酸序列。
56.权利要求52-55中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述F蛋白类似物进一步包含信号肽。
57.权利要求52-56中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述异源三聚化结构域包含卷曲-螺旋结构域，例如异亮氨酸拉链。
58.权利要求52-57中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述至少一个改变糖基化的修饰包含含有和/或邻近于对应于SEQ ID NO:2的位置500的氨基酸的一个或多个氨基酸的取代。
59.权利要求58的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中对应于SEQ ID NO:2的位置
500-502的氨基酸选自：NGS、NKS、NGT和NKT。
60.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述F蛋白类似物和/或百日咳抗原配制在包含佐剂的至少一种免疫原性组合物中。
61.权利要求60的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述佐剂包含以下中的至少一种：3D-MPL、QS21、水包油乳状液和矿物盐。
62.权利要求60或61的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述佐剂包含铝盐(明矾)。
63.权利要求60-62中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述佐剂包含
3D-MPL。
64.权利要求60-63中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述佐剂包含QS21。
65.权利要求1-57中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述F蛋白类似物和/或百日咳抗原配制在不含佐剂的至少一种免疫原性组合物中。
66.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述免疫原性组合物通过肌内、皮肤或皮内施用途径施用于怀孕雌性。
67.权利要求20-66中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述至少一种免疫原性组合物通过肌内、皮肤、皮内或鼻内途径施用于婴儿。
68.前述权利要求中任一项的接种方案、方法、用途或试剂盒，其中所述包含F蛋白类似物和/或百日咳抗原的至少一种免疫原性组合物进一步包含来自除了RSV和百日咳博德特氏菌以外的病原生物体的至少一种额外抗原。
69.权利要求68的接种方案、方法、用途或试剂盒，其进一步包含选自以下的一种或多种抗原：白喉类毒素(D)；破伤风类毒素(T)；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)；灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)；缀合至载体蛋白的b型流感嗜血杆菌(H. influenzae) (Hib)的荚膜糖；缀合至载体蛋白的C型脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)的荚膜糖；缀合至载体蛋白的Y型脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖；缀合至载体蛋白的A型脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖；缀合至载体蛋白的W型脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖；来自B型脑膜炎奈瑟氏球菌的抗原和来自流感病毒的抗原。
70.权利要求69的接种方案、方法、用途或试剂盒，其进一步包含D和T；D、T和IPV；
D、T和HBsAg；D、T和Hib；D、T、IPV和HBsAg；D、T、IPV和Hib；D、T、HBsAg和Hib；或D、T、IPV、HBsAg和Hib。
71.前述权利要求中任一项的试剂盒，其中所述第一免疫原性组合物和/或第二免疫原性组合物在至少一个预充式注射器中。
72.权利要求71的试剂盒，其中所述预充式注射器是双腔注射器。
用于在婴儿中引发针对RSV和百日咳博德特氏菌的免疫应
答的方法
[0001] 相关申请的交叉引用本申请要求2012年8月6日提交的美国临时申请号61/679,928和2013年3月15日
提交的美国非临时申请号13/835,829的申请日的权益，其公开内容以其整体通过引用并入本文。
提交的美国非临时申请号13/835,829的申请日的权益，其公开内容以其整体通过引用并入本文。
[0002] 依照37 C.F.R. § 1.71(E)的版权通告本专利文件的部分公开内容含有受到版权保护的材料。版权所有者不反对专利文件或专利公开中任何人使用如Patent and Trademark Office的专利文件或记录中出现的传真复制件，但除此之外保留所有版权利。
[0003] 背景本公开涉及免疫学领域。更具体而言，本公开涉及用于引发对呼吸道合胞病毒(RSV) 和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussi)(百日咳)特异性的免疫应答的组合物和方法。
[0004] 人呼吸道合胞病毒(RSV)是小于6个月龄的婴儿和怀孕期小于或等于35周的早产儿中下呼吸道感染(LRTI)的最常见的全球性原因。
[0005] RSV被充分证明为急性LRTI (包括细支气管炎和肺炎)的每年冬季流行病的一个原因。RSV相关LRTI在其他方面健康的儿童中的发生率计算为生命前两年中37/1000名儿童-年(小于6个月龄的婴儿中45/1000名儿童-年)，而住院风险为6/1000名儿童-年(生命前6个月中每1000名儿童-年)。发生率在患有心肺疾病的儿童和早产儿中较高，在美国这些儿童构成几乎半数的RSV相关医院收治。经受由RSV引起的更严重的LRTI的儿童以后具有升高的儿童哮喘发生率。这些研究表明普遍需要RSV疫苗。
[0006] 细菌百日咳博德特氏菌是百日咳的病原体，所述百日咳是在婴儿和年幼儿童中可严重的呼吸系统疾病。WHO估计表明，在2008年，世界各地发生约16百万例百日咳，并且195,000个儿童死于所述疾病。疫苗已经可用数十年，并且全球接种估计(WHO)已在2008年避免了约687,000例死亡。
[0007] 该疾病的临床过程的特征在于快速咳嗽的发作，随后呼吸努力，经常与特征性“咳嗽”声相关。在严重的情况下，缺氧可导致脑损伤；然而最常见的并发症是继发性肺炎。尽管用抗生素治疗是可用的，但到诊断出疾病时，细菌毒素经常已引起严重损害。因此，所述疾病的预防是非常重要的，因此，开发接种具有重要兴趣。针对百日咳博德特氏菌的第一代疫苗是全细胞疫苗，其由已通过热处理、福尔马林或其他方式杀灭的全细菌构成。这些在1950年代和1960年代引入许多国家，并且在减少百日咳的发病率方面是成功的。后续改进已包括开发无细胞百日咳疫苗，其含有高度纯化的百日咳博德特氏菌蛋白 - 通常至少百日咳类毒素(PT；经化学处理或遗传修饰以去除其毒性的百日咳毒素)和丝状血细胞凝集素(FHA)，经常连同69kD蛋白百日咳杆菌粘附素(PRN)，并且在一些情况下，进一步包括
2型和3型菌毛蛋白(FIM 2和3)。这些无细胞疫苗的反应原性通常远低于全细胞疫苗，并且已被采取用于许多国家的接种计划。
2型和3型菌毛蛋白(FIM 2和3)。这些无细胞疫苗的反应原性通常远低于全细胞疫苗，并且已被采取用于许多国家的接种计划。
[0008] RSV和百日咳两者的特征在于免疫力在儿童期后减弱，并且在对于这些病原体完全实现小儿接种之前，在生命的前几个月过程中的感染导致最严重的发病率和死亡率。
[0009] 尽管百日咳接种充分确立，尽管多种尝试以产生安全且有效的RSV疫苗，其在健康的和有风险的群体中引发持久且保护性的免疫应答，迄今所评估的候选物无一证明作为疫苗用于预防RSV感染和/或减轻或预防RSV疾病是安全且有效的。因此，存在未满足的联合疫苗的需要，所述联合疫苗赋予针对对新生儿和年幼婴儿构成特别危险的RSV和百日咳博德特氏菌感染和相关疾病的保护。
[0010] 简述本公开涉及通过向孕妇施用至少一种包含重组抗原RSV F蛋白类似物和百日咳抗原的免疫原性组合物而保护婴儿免于由呼吸道合胞病毒(RSV)和百日咳博德特氏菌(百日咳)引起的疾病的接种方案和方法。用含有F蛋白类似物和百日咳抗原的一种或多种免疫原性组合物主动免疫孕妇引发母体抗体，所述母体抗体经由胎盘转移至妊娠期婴儿，由此保护婴儿在出生后免于RSV疾病。因此，本公开还涉及免疫孕妇以保护她的婴儿免于RSV和百日咳引起的疾病的接种方案和方法，重组RSV F蛋白类似物和百日咳抗原在免疫怀孕雌性以保护她的婴儿免于RSV引起的疾病中的用途，和可用于免疫孕妇以保护她们的婴儿免于RSV和百日咳的试剂盒。
[0012] 图2显示对于实施例1中进行的豚鼠实验的研究设计。
[0013] 图3显示来自实施例1的用RSV攻击豚鼠后代之后的结果。
[0014] 图4显示实施例1中的豚鼠模型中的中和抗体应答的时间过程。
[0015] 图5A和5B是说明用RSV+百日咳联合疫苗免疫之后针对RSV攻击感染的中和滴度和保护的图。
[0016] 图6A和6B是说明用RSV+百日咳联合疫苗免疫之后针对百日咳博德特氏菌攻击的血清抗体滴度和保护的图。
[0017] 详述介绍
开发保护婴儿免于由呼吸道合胞病毒(RSV)和百日咳博德特氏菌(百日咳)引起的疾病的安全且有效的疫苗中的一个具体挑战在于，最高的发生率和严重性，就发病率和死亡率而言，在非常年幼的婴儿中。这本身提出了许多挑战。年幼婴儿，特别是那些早产儿，可具有不成熟的免疫系统。还存在非常年幼婴儿中接种干扰母体抗体的潜在风险。在过去，已存在针对RSV接种年幼婴儿加重RSV疾病的问题，以及由自然感染和免疫引发的免疫减弱导致的挑战。本公开涉及通过用含有RSV F蛋白类似物和百日咳抗原的免疫原性组合物主动免疫孕妇而保护年幼婴儿(例如，出生和6个月龄之间)免于由RSV和百日咳两者引起的疾病的方法。F蛋白类似物和百日咳抗原优选引发抗体，所述抗体经由胎盘转移至妊娠期婴儿，导致出生后婴儿的被动免疫保护，且持续至对于由RSV和百日咳两者引起的感染和严重疾病的关键期。
开发保护婴儿免于由呼吸道合胞病毒(RSV)和百日咳博德特氏菌(百日咳)引起的疾病的安全且有效的疫苗中的一个具体挑战在于，最高的发生率和严重性，就发病率和死亡率而言，在非常年幼的婴儿中。这本身提出了许多挑战。年幼婴儿，特别是那些早产儿，可具有不成熟的免疫系统。还存在非常年幼婴儿中接种干扰母体抗体的潜在风险。在过去，已存在针对RSV接种年幼婴儿加重RSV疾病的问题，以及由自然感染和免疫引发的免疫减弱导致的挑战。本公开涉及通过用含有RSV F蛋白类似物和百日咳抗原的免疫原性组合物主动免疫孕妇而保护年幼婴儿(例如，出生和6个月龄之间)免于由RSV和百日咳两者引起的疾病的方法。F蛋白类似物和百日咳抗原优选引发抗体，所述抗体经由胎盘转移至妊娠期婴儿，导致出生后婴儿的被动免疫保护，且持续至对于由RSV和百日咳两者引起的感染和严重疾病的关键期。
[0018] 本公开的一个方面涉及保护婴儿(包括新生儿)免于由RSV和百日咳两者引起的感染或疾病的接种方案。接种方案涉及向怀孕雌性施用能够加强(或诱导或引发)针对RSV和百日咳的体液免疫应答(例如，抗体应答)的至少一种免疫原性组合物。有利地，至少一种免疫原性组合物包括包含F蛋白类似物的重组RSV抗原和作为全细胞百日咳抗原或无细胞百日咳蛋白的百日咳抗原。施用至少一种免疫原性组合物后，由免疫原性组合物引发的对于RSV和百日咳特异性的母体抗体的至少一种亚型经由胎盘转移到妊娠期婴儿，由此保护婴儿免于RSV和百日咳两者引起的感染或疾病。
[0019] 本公开的另一个方面涉及保护婴儿免于由呼吸道合胞病毒(RSV)和百日咳引起的感染或疾病的方法，所述方法包括向具有妊娠期婴儿的怀孕雌性施用至少一种免疫原性组合物，所述疫原性组合物包含含有F蛋白类似物的重组RSV抗原和百日咳抗原，其中由免疫原性组合物引发的母体抗体的至少一种亚型经由胎盘转移到妊娠期婴儿，由此保护婴儿免于RSV引起的感染或疾病。
[0020] 在另一个方面，本公开涉及一种或多种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括包含F蛋白类似物的重组RSV抗原和至少一种百日咳抗原，其用于保护婴儿免于RSV和百日咳引起的感染或疾病，所述免疫原性组合物配制用于施用于怀孕雌性。在施用于怀孕雌性后，所述免疫原性组合物能够加强体液免疫应答(例如，诱导、引发或增加)对于RSV和百日咳特异性的母体抗体的至少一种亚型。母体抗体经由胎盘转移到妊娠期婴儿，由此赋予针对RSV和百日咳引起的感染和/或疾病的保护。
[0021] 在另一个方面，本公开涉及包含配制用于施用于怀孕雌性的多种(例如，2种或更多种)免疫原性组合物的试剂盒。所述试剂盒包括(a)包含能够诱导、引发或加强对于RSV特异性的体液免疫应答的F蛋白类似物的第一免疫原性组合物；和(b)包含能够诱导、引发或加强对于百日咳博德特氏菌特异性的体液免疫的至少一种百日咳抗原的第二免疫原性组合物。免疫原性组合物任选地包含在一个或多个预充式注射器中，例如，双(或多)个有腔注射器中。在施用于怀孕雌性后，试剂盒的至少第一和第二免疫原性组合物诱导、引发或加强RSV特异性抗体的至少一种亚型和百日咳特异性抗体的至少一种亚型，所述抗体经由胎盘转移到由怀孕雌性孕育的婴儿。母体抗体经由胎盘转移赋予针对RSV和百日咳两者引起的感染和/或疾病的保护。
[0022] 在一个具体实施方案中，接种方案、方法或用途或试剂盒涉及F蛋白类似物的免疫原性组合物(例如，和其施用)，所述F蛋白类似物是融合前F或“PreF”抗原，其包括稳定F蛋白的融合前构象的至少一个修饰。或者，融合后构象(“PostF”)中稳定或者就构象而言不稳定的F类似物可用于本文描述的方法中。通常，F蛋白类似物，(例如，PreF、PostF等)抗原缺乏跨膜结构域，并且是可溶的，即不是膜结合的(例如，以促进F蛋白类似物的表达和纯化)。
[0023] 在示例性实施方案中，接种方案、方法、用途或试剂盒涉及施用F蛋白类似物，其在N-末端至C-末端方向包含：RSV F蛋白多肽的至少一部分或实质上所有F2结构域和F1结构域，任选地与异源三聚化结构域。在一个实施方案中，F2结构域和F1结构域之间不存在弗林蛋白酶切割位点。在某些示例性实施方案中，F2结构域包含对应于SEQ ID NO:2的参照F蛋白前体多肽(F0)的氨基酸26-105的RSV F蛋白多肽的至少一部分和/或F1结构域包含对应于SEQ ID NO:2的参照F蛋白前体多肽(F0)的氨基酸137-516的RSV F蛋白多肽的至少一部分。
[0024] 例如，在具体实施方案中，F蛋白类似物选自：a) 包含选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22的多肽的多肽；
b) 由选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的多核苷酸、或由在严格条件下在实质上其整个长度与选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，所述多肽包含至少部分对应于天然存在的RSV毒株的氨基酸序列；
c) 与选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22的多肽具有至少95％序列同一性的多肽，所述多肽包含不对应于天然存在的RSV毒株的氨基酸序列。
b) 由选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的多核苷酸、或由在严格条件下在实质上其整个长度与选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽，所述多肽包含至少部分对应于天然存在的RSV毒株的氨基酸序列；
c) 与选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22的多肽具有至少95％序列同一性的多肽，所述多肽包含不对应于天然存在的RSV毒株的氨基酸序列。
[0026] 在包含异源三聚化结构域的实施方案中，此类结构域可以包含卷曲-螺旋结构域，诸如异亮氨酸拉链，或者它可以包含替代三聚化结构域，诸如来自噬菌体T4 fibritin (“foldon”)或流感HA的三聚化结构域。
[0027] 在某些示例性实施方案中，F蛋白类似物包含至少一个选自以下的修饰：(i) 改变糖基化的修饰。
(ii) 消除至少一个非弗林蛋白酶切割位点的修饰；
(iii) 缺失pep27结构域的一个或多个氨基酸的修饰；和
(iv) F蛋白胞外结构域的疏水结构域中取代或添加亲水性氨基酸的修饰。
(ii) 消除至少一个非弗林蛋白酶切割位点的修饰；
(iii) 缺失pep27结构域的一个或多个氨基酸的修饰；和
(iv) F蛋白胞外结构域的疏水结构域中取代或添加亲水性氨基酸的修饰。
[0028] 在某些实施方案中，F蛋白类似物包含多肽的多聚体，例如，多肽的三聚体。
[0029] 就百日咳抗原而言，所述抗原可以是一种或多种无细胞百日咳蛋白或全细胞百日咳抗原。例如，无细胞百日咳蛋白可以选自：百日咳类毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)、百日咳杆菌粘附素(PRN)、2型菌毛蛋白(fimbrae) (FIM2)、3型菌毛蛋白(FIM3)和BrkA。PT可以是化学类毒素化的或遗传类毒素化的(例如，通过一个或两个突变：R9K和E129G)。
在某些有利的实施方案中，百日咳抗原包含百日咳蛋白的组合，例如：PT和FHA；PT、FHA和PRN；或PT、FHA、PRN和任选的FIM2和FIM3中的一者或两者。
在某些有利的实施方案中，百日咳抗原包含百日咳蛋白的组合，例如：PT和FHA；PT、FHA和PRN；或PT、FHA、PRN和任选的FIM2和FIM3中的一者或两者。
[0030] 在包括全细胞(Pw)百日咳抗原的实施方案中，Pw抗原可以具有降低的内毒素含量。降低的内毒素含量可以通过脂寡糖(LOS)的化学提取，或通过内毒素产生的遗传操作，例如以诱导3-O-脱酰酶的过表达或异源表达，来实现。在某些有利的实施方案中，Pw抗原包含含有至少部分3-O-脱酰化的LOS的百日咳博德特氏菌细胞。
[0031] 在某些实施方案中，F蛋白类似物和/或百日咳抗原配制在包含药学可接受的载体或赋形剂、诸如缓冲剂的免疫原性组合物中。任选地，免疫原性组合物还包括佐剂，例如和包括以下的佐剂：3D-MPL、QS21(例如，呈脱毒形式)，水包油乳状液(例如，有或没有免疫刺激分子，诸如α-生育酚)，矿物盐，诸如铝盐(例如，氢氧化铝磷酸铝)，包括明矾，或其组合。优选地，如果免疫原性组合物包括佐剂，则佐剂增强或增加体液免疫，其特征在于产生抗体，特别是IgG1亚类的IgG抗体。或者，免疫原性组合物在不存在(即没有)佐剂的情况下配制。
[0032] 通常，含有F蛋白类似物和百日咳抗原的免疫原性组合物在怀孕(妊娠)的末三月期间施用，尽管有益效果(特别是处于增加早产风险的怀孕)可以在末三月开始之前获得。因此，尽管F蛋白类似物可以在妊娠的26周(从最后一次月经期间开始测量)或更晚(例如，妊娠的26和38周之间，或妊娠的28和34周之间)施用，但F蛋白类似物也可以在妊娠的26周之前施用。
[0033] 在接种方案、方法、用途或试剂盒的某些实施方案中，RSV抗原(重组F蛋白类似物)和百日咳抗原共同配制在相同的免疫原性组合物中。在替代实施方案中，RSV抗原(重组F蛋白类似物)和百日咳抗原配制在不同(例如，两种不同)的免疫原性组合物中，其可以共同施用(即在相同时间或接近相同时间，即，同一天施用)，或在不同天，通常条件是两种免疫原性组合物在怀孕的末三月期间，例如妊娠的26周后、或妊娠的28周后、通常妊娠的34周前、或妊娠的38周前进行施用。施用于怀孕雌性可通过任何各种途径实现，例如，肌内、皮肤或皮内施用途径。
[0034] 有利地，试剂盒中包括的免疫原性组合物的接种方案、方法、用途或施用引发怀孕雌性(优选，人雌性)中的免疫应答，当经由所述胎盘被动转移到她的妊娠期婴儿时，其保护婴儿，例如，从出生到至少约6个月龄的婴儿。因此，受本文公开的方法保护的婴儿可以是免疫未成熟的婴儿，诸如小于六个月龄的婴儿，诸如小于两个月龄的婴儿，例如，小于一个月龄的婴儿，例如新生儿或新出生婴儿。有利地，抗体的至少一种亚型，例如，IgG抗体，诸如IgG1抗体经由胎盘转移。也被视为有利的是，母体抗体的亚型(subset)包括针对RSV的中和抗体。
[0035] 在某些实施方案中，抗体的至少一种亚型(subset)经由胎盘转移可以通过免疫学方法(例如，ELISA)来测量。例如，在某些有利的实施方案中，RSV特异性抗体在出生时婴儿的血清中可以等于或大于30 mcg/ml的水平检测到。类似地，在某些有利的实施方案中，百日咳特异性抗体在出生时婴儿的血清中可以等于或大于10 ELISA单位/ml (EU)的水平检测到。有利地，对于RSV和百日咳特异性的抗体在婴儿血清中在出生时以一定水平存在，所述水平保护免于(或抑制)感染，且减少或防止RSV和百日咳引起的疾病，而不损害婴儿随后对免疫(或暴露)的响应。
[0036] 任选地，为了确保免疫应答超过六个月龄的持续性，接种方案、方法或用途(和试剂盒的组合物的施用)可以涉及向婴儿(怀孕雌性生育的婴儿)施用一种或多种组合物，所述组合物引发或诱导婴儿中针对RSV和/或百日咳的主动免疫应答。向婴儿施用的一种或多种组合物与向怀孕雌性施用的一种或多种组合物可以是相同或不同的。例如，向婴儿施用的组合物可包括作为F蛋白类似物的RSV抗原组分，或它可包括作为编码一种或多种RSV抗原的核酸的RSV抗原组分，诸如活减毒病毒，病毒载体(例如，腺病毒或MVA载体)，或病毒复制子颗粒或其他自我复制的核酸。所述组合物可以可选地或额外包括百日咳抗原组分，其是无细胞百日咳抗原(Pa，例如，一种或多种百日咳蛋白)或全细胞百日咳抗原(Pw)，如本文所述。如果向婴儿施用RSV抗原组分和百日咳抗原组分两者，则RSV抗原组分和百日咳抗原组分可以共同配制在相同的免疫原性组合物中。或者，RSV抗原组分和百日咳抗原组分可以配制在两种(或更多种)不同的免疫原性组合物中，其可以共同施用(同时或在同一天)，或可根据不同的时间表(例如，根据各种批准和/或推荐的小儿免疫时间表)施用。任选地，向婴儿施用的一种或多种组合物可以包括除了RSV或百日咳以外的一种或多种额外病原体的抗原(例如，配制在通常根据各种小儿免疫时间表施用的疫苗中)。根据制剂，免疫原性组合物可以通过各种确立途径，例如，肌内、皮肤、皮内和/或粘膜(例如，鼻内)来向婴儿施用。
[0037] 本文公开的接种方案、方法、用途和试剂盒可减少RSV和百日咳引起的感染或疾病的发病率或严重度。例如，接种方案、方法、用途和试剂盒可减少RSV疾病(诸如LRTI)的发生率或严重度，或通过减少严重RSV疾病(诸如LRTI)的发生率。类似地，接种方案、方法、用途和试剂盒可减少百日咳博德特氏菌感染引起的疾病的发病率或严重度(例如，“百日咳”咳嗽或肺炎或相关症状的持续时间或严重度)。保护婴儿优先包括保护婴儿免于由RSV和/或百日咳引起的严重疾病和住院治疗。因此，本文公开的方法和用途可以使RSV和百日咳两者引起的严重疾病的发病率减少50％或更多、或60％或更多、或70％或更多，如在接种母亲的婴儿组群的严重LRTI率和/或住院治疗和/或肺炎率相比于未接种母亲的婴儿减少50％或更多、或60％或更多、或70％或更多所测量。
[0038] 术语为了便于概览本公开的各个实施方案，提供了术语的下列解释。可以在本公开的上下文中提供额外术语和解释。
[0039] 除非另有解释，本文所使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域普通技术人员的通常理解具有相同含义。分子生物学中的常见术语的定义可见Benjamin Lewin, Genes V,由Oxford University Press出版，1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编)，The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9); 和Robert A. Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 由VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN 1-56081-569-8)。
[0040] 除非上下文另有明确指明，单数术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述(the)”包括复数所指物。类似地，除非上下文另有明确指明，词语“或”意图包括“和”。术语“多个/种”指两个/种或更多个/种。应当进一步理解的是，对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，和所有分子量或分子质量值是近似的，并且为了描述而提供。另外，关于物质诸如抗原的浓度或水平给出的数值限制意图为近似的。因此，当指明浓度是至少(例如)200 pg，则意图该浓度被理解为至少近似(或“约”或“～”)200 pg。
[0041] 尽管与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以在本公开的实践或测试中使用，下文描述了合适的方法和材料。术语“包含”意指“包括”。因此，除非上下文另有要求，词语“包含(comprises)”及其变化形式诸如“包含(comprise)”和“包含(comprising)”应当理解为暗示包括规定的化合物或组合物(例如核酸、多肽、抗原)或步骤，或者化合物或步骤的组，但是不排除任何其他化合物、组合物、步骤，或其组。缩写“例如”(e.g.)衍生自拉丁语exemplify gratia，并且在本文中用于指明非限制性实例。因此，缩写“例如”(e.g.)与术语“例如”(for example)是同义的。
[0042] 术语“F蛋白”或“融合蛋白”或“F蛋白多肽”或“融合蛋白多肽”是指具有RSV融合蛋白多肽的整个或部分氨基酸序列的多肽或蛋白。已经描述了许多RSV融合蛋白，并且是本领域技术人员已知的。WO2008114149记载了示例性F蛋白变体(例如天然存在的变体)。
[0043] “F蛋白类似物”是指包括改变F蛋白的结构或功能的修饰、但保留F蛋白的免疫学特性使得针对F蛋白类似物生成的免疫应答将识别天然F蛋白的F蛋白。以其整体通过引用并入本文的WO2010149745记载了示例性F蛋白类似物。以其整体通过引用并入本文的WO2011008974也记载了示例性F蛋白类似物。F蛋白类似物包括例如PreF抗原，其包括至少一个稳定F蛋白的融合前构象的修饰，且通常是可溶的，即不与膜结合。F蛋白类似物也包括融合后F(postF)抗原，其处于RSV F蛋白的融合后构象中，优选稳定在此类构象中。F类似物进一步包括中间构象、优选稳定在此类构象的F蛋白。此类替代物通常也是可溶的。
[0044] 在提及核酸或多肽(例如RSV F或G蛋白核酸或多肽，或F类似物核酸或多肽)时，“变体”是指与参照核酸或多肽不同的核酸或多肽。通常，变体与参照核酸或多肽之间的差异构成与所指物相比小比例的差异数。
[0045] 多肽或蛋白的“结构域”是指多肽或蛋白内结构限定的元件。例如，“三聚化结构域”是多肽内促进多肽装配成三聚体的氨基酸序列。例如，三聚化结构域可促进经由与(具有相同或不同氨基酸序列的额外多肽的)其他三聚化结构域的结合而装配成三聚体。该术语也用于指编码此类肽或多肽的多核苷酸。
[0046] 术语“天然的”和“天然存在的”是指以与其在自然界中相同状态存在的元件，诸如蛋白、多肽或核酸。也就是说，该元件未经人工修饰。应当理解的是，在本公开的上下文中，RSV蛋白或多肽存在许多天然的/天然存在的变体，例如获得自不同的天然存在的RSV毒株或分离株。以其整体通过引用并入本文的WO2008114149含有示例性RSV毒株、蛋白和多肽，参见例如图4。
[0047] 术语“多肽”是指其中单体是经由酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。如本文中所使用的术语“多肽”或“蛋白”意图涵盖任何氨基酸序列，而且包括经修饰的序列诸如糖蛋白。术语“多肽”具体意图涵盖天然存在的蛋白，以及重组或合成生成的蛋白。术语“片段”提到多肽时是指多肽的部分(即子序列)。术语“免疫原性片段”是指多肽的保留全长参照蛋白或多肽的至少一个优势免疫原性表位的所有片段。多肽内的取向一般以N端至C端方向描述，由各个氨基酸的氨基和羧基部分的取向限定。多肽从N或氨基端朝向C或羧基端翻译。
[0048] “信号肽”是一种短的氨基酸序列(例如长度为约18-25个氨基酸)，其将新合成的分泌性蛋白或膜蛋白引导至膜及穿过膜，例如内质网的膜。信号肽常常但不普遍位于多肽的N端，并且常常在蛋白已穿过膜后被信号肽酶切去。信号序列通常含有三种常见的结构特征：N端极性碱性区(n区)、疏水性核心、和亲水性c区）。
[0049] 术语“多核苷酸”和“核酸序列”是指长度为至少10个碱基的核苷酸聚合形式。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或任一核苷酸的经修饰形式。该术语包括单一和双重形式的DNA。“分离的多核苷酸”意指与编码序列两者均不紧密相邻的多核苷酸，它与所述编码序列在衍生其的生物体的天然存在的基因组中紧密相邻(一个在5’端上，而一个在3’端上)。在一个实施方案中，多核苷酸编码多肽。核酸的5’和3’方向通过参照各个核苷酸单位的连接性来限定，并根据脱氧核糖(或核糖)糖环的碳位置来指定。以5’至3’方向阅读多核苷酸序列的信息(编码)内容。
[0050] “重组”核酸是具有非天然存在的序列或者具有通过人工组合两个在其他情况中分开的序列区段制备的序列的核酸。可以通过化学合成或者，更常见地，通过人工操作分离的核酸区段，例如通过遗传工程技术来实现此人工组合。“重组”蛋白指由已经引入宿主细胞诸如细菌或真核细胞中的异源(例如重组)核酸编码的蛋白。可以在具有能够表达由所引入核酸编码的蛋白的信号的表达载体上引入核酸，或者可以将核酸整合入宿主细胞染色体中。
[0051] 术语“异源的”就核酸、多肽或另一细胞组分而言表明存在如下组分，其在自然界中通常找不到和/或其源自不同来源或物种。
[0052] “抗原”是可在主体中刺激抗体生成和/或T细胞应答的化合物、组合物、或物质，包括注射、吸附、或其他方式引入主体中的组合物。术语“抗原”包括所有相关抗原性表位。术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上由B和/或T细胞应答的位点。“优势抗原性表位”或“优势表位”是针对其产生功能上显著的宿主免疫应答(例如抗体应答或T细胞应答)的那些表位。因此，就针对病原体的保护性免疫应答而言，优势抗原性表位是指在被宿主免疫系统识别时导致产生保护免于由该病原体引起的疾病的那些抗原性部分。术语“T细胞表位”是指在与合适的MHC分子结合时被T细胞特异性结合(经由T细胞受体)的表位。“B细胞表位”是被抗体(或B细胞受体分子)特异性结合的表位。
[0053] “佐剂”是以非抗原特异性方式增强免疫应答产生的试剂。常见的佐剂包括将抗原吸附至其上的矿物质(明矾、氢氧化铝、磷酸铝)的悬液；乳状液，包括油包水、和水包油(及其变体，包括双重乳状液和可逆乳状液)、脂糖、脂多糖、免疫刺激性核酸(诸如CpG寡核苷酸)、脂质体、Toll样受体激动剂(特别是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激动剂)，和此类组分的各种组合。
[0054] “抗体”或“免疫球蛋白”是特异性结合抗原的血浆蛋白，其由四个多肽构成。抗体分子由通过二硫键保持在一起的两个重链多肽和两个轻链多肽(或其倍数)构成。在人中，抗体被定义为五种同种型或类：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。IgG抗体可以进一步分为四个亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。“中和”抗体是能够抑制病毒的感染性的抗体。因此，对于RSV特异性的中和抗体能够抑制或降低RSV的感染性。
[0055] “免疫原性组合物”是适合于对人或动物主体施用(例如在实验或临床背景下)的物质的组合物，其能够引发特异性免疫应答，例如针对病原体诸如RSV或百日咳博德特氏菌）。因此，免疫原性组合物包括一种或多种抗原(例如多肽抗原)或抗原性表位。免疫原性组合物还可以包括一种或多种能够引发或增强免疫应答的额外组分，诸如赋形剂、载体、和/或佐剂。在某些情况下，施用免疫原性组合物来引发保护主体免于由病原体诱导的症状或状况的免疫应答。在一些情况下，在主体暴露于病原体后，通过抑制病原体的复制或细胞感染来预防(或减轻或改善)由病原体引起的症状或疾病。在本公开的上下文中，术语免疫原性组合物应当理解成涵盖意图用于对主体或主体群体施用以引发针对RSV或百日咳的保护性、预防性或姑息性免疫应答的组合物(即疫苗组合物或疫苗)。
[0056] “免疫应答”是免疫系统细胞诸如B细胞、T细胞、或单核细胞对刺激(诸如病原体或抗原(例如，配制为免疫原性组合物或疫苗))的应答。免疫应答可以是B细胞应答，其导致特异性抗体诸如抗原特异性中和性抗体的产生。免疫应答也可以是T细胞应答，诸如CD4+应答或CD8+应答。B细胞和T细胞应答是“细胞”免疫应答的方面。免疫应答也可以是“体液”免疫应答，其由抗体介导，其可以进行检测和/或测量，例如，通过ELISA测定。在一些情况下，应答对特定抗原是特异性的(即“抗原特异性应答”)。如果抗原衍生自病原体，则抗原特异性应答是“病原体特异性应答”。“保护性免疫应答”是抑制病原体的有害功能或活性、减轻病原体感染、或减轻源于病原体感染的症状(包括死亡)的免疫应答。可以例如通过在噬斑减少测定法或中和测定法中抑制病毒复制或噬斑形成，或者通过在体内测量对病原体攻击的抗性来测量保护性免疫应答。主体暴露于免疫原性刺激，诸如病原体或抗原(例如，配制为免疫原性组合物或疫苗)，引发或诱导对于刺激特异性的初级免疫应答，即，暴露“引发”免疫应答。随后暴露(例如，通过免疫)于刺激可以增加或“加强”特异性免疫应答的量级(或持续时间或两者)。因此，通过施用免疫原性组合物“加强”预先存在的免疫应答增加抗原(或病原体)特异性应答的量级，(例如，通过增加抗体滴度和/或亲和力，通过增加抗原特异性B或T细胞的频率，通过诱导成熟效应子功能，或其任何组合)。
[0057] 形容词“药学可接受的”表明所指物适合于对主体(例如人或动物主体)施用。Remington’s Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 第15版(1975)描述了适合于治疗性和/或预防性组合物(包括免疫原性组合物)的药学递送的组合物和制剂(包括稀释剂)。
[0058] 术语“减轻”是一个相对术语，从而使得如果应答或状况在施用试剂后得到定量减弱，或者如果与参照试剂相比，它在施用试剂后得到减弱，则所述试剂减轻应答或状况。类似地，术语“保护”不一定意指试剂完全消除感染或感染引起的疾病的危险，只要应答或状况的至少一种特征被实质上或显著减少或消除。因此，保护免于或减少感染或疾病或其症状的免疫原性组合物可以，但不一定防止或消除所有主体中的感染或疾病，只要感染的发生率或严重度或疾病的发生率或严重度可测量地降低，例如，在所述试剂不存在的情况下或相比于参照试剂的感染或响应的至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％。在某些情况下，降低是下呼吸道感染(LRTI)的发生率，或严重LRTI的发生率，或由于RSV疾病的住院治疗，或RSV引起的疾病的严重度。在其他情况下，降低是肺炎的发生率，或由于百日咳博德特氏菌引起的疾病导致的住院治疗的降低。
[0059] “主体”是活的多细胞脊椎动物生物体。在本公开的上下文中，主体可以是实验主体，诸如非人动物，例如小鼠、棉鼠、豚鼠、奶牛或非人灵长类。或者，主体可以是人主体。类似地，怀孕雌性和婴儿可以分别是非人动物或人雌性和婴儿。
[0060] 母体免疫下呼吸道感染(LRTI)是任何下呼吸道组织的感染，其中最严重形式包括细支气管炎和肺炎。人呼吸道合胞病毒(RSV)是小于6个月龄的婴儿和怀孕期小于或等于35周的早产儿中下呼吸道感染(LRTI)的最常见的全球性原因。RSV疾病范围包括从鼻炎(rhinitis)和耳炎(otitis)至肺炎(pneumonia)和细支气管炎(bronchiolitis)的一大批呼吸症状，后两种疾病与相当高的发病率和死亡率有关。
[0061] 细菌百日咳博德特氏菌(百日咳)是百日咳的病原体，所述百日咳是在婴儿和年幼儿童中可严重的呼吸系统疾病，其中继发性肺炎、窒息和呼吸窘迫和衰竭是严重并发症。尽管用抗生素治疗是可用的，但到诊断出疾病时，细菌毒素可引起严重损害。RSV自然感染和用百日咳疫苗免疫两者导致随着时间推移减弱的免疫力，其后果是青少年和成人可以充当这些高度传染性疾病的储库。这使新生儿在生命的前几个月处于特别风险中，其中感染的后果是最严重的。
[0062] 保护脆弱的新生儿免于百日咳感染和疾病的策略包括“作茧(cocooning)”，即接种可能与新生儿接触的青少年和成人(包括产后妇女)。针对百日咳接种孕妇(母体免疫)现在几个国家中推荐，由此抗百日咳抗体经胎盘转移以提供保护，直至婴儿可以直接接种。尽管如此，仍存在未满足的联合疫苗的需要，所述联合疫苗赋予针对对新生儿和年幼婴儿构成特别危险的RSV和百日咳博德特氏菌感染和相关疾病的保护。
[0063] 开发保护婴儿免于由RSV和百日咳引起的疾病的安全且有效的疫苗中的一个具体挑战在于，最高的发生率和最大的发病率和死亡率在非常年幼的婴儿中。年幼婴儿，特别是那些早产儿，可具有不成熟的免疫系统。婴儿在生理上可能比年长儿童更容易受到下呼吸道疾病的影响。因此，保护年幼婴儿免于RSV疾病、百日咳和特别是免于严重LRTI、肺炎和呼吸窘迫和衰竭是特别重要的。还有婴儿的接种干扰经由胎盘转移至婴儿的抗体(“母源抗体”)的潜在风险，使得早期婴儿期中的接种可能不是足够有效，例如，以引起完全保护性中和抗体响应。
[0064] 本公开涉及适合用于通过用含有RSV F蛋白类似物和无细胞或全细胞百日咳抗原的安全且有效的免疫原性组合物主动免疫孕妇而保护年幼婴儿免于由RSV和百日咳引起的疾病的接种方案、方法和免疫原性组合物的用途和试剂盒。F蛋白类似物通过加强或增加由天然暴露于(或针对RSV的先前接种)RSV先前引发的体液应答的幅度而有利地引发抗体(例如，中和抗体)。类似地，百日咳抗原通过加强或增加由天然暴露于(或针对百日咳的先前接种)百日咳先前引发的体液应答的幅度而引发抗体。响应于F蛋白类似物和百日咳抗原产生的抗体经由胎盘转移至妊娠期婴儿，导致出生后婴儿的被动免疫保护，且持续至对于由RSV和百日咳引起的感染和严重疾病的关键期(例如，在婴儿接种是完全保护的之前)。通常，由该方法赋予的被动免疫保护在出生和至少两个月龄之间持续，例如，长达约6个月龄，或甚至更长。
[0065] 本文所述的含有F蛋白类似物和/或百日咳抗原的免疫原性组合物经设计以诱导强抗体应答(例如，中和抗体)。由于孕妇在她们的生命过程中通常已经一种或多次暴露于RSV，所以她们具有存在的对RSV的引发的响应。到成年暴露于RSV感染的群体的比例基本上是100％。设计保护免于百日咳和预防百日咳的小儿免疫程序是普遍的。然而，尽管广泛免疫，但百日咳博德特氏菌的自然感染也是常见的。因此，引发为百日咳也是普遍的。因此，刚出生后和随后关键的前几个月为婴儿提供保护免于RSV和百日咳可以通过增加母体中针对RSV和百日咳的血清抗体应答(水平)尽可能有效地和就可以穿过胎盘且为婴儿提供保护的特定抗体亚类(亚型)诸如IgG1而言有利地加强这些引发的应答来实现。在一个实施方案中，用于本文中使用的免疫原性组合物不包括佐剂，或包括有利于强烈IgG1应答的佐剂，诸如矿物盐诸如铝盐或钙盐，特别是氢氧化铝、磷酸铝或磷酸钙。因此，一个具体实施方案中，用于本文所述的方法和用途的F蛋白类似物有利地用无机盐(优选明矾)配制。在替代实施方案中，有利于强烈IgG1应答的佐剂是水包油乳状液、或皂苷，诸如QS21(或其脱毒版本)，这将在下面更详细地描述。
[0066] 怀孕雌性可以是人雌性，并且相应地，婴儿或妊娠期婴儿可以是人婴儿。对于怀孕的人雌性，正在发育胎儿的胎龄从最后一次月经周期的开始进行测量。受孕后周数从最后一次月经周期开始后14天进行测量。因此，当怀孕妇女据说是受孕后24周时，这将等于她最后一次月经周期开始后26周，或妊娠的26周。当怀孕已通过辅助生殖技术实现时，正在发育的胎儿的妊娠期从受孕日期之前两周进行计算。
[0067] 如本文所使用的术语“妊娠期婴儿”意指怀孕雌性的胎儿或正在发育的胎儿。术语“胎龄”用于指孕周数，即从最后一次月经周期开始后的周数。人妊娠通常是从最后一次月经周期开始约40周，并且可以方便地分成几个三个月，第一个三个月从最后一次月经周期的第一天延伸到妊娠的第13周；第二个三个月从妊娠的第14周跨越至跨越妊娠的第27周，且末三月在第28周开始，延伸直到出生。因此，末三月在受孕后26周开始，并且继续直到婴儿的出生。
[0068] 当是指人时，术语“婴儿”是0和两岁之间。将理解的是，由本文所述的方法和用途提供的保护可以潜在地为婴儿至2岁到11岁的儿童、或例如2岁到5岁的早期儿童或甚至12岁到18岁的青春期提供保护。然而，在婴儿期过程中，个体最容易受到严重RSV疾病和百日咳(百日咳)的并发症的影响，所以这是本公开的焦点(例如，从出生到约6个月龄)。
[0069] 在生命的前几个月，特别是当早产时，例如35周妊娠之前，当免疫系统不能足够充分发育以达到能够以发育的免疫系统将能够响应于相同病原体发挥作用的方式防止病原体引起的感染或疾病的免疫应答时，人婴儿可以是在免疫不成熟的。免疫不成熟的婴儿比具有更发达或成熟的免疫系统的婴儿更可能屈服于病原体引起的感染和疾病。人婴儿还可以由于生理和发育的原因在生命的前几个月过程中具有对LRTI (包括肺炎)的增加的脆弱性，例如，气道很小，并且相比于儿童和成人不那么发达或成熟的。由于这些原因，当我们在本文中提到婴儿期的前六个月时，这对于不成熟或早产婴儿可以根据低于40周或低于38周或低于35周的胎龄丢失的时间量进行延伸。
[0070] 在一个替代实施方案中，怀孕雌性及其婴儿来自任何物种，诸如上述在“主体”下的那些。对于怀孕动物，诸如怀孕豚鼠或牛，受孕后的时间被测量从交配开始的时间。在人和一些动物(例如豚鼠)中，抗体从母体经由胎盘传给胎儿。一些抗体同种型可优先通过胎盘转移，例如，在人中，IgG1抗体是通过胎盘最有效地转移的同种型。尽管亚类存在于实验动物诸如豚鼠和小鼠中，但各种亚类不一定行使相同功能，并且人和动物的亚类之间的直接关联不能容易地实现。
[0071] 有利地，通过降低抑制RSV和百日咳引起的感染和减少RSV和百日咳引起的疾病的发病率或严重度保护婴儿覆盖至少新生儿期间和非常年幼的婴儿期，例如出生后生命的至少前几周，诸如从出生的第一个月，或从出生的前两个月或前三个月或前四个月或前五个月或前六个月，或更长时间，例如，当婴儿是妊娠的约40周或更晚生育的完全足月婴儿时。前几个月后，当婴儿不那么容易受到严重RSV疾病和百日咳的影响时，针对这些感染的保护可以减弱。因此，重要保护在当最需要它的期间过程中提供。在早产儿的情况下，有利地，根据出生时婴儿的胎龄，提供保护持续从出生的更长期间，例如至少等于婴儿出生和已经是35周妊娠(即，到约5个额外周)或38周妊娠(约2个额外周)或更长的时间之间的时间间隔的额外时间期间。
[0072] 将明显的是，保护婴儿不一定意指100％保护免于RSV或百日咳的感染。如果感染或疾病的发生率或严重度存在降低，则将认识到提供保护。保护婴儿优先包括保护婴儿免于RSV和百日咳引起的严重疾病和住院治疗。因此，本文公开的方法和用途减少RSV和百日咳引起的感染或疾病诸如LRTI、肺炎或其他症状或疾病的发生率或严重度。例如，施用本文公开的含有F蛋白类似物的免疫原性组合物可相比于未接种母亲的婴儿使LRTI的(接种母亲的婴儿的组群中)发生率降低至少约50％，或至少约60％，或60至70％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％。有利地，此类施用相比于未接种母亲的感染婴儿使LRTI的严重度降低至少约50％，或至少约60％，或60至70％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％。有利地，此类施用相比于未接种母亲的感染婴儿使此类组群中由于严重RSV疾病导致的住院治疗的需要降低至少约50％，或至少约60％，或60至70％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％。是否被认为存在由于严重LRTI导致的住院治疗的需要，或是否LRTI的具体病例住院治疗，可以因国家不同而不同，并且因此，根据本领域众所周知的定义的临床症状而判断的严重LRTI可以是比需要住院治疗更好的措施。就百日咳而言，施用本文公开的含有无细胞或全细胞百日咳抗原的免疫原性组合物可相比于未接种母亲的婴儿使严重疾病(例如，肺炎和/或呼吸窘迫和衰竭)的(接种母亲的婴儿的组群中)发生率降低至少约50％，或至少约60％，或60至70％，或至少约70％，或至少约
80％，或至少约90％。有利地，此类施用相比于未接种母亲的感染婴儿使肺炎的严重度降低至少约50％，或至少约60％，或60至70％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％。
有利地，此类施用相比于未接种母亲的感染婴儿使此类组群中由于严重的百日咳并发症导致的住院治疗的需要降低至少约50％，或至少约60％，或60至70％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％。
80％，或至少约90％。有利地，此类施用相比于未接种母亲的感染婴儿使肺炎的严重度降低至少约50％，或至少约60％，或60至70％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％。
有利地，此类施用相比于未接种母亲的感染婴儿使此类组群中由于严重的百日咳并发症导致的住院治疗的需要降低至少约50％，或至少约60％，或60至70％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％。
[0073] 通常，根据接种方案、方法、用途和试剂盒，将F蛋白类似物和百日咳抗原在怀孕(妊娠)的末三月过程中施用于怀孕雌性。母体免疫的时机经设计以允许生成母体抗体和母体抗体转移至胎儿。因此，有利地，免疫和出生之间经过足够时间，以允许母体抗体通过胎盘的最佳转移。抗体转移在人中通常在妊娠的约25周开始，增加直至28周，并且从妊娠的约30周变得最佳且保持最佳。据信在如本文所述的母体免疫和出生之间需要最少约二至四周，以允许针对RSV F蛋白和百日咳抗原(例如，包含百日咳类毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)、百日咳杆菌粘附素(PRN)、2型菌毛蛋白(FIM2)、3型菌毛蛋白(FIM3)和BrkA、或全细胞百日咳抗原中的一种或多种)的母体抗体有效转移至胎儿。因此，母体免疫可以在妊娠25周后的任何时间发生，例如在妊娠的25、26、27、28、29、30、31、32、33或34周(受孕后的23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36周)或其之后，或妊娠的38、37、36、35、34、33、32、31或30周(受孕后的36、35、34、33、32、31、29或28周)在或其之前发生。有利地，母体免疫在妊娠的26至38周，诸如28至34周实施。
[0074] 有利地，母体免疫在婴儿的预产期之前至少两周或至少三周或至少四周或至少五周或至少六周实施。在怀孕雌性处于早产风险的情况下，施用时机可能需要进行调整，以便提供足够时间用于生成抗体和转移至胎儿。
[0075] 有利地，将F蛋白类似物和百日咳抗原或其制剂在所述期间过程中以单一剂量施用于怀孕雌性。如本文所述的针对RSV和百日咳的母体免疫可以被认为是现有的针对RSV和百日咳的母体免疫的“加强剂”，其增加先前已经引发(例如，通过天然暴露或接种)的针对RSV和百日咳的免疫应答。因此，预期只需要单一剂量。如果施用第二剂量，则这有利地也在施用第一剂量的时间期间内，有利地第一和第二剂量之间的时间差为例如一至八周或两至六周，例如两周或四周或六周。
[0076] 向怀孕雌性施用F蛋白类似物和百日咳抗原导致加强母体抗体滴度，例如，增加血清(例如，中和)抗体，优选IgG1亚类的滴度。母亲中增加的抗体滴度导致RSV特异性和百日咳特异性抗体(例如，具有中和效应子功能)经由Fc受体介导的主动转运机制(例如，在绒膜绒毛的合体滋养细胞(syncytiotrophoblast)中)通过胎盘被动转移至正在孕育的婴儿。由本文公开的免疫方法产生的RSV-和百日咳特异性的IgG1抗体的跨胎盘转运预期是有效的，且导致的滴度在足月或接近足月出生的婴儿中接近、等于或超过母体循环中的滴度。例如，RSV特异性抗体的滴度有利地在出生时在至少30 mcg/mL的水平。通常，所述滴度在足月妊娠出生的健康婴儿中等于或超过该水平，诸如在40 mcg/mL，50 mcg/mL，60 mcg/mL，或甚至更高，诸如75 mcg/mL，80 mcg/mL，90 mcg/mL，100 mcg/mL，或者甚至高达
120 mcg/mL或更高。
120 mcg/mL或更高。
[0077] 百日咳-(例如，PT-)特异性抗体的滴度通常通过ELISA在ELISA单位/ml (EU)的方面进行测量，如描述于，例如，Meade等人, “Description and evaluation of serologic assays used in a multicenter trial of acellular pertussis vaccines”, Pediatrics (1995) 96:570-5。简而言之，例如，微量滴定板(例如，Immulon 2 , VWR International, West Chester, PA, USA)用标准量的PT、FHA、FIM或PRN包被。血清的系列稀释液在28℃孵育约2小时，并且添加碱性磷酸酶缀合的山羊抗人IgG的适当稀释液。将反应显色且在405 nm读数。每种特定抗体的检测下限通过多次测量每种抗原的系列稀释的参照材料来测定，并且对于PT、FHA和PRN设定为1个ELISA单位(EU)，对于FIM设定为2个EU。有利地，在施用根据本文公开的接种方案、方法、用途或如试剂盒中所含的包含百日咳抗原的免疫原性组合物之后，百日咳特异性抗体滴度在出生时为至少10 EU的水平。
通常，滴度可以等于或高于该水平，诸如等于20 EU、30 EU、40 EU、50 EU、60 EU、70 EU、80 EU、90 EU，或等于或高于100 EU。这些值可以基于个体或基于群体平均值。有利地，在出生时观察到的抗体水平高于规定阈值，且在出生后持续几个月。
通常，滴度可以等于或高于该水平，诸如等于20 EU、30 EU、40 EU、50 EU、60 EU、70 EU、80 EU、90 EU，或等于或高于100 EU。这些值可以基于个体或基于群体平均值。有利地，在出生时观察到的抗体水平高于规定阈值，且在出生后持续几个月。
[0078] 转移抗体的效应子功能，例如，中和能力(中和滴度)也可进行评价，并且提供与保护相关的抗体的功能属性的量度。例如，在RSV的情况下，将特定量的能够复制的RSV病毒和血清的定义稀释液混合并孵育。然后将病毒血清反应混合物转移到容许病毒复制的宿主细胞(例如，HEp-2细胞)上，并且在适于细胞生长和病毒复制的条件和时间段孵育。未中和的病毒能够感染宿主细胞和在宿主细胞中复制。这导致在细胞单层上形成给定数量的噬斑形成单位(PFU)，这可以使用荧光标签的抗RSV抗体来检测。中和滴度通过计算诱导与单独病毒在无血清的情况下感染的细胞单层相比PFU的指定水平的抑制(例如，50％抑制或60％抑制)的血清稀释度来测定。例如，帕利珠单抗抗体已显示具有分别针对临床RSV A和RSV B分离株的0.65 mcg/mL (平均0.75 ± 0.53 mcg/mL；n=69，范围0.07-2.89 mcg/mL)和0.28 mcg/mL (平均0.35 ± 0.23 mcg/mL；n=35，范围0.03-0.88 mcg/mL)的中和滴度(50％有效浓度[EC 50])，所述中和滴度表示为与未处理的病毒感染的细胞相比使RSV抗原的检测降低50％需要的抗体浓度。因此，在某些实施方案中，经由胎盘转移到妊娠期婴儿的抗体的中和滴度可以在出生后的婴儿中测量，并且对于RSV A毒株具有(基于群体中值)至少约0.50 mcg/mL (例如，至少约0.65 mcg/mL)或更大的EC50，并且对于RSV B毒株具有至少约0.3 mcg/mL (例如，至少约0.35 mcg/mL)或更大的EC50。有利地，中和抗体滴度在出生后持续数周至数月维持高于规定阈值。
[0079] 对于百日咳毒素特异性的抗体的毒素中和效应子功能，如果需要，也可以，例如，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中和测定中，进行测量，所述测定，例如，描述于Gillenius等人 , “The standardization of an assay for pertussis toxin and antitoxin in microplate culture of Chinese hamster ovary cells”. J. Biol. Stand. (1985)13:61-66。然而，该测定中的中和活性与保护不是那么良好相关。
[0080] 任选地，根据本文公开的接种方案、方法、用途和试剂盒，为了延长针对RSV和百日咳的保护超越被动转移的母体抗体提供保护的生命的最初几个月，可以对婴儿主动免疫以引发对于RSV和/或百日咳特异性的适应性免疫应答。婴儿的此类主动免疫可以通过施用一种或多于一种含有RSV抗原和/或百日咳抗原的组合物来实现。例如，所述(一种或多种)组合物可以包含F蛋白类似物，任选地与佐剂配制以增强抗原引发的免疫应答。对于向以前尚未暴露于RSV的婴儿的施用，F蛋白类似物可以与佐剂配制，其引发免疫应答，所述免疫应答的特征在于产生表现出Th1细胞因子概况的T细胞(或者，特征在于表现出Th1和Th2细胞因子概况的T细胞的平衡)。
[0081] 或者，而不是施用F蛋白类似物或其他蛋白亚单位疫苗，引发适应性免疫应答以保护免于RSV的组合物可以包括活减毒病毒疫苗，或编码一种或多种RSV抗原(诸如F抗原、G抗原、N抗原或M2抗原或其部分)的核酸。例如，所述核酸可以在载体中，诸如重组病毒载体，例如，腺病毒载体，腺相关病毒载体，MVA载体，麻疹载体等。示例性病毒载体公开于WO2012 089231，其出于说明含有编码一种或多种RSV抗原的病毒载体的免疫原性组合物的目的并入本文。或者，核酸可以是自我复制的核酸，诸如自我复制的RNA，例如，呈病毒复制子，诸如α病毒复制子的形式(例如，呈用病毒结构蛋白包装的病毒复制子颗粒的形式)。此类自我复制的RNA复制子的实例描述于WO2012/103361，其出于公开编码RSV蛋白的RNA复制子和它们的作为免疫原性组合物的制剂的目的并入本文。
[0082] 额外或替代地，可以将一种或多种含有百日咳抗原的组合物施用于婴儿。例如，所述组合物可以包括选自以下的无细胞百日咳抗原：百日咳类毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)、百日咳杆菌粘附素(PRN)、2型菌毛蛋白(FIM2)、3型菌毛蛋白(FIM3)和BrkA或其组合(例如，PT和FHA；PT、FHA和PRN；或PT、FHA、PRN和FIM2和FIM3中的一者或两者)，例如，其中PT如下所述化学或遗传类毒素化。或者，所述组合物可以包括如下所述的全细胞百日咳抗原。
[0083] 在某些实施方案中，将RSV抗原组分(例如，重组蛋白，诸如F蛋白类似物)和百日咳抗原组分共同配制成待根据本文所述的接种方案、方法或用途施用的单一免疫原性组合物。或者，将RSV抗原组分和百日咳抗原组分配制在两种(或更多种)不同的免疫原性组合物中，其可以，例如，根据各种批准和推荐的小儿免疫时间表，在相同或不同的时间施用。
[0084] 当将引发适应性RSV免疫应答和/或适应性百日咳免疫应答的组合物施用于在怀孕过程中接受本文公开的RSV疫苗的母亲生育的婴儿时，所述组合物可以施用一种或多次。第一次施用可以在出生时或接近出生时(例如，在出生当天或出生次日)，或出生1周内或在出生约2周内。或者，第一次施用可以在出生后约4周，出生后约6周，出生后约2个月，出生后约3个月，出生后约4个月，或更晚，诸如出生后约6个月，出生后约9个月，或出生后约12个月。例如，在含有百日咳抗原(例如，Pa或Pw)的组合物的情况下，通常在出生后约2、4和6个月施用疫苗(随后在12-18个月和任选4-7岁之间的额外剂量)。因此，在一个实施方案中，本公开提供用于通过向雌性生育的婴儿施用一种或多种引发对于RSV和/或百日咳特异性的免疫应答的组合物而保护婴儿免于RSV和百日咳引起的疾病的方法，所述雌性在她怀有该婴儿时过程中施用包含F蛋白类似物和百日咳抗原的免疫原性组合物。
[0085] RSV F蛋白类似物本文公开且适于接种方案、方法、用途和试剂盒中使用的重组RSV抗原是源自(即，免疫上全部或部分对应于)RSV F蛋白的F蛋白类似物。它们可以包括一个或多个改变F蛋白的结构或功能的修饰、但保留F蛋白的免疫学特性，使得针对F蛋白类似物生成的免疫应答将识别天然F蛋白并因此识别RSV。本文所述的F蛋白类似物可用作免疫原。
[0086] 本文参照本领域中广泛接受的术语和名称来提供RSV F蛋白结构的详情，并在图1A中示意性显示。参照F蛋白多肽的一级氨基酸序列(图1A)，利用下列术语来描述F蛋白类似物的结构特征。
[0087] 术语F0指全长翻译的F蛋白前体。F0多肽可以细分成由称作pep27的居间肽分开的F2结构域和F1结构域。成熟过程中，F0多肽在位于F2和F1之间且在pep27侧翼的两个弗林蛋白酶位点处经历蛋白水解切割。为了随后的讨论，F2结构域包括F蛋白氨基酸1-109的至少一部分，并且多达所有，而F1结构域的可溶性部分包含F蛋白氨基酸137-526的至少一部分，并且多达所有。如上文所指明的，这些氨基酸位置(和本文指明的所有随后的氨基酸位置)参照SEQ ID NO：2的示例性F蛋白前体多肽(F0)给出。
[0088] 在自然界中，RSV F蛋白表达为长度为574个氨基酸的单一多肽前体，称作F0。在体内，F0在内质网中寡聚化，并且在两种保守的弗林蛋白酶共有序列(弗林蛋白酶切割位109 136
点)，即RARR (SEQ ID NO：15)和RKRR (SEQ IDNO：16)处被弗林蛋白酶蛋白水解加工以产生由两个二硫化物连接的片段组成的寡聚物。这些片段中较小者称作F2，并且源于F0前体的N端部分。本领域技术人员应当认识到的是，缩写F0、F1和F2在科学文献中通常称作F0、F1和F2。较大的、C端F1片段经由疏水性氨基酸序列锚定膜中的F蛋白，所述疏水性氨基酸与24个氨基酸的胞质尾部相邻。三个F2-F1二聚体结合以形成成熟的F蛋白，其采用亚稳性融原前(prefusogenic)(“融合前”)构象，该构象在与目标细胞膜接触后得到触发以经受构象变化。此构象变化暴露疏水性序列(称为融合肽)，其与宿主细胞膜结合，并促进病毒或受感染细胞的膜与目标细胞膜融合。
点)，即RARR (SEQ ID NO：15)和RKRR (SEQ IDNO：16)处被弗林蛋白酶蛋白水解加工以产生由两个二硫化物连接的片段组成的寡聚物。这些片段中较小者称作F2，并且源于F0前体的N端部分。本领域技术人员应当认识到的是，缩写F0、F1和F2在科学文献中通常称作F0、F1和F2。较大的、C端F1片段经由疏水性氨基酸序列锚定膜中的F蛋白，所述疏水性氨基酸与24个氨基酸的胞质尾部相邻。三个F2-F1二聚体结合以形成成熟的F蛋白，其采用亚稳性融原前(prefusogenic)(“融合前”)构象，该构象在与目标细胞膜接触后得到触发以经受构象变化。此构象变化暴露疏水性序列(称为融合肽)，其与宿主细胞膜结合，并促进病毒或受感染细胞的膜与目标细胞膜融合。
[0089] F1片段至少含有两种七价(heptad)重复结构域，称作HRA和HRB，并且分别位于融合肽和跨膜锚定结构域附近。处于融合前构象，F2-F1二聚体形成球状头部和茎状结构，其中HRA结构域在球状头部中处于分段的(延伸的)构象。相比之下，HRB结构域形成自头部区域延伸的三链卷曲螺旋茎。从融合前向融合后构象转变期间，HRA结构域崩塌(collapse)，并使其接近HRB结构域以形成反平行的六螺旋束。处于融合后状态，融合肽和跨膜域并列以便于膜融合。
[0090] 尽管上文所提供的构象描述基于晶体学数据的分子建模，但是可以在不诉诸于晶体学的情况下监测融合前与融合后构象之间的结构差别。例如，可以使用电子显微照相术来区别融合前和融合后(或者称作融原前和融原)构象，如由Calder等人, Virology,271:122-131 (2000)和Morton等人, Virology, 311:275-288所表明，其出于它们的技术教导的目的通过引用并入本文。也可以通过脂质体结合测定法来区别融合前构象与融原(融合后)构象，如由Connolly等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:17903-17908 (2006)所描述的，其出于其技术教导的目的通过引用并入本文。另外，可以使用如下抗体来区别融合前与融原构象，所述抗体特异性识别在RSV F蛋白的融合前或融原形式之一种或另一种上存在，而另一种形式上不存在的构象表位。此类构象表位可以是由于分子表面上抗原决定簇的优先暴露。或者，构象表位可以源于线性多肽中非连续氨基酸的并列。
[0091] 通常，F蛋白类似物(PreF、PostF等)类似物缺乏跨膜结构域和胞质尾，并且也可以被称为F蛋白胞外结构域或可溶性F蛋白胞外结构域。
[0092] F蛋白类似物包括F蛋白多肽，其已经进行修饰以稳定F蛋白的融合前构象，即成熟的经装配的F蛋白在与宿主细胞膜融合前的构象。出于清晰和简单的目的，这些F蛋白类似物称作“PreF类似物”、“PreF”或“PreF抗原”并且通常是可溶的。本文所公开的PreF类似物以如下发现为基础，即已经通过并入异源三聚化结构域来修饰的可溶性F蛋白类似物展现出改进的免疫原性特征，而且在对主体体内施用时是安全且高度保护性的。示例性PreF抗原描述于WO2010149745，其出于提供PreF抗原的实例的目的以其整体通过引用并入本文。
[0093] F蛋白类似物也包括F蛋白多肽，其具有融合后F蛋白的构象，并且可被称为PostF抗原或融合后抗原。PostF类似物描述于通过引用并入本文的WO2011008974。PostF抗原含有至少一个修饰以改变天然融合后F蛋白的结构或功能。
[0094] 在一个优选实施方案中，用于母体免疫以保护婴儿免于RSV疾病的组合物包括细胞粘附和融合之前在病毒上发现的融合前构象中稳定的RSV PreF类似物抗原。图1B中提供了示例性PreF类似物的示意图。本领域技术人员将理解，根据本文提供的教导，可以修饰任何RSV F蛋白来稳定融合前构象。因此，为了便于理解指导PreF(以及PostF，和其他构象)类似物的产生的原则，各个结构组分会参照示例性F蛋白来指明，所述示例性F蛋白的多核苷酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs:1和2中提供。类似地，当可适用时，G蛋白抗原参照示例性G蛋白来描述，所述示例性G蛋白的多核苷酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs:3和4中提供。
[0095] 将本文所公开的PreF类似物设计成稳定并维持RSV F蛋白的融合前构象，从而使得在所表达蛋白的群体中，实质部分的所表达蛋白群体处于融原前(融合前)构象(例如如通过结构和/或热力学建模所预测或者如通过上文所公开的一种或多种方法所评价)。将稳定化修饰引入天然的(或合成的)F蛋白诸如SEQ ID NO：2的示例性F蛋白中，从而使得F蛋白的融合前构象的主要免疫原性表位在将PreF类似物引入细胞或细胞外环境后(例如在体内，例如在对主体施用后)得到维持。
[0096] 第一，可以在构建体的C端末端放置异源稳定化结构域以替换F0多肽的膜锚定域。预测此稳定化结构域补偿HRB不稳定性，有助于稳定融合前构象异构体。在示例性的实施方案中，异源稳定化结构域是蛋白多聚化域。此类蛋白多聚化域的一个特别有利的实例是三聚化结构域。示例性三聚化结构域折叠成卷曲螺旋，其促进装配成具有此类卷曲螺旋域的多个多肽的三聚体。三聚化结构域的实例包括来自流感血细胞凝集素、SARS刺突、HIV gp41、修饰的GCN4、噬菌体T4 fibritin和ATCase的三聚化结构域。三聚化结构域的一个有利的实例是异亮氨酸拉链。一种示例性异亮氨酸拉链结构域是由Harbury等人 Science262:1401-1407 (1993)所描述的经工程改造的酵母GCN4异亮氨酸变体。一种合适的异亮氨酸拉链域的序列以SEQ ID NO：11表示，尽管保留形成卷曲螺旋稳定化结构域的能力的该序列的变体是同样合适的。替代的稳定化卷曲螺旋三聚化结构域包括：TRAF2(GENBANK®登录号Q12933 [gi:23503103]；氨基酸299-348)；血小板反应蛋白1(登录号PO7996 [gi:135717]；氨基酸291-314)；胞外基质蛋白-4(登录号O95460 [gi:14548117]；氨基酸
594-618)；CMP(胞外基质蛋白-1)(登录号NP_002370 [gi:4505111]；氨基酸463-496)；
HSF1(登录号AAX42211 [gi:61362386]；氨基酸165-191)；和Cubilin(登录号NP_001072 [gi:4557503]；氨基酸104-138)。预期合适的三聚化结构域导致实质部分的所表达蛋白装配成三聚体。例如，至少50％的具有三聚化结构域的重组PreF多肽将装配成三聚体(例如如通过AFF-MALS所评价)。通常，至少60％，更有利地，至少70％，并且最期望地，至少约
75％或更多的所表达多肽作为三聚体存在。
594-618)；CMP(胞外基质蛋白-1)(登录号NP_002370 [gi:4505111]；氨基酸463-496)；
HSF1(登录号AAX42211 [gi:61362386]；氨基酸165-191)；和Cubilin(登录号NP_001072 [gi:4557503]；氨基酸104-138)。预期合适的三聚化结构域导致实质部分的所表达蛋白装配成三聚体。例如，至少50％的具有三聚化结构域的重组PreF多肽将装配成三聚体(例如如通过AFF-MALS所评价)。通常，至少60％，更有利地，至少70％，并且最期望地，至少约
75％或更多的所表达多肽作为三聚体存在。
[0097] 稳定化突变的另一个实例是将亲水性氨基酸添加或取代入F蛋白的疏水域中。通常，会在疏水区中添加带电荷的氨基酸诸如赖氨酸或者用其取代中性残基诸如亮氨酸。例如，可以将/用亲水性氨基酸添加至或取代F蛋白胞外结构域的HRB卷曲螺旋域内的疏水性或中性氨基酸。通过实例的方式，可以用带电荷的氨基酸残基诸如赖氨酸取代F蛋白的位置512处存在的亮氨酸(相对于天然F0多肽；SEQ ID NO：6的示例性PreF类似物多肽的L482K)。可选地或额外地，可以将/用亲水性氨基酸添加至或取代F蛋白的HRA结构域内的疏水性或中性氨基酸。例如，可以在PreF 类似物的位置105-106处或者接近位置105-106处(例如在对应于参照SEQ ID NO：2的残基105的氨基酸之后，诸如在氨基酸105和106之间)插入一个或多个带电荷的氨基酸诸如赖氨酸。任选地，可以在HRA和HRB结构域两者中添加亲水性氨基酸或者用亲水性氨基酸取代。或者，可以缺失一个或多个疏水性残基，只要PreF 类似物的总体构象没有受到不利影响。
[0098] 第二，可以去除pep27。对处于融合前状态的RSV F蛋白的结构模型的分析提示pep27在F1和F2之间产生大的无约束环。此环并不促成融合前状态的稳定化，并且在弗林蛋白酶切割天然蛋白后被去除。因此，pep27也可以从涉及融合后(或其他)构象类似物的实施方案中去除。
[0099] 第三，可以缺失两个弗林蛋白酶切割基序中的一者或两者 (从天然F0蛋白的F2和F1结构域之间)。位于位置105-109或106-109和位置133-136的一个或两个弗林蛋白酶识别位点可以通过以下去除：缺失或取代弗林蛋白酶识别位点的一个或多个氨基酸，例如缺失一个或多个氨基酸或取代一个或多个氨基酸或一个或多个取代或缺失的组合，或使得蛋白酶不能将PreF(或其他F蛋白类似物)多肽切割为其组成结构域的修饰。任选地，也可以去除或用例如接头肽取代居间pep27肽。另外，或任选地，可以去除或取代接近融合肽的非弗林蛋白酶切割位点(例如位置112-113的金属蛋白酶位点)。
[0100] 因此，可以获得用于根据本发明的方法和用途中使用的F蛋白类似物，这是具有一个或多个改变的弗林蛋白酶切割位点的未裂解胞外域。此类F蛋白类似物多肽在宿主细胞中重组产生，所述宿主细胞在氨基酸101至161的位置未切割，例如在位置105-109和131-136的弗林蛋白酶切割位点未切割的形式分泌它们。在具体实施方案中，取代K131Q，在位置131-134的氨基酸缺失，或取代K131Q或R133Q或R135Q或R136Q，被用来抑制
136/137的切割。
136/137的切割。
[0101] 在一个示例性设计中，不从F2切割融合肽，这阻止从融合前构象异构体的球状头部释放和与邻近膜的可接近性。预测融合肽与膜界面之间的相互作用是融合前状态不稳定性的主要问题。融合过程期间，融合肽与目标膜之间的相互作用导致融合肽从球状头部结构内暴露，增强融合前状态的不稳定性，并折叠成融合后构象异构体。此构象变化实现膜融合过程。预测去除两个弗林蛋白酶切割位点中的一者或两者阻止膜与融合肽N端部分的可接近性，这稳定融合前状态。因此，在本文公开的示例性实施方案中，去除弗林蛋白酶切割基序导致产生包含完整融合肽的PreF类似物，其在加工和装配期间或之后不被弗林蛋白酶切割。
[0102] 任选地，还可以通过例如取代一个或多个氨基酸来去除至少一个非弗林蛋白酶切割位点。例如，实验证据提示，在有助于某些金属蛋白酶进行切割的条件下，可以在氨基酸110-118附近切割F蛋白类似物 (例如其中切割在F蛋白类似物的氨基酸112和113之间；
在参照F蛋白多肽SEQ ID NO：2的位置142的亮氨酸和位置143的甘氨酸之间发生)。因而，该区域内的一个或多个氨基酸的修饰可降低F蛋白类似物的切割。例如，可以用不同氨基酸诸如异亮氨酸、谷氨酰胺或色氨酸(如SEQ ID NO：20的示例性实施方案中所示)取代位置112的亮氨酸。可选地或额外地，可以用丝氨酸或丙氨酸取代位置113的甘氨酸。在进一步实施方案中，F蛋白类似物进一步含有改变的胰蛋白酶切割位点，并且F蛋白类似物在氨基酸101和161之间的位点不被胰蛋白酶切割。
在参照F蛋白多肽SEQ ID NO：2的位置142的亮氨酸和位置143的甘氨酸之间发生)。因而，该区域内的一个或多个氨基酸的修饰可降低F蛋白类似物的切割。例如，可以用不同氨基酸诸如异亮氨酸、谷氨酰胺或色氨酸(如SEQ ID NO：20的示例性实施方案中所示)取代位置112的亮氨酸。可选地或额外地，可以用丝氨酸或丙氨酸取代位置113的甘氨酸。在进一步实施方案中，F蛋白类似物进一步含有改变的胰蛋白酶切割位点，并且F蛋白类似物在氨基酸101和161之间的位点不被胰蛋白酶切割。
[0103] 任选地，F蛋白类似物可以包括一个或多个改变糖基化模式或状态的修饰(例如通过提高或降低天然F蛋白多肽中存在的一个或多个糖基化位点上被糖基化的分子比例)。例如，预测SEQ ID NO：2的天然F蛋白多肽可以在氨基酸位置27、70和500(对应SEQ ID NO：6的示例性PreF类似物的位置27、70和470)被糖基化。在一个实施方案中，在位于氨基酸位置500的糖基化位置附近引入修饰(指定为N470)。例如，可以通过用氨基酸诸如谷氨酰胺(Q)取代以替代(通过比对对应于示例性PreF类似物的位置470的参照序列的)位置500的天冬酰胺去除糖基化位点。有利地，在该糖基化位点引入增加糖基化效率的修饰。合适修饰的实例包括在位置500-502的以下氨基酸序列：NGS、NKS、NGT、NKT。有趣的是，已发现导致该糖基化位点的糖基化增加的修饰也导致实质增加的PreF产生。因此，在某些实施方案中，PreF类似物在对应于参照PreF序列(SEQ ID NO：2)氨基酸500的位置(例如在SEQ ID NO：6所例举的PreF类似物的位置470)具有修饰的糖基化位点。合适的修饰包括在对应于参照F蛋白多肽序列中位置500-502的氨基酸的序列：NGS、NKS、NGT、NKT。包括“NGT”修饰的示例性实施方案的氨基酸提供于SEQ ID NO:18。本领域技术人员可以容易地确定对应NGS、NKS和NKT修饰的类似修饰。此类修饰有利地与任何本文公开的稳定化突变(例如，异源卷曲螺旋，诸如异亮氨酸拉链，疏水性区域中的结构域和/或修饰，和/或去除pep27，和/或去除弗林蛋白酶切割位点，和/或去除非弗林蛋白酶切割位点，和/或去除非弗林蛋白酶切割位点)进行组合。例如，在一个具体实施方案中，F蛋白类似物包括去除非弗林蛋白酶切割位点的取代和增加糖基化的修饰。示例性PreF类似物序列提供于SEQ ID NO:22 (其示例性实施方案包括“NGT”修饰和谷氨酰胺取代位置112的亮氨酸的取代)。例如，在某些示例性实施方案中，糖基化修饰的PreF类似物选自：a) 包含SEQ ID NO:22或由其组成的多肽；b) 由SEQ ID NO:21或在严格条件下在实质上其整个长度与SEQ ID NO:21杂交的多核苷酸序列编码的多肽；c) 与SEQ ID NO:22具有至少95％序列同一性的多肽。
[0104] 更通常，本文公开的任一稳定修饰，例如添加异源稳定结构域，诸如卷曲螺旋(例如，异亮氨酸拉链结构域)，优选位于可溶性F蛋白类似物的C末端；疏水HRB结构域中残基的修饰，诸如亮氨酸到赖氨酸的修饰；去除pep27；去除一个或两个弗林蛋白酶切割基序；去除非弗林蛋白酶切割位点诸如胰蛋白酶切割位点；和/或糖基化位点的修饰可以与任何一种或多种(或者多达以任何期望组合中的所有)其他稳定修饰组合使用。例如，可以单独使用异源卷曲螺旋(或其他异源稳定结构域)，或者与下述中的任一种组合使用：疏水区内的修饰、和/或去除pep27、和/或去除弗林蛋白酶切割位点、和/或去除非弗林蛋白酶切割位点、和/或去除非弗林蛋白酶切割位点。某些特定实施方案中， F蛋白类似物诸如PreF类似物，包含C-端卷曲螺旋(异亮氨酸拉链)结构域、HRB疏水结构域中的稳定取代和一个或两个弗林蛋白酶切割位点的去除。此类实施方案包括未被弗林蛋白酶切割去除的完整融合肽。在一个特定实施方案中，F蛋白类似物还包括氨基酸位点500的修饰的糖基化位点。
[0105] 用于本文所述的方法和用途的F蛋白类似物可以通过这样的方法产生，所述方法包括提供含有F蛋白类似物(例如，PreF类似物、PostF类似物或未切割F蛋白胞外域，等)的生物材料和从所述生物材料纯化类似物多肽单体或多聚体(例如，三聚体)或其混合物。
[0106] F蛋白类似物可以是多肽单体或三聚体或可平衡存在的单体和三聚体的混合物的形式。单一形式的存在可以提供优点，诸如更可预测的免疫应答和更好的稳定性。
[0107] 因此，在一个实施方案中，用于本发明中使用的F蛋白类似物是纯化的F蛋白类似物，其可以是单体或三聚体或单体和三聚体的混合物的形式，其实质上不含脂质和脂蛋白。
[0108] F蛋白多肽可以选自RSVA或RSV B毒株的任何F蛋白，或者选自其变体(如上文所定义的)。在某些示例性的实施方案中，F蛋白多肽是以SEQID NO：2表示的F蛋白。为了便于理解本公开内容，所有氨基酸残基位置(不管毒株)相对于(即氨基酸残基位置对应于)示例性F蛋白的氨基酸位置给出。本领域普通技术人员可以通过使用容易地可获得且众所周知的比对算法(诸如BLAST，例如使用默认参数)来比对选定RSV毒株的氨基酸序列与示例性序列的氨基酸序列，从而容易地确定任何其他RSV A或B毒株的相当氨基酸位置。WO2008114149中公开了来自不同RSV毒株的F蛋白多肽的许多额外实例(出于提供RSV F和G蛋白序列的额外实例的目的通过引用并入本文)。额外变体可以经由遗传漂移生成，或者可以使用定点或随机诱变，或者通过重组两种或更多种先前存在的变体来人工生成。此类额外变体也适用于本文公开的免疫方法的背景下利用的F蛋白类似物的背景下。
[0109] 在可用于本文所述的方法和用途的替代实施方案中，重组RSV蛋白是如WO2011008974(其出于描述额外F蛋白类似物的目的通过引用并入本文)中所述的F蛋白类似物，参见例如WO2011008974的图1中和还有WO2011008974的实施例1中描述的F蛋白类似物。
[0110] 在选择F蛋白的F2和F1结构域时，本领域技术人员将认识到，包括整个F2和/或F1结构域不是严格必要的。通常，构象考虑在选择F2结构域的子序列(或片段)时是重要的。因此，F2结构域通常包括F2结构域中促进多肽装配和稳定性的部分。在某些示例性的变体中，F2结构域包括氨基酸26-105。然而，在长度上具有微小修饰(通过添加或缺失一个或多个氨基酸)的变体也是可能的。
[0111] 通常，选择至少F1结构域的子序列(或片段)，并将其设计成维持包括F蛋白的免疫优势表位的稳定构象。例如，通常期望选择F1多肽结构域中包括氨基酸262-275(帕利珠单抗(palivizumab)中和)和423-436(Centocor的ch101F单抗)的区域中由中和性抗体识别的表位的子序列。另外，期望包括T细胞表位，例如在氨基酸328-355的区域中。最常见地，作为F1亚单位的单一连续部分(例如跨越氨基酸262-436)，但是表位可以在包括作为以稳定构象装配的不连续元件的这些免疫优势表位的合成序列中得到保留。因此，F1结构域多肽包含RSV F蛋白多肽的至少约氨基酸262-436。在本文提供的一个非限制性实例中，F1结构域包含天然F蛋白多肽的氨基酸137至516。本领域技术人员将认识到，额外更短的子序列可以任凭从业人员使用。
[0112] 在选择F2或F1结构域的子序列时(例如，如在下文就某些PreF-G 类似物的G蛋白组分而言进行讨论)，除了构象考虑以外，可期望基于包括额外免疫原性表位来选择序列(例如变体、子序列等)。例如，可以使用本领域中已知的锚基序或其他方法诸如神经网络或多项式确定来鉴定额外T细胞表位，参见例如RANKPEP(在万维网上于：mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html可获得)；ProPredI(在万维网上于：imtech.res.in/raghava/propredI/index.html可获得)；Bimas(在万维网上于：www-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.html可获得)；和SYFPEITH(在万维网上于：syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm可获得)。例如，使用算法来测定肽的“结合阈值”，并选择具有给予它们MHC或抗体以某种亲和力结合的高概率的得分的那些。算法基于对MHC结合特定位置处的特定氨基酸的影响、对抗体结合特定位置处的特定氨基酸的影响、或对结合含有基序的肽中的特定取代的影响。在免疫原性肽的背景内，“保守残基”是在肽中特定位置处以比通过随机分布会预期的频率显著更高的频率出现的残基。锚残基是保守残基，其提供与MHC分子的接触点。由此类预测方法鉴定的T细胞表位可以通过测量它们对特定MHC蛋白的结合及通过其在MHC蛋白的背景下呈递时刺激T细胞的能力来确认。
[0113] 有利地，F蛋白类似物, 例如PreF 类似物 (包括PreF-G 类似物，如下文所讨论的)，Post F 类似物，或其他构象类似物，包括对应于表达系统的信号肽，例如哺乳动物或病毒信号肽，诸如RSV F0天然信号序列(例如SEQ ID NO：2的氨基酸1-25或SEQ ID NO：6的氨基酸1-25)。通常，信号肽选择为与选择用于重组表达的细胞相容。例如，可以用信号肽(诸如杆状病毒信号肽，或蜂毒肽信号肽)取代以在昆虫细胞中表达。合适的植物信号肽是本领域中已知的，如果植物表达系统是优选的。许多示例性信号肽是本领域中已知的(参见例如，参见Zhang & Henzel,Protein Sci.,13:2819-2824 (2004)，其描述了许多人信号肽)，并列入例如SPdb信号肽数据库，其包括古细菌、原核生物和真核生物的信号序列(http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/)。任选地，任何前述抗原可以包括额外序列或标签诸如His标签来促进纯化。
[0114] 任选地，F蛋白类似物(例如，PreF或Post F或其他类似物)可包括额外免疫原性组分。在某些特别有利的实施方案中，F蛋白类似物包括RSV G蛋白抗原性组分。具有PreF和G组分的示例性嵌合蛋白包括下列PreF_V1(以SEQ ID NO：7和8表示)和PreF_V2(以SEQ IDNO：9和10表示)。
[0115] 在PreF-G类似物中，在构建体的C端末端处添加G蛋白的抗原性部分(例如截短的G蛋白，诸如氨基酸残基149-229)。通常，经由柔性接头序列将G蛋白组分连接至F蛋白组分。例如，在示例性PreF_V1设计中，通过-GGSGGSGGS-接头(SEQ ID NO：14)将G蛋白连接至PreF组分。在PreF_V2设计中，接头较短。代替具有-GGSGGSGGS-接头(SEQ ID NO：14)，PreF_V2具有用于接头的2个甘氨酸(-GG-)。
[0116] 在存在时，G蛋白多肽结构域可以包括选自任何RSV A或RSV B毒株的G蛋白的整个或部分。在某些示例性实施方案中，G蛋白是以SEQ ID NO:4表示的G蛋白(或者与其95％相同)。合适的G蛋白序列的额外实例可见WO2008114149 (通过引用并入本文)。
[0117] G蛋白多肽组分选择为包括至少G蛋白的保留免疫优势T细胞表位(例如在氨基酸183-197的区域中)的子序列(或片段)，诸如G蛋白的包括天然G蛋白的氨基酸151-229、149-229、或128-229的片段。在一个示例性实施方案中，G蛋白多肽是天然G蛋白多肽中包括天然G蛋白多肽的氨基酸残基149至229整个或部分的子序列(或片段)。本领域技术人员将容易理解，也可以使用更长或更短的G蛋白部分，只要所选部分不在构象上使F蛋白类似物不稳定或者破坏F蛋白类似物的表达、折叠或加工。任选地，G蛋白结构域包括位置191的氨基酸取代，先前已经显示其参与减轻和/或预防特征在于与福尔马林灭活的RSV疫苗相关的嗜酸粒细胞增多的增强性疾病。天然存在的和取代的(N191A)G蛋白的属性的全面描述可见例如美国专利公开号2005/0042230，其通过引用并入本文。
[0118] 或者，F蛋白类似物可配制在免疫原性组合物中，所述免疫原性组合物还含有包括G蛋白组分的第二多肽。G蛋白组分通常包括至少G蛋白的氨基酸149-229。尽管可以使用G蛋白的更小部分，但是此类片段应当最低限度包括氨基酸184-198的免疫学优势表位。或者，G蛋白可以包括G蛋白的更大部分，诸如氨基酸128-229或130-230，任选地，作为更大蛋白诸如全长G蛋白或嵌合多肽的元件。
[0119] 例如，就选择与天然存在的毒株对应的序列而言，一个或多个结构域可以在序列上对应于RSV A或B毒株，诸如称作A2或Long的常见实验室分离株，或任何其他天然存在的毒株或分离株。迄今已经分离出多种RSV毒株。由GenBank和/或EMBL登录号指明的示例性毒株可见WO2008114149，出于公开适合于在本文公开的F蛋白类似物中使用的RSV F的核酸和多肽序列的目的，其通过引用并入本文。额外RSV毒株可能会得到分离，并且涵盖在RSV属内。类似地，RSV属涵盖通过遗传漂移和/或重组，由天然存在毒株(例如以前或以后鉴定的毒株)产生的变体。
[0120] 除了此类天然存在的和分离的变体外，也可以在F蛋白类似物包括PreF、PostF或其他类似物(包括F-G)类似物的背景下采用与上述序列共享序列相似性的经工程改造的变体。本领域技术人员应当理解的是，F蛋白类似物多肽(和如下所述的多核苷酸序列)之间的相似性，就多肽(和通常，核苷酸序列)而言，可以在序列间的相似性(在其他情况中称为序列同一性)方面表示。序列同一性常常在百分比同一性(或相似性)方面进行测量；百分比越高，两种序列的一级结构越相似。通常，两种氨基酸(或多核苷酸)序列的一级结构越相似，源于折叠和装配的更高级结构越相似。F蛋白多肽(和多核苷酸)序列的变体通常具有一个或少量氨基酸缺失、添加或取代，但是仍然共享非常高百分比的其氨基酸，和通常其多核苷酸序列。更重要的是，变体保留本文所公开的参照序列的结构属性和因此，构象属性。
[0121] 测定序列同一性的方法是本领域中众所周知的，并且可适用于F蛋白类似物多肽，以及编码它们的核酸(例如如下所述)。多种程序和比对算法描述于Smith和Waterman, Adv.Appl.Math.2:482,1981;Needleman 和 Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970;Higgins 和Sharp,Gene 73:237,1988;Higgins和Sharp, CABIOS 5:151, 1989;Corpet等人, Nucleic Acids Research 16:10881,1988; 以 及Pearson 和 Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444,1988。Altschul等人,Nature Genet.6:119, 1994呈现了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。NCBI基本的局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST) (Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403, 1990)可获自数个来源，包括(美国)国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI，Bethesda，MD)及在因特网上，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx组合使用。如何使用此程序来测定序列同一性的描述在因特网上NCBI网站上可获得。
[0122] 在一些情况下，F蛋白类似物相对于衍生其的天然存在的毒株的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸修饰(例如除了上述稳定化修饰外)。此类差异可以是一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。变体通常相差不超过约1％、或2％、或5％、或10％、或15％、或20％的氨基酸残基。例如，与参照F蛋白序列(例如，SEQ ID NO:6、8、10、18、20和/或22的PreF类似物多肽序列)的相关部分相比，变体F蛋白类似物，例如，PreF或PostF或其他类似物多肽序列可以包括1或2，或至多5，或至多约10，或至多约15，或至多约50，或至多约100个氨基酸差异。因此，RSV F或G蛋白，或F蛋白类似物背景下的变体通常与参照蛋白(例如在PreF类似物的背景下：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、18、20和/或22中显示的参照序列，或本文所公开的任何示例性PreF类似物)共享至少80％、或85％，更常见地，至少约90％或更多，诸如95％，或甚至98％或99％序列同一性。作为本公开的特征包括的额外变体是包括选自WO2008114149中所公开的天然存在变体的核苷酸或氨基酸序列整个或部分的F蛋白类似物。额外变体可以经由遗传漂移生成，或者可以使用定点或随机诱变，或者通过重组两种或更多种先前存在的变体来人工生成。此类额外变体在本文所公开的F蛋白类似物抗原的背景下也是合适的。例如，修饰可以是一个或多个氨基酸(诸如两个氨基酸、三个氨基酸、四个氨基酸、五个氨基酸、多至约十个氨基酸，或更多个)的取代，其不改变所得F蛋白类似物的构象或免疫原性表位。
[0123] 可选地或额外地，修饰可以包括一个或多个氨基酸的缺失和/或一个或多个氨基酸的添加。确实，如果需要，一个或多个多肽结构域可以是合成的多肽，其不对应于任何单一毒株，但是包括来自多个毒株，或者甚至来自通过比对多种RSV病毒株多肽推导的共有序列的组分子序列。在某些实施方案中，通过添加构成标签的氨基酸序列来修饰一个或多个多肽结构域，所述标签便于随后的加工或纯化。此类标签可以是抗原性或表位标签、酶标签或多组氨酸标签。通常，标签位于蛋白的一个或另一个末端，诸如在抗原或融合蛋白的C端或N端。
[0124] 本文公开的F蛋白类似物(和还有如果适用，G抗原)可以使用充分确立的表达和纯化重组蛋白的程序来产生。
[0125] 简而言之，通过任何许多众所周知的程序，诸如电穿孔、脂质体介导的转染、磷酸钙沉淀、感染、转染等(这取决于载体和宿主细胞的选择)将编码F蛋白类似物的重组核酸引入宿主细胞。有利的宿主细胞包括原核(即细菌)宿主细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)，以及许多真核宿主细胞，包括真菌 (例如，酵母，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴氏德毕赤酵母(Picchia pastoris))细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞(诸如3T3、COS、CHO、BHK、HEK 293)或Bowes黑色素瘤细胞。在所选宿主细胞中表达之后，重组F蛋白类似物可以根据本领域众所周知的程序进行分离和/或纯化。示例性表达方法以及编码PreF类似物(包括PreF-G类似物)的核酸提供在WO2010149745中，其出于提供用于表达和纯化F蛋白类似物的合适方法的目的并入本文。
[0126] 百日咳抗原在本文公开的接种方案、方法、用途和试剂盒的背景下，所述至少一种百日咳博德特氏菌抗原可以是选自以下的至少一种无细胞百日咳(Pa)蛋白：百日咳类毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)、百日咳杆菌粘附素(PRN)、2型菌毛蛋白(FIM2)、3型菌毛蛋白(FIM3)。此类无细胞抗原是本领域众所周知的。抗原进行部分或高度纯化。
[0127] PT可以以各种方式产生，例如通过从百日咳博德特氏菌的培养物纯化毒素、随后化学脱毒(例如如WO91/12020中描述，其通过引用并入本文)，或者通过纯化PT的遗传脱毒的类似物(例如，如以下中描述，其出于公开考虑的PT的遗传修饰的目的通过引用并入本文：EP306318、EP322533、EP396964、EP322115、EP275689)。在一个具体实施方案中，PT是遗传脱毒的。更具体地，遗传脱毒的PT携带以下取代中的一者或两者：R9K和E129G。
[0128] 百日咳抗原组分可以包括无细胞百日咳抗原PT、FHA、PRN、FIM2和FIM3中的任何1、2、3、4或5种，包括其组合。更具体地，组合可以具体包括(且不限于)：PT和FHA；PT、FHA和PRN；PT、FHA、PRN和FIM2；PT、FHA、PRN和FIM3；和PT、FHA、PRN、FIM2和FIM3。
[0129] 在一个具体实施方案中，PT以2-50ug (例如精确地或近似地2.5或3.2ug/剂量)，5-40ug (例如精确地或近似地5或8ug/剂量)或10-30ug (例如精确地或近似地20或25ug/剂量)的量使用。
[0130] 在一个具体实施方案中，FHA以2-50ug (例如精确地或近似地2.5或34.4ug/剂量)，5-40ug (例如精确地或近似地5或8ug/剂量)或10-30ug (例如精确地或近似地20或25ug/剂量)的量使用。
[0131] 在一个具体实施方案中，PRN以0.5-20ug，0.8-15ug (例如精确地或近似地0.8或1.6ug/剂量)或2-10ug (例如精确地或近似地2.5或3或8ug/剂量)的量使用。
[0132] 在一个具体实施方案中，FIM2和/或FIM3以0.5-10ug(例如精确地或近似地0.8或5ug/剂量)的总量使用。
[0133] 在一个具体实施方案中，百日咳抗原组分包括等量/剂量(为精确地或近似地8或20或25ug)的PT和FHA。或者，百日咳抗原组分包括精确地或近似地分别5和2.5ug或精确地或近似地3.2和34.4ug的PT和FHA。在一个进一步实施方案中，免疫原性组合物包含分别精确或近似量/剂量为25:5:8ug；8:8:2.5ug；20:20:3ug；2.5:5:3ug；5:2.5:2.5ug；或3.2:34.4:1.6ug的PT、FHA和PRN。
[0134] 或者，或与任何上面讨论的无细胞百日咳抗原组合，百日咳抗原组分可以包含源自百日咳博德特氏菌‘BrkA’抗原的抗原(如公开于WO2005/032584，和Marr等人(2008), Vaccine, 26(34):4306-4311，其通过引用并入本文)。
[0135] 在一个进一步实施方案中，至少一种Pa抗原可以采用从百日咳博德特氏菌获得的外膜囊泡(OMV)的形式，如公开于Roberts等人(2008), Vaccine, 26:4639-4646，其通过引用并入本文。具体而言，此类OMV可以源自表达脂质A修饰酶，诸如3-O-脱酰酶，例如PagL的重组百日咳博德特氏菌菌株(Asensio等人(2011), Vaccine, 29:1649-1656，其通过引用并入本文)。
[0136] 在一个替代实施方案中，至少一种百日咳博德特氏菌抗原是全细胞百日咳(Pw)疫苗，此类Pw疫苗是本领域众所周知的。Pw可以通过几种已知方法，包括无汞方法，进行灭活。此类方法可以包括热(例如55-65℃或56-60℃，持续5-60分钟或持续10-30分钟，例如60℃持续30分钟)，甲醛(例如0.1％，在37℃，24小时)，戊二醛(例如，0.05%，在室温，10分钟)，丙酮-I(例如，在室温三次处理)或丙酮-II(例如在室温三次处理和在37℃第四次处理)灭活(参见例如Gupta等人, 1987, J. Biol. Stand. 15:87; Gupta等人,1986, Vaccine, 4:185)。制备适用于本发明的免疫原性组合物中的杀灭的全细胞百日咳博德特氏菌(Pw)的方法公开于WO93/24148。
[0137] 更具体地，本发明的免疫原性组合物包含5-50、7-40、9-35、11-30、13-25、15-21、或近似地或精确地20(以国际不透明度单位，“IOU”)的量/剂量的Pw。
[0138] 在本发明的包含Pw的免疫原性组合物的一个具体实施方案中，组合物的Pw疫苗组分引发降低的反应原性。Pw疫苗的反应原性(疼痛、发热、肿胀等)主要由脂寡糖(‘LOS’，其在百日咳博德特氏菌的背景下与脂多糖(‘LPS’)同义；‘LOS’将用于本文中)引起，所述脂寡糖是来自细菌外膜的内毒素。LOS的脂质A部分是主要负责的。为了产生更低反应原性的含有Pw的疫苗(相对于诸如通过上面讨论的失活方法制备的‘传统’Pw疫苗)，内毒素可以遗传或化学脱毒和/或从外膜提取。然而，这必须以不实质损害Pw疫苗的免疫原性的方式来进行，因为LOS是免疫系统的有效佐剂。
[0139] 在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物的至少一种百日咳博德特氏菌抗原包含‘低反应原性’Pw疫苗，其中LOS已经遗传或化学脱毒和/或提取。例如，Pw疫苗可以进行用有机溶剂(诸如丁醇和水)的混合物处理，如描述于WO2006/002502和Dias等人(2012), Human Vaccines & Immunotherapeutics, 9(2):339-348，其出于公开LOS的化学提取的目的通过引用并入本文。
[0140] 在一个替代实施方案中，‘低反应原性’通过从经遗传工程改造以产生较低毒性LOS的百日咳博德特氏菌菌株衍生Pw疫苗来实现。WO2006/065139(通过引用并入本文)公开了百日咳博德特氏菌LOS的遗传3-O-脱酰化和脱毒，这导致产生包含至少部分的3-O-脱酰化的LOS的菌株。本发明的免疫原性组合物的至少一种百日咳博德特氏菌抗原因此可以是衍生自已经工程改造以表达脂质A修饰酶诸如脱-O-酰化酶的百日咳博德特氏菌菌株的Pw疫苗。具体而言，此类菌株可以表达PagL，如描述于WO2006/065139，以及Geurtsen等人(2006), Infection and Immunity, 74(10):5574-5585和Geurtsen等人(2007), Microbes and Infection, 9:1096-1103，所有都通过引用并入本文。可选地或额外地，衍生Pw疫苗的菌株可以天然地，或由于工程改造：缺乏用葡糖胺修饰其脂质A磷酸基团的能力；具有在C-3’位置被C10-OH或C12-OH取代的脂质A二葡糖胺骨架；和/或表达缺乏末端庚糖的分子LOS种类。此类菌株，18-323，公开于Marr等人(2010), The Journal of Infectious Diseases, 202(12):1897-1906 (通过引用并入本文)。
[0141] 免疫原性组合物表达和纯化之后，F蛋白类似物通常配制入用于施用于怀孕雌性的免疫原性组合物，且当需要时配制入用于施用于出生后的婴儿的制剂。此类制剂通常含有药学可接受的载体或赋形剂。任选地，额外抗原也可以包括在制剂中，诸如另一种RSV抗原(例如，如WO2010149745中所述的G蛋白抗原)或人偏肺病毒(hMPV)抗原、白喉抗原、破伤风抗原或流感抗原。WO2010149743描述了可与RSV抗原组合的hMPV抗原的实例，并且出于提供hMPV抗原的实例的目的通过引用并入本文。Gall S.A. 等人. Maternal Immunization with tetanus-diphtheria-pertussis vaccine: effect on maternal and neonatal serum antibody levels. Am J Obstet Gynecol 2011:204，描述了用含有百日咳抗原百日咳杆菌粘附素(PRN)、百日咳毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)和菌毛蛋白(FIM) 2/3的白喉-破伤风-百日咳(Tdap)疫苗免疫孕妇，并且出于提供关于使用百日咳抗原的母体免疫的额外细节的目的通过引用并入本文。
[0142] 药学可接受载体和赋形剂是众所周知的，并且可以由本领域技术人员进行选择。例如，载体或赋形剂可以有利地包括缓冲剂。任选地，载体或赋形剂还含有至少一种稳定溶解度和/或稳定性的组分。增溶剂/稳定剂的实例包括去污剂，例如月桂树肌氨酸和/或tween。替代的增溶剂/稳定剂包括精氨酸和玻璃形成多元醇(诸如蔗糖、海藻糖等)。许多药学可接受的载体和/或药学可接受的赋形剂是本领域已知的，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,E.W.Martin,Mack Publishing Co., Easton, PA, 第5版(975)。
[0143] 因此，本领域技术人员可以选择合适的赋形剂和载体以产生适合于通过所选施用途径向主体递送的制剂。
[0144] 合适的赋形剂包括但不限于：甘油、聚乙二醇(PEG)、山梨糖醇、海藻糖、N-月桂酰2+ 2+
肌氨酸钠盐、L-脯氨酸、非去污剂磺基甜菜碱、盐酸胍、脲、三甲胺氧化物、KCl、Ca 、Mg 、
2+ 2+
Mn 、Zn 和其他二价阳离子相关盐、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇(Dithioerytrol)、和β-巯基乙醇。其他赋形剂可以是去污剂(包括：Tween80、Tween20、Triton X-00、NP-40、Empigen BB、辛基葡糖苷、月桂酰麦芽糖苷、Zwittergent 3-08、Zwittergent 3-0、Zwittergent3-2、Zwittergent 3-4、Zwittergent 3-6、CHAPS、去氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、溴化十六烷基三甲铵)。
肌氨酸钠盐、L-脯氨酸、非去污剂磺基甜菜碱、盐酸胍、脲、三甲胺氧化物、KCl、Ca 、Mg 、
2+ 2+
Mn 、Zn 和其他二价阳离子相关盐、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇(Dithioerytrol)、和β-巯基乙醇。其他赋形剂可以是去污剂(包括：Tween80、Tween20、Triton X-00、NP-40、Empigen BB、辛基葡糖苷、月桂酰麦芽糖苷、Zwittergent 3-08、Zwittergent 3-0、Zwittergent3-2、Zwittergent 3-4、Zwittergent 3-6、CHAPS、去氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、溴化十六烷基三甲铵)。
[0145] 在用于本文所述的接种方案、方法、用途和试剂盒的含有F蛋白类似物和/或百日咳抗原的组合物中，所述组合物被设计为诱导强烈血清(例如，中和)抗体应答。母亲已经暴露于RSV和百日咳(例如，通过自然感染或免疫)，并且因此将具有现有引发的应答，所以为婴儿提供保护的目标是尽可能有效地和就可以高效穿过胎盘且为婴儿提供保护的抗体亚类诸如IgG1而言加强这种引发的应答。这可以在不包括佐剂，或通过包括仅包括矿物盐诸如铝盐或钙盐、特别是氢氧化铝、磷酸铝或磷酸钙的佐剂，来实现。或者，这可以通过用油和水乳状液佐剂或增强IgG1亚类的抗体产生的另一种佐剂配制来实现。因此，用于本文所述的接种方案、方法、用途和试剂盒的F蛋白类似物和/或百日咳抗原有利地与矿物盐，有利地明矾(氢氧化铝或磷酸铝)，或者与油和水乳状液佐剂配制。
[0146] 选择在孕妇中安全且良好耐受的任何佐剂。任选地，免疫原性组合物还包括除了明矾以外的佐剂。例如，有利地选择包括3D-MPL、角鲨烯(例如，QS21)、脂质体、和/或油和水乳状液中的一种或多种的佐剂，条件是最终制剂增强怀孕(并且通常引发的)雌性中具有期望特征(例如，亚类和中和功能)的RSV特异性抗体和百日咳抗体的产生。
[0147] 在一些情况下，佐剂制剂包括矿物盐诸如钙或铝(明矾)盐，例如磷酸钙、磷酸铝或氢氧化铝。当存在明矾(或单独，或例如，与3D-MPL组合)时，所述量通常为约100μg至1mg，诸如约100μg，或约200μg至约750μg，诸如约500μg/剂量。
[0148] 在一些实施方案中，佐剂包括油和水乳状液，例如，水包油乳状液。水包油乳状液的一个实例包含在含水载体中可代谢油，诸如角鲨烯；母育酚(tocol)，诸如生育酚，例如α-生育酚；和表面活性剂，诸如山梨醇三油酸酯(Span 85™)或聚环氧乙烷山梨醇单油酸酯(Tween 80™)。水包油乳状液的实例为MF59。在某些实施方案中，水包油乳状液不含有任何额外免疫刺激剂(特别是其不含有无毒脂质A衍生物，诸如3D-MPL；或皂苷，诸如QS21)。含水载体可以是例如磷酸盐缓冲盐水。此外，水包油乳状液可以含有span 85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。
[0149] 在本发明的另一个实施方案中，佐剂组合物包含水包油乳状液和任选地，一种或多种进一步免疫刺激物，其中所述水包油乳状液包含0.5-10 mg可代谢油(合适地角鲨烯)、0.5-11 mg母育酚(合适的是生育酚，诸如α-生育酚)和0.4-4 mg乳化剂。
[0150] 以其自身或与3D-MPL或本文所述的另一种佐剂组合，用于此处描述的接种方案、方法、用途和试剂盒的免疫原性组合物中的可以与F蛋白类似物，诸如PreF类似物用于免疫原性组合物中的其他佐剂，是皂苷，诸如QS21。此类佐剂通常不与百日咳抗原一起采用(但如果需要这样，可以采用)。
[0151] 在一个实施方案中，用于本文所述的方法和用途的重组F蛋白类似物，诸如PreF抗原与皂苷例如QS21配制，特别是提供了preF类似物和QS21的组合。
[0152] 在另一个实施方案中，用于本文所述的方法和用途的F蛋白类似物诸如PreF抗原与QS21和3D-MPL配制。
[0153] 皂苷类教导于：Lacaille-Dubois, M和Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine第二卷pp363-386)。皂苷类是植物和海洋动物界中广泛分布的类固醇或三萜糖苷。皂苷类记录用于在水中形成胶体溶液(其在摇动后起泡沫)且用于沉淀胆固醇。当皂苷类接近细胞膜时，它们在膜中产生引起膜爆裂的孔样结构。红细胞溶血是此现象的一个实例，其是某些但不是所有皂苷类的特性。
[0154] 已知皂苷类为用于全身施用的疫苗中的佐剂。本领域中已经广泛研究了个别皂苷的佐剂和溶血活性(Lacaille-Dubois和Wagner，参见上文)。例如，QuilA(衍生自南美乔木皂皮树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮)及其级分描述于US 5,057,540和“Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; 以及EP 0 362 279 B1。包含Quil A级分的颗粒结构(称作免疫刺激性复合物(ISCOMS))是溶血的，并且已经在疫苗的制造中使用(Morein, B., EP 0109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739)。溶血性皂苷类QS21和QS17(HPLC纯化的Quil A级分)已经被描述为有效的系统佐剂，并且其生产方法公开于美国专利号5,057,540和EP 0 362 279 B1，通过引用并入本文。已经在系统疫苗接种研究中使用的其他皂苷类包括衍生自其他植物物种诸如丝石竹(Gypsophila)和肥皂草(Saponaria)的那些(Bomford等人, Vaccine, 10(9):572-577, 1992)。
[0155] QS21是衍生自皂皮树树皮的Hplc纯化的非毒性级分。美国专利号5,057,540中公开了用于生成QS21的方法。含有QS21的非反应原性佐剂制剂描述于WO 96/33739。前述参考文献通过引用并入本文。可以以每人剂量的免疫原性组合物1和50μg之间的量使用所述免疫学活性皂苷，诸如QS21。有利地，以约25μg，例如20-30μg之间，合适地，21-29μg之间或22-28μg之间或23-27μg之间或24-26μg之间，或25μg的水平使用QS21。在另一个实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约10μg，例如5和15μg之间，合适地6-14μg之间，例如7-13μg之间或8-12μg之间或9-11μg之间，或10μg的水平的QS21。在一个进一步实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约5μg，例如1-9μg之间，或2-8μg之间或者合适地3-7μg之间或4-6μg之间，或5μg的水平的QS21。已经显示了包含QS21和胆固醇的此类制剂在与抗原一起配制时是成功的Th1刺激性佐剂。因此，例如，PreF多肽可以有利地与包含QS21和胆固醇的组合的佐剂用于免疫原性组合物中。
[0156] 如上所示，所述佐剂可以包括矿物盐诸如铝盐或钙盐、特别是氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙。此类佐剂还可以包括3D-MPL。例如，含有3D-MPL以及铝盐(例如，氢氧化铝或磷酸铝，“明矾”)的佐剂适合于配制用于施用于人主体的含有F蛋白类似物的免疫原性组合物中。此类制剂通常不与百日咳抗原一起使用，但如果需要这样，可以使用。
[0157] 3D-MPL是非毒性细菌脂多糖衍生物。合适的脂质A的非毒性衍生物的实例是单磷酰脂质A或者更具体地，3-脱酰单磷酰(monophoshoryl)脂质A(3D-MPL)。3D-MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.以名称MPL销售，并且在整个文献中称为MPL或3D-MPL。参见例如，美国专利号4,436,727; 4,877,611; 4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进具有IFN-γ(Th1)表型的CD4+T细胞应答。可以根据GB2220211 A中所公开的方法来生成3D-MPL。在化学上，它是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。在本发明的组合物中，可以使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有如下颗粒大小，使得其可以无菌过滤通过0.22μm滤器。此类制备物描述于WO94/21292。
[0158] 可以以每人剂量的免疫原性组合物1和50μg之间的量使用脂多糖诸如3D-MPL。可以以约25μg，例如20-30μg之间，合适地21-29μg之间或22和28μg之间或23和
27μg之间或24和26μg之间，或25μg的水平使用此类3D-MPL。在另一个实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约10μg，例如5和15μg之间，合适地6和14μg之间，例如7和13μg之间或8和12μg之间或9和11μg之间，或10μg的水平的3D-MPL。在一个进一步实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约5μg，例如1和9μg之间，或2和8μg之间或者合适地3和7μg之间或4和μg之间，或5μg的3D-MPL。
27μg之间或24和26μg之间，或25μg的水平使用此类3D-MPL。在另一个实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约10μg，例如5和15μg之间，合适地6和14μg之间，例如7和13μg之间或8和12μg之间或9和11μg之间，或10μg的水平的3D-MPL。在一个进一步实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约5μg，例如1和9μg之间，或2和8μg之间或者合适地3和7μg之间或4和μg之间，或5μg的3D-MPL。
[0159] 在其他实施方案中，脂多糖可以是β(1-6)葡糖胺二糖，如描述于美国专利号6,005,099和EP专利号0 729 473 B1。基于这些参考文献的教导，本领域技术人员会容易地能够产生各种脂多糖，诸如3D-MPL。尽管如此，每篇这些参考文献通过引用并入本文。除了前述免疫刺激物(其在结构上与LPS或MPL或3D-MPL类似)外，作为上述MPL结构的亚部分的酰化单糖和二糖衍生物也是合适的佐剂。在其他实施方案中，佐剂是脂质A的合成衍生物，其中一些被描述为TLR-4激动剂，并且包括但不限于：OM174(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰基氧基十四烷酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基二氢磷酸酯) (WO
95/14026)；OM 294 DP (3S,9R)-3--[(R)-十二烷酰基氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸-1,10-二醇，1,10-二(二氢磷酸酯) (WO 99/64301和WO 00/0462 )；和OM 197 MP-Ac DP (3S-,9R)-3-[(R)-十二烷酰基氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸-1,10-二醇，
1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯) (WO 01/46127)。
95/14026)；OM 294 DP (3S,9R)-3--[(R)-十二烷酰基氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸-1,10-二醇，1,10-二(二氢磷酸酯) (WO 99/64301和WO 00/0462 )；和OM 197 MP-Ac DP (3S-,9R)-3-[(R)-十二烷酰基氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸-1,10-二醇，
1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯) (WO 01/46127)。
[0160] 在一个具体实施方案中，佐剂制剂包括以乳状液诸如水包油乳状液形式制备的3D-MPL。在一些情况下，所述乳状液具有直径小于0.2μm的小粒径，如公开于WO94/21292。例如，3D-MPL颗粒可以小得足以无菌过滤通过0.22微米膜(如描述于欧洲专利号0 689 454)。或者，3D-MPL可以制备在脂质体制剂中。任选地，含有3D-MPL(或其衍生物)的佐剂还包括额外免疫刺激性组分。
[0161] 不同佐剂诸如本文上面提及那些的组合，也可以与F蛋白类似物诸如PreF类似物(和如果需要，任选地还与百日咳抗原)用于组合物中。例如，如已经注明，可以将QS21与3D-MPL配制在一起。QS21∶3D-MPL的比率将通常为大约1∶10至10∶1；诸如1∶5至
5∶1，和经常实质上为1∶1。通常，比率在2.5∶1至1∶1 3D-MPL∶QS21的范围中。
另一种组合佐剂制剂包括3D-MPL和铝盐，诸如氢氧化铝。
5∶1，和经常实质上为1∶1。通常，比率在2.5∶1至1∶1 3D-MPL∶QS21的范围中。
另一种组合佐剂制剂包括3D-MPL和铝盐，诸如氢氧化铝。
[0162] 可以使用的其他TLR4配体是烃基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)诸如WO 98/50399或美国专利号6,303,347 (还公开了用于制备AGP的方法)中公开的那些，合适地，RC527或RC529或AGP的药学可接受盐，如公开于美国专利号6,764,840。一些AGP是TLR4激动剂，而一些是TLR4拮抗剂。认为两者作为佐剂都是有用的。
[0163] 能够经由TLR-4引起信号传导应答(Sabroe等人, JI 2003 p1630-5)的其他合适的TLR-4配体是例如来自革兰氏阴性细菌的脂多糖及其衍生物，或其片段，特别是LPS的非毒性衍生物(诸如3D-MPL)。其他合适的TLR激动剂是：热休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性剂蛋白A、乙酰透明质酸寡糖、硫酸乙酰肝素片段、纤连蛋白片段、血纤蛋白原肽和b-防卫素-2、和胞壁酰二肽(MDP)。在一个实施方案中，TLR激动剂是HSP
60、70或90。其他合适的TLR-4配体如描述于WO 2003/011223和WO 2003/099195，诸如WO2003/011223的第4-5页或WO2003/099195的第3-4页上公开的化合物I、化合物II和化合物III和特别是WO2003/011223中公开为ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764的那些化合物。例如，一种合适的TLR-4配体是ER804057。
60、70或90。其他合适的TLR-4配体如描述于WO 2003/011223和WO 2003/099195，诸如WO2003/011223的第4-5页或WO2003/099195的第3-4页上公开的化合物I、化合物II和化合物III和特别是WO2003/011223中公开为ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764的那些化合物。例如，一种合适的TLR-4配体是ER804057。
[0164] 额外TLR激动剂作为佐剂也是有用的。术语“TLR激动剂”是指能够经由TLR信号传导途径引起信号传导应答(或是作为直接的配体或是间接地经由生成内源或外源配体)的试剂。可以使用此类天然的或合成的TLR激动剂作为替代或额外佐剂。Kaisho & Akira, Biochimica et Biophysica Acta 1589:1-13, 2002中提供了TLR作为佐剂受体的作用的简短综述。这些潜在佐剂包括但不限于TLR2、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的激动剂。因此，在一个实施方案中，佐剂和免疫原性组合物进一步包含选自以下的佐剂：TLR-1激动剂、TLR-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-5激动剂、TLR-6激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂、或其组合。
[0165] 在本发明的一个实施方案中，使用能够经由TLR-1引起信号传导应答的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-1引起信号传导应答的TLR激动剂选自：三酰化脂肽(LP)；酚可溶性调控蛋白(modulin)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)LP；S-(2,3-二(棕榈酰基氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH三盐酸盐(Pam3Cys)LP (其模拟细菌脂蛋白的乙酰化氨基端)和来自布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的OspA LP。
[0166] 在一个替代实施方案中，使用能够经由TLR-2引起信号传导应答的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-2引起信号传导应答的TLR激动剂是以下中的一者或多者：来自结核分枝杆菌、布氏疏螺旋体或苍白密螺旋体(T pallidum)的脂蛋白、肽聚糖、细菌脂肽；来自包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的物种的肽聚糖；脂磷壁酸质类、甘露糖醛酸类、奈瑟氏球菌(Neisseria)孔蛋白、细菌菌毛蛋白、耶尔森氏菌(Yersina)毒力因子、CMV病毒粒子、麻疹血细胞凝集素、和来自酵母的酵母聚糖。
[0167] 在一个替代实施方案中，使用能够经由TLR-3引起信号传导应答的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-3引起信号传导应答的TLR激动剂是双链RNA(dsRNA)、或聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly IC)，与病毒感染有关的分子核酸模式。
[0168] 在一个替代实施方案中，使用能够经由TLR-5引起信号传导应答的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-5引起信号传导应答的TLR激动剂是细菌鞭毛蛋白。
[0169] 在一个替代实施方案中，使用能够经由TLR-6引起信号传导应答的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-6引起信号传导应答的TLR激动剂是分枝杆菌脂蛋白、二酰化LP、和酚可溶性调控蛋白。额外TLR6激动剂描述于WO 2003/043572。
[0170] 在一个替代实施方案中，使用能够经由TLR-7引起信号传导应答的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-7引起信号传导应答的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、洛索立宾(loxoribine)、在位置N7和C8的鸟苷类似物、或咪唑喹啉化合物、或其衍生物。在一个实施方案中，TLR激动剂是咪喹莫特(imiquimod)。其他TLR7激动剂描述于WO 2002/085905。
[0171] 在一个替代实施方案中，使用能够经由TLR-8引起信号传导应答的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-8引起信号传导应答的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、具有抗病毒活性的咪唑喹啉分子，例如瑞喹莫德(resiquimod，R848)；瑞喹莫德也能够被TLR-7识别。可以使用的其他TLR-8激动剂包括描述于WO 2004/071459的那些。
[0172] 在一个替代实施方案中，使用能够经由TLR-9引起信号传导应答的TLR激动剂。在一个实施方案中，能够经由TLR-9引起信号传导应答的TLR激动剂是HSP90。或者，能够经由TLR-9引起信号传导应答的TLR激动剂是细菌或病毒DNA、含有未甲基化的CpG核苷酸的DNA，特别是称为CpG基序的序列背景。含有CpG的寡核苷酸主要诱导Th1应答。此类寡核苷酸是众所周知的，并且描述于例如WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利号6,008,200和5,856,462。合适地，CpG核苷酸是CpG寡核苷酸。在本发明的免疫原性组合物中使用的合适的寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸，任选地，其含有由至少三个，合适地，至少六个或更多个核苷酸分开的两个或更多个二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸和随后的鸟嘌呤核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在一个具体实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键是二硫代磷酸酯，或者合适地硫代磷酸酯键，尽管磷酸二酯和其他核苷酸间键在本发明的范围内。还包括在本发明的范围内的是具有混合的核苷酸间键的寡核苷酸。用于产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于美国专利号5,666,153、5,278,302和WO 95/26204。
[0173] 用于与F蛋白类似物诸如PreF类似物(和任选地，如果需要，与百日咳抗原，诸如纯化的无细胞百日咳蛋白)用于制剂中的另一类合适的佐剂包括基于OMP的免疫刺激性组合物。基于OMP的免疫刺激性组合物特别适合作为粘膜佐剂，例如，用于鼻内施用。基于OMP的免疫刺激性组合物是一类来自革兰氏阴性细菌诸如但不限于奈瑟氏球菌物种的外膜蛋白(OMP，包括一些孔蛋白)的制备物(参见例如Lowell等人., J. Exp. Med.
167:658, 1988; Lowell等人., Science 240:800, 1988; Lynch等人., Biophys. J.
45:104, 1984; Lowell, 于 "New Generation Vaccines"第2版, Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong, page 193, 1997; 美国专利号5,726,292; 美国专利号
4,707,543)，其作为载体或者在免疫原诸如细菌或病毒抗原的组合物中是有用的。一些基于OMP的免疫刺激性组合物可以称为“蛋白体”，其是疏水性的，并且对于人使用是安全的。
蛋白体具有自动装配成约20nm至约800nm的囊泡或囊泡样OMP簇的能力，和非共价地与蛋白抗原(Ag)，特别是具有疏水性部分的抗原合并、协调、结合(例如静电地或疏水地)、或以其他方式协作的能力。导致产生囊泡或囊泡样形式的外膜蛋白组分(包括一种或多种OMP的多分子膜性结构或熔球样OMP组合物)的任何制备方法包括在蛋白体的定义内。
可以制备蛋白体，例如如本领域中所述(参见例如美国专利号5,726,292或美国专利号
5,985,284)。蛋白体还可以含有源于用于生成OMP孔蛋白的细菌(例如奈瑟氏球菌物种)的内源脂多糖或脂寡糖(分别为LPS或LOS)，其通常将为总OMP制备物的小于2％。
167:658, 1988; Lowell等人., Science 240:800, 1988; Lynch等人., Biophys. J.
45:104, 1984; Lowell, 于 "New Generation Vaccines"第2版, Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong, page 193, 1997; 美国专利号5,726,292; 美国专利号
4,707,543)，其作为载体或者在免疫原诸如细菌或病毒抗原的组合物中是有用的。一些基于OMP的免疫刺激性组合物可以称为“蛋白体”，其是疏水性的，并且对于人使用是安全的。
蛋白体具有自动装配成约20nm至约800nm的囊泡或囊泡样OMP簇的能力，和非共价地与蛋白抗原(Ag)，特别是具有疏水性部分的抗原合并、协调、结合(例如静电地或疏水地)、或以其他方式协作的能力。导致产生囊泡或囊泡样形式的外膜蛋白组分(包括一种或多种OMP的多分子膜性结构或熔球样OMP组合物)的任何制备方法包括在蛋白体的定义内。
可以制备蛋白体，例如如本领域中所述(参见例如美国专利号5,726,292或美国专利号
5,985,284)。蛋白体还可以含有源于用于生成OMP孔蛋白的细菌(例如奈瑟氏球菌物种)的内源脂多糖或脂寡糖(分别为LPS或LOS)，其通常将为总OMP制备物的小于2％。
[0174] 蛋白体主要由通过去污剂维持在溶液中的来自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria menigitidis)的化学提取的外膜蛋白(OMP)(主要为孔蛋白A和B以及第4类OMP)构成(Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. : Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS,编, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206)。蛋白体可以与多种抗原诸如衍生自病毒来源的纯化的或重组的蛋白(包括本文所公开的F蛋白类似物诸如PreF多肽)(例如通过渗滤或传统的透析方法)或与纯化的百日咳抗原蛋白一起配制。逐渐去除去污剂容许直径约100-200nm的微粒疏水性复合物的形成(Lowell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. : Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, 编, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206)。
[0175] 如本文中所使用的“蛋白体：LPS或Protollin”是指与至少一类脂多糖混合(例如通过外源添加)以提供OMP-LPS组合物(其可以发挥免疫刺激性组合物的功能)的蛋白体制备物。因此，OMP-LPS组合物可以由Protollin基本组分中的两种构成，其包括(1)从革兰氏阴性细菌诸如脑膜炎奈瑟氏球菌制备的蛋白体(例如Projuvant)的外膜蛋白制备物，和(2)一种或多种脂糖的制备物。脂寡糖可以是内源的(例如与OMP蛋白体制备物天然包含在一起)，可以与来自外源制备的脂寡糖(例如从与OMP制备物不同的培养物或微生物制备)的OMP制备物混合或组合，或者可以是其组合。此类外源添加的LPS可以来自制备OMP制备物的相同革兰氏阴性细菌或者来自不同革兰氏阴性细菌。还应当理解，任选地，Protollin包括脂质、糖脂、糖蛋白、小分子等，及其组合。可以制备Protollin，例如如描述于美国专利申请公开号2003/0044425。
[0176] 应当注意到，不管所选佐剂，最终制剂中的浓度计算为在怀孕雌性的目标群体中是安全且有效的。
[0177] 用于本文的免疫方案、方法、用途和试剂盒中使用的免疫原性组合物通常含有免疫保护量(或其部分剂量)或提供抗体的被动转移的量的抗原，以便在经免疫的怀孕雌性的婴儿中是免疫保护的，并且可以通过常规技术制备。免疫原性组合物(包括用于对人主体施用的免疫原性组合物)的制备通常描述于Pharmaceutical Biotechnology, 第61卷 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, Powell和Newman编, Plenurn Press,1995.New Trends and Developments in Vaccines, Voller 等人编, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978。例如，Fullerton，美国专利4,235,877描述了脂质体内的包囊。例如，Likhite，美国专利4,372,945和Armor等人，美国专利4,474,757公开了蛋白与大分子的缀合。
[0178] 通常，每剂量免疫原性组合物中的抗原(例如，蛋白)的量选择为在典型的主体(即，怀孕雌性或妊娠婴儿)中诱导婴儿中的免疫保护性应答而没有显著的、不利的副作用的量。在此背景下的免疫保护性并不必然意指针对感染的完全保护性；它意指保护免于症状或疾病，尤其是与病毒相关的严重疾病。抗原量可以根据采用哪种特定免疫原而变化。通常，预期每个人剂量将包含1-1000μg每种蛋白或抗原，诸如约1μg至约100μg，例如，约1μg至约60μg，诸如约1μg，约2μg，约5μg，约10μg，约15μg，约20μg，约25μg，约
30μg，约40μg，约50μg，或约60μg。通常，人剂量将在0.5 ml体积中。因此，用于本文所述的用途和方法的组合物可以是例如0.5 ml人剂量中的10μg或30μg或60μg。基于主体群体来选择免疫原性组合物中利用的量。可以通过涉及在主体中观察抗体滴度和其他应答的标准研究来确定特定组合物的最佳量。在初始接种之后，主体可以在婴儿分娩之前约4-12周或者任何时候，有利地预期分娩日之前至少两周或至少四周接受加强。
30μg，约40μg，约50μg，或约60μg。通常，人剂量将在0.5 ml体积中。因此，用于本文所述的用途和方法的组合物可以是例如0.5 ml人剂量中的10μg或30μg或60μg。基于主体群体来选择免疫原性组合物中利用的量。可以通过涉及在主体中观察抗体滴度和其他应答的标准研究来确定特定组合物的最佳量。在初始接种之后，主体可以在婴儿分娩之前约4-12周或者任何时候，有利地预期分娩日之前至少两周或至少四周接受加强。
[0179] 额外制剂细节可见WO2010149745，其出于提供关于包含F蛋白类似物诸如PreF类似物的免疫原性组合物的制剂的额外细节的目的通过引用并入本文。
[0180] 任选地，含有F蛋白类似物诸如PreF或PostF类似物的免疫原性组合物与除了RSV以外的病原生物体的至少一种额外抗原配制。例如，病原性生物体可以是呼吸道病原体(诸如引起呼吸道感染的病毒)。在某些情况下，免疫原性组合物含有从除了RSV以外的病原性病毒(诸如引起呼吸道感染诸如流感或副流感的病毒)衍生的抗原。类似地，如果需要，百日咳抗原也可以与除了RSV以外的病原病毒的抗原配制。
[0181] RSV蛋白类似物与无细胞百日咳抗原或全细胞百日咳抗原的共同配制描述于本文中，并且是本文公开的接种方案、方法和用途的一个优选实施方案。
[0182] 在某些实施方案中，适用于本文公开的接种方案、方法、用途和试剂盒的免疫原性组合物额外包含来自除了RSV和百日咳博德特氏菌以外的至少一种病原生物体的至少一种抗原。具体而言，所述至少一种病原生物体可以选自：白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；破伤风梭菌(Clostridium tetani)； 乙型肝炎病毒；脊髓灰质炎病毒；b型流感嗜血杆菌；C型脑膜炎奈瑟氏球菌；Y型脑膜炎奈瑟氏球菌；A型脑膜炎奈瑟氏球菌，W型脑膜炎奈瑟氏球菌；和B型脑膜炎奈瑟氏球菌。更具体地，所述至少一种抗原可以选自：白喉类毒素(D)；破伤风类毒素(T)；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)；灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)；缀合至载体蛋白的b型流感嗜血杆菌(Hib)的荚膜糖；缀合至载体蛋白的C型脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖(MenC)；缀合至载体蛋白的Y型脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖(MenY)；缀合至载体蛋白的A型脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖(MenA)；缀合至载体蛋白的W型脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖(MenW)；和来自B型脑膜炎奈瑟氏球菌的抗原(MenB)。在这些或其他实施方案中，可以选择额外抗原来便于施用或减少保护主体免于多种感染性生物体的影响所需的接种数目。例如，抗原可以衍生自以下中的一种或多种：流感、乙性肝炎、白喉、破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)、脊髓灰质炎病毒、hMPV、链球菌属(Streptococcus)或肺炎球菌属(Pneumococcus)等。
[0183] 含有百日咳博德特氏菌抗原(Pa或Pw)与D和T以及其他抗原(诸如选自IPV、HBsAg、Hib和缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖)的各种组合的联合疫苗是本领域众所周知的，并且适合于本文的接种方案、方法、用途和试剂盒的背景下，例如作为TM TM
Infanrix (诸如DTPa-IPV-HBsAg-Hib)和Boostrix (诸如dTpa)产品。在这方面，WO93/024148、WO97/000697和WO98/019702通过引用并入，如同WO02/00249，其公开了DTPw-HepB-MenAC-Hib组合物。此类联合疫苗适合于本文公开的接种方案、方法、用途和试剂盒的背景下。
Infanrix (诸如DTPa-IPV-HBsAg-Hib)和Boostrix (诸如dTpa)产品。在这方面，WO93/024148、WO97/000697和WO98/019702通过引用并入，如同WO02/00249，其公开了DTPw-HepB-MenAC-Hib组合物。此类联合疫苗适合于本文公开的接种方案、方法、用途和试剂盒的背景下。
[0184] 适用于本文公开的接种方案、方法、用途和试剂盒的具体免疫原性组合物除了至少一种RSV抗原和至少一种百日咳博德特氏菌抗原以外包括：D和T；D、T和IPV；D、T和HBsAg；D、T和Hib；D、T、IPV和HBsAg；D、T、IPV和Hib；D、T、HBsAg和Hib；或D、T、IPV、HBsAg和Hib。
[0185] 在一个具体实施方案中，D以每个剂量1-10个国际单位(IU) (例如精确地或近似地2IU)或10-40IU (例如精确地或近似地20或30IU)或1-10个絮凝沉淀单位(Lf单位) (例如精确地或近似地2或2.5或9Lf)或10-30Lf (例如精确地或近似地15或25Lf)的量使用。
[0186] 在一个具体实施方案中，T以每个剂量10-30 IU (例如精确地或近似地20IU)或30-50IU (例如精确地或近似地40IU)或1-15Lf (例如精确地或近似地5或10Lf)的量使用。
[0187] 在示例性实施方案中，适合于接种方案、方法、用途和试剂盒的免疫原性组合物，除了所述至少一种RSV抗原和至少一种百日咳博德特氏菌抗原以外，包括每个剂量各自精确或近似量为30:40IU；25:10Lf；20:40IU；15:5Lf；2:20IU；2.5:5Lf；2:5Lf；25:10Lf；9:5Lf的D和T。例如，此类组合物可包含(除了所述至少一种RSV抗原以外)：
(i) 20-30ug，例如精确地或近似地25ug的PT；
(ii) 20-30ug，例如精确地或近似地25ug的FHA；
(iii) 1-10ug，例如精确地或近似地3或8ug的PRN；
(iv) 10-30Lf，例如精确地或近似地15或25Lf的D；和
(v) 1-15Lf，例如精确地或近似地5或10Lf的T。
(i) 20-30ug，例如精确地或近似地25ug的PT；
(ii) 20-30ug，例如精确地或近似地25ug的FHA；
(iii) 1-10ug，例如精确地或近似地3或8ug的PRN；
(iv) 10-30Lf，例如精确地或近似地15或25Lf的D；和
(v) 1-15Lf，例如精确地或近似地5或10Lf的T。
[0188] 通过另一个实例的方式，此类合适的组合物可包含(除了所述至少一种RSV抗原以外)：(i) 2-10ug，例如精确地或近似地2.5或8ug的PT；
(ii) 2-10ug，例如精确地或近似地5或8ug的FHA；
(iii) 0.5-4ug，例如2-3ug，诸如精确地或近似地2.5或3ug的PRN；
(iv) 1-10Lf，例如精确地或近似地2或2.5或9Lf的D；和
(v) 1-15Lf，例如精确地或近似地5或10Lf的T。
(ii) 2-10ug，例如精确地或近似地5或8ug的FHA；
(iii) 0.5-4ug，例如2-3ug，诸如精确地或近似地2.5或3ug的PRN；
(iv) 1-10Lf，例如精确地或近似地2或2.5或9Lf的D；和
(v) 1-15Lf，例如精确地或近似地5或10Lf的T。
[0189] 因此，将清楚的是，根据本文公开的接种方案、方法、用途和试剂盒，考虑所述免疫原性组合物用于医学中使用，具体而言用于预防或治疗人主体中RSV和百日咳博德特氏菌的感染，或与RSV和百日咳博德特氏菌相关的疾病。在含有来自其他病原体的抗原的某些实施方案中，此类预防或治疗将延伸到其他病原体。
[0190] 如本文所述的母体免疫经由用于RSV疫苗和百日咳疫苗的合适施用途径实施，包括肌内、鼻内或皮肤施用。有利地，如本文所述的RSV和/或百日咳母体免疫皮肤实施，这意指将抗原引入皮肤的真皮和/或表皮(例如，皮内)。在一个具体实施方案中，将包含F蛋白类似物诸如PreF抗原或PostF抗原的重组RSV抗原和/或包含无细胞百日咳蛋白或全细胞百日咳的百日咳抗原皮肤或皮内递送至怀孕雌性。在一个具体实施方案中，F蛋白诸如PreF抗原或postF抗原与本文所述的佐剂，例如皂苷诸如QS21，有或没有3D-MPL，配制，用于皮肤或皮内递送。在另一个具体实施方案中，F蛋白类似物诸如PreF或postF抗原与矿物盐诸如氢氧化铝或磷酸铝或磷酸钙，有或没有免疫刺激剂诸如QS21或3D-MPL，配制，用于皮肤或皮内递送。百日咳抗原通常与铝盐组合配制，并且可以任选地通过皮肤或皮内途径施用。任选地，F蛋白类似物和百日咳抗原共同配制，例如，在矿物盐诸如氢氧化铝或磷酸铝或磷酸钙存在的情况下，有或没有免疫刺激剂诸如QS21或3D-MPL，用于皮肤或皮内递送。
[0191] 经由皮肤途径(包括皮内途径)的递送可需要或允许比其他途径诸如肌内递送更低剂量的抗原。因此还提供了用于皮肤或皮内递送的免疫原性组合物，其包含低剂量例如小于正常肌内剂量，例如正常肌内剂量的50%或更小，例如每个人剂量50 μg或更小、或20 μg或更小、或10 μg或更小、或5 μg或更小的F蛋白类似物。类似地，含有百日咳抗原的免疫原性组合物可以用于皮肤或皮内施用的剂量范围下端(或者甚至更低剂量)配制，例如，1-10 µg PT，1-10 µg FHA，0.5-4 µg PRN (有或没有额外抗原组分)。任选地，用于皮肤或皮内递送的免疫原性组合物还包含佐剂例如铝盐或QS21或3D-MPL或其组合。
[0192] 用于皮肤施用的设备包括短针设备(其具有长度为约1至约2 mm的针)，诸如US 4,886,499、US5,190,521、US5,328,483、US 5,527,288、US 4,270,537、US 5,015,235、US 5,141,496、US 5,417,662和EP1092444中描述的那些。皮肤疫苗也可通过限制针进入皮肤的有效穿透长度的设备施用，所述设备诸如在WO99/34850(其通过引用并入本文)中描述的那些，以及它们的功能等同物。还合适的是，经由液体喷射注射器或经由刺穿角质层并产生到达真皮的喷射的针递送液体疫苗到真皮的喷射注射设备。喷射注射设备描述于，例如US 5,480,381、US 5,599,302、US 5,334,144、US 5,993,412、US5,649,912、US 5,569,189、US 5,704,911、US 5,383,851、US 5,893,397、US 5,466,220、US
5,339,163、US5,312,335、US 5,503,627、US 5,064,413、US 5,520,639、US 4,596,556US 5
4,790,824、US 4,941,880、US 4,940,460、WO 97/37705和WO 97/13537。
5,339,163、US5,312,335、US 5,503,627、US 5,064,413、US 5,520,639、US 4,596,556US 5
4,790,824、US 4,941,880、US 4,940,460、WO 97/37705和WO 97/13537。
[0193] 用于皮肤施用的设备还包括使用压缩气体以加速粉末形式的疫苗通过皮肤的外层到真皮的弹道粉末/颗粒递送设备。此外，常规注射器可以在皮肤施用的经典曼托法(mantoux method)中使用。然而，使用常规注射器需要高度熟练的操作人员，并且因此能够在没有高度熟练的使用者的情况下准确地递送的设备是优选的。用于皮肤施用的额外设备包括包含如本文所述的免疫原性组合物的贴剂。皮肤递送贴剂通常包括背板，所述背板包括固体基材(例如闭塞或非闭塞性外科敷料)。此类贴剂经由刺穿角质层的微突将免疫原性组合物递送至真皮或表皮。微突通常为10Dm至2mm，例如20Dm至500Dm，30Dm至1mm，100至200，200至300，300至400，400至500，500至600，600至700，700，800，800至900，100Dm至400Dm，特别是约200Dm至300Dm或约150Dm至250Dm。皮肤递送贴剂通常包含多个微突，例如2至5000个微针，例如1000至2000个微针。所述微突出可以是适合于刺穿角质层、表皮和/或真皮的任何形状。微突出可以做成如在例如WO2000/074765和WO2000/074766中所公开的形状。所述微突出可以具有至少3：1(高度对基底处的直径)，至少约2：1或至少约1：1的高宽比。用于微突出的一个具体形状是具有多边形的底部，例如六边形或菱形的椎体。其他可能的微突出形状显示于，例如美国公开的专利申请2004/0087992。在具体实施方案中，微突出具有朝向基底变厚的形状。阵列中微突出的数目通常至少约100、至少约500、至少约1000、至少约1400、至少约1600或至少约 2000。鉴于它们小的尺寸，微突出的面积密度不可以特别高，但是例如每cm2的微突出的数目可以是至少约50、至少约250、至少约500、至少约750、至少约1000或至少约1500。在本发明的一个实施方案中，F蛋白类似物在将贴剂置于宿主的皮肤上的5小时内，例如4小时、3小时、2小时、1小时或30分钟内递送到主体。在具体实施方案中，F蛋白类似物在放置贴剂在皮肤上20分钟内，例如30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19分钟内递送。
[0194] 所述微突可以由本领域技术人员已知的任何合适的材料制成。在具体实施方案中，至少部分微突是生物可降解的，尤其是在微突的顶端或微突的最外层。在具体实施方案中，实质上所有的微突是生物可降解的。如本文所使用的术语“生物可降解的”意指在体内使用(例如插入皮肤)的预期条件下可降解，而无论生物降解机制。生物降解的示例性机制包括崩解、分散、溶解、腐蚀、水解和酶促降解。
[0195] 包含抗原的微突的实例公开于WO2008/130587和WO2009/048607。可代谢的微针的制造方法公开于WO2008/130587和WO2010/124255。用抗原包被微突可以通过技术人员已知的任何方法例如WO06/055844、WO06/055799中公开的方法进行。
[0196] 本文所述的方法和用途中用于皮肤递送、包括皮内递送的合适的递送设备包括BD SoluviaTM设备(这是用于皮内施用的微针设备)、Corium MicroCorTM贴剂递送系统、Georgia Tech微针疫苗贴剂、Nanopass微针递送设备和Debiotech NanojectTM微针设备。还提供了含有本文所述的用于RSV母体免疫的免疫原性组合物(例如重组F蛋白类似物诸如PreF抗原，任选地与佐剂诸如矿物盐例如明矾或QS21或3D-MPL或其组合配制)的皮肤或皮内递送设备。
实施例
实施例
[0197] 实施例1 概念验证 - 豚鼠模型中的母体接种选择豚鼠模型，这是因为胎盘结构和IgG转移比典型啮齿动物模型的情况更接近于人(综述于Pentsuk和van der Laan (2009) Birth Defects Research (part B)
86:328-344。豚鼠的相对长的妊娠间(68天)允许怀孕过程中的免疫和免疫应答发展。为了模拟在其整个生命已经暴露于RSV且具有对RSV的预先存在的免疫应答的孕妇的RSV免疫状态，在接种之前6周或10周用活RSV引发雌性豚鼠。
86:328-344。豚鼠的相对长的妊娠间(68天)允许怀孕过程中的免疫和免疫应答发展。为了模拟在其整个生命已经暴露于RSV且具有对RSV的预先存在的免疫应答的孕妇的RSV免疫状态，在接种之前6周或10周用活RSV引发雌性豚鼠。
[0198] 在接种之前6或10周(约交配时或交配前4周)，用活RSV病毒(2.5 x 105 pfu)鼻内引发雌性豚鼠(N=5/组)。两组未引发。在妊娠开始后约6周用与氢氧化铝组合的10 µg PreF抗原免疫怀孕雌性。一组未引发的雌性用PBS注射。在整个引发和妊娠期收集血清样品，以监测抗RSV结合和中和抗体的水平。
[0199] 后代(7至16日龄)用1 x 107 pfu的活RSV鼻内攻击。攻击后四天，将肺收集并分离成7叶。滴定7叶中的6叶中的病毒，并且计算每克肺的总病毒颗粒。
[0200] 结果显示在图2和3中的图表中。
[0201] 在接种当天观察到类似水平的抗体，无论豚鼠在6或10周前是否已经引发。从引发后14天达到平台滴度。中和抗体滴度在达到平台后没有下降，持续至少约60天后。因此，在两个时间点的引发在该模型中是等效的，并且适于模拟人中的母体感染。
[0202] 来自豚鼠后代中的肺病毒载量的结果表明，与由无引发/未接种的母体生育的后代相比，由已引发和接种的母体生育的后代受保护免于RSV攻击。相反，由无引发/未接种的母体生育的后代未受保护免于RSV攻击。
[0203] 实施例2 联合疫苗保护免于RSV攻击本实施例表明含有RSV和百日咳博德特氏菌(B. Pertussis)抗原(PT、FHA和PRN)的联合疫苗引发的针对RSV的保护。两个剂量的联合Pa-RSV疫苗的免疫原性(中和抗体滴度)在Balb/c小鼠模型中评估，随后鼻内RSV攻击来测量联合疫苗的功效。
[0204] 几组BALB/c小鼠(n=14/组)以3周间隔用表1中显示的制剂肌内免疫两次。
[0205] 表 1：RSV攻击前施用的疫苗制剂
[0206] 来自所有小鼠的血清在第0天(第一次免疫前)、在第21天(第二次免疫前)和在第35天(第二次免疫后2周)单独收集，并且使用噬斑减少测定测试RSV中和抗体的存在。简而言之，将各血清的系列稀释液与RSV A Long(靶向100 pfu/孔)在37℃孵育20 min。孵育后，将病毒-血清混合物转移至用Vero细胞预先接种且缺乏生长培养基的板。在每个板上，将一列的细胞仅与病毒孵育(100％感染性)，并且2个孔不接受任何病毒或血清(细胞对照)。板在37℃孵育2小时，去除培养基，并且将含有0.5％CMC(低粘度羧甲基纤维素)的RSV培养基添加至所有孔。在免疫荧光染色前，将板在37℃孵育3天。
[0207] 对于染色，将细胞单层用PBS洗涤，并用1％多聚甲醛固定。使用商业的山羊抗RSV抗血清和随后的缀合至FITC的兔抗山羊IgG来检测RSV阳性细胞。每孔的染色噬斑数目使用自动成像系统进行计数。将各血清的中和抗体滴度测定为引起噬斑数目相比于无血清对照60％降低的血清稀释度的倒数(ED60)。结果显示于图5A中。
[0208] 用Al(OH)3佐剂化的基于PreF的疫苗保护小鼠免于鼻内RSV攻击，并且该动物模型因此可用于研究RSV疫苗介导肺部病毒清除的能力。然后测试单一疫苗中百日咳博德特氏菌(PT、FHA和PRN)和RSV(PreF)抗原的组合在鼻内RSV攻击小鼠模型中的保护效力。第二次疫苗剂量后两周，通过滴注50 µl (每个鼻孔25 µL)的活RSV A Long菌株(约6
1.45x10 pfu/50 µl)而攻击小鼠。在攻击后四天收集肺，用于评估肺病毒载量。攻击后四天，使小鼠安乐死，无菌收获肺并个别称重和匀浆。将每种肺匀浆的系列稀释液(各8个重复)与Vero细胞孵育，并且接种后6天，通过免疫荧光鉴定含有噬斑的孔。病毒滴度使用Spearman-Kärber方法测定用于TCID50计算，并以每克肺表示。所采用的统计方法是对log10值的方差分析(ANOVA 1)。
1.45x10 pfu/50 µl)而攻击小鼠。在攻击后四天收集肺，用于评估肺病毒载量。攻击后四天，使小鼠安乐死，无菌收获肺并个别称重和匀浆。将每种肺匀浆的系列稀释液(各8个重复)与Vero细胞孵育，并且接种后6天，通过免疫荧光鉴定含有噬斑的孔。病毒滴度使用Spearman-Kärber方法测定用于TCID50计算，并以每克肺表示。所采用的统计方法是对log10值的方差分析(ANOVA 1)。
[0209] 结果显示于图5B中。如预期，与用单独(standalone) Pa接种的小鼠(对照组，其中预期没有保护免于RSV攻击)相比，与Al(OH)3组合的2 µg PreF有效促进了肺部病毒清除。PreF组中的14只中只有两只动物在肺部具有可检测水平的RSV，其中在12只其他动物中没有可检测的RSV。Pa-RSV联合疫苗同样能够保护小鼠免于RSV攻击，如14只动物中只有一只在肺部具有可检测水平的RSV所示，在剩余13只动物中没有检测到RSV。总体而言，与用单独Pa接种的对照动物相比，用PreF + Al(OH)3疫苗或用Pa抗原 + PreF + Al(OH)3接种的动物具有显著更低的肺病毒滴度(P<0.001)。在不存在佐剂的Pa抗原 + PreF接种的组中，肺病毒滴度显著降低(P<0.001)，然而，该组中没有动物看起来受到充分保护免于RSV攻击，因为在来自所有动物的肺部的病毒是可定量的。
[0210] 使用攻击动物模型，我们观察到，Pa-RSV联合疫苗引发与RSV疫苗相当的针对RSV的保护性免疫应答。该免疫应答与RSV中和抗体的产生相关。
[0211] 实施例3 联合疫苗保护免于百日咳博德特氏菌攻击本实施例表明含有RSV和百日咳博德特氏菌(B. Pertussis)抗原(PT、FHA和PRN)的联合疫苗引发的针对百日咳博德特氏菌的保护。两个剂量的联合Pa-RSV疫苗的免疫原性(中和抗体滴度)在Balb/c模型中评估，随后用感染性百日咳博德特氏菌鼻内攻击来测量联合疫苗的功效。
[0212] 几组BALB/c小鼠(n=20/组)以3周间隔用表2中显示的制剂皮下免疫两次。
[0213] 表 1：百日咳博德特氏菌攻击前施用的疫苗制剂
[0214] 来自所有小鼠的血清在第二次免疫后七天(d28 – 攻击前一天)个别收集，并测试抗-PT、-FHA和-PRN IgG抗体的存在。简而言之，96孔板用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(50mM)中的FHA (2 µg/ml)、PT (2 µg/ml)或PRN (6 µg/ml)包被，并且在4℃孵育过夜。用PBS-BSA 1%缓冲液的饱和步骤后，将小鼠血清以1/100稀释在PBS-BSA 0.2% Tween 0.05%中，并且系列稀释在来自板的孔中(12个稀释度，步骤½)。添加偶联至过氧化物酶的抗小鼠IgG(1/5000稀释)。比色反应在添加过氧化物酶底物(OPDA)后观察，并且用HCL 1M终止，然后通过分光光度法(波长：490-620 nm)读数。对于测试的每种血清和每个板上添加的标准品，将4-参数逻辑曲线拟合至OD和稀释度之间的关系(Softmaxpro)。这允许推导以STD滴度表示的每个样品滴度。疫苗诱导的对于Pa抗原(PT、FHA和PRN)特异性的血清学抗体应答被认为表明(但不是决定性的)疫苗引发针对Pa疫苗中发现的个别抗原的抗体应答的能力。图6A显示，DTPa、单独Pa和Pa-RSV组合在两次免疫后促进PT、FHA和PRN特异性IgG应答。在来自未接种或RSV-接种的小鼠的血清中没有检测到任何抗原特异性抗体(数据未呈现)。统计分析表明DTPa (Infanrix)和Pa-RSV组合诱导的抗PT和抗FHA抗体应答之间的等效性。单独Pa和Pa-RSV联合疫苗诱导的抗PRN特异性抗体的量也是统计学等效的，表明RSV抗原的存在不干扰抗百日咳抗体应答的产生。
[0215] 为了证明保护，加强后一周，通过将50 µl细菌悬浮液(约5E6 CFU/50 µl)滴注至左鼻孔而攻击小鼠。细菌攻击后2小时、2天、5天和8天使每组五只小鼠安乐死。无菌收获肺并个别匀浆。肺细菌清除通过计数Bordet-Gengou琼脂板上的菌落生长来测量。对于每个收集时间，根据每个治疗组中每个肺的菌落形成单位(CFU – log10)的数目的平均数值对数据进行作图。所采用的统计方法是使用异质方差模型用2个因素(治疗和天)对log10值的方差分析(ANOVA)。
[0216] 在该模型中，无细胞的百日咳博德特氏菌疫苗(Pa)保护小鼠免于细菌的鼻内攻击。该动物模型因此可用于研究基于百日咳博德特氏菌的疫苗介导肺部细菌清除的能力。然后测试单一疫苗中百日咳博德特氏菌(PT、FHA和PRN)和RSV (Pre-F)抗原的组合在鼻内攻击小鼠模型中的保护效力。代表性结果显示于图6B。如预期，与未接种的小鼠相比，经调整的人剂量(四分之一剂量的商业DTPa疫苗Infanrix)有效地促进了细菌清除。单独的Pa和Pa-RSV联合疫苗两者也能够引发保护性免疫应答，导致细菌消除。如预期，单独的Pre-F RSV疫苗无法在该动物模型中保护免于百日咳博德特氏菌。
[0217] 这些结果在动物模型中表明，Pa-RSV联合疫苗引发针对百日咳博德特氏菌以及针对RSV的保护性免疫应答，如上述实施例2中所证实。该免疫应答与针对无细胞Pa疫苗中发现的三种亚单位抗原(PT、FHA、PRN)的特异性抗体的产生相关。
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