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适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基及应用

阅读：781发布：2021-12-13

专利汇可以提供适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基及其制备方法，该培养基包含有：氯化钙、硫酸镁、氯化钾、磷酸二氢钠、L 盐酸精氨酸、L天冬酰胺、L胱氨酸二盐酸盐、L盐酸组氨酸、L亮氨酸、L异亮氨酸等。本发明提供的培养基不仅能够满足二倍体细胞生长或细胞维持阶段的需求，而且避免与蛋白、血清中可能存在的外源病毒的接触，从而降低了安全隐患；由于组分简单、明确，均可以从市场上购买到标准化产品，产品批次间差异小，同时也简化了下游产品的纯化步骤；为大规模标准化生产提供了科学依据。此外，本发明提供了无蛋白无血清培养基能够在二倍体细胞生长阶段或细胞维持阶段中应用。，下面是适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基及应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基，其特征在于，由如下组分制备而成：
氯化钙                             100-300mg/L
硫酸镁                             50-150mg/L
氯化钾                             300-800mg/L
磷酸氢二钠                         100-200mg/L
氯化钠                             4.5-10g/L
磷酸二氢钾                         20-150mg/L
L盐酸精氨酸                        100-600mg/L
L天冬氨酸                          20-100mg/L
L天冬酰胺                         200-600mg/L
L胱氨酸二盐酸盐                    100-300mg/L
L盐酸组氨酸                        10-200mg/L
L亮氨酸                            100-200mg/L
L异亮氨酸                          20-200mg/L
甘氨酸                             0-80mg/L
L盐酸赖氨酸                        60-200mg/L
L甲硫氨酸                          5-200mg/L
L苯丙氨酸                          15-150mg/L
L脯氨酸                            0-50mg/L
L丝氨酸                            80-200mg/L
L苏氨酸                            30-100mg/L
L色氨酸                            8-45mg/L
L酪氨酸二钠盐                      10-130mg/L
L缬氨酸                            100-200mg/L
L鸟氨酸盐酸盐                      5-25mg/L
L 瓜氨酸                           10-50mg/L
L谷氨酸                            0-80 mg/L
草酰乙酸                           10-80mg/L
生物素                             0.004-2mg/L
氯化胆碱                           5-80mg/L
维生素C                           0.3-15mg/L
叶酸                               2.5-13mg/L
肌醇                               2-30mg/L
烟酰胺                             1-18mg/L
对氨基苯甲酸                       0.03-6.5mg/L
D泛酸钙                          1-9mg/L
盐酸吡哆醛                       1.5-10mg/L
盐酸吡哆醇                         0.1-3mg/L
核黄素                             0.001-0.5mg/L
维生素B12                        0.5-5mg/L
羧甲基纤维素钠                    0.1-2g/L
葡萄糖                             1-20g/L
酚红                               5-50mg/L
乙醇胺                             0.5-5mg/L
L谷氨酰胺                         50-400mg/L
碳酸氢钠                           1-3.95g/L
果糖                               0-6g/L
硫酸锌                             0.05-0.5mg/L
硫酸铜                             0.01-0.05mg/L
硝酸铁                            0.05-1mg/L
偏钒酸铵                          0.001-0.02mg/L
碘化钾                            0.00001-0.01mg/L
氯化锡                             0.000018-0.00018mg/L
硫酸镍                             0.0002-0.001mg/L
硅酸钠                            0.005-0.018mg/L
硫辛酸                             0.8-50mg/L
维生素E                           0.2-2mg/L
亚硒酸钠                          0.001-0.1mg/L
胆固醇                             0.00002-0.006mg/L
亚油酸                             0.0005-0.15mg/L
亚麻酸                             0.0005-0.85mg/L
花生四烯酸                         0.0001-0.03mg/L
孕酮                               0.0003-0.002mg/L
吐温80                            1-10mg/L
胸苷                              3-6mg/L
豆蔻酸                            0.2-0.8 mg/L
硬脂酸                          0.18-0.5mg/L
L-半胱氨酸                         16.5-70.8 mg/L
氯化镁                           30-300mg/L
丁酸钠                            27-429mg/L
次黄嘌呤                          0.5-5mg/L
腺嘌呤                            2-8mg/L
硫酸亚铁                          3-10mg/L
腐胺                             0.02-1.6mg/L
牛磺酸                           5-60mg/L
柠檬酸                            60-120mg/L
β-巯基乙醇                       0.1-9.9mg/L
地塞米松                          0.001-0.1mg/L
枸橼酸铋铵                        0.05-0.2mg/L
HEPES                            2-6mg/L
咖啡酸                           0.05-0.5mg/L
谷丙二肽                          20-200mg/L
硝酸钴                            0.0248mg/L
硼酸钠                            0.0177mg/L
钼酸铵                            0.00925mg/L。
2.权利要求1所述的培养基的制备方法，其特征在于，将1-10mg吐温80溶解于50ml注射用水中，然后加入0.0005-0.15mg亚油酸、0.0005-0.85mg亚麻酸、0.0001-0.03mg花生四烯酸、0.2-2mg维生素E、0.2-0.8mg豆蔻酸、0.18-0.5mg硬脂酸，待其溶解充分，用注射用水补液至500ml，再加入4.5-10g氯化钠、1-20g葡萄糖、0-6g果糖，搅拌至澄清，用注射用水补液至900ml，最后再加入：
氯化钙                             100-300mg/L
硫酸镁                             50-150mg/L
氯化钾                             300-800mg/L
磷酸氢二钠                         100-200mg/L
磷酸二氢钾                         20-150mg/L
L盐酸精氨酸                       100-600mg/L
L天冬氨酸                         20-100mg/L
L天冬酰胺                          200-600mg/L
L胱氨酸二盐酸盐                    100-300mg/L
L盐酸组氨酸                        10-200mg/L
L亮氨酸                            100-200mg/L
L异亮氨酸                          20-200mg/L
甘氨酸                             0-80mg/L
L盐酸赖氨酸                        60-200mg/L
L甲硫氨酸                          5-200mg/L
L苯丙氨酸                          15-150mg/L
L脯氨酸                            0-50mg/L
L丝氨酸                            80-200mg/L
L苏氨酸                            30-100mg/L
L色氨酸                            8-45mg/L
L酪氨酸二钠盐                      10-130mg/L
L缬氨酸                            100-200mg/L
L鸟氨酸盐酸盐                      5-25mg/L
L 瓜氨酸                           10-50mg/L
L谷氨酸                            0-80 mg/L
草酰乙酸                           10-80mg/L
生物素                             0.004-2mg/L
氯化胆碱                           5-80mg/L
维生素C                           0.3-15mg/L
叶酸                               2.5-13mg/L
肌醇                               2-30mg/L
烟酰胺                             1-18mg/L
对氨基苯甲酸                       0.03-6.5mg/L
D泛酸钙                           1-9mg/L
盐酸吡哆醛                         1.5-10mg/L
盐酸吡哆醇                         0.1-3mg/L
核黄素                             0.001-0.5mg/L
维生素B12                         0.5-5mg/L
羧甲基纤维素钠                    0.1-2g/L
酚红                               5-50mg/L
乙醇胺                             0.5-5mg/L
L谷氨酰胺                         50-400mg/L
碳酸氢钠                           1-3.95g/L
硫酸锌                             0.05-0.5mg/L
硫酸铜                             0.01-0.05mg/L
硝酸铁                             0.05-1mg/L
偏钒酸铵                           0.001-0.02mg/L
碘化钾                             0.00001-0.01mg/L
氯化锡                             0.000018-0.00018mg/L
硫酸镍                             0.0002-0.001mg/L
硅酸钠                             0.005-0.018mg/L
硫辛酸                             0.8-50mg/L
亚硒酸钠                           0.001-0.1mg/L
胆固醇                             0.00002-0.006mg/L
孕酮                               0.0003-0.002mg/L
胸苷                              3-6mg/L
L-半胱氨酸                         16.5-70.8 mg/L
氯化镁                           30-300mg/L
丁酸钠                            27-429mg/L
次黄嘌呤                          0.5-5mg/L
腺嘌呤                            2-8mg/L
硫酸亚铁                          3-10mg/L
腐胺                              0.02-1.6mg/L
牛磺酸                            5-60mg/L
柠檬酸                            60-120mg/L
β-巯基乙醇                         0.1-9.9mg/L
地塞米松                          0.001-0.1mg/L
枸橼酸铋铵                        0.05-0.2mg/L
HEPES                            2-6mg/L
咖啡酸                            0.05-0.5mg/L
谷丙二肽                          20-200mg/L
硝酸钴                            0.0248mg/L
硼酸钠                            0.0177mg/L
钼酸铵                            0.00925mg/L
添加完毕后，继续搅拌至完全溶解，再用注射用水补液至1000ml，0.22μm滤器过滤除菌，4℃避光保存。
3.权利要求1所述的培养基在二倍体细胞生长阶段或细胞维持阶段中作为培养基的应用。
4.权利要求1所述的培养基用于人用狂犬、水痘、脊髓灰质炎疫苗生产的应用。

说明书全文

适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基及应用

技术领域

[0001] 本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种无蛋白无水解物成分明确的无血清培养基，特别涉及一种适用于二倍体细胞培养的无蛋白无水解物成分明确的无血清培养基及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 细胞培养基是体外培养细胞时供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境，是体外细胞培养的基础，广泛应用于生物制品领域，干细胞治疗等领域。无蛋白无水解物成分明确的无血清培养基是细胞培养基中的一种，其成分完全明确，不含蛋白、水解物等成分未知的物质。

[0003] 在用二倍体细胞制备疫苗过程中，有两个阶段需使用细胞培养基，分别是细胞生长阶段(细胞扩增阶段)和细胞维持阶段(病毒扩增阶段)。

[0004] 依据现有技术，在用二倍体细胞生产疫苗的过程中，细胞培养扩增阶段，多采用5％-10％血清浓度的常规培养基如MEM、DMEM,或者含有胰岛素，转铁蛋白、白蛋白、水解物等成分不明确物质的无血清培养基，该类培养基成本高昂，下游产品纯化复杂，并且其可能携带的外源病毒会带来严重的安全隐患，而无蛋白，无水解物的无血清培养基可有效解决这些问题。虽然申请号为CN200710129800.3的专利申请文件公开了一种二倍体细胞狂犬疫苗及纯化狂犬疫苗的制备方法，该疫苗制备方法的细胞培养阶段采用无血清培养基培养，该方法所使用的无血清培养基均有蛋白添加。申请号为201310523326.8的专利申请文件公开了一种用无血清培养基制备风疹病毒活疫苗的方法，该方法的细胞培养阶段采用无血清培养基，该无血清培养基成分不明确，并且含有蛋白。

[0005] 在病毒扩增阶段，目前国内生产多采用含有1％-2％血清或者人血白蛋白的常规培养基。虽然申请号为CN200710129799.4的专利申请文件公开了一种二倍体细胞乙型脑炎疫苗的制备方法，在生产制备过程中的细胞培养扩增阶段，使用了无血清培养基，但该方法所用的培养基均含蛋白添加。申请号为CN200710129800.3的专利申请文件公开了一种二倍体细胞狂犬疫苗及纯化狂犬疫苗的制备方法，该方法的细胞维持阶段采用的无血清培养基同样均有蛋白添加。申请号为CN201310523326.8的专利申请文件公开了一种用无血清培养基制备风疹病毒活疫苗的方法，该方法的细胞维持阶段采用无血清培养基，该无血清培养基成分不明确，并且含有蛋白。

[0006] 从上述分析可以看出，目前的生产工艺中存在至少两方面的问题，一方面是培养基中需要添加血清；另一方面是培养基中含蛋白等不明确组分，增加了培养的风险，亦不利于产物纯化。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基，具有无蛋白、无水解物、无血清、组分明确的优点，能够支持二倍体细胞培养的细胞扩增或病毒扩增。

[0008] 本发明的另外一个目的在于提供上述适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基的制备方法。

[0009] 本发明的再一目的在于提供上述无蛋白无水解物成分明确的无血清培养基，具体在二倍体细胞培养的细胞生长阶段或细胞维持阶段中的应用。

[0010] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案来实现。

[0011] 本发明提供了一种适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基，由表1中组分制备而成：

[0012] 表1：适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基组分

[0013]

[0014]

[0015] 本发明进一步提供了上述适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基的制备方法，将1-10mg吐温80溶解于50ml注射用水中，然后加入0.0005-0.15mg亚油酸、0.0005-0.85mg亚麻酸、0.0001-0.03mg花生四烯酸、0.2-2mg维生素E、0.2-0.8mg豆蔻酸、0.18-
0.5mg 硬脂酸，待其溶解充分，用注射用水补液至500ml，再加入4.5-10g 氯化钠、1-20g 葡萄糖、0-6g果糖，搅拌至澄清，用注射用水补液至900ml，最后加入表2中组分：

[0016] 表2：适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基除吐温80、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、维生素E、豆蔻酸、硬脂酸、氯化钠、葡萄糖、果糖以外的组分

[0017]

[0018]

[0019] 添加完毕后，继续搅拌至完全溶解，再用注射用水补液至1000ml，0.22μm滤器过滤除菌，4℃避光保存。

[0020] 通过对二倍体细胞的代谢分析，确定L天冬酰胺、L异亮氨酸、L亮氨酸、L缬氨酸等几个氨基酸为快速消耗型氨基酸，增加这几个氨基酸的用量，对细胞生长和维持均有很好的效果。

[0021] 维生素作为无血清培养基中不可缺少的成分，其在细胞代谢过程中一般作为辅酶或辅基参与细胞的代谢调控，如生物素作为一些特异性羟化酶的组成成分，参与糖代谢和脂肪酸的合成；叶酸用于细胞合成四氢叶酸，四氢叶酸是重要的一碳单位，在核酸和蛋白质的合成中起重要作用；D泛酸钙在细胞内转变成酰基载体蛋白和辅酶，参与糖类、脂类、蛋白质代谢中的催化反应。通过应用plackett-burman设计方法及中心组合设计方法等确定了适用于二倍体细胞生长和维持的维生素配比。

[0022] 添加细胞相对葡萄糖不易利用的果糖，可减少代谢过程中乳酸的生成，从而稳定pH值；亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸为哺乳动物细胞所必须的脂肪酸；优化的葡萄糖和谷氨酰胺配比，可以有效控制细胞代谢过程中乳酸和氨的生成量。

[0023] 在二倍体细胞培养过程中柠檬酸、硫酸亚铁和硝酸铁组合使用可以很好的替代铁蛋白，其效果优于单独使用柠檬酸铁或者硝酸铁；硫酸锌可以替代胰岛素的作用，促进糖原和脂肪酸的合成；羧甲基纤维素钠可以替代白蛋白作为微量元素、必需脂肪酸的载体；β-巯基乙醇则可直接刺激细胞生长，有血清的部分作用。

[0024] 上述无蛋白无水解物成分明确的无血清培养基，用于二倍体细胞的细胞生长阶段和细胞维持阶段。采用本发明提供的培养基后，在二倍体细胞培养和维持阶段，均不使用血清和白蛋白，可用于人用狂犬、水痘、脊髓灰质炎等疫苗的生产。

[0025] 本发明提供的适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基及其制备方法，具有以下至少一项有益效果：

[0026] (1)制备的无蛋白无水解物成分明确的无血清培养基，不仅能够满足二倍体细胞培养或维持的需求，而且由于无需添加血清、蛋白以及水解物等，从而避免与蛋白、血清中可能存在的外源病毒的接触，从而降低了安全隐患；

[0027] (2)由于组分简单、明确，均可以从市场上购买到标准化产品，产品批次间差异小，同时也简化了下游产品的纯化步骤；为大规模标准化生产提供了科学依据；

[0028] (3)由于不含有蛋白等成分不明确的添加物，组分明确，显著降低了疫苗后期分离纯化难度和成本，降低过敏反应风险；

[0029] (4)用本发明提供的无血清、无蛋白培养基培养二倍体细胞，可得到与常规有血清培养基培养相当的细胞密度，在应用于乙型脑膜炎病毒、狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒制备时，获得的病毒滴度与常规有血清培养基培养获得的病毒滴度无显著差异。附图说明

[0030] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，以下描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图所示实施例得到其它的实施例及其附图。

[0031] 图1A为分别采用本实施例提供的培养基和血清浓度为10％的MEM培养MRC-5细胞的细胞生长曲线图；

[0032] 图1B为采用本实施例提供的培养基培养MRC-5细胞72h的细胞状态图；

[0033] 图1C为采用血清浓度为10％的MEM培养MRC-5细胞72h的细胞状态图；

[0034] 图2A为分别采用本实施例提供的培养基和血清浓度为10％的MEM培养2BS细胞的细胞生长曲线图；

[0035] 图2B为采用本实施例提供的培养基培养2BS细胞72h的细胞状态图；

[0036] 图2C为采用血清浓度为10％的MEM培养2BS细胞72h的细胞状态图。

具体实施方式

[0037] 以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。

[0038] 实施例1

[0039] 本实施例制备的是适用于MRC-5细胞培养的培养基，各组分用量可以参照表3中给出的数据，具体步骤如下：

[0040] 在容量为1000ml的反应容器中加入吐温80，再加入50ml注射用水进行溶解，然后依次加入亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、维生素E、豆蔻酸、硬脂酸，待其溶解充分，用注射用水补液至500ml，再依次加入氯化钠、葡萄糖、果糖，搅拌至澄清，用注射用水补液至900ml，最后依次加入氯化钙、硫酸镁、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、L盐酸精氨酸、L天冬氨酸、L天冬酰胺、L胱氨酸二盐酸盐、L盐酸组氨酸、L亮氨酸、L异亮氨酸、甘氨酸、L盐酸赖氨酸、L甲硫氨酸、L苯丙氨酸、L脯氨酸、L丝氨酸、L苏氨酸、L色氨酸、L酪氨酸二钠盐、L缬氨酸、L鸟氨酸盐酸盐、L瓜氨酸、L谷氨酸、草酰乙酸、生物素、氯化胆碱、维生素C、叶酸、肌醇、烟酰胺、对氨基苯甲酸、D泛酸钙、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、维生素B12、羧甲基纤维素钠、酚红、乙醇胺、L谷氨酰胺、碳酸氢钠、硫酸锌、硫酸铜、硝酸铁、偏钒酸铵、碘化钾、氯化锡、硫酸镍、硅酸钠、硫辛酸、维生素E、亚硒酸钠、胆固醇、孕酮、胸苷、豆蔻酸、硬脂酸、L-半胱氨酸、氯化镁、丁酸钠、次黄嘌呤、腺嘌呤、硫酸亚铁、腐胺、牛磺酸、柠檬酸、β-巯基乙醇、地塞米松、枸橼酸铋铵、HEPES、咖啡酸、谷丙二肽、硝酸钴、硼酸钠、钼酸铵；添加完毕后，继续搅拌至完全溶解，再用注射用水补液至1000ml，0.22μm滤器过滤除菌，4℃避光保存。

[0041] 表3：实施例1和实施例2中无蛋白无水解物成分明确的无血清培养基组分[0042]

[0043]

[0044]

[0045] 为了考察本实施例提供的培养基在细胞生长阶段中的性能，将本实施例提供的培养基和血清浓度为10％的MEM按照常规方法分别培养MRC-5细胞。本实施例采取的具体实施方式为：取细胞代次在10-40代的MRC-5细胞，用0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)溶液将单层细胞从培养瓶中消化下来，分别用配制好的本实施例培养基和含10％血清浓度的MEM重悬细胞，并均以0.6*106cells/ml接种，补加一定量的对应培养基置于37℃培养，每24h消化计数。

[0046] 下面结合细胞生长曲线图和细胞状态图对本实施例提供的培养基与传统含血清培养基培养的MRC-5细胞进行比对。图1A给出了分别采用本实施例提供的培养基和MEM培养MRC-5细胞的细胞生长曲线图，从图中可以看出，采用本实施提供的培养基时，其生长速率更快，能够更早达到最大细胞密度。图1B为采用本实施例提供的培养基培养MRC-5细胞72h的细胞状态图，图1C为采用浓度为10％的MEM培养MRC-5细胞72h的细胞状态图。从图1B和图1C的对比看，用本实施例提供的培养基按照常规方法培养MRC-5细胞，其生长状态与采用MEM培养基相当。

[0047] 为了考察本实施提供的培养基在细胞维持阶段的性能，利用本实施例提供的培养基培养MRC-5细胞，然后分别接种水痘病毒(Oka株VZV和狂犬病毒PM毒株)后扩增培养，收获病毒液，发现获得的病毒滴度及病毒收获量与现有技术所用的常规培养基的相当，其病毒滴度见表4所示。

[0048] 表4：实施例提供的培养基培养MRC-5细胞和常规培养基培养MRC-5细胞制备水痘病毒和狂犬病毒的病毒滴度

[0049]培养基水痘(Oka株VZV) 狂犬病毒(PM狂犬病毒株)
本实施例培养基 7.3 8.4
MEM(10％血清浓度) 7.25 8.5

[0050] 实施例2

[0051] 本实施例制备的是适用于2BS细胞培养的培养基，各组分用量可以参照表3中给出的数据，具体步骤与实施例1中相同。

[0052] 为了考察本实施例提供的培养基在细胞生长阶段中的性能，将本实施例提供的培养基和浓度为10％的MEM分别培养2BS细胞。本实施例采取的具体实施方式为：取细胞代次在10-40代的2BS细胞，用0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)溶液将单层细胞从培养瓶中消化下来，分别用配制好的本实施例培养基和含10％血清浓度的MEM重悬细胞，并均以0.55*106cells/ml接种，补加一定量的对应培养基置于37℃培养，每24h消化计数。

[0053] 下面结合细胞生长曲线图和细胞状态图对本实施例提供的培养基与传统含血清培养基培养的2BS细胞进行比对。图2A给出了分别采用本实施例提供的培养基和MEM培养2BS细胞的细胞生长曲线图，图2B为采用本实施例提供的培养基培养2BS细胞72h的细胞状态图，图2C为采用浓度为10％的MEM培养MRC-5细胞72h的细胞状态图。从图2A、2B和2C的对比看，用本实施例提供的培养基按照常规方法培养2BS细胞，其生长状态与采用MEM培养基相当，最大细胞密度相当。

[0054] 为了考察本实施提供的培养基在细胞维持阶段的性能，利用本实施例提供的培养基培养2BS细胞，然后接种脊髓灰质炎病毒(sabine株II型)，经检测发现获得的病毒滴度及病毒收获量与现有技术所用的常规培养基的相当，其病毒滴度见表5所示。

[0055] 表5：实施例提供的培养基培养2BS细胞和常规培养基培养2BS细胞制备脊髓灰质炎病毒的病毒滴度

[0056]培养基脊髓灰质炎病毒(sabine株Ⅱ型)
本发明培养基 7.56
MEM(10％血清浓度) 7.52

[0057] 从对实施例1和实施2的分析可以看出，本发明提供的适用于二倍体细胞培养的培养基完全可以替代现有技术中常规的有血清培养基或者是含蛋白的无血清培养基；由于其自身无血清、无蛋白、无水解物、成分明确，该培养基具有无可比拟的优势，在培养基领域具有很大的应用空间和发展空间。

[0058] 本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

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适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基及应用

适用于二倍体细胞培养的无蛋白无血清培养基及应用

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