本发明具体涉及编码新的细胞内劳索尼亚菌(Lawsonia intracellularis)蛋白的核酸，包含这些序列的DNA片段、重组DNA 分子和活的重组载体、包含这些核酸、DNA片段、重组DNA分子和活 的重组载体的宿主细胞、由这些核苷酸序列编码的蛋白和其在疫苗制 备中的用途、抗细胞内劳索尼亚菌感染的疫苗和其制备方法和用于细 胞内劳索尼亚菌抗原和抗细胞内劳索尼亚菌的抗体的检测的诊断检验 法。

猪增生性肠病(PPE或PE)已成为世界范围内现代猪产业的重大 疾病。所述疾病影响了15％至50％的正在生长的畜群和在已确定了的问 题畜群中影响高达30％的动物个体。如今在每头受影响的猪的额外的 饲料和设施时间花费上，年经济损失估计已达5-10美元。PPE是具有 许多不同临床症状(死亡、苍白(pale)和贫血的动物、水样、黑色 或鲜红的腹泻粪便、萎靡、食欲不振和行动迟缓、生长迟滞以及增加 的FCR)的一组慢性和急性病症。然而，存在两个一致的特征。第一 特征(只在尸体剖检时观察到的病理学变化)是小肠和结肠粘膜的增 厚。第二是在受感染的肠的肠上皮细胞(enterocytes)中出现胞质内 小弯曲细菌(small-curved bacteria)。这些细菌现在已被确定为 PPE的病原因子(etiological agent)并被称为细胞内劳索尼亚菌。

许多年来，已发现细胞内劳索尼亚菌感染许多种类的动物，包括 猴子、兔子、白鼬(ferrets)、仓鼠、狐狸、马和差异如驼鸟和emoe 般大的其他动物。细胞内劳索尼亚菌是革兰氏阴性的、带鞭毛的细菌， 其只在真核生物的肠上皮细胞中繁殖并且非细胞体系培养还未曾被描 述过。为了在细胞中生存和繁殖，细胞内劳索尼亚菌必须要穿透正在 分裂的(dividing)隐窝细胞。细菌与细胞膜结合并通过进入液泡快速 地进入肠上皮细胞。然后该液泡迅速地破裂(在3小时内)，细菌便 在细胞质中旺盛地生长和自由地繁殖。细菌导致被感染的细胞不能成 熟，持续地进行有丝分裂和形成发育不全的隐窝细胞的机制仍不清楚。

目前对细胞内劳索尼亚菌感染、对该疾病的治疗和控制的理解一 直因为细胞内劳索尼亚菌不能在非细胞培养基中进行培养而受到阻 碍。尽管报道了在大鼠肠上皮细胞中成功的共培养细胞内劳索尼亚菌， 但这仍未导致抗细胞内劳索尼亚菌的经灭活的疫苗的开发，尽管明显 地存在对这些疫苗的需求。

本发明的目的是提供抗细胞内劳索尼亚菌感染的疫苗。

现在令人惊奇地发现，细胞内劳索尼亚菌产生能够诱导抗细胞内 劳索尼亚菌的保护性免疫的新的蛋白。

所述新的蛋白称作26kD蛋白。

该新的蛋白的氨基酸序列示于序列标志符SEQ ID NO：2。编码该 蛋白的基因已被测序，其核酸序列示于序列标志符SEQ ID NO：1。该 基因在实施例中也称作“基因5608”。

在本领域众所周知，许多不同的核酸序列可编码同一种的蛋白。 该现象通常称作在编码氨基酸的各三联体的第二和特别是第三位碱基 上的摇摆现象。该现象可导致两个核酸序列大约30％的异源性，但其 仍能编码相同的蛋白。因此，具有大约70％序列同源性的两个核酸序 列仍可编码同一种蛋白。

因此，一个实施方案涉及编码细胞内劳索尼亚菌蛋白的核酸和该 核酸的编码该蛋白的免疫原性片段的部分，其中这些核酸或其部分和 序列示于SEQ ID NO：1的核酸具有至少90％的同源性水平。

优选地，编码该细胞内劳索尼亚菌蛋白的核酸或所述核酸的部分 和具有SEQ ID NO：1所示序列的核酸具有至少92％、优选地94％、更 优选地95％和甚至更优选地96％的同源性。更优选的是98％或甚至100％ 的同源性水平。

可用计算机程序“BLAST 2 SEQUENCES”，通过选择可在www.ncbi. nlm.nih.gov/blast/b12seq/b12.html上找到的子程序“BLASTN”来 确定核苷酸同源性的水平。

该程序的参考资料是Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden FEMS Microbiol.Letters174：247-250(1999)。使用的参数是缺 省参数：匹配赏分(Reward for match)：+1、错配罚分：-2、开放 空位：5、延伸空位：2、Gap x_dropoff：50。

确定某核酸是否是本发明的核酸的另一方法涉及这样的问题，即 该特定核酸是否在严紧条件下确实与具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸 序列的核酸杂交。

如果核酸在严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交， 那么其被认为是本发明的核酸。

按照Meinkoth和Wah1(1984.Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports.Anal.Biochem.138：267-284.) 的公式定义严紧条件

Tm＝[81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰 胺)-500/L]-1℃/1％错配

在公式中，M是单价阳离子的摩尔浓度；％GC是DNA中鸟嘌呤和 胞嘧啶核苷酸的百分比；L是在碱基对上的杂交长度。

严紧条件是这样的条件，即在该条件下，如果核酸或其片段和具 有SEQ ID NO：1所示序列的核酸具有至多10％的错配，其仍能杂交。

因为本发明公开了编码新的细胞内劳索尼亚菌蛋白的核酸，因此 现在第一次有可能以足够的量获得这些蛋白。这可以通过例如使用表 达系统表达编码所述蛋白的基因来实现。

因此，在更优选的实施方案中，本发明涉及包含本发明的核酸的 DNA片段。这样的DNA片段可以是例如克隆了本发明的核酸的质粒。 如下所述，这些DNA片段例如用作引物可用以增加DNA的量。

表达核酸的必要条件是有效地连接所述核酸的恰当的启动子，这 样所述核酸就在启动子的控制之下。启动子的选择扩展至能够在细胞 (用作蛋白表达的宿主细胞)中指导基因转录的任何真核、原核或病 毒启动子对本领域技术人员来说是显而易见的。

因此，该实施方案的更优选的形式涉及重组DNA分子，所述重组 DNA分子包含置于有效连接的启动子控制之下的本发明的DNA片段或 核酸。这可通过例如标准的分子生物学技术(Sambrook，J.和 Russell，D.W.，Molecular cloning：a laboratory manual，2001. ISBN0-87969-577-3)的方法来实现。有效连接的启动子是能够控制其 连接的核酸转录的启动子。

这样的启动子可以是劳索尼亚氏菌属(Lawsonia)启动子例如参 与编码26kD蛋白的基因的体内表达的启动子，假如该启动子在用于 表达的细胞中是有效的。其也可以是异源启动子。当宿主细胞是细菌 时，可使用的有用的表达控制序列包括Trp启动子和操纵子(Goeddel， 等人，Nucl.Acids Res.，8，4057，1980)；lac启动子和操纵子(Chang， 等人，Nature，275，615，1978)；外膜蛋白启动子(Nakamura，K.和 Inouge，M.，EMBO J.，1，771-775，1982)；噬菌体λ启动子和操纵子 (Remaut，E.等人，Nuc l.Acids Res.，11，4677-4688，1983)；α 淀粉酶(枯草芽孢杆菌(B.subtilis))启动子和操纵子，与选择 的宿主细胞相容的终止序列和其他增强和控制表达的序列。

当宿主细胞是酵母时，有用的表达控制序列包括，例如α-交配 因子(mating factor)。对于昆虫细胞，可使用杆状病毒的多角体蛋 白和p10启动子(Smith，G.E.等人，Mol.Cell.Biol.3，2156-65， 1983)。当宿主细胞是哺乳动物来源的宿主细胞时，举例说明性的有用 的表达控制序列包括SV-40启动子(Berman，P.W.等人，Science， 222，524-527，1983)或金属硫蛋白启动子(Brinster，R.L.， Nature，296，39-42，1982)或热激启动子(Voellmy等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，82，4949-53，1985)。

细菌、酵母、真菌、昆虫和哺乳动物细胞表达系统是非常频繁使 用的系统。这些系统在本领域是熟知的并且通常是可获得的，例如从 Invitrogen(www.invitrogen.com)，Novagen(www.merckbiosciences. de)或Clontech Laboratories，Inc.4030 Fabian Way，Palo Alto， California 94303-4607，USA商购获得。除了这些表达系统外，基于 寄生虫的表达系统是非常有吸引力的表达系统。这些系统描述于例如 公开号为2714074的法国专利申请和US NTIS公开号US 08/043109(Hoffman，S.和Rogers，W.：Public.1993年12月1日)。

本发明的该实施方案的其他更优选的形式涉及活重组载体 (LRC)，该重组载体包含编码本发明的26kD蛋白或其免疫原性片段 的核酸、本发明的DNA片段或本发明的重组DNA分子。这些载体是例 如细菌和病毒。这些LRC是这样的微生物或病毒，即在其中已克隆了 额外的遗传信息，在该情况下是编码本发明的26kD蛋白或其免疫原性 片段的核酸。用这些LRC感染的动物将产生这样的免疫应答，即该免 疫应答不仅抗所述载体的免疫原而且抗遗传密码被另外地克隆入LRC 的蛋白(例如26kD蛋白)的免疫原部分。

作为LRC的例子，可使用本领域已知的具有吸引力的减毒的沙门 氏菌属(Salmonella)株系。

Vermeulen，A.N.(Int.Journ.Parasitol.28：1121-1130 (1998))已具体描述了活的重组载体寄生虫。LCR也可用作将核酸运送 入靶细胞的手段。活的重组载体病毒也称作载体病毒。通常用作载体 的病毒是痘苗病毒(Panicali-等人；Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 79：4927(1982)、疱疹病毒(E.P.A.0473210A2)和逆转录病毒 (Valerio，D.等人；in Baum，S.J.，Dicke，K.A.，Lotzova，E. 和Pluznik，D.H.(编著)，Experimental Haematology today-1988. Springer Verlag，New York：pp.92-99(1989))。

可使用本领域熟知的体内同源重组技术将重组核酸导入选择的 细菌、寄生虫或病毒的基因组，所述细菌、寄生虫或病毒能够诱导本 发明的插入的核酸在宿主动物中表达。

最后本发明的该实施方案的其他形式涉及这样的宿主细胞，即其 包含在有效连接的启动子控制之下的编码本发明的蛋白的核酸、包含 这样的核酸的DNA片段或包含这样的核酸的重组DNA分子。该形式也 涉及含有活的重组载体的宿主细胞，所述载体含有编码本发明的26kD 蛋白或其片段的核酸分子。

宿主细胞可以是含有基于细菌的质粒如pBR322或细菌表达载体 如pGEX或含有噬菌体的细菌来源的细胞例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)种类的细胞。 宿主细胞也可以是真核来源的细胞，例如含有酵母特异性载体分子的 酵母细胞，或含有载体或重组杆状病毒的高等真核细胞例如昆虫细胞 (Luckow等人；Bio-technology 6：47-55(1988))，和例如含有基于 Ti质粒载体或植物病毒载体的植物细胞(Barton，K.A.等人；Cell 32：1033(1983))，也含有合适的载体或重组病毒的哺乳动物细胞如 Hela细胞、中国仓鼠细胞(CHO)或Crandell Feline肾细胞。

本发明的另一个实施方案涉及本发明的新的蛋白和其免疫原性 片段。

下面定义免疫原性片段的概念。

该实施方案的一种形式具体涉及具有和SEQ ID NO：2所示的氨 基酸序列具有至少90％的同源性的氨基酸序列的细胞内劳索尼亚菌蛋 白和所述蛋白的免疫原性片段。

在优选的形式中，所述实施方案涉及这样的细胞内劳索尼亚菌蛋 白和所述蛋白的免疫原性片段，即所述蛋白和SEQ ID NO：2所示的氨 基酸序列具有至少92％、优选地94％、更优选地96％的序列同源性。甚 至更优选的是具有98％或甚至100％的同源性水平。

可用计算机程序“BLAST 2 SEQUENCES”，通过选择可在www. ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/b12.html.上找到的子程序： “BLASTP”来确定蛋白同源性的水平。

该程序的参考资料是Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden FEMS Microbiol.Letters 174：247-250(1999)。使用的矩阵： “blosum62”。使用的参数是缺省参数：开放空位：11、延伸空位：1、 Gap x_dropoff：50。

要理解的是，对于此处包括的特定蛋白，单独的细胞内劳索尼亚 菌株系之间可存在天然的变异。这些变异可通过总的序列上的氨基酸 差异或所述序列中氨基酸的缺失、替换、插入、倒位或添加来表明。 例如，Neurath等人在“The Proteins”Academic Press New York(1979) 中描述了基本上不改变生物学和免疫学活性的氨基酸替换。除其他以 外，关联氨基酸之间的氨基酸置换或在演化中频繁发生的置换特别是 Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val(参见Dayhof，M.D.， Atlas of protein sequence and structure，Nat.Biomed.Res. Found.，Washington D.C.，1978，第5卷，suppl.3)。其他氨 基酸替换包括Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、 Ala/Val、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Leu/Ile、Leu/Val和Ala/Glu。 基于该信息，Lipman和Pearson开发了用于快速和灵敏地氨基酸比较 (Science，227，1435-1441，1985)和确定同源蛋白之间的功能相似 性的方法。本发明的示例性实施方案的这些氨基酸替换以及具有缺失 和/或插入的变异在本发明的范围之内，只要所得的蛋白保持其免疫反 应性。这解释了本发明的细胞内劳索尼亚菌蛋白，当从不同野外分离 株(field isolate)中分离时，可具有大约90％的同源性水平，但却 代表具有相同免疫学特性的相同蛋白的原因。在本发明的特定蛋白的 氨基酸序列上的这些变异被认为“基本不影响免疫原性”，即所述变 异仍可提供能够诱导抗细胞内劳索尼亚菌引起的感染或至少抗所述感 染的临床表现的免疫应答的蛋白。

然而，当蛋白用于例如接种目的或用于产生抗体时，不必使用完 整的蛋白。也可能使用该蛋白的片段(所谓的免疫原性片段)，所述 片段同样能够诱导抗该蛋白的免疫应答或偶联至能够诱导抗该蛋白的 免疫应答的载体例如KLH。“免疫原性片段”被理解为在宿主中仍然 保持其诱导免疫应答的能力的全长蛋白的片段，即所述片段包含B或 T细胞表位。现在，可利用各种技术容易地鉴定编码抗原片段(决定 簇)的DNA片段。由Geysen等人(专利申请WO 84/03564、专利申请 WO 86/06487、美国专利4,833,092、Proc.Natl Acad.Sci. 81：3998-4002(1984)，J.Imm.Meth.102，259-274(1987)描述 的方法(所谓的PEPSCAN方法)是容易进行的、快速的和已良好建立 的用于检测表位、蛋白的免疫学上重要区域的方法。所述方法得到广 泛使用并且同样对本领域技术人员来说是熟知的。该(经验性的)方 法特别适合用于B细胞表位的检测。此外，给定编码任何蛋白的基因 的序列，计算机算法能够在其序列和/或结构上与现在已知的抗表位一 致的基础上将特定的蛋白片段指定为免疫学上重要的原表位。这些区 域的确定基于根据Hopp和Woods(Proc.Nat1.Acad.Sci.78： 38248-3828(1981))的亲水性标准和根据Chou和Pasman(Advances in Enzymology 47：45-148(1987)和美国专利4,554,101)的二级结 构状况的结合。同样借助于Berzofsky的两亲性标准(Science 235，1059-1062(1987)和美国专利申请NTIS US 07/005,885)通过计 算机可根据序列预测T细胞表位。可在：Shan Lu关于普通原理： Tibtech9：238-242(1991)、Good等人关于疟疾的抗原表位；Science 235：1059-1062(1987)、Lu的综述；Vaccine 10：3-7(1992)、 Berzowsky关于HIV-表位；The FASEB Journal 5：2412-2418(1991) 中查到精简的概述。

因此，本发明的另外的实施方案的一种形式涉及能够保护猪抗细 胞内劳索尼亚菌感染的疫苗，该疫苗包含如上所述的本发明的蛋白或 其免疫原性片段和药物可接受的载体。

本发明的其他实施方案涉及用于疫苗的本发明的蛋白。

其他实施方案涉及本发明的蛋白在生产抗细胞内劳索尼亚菌感 染的疫苗上的用途。

一种制备本发明的疫苗的方法是通过生物化学纯化法从细菌(从 感染的肠壁获取的粘膜刮取物(scrapings)中获得的)纯化出本发明 的蛋白或其免疫原性片段。然而这是非常耗时的制备疫苗的方法。

因此在疫苗中使用编码本发明的蛋白或其免疫原性片段的基因 的表达产物要方便得多。本发明提供了编码26kD蛋白的基因的核酸。

根据本发明，通过将本发明的蛋白或其免疫原性片段与药物可接 受载体混合可容易地制备基于这些基因的表达产物的这些疫苗，如下 所述。

或者，本发明的疫苗可包括如上描述的活的重组载体，所述载体 能够表达本发明的蛋白或其免疫原性片段。这些疫苗，例如基于感染 肠上皮或例如呼吸上皮的沙门氏菌属载体或病毒载体的疫苗具有优于 亚单位疫苗的有利方面，其更好地模拟细胞内劳索尼亚菌的感染的天 然方式。此外，其自我繁殖是有利的，因为免疫只需要少量的重组载 体。

上述疫苗都有助于主动接种，即，宿主的免疫系统通过本发明的 蛋白或其免疫原性片段引发，产生抗这些蛋白的抗体。

另外，这些抗体可在例如兔子中产生或可从如下所述的抗体产生 性细胞系中获得。然后可将这些抗体给宿主动物施用。该接种方法(被 动接种)是当动物已被感染而且没有时间允许天然的免疫应答被触发 时选择的接种。它也是接种免疫功能受损(immune-compromised)的 动物的优选的方法。施用的抗细胞内劳索尼亚菌的抗体可在这些情况 下直接结合细菌。这具有其立即减少了或阻止了细胞内劳索尼亚菌的 生长的有利方面。

因此，本发明的该实施方案的一种其他的形式涉及包含抗本发明 的26kD细胞内劳索尼亚菌的抗体的疫苗。

疫苗也可以基于如上所述的宿主细胞，其包含本发明的蛋白或其 免疫原性片段。

另外有效的接种方式是直接用编码相关抗原的DNA进行接种。用 编码蛋白的DNA直接接种已在许多不同的蛋白上获得成功。(如在例 如Donnelly等人，The Immunologist 2：20-26(1993)中所综述的)。 该接种方法对抗细胞内劳索尼亚菌感染的猪的接种是非常有吸引力 的。

因此，本发明的该实施方案的其他形式涉及包含编码本发明的蛋 白或其免疫原性片段的核酸的疫苗和涉及包含含有这些核酸的DNA片 段的疫苗。

该实施方案的其他形式涉及包含本发明的重组DNA分子的疫苗。

通过皮内施用例如使用无针头注射器(needle-less injector) 可容易地施用DNA疫苗。该施用方法将DNA直接递送至被接种的动物 的细胞中。1和100μg之间的微克范围内的DNA量提供了非常好的 结果。

在其他实施方案中，本发明的疫苗额外地包含了一种或多种来源 于其他猪病源性生物体和病毒的抗原或编码这些抗原的遗传信息。

这些生物体和病毒优选地选自伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)、猪流感病毒(Porcine influenza virus)、猪细小病毒 (Porcine parvo virus)、传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastro-erteritis virus)、轮状病毒(Rotavirus)、大肠杆菌、 猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、支气管炎博德 特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerasuis)、副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)、多杀巴斯 德氏菌(Pasteurella multocida)、猪链球菌(Streptococcus suis)、 猪肺炎枝原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、猪痢疾螺旋体 (Brachyspira hyodysenteriae)和胸膜肺炎放线杆菌 (Actinoba cillus pleuropneumoniae)。

本发明的所有疫苗包含药物可接受的载体。药物可接受的载体可 以是例如无菌水或无菌生理盐溶液。更复杂形式的载体可以是例如缓 冲剂。

用于制备疫苗的方法包括将本发明的蛋白或其免疫原性片段与 药物可接受的载体混合。

本发明的疫苗优选地也可包含佐剂。佐剂通常包含以非特异性方 式增强宿主的免疫应答的物质。许多不同的佐剂在本领域是已知的。 佐剂的例子是弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子阻断聚合体、 胞壁酰二肽、QuillA(R)、矿质油例如Bayol(R)或Markol(R)、植物油 和Carbopol(R)(同聚物)，或Diluvac(R)Forte。疫苗也可以包含所谓 的“载体”。载体是多肽附着但非共阶地结合其的化合物。经常使用 的载体化合物是例如氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、二氧化硅、高岭土 和皂土。这样的载体的特殊形式是所谓的ISCOM(EP 109.942、EP180. 564、EP242.380)，在所述形式中抗原部分地包埋在载体中。此外， 疫苗可包含一种或多种合适的表面活性化合物或乳化剂，例如Span 或Tween。通常，疫苗与稳定剂混合例如以保护易于降解的多肽免受 降解，从而延长疫苗的货架期(shelf-life)，或提高冷冻干燥效率。 有用的稳定剂特别是SPGA(Bovarnik等人；J.Bacteriology 59：509 (1950))、糖类例如山梨糖醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚 糖或葡萄糖、蛋白例如白蛋白或酪蛋白或其降解产物，和缓冲剂例如 碱金属磷酸盐。

此外，疫苗可悬浮在生理可接受的稀释剂中。不用说，其他佐剂 化、添加载体化合物或稀释剂、乳化或稳定化多肽的方法也在本发明 的范围之内。

非常合适地可以1至100微克范围内的量施用本发明的疫苗，尽 管原则上可以使用更少量的剂量。超过100微克的剂量，尽管在免疫 上非常合适，但出于商业原因较少有吸引力。

基于活的减毒的重组载体(例如LRC病毒和上述细菌)的疫苗可 以低得多的剂量进行施用，因为在感染过程中其自身可增殖。因此， 对于细菌和病毒非常合适的量分别在103至109CFU/PFU范围之间。

可使用许多施用方式。经口施用是非常有吸引力的施用方式，因 为感染是消化道的感染。在本领域已知的和经常使用的优选的经口施 用方式是将疫苗装入胶囊中，所述胶囊只有在其通过胃的高度酸性的 环境后解体。此外，还可将疫苗与本领域已知的化合物混合以临时增 加胃的pH值。全身性施用例如通过疫苗的肌内施用也是合适的。如果 使用该途径，本领域已知的用于全身性施用的标准方法是合适的。

从抗疾病的保护性方面来看，快速而正确地诊断细胞内劳索尼亚 菌是非常重要的。因此本发明的另一目的是提供适合用于细胞内劳索 尼亚菌感染检测的诊断工具。

用于检测血清中细胞内劳索尼亚菌抗体的诊断检验法可以是例 如简单的标准夹心ELISA检验法，在所述方法中用本发明的26kD蛋白 或其抗原性片段包被ELISA板的孔壁。用于检测这些抗体的方法是通 过例如用来自待测哺乳动物的血清温育26kD蛋白或其抗原性片段，接 着用例如经标记的抗相关哺乳动物的抗体的抗体温育来进行的。然后 颜色反应可显示抗细胞内劳索尼亚菌的抗体的存在或不存在。诊断检 验系统的另一例子是例如将包含本发明的26kD蛋白或其抗原性片段 的Western印迹和待测哺乳动物的血清一起温育，接着进行印迹分析。

因此，本发明的另一实施方案涉及用于抗细胞内劳索尼亚菌的抗 体的检测的诊断检验法。这些检验法包含本发明的蛋白或其片段。

基于细胞内劳索尼亚菌抗原的特定26kD蛋白的抗原性材料的检 测从而适合用于细胞内劳索尼亚菌感染的检测的诊断检验法也可以是 标准的ELISA检验法。在这样的检验法的一个实施例中，用抗26kD 蛋白的抗体包被ELISA板的孔壁。在用待测材料温育后，向孔中加入 经标记的抗细胞内劳索尼亚菌的抗体。然后颜色反应显示来自细胞内 劳索尼亚菌的抗原性材料的存在。

因此，本发明的另一实施方案涉及用于细胞内劳索尼亚菌的抗原 性材料的检测的诊断检验法。这些检验法包含抗本发明的蛋白或其片 段的抗体。

可使用如上表征的表达的本发明的多肽或其免疫原性片段来生 产抗体，所述抗体可以是多克隆的、单特异性的或单克隆的(或其衍 生物)。如果多克隆抗体是想要的，用于生产和加工多克隆血清的技 术在本领域是熟知的(例如Mayer和Walter(编著)Immunochemical Methodsin Cell and Molecular Biology，Academic Press，London， 1987)。

可通过用本领域也已知的技术(Kohler和Milstein，Nature， 256，495-497，1975)免疫近交小鼠来制备本发明的抗本发明的多肽 (或其变体或片段)的单克隆抗体。

用于大规模生产本发明的抗体的方法在本领域也是已知的。这些 方法依赖于编码本发明的蛋白的遗传信息(其片段)在用于噬菌体展 示的丝状噬菌体中的克隆。特别在http://aximtl.imt. uni-marburg.de/～rek/aepphage.html.上的“filamentous phage display”下的“Antibody Engineering Page”中和Cortese，R.等 人，(1994)in Trends Biotechn.12：262-267.、Clackson，T.& Wells，J.A.(1994)in Trends Biotechn.12：173-183、Marks，J. D.等人，(1992)in J.Biol.Chem.267：16007-16010、Winter，G. 等人，(1994)in Annu.Rev.Immunol.12：433-455和Little，M.等 人，(1994)Biotechn.Adv.12：539-555的综述论文中描述了这些 技术。随后使用噬菌体筛选表达骆驼(camelid)重链抗体的骆驼表达 文库。(Muyldermans，S.和Lauwereys，M.，Journ.Molec.Recogn. 12：131-140(1999)和Ghahroudi，M.A.等人，FEBS Letters 414： 512-526(1997))。可复制来自表达想要的抗体的文库的细胞，然后 将其用于抗体的大规模表达。

实施例

实施例1：

来自经感染的猪回肠的细胞内劳索尼亚菌的分离

从患PE死亡的猪中收集经组织病理学和抗酸萎尼染色法 (acid-fast Zieh1-Neelsen staining)确定的经细胞内劳索尼亚菌 感染的回肠，并在-80℃下贮存。解冻后，从采自经感染的肠壁的粘膜 刮取物中分离细胞内劳索尼亚菌。如Lawson等人(Vet.Microbiol. 10：303-323(1985))所描述的，在通用均浆器中，在PBS中对回肠刮 取物反复进行匀浆以释放细胞内的细菌。将低速离心除去细胞碎片后 获得的上清液通过5.0、3.0、1.2和0.8μm过滤器(Millipore)进 行过滤。然后将滤液在8000g下离心30分钟，产生细胞内劳索尼亚 菌的小沉淀。使用Percoll梯度离心法进一步纯化这些细菌。通过PCR 检测经纯化的细菌的身份(Jones等人，J.Clin.Microbiol.31： 2611-2615(1993))，同时通过相差显微镜评估细菌的纯度(＞95％) 以显示任何污染性细菌或肠碎片的存在。

细菌株系和质粒

如上所述从经感染的回肠材料中分离细胞内劳索尼亚菌细胞。从 Novagen(Madison，Wisconsin，USA)购买含有载体pLysSrare和质 粒pET22b的大肠杆菌株系BL21star(DE3)。大肠杆菌株系TOP10F’购 自Invitrogen(Groningen，the Netherlands)。将所有细菌株系的 原种(含有30％甘油)在-70℃下贮存。根据标准的方法制备Luria Bertani液体培养基(LB)和LB平板。

DNA分离

为了获得高度纯化的细胞内劳索尼亚菌染色体DNA，使用Biorad 染色体DNA分离试剂盒(Biorad，Veenendaal，the Netherlands)从 细菌细胞中制备DNA。使用Qiagen产物分离质粒DNA。

PCR扩增

使用含有52U/ml Expand High Fidelity Enzyme Mix、具有2.5 mM MgCl2、16mM dNTPs(Promega，Wisconsin，USA)的Expand HF缓 冲液、20皮摩尔的引物和15ng作为模板的细胞内劳索尼亚菌的染色 体DNA的PCR混合物进行PCR扩增。对于标准的应用(即菌落PCR)， PCR混合物含有20U/ml Supertaq和含有8mM dNTPs(Promega， Wisconsin，USA)的Supertaq缓冲液(HT Biotechnology Ltd， Cambridge，UK)、10皮摩尔的引物和15ng模板。

连接和转化

在16℃下、在1x连接缓冲中用1个单位的连接酶(Gibco BRL Life Technologies Inc.，USA)进行连接过夜。通过热激法用1μl 的连接反应物转化大肠感菌感受态细胞。使用标准的方法制备处于感 受态的BL21star(DE3)大肠杆菌感受态细胞和TOP10F′大肠杆菌感 受态细胞。

10xHIS融合蛋白的表达

确定表达载体的DNA序列，然后将表达载体转化入含有 pLysSrar的BL21star(DE3)。将所得的株系在37℃、200rpm下于5ml 含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中培养过夜。在50ml含有100μg/ml 氨苄青霉素的LB中将过夜培养物按1∶100稀释。将该培养物在相同 的条件下培养直至OD600达到0.5。用IPTG诱导培养物至1mM的终浓度 并继续再培养3小时。取出100μl样品进行分析。培养含有pLysSrare 的大肠杆菌株系BL21star(DE3)并在相同的条件下进行诱导，获取样 品作为阴性对照。通过SDS PAGE电泳分析样品。

聚丙酰胺凝胶电泳和western印迹

使用4-12％来自NuPAGE电泳系统(Invitrogen，www.invitrogen. com)的Bis-Tris凝胶进行SDS-PAGE。使用半干燥印迹方法进行 Western印迹。使用鸡抗Lawsonia多克隆血清或使用猪血清对Western 印迹进行显色，所述鸡抗Lawsonia多克隆血清是针对乳浊液(水∶油 ＝45∶55)中的完整细胞制剂产生的，所述猪血清获自用纯化的细胞内 劳索尼亚菌经口攻击并产生临床症状和细胞内劳索尼亚菌感染典型的 死后(post-mortem)损伤的动物。在4℃下，使用等体积的来自含有载 体pLysSrare的BL21star(DE3)的粗制细胞提取物预吸附血清4小时。

结果

细胞内劳索尼亚菌基因5608在基于T7的表述载体中的克隆

使用引物2179(CATGCCATGGATTTGATGGAACAGGATTAAAG)和 2180(CCGCTCGAGCCATAACCCCTTTTCGATAC)扩增基因5608。在该过程中 将5’NcoI和3′XhoI位点引入PCR产物中。使用限制性酶NcoI和 XhoI消化所获得的PCR产物。随后将消化的PCR产物连接至已用相同 的两个限制性酶切割的pET22b。将连接混合物转化大肠杆菌TOP10F 并在37℃温育过夜。使用集落PCR就正确的质粒检测假定的转化子。 通过核苷酸序列分析检测集落PCR阳性转化子的质粒插入物。选择含 有基于克隆策略预期的序列的克隆中的一个克隆并称之为pET5608。

细胞内劳索尼亚菌基因5608在大肠杆菌中通过T7启动子的表达

将质粒pET5608转化入BL21Star(DE3)pLysSrare。如上所述 检测所得的菌株的重组蛋白产物。通过SDS-PAGE凝胶电泳分析经诱导 的培养物的样品和对照样品(图1A)。和未经诱导的样品(图1A，泳 道2)相比，在经3小时的诱导后采集的样品(图1A，泳道3)中观 察到大约26kDa的清晰蛋白带。也使用猪和鸡血清通过Western印迹 分析相同的样品。使用来自已用纯化的细胞内劳索尼亚菌细胞经口攻 击的猪的血清(图1B，泳道3)和鸡抗细胞内劳索尼亚菌的血清(图 1C，泳道3)观察到与蛋白5608的反应。

结论：26kD疫苗组分可成功地进行大量表达并且确实被经口攻击 的猪抗细胞内劳索尼亚菌血清和鸡抗细胞内劳索尼亚菌血明显地识 别。

附图说明

图1.通过SDS-PAGE(A)和使用多克隆猪血清(B)和多克隆鸡 血清(C)的Western印迹对细胞内劳索尼亚菌基因5608在大肠杆菌 BL21 STAR/pLysSRARE中的过量表达的分析。泳道1，分子量标记；泳 道2，pET5608 T＝0；泳道3，pET5608 T＝3。箭头表示表达产物的位 置。

序列表

<110>AKZO Nobel N.V.

<120>细胞内劳索尼亚菌26kD亚单位疫苗

<130>2003.023

<160>2

<170>PatentIn vetsion 3.2

<210>1

<211>856

<212>DNA

<213>细胞内劳索尼亚菌(Lawsonia intracellularis)

<220>

<221>CDS

<222>(80)..(823)

<400>1

atggctataa gcgattgaat aacagaaaat aacacctatg cctgaaattt tcgacgcgtc     60

gaaattttta gaggaaacc atg aaa aaa cta ctc ctt ttg tta tct att ctg      112

                     Met Lys Lys Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ile Leu

                     1               5                   10

ttt cta acc cca agt att acc ttg gcg gaa ggt aat act ttc aat gat       160

Phe Leu Thr Pro Ser Ile Thr Leu Ala Glu Gly Asn Thr Phe Asn Asp

            15                  20                  25

agt ttc aac aag gct aag cgc ata ctg caa gat gag gtg tat tac gac       208

Ser Phe Asn Lys Ala Lys Arg Ile Leu Gln Asp Glu Val Tyr Tyr Asp

        30                  35                  40

cac caa gtt aca cta tac tgc gga tat gaa tat gat gac caa aaa agg       256

His Gln Val Thr Leu Tyr Cys Gly Tyr Glu Tyr Asp Asp Gln Lys Arg

    45                  50                  55

ata tgt ctc cct gat gga ttt ata gca gag aaa cat caa aaa aga tca       304

Ile Cys Leu Pro Asp Gly Phe Ile Ala Glu Lys His Gln Lys Arg Ser

60                  65                  70                  75

tat aaa att gag tgg gaa cat agt gtg cct gct gag aat ttt ggc aga       352

Tyr Lys Ile Glu Trp Glu His Ser Val Pro Ala Glu Asn Phe Gly Arg

                80                  85                  90

gct ttt act gaa tgg cgc gaa ggt cat cct ctt tgt gta gat aat aaa       400

Ala Phe Thr Glu Trp Arg Glu Gly His Pro Leu Cys Val Asp Asn Lys

            95                  100                 105

ggt aaa agt ttc aaa gga cga aaa tgt gca gaa aaa gta aat aaa aca       448

Gly Lys Ser Phe Lys Gly Arg Lys Cys Ala Glu Lys Val Asn Lys Thr

        110                 115                 120

tat aga tat atg cag tct gat atg tac aat ttg ttt cca gca gtc ggg       496

Tyr Arg Tyr Met Gln Ser Asp Met Tyr Asn Leu Phe Pro Ala Val Gly

    125                 130                 135

tct gtc aat gct gcg aga agc aat aag caa tac tca gag tta ctt gga       544

Ser Val Asn Ala Ala Arg Ser Asn Lys Gln Tyr Ser Glu Leu Leu Gly

140                 145                 150                 155

gtt caa tct gct ttt gga acg tgt gag gca aaa ata gat ggg aat aga       592

Val Gln Ser Ala Phe Gly Thr Cys Glu Ala Lys Ile Asp Gly Asn Arg

                160                 165                 170

ttc gaa cca ccg gat aga gct aaa ggt caa gta gcc cgt gct gct ctt    640

Phe Glu Pro Pro Asp Arg Ala Lys Gly Gln Val Ala Arg Ala Ala Leu

            175                 180                 185

tat atg gat aaa gag tac aag gaa tac aat cta agt cgt cag caa aga    688

Tyr Met Asp Lys Glu Tyr Lys Glu Tyr Asn Leu Ser Arg Gln Gln Arg

        190                 195                 200

aga ctt ttt gag gct tgg agt aat atg tat cca gtc gat gaa tgg gag    736

Arg Leu Phe Glu Ala Trp Ser Asn Met Tyr Pro Val Asp Glu Trp Glu

    205                 210                 215

tgt aca cga gcc aaa cga atc gaa tct ata cag gga aat gaa aat att    784

Cys Thr Arg Ala Lys Arg Ile Glu Ser Ile Gln Gly Asn Glu Asn Ile

220                 225                 230                 235

ttt gta aaa aat atg tgt atc gaa aag ggg tta tgg taa acaaacgagg     833

Phe Val Lys Asn Met Cys Ile Glu Lys Gly Leu Trp

                240                 245

acaatataaa tactacctaa gta                                          856

<210>2

<211>247

<212>PRT

<213>细胞内劳索尼亚菌

<400>2

Met Lys Lys Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ile Leu Phe Leu Thr Pro Ser

1               5                   10                  15

Ile Thr Leu Ala Glu Gly Asn Thr Phe Asn Asp Ser Phe Asn Lys Ala

            20                  25                  30

Lys Arg Ile Leu Gln Asp Glu Val Tyr Tyr Asp His Gln Val Thr Leu

        35                  40                  45

Tyr Cys Gly Tyr Glu Tyr Asp Asp Gln Lys Arg Ile Cys Leu Pro Asp

    50                  55                  60

Gly Phe Ile Ala Glu Lys His Gln Lys Arg Ser Tyr Lys Ile Glu Trp

65                  70                  75                  80

Glu His Ser Val Pro Ala Glu Asn Phe Gly Arg Ala Phe Thr Glu Trp

                85                  90                  95

Arg Glu Gly His Pro Leu Cys Val Asp Asn Lys Gly Lys Ser Phe Lys

            100                 105                 110

Gly Arg Lys Cys Ala Glu Lys Val Asn Lys Thr Tyr Arg Tyr Met Gln

        115                 120                 125

Ser Asp Met Tyr Asn Leu Phe Pro Ala Val Gly Ser Val Asn Ala Ala

    130                 135                 140

Arg Ser Asn Lys Gln Tyr Ser Glu Leu Leu Gly Val Gln Ser Ala Phe

145                 150                 155                 160

Gly Thr Cys Glu Ala Lys Ile Asp Gly Asn Arg Phe Glu Pro Pro Asp

                165                 170                 175

Arg Ala Lys Gly Gln Val Ala Arg Ala Ala Leu Tyr Met Asp Lys Glu

            180                 185                 190

Tyr Lys Glu Tyr Asn Leu Ser Arg Gln Gln Arg Arg Leu Phe Glu Ala

        195                 200                 205

Trp Ser Asn Met Tyr Pro Val Asp Glu Trp Glu Cys Thr Arg Ala Lys

    210                 215                 220

Arg Ile Glu Ser Ile Gln Gly Asn Glu Asn Ile Phe Val Lys Asn Met

225                 230                 235                 240

Cys Ile Glu Lys Gly Leu Trp

                245