一种猪圆环病毒亚单位灭活疫苗
阅读：332发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种猪圆环病毒亚单位灭活疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种猪 圆环病毒 亚单位灭活 疫苗 的制备。所述疫苗包含PCV1主要结构蛋白Cap蛋白亚单位、PCV2主要结构蛋白Cap蛋白亚单位、猪白细胞介素‑2及纯化标签。本疫苗制备工艺稳定，适合大规模生产。动物试验表明，本发明所述的 猪圆环病毒 亚单位灭活疫苗具有良好的安全性，且能够诱导动物 机体 产生显著的体液免疫及细胞免疫，有效 预防 猪圆环病毒的感染。，下面是一种猪圆环病毒亚单位灭活疫苗专利的具体信息内容。
一种猪圆环病毒亚单位灭活疫苗
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于免疫的融合蛋白，其由PCV1和PCV2的主要结构蛋白Cap蛋白的亚单位、猪白细胞介素-2及纯化标签序列串联而成，然后克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵、纯化、乳化工艺制备成猪圆环病毒亚单位灭活疫苗，该疫苗能够诱导机体产生显著体液免疫和细胞免疫，有效预防猪圆环病毒的感染。
背景技术
[0002] 猪圆环病毒感染是由猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)引起的一种传染病。主要临床表现为体质下降、消瘦、贫血、黄疸、生长发育不良、腹泻、呼吸困难、母猪繁殖障碍，内脏器官及皮肤的广泛病理变化，特别是肾脏、脾脏及全身淋巴结的高度肿大、出血和坏死。
[0003] 猪圆环病毒为圆环病毒科圆环病毒属，由Tischer于1974年首先在PK-15(ATCC-CCL)细胞中发现。PCV有2种血清型，即PCV1和PCV2。已知PCV1对猪的致病性较低，偶尔可引起怀孕母猪的胎儿感染，造成繁殖障碍，但在正常猪群及猪源细胞中污染率极高。PCV2对猪的危害极大，主要侵害猪体的免疫系统，引起机体免疫抑制及抵抗力下降，从而继发其它疾病。已证明是仔猪多系统衰竭综合征发生的必要病原，此外，猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道综合征、母猪繁殖障碍等疾病的发生也与PCV2的感染有关。PCV基因组分为两种基因型，即PCV1型基因组和PCV2型基因组。PCV1基因组全长约1.7kb，PCV2约1.768kb。PCV1和PCV2的基因结构极为相似，都含有11个ORFs，其中ORF1和ORF2是最主要的两个ORF，ORF1编码Rep和Rep’蛋白，主要参与病毒复制；ORF2编码Cap蛋白，大小约27.8KD，是PCV2唯一的结构蛋白，也是主要的免疫原性蛋白，能诱导机体产生中和抗体。基因序列分析发现，同一血清型中各毒株之间的核苷酸序列同源性在96％以上，而不同血清型核苷酸序列同源性低于80％。PCV1和PCV2之间与复制有关的DNA复制起始区和Rep蛋白基因序列同源性分别为79.5％和
82％；而Cap蛋白基因存在较大差异，同源性只有62％左右。
82％；而Cap蛋白基因存在较大差异，同源性只有62％左右。
[0004] 自PCV发现以来，PCV1和PCV2已被证实为世界性流行和存在的病毒，我国由郎洪武等2001年首次从猪群中分离到PCV2，目前各猪场已普遍存在。血清学调查发现，国内猪群阳性率高达52.8％-100％。该病发病率高达50％，死亡率因猪场条件、继发感染等情况而不同，一般在5％-70％，是目前造成养猪业重大经济损失的主要传染病之一。目前，商品化疫苗主要有杆状病毒表达的亚单位疫苗和PCV2灭活疫苗，抗原纯度不高且价格昂贵，加上体外培养PCV比较困难，病毒滴度较低，因而急需研制安全有效的新型疫苗来预防猪圆环病毒的感染。
[0005] 白介素-2(Interleukin-2，IL-2)又称T细胞生长因子，是由辅助性T细胞(THC)分泌的一种糖蛋白。IL-2在体外能促进T细胞分化成熟和扩增，促进THC的增长，刺激NK细胞生长并增强其溶细胞功能，增强B细胞和巨噬细胞的作用，是一种具有广泛生物活性的细胞因子。IL-2在特异性免疫应答反应中发挥重要作用，将IL-2与保护性抗原基因连接构成融合蛋白，可以增强亚单位疫苗的抗体产生和细胞免疫水平。本发明提供了一种新的用于免疫的融合蛋白及其疫苗组合物，能有效预防猪圆环病毒的感染。
发明内容
[0006] 本发明根据不同结构蛋白在PCV病毒感染中的作用，选择PCV1和PCV2主要结构蛋白Cap蛋白亚单位作为疫苗框架结构，通过柔性Linker连接后再与猪白介素-2串联，克隆入pRSETB载体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的猪圆环病毒亚单位疫苗。利用本发明制备的疫苗可以有效预防猪圆环病毒的感染。
[0007] 在第一个方面，本发明提供了一种用于制备免疫的融合蛋白，其含有PCV1型和PCV2型病毒主要结构蛋白Cap蛋白亚单位以及猪白介素2(IL-2)。所述的“PCV1型和PCV2型病毒主要结构蛋白Cap蛋白亚单位”指的是具有免疫原性的PCV1和PCV2的主要结构蛋白Cap蛋白的一部分多肽或其具有基本相同免疫原性的功能等价物，优选是选自SEQ ID No.4、6的氨基酸序列或其功能等价物。所述的“猪白介素-2”指的是猪白细胞介素-2(IL-2)亚单位或其具有基本相同佐剂功能的功能等价物，优选是如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列或其功能等价物。所述的融合蛋白或多肽或药学上可接受的盐以及表达抗原表位所需要的载体。载体也可以包括单独编码各抗原表位的序列，串联可以通过遗传工程方法进行。所述疫苗也包括非免疫活性物质，即为各多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。
[0008] 在第二个方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的猪圆环病毒亚单位疫苗多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式、DNA形式，通过人工合成方式合成抗原表位串联序列，然后通过基因工程操作连接后克隆入载体，转化入大肠杆菌，经过筛选、发酵、纯化等工艺获得猪圆环病毒亚单位疫苗多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切、连接等。优选本发明中的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0009] 在第三个方面，本发明提供了一种载体，其含有本发明第二方面所述的核酸分子。本文中的术语“重组表达载体”、“表达载体”，有时仅称为“载体”，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其他各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可以使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His、Leu、Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。在一优选实施方式中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码融合蛋白的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以获得所需要的融合蛋白。
[0010] 在第四个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述的细胞已用本发明第三方面所述的核酸分子转化或转染。宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。
[0011] 在第五个方面，本发明提供了制备本发明第一个方面所述融合蛋白的方法，其包括以下步骤：用本发明第四个方面的宿主细胞表达本发明第一个方面的融合蛋白，并分离所述的融合蛋白。获得的工程细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需的融合蛋白，包括发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。根据需要，可利用融合蛋白的物理的、化学的以及其他生物学特性，进行分离纯化。方法包括但不限于：裂菌(超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱(亲和层析、金属螯合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，制备性等点聚焦以及常规的变性、复性处理等，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。
[0012] 在第六个方面，本发明提供了一种用于免疫的药物组合物，其包括本发明第一个方面所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体，能预防猪圆环病毒的感染。对于本领域普通技术人员来说，已经有很多公知的方法能将蛋白质或多肽活性成分与药学上可接受的载体制备成药物组合物。本文中使用的药学上可接受的载体指无毒的填充剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、注射剂、喷雾剂型或作为饲料添加剂的剂型。优选该药物组合物为注射剂型、喷雾剂型或作为饲料添加剂的剂型、这些组合物包括不同缓冲液内容(如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液)、相应的离子强度和pH值，以及其他物质(如聚乳酸、甘露醇等)。也优选该药物组合物为疫苗组合物，优选进一步含有佐剂，如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、CpG序列等。
[0013] 在第七个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述的融合蛋白在制备预防猪圆环病毒感染的药物中的应用。在第八个方面，本发明提供了本发明第五个方面所述的药物组合物在制备预防猪圆环病毒感染的药物中的应用。在本发明的一个优选实施方式中，通过对实验动物以特定剂量肌肉注射给药，有效地保护了实验动物。附图说明
[0015] 图1为含有融合蛋白编码基因的表达载体pRSETB-PCV-IL-2的示意图。
[0016] 图2显示了重组表达载体pRSETB-PCV-IL-2用HamH I+HindIII酶切后的电泳结果，其中M为DNAMarker，泳道1为质粒酶切图，泳道2为未酶切对照，泳道3为空质粒。
[0017] 图3为融合蛋白编码基因表达产物SDS-PAGE鉴定结果，其中M为分子量Marker，从上至下依次为94KD、66KD、45KD、33KD、26KD、20KD、14KD，1泳道为诱导纯化样品。
[0018] 图4为样品纯化Western Blot印迹结果，其中M为预染Marker，从上至下依次为94KD、62KD、40KD、30KD、24KD、16KD，泳道1为样品，泳道2为阴性对照。
[0019] 图5为免疫小白鼠ELISA检测血清特异性抗体结果，其中(-◆-)为20150302组；(-■-)为20150304组；(-▲-)为20150306组；(-●-)为商品化灭活苗组；(-+-)为PBS对照组。
[0020] 图6为PCV刺激鼠脾细胞T淋巴细胞增殖反应检测结果。
具体实施方式
[0021] 实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐明本发明，但并不构成对本发明范围的限制，以下所述实验方法，没有具体说明的，均按照《分子克隆实验指南》(2002年，第三版，科学出版社)所述方法进行。
[0022] 实施例一 融合蛋白基因的来源
[0023] 本发明综合分析国内猪圆环病毒1型和2型主要流行株的基因序列、抗原结构、流行病学研究进展，根据其主要结构蛋白Cap蛋白的氨基酸序列，利用相关生物信息学软件对其亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和二级结构进行分析，预测可能的抗原表位，并综合相关报道，从而确定PCV1和PCV2Cap蛋白亚单位。通过柔性Linker连接形成疫苗骨架结构后再与猪白介素2串联，该疫苗总体结构为：
[0024] PCV1 Cap-PCV2 Cap-IL-2-Tag
[0025] 实施例二 大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建
[0026] 将实施例一中设计好的多肽编码核苷酸送上海英俊生物技术公司合成，核苷酸片段两端分别设计了BamH I(5’端)和HindIII(3’端)限制性酶切位点，将合成好的片段克隆到pMD18T载体上，序列测定证实插入基因片段与涉及序列一致(见序列表)。将重组质粒命名为pMD18T-PCV-IL-2，用相应的限制性内切酶对质粒进行酶切处理，大肠杆菌表达载体选用Invitrogen公司的pRSETB质粒，也使用相同的限制性内切酶处理，酶切条件：10μL反应体系，体系内加入质粒2μL，限制性内切酶5个活性单位(New England biolabs)，10×缓冲液1μL，去离子水补齐，37.0℃酶切1.5小时。酶切结束后加入1μL 200mM EDTA终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中电泳30分钟。紫外灯下将pRSETB质粒和目的片段切下，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段为1∶2-3的比例将多表位核苷酸片段与表达载体混合，反应体系15μL，由T4DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，获得重组质粒命名为pRSETB-PCV-IL-2(见图1)，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。
[0027] 转化：将pRSETB-PCV-IL-2置冰上融化，加入1mL连接反应液，再次混匀，冰水浴30分钟，42℃30秒钟，然后迅速放回冰水浴90秒钟，加入1mL LB培养液，37.0℃静置培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200μL LB培养基重悬菌体，将菌液均匀涂布于含有100μL/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板上，倒置于37℃恒温箱中培养12-16小时，直至克隆形成。
[0028] 鉴定：挑取平板上的单克隆至LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养12小时，提取质粒，使用限制性内切酶BamH I和HindIII进行双酶切，可以切出相应猪圆环病毒亚单位疫苗基因大小片段的克隆为1700bp左右，可初步确定为阳性克隆(见图2)，阳性克隆进行DNA序列测定进一步验证其正确性(见序列表)。
[0029] 诱导表达：将阳性克隆过夜培养，次日早上按照1∶100转接，37℃震荡培养3小时候，加入0.5mM IPTG诱导，继续培养3小时，制备样品。常规SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况，可在66KD分子量处见到特异性条带为正确克隆(见图3)。取正确克隆，放大培养，SDS-PAGE证实表达正确后，使用常规Western-blot进一步证实其表达准确性(见图4)。最后筛选得到的高效分泌表达融合蛋白的工程菌，命名为pRSETB-PCV-IL-2/BL21(DE3，PLys)。
[0030] 实施例三 工程菌的发酵、纯化与乳化
[0031] 发酵 将生产菌种接种到2mL含有100μL/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养12小时活化菌种。将活化好的菌种以1∶100的接种量接入摇瓶，37℃震荡培养至OD600＝3，可按10％比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素。校正溶氧和pH值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37℃时，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0℃±0.1℃，溶氧控制在20％左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体OD600＝1.0-1.2时流加补料500mL，补料后1小时加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导表达，连续诱导6个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检测表达情况。
[0032] 纯化 将收集的菌体，用包涵体洗液I(1％Triton X-100，20Mm Tris-cl pH 8.0)混悬后进行超声，2000W超声裂解1小时。4℃，12000rpm离心收集包涵体，并用包涵体洗液II(1％DOC，4M尿素，20mM Tris-cl pH 8.0)混悬二次超声洗涤包涵体，二次低温离心收集包涵体。包涵体沉淀用8M尿素，0.3％β-ME，20mMTris-cl(pH＝8.0)混匀，室温搅拌4小时，8000rpm低温离心30分钟，弃去沉淀。变性蛋白1∶100稀释，复性液用Tris(pH＝8.0)缓冲体系，加入0.3M精氨酸，4℃搅拌复性24小时。复性液用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，0.5M咪唑洗脱。再用1.5M硫酸铵、100mM EDTA、pH＝8.5的10mM磷酸氢二钠平衡上疏水层析柱，再平衡，用pH＝8.5的10mM磷酸氢二钠洗脱，即得猪圆环病毒亚单位疫苗半成品原液，进行SDS-PAGE以及Western-blot印记检定纯化产物是否为目的蛋白。
[0033] 乳化 将纯化的半成品原液用灭菌PBS稀释至200μg/mL。取进口白油矿物油佐剂DUOPRIME(医药级)经121℃灭菌15分钟，备用。按油相∶水相＝50∶50的比例配制，先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以80-100r/min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水相，加完后再搅拌2分钟，然后以5500r/min高速循环乳化9分钟，制成油包水单相疫苗。
[0034] 实施例四 猪圆环病毒亚单位灭活疫苗安全性实验
[0035] 材料
[0036] 疫苗：猪圆环病毒亚单位灭活苗，批号20150302、20150304、20150306，由公司研发中心提供。
[0037] 试验动物：8周龄BaIb/c小白鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。28日龄健康三元杂交断奶仔猪由广东永顺制药提供。
[0038] 方法
[0039] 疫苗对小白鼠的安全性
[0040] 将40只8周龄BaIb/c小白鼠随机分为3个批次组和1个对照组，10只/组。批次组分别皮下注射3个不同批次的猪圆环病毒亚单位灭活疫苗，0.5mL/只。对照组皮下注射生理盐水白油乳剂0.5mL/只。连续观察14天，观测小白鼠的健康状况。
[0041] 疫苗对仔猪的安全性
[0042] 将20头28日龄健康三元杂交断奶仔猪随机分为3个批次组和1个对照组，5头/组。批次组分别耳后肌肉注射3个不同批次的猪圆环病毒亚单位灭活疫苗，2mL/头。对照组注射生理盐水白油乳剂2mL/只。连续观察14天，观测仔猪的健康状况。
[0043] 试验结果
[0044] 疫苗对小白鼠的安全性试验
[0045] 结果见表1，免疫后，所有试验小鼠均未出现任何过敏反应或中毒症状，精神状态良好，体温、采食、饮水等一切正常，未出现明显局部炎症等损伤性临床副反应，无死亡发生，与对照组一致，表明猪圆环病毒亚单位灭活苗对小白鼠是安全的。
[0046] 表1疫苗对小白鼠的安全性试验结果
[0047]组别 动物数量 体温 食欲 精神 健康状况 死亡数量
20150302 10 正常 正常 正常 良好 0
20150304 10 正常 正常 正常 良好 0
20150306 10 正常 正常 正常 良好 0
对照组 10 正常 正常 正常 良好 0
20150302 10 正常 正常 正常 良好 0
20150304 10 正常 正常 正常 良好 0
20150306 10 正常 正常 正常 良好 0
对照组 10 正常 正常 正常 良好 0
[0048] 疫苗对仔猪的安全性试验
[0049] 结果如表2，整个观察期内，所有免疫的仔猪体温和食欲均正常，精神状态良好，未出现任何临床异常现象，免疫部位未发现过敏或炎症，无死亡发生，批次组与对照组一致，表明猪圆环病毒亚单位灭活苗对断奶仔猪是安全的。
[0050] 表2疫苗对仔猪的安全性试验结果
[0051]组别 动物数量 体温 食欲 精神 健康状况 死亡数量
20150302 5 正常 正常 正常 良好 0
20150304 5 正常 正常 正常 良好 0
20150306 5 正常 正常 正常 良好 0
对照组 5 正常 正常 正常 良好 0
20150302 5 正常 正常 正常 良好 0
20150304 5 正常 正常 正常 良好 0
20150306 5 正常 正常 正常 良好 0
对照组 5 正常 正常 正常 良好 0
[0052] 实施例五 亚单位疫苗与传统疫苗免疫效力对比试验
[0053] 疫苗：猪圆环病毒亚单位灭活苗，批号20150302、20150304、20150306，由公司研发中心提供。商品化灭活苗由广东永顺制药提供。
[0054] 试验动物：8周龄BaIb/c小白鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。
[0055] 方法
[0056] 将25只8周龄BaIb/c小白鼠随机分为5组，3个疫苗免疫组，1个商品化灭活苗对照组和1个空白对照组，5只/组。按照分组情况对试验小白鼠进行免疫，皮下注射0.2ml/只，首免21天后，同等剂量同样方法加强免疫一次。分别在免前和首免后7、14、21、28、35、42、49、56天断尾采血，分离血清用于抗体检测，并于最后一次采血后，宰杀小鼠，分离鼠脾细胞用于T淋巴细胞增殖试验。
[0057] 实施例六 间接ELISA检测特异性抗体
[0058] 将纯化的PCV重组蛋白抗原用50mmol/L的CBS(pH9.6)稀释成1μg/mL，加入酶标板中，100μL/孔，4℃静置包被过夜；去掉液体，用PBST(含0.05％Tween-20，pH7.4)洗板三次，加入封闭液(含5％小马血清的PBST)，100μL/孔，37℃封闭1小时；洗板三次，用血清稀释液(含5％小马血清的PBST)将待检样品1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800倍稀释，加入酶标板，100μL/孔，同时用免疫PBS的血清做阴性对照，37℃孵育1小时；洗板三次，加入1∶5000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育1小时；洗板四次，加入TMB底物100μL/孔，避光显色15分钟；加入2MH2SO4终止反应，于450nm波长下检测吸光度值(BIORAD 680酶标仪)。
[0059] 试验结果：
[0060] 如图5，免后14天，疫苗免疫组和商品化灭活苗对照组的小白鼠血清中开始检测到特异性抗体，然后抗体水平不断升高，并在首免后35天达到高峰，随后稳定下降，一直持续到试验结束。免疫组与空白对照组呈极显著差异(P＜0.01)。结果表明本发明提供的猪圆环病毒亚单位灭活苗可以刺激小白鼠体内产生较强的体液免疫反应，且抗体水平与现有商品化灭活苗相当，无显著差异(P＞0.05)。
[0061] 实施例七 T淋巴细胞增殖检测
[0062] 首免后56天无菌采集脾脏进行T淋巴细胞增殖试验，以检测亚单位疫苗免疫后的细胞免疫反应。将小鼠脾细胞制备成细胞悬液(2×105个/100μL)，加入96孔细胞版中，100μL/孔；随后加入培养基混匀，100μL/孔；以刀豆球蛋白(5μg/mL，sigma)作为阳性对照，每个样品3个重复；37℃、5％CO2孵育72小时；每孔加入20μL MTS，孵育5小时；酶联免疫检测仪(BIORAD 680酶标仪)490nm波长下读数。刺激指数(SI)用抗原刺激细胞孔的平均值比细胞(未刺激)孔的平均值来计算。
[0063] 试验结果：
[0064] 如图6，亚单位疫苗免疫组观察到了较高水平的脾细胞增殖活性，明显高于商品化灭活苗组和对照组(P＜0.05)，且三个批次之间无明显差异(P＞0.05)。表明本发明提供的亚单位疫苗能够在试验动物体内诱导加强细胞免疫反应。
[0065] 实施例八 亚单位疫苗攻毒保护试验
[0066] 疫苗：猪圆环病毒亚单位灭活苗，批号20150302、20150304、20150306，由公司研发中心提供。商品化灭活苗由广东永顺制药提供。
[0067] 试验动物：28日龄健康三元杂交断奶仔猪山广东永顺制药提供。
[0068] 方法
[0069] 将25头28日龄仔猪随机分为5组，3个疫苗免疫组，1个商品化灭活苗对照组和1个对照组，5头/组。按照分组情况对试验仔猪进行免疫，耳后肌肉注射2ml/只，首免21天后，同等剂量同样方法加强免疫一次，第35天采用PCV2-LG毒株(104.0TCID50/ml)进行攻毒。观察和记录试验仔猪的发病和死亡情况。攻毒后连续14天观察猪群的精神状态、会阴部和四肢是否出现症状、死亡情况，统计死亡数并计算死亡率。
[0070] 保护率＝[(攻毒对照组死亡率-疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率]×100％。
[0071] 试验结果：
[0072] 结果如表3，攻毒对照组5头全部发病，其中4头死亡；商品化疫苗组2头发病，其中一头死亡；亚单位疫苗组中20150302组和20150306组各有一头发病，其中20150306组一头死亡，20150304组无发病，无死亡，保护率不低于商品化灭活苗。
[0073] 表3猪圆环亚单位灭活苗对仔猪的保护效应
[0074]组别 发病数 死亡数 保护率(n＝5)
20150302 1 0 100％
20150304 0 0 100％
20150306 1 1 75％
商品化灭活苗 2 1 75％
对照组 5 4 -
20150302 1 0 100％
20150304 0 0 100％
20150306 1 1 75％
商品化灭活苗 2 1 75％
对照组 5 4 -
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