专利汇可以提供人腺病毒抗原表位嵌合蛋白及其制备、应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 人 腺病毒 抗原 表位嵌合蛋白及其制备、应用涉及基因工程技术、 疫苗 和诊断 试剂 领域。通过计算机分析腺病毒3型、7型、11型、14型及55型六邻体蛋白的 氨 基酸序列,分别筛选出含强抗原性的蛋白 片段 ,片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸进行连接,形成一个多抗原片段 串联 的嵌合蛋白,选择原核偏爱的密码子,将其翻译成相应的核酸序列,化学合成全长基因。基因工程技术表达纯化得到该嵌合蛋白,嵌合蛋白全长363个氨基酸。表达的嵌合蛋白可用于疫苗研究、HAdV 抗体 或抗原的检测等,本发明涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。,下面是人腺病毒抗原表位嵌合蛋白及其制备、应用专利的具体信息内容。
1.一种人腺病毒抗原表位嵌合蛋白,由腺病毒3型、7型、11型、14型及55型抗原表位蛋白片段连接而成,蛋白片段之间用甘氨酸和丝氨酸连接,嵌合蛋白全长363个氨基酸,氨基酸序列如下:
。
2.根据权利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白,其特征在于:其基因序列如下:
ATT GTT ACG ACG AAC GGT GAT AAT GCT GTT ACG ACG ACG ACG AAT ACGGGC GGC TCC AAA GAA GGT CTG CAA ATC GGC AAA GAC ATC ACC ACG ACCGAA GGC GAA GAA AAA CCG ATC TAC GCA GAT AAA GGC GGT AGT GAT GGTCGC GAT GCA GTT GCT GGT GCC CTG GCA CCG GAA ATT GTC CTG TAT ACCGAA AAC GGC GGT AGC ATC AAA GTT AAA ACC GAT GAC ACG AAC GGC TGGGAA AAA GAT GCG AAT GGC GGT AGC ATC GTC ACG ACC GGT GAA GAC AACGCC ACG ACC TAT ACC GGC GGT TCT AAA GAA GGC CTG GAA ATT GGT AAAGAT ATC ACC GCA GAC AAT AAA CCG ATT TAC GCT GAT AAA GGC GGT AGCGAC GGT CGT GAA GCG GCC GAT GCG TTT TCT CCG GAA ATT GTG CTG TATACC GAA AAT GGC GGT TCA ATC AAA CCG CGC GAT ACC GCA TGG GAA AAAGAC ACG GGC GGT TCG ATT GCT GAA GGC GTG AAA AAC ACG ACC GGT GAAGAA CAT GTT ACC GAA GAA GAA ACG AAT ACG ACC ACG TAC ACC GGC GGTTCT AAA GAA GGC TTA CCG GTG GGT CTG GAA GTT AGT GAT GAA GGC GGTTCC CTG GAC AAA GGC GTT GAA ACC ACG GAA GAA CGT CAG AAC GAA GATGGT GAA AAT GAC GAA AAA GCC ACC TAT ACG GGC GGT AGC AAA GAT GGTCTG CCG ATT GGC CTG GAA GTG CCG GCC GAA GGC GAT CCG AAA CCG ATTTAT GCC AAC AAA GGC GGT AGC GAT CTG CGT TCT CAG AAA CAA GGT CTGAAA CCG AAA ATT GTT ATG TAT GCA GAA AAC GGC GGT TCA ATC GGC CCGCGC ACC GAT TCG TAC AAA GAA ATT CAG CTG AAT GGT GAT CAA GCT TGGAAA GAC GTC AAC CCG AAT GGC ATC AGT GAA CTG GTG AAA GGT AAC CCGTTC GGC GGT TCC ATT GCC GAA GGC GTC AAA AAT GGT GAA GAA CGC GTGACC GAA GAA GAA AAC AAT ACG ACG ACG TAC ACG GGC GGT AGC AAA GAAGGT CTG CCG ATT GGT CTG AAA GTC TCC GAT GAA。
3.根据权利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白,其特征在于:来源于腺病毒3型的抗原表位蛋白片段共4个,具体为第136位氨基酸至第151位氨基酸、第164位氨基酸至第
187位氨基酸、第265位氨基酸至第284位氨基酸、第422位氨基酸至第437位氨基酸,各蛋白片段氨基酸序列如下:
第136~151位aa:
Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr第164~187位aa:
Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr Thr Glu Gly GluGlu Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys
第265~284位aa:
Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu Ile Val LeuTyr Thr Glu Asn
第422~437位aa:
Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn
4个蛋白片段之间用甘氨酸和丝氨酸连接,连接成新的重组蛋白片段,氨基酸序列如下:
Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn ThrGly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr ThrGlu Gly Glu Glu Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp GlyArg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr ThrGlu Asn Gly Gly Ser Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly TrpGlu Lys Asp Ala Asn。
4.根据权利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白,其特征在于:来源于腺病毒7型的抗原表位蛋白片段共4个,具体为第136位氨基酸至第148位氨基酸、第161位氨基酸至第
181位氨基酸、第258位氨基酸至第276位氨基酸、第415位氨基酸至第426位氨基酸,各蛋白片段氨基酸序列如下:
第136~148位aa:
Ile Val Thr Thr Gly Glu Asp Asn Ala Thr Thr Tyr Thr
第161~181位aa:
Lys Glu Gly Leu Glu Ile Gly Lys Asp Ile Thr Ala Asp Asn Lys ProIle Tyr Ala Asp Lys
第258~276位aa:
Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val Leu TyrThr Glu Asn
第415~426位aa:
Ile Lys Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr
4个蛋白片段之间用甘氨酸和丝氨酸连接,连接成新的重组蛋白片段,氨基酸序列如下:
Ile Val Thr Thr Gly Glu Asp Asn Ala Thr Thr Tyr Thr Gly Gly SerLys Glu Gly Leu Glu Ile Gly Lys Asp Ile Thr Ala Asp Asn Lys ProIle Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp AlaPhe Ser Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser Ile LysPro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr。
5.根据权利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白,来源于腺病毒11型的抗原表位蛋白片段共2段,具体为第136位氨基酸至第160位氨基酸、第174位氨基酸至第186位氨基酸,各蛋白片段氨基酸序列如下:
第136~160位aa:
Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr GluGlu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr
第174~186位aa:
Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu
2个蛋白片段之间用甘氨酸和丝氨酸连接,连接成新的重组蛋白片段,氨基酸序列如下:
Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr GluGlu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly LeuPro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu。
6.权利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白,其特征在于:来源于腺病毒14型的抗原表位蛋白片段共4个,具体为第136位氨基酸至第160位氨基酸、第174位氨基酸至第196位氨基酸、第268位氨基酸至第286位氨基酸、第415位氨基酸至第450位氨基酸,各蛋白片段氨基酸序列如下:
第136~160位aa:
Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gln Asn Glu Asp GlyGlu Asn Asp Glu Lys Ala Thr Tyr Thr
第174~196位aa:
Lys Asp Gly Leu Pro Ile Gly Leu Glu Val Pro Ala Glu Gly Asp ProLys Pro Ile Tyr Ala Asn Lys
第268~286位aa:
Asp Leu Arg Ser Gln Lys Gln Gly Leu Lys Pro Lys Ile Val Met TyrAla Glu Asn
第415~450位aa:
Ile Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu Ile Gln Leu Asn Gly AspGln Ala Trp Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly Ile Ser Glu Leu Val LysGly Asn Pro Phe
4个蛋白片段之间用甘氨酸和丝氨酸连接,连接成新的重组蛋白片段,氨基酸序列如下:
Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gln Asn Glu Asp GlyGlu Asn Asp Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp Gly LeuPro Ile Gly Leu Glu Val Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro Ile TyrAla Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg Ser Gln Lys Gln Gly Leu LysPro Lys Ile Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser Ile Gly Pro ArgThr Asp Ser Tyr Lys Glu Ile Gln Leu Asn Gly Asp Gln Ala Trp LysAsp Val Asn Pro Asn Gly Ile Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe。
7.根据权利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白,其特征在于:来源于腺病毒55型的抗原表位蛋白片段共2个,具体为第136位氨基酸至第158位氨基酸、第172位氨基酸至第
184位氨基酸,各蛋白片段氨基酸序列如下:
第136~158位aa:
Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu GluAsn Asn Thr Thr Thr Tyr Thr
第172~184位aa:
Lys Glu Gly Leu Pro Ile Gly Leu Lys Val Ser Asp Glu
2个蛋白片段之间用甘氨酸和丝氨酸连接,连接成新的重组蛋白片段,氨基酸序列如下:
Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu GluAsn Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro IleGly Leu Lys Val Ser Asp Glu。
8.权利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白,利用基因工程技术表达、制备该蛋白,具体方法如下:
腺病毒抗原表位蛋白片段的筛选:
利用ANTHEWIN等软件,通过计算机分析腺病毒3型、7型、11型、14型及55型六邻体蛋白的氨基酸序列,发现均有多个片段含有较强的抗原决定簇,腺病毒3型共筛选出四个蛋白片段,分别是第136位氨基酸至第151位氨基酸,共16个氨基酸;第164位氨基酸至第187位氨基酸,共24个氨基酸;第265位氨基酸至第284位氨基酸,共20个氨基酸;第422位氨基酸至第
437位氨基酸,共16个氨基酸,腺病毒7型共筛选出四个蛋白片段,分别是第136位氨基酸至第148位氨基酸,共13个氨基酸;第161位氨基酸至第181位氨基酸,共21个氨基酸;第258位氨基酸至第276位氨基酸,共19个氨基酸;第415位氨基酸至第426位氨基酸,共12个氨基酸,腺病毒11型共两个蛋白片段,分别是第136位氨基酸至第160位氨基酸,共25个氨基酸;第
174位氨基酸至第186位氨基酸,共13个氨基酸,腺病毒14型共四个蛋白片段,分别是第136位氨基酸至第160位氨基酸,共25个氨基酸;第174位氨基酸至第196位氨基酸,共23个氨基酸;第268位氨基酸至第286位氨基酸,共19个氨基酸;第415位氨基酸至第450位氨基酸,共
36个氨基酸,腺病毒55型共两个蛋白片段,分别是第136位氨基酸至第158位氨基酸,共23个氨基酸;第172位氨基酸至第184位氨基酸,共13个氨基酸,蛋白片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸连接,串联成一个多抗原表位嵌合蛋白,选用原核生物偏爱的密码子,将嵌合蛋白翻译成相应的核苷酸序列,在嵌合蛋白基因序列的5'端增加了NdeI酶切位点,在3'端增加了终止密码子(TAA)和EcoRI酶切位点,化学合成该嵌合蛋白的全长基因序列;
筛选的腺病毒3型抗原表位氨基酸序列:
第136~151位aa:
Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr第164~187位aa:
Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr Thr Glu Gly GluGlu Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys
第265~284位aa:
Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu Ile Val LeuTyr Thr Glu Asn
第422~437位aa:
Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn筛选的腺病毒7型抗原表位氨基酸序列:
第136~148位aa:
Ile Val Thr Thr Gly Glu Asp Asn Ala Thr Thr Tyr Thr
第161~181位aa:
Lys Glu Gly Leu Glu Ile Gly Lys Asp Ile Thr Ala Asp Asn Lys ProIle Tyr Ala Asp Lys
第258~276位aa:
Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val Leu TyrThr Glu Asn
第415~426位aa:
Ile Lys Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr
筛选的腺病毒11型抗原表位氨基酸序列:
第136~160位aa:
Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr GluGlu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr
第174~186位aa:
Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu
筛选的腺病毒14型抗原表位氨基酸序列:
第136~160位aa:
Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gln Asn Glu Asp GlyGlu Asn Asp Glu Lys Ala Thr Tyr Thr
第174~196位aa:
Lys Asp Gly Leu Pro Ile Gly Leu Glu Val Pro Ala Glu Gly Asp ProLys Pro Ile Tyr Ala Asn Lys
第268~286位aa:
Asp Leu Arg Ser Gln Lys Gln Gly Leu Lys Pro Lys Ile Val Met TyrAla Glu Asn
第415~450位aa:
Ile Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu Ile Gln Leu Asn Gly AspGln Ala Trp Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly Ile Ser Glu Leu Val LysGly Asn Pro Phe
筛选的腺病毒55型抗原表位氨基酸序列:
第136~158位aa:
Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu GluAsn Asn Thr Thr Thr Tyr Thr
第172~184位aa:
Lys Glu Gly Leu Pro Ile Gly Leu Lys Val Ser Asp Glu
腺病毒3型抗原表位氨基酸序列:
Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn ThrGly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr ThrGlu Gly Glu Glu Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp GlyArg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr ThrGlu Asn Gly Gly Ser Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly TrpGlu Lys Asp Ala Asn
腺病毒7型抗原表位氨基酸序列:
Ile Val Thr Thr Gly Glu Asp Asn Ala Thr Thr Tyr Thr Gly Gly SerLys Glu Gly Leu Glu Ile Gly Lys Asp Ile Thr Ala Asp Asn Lys ProIle Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp AlaPhe Ser Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser Ile LysPro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr
腺病毒11型抗原表位氨基酸序列:
Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr GluGlu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly LeuPro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu
腺病毒14型抗原表位氨基酸序列:
Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gln Asn Glu Asp GlyGlu Asn Asp Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp Gly LeuPro Ile Gly Leu Glu Val Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro Ile TyrAla Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg Ser Gln Lys Gln Gly Leu LysPro Lys Ile Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser Ile Gly Pro ArgThr Asp Ser Tyr Lys Glu Ile Gln Leu Asn Gly Asp Gln Ala Trp LysAsp Val Asn Pro Asn Gly Ile Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe腺病毒55型抗原表位氨基酸序列:
Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu GluAsn Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro IleGly Leu Lys Val Ser Asp Glu
嵌合蛋白氨基酸序列:
Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn ThrGly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr ThrGlu Gly Glu Glu Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp GlyArg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr ThrGlu Asn Gly Gly Ser Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly TrpGlu Lys Asp Ala Asn Gly Gly Ser Ile Val Thr Thr Gly Glu Asp AsnAla Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Glu Ile Gly LysAsp Ile Thr Ala Asp Asn Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly SerAsp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val Leu TyrThr Glu Asn Gly Gly Ser Ile Lys Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu LysAsp Thr Gly Gly Ser Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly GluGlu His Val Thr Glu Glu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly GlySer Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu Gly GlySer Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gln Asn Glu AspGly Glu Asn Asp Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp GlyLeu Pro Ile Gly Leu Glu Val Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro IleTyr Ala Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg Ser Gln Lys Gln Gly LeuLys Pro Lys Ile Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser Ile Gly ProArg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu Ile Gln Leu Asn Gly Asp Gln Ala TrpLys Asp Val Asn Pro Asn Gly Ile Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn ProPhe Gly Gly Ser Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg ValThr Glu Glu Glu Asn Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys GluGly Leu Pro Ile Gly Leu Lys Val Ser Asp Glu
化学合成嵌合蛋白的DNA序列(1104bp)
HAdV抗原表位嵌合蛋白重组质粒的构建:
提取质粒pET-28a(+)(美国Novagen公司产品),用 NdeI和EcoRI双酶切,电泳后回收酶切的质粒大片段,溶于去离子水内,用NdeI和EcoRI双酶切化学合成的HAdV抗原表位嵌合蛋白基因片段,电泳回收后,溶于去离子水内,取上述酶切后DNA片段,插入到载体pET28a(+)内的NdeI和EcoRI位点之间,表达含有五种型别腺病毒抗原表位的嵌合蛋白;
重组质粒的筛选与鉴定:
将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),涂布含卡那霉素(60μg/mL)LB平板,置37℃过夜;
次日随机挑取转化菌落和对照菌(质粒pET28a转化菌),提取质粒,用NdeI和EcoRI双酶切验证,1.0%的琼脂糖凝胶电泳结果表明,切下1104bp的目的基因片段;同时,将含有该基因片段的质粒进行DNA序列分析,序列分析证实重组质粒含有连接在一起的五种型别腺病毒抗原表位基因片段,序列完全正确:
ATT GTT ACG ACG AAC GGT GAT AAT GCT GTT ACG ACG ACG ACG AAT ACG GGC GGC TCC AAA GAA GGT CTG CAA ATC GGC AAA GAC ATC ACC ACG ACC GAA GGC GAA GAA AAA CCG ATC TAC GCA GAT AAA GGC GGT AGT GAT GGT CGC GAT GCA GTT GCT GGT GCC CTG GCA CCG GAA ATT GTC CTG TAT ACC GAA AAC GGC GGT AGC ATC AAA GTT AAA ACC GAT GAC ACG AAC GGC TGG GAA AAA GAT GCG AAT GGC GGT AGC ATC GTC ACG ACC GGT GAA GAC AAC GCC ACG ACC TAT ACC GGC GGT TCT AAA GAA GGC CTG GAA ATT GGT AAA GAT ATC ACC GCA GAC AAT AAA CCG ATT TAC GCT GAT AAA GGC GGT AGC GAC GGT CGT GAA GCG GCC GAT GCG TTT TCT CCG GAA ATT GTG CTG TAT ACC GAA AAT GGC GGT TCA ATC AAA CCG CGC GAT ACC GCA TGG GAA AAA GAC ACG GGC GGT TCG ATT GCT GAA GGC GTG AAA AAC ACG ACC GGT GAA GAA CAT GTT ACC GAA GAA GAA ACG AAT ACG ACC ACG TAC ACC GGC GGT TCT AAA GAA GGC TTA CCG GTG GGT CTG GAA GTT AGT GAT GAA GGC GGT TCC CTG GAC AAA GGC GTT GAA ACC ACG GAA GAA CGT CAG AAC GAA GAT GGT GAA AAT GAC GAA AAA GCC ACC TAT ACG GGC GGT AGC AAA GAT GGT CTG CCG ATT GGC CTG GAA GTG CCG GCC GAA GGC GAT CCG AAA CCG ATT TAT GCC AAC AAA GGC GGT AGC GAT CTG CGT TCT CAG AAA CAA GGT CTG AAA CCG AAA ATT GTT ATG TAT GCA GAA AAC GGC GGT TCA ATC GGC CCG CGC ACC GAT TCG TAC AAA GAA ATT CAG CTG AAT GGT GAT CAA GCT TGG AAA GAC GTC AAC CCG AAT GGC ATC AGT GAA CTG GTG AAA GGT AAC CCG TTC GGC GGT TCC ATT GCC GAA GGC GTC AAA AAT GGT GAA GAA CGC GTG ACC GAA GAA GAA AAC AAT ACG ACG ACG TAC ACG GGC GGT AGC AAA GAA GGT CTG CCG ATT GGT CTG AAA GTC TCC GAT GAA TAA
构建的重组质粒表达含有五种型别腺病毒抗原表位的嵌合蛋白,全长363个氨基酸,在其N端为腺病毒3型抗原表位蛋白片段,依次串联7型、11型、14型抗原表位蛋白片段,C端为腺病毒55型抗原表位蛋白片段,各片段长度依次为3型长85个氨基酸,7型长74个氨基酸,11型长41个氨基酸,14型长112个氨基酸,55型长39个氨基酸,蛋白片段之间由两个甘氨酸和一个丝氨酸连接,其氨基酸序列如下:
Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn ThrGly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr ThrGlu Gly Glu Glu Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp GlyArg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr ThrGlu Asn Gly Gly Ser Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly TrpGlu Lys Asp Ala Asn Gly Gly Ser Ile Val Thr Thr Gly Glu Asp AsnAla Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Glu Ile Gly LysAsp Ile Thr Ala Asp Asn Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly SerAsp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val Leu TyrThr Glu Asn Gly Gly Ser Ile Lys Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu LysAsp Thr Gly Gly Ser Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly GluGlu His Val Thr Glu Glu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly GlySer Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu Gly GlySer Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gln Asn Glu AspGly Glu Asn Asp Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp GlyLeu Pro Ile Gly Leu Glu Val Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro IleTyr Ala Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg Ser Gln Lys Gln Gly LeuLys Pro Lys Ile Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser Ile Gly ProArg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu Ile Gln Leu Asn Gly Asp Gln Ala TrpLys Asp Val Asn Pro Asn Gly Ile Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn ProPhe Gly Gly Ser Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg ValThr Glu Glu Glu Asn Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys GluGly Leu Pro Ile Gly Leu Lys Val Ser Asp Glu
表达嵌合蛋白工程菌的筛选鉴定:
将含有重组质粒的阳性转化子,接种至含3mL LB培养基(含卡那毒素60μg/mL)的试管内,37℃振荡培养3h,加IPTG至终浓度0.5mmol/L,继续振荡培养诱导6h,离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量为55 kD的
HAdV嵌合蛋白,而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带;
人腺病毒抗原表位嵌合蛋白的纯化:
1)表达腺病毒抗原表位嵌合蛋白工程菌的超声裂解
将诱导表达嵌合蛋白的工程菌离心(8000 rpm、10 min、4℃)收菌,菌体重悬于原培养液1/10体积的细菌裂解液(20 mmol/L PB pH7.4、5% 甘油)内,冰浴超声破菌,离心收集上清;
2)表达腺病毒抗原表位嵌合蛋白的硫酸胺分级沉淀
精确量出上清体积,向上清内加入适量饱和硫酸胺溶液,边加边搅拌,使硫酸胺的终浓度为25%,置冰浴内过夜;
离心收集上清,加入适量固体硫酸胺粉末,边加边搅拌,使硫酸胺的终浓度为50%,置冰浴内过夜;次日离心收集沉淀;用200mL平衡液(50mM Tris-HCl,pH 7.5)悬浮沉淀,装入透析袋内,对1000mL平衡液透析过夜,换液4次;离心收集上清,直接上DEAE-Separose FF阴离子柱纯化;
3)DEAE-Separose FF阴离子柱纯化
用平衡液(50mM Tris-HCl,pH 7.5)冲洗平衡DEAE-Separose FF阴离子柱,然后将上步透析好的上清直接上柱,流速为100 mL/h;上样结束后用平衡液充分洗柱,再依次用含100、
200、300、400、500、1000 mmol/L NaCl的溶液洗脱蛋白,收集各洗脱峰蛋白,用12% SDS-PAGE电泳检测各峰蛋白,确定哪个洗脱峰含表达的腺病毒抗原表位嵌合蛋白;300 mmol/L NaCl洗脱蛋白峰即为腺病毒抗原表位嵌合蛋白。
9.权利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白用于研制腺病毒疫苗、抗体或抗原检测试剂,及用于免疫制备抗腺病毒单抗和多抗。
10.权利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白,也可利用酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。
11.权利要求1所述的人腺病毒抗原表位嵌合蛋白,嵌合蛋白中各型别腺病毒抗原表位蛋白片段任意连接,以嵌合蛋白的形式进行表达、制备。
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