登革热的致病因素是登革热病毒，其属于黄病毒科的黄病毒属(Burke and Monath，2001)。黄病毒中一个非常重要的亚群是称做蚊媒 (mosquito-bome)黄病毒的群体，即由蚊子传播的黄病毒的群。这个群除了上 述登革热病毒外，还包括其它重要病毒，如西尼罗病毒(West nile virus)、日 本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)和黄热病病毒(Fields Virology，ed.by Fields B.N.，Lippincott-Raven Publishers，3rd edition 1996，ISBN： 0-7817-0253-4，pages 931-1034)。由这些病毒传播的典型疾病是由西尼罗病 毒引起的西尼罗热和西尼罗脑炎，由日本脑炎病毒引起的脑炎，由黄热病 病毒和登革热病毒引起的黄热病，由登革热病毒引起的登革出血热(DHF； 见下面)和登革休克综合征(DSS)。
黄病毒为包膜单链正链RNA病毒，其由三种结构蛋白组成：与病毒基 因组结合形成核衣壳的衣壳蛋白(C)，所述核衣壳由锚定有M(膜)和E(包膜) 蛋白的脂质双层包围。基因组大约为11kb，且包含编码约3400个氨基酸残 基的多蛋白前体的单一开放阅读框。每种病毒蛋白都通过细胞蛋白酶和病 毒蛋白酶的作用由此前体产生。三种结构蛋白(C，M和E)衍生自多蛋白的 N末端部分，它们之后是七种非结构蛋白：NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A， NS4B和NS5(Lindenbach and Rice，2001)。
存在于所有黄病毒中的糖蛋白NS1倾向于对病毒活力是必需的。登革 热病毒NS1从哺乳动物感染细胞中以可溶六聚体形式分泌出来(Flamand等， 1999)。此非共价结合六聚复合物由3个二聚亚基形成，具有310kDa的分 子量。二聚化是NS1蛋白输出到质膜的先决条件，在质膜上，它作为被感 染的细胞表面唯一的病毒驻留蛋白。
在哺乳动物细胞中，所转运的部分NS1被释放到细胞外环境中，而在 利于登革热感染的昆虫细胞系中却不会如此。细胞外NS1以可溶蛋白的形 式分泌，其中可溶蛋白以较高级六聚寡聚形式存在，或者以与微粒结合而 不与病毒粒子结合的形式分泌。此外，已经发现NS1在感染登革热病毒的 患者的血清中循环，这表明NS1分泌可能是人宿主中黄病毒感染过程中的 一个重要事件。在黄病毒感染的过程中，NS1蛋白引起很强的抗体反应， 这种反应有助于从宿主中清除感染病毒，推测该清除是通过补体介导途径 (Schlesinger，J.J.等，1987)和依赖抗体的细胞毒性(ADCC)(Schlesinger，J.J.等， 1993)。
登革热病毒有四种血清型：登革热病毒血清型1(Den-1)到登革热病毒血 清型4(Den-4)，该病毒是黄病毒属中与感染人类有关的最重要成员，它引起 的疾病从感冒样症状到严重的或致命的疾病，登革出血热及休克综合征。 登革热爆发一直是热带和亚热带密集居住地区的一个主要公众卫生问题， 在这些地区蚊媒丰富。
世界许多地区都十分关注由蚊媒黄病毒引起的登革热感染和其它疾病 的传播，因此大力开发可以预防登革热(DF)和登革出血热(DHF)的登革热疫 苗，并获得了对保护接种个体抵抗由某些或所有蚊媒黄病毒引起的感染有 用的疫苗。
用四种血清型中任意一种首次感染后大多数DF病例都有症状，大部分 DHF病例却发生在第二次用与首次感染的登革热病毒血清型不同的血清型 感染的受检者中。这些观察结果产生了一种假设：间隔适当时期后，对已 有抵抗一种登革热血清型的抗体的个体用另一种病毒血清型继续感染可能 会造成相当数量的DHF病例。在体外已经证实了登革热病毒以及其它包膜 病毒的依赖抗体的增强作用(ADE)，并且认为它是DHF病因中的一个重要 机理。
已经发现DHF通常出现在多种(三或四种)病毒血清型共流行的地理区 域内。在具有地方性DHF的区域，如东南亚国家，年龄特异性发病率在儿 童中较高，在较大年龄组中DHF病例数减少。这与不断增加的登革热血清 阳性率大致相应，表明自然感染可能引起了保护性免疫。这一现象不像观 察到的其它病毒感染，比如甲型肝炎病毒。根据无对照的个案病例描述的 临床观察显示，患者可能经历两次DHF(Nimmannitya等，1990)，但这是很 罕见的，而且正确地鉴定出引起第二次感染和后来感染的血清型是非常困 难的。到现在为止，尽管所有四种登革热病毒血清型在同一区域内流行， 但还没有相同个体后期感染的报告。这表明在自然界中，相同个体中二种 或三种登革热病毒血清型的感染可能形成交叉反应抗体，甚至交叉反应性 细胞毒性淋巴细胞应答。这可能调节或保护机体抵抗自然界中继续存在的 登革热病毒血清型的感染。
目前还没有已被批准的登革热疫苗。现在，登革热病毒感染的预防依 赖于对主要蚊媒—埃及伊蚊(Aedes aegypti)的控制。对杀虫剂的抗性、缺乏 能使地方卫生部门维持有效控蚊计划的技术上和经济上的支持，以及作为 媒介的蚊和登革热病毒的持续的地区传播使得通过现行控蚊计划来抵抗登 革热的感染实际上是不可能的。因此，开发安全有效的抵抗登革热病毒所 有四种血清型的疫苗已经被世界卫生组织(WHO)指定为重点预防登革热病 毒感染的最经济有效的方法。世界卫生组织建议抵抗登革热和DHF的理想 疫苗应该是一种能预防所有血清型引起的感染的疫苗，从而使得连续感染 不能发生。
为达到该目的，WO98/13500提出利用一种表达来自登革热病毒所有血 清型的抗原的重组修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)，和利用四种重组MVA， 其中每种重组MVA表达一种登革热病毒血清型的至少一种抗原。这两个策 略都提供了非常有前景的抵抗登革热病毒所有血清型的接种策略。但是， 希望提供一种单一亚单位疫苗，它在施用后可引起抵抗多于一种黄病毒或 多于一种登革热病毒血清型，优选抵抗登革热病毒所有血清型的免疫反应。 WO98/13500还公开了一种编码登革热病毒NS1的重组MVA。WO98/13500 未公开衍生自一种登革热病毒血清型的抗原能引起的免疫反应不但抵抗产 生该抗原的登革热病毒血清型，而且抵抗衍生自其它登革热病毒血清型的 抗原。
WO99/15692公开了一种重组MVA，它包含并能表达一种或多种编码 不引起免疫增强作用或抗体依赖性增强作用的登革热病毒抗原的DNA序 列。WO99/15692未公开衍生自一种登革热病毒血清型的抗原引起的免疫反 应不但抵抗产生该抗原的登革热病毒血清型，而且抵抗衍生自其它登革热 病毒血清型的抗原。
发明目的
本发明的目的是提供一种衍生自黄病毒或黄病毒血清型的疫苗，它稳 定，易于生产，并能引起保护接种个体不但抵抗衍生该疫苗的黄病毒或黄 病毒血清型，而且抵抗其它黄病毒或黄病毒血清型的免疫反应。本发明的 一个具体目的是提供一种衍生自蚊媒黄病毒的疫苗，它保护接种个体不但 抵抗衍生该疫苗的蚊媒黄病毒或黄病毒血清型，而且抵抗其它蚊媒黄病毒 或黄病毒血清型。本发明的另一个目的是提供衍生自登革热病毒一种血清 型的疫苗，它保护接种个体抵抗至少两种，优选登革热病毒所有血清型的 感染。
本发明涉及：
1.下述物质在制备疫苗中的用途，
(i)包含表达盒的核酸，所述表达盒含有转录调节元件以及至少编码蚊 媒黄病毒的NS1蛋白或其部分的序列，
(ii)包含所述核酸的载体，和/或
(iii)所述黄病毒的NS1蛋白或其部分，
所述疫苗用于抵抗产生所述核酸或者产生所述NS1蛋白或其部分的蚊 媒黄病毒，并抵抗至少一种其它蚊媒黄病毒。
2.项1的用途，其中产生所述核酸或者产生所述NS1蛋白或其部分的 蚊媒黄病毒是登革热病毒。
3.下述物质在制备疫苗中的用途，
(i)包含表达盒的核酸，所述表达盒含有转录调节元件以及至少编码登
革热病毒血清型的NS1蛋白或其部分的序列，
(ii)包含所述核酸的载体，和/或
(iii)所述登革热病毒血清型的NS1蛋白或其部分，
所述疫苗用于抵抗登革热病毒所有血清型，并可选择抵抗至少一种其 它蚊媒黄病毒。
4.项2或3的用途，其中产生所述核酸或者产生所述NS1蛋白或其部 分的登革热病毒是登革热病毒血清型2。
5.项1-4之一的用途，其中编码蚊媒黄病毒或登革热病毒血清型的NS1 蛋白或其部分的序列，在前面接有ATG密码子和编码糖基化信号序列的序 列，且其中编码序列在翻译终止密码子处终止。
6.项1-5之一的用途，其中所述其它蚊媒黄病毒选自西尼罗病毒、黄 热病病毒和日本脑炎病毒。
7.项1-6之一的用途，其中所述载体是痘病毒载体。
8.项7的用途，其中所述痘病毒载体为修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA) 株，特别是保藏在欧洲细胞培养物保藏中心、编号为V00083008的MVA-BN 或其衍生物。
9.项7或8的用途，其中所述痘病毒载体已经冻干，并且可以于给药 前在药学上可接受的稀释剂中重构。
10.项1-9之一的用途，其中所述转录调节元件是痘病毒启动子。
11.项1-10之一的用途，其中所述疫苗在首次接种(“初次接种”)和二 次接种(“加强接种”)中以治疗有效量给药。
12.一种治疗或预防黄病毒感染的方法，其包括给有需要的动物，包 括人，接种
(i)包含表达盒的核酸，所述表达盒包含转录调节元件以及至少编码蚊 媒黄病毒NS1蛋白或其部分的序列，
(ii)包含所述核酸的载体，和/或
(iii)所述黄病毒的NS1蛋白或其部分
其中所述黄病毒感染是被产生所述核酸或者产生所述NS1蛋白或其部 分的蚊媒黄病毒感染，和/或被另一种蚊媒黄病毒感染。
13.项12的方法，其中产生所述核酸或者产生所述NS1蛋白或其部分 的蚊媒黄病毒是登革热病毒。
14.一种治疗或预防黄病毒感染的方法，其包括给有需要的动物，包 括人，接种
(i)包含表达盒的核酸，所述表达盒包含转录调节元件以及至少编码登 革热病毒血清型NS1蛋白或其部分的序列，
(ii)包含所述核酸的载体，和/或
(iii)所述登革热病毒血清型的NS1蛋白或其部分，
其中所述黄病毒感染是被产生所述核酸或者产生所述NS1蛋白或其部 分的登革热病毒血清型感染，和/或被其它登革热病毒血清型感染，和/或被 其它蚊媒黄病毒感染。
15.项12-14之一的方法，其中产生所述DNA或者产生所述蛋白或其 部分的登革热病毒是登革热病毒血清型2。
16.项12-15之一的方法，其中所述编码蚊媒黄病毒或登革热病毒血清 型的NS1蛋白或其部分的序列，在其前面接有ATG密码子和编码糖基化信 号序列的序列，且其中编码序列在翻译终止密码子处终止。
17.项12-16之一的方法，其中所述载体是痘病毒载体。
18.项17的方法，其中所述痘病毒载体是修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA) 株。
19.项18的方法，其中所述MVA株是保藏在欧洲细胞培养物保藏中 心、编号为V00083008的MVA-BN或其衍生物。
20.项17-19之一的方法，其中所述痘病毒载体已经冻干，并且可以于 给药前在药学上可接受的稀释剂中重构。
21.项12-20之一的方法，其中所述转录调节元件是痘病毒启动子。
22.项17-21之一的方法，其中所述痘病毒载体或药物组合物在首次接 种(“初次接种”)和二次接种(“加强接种”)中以治疗有效量给药。
23.一种痘病毒载体，它携有包含表达盒的DNA，所述表达盒包含转 录调节元件以及至少编码黄病毒NS1蛋白或其部分的序列，其中所述痘病 毒是保藏在欧洲细胞培养物保藏中心、编号为V00083008的修饰的安卡拉 痘苗病毒(MVA)BN株或其衍生物。
24.项23的痘病毒载体，其中所述黄病毒是蚊媒黄病毒，特别是登革 热病毒。
25.项24的痘病毒载体，其中所述登革热病毒是登革热病毒血清型2。
26.项23-25之一的痘病毒载体，其中所述编码黄病毒NS1蛋白或其 部分的序列，在其前面接有ATG密码子和编码糖基化信号序列的序列，且 其中编码序列在翻译终止密码子处终止。
27.项23-26之一的痘病毒载体，其中所述转录调节元件为痘病毒启动 子。
28.项23-27之一的痘病毒载体，其中所述痘病毒载体是冻干的。
29.作为疫苗的项23-28之一的痘病毒载体。
30.一种药物组合物，它包含项23-28之一的痘病毒载体和药学上可接 受的载体、稀释剂和/或添加剂。
31.用于治疗和/或预防黄病毒感染的项23-29之一的痘病毒载体或项 30的药物组合物，其中所述痘病毒载体或药物组合物在首次接种(“初次接 种”)和二次接种(“加强接种”)中以治疗有效量给药。
32.一种治疗或预防黄病毒感染的方法，包括给有需要的动物，包括 人，接种项23-29之一的载体或项30的药物组合物。
33.一种细胞，优选人细胞，它含有项23-28之一的痘病毒载体。
34.项23-28之一的痘病毒载体用于制备治疗或预防黄病毒感染的疫苗 的用途。
35.一种用于初次免疫/加强免疫的试剂盒，它在第一个瓶/容器中含有 首次接种(初次接种)所用的项23-29之一的痘病毒载体或项30的药物组合 物，在第二个瓶/容器中含有二次接种(加强接种)所用的项23-29之一的痘病 毒载体或项30的药物组合物。
发明详述
这些问题分别利用黄病毒NS1蛋白或其部分，以及包含编码黄病毒NS1 蛋白或其部分的表达盒的DNA序列得以解决。具体地，通过利用蚊媒黄病 毒，尤其是登革热病毒，优选登革热病毒血清型2的NS1蛋白或其部分， 以及对应的DNA序列，提供衍生自一种蚊媒黄病毒的疫苗，它保护个体抵 抗衍生该疫苗的蚊媒黄病毒的感染，而且抵抗至少一种其它蚊媒黄病毒的 感染。更特别地，通过利用登革热病毒，尤其是登革热病毒血清型2的NS1 蛋白或其部分以及对应的DNA序列，提供了衍生自一种登革热病毒血清型 的疫苗，它保护个体抵抗至少两种，优选至少三种，更优选登革热病毒所 有血清型的感染，并优选还抵抗其它黄病毒，特别是蚊媒黄病毒如日本脑 炎病毒、黄热病病毒和西尼罗病毒的感染。
如在试验部分更详细显示的，衍生自登革热病毒一种血清型并在接种 后重新表达的NS1蛋白能引起与登革热病毒血清型1、2、3和4的NS1蛋 白和来自黄病毒属的其它成员，如日本脑炎病毒，黄热病病毒和西尼罗病 毒的NS1蛋白交叉反应的抗体应答。因此，来自一种登革热病毒血清型的 NS1蛋白是同时抵抗至少二种，更优选三种，甚至更优选所有四种登革热 病毒血清型，而且抵抗黄病毒属一种或更多其它病毒的通用DHF亚单位疫 苗。由于这种亚单位疫苗策略中不包括E蛋白，所以在随后暴露在任何一 种登革热血清型时将不会有依赖抗体的增强作用(ADE)的风险，而且在登革 热感染自然爆发时将不会引起疫苗相关的DHF。
NS1蛋白可以从核酸，优选包含编码至少一种黄病毒NS1蛋白或其部 分的表达盒的DNA表达。本文中的术语“至少”解释为表达盒可以另外编 码其它蛋白/肽，如下面更详细定义的单独的蛋白/肽或与NS1蛋白或其部分 融合的蛋白/肽。本发明中的术语“DNA”指任何形式的DNA，如单链DNA、 双链DNA、线性或环状DNA或质粒形式或病毒基因组形式的DNA。由于 黄病毒是RNA病毒，编码黄病毒NS1蛋白的DNA是非天然DNA，比如 cDNA或合成DNA。
术语“编码黄病毒NS1蛋白或其部分的表达盒(expression cassette)”解 释为编码黄病毒NS1蛋白或其部分的序列在其前面接有控制转录，特别是 转录起始的元件。所述转录调节元件的例子为原核启动子和真核启动子/增 强子。优选的真核启动子/增强子是人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子和 痘病毒启动子，如7.5启动子和痘病毒最小启动子，参见实施例部分。痘病 毒最小启动子的序列如图2和SEQ：ID No.9所示。如果需要，表达盒可进 一步包含控制转录终止的元件，如原核终止元件或真核Poly A信号序列。
表达盒(expression cassette)可以只表达黄病毒NS1蛋白或其部分，或者 表达与一种或多种其它黄病毒蛋白/肽一起的NS1蛋白或其部分，其中NS1 蛋白或其部分和其它蛋白/肽作为单独的蛋白/肽或者融合蛋白制出。如果不 在说明书中另外定义，本发明中的术语“肽”指至少10个氨基酸的连续氨 基酸序列，更优选至少20个氨基酸，最优选至少25个氨基酸。
所述其它黄病毒蛋白不是完整E蛋白，因为此蛋白好象不参与DHF的 进展。因此，如果所述其它黄病毒肽衍生自E蛋白，其将包含少于40个氨 基酸，优选少于35个氨基酸。如果衍生自E蛋白的氨基酸序列与NS1蛋白 或其部分一起表达，应证实此氨基酸链不包含参与ADE和DHF发生的表 位。
如果表达盒除了表达NS1蛋白或其部分外，还表达单独的蛋白/肽形式 的其它黄病毒蛋白/肽，表达盒可以在编码NS1蛋白或其部分的序列和编码 所述其它黄病毒蛋白的序列间包含一个内部核糖体进入位点(IRES)。IRES 元件为本领域技术人员所熟知。IRES元件的例子为小核糖核酸病毒IRES 元件或丙型肝炎病毒的5’非编码区。
另外，编码NS1蛋白或其部分的核酸序列可以与编码其它黄病毒蛋白/ 肽的DNA序列融合，以便产生NS1蛋白或其部分和其它黄病毒蛋白/肽的 融合蛋白。如果要将NS1蛋白或其部分与其它黄病毒蛋白/肽以融合蛋白/ 肽的形式产生，则将其相应编码序列融合在同一阅读框内。
在一优选实施方案中，编码NS1蛋白或其部分的DNA序列在其前面接 有编码E蛋白糖基化信号的序列。按照此实施方案，制备出包含与NS1 蛋白或其部分融合的E蛋白糖基化信号序列的融合蛋白。如上所指出的，E 蛋白衍生的氨基酸链应该尽可能短，而且它应该不包括参与ADE和DHF 发生的表位。E蛋白的糖基化信号序列满足这些要求。
在另一优选实施方案中，本发明所述的表达盒包含编码NS1蛋白或其 部分的序列作为唯一的黄病毒序列。因此，在此优选实施方案中，根据本 发明所述的表达盒不表达黄病毒基因组其它部分的任何其他肽/蛋白，尤其 不表达NS2A或E蛋白。
在另一优选实施方案中，本发明所述的DNA表达NS1蛋白或其部分与 并非衍生自黄病毒的蛋白/肽的融合蛋白，所述并非衍生自黄病毒的蛋白/肽 包含非黄病毒信号序列或可用于检测或纯化所表达的融合蛋白的序列，如 标记。
为了理解本发明一优选实施方案中使用的表达盒中的黄病毒序列的一 般结构，简要地概括一下黄病毒基因组的结构是有利的：在天然黄病毒感 染期间，该病毒产生一种多蛋白，它先被宿主细胞蛋白酶裂解然后被病毒 编码的蛋白酶裂解为下列蛋白：C，PrM和M，E，NS1，NS2A，NS2B， NS3，NS4A，NS4B和NS5(在该多蛋白前体上的蛋白顺序)。因此，编码 NS1蛋白或其部分的DNA序列，尤其是cDNA序列，必须需要添加“ATG” 起始密码子。在一优选实施方案中，起始ATG后面接有编码糖基化信号的 序列，以使新合成的NS1蛋白在内质网中糖基化。所述信号序列为本领域 技术人员所熟知。最后，蛋白编码组件需要一个终止密码子，其可以是加 在编码蛋白的cDNA序列3’末端的TAG。在本发明实施例中使用的“ATG+ 信号序列”元件衍生自编码E蛋白的疏水C末端的序列(最后28个氨基酸， 在登革热病毒New Guinea株(“NGC株”，GeneBank登录号AF038403)中始 于氨基酸M(ATG))。本发明所述的典型表达盒如图2，SEQ：ID NO9和SEQ： ID NO10所示。
因此，概括的讲，此实施方案涉及含有编码黄病毒NS1蛋白或其部分 的表达盒的DNA的用途，其中编码序列前面接有起始密码子(＂ATG＂)和编 码糖基化信号序列的序列，优选如上定义的衍生自E蛋白的序列，且编码 序列止于翻译终止密码子(图1A，1C和2，SEQ：ID 5-10)。
本发明所述的DNA序列编码黄病毒NS1蛋白或其部分。术语“黄病毒” 指任何黄病毒。更优选术语“黄病毒”指蚊媒黄病毒，如西尼罗病毒，日 本脑炎病毒，黄热病病毒和登革热病毒。由本发明所述DNA编码的衍生自 一种蚊媒病毒的NS1蛋白或其部分，应该保护接种个体不但抵抗衍生该疫 苗的病毒或病毒血清型的感染，而且抵抗其它蚊媒病毒或衍生该疫苗的病 毒其它血清型的感染。NS1蛋白优选为任何登革热病毒血清型。更优选地 NS1蛋白编码序列衍生自登革热病毒血清型2，如登革热病毒New Guinea 株(“NGC株”，GeneBank登录号AF038403)。术语“亚型”和“血清型” 在说明书中交替使用。
本文术语“NS1蛋白或其部分”中的术语“其部分”指NS1蛋白的一 段氨基酸链，它的长度足以诱导特异性免疫反应以抵抗作为“其部分”的 来源的NS1蛋白。如果黄病毒为登革热病毒，此氨基酸链应该能在接种动 物(包括人)体内引起抵抗登革热病毒所有血清型的NS1蛋白的免疫反应。在 实施例部分，显示了本领域技术人员如何测定是否NS1蛋白或其部分引起 了对登革热病毒所有血清型的特异性免疫反应。根据一优选的实施方案， 黄病毒DNA序列编码整个NS1蛋白。因此，术语“NS1蛋白或其部分”指 天然NS1蛋白的整个序列，以及仍能引起免疫反应的更短的表位链。
而且术语“NS1蛋白”也指天然NS1蛋白的衍生物。所述衍生物可以 是在天然NS1蛋白中取代、缺失和/或插入一个或更多氨基酸所得的蛋白。 作为实施例，所述衍生物是氨基酸序列同源性至少50％，优选至少75％， 更优选至少90％的蛋白。因此，术语“其部分”也指所述NS1蛋白衍生物 的部分。
概括的讲，本发明的一个最优选的实施方案是含有编码蚊媒黄病毒NS1 或其部分的表达盒的DNA的用途，其中黄病毒优选为登革热病毒，尤其是 登革热病毒血清型2，其中NS1蛋白或其部分的表达由转录调节元件控制。 更优选的，本发明所述DNA编码以与糖基化信号序列的融合蛋白形式的 NS1蛋白或其部分。
本发明进一步涉及含有如上所述DNA的载体，以及所述载体按照本发 明所述诱导免疫反应的用途。术语“载体”指本领域技术人员所熟知的任 何载体。载体可以是质粒载体如pBR322，或pUC系列载体。更优选地， 载体为病毒载体。在本发明正文中，术语“病毒的载体”或“病毒载体” 指含有病毒基因组的感染性病毒。在这种情况下，将本发明DNA克隆入相 应病毒载体的病毒基因组中。然后包装重组病毒基因组，从而获得的重组 载体可以用于感染细胞和细胞系，特别是感染有生命动物(包括人)。根据本 发明所述可以使用的典型的病毒载体是腺病毒载体、逆病毒载体，或以腺 伴随病毒2(AAV2)为基础的载体。最优选的是痘病毒载体。痘病毒优选为金 丝雀痘(canarypox)病毒、禽痘病毒或者痘苗病毒。更优选为修饰的安卡拉痘 苗病毒(MVA)(Sutter，G.等，1994，Vaccine 12：1032-40)。典型的MVA株是 MVA575，它已经保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection ofAnimal Cell Cultures)，保藏编号为ECACC V00120707。最优选为MVA-BN 或在PCT申请WO02/42480中描述的其衍生物(PCT/EP01/13628)。上述申 请的内容包括在本申请中作为参考文献。MVA-BN已经保藏在欧洲动物细 胞培养物保藏中心，保藏编号为ECACC V00083008。由于MVA-BN病毒载 体为高度减毒的病毒，故通过利用MVA-BN或其衍生物，附加的技术问题 得到了解决，从而提供了一种抵抗黄病毒的特别安全的病毒疫苗。特别地， MVA-BN经证实比现有技术已知的MVA株毒力更弱。MVA-BN衍生自修饰 的安卡拉痘苗病毒，并且具有在人细胞系中丧失其复制能力的特性。由于 在人体中不能复制，MVA-BN比任何其它已知的痘苗病株都更加安全。在 优选的实施方案中，本发明涉及一种包含如上所述MVA-BN和MVA-BN衍 生物的DNA的病毒载体。MVA-BN的特性，评价MVA株是否为MVA-BN 或其衍生物的生物学检测和获得MVA-BN或其衍生物的方法在 WO02/42480中公开。
本申请中使用的保藏号为ECACC V00083008的病毒的“衍生物”，即 MVA-BN的衍生物，如WO02/42480中所定义。下面，对MVA-BN衍生物 的特性进行简单地描述。关于MVA-BN衍生物的定义的更加详细的信息， 特别是关于用来测定MVA病毒是否为提及的MVA-BN衍生物的生物学检 测的详细信息参见WO02/42480。因此，所述术语指表现MVA-BN保藏株 的至少一种下述特性，但在其基因组中有一或多处不同的痘苗病毒。优选 的衍生物有至少二种，更优选有至少三种，最优选所有下述四种MVA-BN 特性：
- 在鸡胚成纤维细胞(CEF)以及在幼仓鼠肾细胞系BHK(ECACC 85011433)中有繁殖性复制(reproducetive replication)能力，但是在人细胞系 HaCat中无繁殖性复制能力(Boukamp等1988，J Cell Biol.106(3)：761-71)，
- 不能进行体内复制，
- 与已知株MVA575(ECACC V00120707)相比，在致死性攻击模型中 诱导更高的免疫原性，和/或
- 与DNA初次免疫(prime)/痘苗病毒增加强免疫(boost)的方案相比，在 痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中诱导至少实质上相同的免疫 力水平。
具体地，MVA-BN的衍生物具有与MVA-BN实质上相同的复制特性。 与保藏的病毒具有相同“复制特性”的病毒是，在CEF细胞和细胞系BHK， HeLa，HaCat以及143B细胞系中以相似的扩增比进行复制、并且在转基因 小鼠模型AGR129中经测定具有相似的复制的那些病毒。
在本申请中使用的术语“不能进行繁殖性复制”如WO02/42480中所定 义。因此，“不能进行繁殖性复制”的病毒是指在人细胞系HaCat中扩增比 小于1的病毒(Boukamp等1988，J Cell Biol.106(3)：761-71)。优选地，作为 本发明载体使用的病毒在人细胞系HaCat中的扩增比为0.8或更少。病毒的 “扩增比”是指，感染细胞所产生的病毒量(输出量)与最初用于感染细胞的 病毒量(输入量)的比例(“扩增比”)。输出量与输入量的比例为“1”表示， 感染细胞产生的病毒量与最初用于感染细胞的病毒量相等的扩增状态。。
在定义MVA-BN及其衍生物的上下文中，本申请所用术语“不能进行 体内复制”与WO02/42480中定义相同。因此，所述术语如WO02/42480 所述，是指那些不能在人体和小鼠模型中复制的病毒。WO02/42480使用的 小鼠不能产生成熟B细胞和T细胞(AGR129小鼠)。具体地，MVA-BN和 其衍生物，在对AGR129小鼠腹腔注射107pfu个病毒进行感染后，至少45 天内不杀死小鼠，优选至少60天内，最优选至少90天内。优选地，“不 能在体内进行复制”的病毒的另一特征是，在对AGR129小鼠腹腔注射107 pfu个病毒进行感染后，至少45天不能从该小鼠的器官或组织中收获到任 何病毒，优选至少60天，最优选至少90天。
MVA-BN及其衍生物优选在WO02/42480所述的致死攻击小鼠模型中 测得，致免疫性高于已知病株MVA575。在这样的模型中，未接种的小鼠 被具有复制能力的痘苗病株如Western Reserve株L929TK+或IHD-J感染后 死亡。在描述致死攻击模型的上下文中，被具有复制能力的痘苗病毒感染， 该过程称为“攻击”。受攻击4天后，小鼠通常被杀死，卵巢中的病毒滴度 用VERO细胞经标准空斑试验进行测定。对未接种的小鼠，以及接种了本 发明的痘苗病毒的小鼠，测定它们的病毒滴度。更具体地，MVA-BN及其 衍生物在上述检验中，接种102TCID50/ml的病毒比不接种病毒，小鼠卵巢 病毒滴度减少至少70％，优选至少80％，更优选至少90％。
MVA-BN或其衍生物优选具有以下特性：在痘苗病毒初次免疫/痘苗病 毒加强免疫方案中诱导出与DNA初次免疫/痘苗病毒加强免疫方案相比，至 少实质上相同水平的免疫力。当在WO02/42480所述“试验1”和“试验2” (优选全部两种试验)中测定，CTL应答在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强 免疫方案中与在DNA-初次免疫/痘苗病毒加强免疫方案中相比，至少实质 上相同，则认为痘苗病毒可以在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫方案 中诱导出与在DNA初次免疫/痘苗病毒加强免疫方案中至少实质上相同水 平的免疫力。更优选，在至少一种上述试验中，痘苗病毒初次免疫/痘苗病 毒加强免疫后的CTL应答比DNA-初次免疫/痘苗病毒加强免疫后的高。最 优选CTL应答在两种试验中都更高。
WO02/42480公开了如何获得具有MVA-BN及其衍生物的上述特性的 痘苗病毒。
将上述定义的DNA插入到痘病毒DNA中的方法，以及获得重组痘病 毒的方法为本领域技术人员所熟知。在重组痘苗病毒中，本发明所述DNA 的表达优选但并不仅仅在痘病毒启动子(更优选痘苗病毒启动子)的转录控 制下进行。本发明所述的DNA优选插入到病毒基因组非必要区域内。在本 发明另一优选实施方案中，异源核酸序列插入到MVA基因组的天然缺失位 点处(PCT/EP96/02926中公开)。
概括的讲，本发明一最优选的实施方案是提供一种含有如上定义的 DNA的载体，其中所述载体是MVA-BN或其衍生物，所述DNA含有编码 黄病毒NS1蛋白或其部分的表达盒，黄病毒优选为登革热病毒，更优选为 登革热病毒血清型2。
在一优选实施方案中，发明涉及由本发明所述DNA编码，或本发明所 述载体编码的NS1蛋白或其部分用于通过接种来抵抗多种黄病毒或黄病毒 血清型的用途。对于本发明所述NS1蛋白或其部分的定义参见上面描述的 部分，其中编码NS1的DNA已经定义为由所述DNA表达的产物。因此下 面关于本发明所述蛋白的概述，不能看作是对本发明的限制。概括的讲， NS1蛋白可以是由任意黄病毒编码的分离的NS1蛋白或其部分。NS1蛋白 或其部分优选衍生自登革热病毒，最优选登革热病毒血清型2。所述蛋白可 以只包含病毒NS1蛋白或其部分的氨基酸序列。在一优选实施方案中，NS1 蛋白还可以包含对有效表达该蛋白必需的附加氨基酸。所述氨基酸/氨基酸 序列的例子如上所示，且其包括在蛋白N末端、由附加的ATG密码子编码 的蛋氨酸和衍生自E蛋白C末端、用于使NS1蛋白或其部分糖基化所需的 信号序列的氨基酸序列。其它的信号序列也在本发明范围之内。在另一实 施方案中，NS1氨基酸序列或其部分可以与其它蛋白/肽融合。融合伴侣的 例子为允许识别该蛋白的序列，如标记或其它黄病毒蛋白或其部分。
在一优选实施方案中，本发明涉及作为疫苗，尤其作为抵抗多种黄病 毒或黄病毒血清型的疫苗的本发明DNA，载体或NS1蛋白或其部分。“疫 苗”是诱导特异性免疫反应的化合物，即DNA、蛋白、载体或病毒。
根据此实施方案的一个替代方案，本发明所述“疫苗”是基于一种登 革热病毒NS1蛋白或其部分，该蛋白或其部分能诱导抗登革热病毒所有血 清型的NS1蛋白的免疫反应。特别地，已证实一种登革热病毒血清型，尤 其是血清型2的NS1蛋白诱导的免疫反应能抵抗至少两种，优选至少三种， 最优选登革热病毒所有血清型的NS1蛋白，优选还抵抗至少一种其它蚊媒 黄病毒。
如上所述，本发明的发明人已经发现本发明所述来自一种黄病毒的NS1 蛋白或其部分能诱导抗其它黄病毒NS1蛋白的免疫反应。如上所指出的， “黄病毒”优选是蚊媒黄病毒。换句话说，本发明的发明人已经发现在另 一实施方案中，本发明所述来自一种蚊媒黄病毒的NS1蛋白或其部分诱导 的免疫应答能抵抗衍生疫苗的蚊媒黄病毒的NS1蛋白，还能抵抗其它蚊媒 黄病毒的NS1蛋白。因此，衍生自蚊媒黄病毒的疫苗可以作为抵抗一种或 多种蚊媒黄病毒的疫苗。术语“衍生自黄病毒的载体”或本说明书正文中 的相似术语是指，包含上述DNA的上述载体(如痘病毒载体或质粒)。因此， 此术语涉及载体插入物而不是载体主链。一个“衍生自黄病毒的载体”的 例子是包含含有痘病毒启动子、编码黄病毒NS1蛋白或其部分的序列的表 达盒的痘病毒载体，如MVA，其中所述编码黄病毒NS1蛋白或其部分的序 列前面接有ATG密码子和编码糖基化信号序列的序列，并且所述编码序列 止于翻译终止密码子。
因此，用所述DNA、载体或NS1蛋白或其部分进行的接种可以作为抵 抗较宽范围的黄病毒或至少黄病毒血清型的单一亚单位疫苗。编码来自一 种黄病毒或黄病毒血清型的NS1蛋白或其部分的DNA或载体，或者来自所 述黄病毒或血清型的NS1蛋白或其部分，因此可以用作通过接种来抵抗其 它黄病毒和黄病毒血清型的疫苗。例如，衍生自登革热病毒血清型2的疫 苗可以用作抵抗血清型1，3和4中一种、二种或所有的疫苗，以及抵抗血 清型2的疫苗。它可以进一步用于保护个体抵抗其它黄病毒，如西尼罗病 毒、日本脑炎病毒和黄热病病毒。
在一优选实施方案中，本发明所述DNA用作疫苗。本领域技术人员已 知，用本发明中的含有真核表达盒的裸露DNA，尤其是DNA进行肌内注 射，将引起由该表达盒编码的蛋白的表达。该蛋白暴露于免疫系统，并引 起特异性免疫反应。
在另一实施方案中，通过施用本发明所述载体，特别是病毒载体，更 优选痘病毒载体，最优选痘苗病毒载体，如MVA载体来进行接种。
为了制备基于痘苗病毒的疫苗，可将本发明所述病毒，尤其是MVA-BN 和其衍生物转变为生理学上可接受的形式。这可以依据用于天花预防性接 种的痘病毒疫苗的制备经验来进行(参见Stickl，H.等[1974]Dtsch.med. Wschr.99，2386-2392)。例如，将纯化的病毒以5x108TCID50/ml的浓度配制 在约10mM Tris，140mM NaCl pH 7.4中，-80℃保存。为了制备疫苗针剂 (vaccine shot)，例如，将102-109的病毒颗粒，在有2％蛋白胨和1％人白蛋 白存在的情况下，冻干在安瓿(优选玻璃安瓿)内的100ml磷酸盐缓冲液(PBS) 中。
特别优选用于接种的基于痘苗病毒的疫苗，特别是基于MVA-BN的疫 苗以冻干状态储存。在实施例部分显示，如果用作接种的病毒以冻干病毒 形式储存，由一种黄病毒NS1蛋白诱导的分别对不同黄病毒NS1和黄病毒 血清型NS1蛋白的免疫反应和免疫反应的交叉反应百分比会非常地高。因 此，疫苗针剂优选通过将病毒在配制剂中逐步冻干的方式产生。这种配制 剂可包含适于体内给药的额外添加剂，如甘露醇，葡聚糖，糖，甘氨酸， 乳糖，或聚乙烯吡咯烷酮，或其它添加剂，如抗氧化剂或惰性气体，稳定 剂或重组蛋白(如人血清白蛋白)。适于冻干的包含病毒的典型配制剂含有 10mM Tris-缓冲液，140mM NaCl，18.9g/l葡聚糖(MW 36000-40000)，45g/l蔗 糖，0.108g/l一水合L-谷氨酸单钾盐，pH7.4。然后将玻璃安瓿密封，在介 于4℃和室温之间的温度中保存数月。但是，只要不必使用，优选将安瓿保 存在-20℃以下。为了进行接种，可将冻干品溶于0.1-0.5ml水溶液中，如， 水，生理盐水或Tris缓冲液，经过系统途径或局部途径给药，即通过本领 域技术人员已知的胃肠道外途径、肌肉途径或任何其它给药途径来给药。 给药方式、给药剂量以及给药次数可由本领域技术人员通过已知的方式最 优化。痘病毒载体最优选皮下或肌肉给药。最优选所述接种通过间隔例如 3-5周的两次疫苗注射来进行。
如果疫苗是含有本发明所述DNA的MVA-BN载体或其衍生物，本发 明的一个具体实施方案涉及一种接种试剂盒，它在第一个瓶/容器中含有首 次接种(初次免疫)所用的本发明MVA-BN病毒载体，在第二个瓶/容器中含 有二次接种(加强免疫)所用的本发明MVA-BN病毒载体。
如果疫苗为含有上述DNA的MVA-BN载体或其衍生物，本发明的一 个具体实施方案涉及在首次接种(“初次接种”)和二次接种(“加强接种”) 中以治疗有效量给予疫苗。初次接种和加强接种的时间间隔为，例如2至 12周，优选3到6周，更优选约3周。用于接种注射的病毒量至少为1 x 102 TCID50，优选如1 x 107TCID50到1 x 109TCID50。此外，本发明的一个具体实 施方案涉及一种接种试剂盒，它在第一个瓶/容器中含有首次接种(初次免疫) 所用的上述MVA-BN病毒载体，在第二个瓶/容器中含有二次接种(加强免 疫)所用的上述MVA-BN病毒载体。
因此，在疫苗实施方案中，本发明涉及一种含有如上所述DNA、载体 或NS1蛋白或其部分的疫苗，以及所述DNA、载体或蛋白制备疫苗的用途。 按照一优选的实施方案，本发明涉及所述DNA、载体或蛋白制备疫苗的用 途，其中NS1蛋白或其部分、由DNA或载体编码的NS1蛋白或部分来自 一种登革热病毒血清型，且其中DNA、载体或NS1蛋白或其部分作为抵抗 二种、三种或登革热病毒所有血清型的疫苗。最优选地，登革热病毒血清 型是血清型2。
本发明进一步涉及一种治疗或预防黄病毒感染的方法，包括在有需要 的动物(包括人)体内接种上述DNA、上述载体、或上述NS1蛋白或其部分。 具体地，本发明涉及上述方法，其中所述NS1蛋白或其部分、或由DNA或 载体编码的NS1蛋白或其部分来自登革热病毒血清型，其中DNA、载体或 NS1蛋白或其部分作为抵抗二种、三种或登革热病毒所有血清型的疫苗。
发明概述
具体地，本发明单独或联合涉及下列各项：
下述物质在制备疫苗中的用途，
- 包含表达盒的核酸，所述表达盒含有转录调节元件以及至少编码蚊 媒黄病毒的NS1蛋白或其部分的序列，
- 包含所述核酸的载体，和/或
- 所述黄病毒的NS1蛋白或其部分，
所述疫苗用于抵抗产生所述核酸或者产生所述NS1蛋白或其部分的蚊 媒黄病毒，并抵抗至少一种其它蚊媒黄病毒。
上述用途，其中产生所述核酸或者产生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒 黄病毒是登革热病毒。
下述物质在制备疫苗中的用途，
- 包含表达盒的核酸，所述表达盒含有转录调节元件以及至少编码登 革热病毒血清型的NS1蛋白或其部分的序列，
- 包含所述核酸的载体，和/或
- 所述登革热病毒血清型的NS1蛋白或其部分，
所述疫苗用于抵抗登革热病毒所有血清型，并可选择抵抗至少一种其 它蚊媒黄病毒。
上述用途，其中产生所述核酸或者产生所述NS1蛋白或其部分的登革 热病毒是登革热病毒血清型2。
上述用途，其中编码蚊媒黄病毒或登革热病毒血清型的NS1蛋白或其 部分的序列，在前面接有ATG密码子和编码糖基化信号序列的序列，且其 中编码序列在翻译终止密码子处终止。
上述用途，其中所述其它蚊媒黄病毒选自西尼罗病毒、黄热病病毒和 日本脑炎病毒。
上述用途，其中所述载体是痘病毒载体。
上述用途，其中所述痘病毒载体为修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)株，特 别是保藏在欧洲细胞培养物保藏中心、编号为V00083008的MVA-BN或其 衍生物。
上述用途，其中所述痘病毒载体已经冻干，并且可以于给药前在药学 上可接受的稀释剂中重构。
上述用途，其中转录调节元件是痘病毒启动子。
上述用途，其中疫苗在首次接种(“初次接种”)和二次接种(“加强接 种”)中以治疗有效量给药。
一种治疗或预防黄病毒感染的方法，其包括给有需要的动物(包括人) 接种
- 包含表达盒的核酸，所述表达盒包含转录调节元件以及至少编码蚊 媒黄病毒NS1蛋白或其部分的序列，
- 包含所述核酸的载体，和/或
- 所述黄病毒的NS1蛋白或其部分
其中所述黄病毒感染是被产生所述核酸或者产生所述NS1蛋白或其部 分的蚊媒黄病毒感染，和/或被另一种蚊媒黄病毒感染。
上述方法，其中产生所述核酸或者产生所述NS1蛋白或其部分的蚊媒 黄病毒是登革热病毒。
一种治疗或预防黄病毒感染的方法，其包括给有需要的动物(包括人) 接种
- 包含表达盒的核酸，所述表达盒包含转录调节元件以及至少编码登 革热病毒血清型NS1蛋白或其部分的序列，
- 包含所述核酸的载体，和/或
- 所述登革热病毒血清型的NS1蛋白或其部分，
其中所述黄病毒感染是被产生所述核酸或者产生所述NS1蛋白或其部 分的登革热病毒血清型感染，和/或被其它登革热病毒血清型感染，和/或被 其它蚊媒黄病毒感染。
上述方法，其中产生所述核酸或者产生所述NS1蛋白或其部分的登革 热病毒是登革热病毒血清型2。
上述方法，其中所述编码蚊媒黄病毒或登革热病毒血清型的NS1蛋白 或其部分的序列，在其前面接有ATG密码子和编码糖基化信号序列的序列， 且其中编码序列在翻译终止密码子处终止。
上述方法，其中所述载体是痘病毒载体。
上述方法，其中所述痘病毒载体是修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)株。
上述方法，所述MVA株是保藏在欧洲细胞培养物保藏中心、编号为 V00083008的MVA-BN或其衍生物。
上述方法，其中所述痘病毒载体已经冻干，并且可以于给药前在药学 上可接受的稀释剂中重构。
上述方法，其中所述转录调节元件是痘病毒启动子。
上述方法，其中所述痘病毒载体或药物组合物在首次接种(“初次接种”) 和二次接种(“加强接种”)中以治疗有效量给药。
一种痘病毒载体，它携有包含表达盒的DNA，所述表达盒包含转录调 节元件以及至少编码黄病毒NS1蛋白或其部分的序列，其中所述痘病毒是 保藏在欧洲细胞培养物保藏中心、编号为V00083008的修饰的安卡拉痘苗 病毒(MVA)株BN或其衍生物。
上述痘病毒载体，其中所述黄病毒是蚊媒黄病毒，特别是登革热病毒。
上述痘病毒载体，其中所述登革热病毒是登革热病毒血清型2。
上述痘病毒载体，其中所述编码黄病毒NS1蛋白或其部分的序列，在 其前面接有ATG密码子和编码糖基化信号序列的序列，且其中编码序列在 翻译终止密码子处终止。
上述痘病毒载体，其中所述转录调节元件为痘病毒启动子。
上述痘病毒载体，其中所述痘病毒载体是冻干的。
作为疫苗的上述痘病毒载体。
一种药物组合物，它包含上述痘病毒载体和药学上可接受的载体 (carrier)、稀释剂和/或添加剂。
用于治疗和/或预防黄病毒感染的上述痘病毒载体或上述药物组合物， 其中所述痘病毒载体或药物组合物在首次接种(“初次接种”)和二次接种 (“加强接种”)中以治疗有效量给药。
一种治疗和/或预防黄病毒感染的方法，包括给需要的动物(包括人)接种 上述载体或上述药物组合物。
一种细胞，优选人细胞，它含有上述痘病毒载体。
上述痘病毒用于制备治疗或预防黄病毒感染的疫苗的用途。
一种用于初次免疫/加强免疫的试剂盒，它在第一个瓶/容器中含有首次 接种(初次免疫)所用的上述痘病毒载体或上述药物组合物，在第二个瓶/容 器中含有二次接种(加强免疫)所用的上述痘病毒载体或上述药物组合物。
附图说明
图1A：作为本发明一个例子的构建体的登革热NGC株“信号序列 +NS1”cDNA蛋白编码序列。NS1基因的天然起始位点用箭头指出。重要 特征是添加了ATG起始密码子和终止密码子(在此例中为”TAG”)。核苷酸序 列数字是指在NGC株基因组(Genbank登录号AF038403)中的位置。图1A 中的核苷酸序列和氨基酸序列对应于SEQ：ID No.5。氨基酸单独示于SEQ： ID No.6。
图1B：含登革热NGC株“信号序列+NS1”蛋白编码序列的质粒 pAF7NS1的图谱。
图1C：在质粒pAF7中的NS1组件的核苷酸序列，显示了用oBN345 和oBN338进行PCR扩增时位于此组件上的引物结合位点。图1C中的核苷 酸和氨基酸序列对应于SEQ：ID No.7。氨基酸单独示于SEQ：ID No.8。
图1D：上图：登革热NGC株NS1的氨基酸序列(登革热NCG多蛋白 Genbank登录号AF038403的氨基酸776-1127)的Kyte-Doolittle亲水性图 谱。零以上的值＝疏水。下图：含有衍生自E蛋白C末端最后28个氨基酸(氨 基酸748-775)的信号序列的登革热NGC株NS1氨基酸序列的 Kyte-Doolittle亲水性图谱。完整氨基酸序列代表登革热NGC多蛋白 (Genbank登录号AF038403)的氨基酸748-1127，它对此病毒株而言始于 “ATG”起始密码子但缺少终止密码子。Sig＝信号序列。零以上的值＝疏水。
图2：“痘病毒启动子+信号序列+NS1”表达盒的核苷酸序列。图2中 的核苷酸和氨基酸序列对应于SEQ：ID No.9。氨基酸单独示于SEQ：ID
No.10。简要地讲，痘病毒的最小早期/晚期启动子元件控制登革热病毒血清 型2的NS1蛋白表达，其中NS1蛋白的N末端与E蛋白的28个C末端氨 基酸融合。翻译在插入该核酸序列中的TAG终止密码子处终止。
图3A：将NS1表达盒克隆入pBNX07平末端的XhoI位点(平端克隆化)， 产生克隆pBN41。PPr＝痘病毒启动子，D2F1＝缺失位点2的旁侧1，NPT II＝ 新霉素抗性基因，IRES＝内部核糖体结合位点，EGFP＝增强的绿色荧光蛋白， NS1(pBN41中)＝信号序列+NS1，D2F2＝缺失位点2的旁侧2，Sig＝信号序列。 AmpR＝氨苄青霉素抗性基因。
图3B：MVA(Genbank U94848)的HindIII图谱，显示了MVA六个缺失 位点的位置(-J-＝缺失位点的接头)。将＂PPr+NPT II+IRES+EGFP+PPr+NS1＂ 组件插入MVA的缺失位点2。PPr＝痘病毒启动子，NPT II＝新霉素抗性基因 (蛋白编码序列)，IRES＝内部核糖体结合位点，NS1＝信号序列+登革热2NGC 株的NS1蛋白编码序列。
图4：ELISA吸光度图谱，示出全部三只兔子免疫后的血清滴定。
图5：ELISA交叉反应性研究。在ELISA-分析中，第38天(上部)和第 66天(下部)的兔子血清与已被DENV-1、DENV-3、DENV-4、JEV和WNV 感染的细胞的裂解液的交叉反应性。
实施例
下面的实施例进一步详细说明本发明。本领域技术人员应当很理解下 述实施例不在任何方面解释为将本发明技术的应用限制于这些实施例。
实施例1：mBN07的构建
1.NS1抗原详述(图1)
本实施例涉及衍生自New Guinea C株-NGC株(例如：Genbank序列 AF038403)的血清型2的NS1。由于黄病毒的NS1蛋白作为多蛋白前体的一 部分而产生，因此在相应DNA中的NS1基因前面不接有”ATG”起始密码子。
因此，编码NS1蛋白的cDNA序列必须需要添加一个”ATG”起始密码 子。接着添加信号序列使得新合成的NS1蛋白在内质网内糖基化。最后， 蛋白编码组件需要一个终止密码子，在这个实施例中是将TAG加到蛋白编 码cDNA序列的3′末端。在本发明使用的实施例中，“ATG+信号序列”元 件源自E蛋白疏水性C末端(最后28个氨基酸，其中NGC株以氨基酸 M(ATG)起始)。
图1A显示作为本发明实例使用的确切的信号序列加上NS1序列(见 SEQ：ID5和6)。“信号序列+NS1”核苷酸编码序列通过RT-PCR扩增从登 革热NGC基因组RNA中获得，其使用下述引物：
D2NS1-l上游：5′-ACAAGATCTGGAATGAATTCACGTAGCACCTCA-3′ (SEQ：ID NO4)
斜体字为BglII限制性核酸内切酶识别位点。
下划线为起始密码子。
D2NS1-2下游：5′-AATAGATCTCTACTAGGCTGTGACCAAGGAGTT-3′ (SEQ：ID NO3)
斜体字为BglII限制性核酸内切酶识别位点。
下划线为终止密码子。
使用购自Roche Molecular Biochemical(Catalog No.1-939-823)的Titan One Tube RT-PCR试剂盒，按照制造商的推荐进行RT-PCR扩增。但是，实 际上可以使用任何商业的或非商业的RT-PCR试剂盒。
RT-PCR产物可以接着克隆到许多可商购的细菌克隆质粒中任何多克隆 位点的BamHI位点，但是在此实施例中它被克隆入pAF7，得到克隆 pAF7D2NS1-其序列详见图1B和1C。图1D显示NS1氨基酸序列和添加了 E蛋白C末端氨基酸编码序列中信号序列的NS1的疏水性图谱。
2.NS1表达盒详述(图2)
为了表达来自痘病毒载体，如金丝雀痘、禽痘、牛痘或MVA的“信号 序列+NSI”，需要将痘病毒启动子加到此cDNA的5′末端。聚腺苷酸化信号 序列不是必需的，因为所有痘病毒合成性RNA被病毒编码的酶聚腺苷酸化， 这种酶在实现此功能时不需要polyA附加信号序列。任何痘病毒启动子都 可以用于此组件的表达。图2和SEQ：ID No.9和10显示作为本发明实例 的“痘病毒启动子+信号序列+NS1”组件的核苷酸序列。
作为本发明使用的实例，“信号序列+NS1”进一步用引物oBN338和 oBN345从NS1质粒克隆进行PCR扩增。oBN345引物包含该克隆质粒中靶 序列5′侧的痘病毒最小启动子元件的核酸序列。oBN345引物结合所需的质 粒靶序列在信号序列起始密码子上游约40个核苷酸处。这样就保证了RNA 转录物在信号序列ATG起始密码子前包含一段非蛋白编码序列。
PCR引物与Ps启动子：
oBN338：5′-TTGTTAGCAGCCGGATCGTAGACTTAATTA(30mer)(SEQ： ID No.1)
oBN345：
5′-CAAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAAAA
ACACGATAATACCATGG-3′
(SEQ：ID No.2)
(下划线核苷酸代表痘病毒最小启动子序列。)
PCR扩增反应前5个循环的退火温度，从与oBN34克隆载体中同源序 列结合的核苷酸序列计算出。
3.NS1表达盒整合入MVA(图3)
将PCR扩增产物平端化，再克隆入质粒pBNX07的切口和平端XhoI 位点(见图3a)，而形成质粒pBN41(见图3a)。pBN41是通过同源重组将“pox 启动子+信号序列+NS1”组件整合入MVA的缺失位点2的载体。
pBN41(图3a)的基本特征如下：
- 质粒骨架是来自Stratagene的pBluescript SK+(Genbank VB0078)
- D2F1：缺失位点2旁侧1同源重组臂。它代表MVA Genbank序列 U94848的20117到20717的核苷酸序列。
- PPr：痘病毒启动子。
- NPT II：新霉素磷酸转移酶蛋白编码序列(GenbankV00618的蛋白编 码序列)。
- IRES：来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入序列(Jang等，1989， Genbank M16802)。
- EGFP：增强绿色荧光蛋白的编码序列(蛋白编码序列-Genbank序列 U57609的核苷酸675到核苷酸1394)
- NS1：来自登革热NGC株的“信号序列+NS1”蛋白编码序列。
- D2F2：缺失优点2旁侧2同源重组臂。它代表MVA Genbank序列 U94848的20719到21343的核苷酸序列。
- AmpR：pBluescript的氨苄青霉素抗性基因
3.1通过同源重组将登革热＂pox启动子+信号序列+NS1＂插入MVA的 缺失位点
3.1.1通过同源重组整合进MVA基因组
上述整合载体pBN41通过pBN41旁侧1和旁侧2臂与MVA基因组中 的同源靶序列之间的同源重组，将登革热NS1表达盒加报告组件(pox启动 子+NPT II-IRES-EGFP)整合到MVA基因组。它通过将线性整合载体转染到 已用低感染复数(MOI，例如0.01个感染单位/每个细胞)的MVA感染的鸡胚 成纤维细胞(CEF)中来完成。在感染后48小时或当感染达到汇合时，制备 病毒提取物并保存在-20℃，以准备用于需要的重组MVA(rMVA)的筛选和克 隆纯化。
3.1.2rMVA的筛选和克隆纯化
非重组MVA(空载体病毒)的消除和rMVA的扩增，在存在G418(G418 的量必须优化以便确定不杀死CEF细胞的最高剂量)的条件下，在低MOI 时感染汇合的鸡胚成纤维细胞(CEF)来完成。在细胞维持培养基中添加了 G418时，不包含或整合NPT2基因的任何病毒将不能复制。G418抑制DNA 的复制，但是由于CEF细胞将会处于稳定的非复制阶段，CEF细胞将不会 受G418作用的影响。由于增强荧光绿色蛋白的表达，rMVA感染的CEF细 胞可以在荧光显微镜下观察到。
来自同源重组步骤的病毒提取物必须连续稀释，并且在存在G418的条 件下用来感染新鲜CEF细胞，并用低熔点琼脂糖覆盖。在感染2天后，在 荧光显微镜下观察琼脂糖感染平板，这种观察只能发现绿色的感染细胞。 这些细胞是有标记的，可以将包含细胞感染灶的琼脂糖取出并放入含有无 菌细胞维持培养基的1.5ml小离心管内。通过在-20℃将小离心管冻融三次， 使病毒从琼脂糖塞中释放出来。
在琼脂糖下进一步克隆纯化最好的克隆，直到通过PCR分析不存在空 载体污染的迹象(3至30个克隆纯化循环)。然后通过RT-PCR扩增这些克隆， 以进一步严格测定是否获得正确的插入构型，确认启动子-外源基因组件的 序列和分析表达。在这些分析后，只有一个克隆进一步在G418选择条件下 扩增，以便制备出母液用于进一步鉴定和免疫原性研究。
插入本发明所述登革热NS1表达盒的重组MVA命名为mBN07。图3b 显示mBN07中插入的外源序列的构型。
4.真正NS1的MVA表达
来自重组MVA，mBN07，的NS1蛋白表达在非变性条件下通过标准 western印迹分析证实。更具体地，用MOI为1.0感染单位/细胞的纯化mBN07 来感染哺乳动物组织培养细胞，例如BHK-21细胞，分析NS1表达。从那 些感染24-30小时后的感染细胞制备出粗蛋白提取物，其中一部分用含2 巯基乙醇(2-ME)或不含2-ME的SDS-PAGE凝胶加样缓冲液混合。这些样品 加上来自感染登革热NGC株的细胞(蚊细胞系)的蛋白提取物作为阳性对 照，在SDS-PAGE凝胶中电泳分离，然后印迹到硝酸纤维素膜上。膜用抗 登革热NS1单克隆抗体探测。
结果显示，mBN07表达的NS1被抗登革热NS1单克隆抗体识别，并形 成与来自登革热感染细胞(与不含2-ME的未煮沸mBN07泳道以及不含 2-ME的未煮沸DEN2泳道相比)的NS1类似的正确二聚体形式。另外显示， 在变性条件下二聚体形式分解为单体形式(见含2-ME的煮沸的mBN07泳 道)。
在western印迹分析中，用mBN07感染的细胞中表达的NS1也被混合 的康复病人血清和能与所有四种登革热血清型的NS1交叉反应的单克隆抗 体识别。这表明mBN07表达的NS1具有免疫原性。
在整个实施例部分，mBN07(有时也称为BN07)是以液态(任选冷冻)， 或是冻干状态保存。为了获得冻干病毒，制备了含有病毒的溶液，它包含 10mM Tris-缓冲液，140mM NaCl，18.9g/l葡聚糖(分子量36000-40000)，45g/l 蔗糖，0.108g/l一水合L-谷氨酸单钾pH7.4。然后将所述配制剂冻干。为了 重组，在冻干制剂中加入水。
实施例2：mBN07表达的NS1对除了血清型2以外的登革热病毒NS1 和日本脑炎病毒(JEV)NS1和西尼罗病毒(WNV)NS1的交叉免疫原性
1.从mBN07表达的NS1：对病人康复期血清的反应性
检测mBN07表达的NS1被有早先登革热病毒感染的个体的康复期病人 血清识别的可能性。选取具有抗登革热病毒包膜蛋白的抗体(通过免疫印迹 证实其抵抗登革热血清型1至4的真正抗原)的68例个体的血清，检测由 mBN07感染细胞提取物制备的免疫印迹条带，将MVA-GFP感染细胞的提 取物作为对照。含抗原的细胞裂解物用不含2-巯基乙醇的上样缓冲液处理， 且不加热。检测的68份个体血清中，62份(91.2％)与免疫印迹中由mBN07 表达的BN07 NS1反应。进一步分析这些血清对所有4种登革热病毒血清 型和日本脑炎病毒(JEV)的NS1的反应性。结果示于表1。54份血清与登革 热病毒所有血清型和日本脑炎病毒(JEV)的NS1反应，而且这54份血清中 的53份(98.2％)也与mBN07表达的NS1反应。7份血清对至少一种登革热 病毒血清型的NS1是特异的，而且不与JEV的NS1反应。所有这7份血清 也与mBN07表达的NS1反应。另外的7份血清只与JEV的NS1反应，而 不与任何登革热病毒血清型的NS1反应，然而这些JEV-特异性血清中的2 份(28.6％)也与mBN07表达的NS1反应。
表1
  BN07NS1阴性 BN07NS1阳性 真正DEN NS1 阳性 0％(0/7) 100％(7/7) 真正DEN+JEV NS1 阳性 1.85％(1/54) 98.15％(53/54) 真正JEV NS1 阳性 71.43％(5/7) 28.57％(2/7)
真正NS1和mBN07表达的NS1的抗血清反应比较。括弧中：检测样 品阳性数/检测样品总数。DEN＝登革热，JEV＝日本脑炎病毒。
对相同的68份血清也进行了抵抗前膜蛋白的反应性的分析。在发明人 的经验中，抵抗前膜的抗体比抵抗NS1或E的抗体更具特异性。这样，已 感染登革热的患者将会产生识别登革热病毒前膜而非JEV前膜的抗体，反 之亦然。沿着这条线的分析将会提供更好的个体感染历史的预测。表2显 示了来自22名患者的血清仅与真正登革热前膜蛋白反应，提示这22名患 者只暴露于登革热病毒而非JEV。所有这22份血清与mBN07表达的NS1 反应。另外的22名患者有先前感染登革热和JEV的证据，它们也全都与 mBN07表达的NS1反应。在这个组中也有21名有先前只感染JEV证据的 患者(尽管这些血清有抵抗登革热E的交叉反应抗体)。有趣地是，这21名 JEV反应者中的17名(82％)与mBN07表达的NS1反应。在整个组中，只有 3份血清不与登革热或JEV的前膜蛋白反应，其中只有1份与mBN07表达 的NS1反应。这种情况的最可能理由是抗体滴度太低而无法用免疫印迹检 出。
表2
  BN07NS1阴性 BN07NS1阳性 真正DEN prM 阳性 0％(0/22) 100％(22/22) 真正DEN+JEV prM 阳性 0％(0/22) 100％(22/22) 真正JEV prM 阳性 19.0％(4/21) 81.0％(17/21) PrM 阴性 66.7％(2/3) 33.3％(1/3)
抵抗真正前膜和BN07 NS1的抗血清反应比较。括弧中：检测样品阳性 数/检测样品总数。DEN＝登革热，JEV＝日本脑炎病毒。
表2中的数据也清楚地显示了在6份不与mBN07表达的NS1反应的血 清中，4份来自先前感染了JEV而非登革热的个体，剩余的2份无可检出的 对登革热或JEV前膜蛋白的抗体，可能是由于低滴度。
2.给兔接种mBN07并用免疫印迹和ELISA分析检测抗登革热病毒和 日本脑炎病毒的免疫后血清
三只无特异性病原体的兔子按照如下所示疫苗接种程序采用皮下途径 免疫。每只兔子用使用无菌水重构到1ml的一瓶冻干疫苗(1 x 10e8 TCID50 BN07冻干疫苗)在第0天和第28天接种。在第一次接种前(预取血)和第二 次接种的10天后采取血样。
第0天＝预取血后第一次接种
第28天＝第二次接种
第38天＝取血
第56天＝第三次接种
第66天＝取血
第112天＝从每只兔中抽取50ml血
2.1抵抗登革热血清型2免疫印迹的前期取血和免疫后血清检测
登革热2病毒抗原和未感染的C6/36细胞的抗原通过在非变性条件下的 SDS PAGE分离。为了免疫印迹分析，使用第38天的血清(稀释1:200)。
结果清楚地显示，接种mBN07使所有三只兔子产生高滴度的抗NS1 抗体，且该抗体能与组织培养蚊细胞被登革热血清型2感染后产生的真正 NS1交叉反应。在接种前采集的血清不与免疫印迹上的任何登革热蛋白反 应。
第38天的免疫后血清在1:1000，1:2000，1:4000，1:10-4，1:10-5，1:10-6 下滴定，并在非变性条件下通过SDS PAGE分离的登革热2病毒抗原免疫 印迹条和未感染的C6/36细胞的对照条上检测。第38天的三份兔子血清终 点滴度计算为1:10,000。第66天的血清终点滴度在免疫印迹和ELISA分析 中都计算为1 x 105(数据未显示)。
免疫前和免疫后的血清都在1:10-2，1:10-3，1:10-4，1:10-5，1:10-6，1:10-7 时滴定，而且在间接IgG ELISA中检测。孔用1:250稀释度的登革热2和未 被感染的C6/36的裂解液包被。
表3

示出每只兔子的免疫前和免疫后血清在不同稀释度下的ELISA吸光度 (Pre＝免疫前血清，Post＝免疫后血清)
每只兔子的免疫后血清滴定示于图4中。每只兔子的免疫后血清估计 终点稀释度为1:1000。
2.2抵抗登革热血清型1、3、4和日本脑炎病毒和西尼罗病毒免疫印迹 的前期取血和免疫后血清检测
第38天的每份兔子血清在1:1000稀释度下，在非变性条件下通过SDS PAGE分离的登革热1、2、3、4和JE病毒抗原的免疫印迹条加未感染的 C6/36细胞的对照条上检测。显示每份兔免疫后血清与来自登革热血清型1、 3和4的NS1以及与在日本脑炎免疫印迹上的NS1反应。
第66天的每份兔子血清在1:1000稀释度下，在非变性条件下通过SDS PAGE分离的登革热1、3、4、WNV和JE病毒抗原的免疫印迹条加未感染 的C6/36细胞的对照条上检测。显示每份兔免疫后血清与来自登革热血清型 1、3和4的NS1以及与在日本脑炎病毒和西尼罗病毒免疫印迹上的NS1反 应。
为了证实免疫印迹分析，进行了Elisa交叉反应分析。微滴定板上的孔 用1:250稀释度的DENV-1、DENV-3、DENV-4、JEV、WNV和未感染的细 胞的裂解液包被。血清为第38天(图5A)和第66天(图5B)的血清。
从免疫印迹分析和ELISA试验中可以得出结论：由登革热病毒NS1诱 导的抗体与所有其它登革热血清型、JEV和WNV交叉反应。
2.3.结论
- 用mBN07疫苗免疫的兔子诱导能识别真正登革热病毒血清型2NS1 的抗体。
- 当免疫印迹分析和ELISA中的终点分别在1:10-4和1:10-3时观察到非 常高的免疫反应。
- 在兔子中诱导的抗体与所有其它登革热血清型(1，3和4)交叉反应。
- 所述抗体也与来自异源病毒，如JEV和WNV的NS1交叉反应。
3.小鼠中的免疫原性研究
雌性远系小鼠通过腹膜内途径用表达登革热病毒NS1的mBN07以不同 量和方案免疫，如下所示。mBN08(一种与mBN07相应但不表达NS1的 MVA)和PBS作为对照。小鼠血清用来检验小鼠中产生的抗体是否能够在 Western印迹上分别与来自不同黄病毒血清型和日本脑炎病毒的NS1蛋白反 应。来自对照小鼠的血清在所有试验中都是阴性的。
分析下列各组：
  组 小鼠 只数 第一次剂量 间隔 第二次剂量 取血前 间隔 1 9 每只1 x 107TCID50 BN07(0.1ml疫苗用 PBS以1:5稀释/小鼠) 4周 每只1 x 107TCID50 BN07(0.1ml疫苗用 PBS以1:5稀释/小鼠) 3周
  2 9 每只1 x 107TCID50 BN07冻干疫苗(在 1.2ml水中重构/小鼠) 4周 每只1 x 107TCID50 BN07冻干疫苗(在 1.2ml水中重构/小鼠) 3周 3 10 每只1 x 107TCID50 BN07冻干疫苗(在 1.2ml水中重构/小鼠) 3周 每只1 x 107TCID50 BN07冻干疫苗(在 1.2ml水中重构/小鼠) 4周 4 10 每只1 x 107TCID50 BN07冻干疫苗(0.1ml 疫苗用PBS以1:5稀释 /小鼠) 4周 每只1 x 107TCID50 BN07冻干疫苗(0.1ml 疫苗用PBS以1:5稀 释/小鼠) 4周 5 10 每只1 x 107TCID50 BN07冻干疫苗(在 1.2ml水中重构/小鼠) 4周 每只1 x 107TCID50 BN07冻干疫苗(在 1.2ml水中重构/小鼠) 4周
在免疫印迹试验中，得到下列结果：
表7
  组 检验小 鼠只数 DEN-1 阳性 (阳性％) DEN-2 阳 性(阳性％) DEN-3 阳 性(阳性％) DEN-4 阳 性(阳性％) JEV 阳性 (阳性％) 1 9 5(55.5％) 9(100％) 3(33.3％) 7(77.7％) 5(55.5％) 2 9 8(88.8％) 9(100％) 8(88.8％) 9(100％) 5(55.5％) 3 10 9(90％) 10(100％) 9(90％) 10(100％) 8(80％) 4 10 8(80％) 10(100％) 9(90％) 9(90％) 4(40％) 5 10 10(100％) 10(100％) 9(100％) 10(100％) 8(80％)
用Balb/c小鼠获得了非常相似的试验：在第0天和第21天给小鼠两次 接种1x108TCID50BN07(冻干并用水重构)。在第42天采集血清。100％的血 清与登革热病毒2NS1反应，100％的血清与来自所有四种登革热病毒血清 型的NS1蛋白反应，75％的血清与JEV的NS1蛋白反应。用1 x 108TCID50 非冻干BN07接种的结果如下：100％的血清与来自所有四种登革热病毒血 清型的NS1蛋白反应。识别来自JEV的NS1的血清比用冻干BN07接种小 鼠获得的血清差。
结论：
- 用BN07免疫的小鼠100％具有对DENV-2NS1的非常强反应的抗体。
- 用1 x 10e7 TCID50 BN07免疫小鼠的免疫反应与用1 x 10e8 TCID50 BN07免疫小鼠的免疫反应一样强(数据未示出)。
- 在间隔4周和取血前4周免疫的小鼠上观察到最好的交叉反应性百 分比。
- 与用非冻干疫苗免疫的小鼠相比，用BN07冻干疫苗免疫的小鼠对 NS1具有更强的反应。
此案是申请日为2002年11月20日、中国申请号为02824307.2、 发明名称为“黄病毒NS1亚单位疫苗”的发明申请的分案申请。
参考文献
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Schesinger JJ，Foltzer M and Chapman S.，1993.The Fc portion of antibody to yellow fever virus NS1 is a determinant of protection against yellow fever encephalitis in mice.Virology.192:132-41
本说明书中描述的技术和步骤是分子生物学和病毒学，特别是黄病毒 病毒学和痘病毒基因工程领域的专业人员所熟悉的。所述技术和步骤可以 在下述文献中找到更详细的描述：
Molecular Cloning，A laboratory Manual.Second Edition.By J.Sambrook， E.F.Fritsch and T.Maniatis.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989.
Virology Methods Manual.Edited by Brian WJ Mahy and Hillar O Kangro.Academic Press.1996.
Molecular Virology：A Practical Approach.Edited by AJ Davison and RM Elliott.The Practical Approach Series.IRL Press at Oxford University Press. Oxford 1993.Chapter 9：Expression of genes by vaccinia virus vectors.
Current Protocols in Molecular Biology.Publisher：John Wiley and SonInc.1998.Chapter 16，sectionIV：Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector.
Antibodies，A Laboratory Manual.By Ed Harlow and David Lane.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1988.


序列表
<110> 巴法里安诺迪克有限公司(Bavarian Nordic A/S)
      文图尔技术公司(Venture Technologies Sdn Bhd)
<120> 黄病毒NS1亚单位疫苗
<130> NS1-Dengue
<140> 0000
<141> 2001-12-04
<160> 10
<170> PatentIn Ver.2.1
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：引物
<400> 1

<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：引物
<400> 2

<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：引物
<400> 3

<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：引物
<400> 4

<210> 5
<211> 1143
<212> DNA
<213> 2型登革热病毒
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1140)
<223> E蛋白信号序列+NS1编码序列
<400> 5



<210> 6
<211> 380
<212> PRT
<213> 2 型登革热病毒
<400> 6


<210>7
<211> 1296
<212> DNA
<213> 2 型登革热病毒
<220>
<221> CDS
<222> (50)..(1189)
<220>
<221> 引物_结合
<222> (12)..(32)
<220>
<221> 引物_结合
<222> (1243)..(1273)
<400> 7



<210> 8
<211> 380
<212> PRT
<213> 2 型登革热病毒
<400> 8


<210> 9
<211> 1227
<212> DNA
<213> 2 型登革热病毒
<220>
<221> 启动子
<222> (5)..(48)
<223> 最小痘病毒启动子元件
<220>
<221> CDS
<222> (85)..(1224)
<223> NS1
<400> 9



<210> 10
<211> 380
<212> PRT
<213> 2 型登革热病毒
<400> 10