一种猪细小病毒亚单位疫苗
阅读：111发布：2020-05-16
专利汇可以提供一种猪细小病毒亚单位疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 的目的是提供一种猪细小病毒亚单位 疫苗 ，从而克服由于现有疫苗免疫效果不好的问题。本发明疫苗所用的 抗原 为重组毕赤 酵母 菌X33?VP2表达的猪细小病毒VP2蛋白，该菌株已于2016年3月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016098。本发明将重组毕赤酵母菌X33?VP2接种培养基后诱导表达，经提取纯化、甲 醛 溶液灭活后加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的 亚单位疫苗 能提高免疫后 抗体 的整齐度，保证了疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点。，下面是一种猪细小病毒亚单位疫苗专利的具体信息内容。
1.一种猪细小病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗包包含有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为灭活的猪细小病毒VP2蛋白。
2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的猪细小病毒VP2蛋白经过甲醛溶液灭活。
3.如权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于，所述的猪细小病毒VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
4.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中猪细小病毒VP2蛋白的含量不低于50μg/0.3ml。
5.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的猪细小病毒VP2蛋白是由巴斯德毕赤酵母菌X33-VP2表达的。
6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述的巴斯德毕赤酵母菌X33-VP2的保藏编号为CCTCC NO:M 2016098。
一种猪细小病毒亚单位疫苗
技术领域
背景技术
[0002] 猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一，可导致母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎、弱仔及母猪不育和新生仔猪大量死亡。我国自20世纪80年代后相继从各地分离到PPV，经调查发现一些猪群中该病的血清学阳性率可达85％以上。PPV常呈隐性感染存在，尤其是低剂量持续感染的现象经常发生。该病毒除引起母猪的繁殖障碍，还可与其他病原体协同作用引起多种疾病，给养猪业造成很大的经济损失。猪细小病毒血清型单一、具有较高的免疫原性，疫苗接种是控制PPV感染的有效措施。
[0003] 完整的病原体含有许多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主产生保护性应答。其中某些抗原还能引起过敏，免疫抑制和其他副作用，这是使用完整的病原体做疫苗的缺陷。并且目前国内应用的灭活苗生产制备抗原过程繁琐，而弱毒疫苗现也有接种疫苗发病情况存在。而用亚单位疫苗则可以解决这个问题，尤其是这种疫苗除了具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，敏感性高，不产生其他不相关抗体，免疫效果检测方法方便准确外，还十分易于生产。不用动物体或是胚体生产，不会带有组织残留物,但安全性高。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种包含猪细小病毒VP2蛋白的亚单位疫苗。所提供的疫苗具有高效、安全性好、抗体整齐度高、保护率高的优点，从而弥补现有技术的不足。
[0005] 本发明的猪细小病毒亚单位疫苗，包括抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为灭活的猪细小病毒VP2蛋白，
[0006] 其中的猪细小病毒VP2蛋白经过甲醛溶液灭活；
[0007] 所述的猪细小病毒VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；
[0008] 上述的疫苗中猪细小病毒VP2蛋白的含量不低于为50μg/0.3ml。
[0009] 其中生产猪细小病毒VP2蛋白的巴斯德毕赤酵母X33-VP2(Pichia pastoris X33-VP2),已经于2016年3月9日保藏于位于武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016098。
[0010] 本发明将表达猪细小病毒VP2蛋白的基因工程毕赤酵母菌X33-VP2，接种培养基，在甲醇的作用下，猪细小病毒VP2蛋白获得高效表达，经提取纯化，加入甲醛溶液灭活后，加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提高免疫后抗体的整齐度，保证了疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点。附图说明
[0011] 图1是本发明实施例猪细小病毒VP2蛋白基因PCR的扩增鉴定图，
[0012] 图2是本发明的VP2蛋白的blast比较图；
具体实施方式
[0014] 下面结合附图对本发明的实施例进行具体说明。
[0015] 实施例1：猪细小病毒(PPV)VP2基因的筛选
[0016] 2010年在山东省多个养殖场出现了猪细小病毒病的症状，而发病个体猪之前已经注射了已有的细小病毒疫苗，推测感染的病毒发生了变异；因此从发病个体中进行猪细小病毒的筛选；最终筛选出了猪细小病毒PPV1。
[0017] 为验证筛选的病毒的抗原性，使用了包含筛选的PPV1毒株在内的5个不同来源的病毒株作为抗原制备疫苗，免疫SPF猪后用筛选的病毒液进行攻毒实验，结果表明相比于其它猪细小病毒疫苗，其本身制备的疫苗具有更好的免疫效果(p＜0.05)，因此确定其发生了遗传上的变异。
[0018] 根据猪细小病毒VP2蛋白的抗原特性和氨基酸序列，设计合成一对引物,[0019] primer 1:5'-GCGGTACCATGTCTGAAAATGTTGAAGAAC-3',含KpnI位点；
[0020] primer 2:5'-GCGGCCGCCTAATATAATTTTCTTGGAAT-3'，含NotI位点。
[0021] 取PPV株病毒基因作为模板，PCR扩增目的片段，产物回收连接pMD18-T载体，转化和筛选阳性克隆pMD18-T-VP2，经序列测定(图1为猪细小病毒VP2基因PCR的扩增鉴定图)；其核苷酸序列为SEQ ID NO:2，编码的蛋白的序列为SEQ ID NO:1。与NCBI中公开的猪细小病毒VP2基因相比，最高的同源性为96％；在存在579氨基酸的情况下，表明本发明的猪细小病毒VP2蛋白与已公开的蛋白存在不少于23个氨基酸的差异(图2)。
[0022] 实施例2：重组猪细小病毒VP2蛋白的制备
[0023] 包括以下步骤：a.构建表达载体；b.构建表达菌株；c.重组VP2蛋白的诱导和提取纯化。具体如下：将阳性克隆质粒pMD18-T-VP2和表达载体pPICZα载 体分别用KpnI和NotI双酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收,分别获得约1.7kb和3.3kb片段,在16℃定向连接构建pPICZα-VP2表达载体，经酶切鉴定正确后；将质粒线性化后，电转化入毕赤酵母感受态细胞，构建毕赤酵母表达菌株X33-VP2，并提取表达菌株X33-VP2基因组，使用引物primer 1和primer 2进行PCR鉴定正确,于2016年3月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016098；进行诱导表达，挑取含X33-VP2的单克隆菌落接种于BMGY液体培养基,30℃振荡培养过夜，离心收集菌体，用适量的BMMY悬浮后，加入0.55％甲醇，30℃诱导96小时。4℃,9000rpm离心5min，保留上清液，加入40％的硫酸铵沉淀后，12000rpm离心5min收集蛋白沉淀，用PBS重溶蛋白。加入蛋白电泳上样缓冲液，沸水煮8分钟后，用12％的分离胶进行SDS-PAGE鉴定(图3是重组菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检定图,图中1、2、为VP2蛋白表达产物沉淀，M为分子量标准蛋白质)。
[0024] 实施例3：疫苗的制备
[0025] 将生产猪细小病毒VP2蛋白的毕赤酵母表达菌株X33-VP2株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016098。
[0026] 1.制苗用菌液的制备将X33-VP2菌种接种于含博莱霉素的YPD液体培养基中，30℃振荡培养16～18小时。然后划线接种于加有博莱霉素的YPD固体培养基，选取典型菌落2～3个混合于少量YPD液体培养基中，置30℃摇床中振荡培养18小时，定量分装，经纯粹检验后，作为一级种子。取一级种子接种于BMGY液体培养基中，30℃振荡培养16～18小时，经镜检后，置2～8℃保存，作为二级种子。
[0027] 2.制苗用蛋白的制备按发酵罐容积60％(V/V)加入BMGY不完全液体培养基，同时按培养基0.1％(V/V)加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至32℃，加入YNB和生物素，接种猪细小病毒VP2蛋白生产用毕赤酵母X33-VP2二级种子液，发酵罐参数设置分别为搅拌速度800r/min，温度30℃，维持DO值(溶氧量)在20％。培养24小时后的菌液补加甲醇,甲醇的补加速度为2ml/h/L诱导表达培养，按照以上发酵控制参数及工艺诱导表达120小时；发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的上清，加入硫酸铵沉淀蛋白后，按12000r/min离心30分钟收获沉淀，加入适量的生理盐水溶解蛋白沉淀。
[0028] 3.灭活将蛋白液置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使 其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。
[0029] 4.半成品检验
[0030] (1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
[0031] (2)蛋白含量测定按Bradford法检测蛋白含量。
[0032] (3)灭活检验将灭活后的蛋白液取少量接种YPD固体培养基，置于置30℃继续培养72小时。观察无菌落生长，判灭活检验合格。
[0033] 实施例2：亚单位疫苗的制备
[0034] 经过检验合格后的半成品VP2蛋白抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。
[0036] (2)水相制备将猪细小病毒VP2蛋白使用生理盐水稀释成150μg/0.1ml。取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入制苗用蛋白液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。
[0037] (3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
[0038] 实施例3、疫苗成品检验
[0039] (1)性状
[0040] 外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。
[0041] 剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。
[0042] 稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
[0043] 黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0044] (2)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0045] (3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0046] (4)安全检验用50日龄仔猪5只，每只颈部皮下注射疫苗1.0ml，同时 设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验猪采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
[0047] (5)效力检验初产母猪5只，每只颈部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日龄初产母猪作为不免疫作对照。母猪配种后，怀孕至38-40天时攻毒，结果从接种亚单位疫苗的母猪的血浆中没有分离到病毒，而对照母猪的血浆中则分离到病毒。攻毒40天后宰杀，接种母猪共怀65头胎猪，从它们的脏器中均没有分离到病毒，而对照母猪共怀60头胎猪，其中有31头的脏器分离到病毒。结果表明，用猪细小病毒VP2蛋白亚单位疫苗免疫母猪能够抵抗病毒的攻击，不出现临床症状，胎猪病毒分离均为阴性。对照组，出现轻微的临床症状，胎猪病毒分离阳性率超过50％，表明猪细小病毒亚单位疫苗能够提供有效的保护。
[0048] 对比实验表明，用目前市场上出售的猪细小病疫苗进行免疫，再用本发明筛选的PPV1株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明的VP2蛋白疫苗的效果；推测是由于PPV1株的VP2蛋白疫苗发生变异导致目前疫苗的免疫效果不好。
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