具有狂犬病病毒抗原的黑猩猩腺病毒构建体专利检索-全细胞疫苗疫苗疗法专利检索查询-专利查询网

具有狂犬病病毒抗原的黑猩猩腺病毒构建体

阅读：466发布：2021-12-08

专利汇可以提供具有狂犬病病毒抗原的黑猩猩腺病毒构建体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了包含编码狂犬病病毒抗原的转基因的腺病毒载体。所述载体可用于生产疫苗用于预防、改善和治疗由狂犬病病毒疾病引起的疾病，例如狂犬病。，下面是具有狂犬病病毒抗原的黑猩猩腺病毒构建体专利的具体信息内容。

权利要求

1.重组腺病毒，其包含选自以下的至少一种多核苷酸或多肽：
(a) 编码具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
(b) 编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物的多核苷酸，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，
(c) 编码具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
(d) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；
(e) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，和(f) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；
其中所述腺病毒包含编码狂犬病病毒抗原的核酸序列，其中所述核酸序列与指导所述狂犬病病毒抗原在宿主细胞中表达的一种或多种序列可操作地连接。
2.组合物，包含根据权利要求1的重组腺病毒和药学上可接受的赋形剂。
3.根据权利要求1或2的腺病毒或组合物，其包含（a）编码具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
4.根据权利要求3的腺病毒或组合物，其中所述多核苷酸具有根据SEQ ID NO：2的序列。
5.根据权利要求1或2的腺病毒或组合物，其包含(b)编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物的多核苷酸，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求5的腺病毒或组合物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少89.0％同一性，例如至少99.0%同一性，例如至少99.6%同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求3至6中任一项的腺病毒或组合物，其还包含编码以下的多核苷酸：
(i) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少50.0%同一性的氨基酸序列，或
(i) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至3中任一项的腺病毒或组合物，其还包含编码以下的多核苷酸：
(i) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少50.0%同一性的氨基酸序列，和
(i) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求7或8的腺病毒或组合物，其中具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70.0％，例如至少90.0％，例如至少99％同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求7至9中任一项的腺病毒或组合物，其中具有根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少
70.0％，例如至少90.0％，例如至少99％同一性的氨基酸序列。
11.根据权利要求1或2的腺病毒或组合物，其包含（c）编码具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
12.根据权利要求11的腺病毒或组合物，其中所述多核苷酸具有根据SEQ ID NO：4的多核苷酸序列。
13.根据权利要求11或12的腺病毒或组合物，其还包含编码以下的多核苷酸：
(i) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列，或
(i) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列。
14.根据权利要求11或12的腺病毒或组合物，其还包含编码以下的多核苷酸：
(i) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列，和
(i) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列。
15.根据权利要求13或14的腺病毒或组合物，其中具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70.0％同一性，例如至少99.0％同一性，例如至少99.4％同一性的氨基酸序列。
16.根据权利要求13至15中任一项的腺病毒或组合物，其中具有根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少
70.0％同一性，例如至少90.0％同一性，例如至少99％同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求1或2的腺病毒或组合物，其包含（d）具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。
18.根据权利要求1或2的腺病毒或组合物，其包含(e)其为具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物的多肽，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
19.根据权利要求18的腺病毒或组合物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少89.0％同一性，例如至少99.0％同一性，例如至少
99.6％同一性的氨基酸序列。
20.根据权利要求17至19中任一项的腺病毒或组合物，其还包含：
(i) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少50.0%同一性的氨基酸序列，或
(i) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列。
21.根据权利要求17至19中任一项的腺病毒或组合物，其还包含：
(i) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少50.0%同一性的氨基酸序列，和
(i) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列。
22.根据权利要求20或21的腺病毒或组合物，其中具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70.0％，例如至少90.0％，例如至少99％同一性的氨基酸序列。
23.根据权利要求20至22中任一项的腺病毒或组合物，其中具有根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少
70.0％，例如至少90.0％，例如至少99％同一性的氨基酸序列。
24.根据权利要求1或2的腺病毒或组合物，其包含（f）具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽。
25.根据权利要求24所述的腺病毒或组合物，其还包含：
(i) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列，或
(i) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列。
26.根据权利要求24的腺病毒或组合物，其还包含：
(i) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列，和
(i) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或
(ii) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列。
27.根据权利要求25或26的腺病毒或组合物，其中具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70.0％同一性，例如至少99.0％同一性，例如至少99.4％同一性的氨基酸序列。
28.根据权利要求25至27中任一项的腺病毒或组合物，其中具有根据SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少
70.0％，例如至少90.0％，例如至少99％同一性的氨基酸序列。
29.根据权利要求1-28中任一项的腺病毒或组合物，其中所述多核苷酸包含以下中的至少一种：
● 腺病毒5'-末端，优选腺病毒5'反向末端重复；
● 腺病毒E1A区或其选自E1A_280R和E1A_243R区的片段；
● 腺病毒E1B或IX区，或其选自E1B_19K、E1B_55K或IX区的片段；
● 腺病毒E2b区；或其选自E2B_pTP、E2B_聚合酶和E2B_IVa2区域的片段；
● 腺病毒L1区或其片段，所述片段编码选自L1_13.6k蛋白、L1_52k和L1_IIIa蛋白的腺病毒蛋白；
● 腺病毒L2区或其片段，所述片段编码选自L2_五邻体蛋白、L2_pVII、L2_V和L2_pX蛋白的腺病毒蛋白；
● 腺病毒L3区或其片段，所述片段编码选自L3_pVI蛋白、L3_六邻体蛋白和L3_蛋白酶的腺病毒蛋白；
● 腺病毒E2A区；
● 腺病毒L4区或其片段，所述片段编码选自L4_100k蛋白、L4_33k蛋白和蛋白L4_VIII的腺病毒蛋白；
● 腺病毒E3区或其选自E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8和E3 ORF9的片段；
● 腺病毒L5区或其片段，所述片段编码L5_纤突纤突蛋白；
● 腺病毒E4区或其选自E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2和E4 ORF1的片段；
● 腺病毒3'-末端，优选腺病毒3'反向末端重复；和/或
● 腺病毒VAI或VAII RNA区，优选来自除ChAd155之外的腺病毒、更优选来自Ad5的腺病毒VAI或VAII RNA区。
30.根据权利要求29的腺病毒或组合物，其中所述多核苷酸包含以下中的至少一种：
● 腺病毒5'-末端，优选腺病毒5'反向末端重复；
● 腺病毒L1区或其片段，所述片段编码选自L1_13.6k蛋白、L1_52k和L1_IIIa蛋白的腺病毒蛋白；
● 腺病毒L2区或其片段，所述片段编码选自L2_五邻体蛋白、L2_pVII、L2_V和L2_pX蛋白的腺病毒蛋白；
● 腺病毒L3区或其片段，所述片段编码选自L3_pVI蛋白、L3_六邻体六邻体蛋白和L3_蛋白酶的腺病毒蛋白；
● 腺病毒L4区或其片段，所述片段编码选自L4_100k蛋白、L4_33k蛋白和蛋白L4_VIII的腺病毒蛋白；
● 腺病毒L5区或其片段，所述片段编码L5_纤突纤突蛋白；
● 腺病毒3'-末端，优选腺病毒3'反向末端重复。
31.根据权利要求1-28中任一项的腺病毒或组合物，其中所述多核苷酸包含腺病毒VAI或VAII RNA区。
32.根据权利要求31的腺病毒或组合物，其中所述VAI或VAII RNA区来自除ChAd155之外的腺病毒。
33.根据权利要求32的腺病毒或组合物，其中所述VAI或VAII RNA区域来自Ad5。
34.根据权利要求1-28中任一项的腺病毒或组合物，其中编码狂犬病病毒抗原的核酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO：38具有至少98.6％的同一性，例如至少99％的同一性，例如至少99.5％的同一性。
35.根据权利要求34任一项的腺病毒或组合物，其中编码狂犬病病毒抗原的核酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO：38相同。
36.根据前述权利要求中任一项的腺病毒或组合物，其中所述多核苷酸包含突变或缺失，所述突变或缺失使得选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因组区域的至少一个基因无功能。
37.根据权利要求36的腺病毒或组合物，其中所述多核苷酸缺少选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和/或E4的基因组区域的至少一个基因。
38.根据权利要求36或37的腺病毒或组合物，其中所述基因组区域是E1A和/或E1B。
39.根据权利要求1至38中任一项的腺病毒或组合物，其中所述重组腺病毒是复制缺陷型的。
40.根据权利要求1至39中任一项的腺病毒或组合物，其中所述核酸序列编码来自莫科拉病毒、杜文海格病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒 2或澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒的免疫原。
41.根据权利要求40的腺病毒或组合物，其中所述核酸序列编码来自选自CVS11、CVS-N2C、Evelyn Rokitniki Abelseth (ERA)、Flury、Pitman Moore和Wistar毒株的狂犬病病毒的免疫原。
42.根据权利要求1至41中任一项的腺病毒或组合物，其中所述核酸序列编码源自狂犬病病毒糖蛋白（G）、RNA聚合酶（L）、基质蛋白（M）、核蛋白（N）或磷蛋白（P）的抗原。
43.根据权利要求1至42中任一项的腺病毒或组合物，其中所述核酸序列编码这样的多肽，所述多肽包含狂犬病病毒糖蛋白（G）、RNA聚合酶（L）、基质蛋白（M）、核蛋白（N）和磷蛋白（P）或包含其片段，例如至少20、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500或至少600个氨基酸的片段。
44.根据权利要求1至42中任一项的腺病毒或组合物，其中所述核酸序列编码包含来自莫科拉病毒、杜文海格病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒 2或澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒的糖蛋白的全部或片段的多肽，所述片段合适地为至少20、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400或至少500个氨基酸的片段。
45.根据权利要求1至42中任一项的腺病毒或组合物，其中所述核酸序列编码包含来自选自CVS11、CVS-N2C、Evelyn Rokitniki Abelseth (ERA)、Flury、Pitman Moore和Wistar毒株的狂犬病病毒的糖蛋白的全部或片段的多肽，所述片段合适地为至少20、至少50、至少
100、至少200、至少300、至少400或至少500个氨基酸的片段。
46.根据权利要求1至42中任一项的腺病毒或组合物，其中所述核酸序列编码包含来自多于一种狂犬病病毒的糖蛋白的全部或片段的多肽，所述片段合适地为至少20、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400或至少500个氨基酸的片段。
47.根据权利要求1至44中任一项的腺病毒或组合物，其中所述核酸序列编码包含来自选自CVS11、CVS-N2C、Evelyn Rokitniki Abelseth (ERA)、Flury、Pitman Moore和Wistar毒株的多于一种狂犬病病毒的糖蛋白的全部或片段的多肽，所述片段合适地为至少20、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400或至少500个氨基酸的片段。
48.根据权利要求1至42中任一项的腺病毒或组合物，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO：37的全部或片段的多肽，所述片段合适地为至少20、至少50、至少100、至少200、至少
300、至少400或至少500个氨基酸的片段。
49.根据权利要求48的腺病毒或组合物，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：37的多肽。
50.根据权利要求1至49中任一项的腺病毒或组合物，其中所述核酸序列编码狂犬病病毒抗原，所述狂犬病病毒抗原包含位点I、位点IIa、位点IIb、位点III、位点IV和位点a中的至少一个。
51.根据权利要求50的腺病毒或组合物，其中所述核酸序列编码狂犬病病毒抗原，所述狂犬病病毒抗原包含对应于SEQ ID NO：37的位点I、位点IIa、位点IIb、位点III、位点IV和位点a中的至少一个。
52.根据权利要求51的腺病毒或组合物，其中所述主体被狂犬病病毒感染。
53.根据权利要求52的腺病毒或组合物，其中所述狂犬病病毒是选自RABV、ABLV、ARAV、BBLV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、IRKV、KHUV、LBV、MOKV、SHIV、WCBV和IKOV中的一种或多种的狂犬病病毒的毒株。
54.根据权利要求1至53中任一项的腺病毒或组合物，其中所述核酸序列编码包含这样的序列的狂犬病病毒抗原，所述序列是包含位点I、位点IIa、位点IIb、位点III、位点IV和位点a中的至少一个的免疫原性片段（例如包含一个或多个T细胞表位）。
55.根据权利要求54的腺病毒或组合物，其中狂犬病病毒抗原包含这样的序列，所述序列是至少20个氨基酸残基的免疫原性片段。
56.权利要求1至55中任一项的腺病毒或组合物，其中指导所述产物在宿主细胞中表达的一种或多种序列包括选自转录起始、转录终止、启动子和增强子序列的一种或多种的序列。
57.权利要求56的腺病毒或组合物，其中指导所述产物在宿主细胞中表达的一种或多种序列包括启动子序列。
58.权利要求57的腺病毒或组合物，其中所述启动子序列选自内部启动子、天然启动子、RSV LTR启动子、CMV启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、PGK启动子、EF1a启动子和CASI启动子。
59.根据权利要求1至58中任一项的腺病毒或组合物，其中所述腺病毒在人主体中具有小于10％的血清阳性率，并且优选在人主体中不具有血清阳性率。
60.根据权利要求1至59中任一项的腺病毒或组合物，其中所述腺病毒能够感染哺乳动物细胞。
61.根据权利要求2至60中任一项的组合物，其包含佐剂。
62.根据权利要求1至61中任一项的腺病毒或组合物，其用作药物。
63.根据权利要求62的腺病毒或组合物，其用于刺激免疫应答。
64.根据权利要求63的腺病毒或组合物，其用作疫苗。
65.根据权利要求63的腺病毒或组合物，其用于预防、治疗或改善由狂犬病病毒引起的疾病。
66.根据权利要求1至61中任一项的腺病毒或组合物在制备用于预防由狂犬病病毒感染引起的疾病的药物中的用途。
67.根据权利要求1至61中任一项的腺病毒或组合物在制备用于在人中预防由狂犬病病毒感染引起的疾病的药物中的用途。
68.在主体中诱导免疫应答的方法，其包括向主体施用根据权利要求1至61中任一项的腺病毒或组合物。
69.根据权利要求68的方法，其中所述主体被狂犬病病毒感染。
70.根据权利要求68或69的方法，其中所述主体是人。
71.根据权利要求70的方法，其中所述狂犬病病毒是选自RABV、ABLV、ARAV、BBLV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、IRKV、KHUV、LBV、MOKV、SHIV、WCBV和IKOV的一种或多种的狂犬病病毒的毒株。
72.非人猿猴腺病毒，其包含SEQ ID NO：3的五邻体、SEQ ID NO：5的六邻体或SEQ ID NO：1的纤突，并且还包含编码狂犬病病毒相关抗原的转基因。
73.根据权利要求72的非人猿猴腺病毒，其包含来自ChAd155的五邻体（SEQ ID NO：3）、六邻体（SEQ ID NO：5）和纤突（SEQ ID NO：1）蛋白，并且还包含编码狂犬病病毒相关抗原的转基因。
74.根据权利要求72或73的非人猿猴腺病毒，其中编码的抗原包含与SEQ ID NO. 37具有至少90％同一性的序列。
75.根据权利要求73-74中任一项的非人猿猴腺病毒，其中所述转基因包含SEQ ID NO.38或由SEQ ID NO.38组成。
76.根据权利要求70-75中任一项的非人猿猴腺病毒，其是复制缺陷型腺病毒。
77.根据权利要求75的非人猿猴腺病毒，其中所述腺病毒包含E1基因的功能性失活（例如缺失）。
78.根据权利要求75或77的非人猿猴腺病毒，其中所述腺病毒包含E4基因的功能性失活（例如缺失）。
79.根据权利要求72-78中任一项的非人猿猴腺病毒，其中所述腺病毒包含E3基因的功能性失活（例如缺失）。
80.根据权利要求72-79中任一项的非人猿猴腺病毒，其中所述腺病毒包含Ad5E4orf6基因取代。

说明书全文

具有狂犬病病毒抗原的黑猩猩腺病毒构建体

[0001] 序列表本申请含有已经以ASCII形式电子提交且在此以其整体通过引用并入的序列表。创建于2017年12月6日的所述ASCII拷贝被命名为VU66242WO_SL.txt并且大小为394,117字节。
发明领域

[0002] 本发明属于改善疾病和治疗并预防病毒感染的领域。特别地，本发明涉及编码狂犬病病毒（Lyssavirus）抗原的黑猩猩腺病毒载体。它包括狂犬病病毒抗原用于改善狂犬病病毒的疾病(Lyssaviral diseases)以及治疗和预防狂犬病感染的用途。

[0003] 背景狂犬病病毒是弹状病毒科（Rhabdoviridae）中的包膜单链RNA病毒。狂犬病病毒属的成员引起狂犬病并且具有所有已知人类病毒病原体的最高死亡率。狂犬病通过受感染的哺乳动物的唾液传播。它是一种嗜神经病毒，进入其宿主的神经系统，导致几乎总是致命的脑脊髓炎。目前，全世界每年约有60,000例狂犬病死亡，主要是由亚洲和非洲发展中国家的狗咬伤以及北美野生动物和蝙蝠引起的。

[0004] 狂犬病以狂躁或瘫痪的形式呈现。潜伏期在约五天至几年之间变化，但通常在约20至90天之间。临床疾病最通常始于不适、厌食、疲劳、头痛和发烧的前驱症状，然后在暴露部位出现疼痛或感觉异常。在此期间，焦虑、激动或烦躁可能是突出的，随后是极度活跃、方向障碍、癫痫发作、恐水、多涎，并最终导致瘫痪、昏迷和死亡。

[0005] 腺病毒由于它在多种靶组织中实现高效基因转移的能力和大的转基因容量已经被广泛地用于基因转移应用。按照惯例，将腺病毒E1基因缺失并用由所选启动子、目标基因的cDNA序列和聚腺苷酸信号组成的表达盒替换，从而产生复制缺陷型重组病毒。

[0006] 重组腺病毒可用于基因治疗和用作疫苗。基于非人猿猴腺病毒的病毒载体代表了使用人类来源载体开发基因疫苗的替代方案。从非人猿猴分离的某些腺病毒与从人类分离的腺病毒密切相关，如通过它们在人类起源的细胞中的有效繁殖所证明的。

[0007] 需要能够有效递送疫苗抗原的载体。具体而言，狂犬病仍然是全世界重要的病毒性人畜共患病。虽然目前可以进行预防，但在暴露前和暴露后都需要大量剂量，并且依从性（compliance）低，从而降低了医疗利益。需要改进的狂犬病疫苗，其具有简化的给药方案，增加的安全性和增强的制造特性。腺病毒制造比现有的人狂犬病疫苗更安全且更便宜，其基于灭活的狂犬病病毒。因此，存在开发用于狂犬病疫苗的腺病毒载体的未满足的要求。

[0008] 发明概述本发明人提供了可用作免疫原性组合物（所述免疫原性组合物用于在主体中诱导针对狂犬病病毒的疾病和狂犬病病毒感染的免疫应答）组分的构建体，其用于治疗的方法及其制备方法。

[0009] 提供了分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码选自以下的多肽：(a) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；
(b) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，和(c) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；
其中分离的多核苷酸包含编码狂犬病病毒抗原的核酸序列。

[0010] 还提供了重组多核苷酸，其包含选自以下的多核苷酸：(a) 编码具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
(b) 编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物的多核苷酸，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，和
(c) 编码具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
其中所述重组多核苷酸包含编码狂犬病病毒抗原的核酸序列。

[0011] 还提供了重组载体，其包含选自以下的多核苷酸：(a) 编码具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
(b) 编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物的多核苷酸，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，和
(c) 编码具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
其中所述重组载体包含编码狂犬病病毒抗原的核酸序列。

[0012] 还提供了重组腺病毒，其包含选自以下的至少一种多核苷酸或多肽：(a) 编码具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
(b) 编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物的多核苷酸，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，
(c) 编码具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
(d) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；
(e) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，和(f) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；
其中所述重组腺病毒包含编码狂犬病病毒抗原的核酸序列；和其中所述核酸序列与指导所述狂犬病病毒抗原在宿主细胞中表达的一种或多种序列可操作地连接。

[0013] 本发明提供了重组腺病毒，其包含选自以下的一种多核苷酸或多肽：(a) 编码具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
(b) 编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物的多核苷酸，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，
(c) 编码具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
(d) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；
(e) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，和(f) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；
其中所述腺病毒包含编码狂犬病病毒抗原的核酸序列，其中所述核酸序列与指导所述狂犬病病毒抗原在宿主细胞中表达的一种或多种序列可操作地连接。所述重组腺病毒可包含选自上文所列（a）至（f）的一种或多种其他多核苷酸或多肽。

[0014] 还提供了包含以下中的至少一种的组合物：(a) 编码具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
(b) 编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物的多核苷酸，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，
(c) 编码具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
(d) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；
(e) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，(f) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；
(g) 包含如上文（a）、（b）或（c）中所述的多核苷酸的载体，和
(h) 包含如上文（a）、（b）或（c）中所述的多核苷酸的重组腺病毒和药学上可接受的赋形剂。

[0015] 其中组合物包含编码狂犬病病毒抗原或狂犬病病毒抗原多肽序列的核酸序列；并且，任选地，核酸序列与指导所述狂犬病病毒抗原在宿主细胞中表达的一种或多种序列可操作地连接。

[0016] 还提供了包含以下中的至少一种的细胞：(a) 编码具有根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
(b) 编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物的多核苷酸，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，
(c) 编码具有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
(d) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；
(e) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，(f) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；
(g) 包含如上文（a）、（b）或（c）中所述的多核苷酸的载体，和
(h) 包含如上文（a）、（b）或（c）中所述的多核苷酸的重组腺病毒；
其中所述细胞包含腺病毒，所述腺病毒包含编码狂犬病病毒抗原的核酸序列；并且其中核酸序列与指导所述狂犬病病毒抗原在宿主细胞中表达的一种或多种序列可操作地连接。

[0017] 还提供了选自以下的分离的腺病毒多肽：(a) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；
(b) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，和(c) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；和
还包含狂犬病病毒抗原多肽序列。

[0018] 还提供了分离的多核苷酸、载体、重组腺病毒、组合物或细胞，其包含根据SEQ ID NO：6的序列并且还包含狂犬病病毒抗原。

[0019] 重组腺病毒和组合物可用作药物，特别是用于刺激针对狂犬病病毒的疾病，例如狂犬病感染的免疫应答。

[0020] 通常，本发明的方法的目的是诱导保护性免疫应答，即针对有关的病原体给主体免疫或接种疫苗。本发明因此可用于预防、治疗或改善由于狂犬病病毒的疾病的感染，例如狂犬病病毒感染引起的疾病。

[0021] 在一些方面，本文公开的组合物是免疫原性组合物，其在施用于主体时诱导体液和/或细胞免疫应答，即特异性识别天然存在的狂犬病病毒多肽的免疫应答。例如，免疫原性组合物可以在病毒感染后相对于未治疗的主体诱导记忆T和/或B细胞群，特别是在其中组合物包含含有编码狂犬病病毒抗原的序列的核酸的那些实施方案中。

[0022] 可以提供本发明用于预先暴露预防和暴露后预防由狂犬病病毒的疾病引起的疾病的目的。在一些实施方案中，主体先前已经接种过狂犬病疫苗。例如，本发明的方法可以例如在狂犬病疫苗接种后至少一年，狂犬病疫苗接种后至少两年，狂犬病疫苗接种后至少五年或狂犬病疫苗接种后至少十年用于主体。

[0023] 狂犬病病毒抗原是抗原序列，即来自狂犬病病毒蛋白的序列，其包含至少一个B或T细胞表位。适当地，狂犬病病毒抗原包含至少一个T细胞表位。在本发明的一个实施方案中，腺病毒包含编码狂犬病病毒抗原的核酸序列。在本发明的一个具体实施方案中，腺病毒包含编码衍生自SEQ ID NO：37的多肽的核酸。在本发明的另一个具体实施方案中，腺病毒包含衍生自SEQ ID NO：38的核酸。

[0024] 在本发明的另一个实施方案中，腺病毒可包含编码衍生自SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：45的多肽的核酸。在本发明的其他具体实施方案中，腺病毒可包含衍生自SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：46的核酸。

[0025] 引发的免疫应答可以是抗原特异性B细胞应答，其产生中和抗体。引发的免疫应答可以是抗原特异性T细胞应答，其可以是全身性和/或局部应答。抗原特异性T细胞应答可以包括CD4+ T细胞应答，例如涉及表达多种细胞因子，例如IFNγ、肿瘤坏死因子-α（TNFα）和/或IL2的CD4+ T细胞的应答。可选地或另外，抗原特异性T细胞应答包括CD8+ T细胞应答，例如涉及表达多种细胞因子，例如IFNγ、TNFα和/或IL2的CD8 + T细胞的应答。附图说明

[0026] 图1：表示主要抗原表位的狂犬病糖蛋白的图。图1以出现顺序分别公开了SEQ ID NO 94、64和78。图2A-C：来自指示的猿猴腺病毒的纤突蛋白序列的比对。
图3：用于产生特异性ChAd155 BAC和质粒载体的流程图
图4：物种C BAC 穿梭物 #1365示意图
图5：pArsChAd155 Ad5E4orf6-2 (#1490)示意图
图6：pChAd155/RSV示意图
图7：BAC ChAd155/RSV示意图
图8：E4 Ad5E4orf6/ TetO hCMV RG WPRE (#1509)示意图
图9：表达HIV Gag转基因的ChAd3和ChAd155载体的生产力
图10：表达RSV转基因的ChAd155和PanAd3载体的表达水平 - 蛋白质印迹
图11：表达HIV Gag转基因的ChAd3和ChAd155载体的免疫原性 - IFN-γELISpot
图12：表达RSV转基因的PanAd3和ChAd155载体的免疫原性 - IFN-γELISpot
图13：在小鼠中表达狂犬病G蛋白转基因的ChAd155载体的免疫原性 - （A）抗体中和和（B）IFN-γELISpot
图14：表达狂犬病G蛋白转基因的ChAd155载体诱导的免疫应答的稳定性
图15：与市售疫苗相比，表达狂犬病G蛋白转基因的ChAd155载体的效力
图16：在小鼠中表达狂犬病G蛋白转基因的ChAd155载体的血清转变和保护率
图17：在小鼠中表达狂犬病G蛋白转基因的ChAd155载体的血清转变和保护率
图18：在非人灵长类动物中表达狂犬病G蛋白转基因的ChAd155载体的中和抗体应答图19：在非人灵长类动物中对表达狂犬病G蛋白转基因的ChAd155载体的T细胞应答。

[0027] 序列描述SEQ ID NO：1-ChAd155纤突的多肽序列
SEQ ID NO：2-编码ChAd155纤突的多核苷酸序列
SEQ ID NO：3-ChAd155五邻体的多肽序列
SEQ ID NO：4-编码ChAd155五邻体的多核苷酸序列
SEQ ID NO：5- ChAd155六邻体的多肽序列
SEQ ID NO：6-编码ChAd155六邻体的多核苷酸序列
SEQ ID NO：7-编码ChAd155＃1434的多核苷酸序列
SEQ ID NO：8-编码ChAd155＃1390的多核苷酸序列
SEQ ID NO：9-编码ChAd155＃1375的多核苷酸序列
SEQ ID NO：10-编码野生型ChAd155的多核苷酸序列
SEQ ID NO：11-编码ChAd155/RSV的多核苷酸序列
SEQ ID NO：12-编码CASI启动子的多核苷酸序列
SEQ ID NO：13- Ad5orf6引物1多核苷酸序列
SEQ ID NO：14- Ad5orf6引物2多核苷酸序列
SEQ ID NO：15- BAC/CHAd155 ∆E1_TetO hCMV RpsL-Kana引物1多核苷酸序列
SEQ ID NO：16- BAC/CHAd155 ∆E1_TetO hCMV RpsL-Kana (#1375)引物2多核苷酸序列
SEQ ID NO：17-1021-FW E4 Del Step1引物多核苷酸序列
SEQ ID NO：18-1022-RW E4 Del Step1引物多核苷酸序列
SEQ ID NO：19-1025-FW E4 Del Step2引物多核苷酸序列
SEQ ID NO：20-1026-RW E4 Del Step2引物多核苷酸序列
SEQ ID NO：21-91-SubMonte FW引物多核苷酸序列
SEQ ID NO：22-90-BghPolyA RW引物多核苷酸序列
SEQ ID NO：23- CMVfor引物多核苷酸序列
SEQ ID NO：24- CMVrev引物多核苷酸序列
SEQ ID NO：25-CMVFAM-TAMRA qPCR探针多核苷酸序列
SEQ ID NO：26-土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件（WPRE）多核苷酸序列
SEQ ID NO：27- ChAd3的纤突蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：28- PanAd3的纤突蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：29- ChAd17的纤突蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：30- ChAd19的纤突蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：31- ChAd24的纤突蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：32- ChAd11的纤突蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：33- ChAd20的纤突蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：34- ChAd31的纤突蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：35- PanAd1的纤突蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：36- PanAd2的纤突蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO：37- RG medoid抗原的氨基酸序列
SEQ ID NO：38- RG medoid抗原的核苷酸序列
SEQ ID NO：39- RG AA098的氨基酸序列
SEQ ID NO：40- RG AA098的核酸序列
SEQ ID NO：41- RG AA0093的氨基酸序列
SEQ ID NO：42- RG AA0093的核酸序列
SEQ ID NO：43- RG AA0094的氨基酸序列
SEQ ID NO：44- RG AA0094的核酸序列
SEQ ID NO：45- RG AA0095的氨基酸序列
SEQ ID NO：46- RG AA0095的核酸序列
SEQ ID NO：47- AdC68rab.gp-ERA毒株的氨基酸序列
SEQ ID NO：48- AdC68rab.gp-ERA毒株的核苷酸序列
SEQ ID NO：49-聚组氨酸
SEQ ID NO：50-63-狂犬病G蛋白位点IIb抗原表位
SEQ ID NO：64-77-狂犬病G蛋白位点I抗原表位
SEQ ID NO：78-91-狂犬病G蛋白位点III抗原表位
SEQ ID NO：92- pvjTetOhCMV_WPRE_BghPolyA正向引物
SEQ ID NO：93- pvjTetOhCMV_WPRE_BghPolyA反向引物。

[0028] 发明详述腺病毒载体
腺病毒由于其经证明的安全性、在多种靶组织中实现高效基因转移的能力和大的转基因容量已经被广泛地用于基因转移应用。在本发明中使用的腺病毒载体可以源自许多哺乳动物宿主。已经分离腺病毒的超过100种不同血清型，其感染多种哺乳动物物种。根据序列同源性和它们凝集红细胞的能力，已经将这些腺病毒血清型分为6个亚类（A-F；B细分为B1和B2）。

[0029] 在一个实施方案中，本发明的腺病毒载体源自非人猿猴腺病毒，也简单地称作猿猴腺病毒。已经从非人猿猴例如黑猩猩、倭黑猩猩、恒河猴和大猩猩中分离出许多腺病毒，并且衍生自这些腺病毒的载体诱导对由这些载体编码的转基因的强免疫应答（Colloca 等人 (2012) Sci. Transl. Med. 4:1-9；Roy 等人 (2004) Virol.324: 361-372；Roy 等人 (2010) J. of Gene Med. 13:17-25）。基于非人猿猴腺病毒的载体的某些优点包括在靶群体中相对缺乏针对这些腺病毒的交叉中和抗体，因此它们的使用克服了对人腺病毒的预先存在的免疫力。例如，与在某些候选人腺病毒载体的情况下的35%相比，某些黑猩猩腺病毒与预先存在的中和抗体应答的交叉反应仅存在于2%的靶群体中。

[0030] 具体地，腺病毒载体可以源自非人腺病毒，例如猿猴腺病毒，且特别是黑猩猩腺病毒，例如ChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、Pan 5、Pan 6、Pan 7（也称为C7）或Pan 9并且可以全部或部分包括编码非人腺病毒的纤突、五邻体或六邻体的核苷酸。这样的毒株的实例描述在WO03/000283、WO2010/086189和GB1510357.5中，并且也可从美国典型培养物保藏中心, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209和其他来源获得。或者，腺病毒载体可以源自从矮黑猩猩分离的非人猿猴腺病毒，例如PanAd1、PanAd2或PanAd3。本文描述的这样的载体的实例可以见于例如WO2005/071093和WO2010/086189。腺病毒载体也可以源自从大猩猩分离的腺病毒，例如在WO2013/52799、WO2013/52811和WO2013/52832中所述。

[0031] 腺病毒载体结构腺病毒具有含二十面体衣壳的特征形态，所述二十面体衣壳包含三种主要蛋白：六邻体(II)、五邻体基质(III)和多节纤突(IV)、以及许多其他次要蛋白VI、VIII、IX、IlIa和IVa2。所述六邻体占衣壳的结构组分的大部分，所述衣壳由240个三聚的六邻体壳粒和12个五邻体基质组成。所述六邻体具有三个保守双桶，而顶部具有三个塔，每个塔含有来自每个亚基的环，所述亚基形成衣壳的大部分。六邻体的基质在腺病毒血清型之间是高度保守的，而表面环是可变的。五邻体是另一种腺病毒衣壳蛋白，其形成纤突所连接的五聚体基质。三聚的纤突蛋白从在衣壳的12个顶点中的每一个处的五邻体基质伸出且是有节的杆状结构。
纤突蛋白的主要作用是通过结区域(knob region)与细胞受体的相互作用将病毒衣壳拴系至细胞表面，并且纤突的柔性轴以及结区域中的变化是不同血清型的特征。

[0032] 腺病毒基因组已被充分表征。线性双链DNA与高碱性蛋白VII和小肽pX（也称为mu）相关。另一种蛋白V与该DNA-蛋白复合物一起包装，并通过蛋白VI提供与衣壳的结构连接。就类似地定位(例如每种病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5基因的位置)的特定开放读码框而言，在腺病毒基因组的整体组构中存在普遍保守性。腺病毒基因组的每个末端包含被称作反向末端重复(ITR)的序列，其是病毒复制所必需的。腺病毒基因组的5'末端含有包装和复制所必需的5'顺式元件；即，5'ITR序列（其作为复制起点起功能）和天然
5'包装增强子结构域（其包含用于包装线性腺病毒基因组所必需的序列和E1启动子的增强子元件）。腺病毒基因组的3'末端包括用于包装和衣壳化所必需的3' 顺式元件(包括ITR)。
该病毒也包含病毒编码的蛋白酶，其是用于加工产生传染性病毒粒子所需的一些结构蛋白所必需的。

[0033] 基于在宿主细胞转导以后表达病毒基因的次序描述了腺病毒基因组的结构。更具体地，根据在DNA复制开始之前或之后是否发生转录，将所述病毒基因称作早期(E)或晚期(L)基因。在转导的早期阶段，表达腺病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4基因以制备用于病毒复制的宿主细胞。在感染的晚期阶段，编码病毒颗粒的结构组分的晚期基因L1-L5的表达被活化。

[0034] 腺病毒衣壳蛋白及其编码多核苷酸如上所述，腺病毒衣壳包含三种主要蛋白质，六邻体、五邻体和纤突。所述六邻体占衣壳的结构组分的大部分，所述衣壳由240个三聚的六邻体壳粒和12个五邻体基质组成。所述六邻体具有三个保守双桶，而顶部具有三个塔，每个塔含有来自每个亚基的环，所述亚基形成衣壳的大部分。六邻体的基质在腺病毒血清型之间是高度保守的，而表面环是可变的。

[0035] 五邻体是另一种腺病毒衣壳蛋白，其形成纤突所连接的五聚体基质。三聚的纤突蛋白从在衣壳的12个顶点中的每一个处的五邻体基质伸出且是有节的杆状结构。腺病毒衣壳的表面相对于大多数其他二十面体病毒的表面的显著差异是细长的纤突蛋白的存在。所述纤突蛋白的主要作用是通过它与细胞受体的相互作用而将病毒衣壳与细胞表面拴系。

[0036] 许多腺病毒血清型的纤突蛋白共享共同的构造：N-端尾巴，由重复序列构成的中心轴，以及C-端球形结结构域（或“头部”）。所述中心轴结构域由可变数目的β-重复组成。所述β-重复连接以形成高度刚性且稳定的三个相互缠绕的螺旋链的长形结构。所述轴将N-端尾巴与球形结结构连接，所述球形结结构负责与靶细胞受体的相互作用。腺病毒结结构域的球形性质呈现大表面用于在侧面和在顶点结合所述受体。该构造的作用是使受体结合位点突出远离病毒衣壳，从而使该病毒脱离由相对扁平的衣壳表面呈现的空间约束。

[0037] 尽管许多腺病毒血清型的纤突具有相同的整体构造，但它们具有影响它们的功能以及结构的可变氨基酸序列。例如，在纤突结的表面上的许多暴露区域呈现可容易地适应的受体结合位点。纤突结的球形形状允许受体结合在所述结的侧面处或所述纤突结的顶部上。这些结合位点通常位于表面暴露的环上，所述环连接在人腺病毒之间不太保守的β-链。这些环上的暴露侧链给予所述结多种表面特征，同时保留三级和四级结构。例如，在结表面处的静电势和电荷分布可以由于纤突结序列中的等电点的宽范围(在对于腺病毒“Ad” 8、Ad 19和Ad 37而言大约9至对于亚组B腺病毒而言大约5的pI范围内变化)而变化。作为在结构上复杂的病毒配体，所述纤突蛋白允许来自病毒衣壳的呈许多取向和距离(轴)的多种结合表面(结)的呈现。

[0038] 一些血清型之间最明显的变化之一是纤突长度。研究已经证实，纤突轴的长度强烈地影响所述结和所述病毒与其靶受体的相互作用。此外，血清型之间的纤突蛋白还可以在它们的弯曲能力方面存在差异。尽管所述轴中的β-重复形成高度稳定的且规则的结构，但是电子显微术(EM)研究已经显示所述纤突中的不同铰链。来自几种腺病毒血清型纤突的蛋白序列的分析准确地定位在来自N-端尾巴的第三个β-重复处所述轴的重复序列的破坏，其与所述轴中的铰链之一强相关，如通过EM看到的。所述纤突中的铰链允许所述结采取相对于该病毒衣壳的多种取向，这可以防止对受体接合的位阻，所述受体接合需要所述结上的受体结合位点的正确呈现。例如，亚组D Ads的刚性纤突因此需要柔性受体或预先定位用于病毒附着的受体，因为它们不能自身弯曲。

[0039] 通过使用纤突假型化技术已经实现了对不同Ad血清型特异性的细胞受体的鉴别和它们如何促进组织嗜性的知识。尽管一些亚组的Ad使用柯萨奇病毒(Coxsackievirus)和腺病毒受体(“CAR”)作为第一受体，但越来越清楚的是，许多Ad使用替代性第一受体，从而导致非常不同的体外和体内嗜性。这些血清型的纤突表现出它们的一级结构和三级结构的明显差异，如纤突轴刚度、纤突轴长度，和CAR结合位点和/或推定的HSPG结合基序的缺乏，以及在纤突结内的净电荷的差异。因此，用替代性纤突轴和结将Ad 5颗粒假型化提供除去重要细胞结合结构域的机会，且另外，可以允许与用Ad 5实现的结果相比，更有效的(和潜在地更具细胞选择性的)向确定细胞类型进行转基因递送。如果使用的纤突是来自在人类或实验模型中具有较低血清阳性率的Ad (有利于载体的成功施用的情形)，也可以减少纤突假型化的Ad颗粒的中和。此外，全长纤突以及分离的纤突结区域（但不是单独的六邻体或五邻体）能够诱导树突细胞成熟并且与有效的CD8+ T细胞应答的诱导相关。总之，腺病毒纤突在腺病毒载体的至少受体结合和免疫原性中起重要作用。

[0040] "低血清阳性率"可以是指具有与人腺病毒5(Ad5)相比降低的预先存在的中和抗体水平。类似地或可选地，"低血清阳性率"可以是指小于约20%血清阳性率、小于约15%血清阳性率、小于约10%血清阳性率、小于约5%血清阳性率、小于约4%血清阳性率、小于约3%血清阳性率、小于约2%血清阳性率、小于约1%血清阳性率或无可检测的血清阳性率。使用在Aste-Amézaga等人, Hum. Gene Ther. (2004) 15(3):293-304中描述的方法，可以将血清阳性率测量为具有临床上有关的中和滴度(定义为>200的50%中和滴度)的个体的百分比。

[0041] 图1中提供的比对阐明了C组猿猴腺病毒的纤突蛋白之间的差异。一个突出特征是，这些腺病毒的纤突序列可以宽泛地分组成具有长纤突(如ChAd155)或短纤突(如ChAd3)。该长度差别是由于与长纤突相比在短纤突中大约位置321处的36个氨基酸缺失。另外，存在许多氨基酸取代，它们在短纤突亚组相对于长纤突亚组之间不同，但是在每个亚组内是一致的。尽管尚未阐明这些差异的确切功能，鉴于纤突的功能和免疫原性，它们可能是显著的。已经显示，病毒嗜性的决定簇之一是纤突轴的长度。已经证明，具有较短轴的Ad5载体具有与CAR受体较低的结合效率和较低的感染性。已经推测，这种损害是较短纤突刚性增加的结果，其导致对细胞受体的附着效率较低。这些研究可以解释与以前描述的ChAd3和PanAd3(其携带具有更短轴的纤突)相比携带更长和更柔性纤突的ChAd155的改善的性能。

[0042] 在本发明的一个方面提供了黑猩猩腺病毒ChAd155的分离的纤突、五邻体和六邻体衣壳多肽，和编码黑猩猩腺病毒ChAd155的纤突、五邻体和六邻体衣壳多肽的分离的多核苷酸。“分离的”多核苷酸是从其原始环境中取出的多核苷酸。例如，如果天然存在的多核苷酸分离自天然系统中共存物质的一些或所有中，则其被分离。如果例如将多核苷酸克隆入不是天然环境的一部分的载体内或如果其包含在cDNA内，则认为将其分离。

[0043] 预期所有三种衣壳蛋白都促成低血清阳性率，且因而可以彼此独立地或组合地用于抑制腺病毒对预先存在的中和抗体的亲和力，例如以制备具有降低的血清阳性率的重组腺病毒。这样的重组腺病毒可以是具有衣壳蛋白的嵌合腺病毒，所述衣壳蛋白来自至少具有来自ChAd155的纤突蛋白的不同血清型。

[0044] 转基因腺病毒载体可以用于递送期望的RNA或蛋白序列（例如异源序列）用于体内表达。载体可以包括任何遗传元件，包括裸露DNA、噬菌体、转座子、粘粒、附加体、质粒或病毒。这样的载体含有本文中公开的ChAd155的DNA和表达盒。"表达盒"(或"微基因")是指选择的异源基因(“转基因”)和驱动宿主细胞中的基因产物的翻译、转录和/或表达所必需的其他调节元件的组合。

[0045] 通常，“异源”是指源自与其进行比较的实体的其余部分的基因型不同的实体。异源核酸序列指并非分离自、源自或基于腺病毒载体的天然存在的核酸序列的任何核酸序列。"天然存在的"是指在自然界中发现的且不是合成制备或修饰的序列。当序列分离自一个来源、但是经过适当地修饰(例如，通过缺失、取代(突变)、插入或其他修饰)从而不破坏来源基因的正常功能时，所述序列"源自"所述来源。

[0046] 通常，设计腺病毒载体，使得所述表达盒位于这样的核酸分子中：所述核酸分子在选择的腺病毒基因的天然区域中含有其他腺病毒序列。如果需要的话，可以将所述表达盒插入现存的基因区域中以破坏该区域的功能。或者，可以将所述表达盒插入部分或完全缺失的腺病毒基因的位点。例如，所述表达盒可以位于使选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4的基因组区域的至少一个基因无功能的突变、插入或缺失的位点。术语"使......无功能"是指，将足够量的基因区域除去或以其他方式破坏，使得所述基因区域不再能够产生基因表达的功能产物。如果需要的话，可以将整个基因区域除去(和适当地用所述表达盒替换)。适当地，将腺病毒的E1基因缺失并用由所选启动子、目标基因的cDNA序列和聚腺苷酸信号组成的表达盒替换，从而产生复制缺陷型重组病毒。

[0047] 由腺病毒载体编码的转基因是编码可用于生物学和医学的产物（如治疗性或免疫原性蛋白、RNA或酶中的一种或多种）的序列。合乎需要的RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化RNA、RNA适体和反义RNA。有用的RNA序列的实例是消除治疗的动物中的靶向核酸序列的表达的序列。

[0048] 所述转基因是编码目标蛋白的核酸序列，其与侧接所述转基因的载体序列异源。核酸编码序列以允许宿主细胞中的转基因转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接到调节组分。

[0049] 转基因可编码用于疾病治疗、改善或预防的多肽或蛋白，用于诱导免疫应答，和/或用于预防性疫苗目的。如本文中所用，免疫应答的诱导指蛋白（也被称作"抗原"或"免疫原"）诱导针对所述蛋白的T细胞和/或体液免疫应答的能力。

[0050] 由本发明载体表达的免疫原可用于针对其他病原体免疫人或非人动物，或者来自癌细胞或肿瘤细胞，所述其他病原体包括，例如，感染人和非人脊椎动物的细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生物。例如，免疫原可以选自多种病毒科。在一个实施方案中，免疫原来自狂犬病病毒，例如莫科拉病毒（Mokola virus）、杜文海格病毒（Duvenhage virus）、欧洲蝙蝠狂犬病病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒 2和澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒。在一个实施方案中，狂犬病毒免疫原来自狂犬病病毒，例如来自CVS11、CVS-N2C、Evelyn Rokitniki Abelseth (ERA)、Flury、Pitman Moore或Wistar毒株。这些抗原可以源自狂犬病病毒糖蛋白（G）、RNA聚合酶（L）、基质蛋白（M）、核蛋白（N）和磷蛋白（P），例如包含狂犬病病毒糖蛋白（G）、RNA聚合酶（L）、基质蛋白（M）、核蛋白（N）和磷蛋白（P）或包含其片段（合适地是至少20、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500或至少600个氨基酸的片段）。

[0051] 在一个实施方案中，由本发明的载体表达的免疫原包含来自莫科拉病毒、杜文海格病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒 2和澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒的糖蛋白的全部或片段，所述片段合适地为至少20、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400或至少500个氨基酸的片段。在一个实施方案中，由本发明的载体表达的免疫原包含来自狂犬病病毒、例如来自CVS11、CVS-N2C、Evelyn Rokitniki Abelseth (ERA)、Flury、Pitman Moore或Wistar毒株的糖蛋白的全部或片段，所述片段合适地为至少20、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400或至少500个氨基酸的片段。在一个实施方案中，由本发明的载体表达的免疫原包含SEQ ID NO：37的全部或片段，所述片段合适地为至少20、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400或至少500个氨基酸的片段。

[0052] 在一个实施方案中，由本发明的载体表达的免疫原包含表1中所示的一种或多种抗原表位。在一个实施方案中，由本发明的载体表达的免疫原包含对应于狂犬病病毒毒株RABV、ABLV、ARAV、BBLV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、IRKV、KHUV、LBV、MOKV、SHIV、WCBV或IKOV的位点I、位点IIa、位点IIb、位点III、位点IV和/或位点a的表位。在一个具体实施方案中，本发明的载体包含对应于SEQ ID NO：37中发现的位点I、位点IIa、位点IIb、位点III、位点IV和/或位点a的表位。

[0053] 在一个实施方案中，可以通过包含抗原的medoid序列来增加疫苗构建体的交叉保护性宽度。“medoid”是指狂犬病病毒序列，其与其他狂犬病病毒序列具有最小的差异性(dissimilarity)。在一个具体实施方案中，本发明的载体包含G糖蛋白的medoid序列。在一个具体实施方案中，本发明的非人灵长类动物载体包含G糖蛋白的medoid序列。在一个具体实施方案中，本发明的ChAd155载体包含G糖蛋白的medoid序列。在一个具体实施方案中，medoid序列源自天然病毒毒株，其在NCBI数据库中注释的所有G蛋白序列中具有最高的氨基酸同一性平均百分比。在一个具体实施方案中，G糖蛋白的medoid序列是NCBI毒株AGN94271。

[0054] 可选地或另外，转基因序列可以包括报告序列(reporter sequence)，其在表达后产生可检测信号。这样的报告序列包括但不限于，编码β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、萤光素酶、膜结合蛋白(包括例如，CD2、CD4、CD8、流感血凝素蛋白和本领域众所周知的其他蛋白(存在针对它们的高亲和力抗体或可以通过常规方式生产所述抗体))和包含适当地与抗原标签结构域(尤其来自血凝素或Myc)融合的膜结合蛋白的融合蛋白的DNA序列。这些编码序列当与驱动它们的表达的调节元件结合时会提供可通过常规方式检测的信号，所述常规方式包括酶测定、放射摄影测定、比色测定、荧光测定或其他光谱测定、荧光活化细胞分选测定和免疫学测定（包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学）。

[0055] 除了转基因以外，所述表达盒还可以包括常规控制元件，所述控制元件以允许所述转基因在被所述腺病毒载体转染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与所述转基因可操作地连接。如本文所用，"可操作地连接的"序列包括与目标基因邻接的表达控制序列和以反式或在一定距离处起作用以控制目标基因的表达控制序列。

[0056] 表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和聚腺苷酸化（poly A）信号，包括兔β-珠蛋白polyA；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列（例如，Kozak共有序列）；增强蛋白稳定性的序列；并且当需要时，增强编码产物分泌的序列。在其他序列中，可以使用嵌合的内含子。

[0057] "启动子"是允许RNA聚合酶的结合并指导基因的转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5 '非编码区，在所述基因的转录起始位点的近侧。在转录的起始中起作用的启动子内的序列元件经常特征在于共有核苷酸序列。启动子的实例包括但不限于来自细菌、酵母、植物、病毒和哺乳动物(包括人类)的启动子。大量表达控制序列（包括内部的、天然的、组成型、诱导型和/或组织特异性的启动子）是本领域已知的且可以利用。

[0058] 组成型启动子的实例包括但不限于TBG启动子、逆转录病毒劳氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virus）LTR启动子（任选地具有增强子）、巨细胞病毒（CMV）启动子（任选地具有CMV增强子，参见例如Boshart 等人, Cell, 41:521-530 (1985)）、CASI启动子（WO2012/115980）、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶（PGK）启动子和EF1a启动子（Invitrogen）。

[0059] 诱导型启动子允许调节基因表达，并且可以通过外源提供的化合物、环境因素如温度或特定生理学状态（例如急性期）的存在、细胞的特定分化状态或仅在复制中的细胞中被调节。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。已经描述了许多其他系统，并且本领域技术人员可以容易地选择这些系统。例如，诱导型启动子包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白（MT）启动子和地塞米松（Dex）诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）启动子。其他诱导型系统包括T7聚合酶启动子系统；蜕皮激素昆虫启动子，四环素可抑制系统和四环素诱导系统。其他系统包括FK506二聚体、VP16或p65（使用甘珀二醇(castradiol)、联苯酚米勒甾酮(diphenol murislerone)）、RU486诱导系统和雷帕霉素诱导系统。一些诱导型启动子的有效性随着时间的推移而增加。在这样的情况下，可以通过插入多个串联阻遏物(例如，通过IRES与TetR连接的TetR)增强这样的系统的有效性。

[0060] 在另一个实施方案中，可以使用转基因的天然启动子。当期望转基因的表达应当模拟天然表达时，可以优选所述天然启动子。当转基因的表达必须在时间上或在发育上受到调节或以组织特异性的方式受到调节或响应于特定转录刺激而调节时，可以使用所述天然启动子。在另一个实施方案中，其他天然表达控制元件(例如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列)也可以用于模拟天然表达。

[0061] 转基因可以与组织特异性启动子可操作地连接。例如，如果需要在骨骼肌中表达，则应使用在肌肉中有活性的启动子。这些包括来自编码骨骼β-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、肌营养不良蛋白、肌肉肌酸激酶的基因的启动子，以及具有高于天然存在的启动子的活性的合成肌肉启动子。组织特异性的启动子的实例已知针对肝的；乙型肝炎病毒核心；甲胎蛋白，骨钙素；骨唾液蛋白，淋巴细胞，免疫球蛋白重链；T细胞受体链），针对神经元的例如神经元特异性的烯醇化酶（NSE）启动子，神经丝轻链基因和神经元特异性的vgf基因等。

[0062] 在一些实施方案中，土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件（WPRE）（Zuffrey 等人 (1999) J. Virol.；73(4):2886-9）可以与转基因可操作地连接。

[0063] 转基因可以用于治疗，例如作为疫苗，用于诱导免疫应答，和/或用于预防性疫苗目的。如本文所用，免疫应答的诱导是指蛋白诱导针对所述蛋白的T细胞和/或体液免疫应答的能力。

[0064] 腺病毒载体构建通过修饰野生型腺病毒以表达异源基因和/或缺失或失活不希望的腺病毒序列来制备腺病毒载体。腺病毒载体也可能具有改变的复制能力。例如所述载体可以是复制缺陷型或具有有限的复制，使得它在非互补细胞(non-complementing cells)中具有与野生型病毒相比减少的复制能力。这可以如下实现：突变所述病毒，例如通过缺失参与复制的基因，例如缺失E1A、E1B、E3或E4基因。

[0065] 根据本发明的腺病毒载体可包含功能性E1缺失。因此，由于缺乏表达腺病毒E1A和/或E1B的能力，根据本发明的腺病毒载体可能是复制缺陷型的。所述重组腺病毒还可能在其他基因中携带功能性缺失，例如，E3或E4基因中的缺失。所述腺病毒延迟早期基因E3可从腺病毒序列（其构成所述重组病毒的一部分）中被消除。E3的功能对于生产所述重组腺病毒颗粒不是必要的。因此，没有必要替换此基因产物的功能从而包装可用于本发明的重组腺病毒。在一个具体的实施方案中，所述重组腺病毒具有功能上缺失的E1和E3基因。此类载体的构建在Roy 等人，Human Gene Therapy 15:519-530, 2004中有述。

[0066] 还可以构建具有E4基因功能缺失的重组腺病毒。在一个具体实施方案中，重组腺病毒具有功能缺失的E1和E4基因，如Colloca 等人 (2012) Sci. Transl. Med. 4:1-9；Roy 等人 (2004) Virol.324: 361-372中所述。在一些实施方案中，可能需要保留E4 ORF6功能。在一个实施方案中，E4 ORF6区域可以被例如来自人腺病毒5（Ad5）的异源E4 ORF6替换。因此，在一个具体的实施方案中，腺病毒载体可以在E1中功能缺失并且具有来自Ad5的E4 ORF6区域。根据本发明的腺病毒载体还可含有延迟早期基因E2a中的功能缺失。缺失还可发生在腺病毒基因组的晚期基因L1至L5中的任一者上。类似地，中间基因(intermediate genes) IX和IVa中的缺失可能是有用的。

[0067] 可以在其他结构或非结构腺病毒基因中产生其他缺失。以上缺失可单独使用，例如，用于本发明中的腺病毒序列可仅含有E1缺失。或者，可以以任意组合使用有效地破坏它们的生物活性的整个基因或其部分的缺失。例如，在一个示例性载体中，腺病毒序列可具有： E1基因和E4基因缺失，或E1、E2a和E3基因缺失，或E1和E3基因缺失(例如E1a和E1b中的功能性缺失以及至少部分E3的缺失)，或E1、E2a和E4基因缺失，具有或没有E3缺失，等等。此类缺失可能是这些基因的部分或完全缺失，并且可能与其他突变（例如温度敏感突变）组合使用以实现所需结果。

[0068] 使用本领域技术人员已知的技术制备这些载体。这样的技术包括常规cDNA克隆技术（如在教科书中描述的那些）、腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列的使用、聚合酶链式反应，和提供期望的核苷酸序列的任何合适方法。特别合适的方法包括标准同源重组方法，例如Colloca 等人 (2012) Sci. Transl. Med. 4:1-9；Roy 等人 (2004) Virol.324: 361-372；Roy 等人 (2010) J. of Gene Med. 13:17-25；和WO2010/085984中提供的那些或Warming 等人 Nuc. Acids Res. (2005) 33:e36中描述的重组方法。

[0069] 腺病毒载体生产可以在任何合适的细胞系（所述病毒在其中能够复制）中生产腺病毒载体。具体地，可以使用互补细胞系，其提供了从所述病毒载体缺失的因素，这些缺失的因素导致其受损的复制特性（如E1）。不受限制地，此类细胞系可以是HeLa (ATCC登录号CCL 2)、A549 (ATCC登录号CCL 185)、HEK 293、KB (CCL 17)、Detroit (例如，Detroit 510, CCL 72) 和WI-38 (CCL 75)细胞等等。这些细胞系均可得自美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA。其他合适的亲代细胞系可得自其他来源，例如PGK-E1成视网膜细胞，例如，PER.C6™ 细胞，例如以ECACC号96022940保藏在应用微生物学与研究中心(CAMR, UK)的欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)的细胞所示，或Her 96 细胞(Crucell)。

[0070] 在许多情况下，表达病毒的复制和感染性所必需的一种或多种缺失基因(如人E1)的细胞系可以用于反式互补(transcomplement)黑猩猩腺病毒载体。这是特别有利的，因为，由于本发明的黑猩猩腺病毒序列和在目前可得到的包装细胞中发现的人腺病毒序列之间的多样性，当前的含有人E1的细胞的使用会阻止在复制和生产过程中产生复制型的腺病毒。

[0071] 或者，如果需要的话，可以利用本文中提供的序列来产生包装细胞或细胞系，其在选定的亲代细胞系中用于表达的启动子的转录控制下最少表达来自ChAd155的E1基因。诱导型或组成型启动子可以用于此目的。这样的启动子的实例详细描述在该文件的别处。选择亲代细胞用于产生表达任何期望的ChAd155基因的新细胞系。不受限制地，这样的亲代细胞系可以是HeLa [ATCC登录号CCL 2]、A549 [ATCC登录号CCL 185]、HEK 293、KB [CCL 17]、Detroit [例如，Detroit 510、CCL 72]和WI-38 [CCL 75]细胞，等等。这些细胞系都可得自美国典型培养物保藏中心, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia
20110-2209, USA。

[0072] 这样的表达E1的细胞系可用于产生重组腺病毒E1缺失的载体。另外或可选地，可以使用与在重组病毒载体的产生中所用的程序基本上相同的程序构建表达一种或多种腺病毒基因产物(例如，E1A、E1B、E2A、E3和/或E4)的细胞系。这样的细胞系可以用于反式互补(transcomplement)编码那些产物的必需基因有缺失的腺病毒载体，或提供辅助依赖性病毒(例如，腺伴随病毒)的包装所必需的辅助功能。宿主细胞的制备涉及技术例如选择的DNA序列的组装。

[0073] 在实施方案中，必需的腺病毒基因产物由腺病毒载体和/或辅助病毒以反式提供。在这样的实例中，合适的宿主细胞可以选自任何生物，包括原核(例如，细菌)细胞和真核细胞，包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。

[0074] 宿主细胞可以选自任何哺乳动物物种，包括但不限于，细胞如A549、WEHI、3T3、10ΊΊ/2、HEK 293细胞或Per.C6 (它们中的后二者表达功能性腺病毒E1)、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2和源自哺乳动物(包括人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠)的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。

[0075] 特别合适的互补细胞系是Procell92细胞系。Procell 92细胞系是基于表达腺病毒E1基因(在人磷酸甘油酸激酶-1 (PGK)启动子的控制下用Tet阻遏物转染)和G418-抗性基因的HEK 293细胞(Vitelli 等人 PLOS One (2013) 8(e55435):1-9）。Procell92.S适合于在悬浮条件中生长，且可用于产生表达毒性蛋白的腺病毒载体(www.okairos.com/e/inners.php m=00084, 最后一次登录在2015年4月13日)。

[0076] 腺病毒递送方法和剂量腺病毒载体可以以免疫原性组合物施用。如本文中所述的免疫原性组合物是包含一种或多种重组载体的组合物，所述重组载体能够在递送给哺乳动物(适当地为人)以后诱导针对由所述载体递送的转基因产物的免疫应答，例如体液(例如，抗体)和/或细胞介导的(例如，细胞毒性的T细胞)应答。重组腺病毒可以包含(适当地在它的基因缺失中的任一个中)编码期望的免疫原的基因，且因此可以用在疫苗中。重组腺病毒可用作针对任何病原体的预防性或治疗性疫苗，对于所述病原体，对诱导免疫应答至关重要的抗原能够限制病原体的扩散并且对于所述病原体可获得cDNA。

[0077] 可以在合适的递送媒介物中配制这样的疫苗或其他免疫原性组合物。可以监测选择的基因的免疫水平以确定对强化的需要(如果有的话)。在评估血清中的抗体滴度以后，可以期望任选的强化免疫。

[0078] 任选地，可以将本发明的疫苗或免疫原性组合物配制成含有其他组分，包括例如，佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。在下面在“佐剂”下提供了合适的佐剂的实例。这样的佐剂可以与编码抗原的引发DNA疫苗一起施用，以与用编码仅抗原的DNA疫苗引发后产生的免疫应答相比增强抗原特异性的免疫应答。或者，这种佐剂可以与多肽抗原一起施用，所述多肽抗原以涉及本发明载体的施用方案施用。

[0079] 可以如下制备用于施用的腺病毒载体：悬浮或溶解于药学上或生理上可接受的载体例如等渗盐水、等渗盐、溶液或本领域技术人员将显而易见的其他制剂。适当的载体是本领域技术人员显而易见的，且很大程度上取决于施用途径。使用可生物降解的生物相容的聚合物，或通过使用胶束、凝胶和脂质体的现场递送，可以在持续释放制剂中将本文描述的组合物施用给哺乳动物。

[0080] 在一些实施方案中，通过肌内注射、静脉内注射、腹膜内注射、皮下注射、表皮施用、皮内施用、透皮施用、阴道内施用、鼻内施用、直肠施用或口腔施用将本发明的重组腺病毒施用于主体。

[0081] 如果治疗方案涉及共同施用一种或多种腺病毒载体和另外的组分，则将每种组分配制在不同的组合物中，它们有利地在相同位点或相同位点附近共位置施用。例如，可以将组分（例如通过选自肌内、透皮、皮内、皮下的施用途径）施用至同一侧或肢体（“同侧”施用）或相对侧或肢体（“对侧”施用）。

[0082] 病毒载体的剂量主要取决于诸如所治疗的病况、所治疗病况的严重程度和患者的年龄、体重和健康等因素，因此可能因患者而异。例如，病毒载体的治疗有效成人剂量通常含有1×105至1×1015个病毒颗粒，例如从1×108至1x1012（例如，1x108、5x108、1x109、5x109、10 10 10 11 11 12 5
1x10 、2.5x10 、5x10 、1x10 5x10 或1x10 个颗粒）。或者，病毒载体可以以通常1x10至1x1010噬斑形成单位（PFU），例如1x105 PFU、5x105 PFU、1x106 PFU、5x106 PFU、1x107 PFU、5x107 PFU、1x108 PFU、5x108 PFU、1x109 PFU、5x109 PFU或1x1010 PFU的剂量施用。剂量将随主体的大小和施用途径而变化。例如，对于单个位点，用于肌内注射的合适的人剂量(对于约80 kg主体)是在约1x105至约5x1012个颗粒/ml的范围内。任选地，可以使用多个施用位点。在另一个实例中，对于口服制剂，合适的人或兽医学剂量可以是在1x107至约1x1015个颗粒的范围内。

[0083] 可以例如使用基于CMV启动子区域设计的引物和探针，使用含有载体基因组（其含有包括人CMV (hCMV)启动子的表达盒）的质粒DNA的系列稀释物作为标准曲线，通过定量PCR分析(Q-PCR)定量腺病毒载体。通过平行线分析方法确定测试样品中的拷贝数。用于载体颗粒定量的替代方法包括基于A260nm的分析型HPLC或分光光度法。

[0084] 免疫有效量的核酸可适当地在1ng至100mg之间。例如，合适的量可以是1μg至100mg。“免疫有效量”是指向主体施用该量对于在主体中诱导针对狂犬病病毒的可测量的免疫应答是有效的。

[0085] 本领域技术人员可以容易地确定特定核酸(例如，载体)的适当量。

[0086] 核酸组分的示例性有效量可以是在1 ng至100µg之间，例如在1 ng至1 µg之间(例如，100 ng-1 µg)，或在1µg至100µg之间，如10 ng、50 ng、100 ng、150 ng、200 ng、250 ng、500 ng、750 ng或1µg。核酸的有效量还可以包括1 µg至500µg，例如1µg至200µg之间，例如
10-100µg之间，例如1µg、2µg、5µg、10µg、20µg、50µg、75µg、100µg、150µg或200µg。或者，核酸的示例性有效量可以是在100µg至1 mg之间，例如100µg至500µg之间，例如，100 µg、150 µg、200 µg、250 µg、300 µg、400 µg、500 µg、600 µg、700 µg、800 µg、900 µg或1 mg。

[0087] 通常，人剂量的体积为0.1ml至2ml，例如0.5ml和2ml。因而，可以将本文描述的组合物配制在例如0.1、0.25、0.5、1.0、1.5或2.0 ml人剂量/单一或组合免疫原性组分的体积中。

[0088] 本领域技术人员可以调节这些剂量，这取决于施用途径和采用重组载体的治疗或疫苗应用。可以监测转基因的表达水平，或对于佐剂而言，监测循环抗体的水平，以确定剂量施用的频率。

[0089] 如果使用一个或多个引发和/或强化步骤，那么该步骤可以包括每小时、每天、每周或每月或每年施用的单剂量。作为实例，哺乳动物可以接受含有在载体中约10 μg至约50 μg质粒的一个或两个剂量。期望地基于哺乳动物的身份和状况选择递送的量或位点。

[0090] 可以监测由选定的转基因编码的蛋白的治疗水平或针对所述蛋白的免疫应答的水平，以确定对强化的需要（如果有的话）。在评估血清中的CD8+ T细胞应答或任选的抗体滴度以后，可能期望任选的强化免疫。任选地，可以在单次施用中或在多种组合方案例如与涉及其他活性成分的方案或疗程组合或在引发-强化方案中递送腺病毒载体。

[0091] 重组腺病毒或包含多肽序列的组合物适当地，本发明的多核苷酸是重组的。重组意味着所述多核苷酸是克隆、限制或连接步骤或产生不同于在自然界中发现的多核苷酸的多核苷酸的其他程序中的至少一者的产物。
重组腺病毒是包含重组多核苷酸的腺病毒。重组载体是包含重组多核苷酸的载体。“重组病毒”包括原始重组病毒的后代。“重组载体”包括原始重组载体的重复。“重组多核苷酸”包括原始重组多核苷酸的重复。

[0092] 多肽的"功能衍生物"适当地是指多肽的经修饰形式，例如其中所述多肽的一个或多个氨基酸可以被缺失、插入、修饰和/或取代。例如，在以下情况下，认为未修饰的腺病毒衣壳蛋白的衍生物是有功能的：(a) 与包含未修饰的衣壳蛋白的腺病毒相比，在其衣壳内包含衍生衣壳蛋白的腺病毒保持基本上相同或更低的血清阳性率，和/或
(b) 与包含未修饰的衣壳蛋白的腺病毒相比，在其衣壳内包含衍生衣壳蛋白的腺病毒保持基本上相同或更高的宿主细胞感染性，和/或
(c) 与包含未修饰的衣壳蛋白的腺病毒相比，在其衣壳内包含衍生衣壳蛋白的腺病毒保持基本上相同或更高的免疫原性，和/或
(d) 与包含未修饰的衣壳蛋白的腺病毒相比，在其衣壳内包含衍生衣壳蛋白的腺病毒保持基本上相同或更高的转基因生产力水平。

[0093] 本发明的重组腺病毒或组合物适当地包含具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。适当地，本发明的重组腺病毒或组合物包含这样的多肽：其为具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。适当地，具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性、例如至少85.0%同一性、例如至少90%同一性、例如至少91.0%同一性、例如至少
93.0%同一性、例如至少95.0%同一性、例如至少97.0%同一性、例如至少98.0%同一性、例如至少99.0%同一性、例如至少99.2%同一性、例如至少99.4%同一性、例如99.5%同一性、例如至少99.6%同一性、例如至少99.8%同一性、例如99.9%同一性的氨基酸序列。或者，所述功能衍生物相对于SEQ ID NO:1具有不超过130个、更适当地不超过120个、更适当地不超过110个、更适当地不超过100个、更适当地不超过90个、更适当地不超过80个、更适当地不超过70个、更适当地不超过60个、更适当地不超过50个、更适当地不超过40个、更适当地不超过30个、更适当地不超过20个、更适当地不超过10个、更适当地不超过5个、更适当地不超过4个、更适当地不超过3个、更适当地不超过2个并且更适当地不超过1个添加、缺失和/或取代。

[0094] 根据本发明的重组腺病毒或组合物适当地还包含：(a) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；或
(b) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少50.0%同一性的氨基酸序列，和/或
(a) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或
(b) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列。

[0095] 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的功能衍生物适当地具有这样的氨基酸序列：其在其整个长度上与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少60.0%、例如至少70.0%、例如至少80.0%、例如至少85.0%、例如至少90.0%、例如至少91.0% 同一性、例如至少93.0%同一性、例如至少95.0%同一性、例如至少97.0%同一性、例如至少98.0%同一性、例如至少99.0%、例如至少99.2%、例如至少99.4%、例如99.5% 同一性、例如至少99.6%、例如至少
99.7%同一性、例如至少99.8%同一性、例如99.9%同一性。或者，所述功能衍生物相对于SEQ ID NO:3具有不超过300个、更适当地不超过250个、更适当地不超过200个、更适当地不超过
150个、更适当地不超过125个、更适当地不超过100个、更适当地不超过90个、更适当地不超过80个、更适当地不超过70个、更适当地不超过60个、更适当地不超过50个、更适当地不超过40个、更适当地不超过30个、更适当地不超过20个、更适当地不超过10个、更适当地不超过5个、更适当地不超过4个、更适当地不超过3个、更适当地不超过2个并且更适当地不超过
1个添加、缺失和/或取代。

[0096] 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物适当地具有这样的氨基酸序列：其在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少60.0%、例如至少70.0%、例如至少80.0%、例如至少85.0%、例如至少90.0%、例如至少91.0%同一性、例如至少93.0%同一性、例如至少95.0%同一性、例如至少97.0%同一性、例如至少98.0%同一性、例如至少99.0%、例如至少99.2%、例如至少99.4%、例如99.5%同一性、例如至少99.6%、例如99.7%同一性、例如至少99.8%同一性、例如99.9%同一性。或者，所述功能衍生物相对于SEQ ID NO:5具有不超过500个、更适当地不超过400个、更适当地不超过450个、更适当地不超过300个、更适当地不超过250个、更适当地不超过200个、更适当地不超过150个、更适当地不超过125个、更适当地不超过100个、更适当地不超过90个、更适当地不超过80个、更适当地不超过70个、更适当地不超过60个、更适当地不超过50个、更适当地不超过40个、更适当地不超过30个、更适当地不超过20个、更适当地不超过10个、更适当地不超过5个、更适当地不超过4个、更适当地不超过3个、更适当地不超过2个并且更适当地不超过1个添加、缺失和/或取代。

[0097] 本发明的重组腺病毒或组合物适当地包含具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽。

[0098] 本发明的重组腺病毒或组合物适当地还包含：(a) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；或
(b) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，和/或
(a) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或
(b) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少60%同一性的氨基酸序列。

[0099] 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物适当地具有这样的氨基酸序列：其在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少60.0%同一性、例如至少70.0%同一性、例如至少80.0%同一性、例如至少85.0%同一性、例如至少87.0%同一性、例如至少89.0%同一性、例如至少91.0%同一性、例如至少93.0%同一性、例如至少95.0%同一性、例如至少97.0%同一性、例如至少98.0%同一性、例如至少99.0%同一性、例如至少99.2%、例如至少99.4%、例如99.5%同一性、例如至少99.6%、例如至少99.8%同一性、例如99.9%同一性。或者，所述功能衍生物相对于SEQ ID NO:1具有不超过130个、更适当地不超过120个、更适当地不超过110个、更适当地不超过100个、更适当地不超过90个、更适当地不超过80个、更适当地不超过70个、更适当地不超过60个、更适当地不超过50个、更适当地不超过40个、更适当地不超过30个、更适当地不超过20个、更适当地不超过10个、更适当地不超过5个、更适当地不超过4个、更适当地不超过3个、更适当地不超过2个并且更适当地不超过1个添加、缺失和/或取代。

[0100] 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物适当地具有这样的氨基酸序列：其在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少60.0%、例如至少70.0%、例如至少80.0%、例如至少85.0%、例如至少90.0%、例如至少95.0%、例如至少97.0%、例如至少99.0%、例如至少99.0%、例如至少99.2%、例如至少99.4%、例如99.5%同一性、例如至少99.6%、例如至少99.8%同一性、例如99.9%同一性。或者，所述功能衍生物相对于SEQ ID NO:
5具有不超过500个、更适当地不超过400个、更适当地不超过450个、更适当地不超过300个、更适当地不超过250个、更适当地不超过200个、更适当地不超过150个、更适当地不超过125个、更适当地不超过100个、更适当地不超过90个、更适当地不超过80个、更适当地不超过70个、更适当地不超过60个、更适当地不超过50个、更适当地不超过40个、更适当地不超过30个、更适当地不超过20个、更适当地不超过10个、更适当地不超过5个、更适当地不超过4个、更适当地不超过3个、更适当地不超过2个并且更适当地不超过1个添加、缺失和/或取代。

[0101] 本发明的重组腺病毒或组合物适当地包含编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸适当地具有根据SEQ ID NO:2的序列。

[0102] 或者，本发明的重组腺病毒或组合物包含编码具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物的多核苷酸，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物适当地具有这样的氨基酸序列：其在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80%同一性、例如至少85.0%同一性、例如至少90%同一性、例如至少91.0%同一性、例如至少93.0%同一性、例如至少95.0%同一性、例如至少97.0%同一性、例如至少98.0%同一性、例如至少99.0%同一性、例如至少99%同一性、例如至少99.4%同一性、例如至少99.6%同一性或例如至少99.8%同一性。或者，所述功能衍生物相对于SEQ ID NO:1具有不超过130个、更适当地不超过120个、更适当地不超过110个、更适当地不超过100个、更适当地不超过90个、更适当地不超过80个、更适当地不超过70个、更适当地不超过60个、更适当地不超过50个、更适当地不超过40个、更适当地不超过30个、更适当地不超过20个、更适当地不超过10个、更适当地不超过5个、更适当地不超过4个、更适当地不超过3个、更适当地不超过2个并且更适当地不超过1个添加、缺失和/或取代。

[0103] 本发明的重组腺病毒或组合物适当地还包含这样的多核苷酸，其编码：(a) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽；或
(b) 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少50.0%同一性的氨基酸序列，和/或
(a) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或
(b) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列。

[0104] 具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的功能衍生物适当地具有这样的氨基酸序列：其在其整个长度上与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少60.0%、例如至少70.0%、例如至少80.0%、例如至少85.0%、例如至少90.0%、例如至少91.0%同一性、例如至少93.0%同一性、例如至少95.0%同一性、例如至少97.0%同一性、例如至少98.0%同一性、例如至少99.0%、例如至少99%、例如至少99.4%、例如至少99.6%、例如至少99.8%同一性。或者，所述功能衍生物相对于SEQ ID NO:3具有不超过300个、更适当地不超过250个、更适当地不超过
200个、更适当地不超过150个、更适当地不超过125个、更适当地不超过100个、更适当地不超过90个、更适当地不超过80个、更适当地不超过70个、更适当地不超过60个、更适当地不超过50个、更适当地不超过40个、更适当地不超过30个、更适当地不超过20个、更适当地不超过10个、更适当地不超过5个、更适当地不超过4个、更适当地不超过3个、更适当地不超过
2个并且更适当地不超过1个添加、缺失和/或取代。

[0105] 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物适当地具有这样的氨基酸序列：其在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少60.0%、例如至少70.0%、例如至少80.0%、例如至少85.0%、例如至少90.0%、例如至少95.0%、例如至少97.0%、例如至少98.0%、例如至少99.0%、例如至少99.2%、例如至少99.4%、例如99.5%同一性、例如至少99.6%、例如99.7%同一性、例如至少99.8%同一性、例如99.9%同一性。或者，所述功能衍生物相对于SEQ ID NO:5具有不超过500个、更适当地不超过400个、更适当地不超过450个、更适当地不超过300个、更适当地不超过250个、更适当地不超过200个、更适当地不超过150个、更适当地不超过125个、更适当地不超过100个、更适当地不超过90个、更适当地不超过80个、更适当地不超过70个、更适当地不超过60个、更适当地不超过50个、更适当地不超过40个、更适当地不超过30个、更适当地不超过20个、更适当地不超过10个、更适当地不超过5个、更适当地不超过4个、更适当地不超过3个、更适当地不超过2个并且更适当地不超过1个添加、缺失和/或取代。

[0106] 本发明的重组腺病毒或组合物适当地包含编码具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸适当地具有根据SEQ ID NO:4的序列。

[0107] 本发明的重组腺病毒或组合物适当地还包含这样的多核苷酸，其编码：(a) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽；或
(b) 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列，和/或
(a) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；或
(b) 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物，其中所述功能衍生物具有在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列。

[0108] 具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的功能衍生物适当地具有这样的氨基酸序列：其在其整个长度上与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少60.0%同一性、例如至少70.0%同一性、例如至少80.0%同一性、例如至少85.0%同一性、例如至少87.0%同一性、例如至少89.0%同一性、例如至少91.0%同一性、例如至少93.0%同一性、例如至少95.0%同一性、例如至少97.0%同一性、例如至少98.0%同一性、例如至少99.0%、例如至少99.2%、例如至少
99.4%、例如99.5%同一性、例如至少99.6%、例如99.7%同一性、例如至少99.8%同一性、例如
99.9%同一性。或者，所述功能衍生物相对于SEQ ID NO:1具有不超过130个、更适当地不超过120个、更适当地不超过110个、更适当地不超过100个、更适当地不超过90个、更适当地不超过80个、更适当地不超过70个、更适当地不超过60个、更适当地不超过50个、更适当地不超过40个、更适当地不超过30个、更适当地不超过20个、更适当地不超过10个、更适当地不超过5个、更适当地不超过4个、更适当地不超过3个、更适当地不超过2个并且更适当地不超过1个添加、缺失和/或取代。

[0109] 具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的功能衍生物适当地具有这样的氨基酸序列：其在其整个长度上与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少60.0%、例如至少70.0%、例如至少80.0%、例如至少85.0%、例如至少90.0%、例如至少95.0%、例如至少97.0%、例如至少98.0%、例如至少99.0%、例如至少99.2%、例如至少99.4%、例如99.5%同一性、例如至少99.6%、例如99.7%同一性、例如至少99.8%同一性、例如99.9%同一性。或者，所述功能衍生物相对于SEQ ID NO:5具有不超过500个、更适当地不超过400个、更适当地不超过450个、更适当地不超过300个、更适当地不超过250个、更适当地不超过200个、更适当地不超过150个、更适当地不超过125个、更适当地不超过100个、更适当地不超过90个、更适当地不超过80个、更适当地不超过70个、更适当地不超过60个、更适当地不超过50个、更适当地不超过40个、更适当地不超过30个、更适当地不超过20个、更适当地不超过10个、更适当地不超过5个、更适当地不超过4个、更适当地不超过3个、更适当地不超过2个并且更适当地不超过1个添加、缺失和/或取代。

[0110] ChAd155主链本申请描述了黑猩猩腺病毒ChAd155的分离的多核苷酸序列，其包括野生型未修饰的ChAd155的分离的多核苷酸序列(SEQ ID NO:10)和ChAd155的经修饰的主链构建体。这些修饰的主链构建体包括ChAd155#1434 (SEQ ID NO: 7)、ChAd155#1390 (SEQ ID NO: 8)和ChAd155#1375 (SEQ ID NO: 9)。ChAd155主链可以用于构建复制型的或复制缺陷型的重组腺病毒用于递送转基因。

[0111] 术语“构建体”是指编码本文所述多肽序列的核酸，并且可包含DNA或非天然存在的核酸单体。

[0112] 术语“复制型”腺病毒表示在没有细胞所包含的任何重组辅助蛋白存在下可以在所述宿主细胞中复制的腺病毒。适当地，“复制型”腺病毒包含以下完整或功能性必需早期基因：E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4。从特定动物分离的野生型腺病毒在该动物中将是复制型的。

[0113] 术语"复制缺陷型"或"复制缺陷的"腺病毒表示不能复制的腺病毒，因为它已经被工程改造成至少包含功能缺失(或"功能丧失"突变)，即在不将基因完全除去的情况下损害该基因的功能的缺失或突变，例如人工终止密码子的引入、活性位点或相互作用结构域的缺失或突变、基因的调节序列等的突变或缺失，或编码病毒复制所必需的基因产物的基因的完全除去，例如选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4 (例如E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2和/或E4 ORF1)的腺病毒基因中的一个或多个。特别适当地E1和任选地E3和/或E4是缺失的。如果缺失的话，当确定相对于另一个序列的%同一性时，适当地将在比对中不考虑前述缺失的基因区域。

[0114] 本发明的序列可用作治疗剂和用于构建多种载体系统、重组腺病毒和宿主细胞。适当地，术语"载体"是指相对于野生型序列已经实质上改变(例如，已经缺失和/或失活的基因或功能区域)和/或掺入了异源序列的核酸，即，获得自不同来源(也称为"插入物")且在引入细胞(例如，宿主细胞)中时复制和/或表达插入的多核苷酸序列的核酸。例如，所述插入物可以是本文描述的ChAd155序列的全部或部分。另外或可选地，ChAd155载体可以是包含病毒基因（例如E1或本文描述的其他病毒基因或功能区域）的一个或多个缺失或失活的ChAd155腺病毒。这样的ChAd155(其可以包含或不包含异源序列)经常被称作"主链"，且可以原样使用或作为对载体的另外修饰的起始点使用。

[0115] 下面提供了ChAd155野生型序列(SEQ ID NO:10)序列的注解。

[0116] 序列同一性关于序列的同一性在本文中定义为，在比对序列并按需要引入空位以达到最大序列同一性百分比，并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分以后与参照氨基酸序列相同的候选序列中的氨基酸残基的百分比。

[0117] 序列同一性可以通过标准方法确定，所述标准方法通常用于比较两个多肽的氨基酸位置的相似性。使用如BLAST或FASTA的计算机程序，比对两个多肽以使它们各自的氨基酸最佳匹配（沿着一个或两个序列的全长或沿着一个或两个序列的预定部分）。程序提供默认开放罚分和默认空位罚分，以及如PAM 250的评分矩阵（标准评分矩阵可以与计算机程序一起使用。例如，百分比同一性可以计算为相同匹配的总数乘以100，然后除以匹配范围内较长序列的长度和引入较短序列中以便比对两个序列的空位数之和。

[0118] 在本公开通过参考UniProt或Genbank登录码指代序列的情况下，所指的序列是截至本申请的提交日期的当前版本。

[0119] 技术人员会认识到，改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对蛋白的个别取代、缺失或添加是这样的"免疫原性衍生物"，其中所述改变导致在功能上类似的氨基酸对氨基酸的取代或者不会实质上影响免疫原性功能的残基的取代/缺失/添加。

[0120] 提供在功能上类似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。一般而言，这样的保守取代将落入下文详细说明的氨基酸分组之一中，尽管在一些情况下，其他取代也会是可能的，而不实质上影响所述抗原的免疫原性特性。以下八组各自含有通常彼此保守取代的氨基酸：1) 丙氨酸 (A), 甘氨酸 (G)；
2) 天冬氨酸 (D), 谷氨酸 (E)；
3) 天冬酰胺 (N), 谷氨酰胺 (Q)；
4) 精氨酸 (R), 赖氨酸 (K)；
5) 异亮氨酸 (I), 亮氨酸 (L), 甲硫氨酸 (M), 缬氨酸 (V)；
6) 苯丙氨酸 (F), 酪氨酸 (Y), 色氨酸 (W)；
7) 丝氨酸 (S), 苏氨酸 (T)；和
8) 半胱氨酸 (C), 甲硫氨酸 (M)。

[0121] 适当地，这样的取代不发生在表位区域，且因此对所述抗原的免疫原性特性不具有显著影响。

[0122] 免疫原性衍生物还可以包括与参照序列相比在其中插入了另外氨基酸的那些。适当地，这样的插入不发生在表位区域，且因此对所述抗原的免疫原性特性不具有显著影响。插入的一个实例包括组氨酸残基的短片段（例如2-6个残基）(SEQ ID NO: 49)以帮助目标抗原的表达和/或纯化。

[0123] 免疫原性衍生物包括与参照序列相比其中已经缺失氨基酸的那些。适当地，这样的缺失不发生在表位区域，且因此对所述抗原的免疫原性特性不具有显著影响。

[0124] 技术人员会认识到，特定的免疫原性衍生物可以包含取代、缺失和添加(或它们的任意组合)。

[0125] 狂犬病毒抗原和疫苗狂犬病病毒属是弹状病毒科的一个属，是具有单链反义RNA基因组的包膜病毒。RNA以核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和病毒RNA聚合酶（L）的顺序编码五种结构蛋白。P蛋白是核糖核蛋白的结构组分，并且在病毒颗粒的形成和病毒RNA合成中起作用。G蛋白被认为在病毒致病性和保护性免疫中很重要；它是保护性中和抗体的主要靶标。狂犬病病毒是一种嗜神经病毒，其通过中枢神经系统传播，导致大脑和脊髓的严重炎症。

[0126] 狂犬病病毒属包含七种基因型，其中以下六种已经与人狂犬病病例有关：狂犬病病毒（RABV，基因型1）、莫科拉病毒（基因型3）、杜文海格病毒（基因型4）、欧洲蝙蝠狂犬病病毒（基因型5）、欧洲蝙蝠狂犬病病毒 2（基因型6）和澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒（基因型7）（Jackson (2016) Curr Infec Dis Rep 18:38）。一旦出现症状，狂犬病几乎百分之百致命。

[0127] 已经在多种狂犬病病毒毒株中鉴定了存在于狂犬病G蛋白上的抗原表位。它们被划分为位点I、位点IIa、位点IIb、位点III、位点IV和位点a并被列于表1。该表以出现顺序分别公开了作为SEQ ID NOS 50-63的'位点 II b'序列，作为SEQ ID NOS 64-77的'位点I'序列，和作为SEQ ID NOS 78-91的'位点III'序列。

[0128] 表1 狂犬病G蛋白抗原表位

[0129] 在图1中显示了存在于对应于SEQ ID NO：37的狂犬病G蛋白上的抗原表位。抗原位点I携带构象和线性表位，并且位于氨基酸残基226-231。抗原位点II是残基34-42（IIb）和198-200（IIa）处的不连续构象表位。抗原位点III是残基330-338处的连续构象表位。抗原位点IV位于残基263-264处。抗原位点a位于残基342-343处。

[0130] 狂犬病疫苗目前主要用于暴露后预防，只有一小部分狂犬病疫苗剂量用于暴露前预防。干预时间表由世界卫生组织根据病毒进入的伤口的严重性和类型来定义，并且可以包括用抗狂犬病免疫球蛋白的额外治疗。暴露前预防通常涉及2至3次肌内剂量的2-3次随访，及根据暴露风险定时加强。暴露后预防通常涉及4-5次肌内剂量的3-5次随访或4次皮内剂量的4次随访。在一些欠发达国家，仍然通过在受感染动物的大脑中繁殖狂犬病病毒，灭活病毒并且提供每天皮下给予的14-21次注射到腹壁来进行免疫接种。

[0131] 目前有几种狂犬病疫苗可用于人体暴露前和暴露后预防。IMOVAX (Sanofi Pasteur)作为从Wistar Institute获得的毒株PM-1503-3M制备的冷冻干燥的狂犬病病毒而提供。其从感染的人二倍体细胞收获然后灭活。暴露前和暴露后预防由在第0、7和21或28天肌内施用三次剂量组成。VERORAB (Sanofi Pasteur)作为从Wistar Institute获得的毒株PM/WI 38 1503-3M制备的冷冻干燥的狂犬病病毒提供。从Vero细胞收获然后灭活。暴露前预防由在第0、7和21或28天肌内施用三次剂量组成。暴露后预防由在第0、3、7、14和28天肌内施用五次剂量组成。VAXIRAB/ LYSSAVAC (Zydus Cadila/ Novavax)作为由狂犬病病毒的Pitman Moore毒株制备的冷冻干燥的狂犬病病毒提供。它在鸭胚细胞中产生然后灭活。暴露前预防由在第0、7和21或28天肌内施用三次剂量组成。暴露后预防由在第0、3、7、14和28天肌内施用五次剂量组成。暴露后预防也可以皮内施用，在第0、3、7和28天在两个部位的每一个处注射。RABIPUR/ RABAVERT (GSK)作为从Flury LEP（低胚传代）毒株制备的冷冻干燥的狂犬病病毒提供。它在鸡成纤维细胞的原代培养物中生长，然后灭活。暴露前预防由在第0、7和21或28天肌内施用三次剂量组成。暴露后预防由在第0、3、7、14和28天肌内施用五次剂量组成。

[0132] 在文献中已经报道了腺病毒载体的（adeno-vectored）狂犬病疫苗的支持性临床前证据。腺病毒重组病毒载体SAdV24，也称为AdC68或ChAd68，被修饰为复制缺陷并且表达狂犬病的Evelyn Rokitniki Abelseth（ERA）毒株的全长糖蛋白（G），当在狂犬病攻击之前给予时，在食蟹猴中显示出一定程度的免疫原性，但在狂犬病暴露后没有提供可靠的保护（Xiang 等人 (2014) Virol. 450-451:243-249)。肌内给予的表达Evelyn Rokitniki Abelseth（ERA）狂犬病毒株的全长糖蛋白（G）的类似复制缺陷型ChAd68载体针对狂犬病攻击诱导一定程度的保护作用（Zhou 等人 (2006) Mol. Ther. 14:662-672；部分再现于图16)。

[0133] 佐剂如本文中使用的"佐剂"是指增强对免疫原的免疫应答的组合物。包含佐剂的根据本发明的组合物可以用作疫苗，例如用于人类主体。与单独施用抗原相比，佐剂加速、延长和/或增强对抗原/免疫原的免疫应答的质量和/或强度，因此，减少任何给定疫苗中必需的抗原/免疫原的量，和/或所必需的注射频率以对目标抗原/免疫原产生足够的免疫应答。

[0134] 可用于本发明组合物背景中的佐剂的实例包括无机佐剂（例如无机金属盐，例如磷酸铝或氢氧化铝）、氢氧化铝（明矾）的凝胶状沉淀物；AlPO4；铝胶；来自革兰氏阴性细菌外膜的细菌产物，特别是单磷酰脂质A（MPLA）、脂多糖（LPS）、胞壁酰二肽及其衍生物；弗氏不完全佐剂；脂质体，特别是中性脂质体，含有该组合物和任选细胞因子的脂质体；AS01B、AS01E、AS02；非离子嵌段共聚物；ISCOMATRIX佐剂；包含CpG二核苷酸（CpG基序）的未甲基化DNA，特别是具有硫代磷酸酯（PTO）骨架（CpG PTO ODN）或磷酸二酯（PO）骨架（CpG PO ODN）的CpG ODN；合成的脂肽衍生物，特别是Pam3Cys；脂阿拉伯甘露聚糖；肽聚糖；酵母聚糖；热休克蛋白（HSP），特别是HSP 70；dsRNA及其合成衍生物，特别是Poly I：poly C；聚阳离子肽，特别是聚-L-精氨酸；紫杉醇；纤连蛋白；鞭毛蛋白；咪唑并喹啉；具有佐剂活性的细胞因子，特别是GM-CSF、白细胞介素（IL-1）2、IL-6、IL-7、IL-18、I型和II型干扰素，特别是干扰素-γ（IFN-γ）、TNF- α；25-二羟基维生素D3（骨化三醇）；和合成的寡肽，特别是MHCII呈递的肽。含有聚氧乙烯（POE）和聚氧丙烯（POP）的非离子嵌段聚合物，例如POE-POP-POE嵌段共聚物可用作佐剂。

[0135] 佐剂的其他实例包括无机佐剂（例如无机金属盐，例如磷酸铝或氢氧化铝）、有机佐剂（例如皂苷，例如QS21或角鲨烯）、油基佐剂（例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂）、细胞因子（例如IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和INF-γ）颗粒佐剂（例如免疫刺激复合物（ISCOMS）、脂质体、可生物降解的微球、病毒体，细菌佐剂（例如单磷酰脂质A，例如3-脱-O-酰化单磷酰脂质A（3D-MPL）或胞壁酰肽）、合成佐剂（例如单磷酰脂质A（MPL），特别是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A（3D-MPL和胞壁酰肽类似物，或合成的脂质A，和合成的多核苷酸佐剂，例如聚精氨酸或聚赖氨酸。

[0136] 皂苷也是合适的佐剂，例如，源自南美树皂树Molina的树皮的皂苷Quil A及其级分。Quil A的纯化级分也称为免疫刺激剂，如角鲨烯、QS21、QS17和QS7、Quil-A的非溶血性级分。QS21和聚山梨醇酯或环糊精的组合也是合适的。

[0137] 佐剂的另一个实例是免疫刺激寡核苷酸，其含有DNA中存在的未甲基化的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序（“CpG”）。当通过全身和粘膜途径施用时，CpG被称为佐剂。当配制成疫苗时，它可以与游离抗原一起在游离溶液中施用或与抗原共价缀合或与载体如氢氧化铝一起配制。

[0138] 特异性受体的活化可以刺激免疫应答。这些受体是本领域技术人员已知的，并且包括，例如，细胞因子受体，特别是I型细胞因子受体、II型细胞因子受体、TNF受体；和作为转录因子的维生素D受体；和Toll样受体1（TLR1）、TLR-2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7和TLR9。这些受体的激动剂具有佐剂活性，即是免疫刺激性的。其他合适的佐剂包括烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯（AGP）或AGP的药学上可接受的盐。一些AGP是TLR4激动剂，而一些是TLR4拮抗剂。本发明组合物的佐剂可以是一种或多种Toll样受体激动剂。在更优选的实施方案中，佐剂是Toll样受体4激动剂。在特别优选的实施方案中，佐剂是Toll样受体9激动剂。

[0139] 佐剂如上述的那些可以与载体如脂质体、水包油乳剂和/或金属盐(包括铝盐如氢氧化铝)一起配制。例如，3D-MPL可以用氢氧化铝或水包油乳剂配制；QS21可以与含胆固醇的脂质体、水包油乳剂或明矾配制；CpG可以与明矾或其他阳离子载体配制。

[0140] 佐剂的组合可用于本发明，特别是单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，更特别是QS21和3D-MPL的组合或其中QS21在含胆固醇的脂质体中淬灭的组合物（DQ）。或者，CpG加皂苷如QS21的组合是适用于本发明的佐剂，如同在水包油乳剂中涉及QS21、3D-MPL和生育酚的有效佐剂制剂。可以将皂苷佐剂配制在脂质体中，并与免疫刺激的寡核苷酸组合。因此，合适的佐剂系统包括，例如，单磷酰脂质A，优选3D-MPL与铝盐的组合。另一种示例性的佐剂包含QS21和/或MPL和/或CpG。QS21可以在含胆固醇的脂质体中淬灭。

[0141] 如果与腺病毒一起施用，则恒定链与由用于疫苗接种的表达系统所包含的抗原的融合增加了针对所述抗原的免疫应答。因此，在本发明的一个实施方案中，免疫原性的转基因可以与重组ChAd155病毒载体中的恒定链共表达。

[0142] 在另一个实施方案中，本发明提供了通过将ChAd155衣壳递送给主体的ChAd155的衣壳(任选地使用完整或重组病毒颗粒或空衣壳)诱导免疫调节应答或增强或辅助对另一种活性剂的细胞毒性T细胞应答的用途。可以将ChAd155衣壳单独递送，或在组合方案中与活性剂一起递送以增强对其的免疫应答。有利地，在不用腺病毒感染宿主的情况下，可以实现期望的效应。

[0143] 一般原则除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语具有如本公开内容所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。单数术语"一种"、"一个"和"所述/该"包括复数指示对象，除非上下文清楚地另外指示。类似地，词语"或"意在包括"和"，除非上下文清楚地另外指示。术语"复数"是指两个/种或更多。另外，关于物质的浓度或水平（例如溶液组分浓度或其比率）和反应条件（例如温度、压力和循环时间）给出的数值限制旨在是近似的。本文使用的术语“约”意指量±10％。

[0144] 将参考以下非限制性实施例和附图进一步描述本发明。实施例

[0145] 实施例1：ChAd155的分离使用如Colloca 等人 (2012) Sci. Transl. Med. 4:1-9和WO 2010086189(其为描述腺病毒分离和表征技术的目的通过引用并入本文)中描述的标准程序从 New Iberia Research Center 设施 (New Iberia Research Center, The University of Louisiana at Lafayette)圈养的健康年幼黑猩猩分离野生型黑猩猩腺病毒155型（ChAd155）。

[0146] 实施例2：ChAd155-RG载体构建然后将ChAd155病毒基因组克隆到质粒或BAC载体中，并随后如图3所示进行修饰:
a）病毒基因组的E1区（从bp 449到bp 3529）的缺失；
b）病毒基因组的E4区域（从bp 34731到bp 37449）的缺失；
c）源自人Ad5的E4orf6的插入；和
d）hCMV-RG-WPRE表达盒的插入。

[0147] 2.1： E1区域的缺失：BAC/ChAd155 ΔE1_TetO hCMV RpsL-Kana#1375的构建在用ChAd155病毒DNA和亚组C BAC 穿梭物（#1365）共转化的大肠杆菌菌株BJ5183电穿孔感受态细胞（Stratagene目录号2000154）中通过同源重组将ChAd155病毒基因组克隆到BAC载体中。如图4的示意图所示，亚组C 穿梭物是源自pBeloBAC11 (GenBank U51113, NEB)的BAC载体。它致力于克隆属于物种C的黑猩猩腺病毒，并因此含有pIX基因和来自物种C ChAd病毒的右端和左端（包括右和左ITR）的DNA片段。

[0148] 物种C BAC 穿梭物还含有插入左端和pIX基因之间的RpsL-Kana盒。另外，侧翼为ISceI限制性位点的Amp-LacZ-SacB选择盒存在于pIX基因和病毒基因组的右端之间。特别地，BAC 穿梭物包括以下特征：左ITR：bp 27至139，hCMV（tetO）RpsL-Kana盒：bp 493至3396，pIX基因：bp 3508至3972，ISceI限制性位点：bp 3990和7481，Amp-LacZ-SacB选择盒：
bp 4000至7471，右ITR：bp 7805至7917。

[0149] 用ChAd155纯化的病毒DNA和经ISceI限制酶消化的亚组C BAC 穿梭物载体通过电穿孔共转化BJ5183细胞，然后凝胶纯化。在pIX基因和右ITR序列（存在于物种C BAC 穿梭物线性化DNA的末端）之间发生的同源重组和ChAd155病毒DNA中存在的同源序列导致ChAd155病毒基因组DNA插入BAC穿梭载体中。同时，缺失病毒E1区并用RpsL-Kana盒代替，产生BAC/ChAd155 ΔE1/ TetO hCMV RpsL-Kana#1375。

[0150] 2.2：在大肠杆菌BJ5183中通过同源重组构建质粒2.2.1： E4区的缺失 - pChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (#
1434)的构建
为了提高载体的增殖，通过使用涉及在大肠杆菌中克隆和同源重组的几个步骤的策略用Ad5 E4orf6编码序列替换天然E4区域，在载体主链中引入跨越核苷酸34731-37449（ChAd155野生型序列）的E4区域的缺失。E4编码区完全缺失，而E4天然启动子和多腺苷酸化信号被保留。为此，构建穿梭载体以允许通过在大肠杆菌 BJ5183中同源重组替换ChAd155天然E4区来插入Ad5orf6，如下所述。

[0151] pARS 物种C Ad5E4orf6-1的构建使用Ad5 DNA作为模板，利用寡核苷酸为 5’-ATACGGACTAGTGGAGAAGTACTCGCCTACATG-
3’ (SEQ ID NO: 13)和5’-ATACGGAAGATCTAAGACTTCAGGAAATATGACTAC-3’ (SEQ ID NO:
14)通过PCR获得含有Ad5orf6的DNA片段。用BglII和SpeI消化PCR片段，并克隆到用BglII和SpeI消化的物种 C RLD-EGFP穿梭物中，产生质粒pARS 物种 C Ad5orf6-1。有关穿梭物的详细信息可见于Colloca 等人, Sci. Transl. Med. (2012) 4:115ra2。

[0152] pARS 物种C Ad5E4orf6-2的构建为了缺失E4区域，使用质粒BAC/ChAd155 ΔE1_TetO hCMV RpsL-Kana (#1375)作为模板，利用以下寡核苷酸5’-ATTCAGTGTACAGGCGCGCCAAAGCATGACGCTGTTGATTTGATTC-3’ (SEQ ID NO: 15)和5’-ACTAGGACTAGTTATAAGCTAGAATGGGGCTTTGC-3’ (SEQ ID NO: 16)通过PCR扩增跨越ChAd155 wt序列（SEQ ID NO：10）的bp 34586至bp 34730的177 bp DNA片段。用BsrGI和SpeI消化PCR片段，并克隆到用BsrGI和SpeI消化的pARS 亚组C Ad5orf6-1中，产生质粒pARS 物种C Ad5orf6-2 (#1490)。在图5中提供该穿梭质粒的示意图。特别地，穿梭质粒包含以下特征：左ITR：bp 1至113，物种C第一个460bp：bp 1至460，ChAd155 wt（SEQ ID NO：10的bp 34587至bp 34724）：bp 516至650， Ad5 orf6：bp 680和1561，物种C最后393 bp：bp 1567至1969，右ITR：bp 1857至1969。

[0153] pChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (#1434)的构建然后使用所得质粒pARS 亚组C Ad5orf6-2用Ad5orf6替换ChAd155主链内的E4区。为此，用PacI/PmeI消化质粒BAC/ChAd155 ΔE1_TetO hCMV RpsL-Kana (#1375)，并用消化的质粒pARS 亚组C Ad5orf6-2 BsrGI/AscI共转化到BJ5183细胞中以获得pChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (#1434) 前腺病毒(pre-adeno)质粒。

[0154] 2.2.2： hCMV-RG表达盒的插入 - pChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV-RG#1481的构建通过利用hCMV启动子和BGH polyA序列之间存在的同源性，通过大肠杆菌中的同源重组将hCMV-RG盒克隆到线性化的前腺病毒受体载体中。如图6所示的质粒pvjTetOhCMV_RG_bghpolyA用SpeI、SphI和AsiSI切割以切除含有具有tetO、RG和BGHpolyA序列的hCMV启动子的2.58Kb片段。通过同源重组将得到的2.58Kb片段克隆到携带在HCMV和BGHpA控制下的RpsL-Kana选择盒的pChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV RpsL-Kana (#1434)受体载体中。受体前腺病毒质粒用限制性内切核酸酶SnaBI线性化。得到的构建体是pChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV-RG载体(#1481)（图7)。

[0155] 2.2.3： hCMV-RG-WPRE表达盒的插入- pChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV-RG-WPRE#1509的构建通过利用pChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV-RG载体(#1481)的碱基2840-
2939和3180-3279之间存在的同源性，通过在大肠杆菌中同源重组将WPRE序列克隆到前腺病毒受体载体中。通过PCR扩增1031bp DNA片段，并含有WPRE，BGHpolyA和对应于#1481 pAdeno载体的碱基2840-2939和3180-3279的重组臂。使用质粒pvjTetOhCMV_WPRE_BghPolyA (#1478)作为模板并利用以下寡核苷酸FW 5’-ggaaggtcagcgtgaccagccagtccggcaaagtgatttcctcctgggagagctataaaagcggcggagagaccaggctgtgatgagcggccgcgatctgtaatcaacctctggattaca -3’ (SEQ ID NO: 92)和RW 5’- ATGGCTCCGGCGGTCTCTGCAACACAAATAAAGAGACCCTAAGACCCCCAACTTATATATTTTCATGACCACCCCAGGCCACGCCCACTCACCCACCTCACCATAGAGCCCACCGCATCC-3’ (SEQ ID NO: 93)进行PCR。通过同源重组将得到的1.03 Kb片段克隆到携带hCMV启动子和BGHpA控制下的RG转基因（SEQ ID NO：38）的pChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV-RG载体(#1481)受体载体中。用限制性内切核酸酶AsiSI消化受体前腺病毒质粒。得到的构建体是pChAd155 ΔE1, E4_Ad5E4orf6/TetO hCMV-RG-WPRE载体(#
1509)，如图8所示。

[0156] 实施例3：ChAd155-RG载体产生与Procell 92细胞系中的ChAd3和PanAd3相比，评估ChAd155的生产力。

[0157] 3.1：包含HIV Gag转基因的载体的产生如上所述(ChAd155/GAG) 或之前如对于ChAd3/GAG (Colloca 等人, Sci. Transl. Med. (2012) 4:115ra2)所述制备表达HIV Gag蛋白的载体。在Procell 92中拯救并扩增ChAd3/GAG和ChAd155/GAG直至第3代（P3）；使用P3裂解物感染两个T75烧瓶的用每个载体单层培养的Procell 92细胞。 100vp/细胞的感染复数（MOI）用于两个感染实验。当完全细胞病变效应明显（感染后72小时）时收集感染的细胞并进行合并；通过三个冷冻/解冻循环（-
70°/ 37℃）从感染细胞释放病毒，然后通过离心澄清裂解物。通过定量PCR（QPCR）分析用与CMV启动子区互补的引物和探针定量澄清的裂解物。寡核苷酸序列如下：CMVfor 5’-CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3’ (SEQ ID NO: 23)、CMVrev 5’-
GACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3’ (SEQ ID NO: 24)、CMVFAM-TAMRA探针5’-
ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3’ (SEQ ID NO: 25) (在ABI Prism 7900 Sequence检测仪– Applied Biosystem上运行 QPCR)。在下表2中提供在澄清的裂解物上测量的所得体积滴度（vp/ml）和以病毒颗粒/细胞（vp/细胞）表示的细胞比生产力。

[0158] 表2. 来自P3裂解物的载体生产力

[0159] 为了证实表达HIV Gag转基因的ChAd155载体的较高生产力，使用经纯化的病毒作为接种物进行了第二个实验。为此目的，将Procell 92细胞接种在T25烧瓶中并在细胞汇合为约80%时，使用MOI=100 vp/细胞，用ChAd3/GAG和ChAd155/GAG进行感染。当完全细胞病变效应明显时收集感染的细胞；通过冷冻/解冻从感染的细胞中释放病毒并通过离心澄清。通过使用与CMV启动子区互补的以下引物和探针通过定量PCR分析定量澄清的裂解物：CMVfor 5’-CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3’ (SEQ ID NO: 23)、CMV rev
GACTTGGAAATCCCCGTGAGT (SEQ ID NO: 24)、CMV FAM-TAMRA探针5’-
ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3’ (SEQ ID NO: 25) （样品在ABI Prism 7900序列检测仪-Applied Biosystems上分析）。在表3中提供在澄清的裂解物上测量的所得体积滴度（vp/ml）和以病毒颗粒/细胞（vp/细胞）表示的细胞比生产力。

[0160] 表3 来自纯化的病毒的载体生产力

[0161] 3.2：包含RSV转基因的载体的产生进行不同组的实验以评估在悬浮液中培养的Procell 92.S细胞中RSV疫苗载体的生产力。所述实验通过以5x105个细胞/ml的细胞密度感染Procell 92.S平行比较PanAd3/RSV (在WO2012/089833中有所描述)和ChAd155/RSV。感染后三天收集感染的细胞；通过三个冷冻/解冻循环从感染的细胞中释放病毒，并通过离心澄清裂解物。然后将澄清的裂解物通过如上报告的定量PCR分析定量。在表4中提供在澄清的裂解物上测量的所得体积滴度（vp/ml）和以病毒颗粒/细胞（vp/细胞）表示的细胞比生产力。

[0162] 表4纯化的病毒的载体生产力

[0163] 实施例4：转基因表达水平4.1: HIV Gag转基因的表达水平
通过用包含HIV Gag转基因的ChAd3和ChAd155载体感染HeLa细胞，在平行实验中比较表达水平。将HeLa细胞接种在24孔板中，并使用MOI=250 vp/细胞用ChAd3/GAG和ChAd155/GAG纯化的病毒一式两份地感染。在感染后48小时收集HeLa感染的细胞的上清液，并使用市售的ELISA 试剂盒(HIV-1 p24 ELISA试剂盒，PerkinElmer Life Science)定量分泌的HIV GAG蛋白的产生。使用HIV-1 p24抗原标准曲线，根据生产商的说明书就行定量。在图9中说明了以pg/ml Gag蛋白表示的结果。

[0164] 4.2: RSV F转基因的表达水平通过用包含RSV F转基因的上述PanAd3和ChAd155载体感染HeLa细胞，在平行实验中比较表达水平。为此目的，将HeLa细胞接种在6孔板中，并使用MOI=500 vp/细胞用PanAd3/RSV和ChAd155/RSV纯化的病毒一式两份地感染。在感染后48小时收集上清液，并通过ELISA定量分泌的RSV F蛋白的产生。将上清液的5种不同稀释液转移至用市售的小鼠抗-RSV F单克隆抗体包被的微量培养板孔中。使用第二抗-RSV F兔抗血清，随后是生物素缀合的抗-兔IgG，然后加入链霉抗生物素蛋白-AP缀合物(BD Pharmingen目录554065)来揭示抗原捕获。
使用RSV F蛋白(Sino Biological目录11049-V08B)标准曲线进行定量。在表5中提供得到的结果(表示为ug/ml的RSV F蛋白)。

[0165] 表5 RSV F转基因的表达水平

[0166] 还进行蛋白质印迹分析以证实由ChAd155 RSV载体提供的相对于PanAd3 RSV载体更高的转基因表达水平。使用MOI=250和500 vp/细胞，用PanAd3/RSV和ChAd155/RSV纯化的病毒感染铺板在6孔板中的HeLa细胞。收集HeLa感染细胞的上清液，并通过非还原性SDS凝胶电泳随后通过蛋白质印迹分析来分析分泌的RSV F蛋白的产生。将等量的上清液上样到非还原性SDS凝胶上；电泳分离后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，以用可在antibodies-online.com上获得（最后登录为2015年4月13日）的抗RSV F小鼠单克隆抗体（克隆RSV-F-3目录号：ABIN308230）进行探测。与第一抗体温育后，洗涤膜，然后与抗小鼠HRP缀合物第二抗体温育。最后，使用标准技术（ECL检测试剂Pierce目录号W3252282）通过电化学发光（ECL）将测定显色。在图10中显示了蛋白质印迹结果。通过针对F蛋白产生的单克隆抗体mAb 13揭示由箭头指示的约170kD的条带，其对应于三聚的F蛋白的预期分子量。可以看出，ChAd155 RSV载体在250和500 vp/细胞的MOI下产生比PanAd3RSV更深的条带。

[0167] 实施例5：通过小鼠免疫实验评估免疫效力5.1: 包含HIV Gag转基因的载体的免疫原性
在BALB/c小鼠(5只/组)中，平行地评估ChAd155/GAG载体与ChAd3/GAG载体的免疫原性。通过肌内注射106个病毒颗粒进行实验。在免疫接种后3周，使用在BALB/c小鼠中定位的GAG CD8+ T细胞表位，通过离体IFN-γ酶联免疫斑点(ELISpot)测量T-细胞应答。结果显示于图11中，其表示为IFN-γ点形成细胞/百万个脾细胞（SFC）。每个斑点代表在单一小鼠中的应答，且所述线对应于每个剂量组的平均值。在对两种载体的应答中，五只小鼠中有四只对CD8免疫显性肽呈阳性应答。

[0168] 5.2：包含RSV转基因的载体的免疫原性在BALB/c小鼠中评估了PanAd3/RSV和ChAd155/RSV载体的免疫效力。将两种载体以
108、107和3x106 vp的剂量进行肌内注射。接种后3周，将免疫的小鼠的脾细胞分离，并使用在BALB/c小鼠中定位的免疫优势肽F和M表位作为抗原，通过IFN-γ-ELISpot进行分析。免疫应答的水平与递减剂量一致地下降(如预期)，但是在用ChAd155/RSV载体免疫的小鼠组中的免疫应答明显高于用PanAd3/RSV疫苗免疫的等同小鼠组(图12)。符号显示各个小鼠数据，其表示为IFN-γ斑点形成细胞（SFC）/百万个脾细胞，计算为对三种优势免疫表位(F51-66, F85-93和M2-1282-290)的反应总和并对背景进行校正。水平线代表每个剂量组的IFN-γSFC/百万个脾细胞的平均数目。

[0169] 总之，上面报告的结果证实，ChAd155是与ChAd3和PanAd3载体相比改善的腺病毒载体。显示了ChAd155是生产力更高的，因此有助于制备过程，并显示能够在体外和在体内表达更高水平的转基因，提供对在动物模型中表达的抗原的更强T-细胞应答。

[0170] 实施例6：ChAd155-RG是免疫原性的并针对狂犬病攻击具有保护性6.1：ChAd155-AG载体的免疫原性
在CD1小鼠中评估ChAd155-RG载体的免疫效力，并将结果显示在图13中。通过肌内注射
109 vp进行实验。每个点代表单个小鼠的应答。图13证明单次施用编码狂犬病病毒G蛋白抗原的复制缺陷型腺病毒载体诱导了有效的免疫应答。载体诱导中和抗体的保护性水平（图
13A）并诱导循环狂犬病特异性T细胞（图13B）。

[0171] 如Cliquet F. 等人, J. Immunol. Methods (1998) 212:79-87所述进行荧光抗体病毒中和测定（FAVN）。图13A证明在单次施用复制缺陷型ChAd155-RG后两周内在血清中检测功能性中和抗体。在施用后第二周检测到中和抗体其量远高于0.5 IU/ml的保护阈值水平（如在世界卫生组织指导方针（虚线）中所述），且在第4周没有显示出下降的迹象。图13B证明在注射10-9 pfu/ml ChAd155-RG的CD1小鼠的脾脏中检测到狂犬病特异性T细胞。如上所述对横跨狂犬病G蛋白序列的重叠肽进行的干扰素-γELISpot测定证明狂犬病特异性T细胞的存在。

[0172] 在单次疫苗注射后跟踪抗体动力学至21周；滴度在第8周达到峰值，然后下降，但仍然远高于血清转变阈值（虚线），如图14所示。

[0173] 然后将ChAd155-RG的免疫效力与单剂量方案中的市售狂犬病疫苗进行比较，并将结果显示在图15中。左图显示了用估计的1/500的人剂量的ChAd155-RG（5×108个病毒颗粒）或1/10的犬剂量的兽用狂犬病疫苗NOBIVAC免疫Balb/c小鼠的结果。右图显示了用1/1000的估计的人剂量的ChAd155-RG（108个病毒颗粒）或1/10的人剂量的RABIPUR免疫CD1小鼠的结果。如上所述测量病毒中和抗体滴度，描述为IU/ML，并且在单剂量接种后两个月显示滴度。尽管商业疫苗存在大量过量，但ChAd155-RG载体诱导的免疫力证明优于商业上可获得的兽用和人狂犬病疫苗。

[0174] 6.2：ChAd155-AG载体针对狂犬病攻击进行保护的能力图16证明单剂量的ChAd155-RG针对狂犬病攻击进行保护。使用ChAd155-RG、ChAd155对照载体或RABIPUR以表6中所示的剂量注射到4至6周龄的远交ICR小鼠的腓肠肌中。组1-6中的每一组由10只小鼠组成。在第0、7和21天给予小鼠三剂量的RABIPUR或以表6中所示的剂量给予单剂量的ChAd155或ChAd155-RG。

[0175] 表6单剂量的ChAd155-RG针对狂犬病攻击进行保护组载体剂量血清转变率存活率
1 ChAd155对照 108病毒颗粒 0% 60%
2 在第0、7和21天 RABIPUR 1/10的人剂量x 3 100% 100%
3 ChAd155-RG 108病毒颗粒 100% 100%
4 ChAd155-RG 107病毒颗粒 100% 100%
5 ChAd155-RG 106病毒颗粒 90% 90%
6 ChAd155-RG 105病毒颗粒 20% 60%

[0176] 然后用蝙蝠狂犬病病毒变体的人分离物攻击小鼠并随后进行90天。攻击病毒是从与暴露于狂犬病蝙蝠相关的致命人类病例中分离的街头 RABV变体Ps P4。在先前实验中先前未接种动物中计算的攻击剂量是100％致死的。在这项研究中，相同的剂量是60％致死。通过对狂犬病的快速荧光聚焦抑制试验（RFFIT）进行血清学检测来检测狂犬病特异性中和抗体，如Smith 等人 (1973) Bull. World Health Organ. 48:535–541所进行。此外，使用LIGHT DIAGNOSTICS狂犬病多克隆DFA试剂（Millipore Cat#5199）进行直接免疫荧光以检测脑组织中的病毒抗原。

[0177] 图16显示了每只个体小鼠的狂犬病特异性中和抗体的水平。给予不包含狂犬病抗原的阴性对照载体的组1中的小鼠不发生血清转变，并且组中的60％存活。给予组3-6中的8 7
小鼠渐降的ChAd155-RG的病毒颗粒载量。当给予10或10个病毒颗粒时，所有小鼠都发生血清转变并存活。注射106个病毒颗粒的小鼠具有90％的血清转变率并且90％存活。注射105个病毒颗粒的小鼠具有20％的血清转变率并且60％存活。这证明ChAd155-RG的单次肌内接种在宽剂量范围内引起中和抗体滴度高于0.5IU/ml的阈值，并赋予针对致死性狂犬病攻击的保护。图16和表6因此证明单次施用重组ChAd155-RG可以至少与常规的、目前使用的灭活病毒疫苗一样有效地针对狂犬病进行保护。

[0178] 实施例7： ChAd155-RG在针对狂犬病攻击进行保护中比AdC68rab.gp更有效将ChAd155-RG载体针对狂犬病病毒攻击进行保护的效力与如文献中报道的AdC68 rab.gp载体的效力进行比较。如表7中所示，用单剂量的ChAd155-RG肌内免疫Balb/c小鼠。
攻击前病毒中和抗体水平是剂量依赖性的，并显示于图17A中。然后如实施例6中所述，用蝙蝠狂犬病病毒变体的人分离物攻击这些小鼠。如表7中所示，给予对照ChAd155载体的60％小鼠存活。用108或107 vp ChAd155-RG免疫的Balb/c小鼠具有100％的存活率，用106 vp ChAd155-RG免疫的小鼠具有90％的存活率，且用106 vp ChAd155-RG免疫的小鼠具有60％的存活率，并且中和抗体滴度降至接近血清转变阈值。

[0179] 然后将这些结果与Zhou (2006) Mol. Ther. 14:662于670（图17B）公布在结果相关联。Zhou 等人报道用腺病毒重组病毒载体AdC68rab.gp肌内免疫ICR小鼠，然后用CVS-N2C狂犬病病毒鼻内攻击。对照动物未接种并且具有100％的死亡率。用5x105 pfu AdC68rab.gp免疫的小鼠的45％发生血清转变并显示77％的存活率（17B左图），而用5x104 pfu ChAd155-RG（17B右图）免疫的小鼠显示90％血清转变并且具有60％存活率。

[0180] 当使用1/50的剂量（AdC68rab.gp以5x105 pfu 相比于ChAd155-RG以104 pfu）时，在发明人的本研究和Zhou等人报道的研究中获得类似的血清学和保护效力数据。因此，ChAd155-RG的效力约是AdC68rab.gp的50倍。

[0181] 表7 ChAd155-RG和AdC68rab.gp的效力组载体剂量血清转变率存活率
1 ChAd155对照 108个病毒颗粒 0% 60%
2 ChAd155-RG 108个病毒颗粒 100% 100%
3 ChAd155-RG 107个病毒颗粒 100% 100%
4 ChAd155-RG 106个病毒颗粒 90% 90%
5 ChAd155-RG 105个病毒颗粒 20% 60%
6 AdC68rab.gp 5x107个病毒颗粒 44% 77%
7 AdC68rab.gp 5x106个病毒颗粒 10% 60%

[0182] 实施例8：ChAd155-RG为非人灵长类动物提供长期免疫原性为了评估非人灵长类动物中ChAd155-RG的免疫原性的动力学、广度和寿命，如下处理三组的五只食蟹猴（Macaca fascicularis）。用ChAd155-RG 5x1010病毒颗粒IM免疫第1组，然后在第48周用加强剂量的ChAd155-RG 5x1010病毒颗粒IM免疫。用ChAd155-RG 5x1010病毒颗粒IM免疫第2组，随后是在第24周加强剂量的RABIPUR接种，和在第48周IM加强剂量的ChAd155-RG 5x1010病毒颗粒。第3组接受肌内施用一半人剂量的RABIPUR，并在第7天和第21天接受相同的加强剂量。定期收集血清样品，并收集全血用于外周血单核细胞（PBMC）分析。

[0183] 将单剂量ChAd155-RG诱导的长达48周的免疫原性与RABIPUR的全程进行比较。引入在第24周时使用RABIPUR或在第48周时使用ChAd155的加强以评估两种疫苗的相容性和加强中期至长期免疫应答的能力。

[0184] 将通过用ChAd155-RG单次免疫诱导的中和抗体滴度与用完全三剂量疗程的RABIPUR诱导的那些进行比较。图18显示了如通过FAVN测定法测定的用重组ChAd155-RG（第1组和第2组）免疫的猴子与用固定的细胞培养病毒疫苗RABIPUR（第3组）免疫长达接种后6个月的那些猴子的中和抗体应答的比较。单剂量的1010个病毒颗粒ChAd155-RG诱导与三次剂量RABIPUR相同的免疫应答。

[0185] 这些结果显示单次施用ChAd155-RG能够引发远高于血清转变阈值的中和抗体滴度，其在至少48周内是稳定的并且与三次剂量在RABIPUR相当。由ChAd155-RG诱导的血清转变是快速的。用ChAd155-RG免疫的所有动物在免疫后两周超过阈值，此时用RABIPUR免疫的动物早已经接受第二剂量。

[0186] 在第24周用RABIPUR加强第2组中的动物（图18-正方形）在将病毒中和抗体提高到远高于第0天施用ChAd155-RG后达到的峰值水平方面非常有效。这证明RABIPUR病毒裂解物抗原完全能够加强由ChAd155-RG核酸编码的抗原诱导的免疫力。

[0187] 使用ChAd155-RG加强第1组（图18-三角形）和第2组（图18-倒三角形）中的动物也非常有效。无论它们是否用RABIPUR进行中间加强，用ChAd155-RG免疫的动物在第48周对ChAd155-RG加强产生(mounted)强烈的免疫应答。这证明可以有效地再施用ChAd155-RG核酸编码的抗原。它还证明ChAd155-RG核酸编码的抗原在施用RABIPUR病毒裂解物抗原后有效加强免疫应答。总之，图18证明了编码狂犬病G抗原的猿猴腺病毒ChAd155与包含病毒裂解物抗原的常规狂犬病疫苗的相容性。

[0188] 实施例9： ChAd155-RG在非人灵长类动物中诱导细胞免疫应答除了实施例8中证明的体液抗体应答外，ChAd155-RG还诱导强烈的细胞免疫应答。图19显示单剂量的ChAd155-RG在接种动物的外周血中诱导持续水平的狂犬病糖蛋白特异性IFNγ分泌T细胞，如通过IFNγ-ELIspot测定所检测的。相反，细胞免疫应答低于用RABIPUR接种的动物的检测限。

[0189] 如实施例8中所述，用ChAd155-RG免疫并在第48周用ChAd155-RG加强的第1组中的动物，证明加强再次放大IFNγ水平。用ChAd155-RG免疫并在第24周用RABIPUR首先加强，然后在第48周用ChAd155-RG加强的第2组中的动物，没有显示出响应于RABIPUR加强的IFNγ水平的增加，但显示出对ChAd155-RG加强的强烈应答。这证明ChAd155-RG加强可以扩增成熟动物中的记忆T细胞。在整个随访过程中未检测到白介素4应答。

[0190] 实施例10：人中安全性的剂量递增研究为了评估ChAd155-RG在人中的安全性，将启动I期研究。主体将是正常健康的成年男性和女性，其没有狂犬病疫苗接种史，未暴露于狂犬病动物或接受基于腺病毒的研究性疫苗。
研究规模将足够大以确定主要研究终点安全性的结果。将进行标准统计分析，包括95％置信区间。

[0191] 主体将接受一次或多次肌内注射ChAd155-RG；RABIPUR将用作比较物。将施用低剂量的ChAd155-RG疫苗，并且在数据审查和批准之后，然后将增加剂量。主体将在施用后跟踪全身性和局部不良事件，包括但不限于发烧、头痛、恶心、呕吐、不适和肌痛；以及注射部位处的疼痛、压痛、硬结、发红或肿胀。将检查血液参数并记录任何其他主动提供的症状。

[0192] 该研究还可以通过评估疫苗相关的免疫应答来评价免疫原性。结果测量可包括但不限于血清中和抗体的水平、循环B细胞分泌的抗体的定量和针对狂犬病病毒抗原的T细胞应答的定量。

标题	发布/更新时间	阅读量
一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株及其制法和采用该细胞株制备的抗原及疫苗	2020-05-13	380
一种细胞膜肿瘤疫苗及制备方法与应用	2020-05-13	211
选择性裂解的全细胞疫苗	2020-05-11	776
一种放射抗拒性肺癌全细胞疫苗及其制备方法和应用	2020-05-12	648
具有全细胞百日咳的联合疫苗	2020-05-11	418
一种全悬浮ST细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法	2020-05-11	613
紫杉醇及多西紫杉醇的用途	2020-05-13	257
马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的全长基因序列	2020-05-12	288
基于表达HBsAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗	2020-05-12	255
适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系及其在培养流感病毒、生产流感病毒疫苗中的应用	2020-05-13	402

具有狂犬病病毒抗原的黑猩猩腺病毒构建体

具有狂犬病病毒抗原的黑猩猩腺病毒构建体

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：