用于稳定病毒颗粒、多肽或生物材料的赋形剂
阅读：506发布：2021-12-10
专利汇可以提供用于稳定病毒颗粒、多肽或生物材料的赋形剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种无菌药用 水 性溶液，该溶液是以密封的容器提供的，并且包括：药用水性 溶剂 ；病毒颗粒或生理活性多肽；选自聚乙烯亚胺、化学式（I）的化合物或其生理学可接受的盐或酯；或化学式（II）的化合物或其生理学可接受的盐或酯的赋形剂；以及可选地，一种或多种糖类。，下面是用于稳定病毒颗粒、多肽或生物材料的赋形剂专利的具体信息内容。
1.一种无菌药用水性溶液，所述溶液是以密封的容器提供的，并且包括：
-药用水性溶剂；
-病毒颗粒或生理活性多肽；
-选自以下的赋形剂：聚乙烯亚胺；化学式（I）的化合物或其生理学可接受的盐或酯其中：
R1表示氢或C1-6烷基；以及
R4表示氢；或
R1和R4与和它们连接的原子一起形成吡咯烷环；
R2表示氢、C1-6烷基或-(CH2)2-5NHC(O)(CH2)5-15CH3；以及
R3表示C1-6烷基；
或者化学式（II）的化合物或其生理学可接受的盐或酯
其中：
+
X表示-S(O)2-或-S(Rc)-；
Ra和Rb独立地表示C1-6烷基；以及
Rc表示用羧酸根阴离子和用胺（-NH2）部分取代的C1-6烷基；
以及
-可选地，一种或多种糖类。
2.根据权利要求1所述的溶液，其包含病毒颗粒。
3.根据权利要求2所述的溶液，其中，（a）所述病毒颗粒由活病毒或死病毒构成，或（b）所述病毒颗粒由活病毒或死病毒构成，并且所述活病毒是全病毒或减毒病毒。
4.根据权利要求2或3所述的溶液，其包括（a）选自腺病毒科（Adenoviridae）、正粘病毒科（Orthomyxoviridae）、副粘病毒科（Paramyxoviridae）、细小病毒科（Parvoviridae）、小核糖核酸病毒科（Picornoviridae）、痘病毒科（Poxviridae）的病毒，或（b）选自腺病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、细小病毒科、小核糖核酸病毒科、痘病毒科的病毒，所述病毒选自腺病毒、痘苗病毒、流感病毒或麻疹病毒。
5.根据权利要求1所述的溶液，其包括生理活性多肽。
6.根据权利要求5所述的溶液，其中，所述多肽是：
（a）激素、生长因子、肽或细胞因子；
（b）抗体或其抗原-结合片段或其配体-结合片段；
（c）氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶；或
（d）疫苗免疫原。
7.根据权利要求6所述的溶液，其中，所述多肽是：
（i）速激肽、血管活性肠肽、胰多肽相关肽、阿片肽或降钙素肽；
（ii）其单克隆抗体或片段；
（iii）嵌合的、人化的或人抗体、或其片段；
（iv）氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶；或
（v）全长病毒或细菌蛋白、糖蛋白或脂蛋白；或其片段
8.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中，所述赋形剂是具有数均摩尔质量（Mn）在20至1,000kDa或1至10,000Da的聚乙烯亚胺。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的溶液，其中，所述赋形剂是N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸、N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸、或N-C1-6烷基-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯。
10.根据权利要求9所述的溶液，其中，所述赋形剂是（a）N,N-二甲基甘氨酸、N,N,N-三甲基甘氨酸、或N-甲基甘氨酸或其生理可接受的盐或酯，或（b）N-甲基甘氨酸、N,N-二甲基甘氨酸或N,N,N-三甲基甘氨酸或其盐酸盐。
11.根据权利要求10所述的溶液，其中，所述赋形剂是N,N-二甲基甘氨酸或其生理可接受的盐或酯。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的溶液，其中，所述赋形剂是
-化学式（IA）的化合物或其生理可接受的盐或酯
其中，R5和R6独立地表示C1-4烷基，并且R7表示C1-4烷基或-(CH2)2-5NHC(O)(CH2)5-15CH3；
-化学式（IB）的化合物或其生理可接受的盐或酯
其中，R8和R9独立地表示C1-4烷基；
-化学式（IIA）的化合物或其生理可接受的盐或酯：
其中，Rc和Rd独立地表示C1-4烷基；或
-化学式（IIB）的化合物或其生理可接受的盐或酯：
其中，Re和Rf独立地表示C1-4烷基；并且Rg表示用羧酸根阴离子或用胺部分取代的C1-4烷基。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的溶液，其中，所述赋形剂是二甲基砜、N-甲基-甘氨酸、N,N-二甲基-甘氨酸、N,N,N-三甲基甘氨酸、椰油酰胺丙基甜菜碱、脯氨酸甜菜碱或S-甲基-L-甲硫氨酸。
14.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中，（a）存在蔗糖，或（b）存在蔗糖并且还存在棉子糖。
15.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，所述溶液适宜肠道外给予。
16.一种无菌药用水性溶液，所述溶液包括：
-药用水性溶剂；
-如在权利要求1、3或4中任一项定义的病毒颗粒；
-如在权利要求9至11中任一项限定的N-(C1-6烷基)-甘氨酸、N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯；以及
-化学式（IIC）的砜化合物：
其中，Ra和Rb独立地表示C1-6烷基；以及
-可选地，一种或多种糖类。
17.根据权利要求16所述的溶液，其中，（a）所述N-(C1-6烷基)-甘氨酸、N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其盐或酯的浓度是从0.1至1.5M，和/或（b）所述化学式（IIC）的砜化合物是甲磺酰基甲烷，和/或（c）所述化学式（I）的砜化合物的浓度是从0.1至1.5M，和/或（d）所述水性溶液包括非还原糖类或糖醇；和/或（e）所述水性溶液包括蔗糖或甘露醇；和/或（f）所述水性溶液的所述糖类的浓度是从0.05至1M，和/或（g）所述溶液是以密封的容器提供的。
18.根据前述权利要求中任一项所述的水溶液，所述溶液进一步包括：
-佐剂；
-生理可接受的缓冲剂；和/或
-渗透压调节剂；和/或
-防腐剂。
19.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，所述溶液是（a）等渗的，和/或（b）是在氮气下以密封的容器提供的。
20.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其中（a）所述溶液是以密封的小瓶、安瓿、注射器、药筒、柔性袋或玻璃瓶提供的，和/或（b）存在病毒颗粒或多肽的单位剂量。
21.一种用于制备如权利要求1中的无菌药用溶液的方法，所述方法包括：
（a）提供药用水性溶液中的所述病毒颗粒或生理活性多肽、赋形剂、以及可选地，一种或多种糖类的无菌溶液；
（b）将所述溶液密封在容器中。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，使所述药用水性溶剂中的所述病毒颗粒或多肽、赋形剂以及可选地，一种或多种糖类的所述溶液通过步骤（a）中的无菌过滤器。
23.一种用于制备如权利要求1中的无菌药用溶液的方法，所述方法包括：
（a）将药用水性溶剂中的病毒颗粒或生理活性多肽、赋形剂以及可选地，一种或多种糖类的溶液密封在容器中；以及
（b）将所述容器中的所述溶液灭菌。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中，所述容器是小瓶、安瓿、注射器、药筒、柔性袋或玻璃瓶。
25.一种即用的、储存稳定的水性溶液，所述溶液是以密封的容器提供的，并且包括：
-水性溶剂；
-如权利要求1、3或4中任一项限定的病毒颗粒或如权利要求1、6或7中任一项限定的生理活性多肽；
-如权利要求1或8至13中任一项限定的赋形剂；以及
-可选地，一种或多种糖类。
26.根据权利要求25所述的溶液，其中，所述溶液是以密封的小瓶、安瓿、注射器、药壳、弹性袋或玻璃瓶提供的。
27.根据权利要求25或26所述的溶液，其中，（a）存在蔗糖，或（b）存在蔗糖还存在棉子糖。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的溶液，所述溶液进一步包括：
-佐剂；
-生理可接受的缓冲剂；和/或
-张力调节剂；和/或
-防腐剂。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的溶液，所述溶液（a）是等渗的，和/或（b）是在氮气下以所述密封的容器提供的。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的溶液，其中，存在单位剂量的病毒颗粒或多肽。
31.一种用于制备如权利要求25中所述的溶液的方法，所述方法包括：
（a）提供水性溶剂中的所述病毒颗粒或多肽、赋形剂、以及可选地，一种或多种糖类的溶液；
（b）将所述溶液密封在容器中。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，使步骤（a）中的所述水性溶剂中的所述病毒颗粒、赋形剂以及可选地，一种或多种糖类的所述溶液通过无菌过滤器。
33.一种用于制备如在权利要求25中所述的无菌溶液的方法，所述方法包括：
（a）将水性溶剂中的所述病毒颗粒或多肽、赋形剂以及可选地，一种或多种糖类的溶液密封在容器中；以及
（b）将所述容器中的所述溶液灭菌。
34.一种用于制备如在权利要求16中限定的无菌药用溶液的方法，所述方法包括提供药用水性溶剂中的病毒颗粒；N-(C1-6烷基)-甘氨酸、N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯；如在权利要求16中限定的化学式（IIC）的砜化合物；以及可选地，一种或多种糖类的无菌溶液；
35.根据权利要求34所述的方法，其中，（a）在无菌条件下混合所述溶液的各组分，或混合所述溶液中的各组分并将所述溶液灭菌，或（b）
在无菌条件下混合所述溶液的各组分，或混合所述溶液中的各组分、
将所述溶液灭菌并且将所述无菌溶液密封在容器中。
36.根据权利要求34或35所述的方法，包括：
（a）提供药用水性溶剂中的所述病毒颗粒；所述N-(C1-6烷基)-甘氨酸、N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其盐或酯；所述化学式（I）的砜化合物；
以及可选地，一种或多种糖类的溶液；以及
（b）使所述溶液通过灭菌过滤器；以及
（c）可选地，将所述溶液密封在容器中。
37.根据权利要求34或35所述的方法，包括：
（a）将药用水性溶剂中的病毒颗粒；所述N-(C1-6烷基)-甘氨酸、N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其盐或酯；所述化学式（I）的砜化合物；以及可选地，一种或多种糖类的溶液密封在容器中；以及
（b）将在所述容器中的所述溶液灭菌。
38.根据权利要求31至37中任一项所述的方法，其中所述容器是小瓶、安瓿、注射器、药筒、柔性袋或玻璃瓶。
39.一种提供即用的、储存稳定的水溶液的密封容器，所述容器包括：
-水性溶剂；
-如权利要求1、3或4中任一项限定的病毒颗粒；
-如权利要求9至11中限定的N-(C1-6烷基)-甘氨酸、N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯；
-如权利要求16或17中限定的化学式（IIC）的砜化合物；以及
-可选地，一种或多种糖类。
40.根据权利要求39所述的密封容器，其中，（a）在所述溶液中所述(N-C1-6烷基)-甘氨酸、N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其盐或酯的浓度是从0.1至1.5M，和/或（b）在所述溶液中所述化学式（IIC）的砜化合物的浓度是从0.1至
1.5M，和/或c）所述溶液包含非还原糖或糖醇，和/或（d）所述溶液包含蔗糖或甘露醇，和/或（e）所述溶液中的所述糖类的浓度是从0.05至1M。
41.根据权利要求39或40所述的密封容器，其中，（a）所述溶液进一步包含佐剂；生理可接受的缓冲剂；和/或张力调节剂；和/或防腐剂，和/或（b）所述溶液是等渗的，和/或（d）所述密封容器是密封的小瓶、安瓿、注射器、药筒、柔性袋或玻璃瓶，和/或（e）所述溶液是在氮气下提供的，和/或（f）在所述溶液中存在单位剂量的病毒颗粒。
42.一种用于生产如权利要求39中限定的密封容器的方法，所述方法包括提供药用水性溶剂中的病毒颗粒；(N-C1-6烷基)-甘氨酸、N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯；如在权利要求16中限定的化学式（IIC）的砜化合物；以及可选地，一种或多种糖类的溶液；以及将所述溶液密封在容器中。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，（a）在无菌条件下混合所述溶液的各组分，或混合所述溶液中的各组分并将所述溶液灭菌，或（b）在无菌条件下混合所述溶液的各组分，或混合所述溶液中的各组分、将所述溶液灭菌并且在将所述溶液引入容器中之前通过使溶液通过无菌过滤器使所述溶液无菌，和/或（c）所述容器是小瓶、安瓿、注射器、药筒、柔性袋或玻璃瓶。
44.一种用于制备病毒颗粒或多肽的药用水性溶液的方法，所述方法包括：
（a）提供所述病毒颗粒或生理活性多肽、如在权利要求1或8至13中任一项限定的赋形剂、以及可选地，一种或多种糖类的溶液；
（b）去除所述赋形剂。
45.根据权利要求44所述的方法，所述方法进一步包括：
（c）将所述溶液密封在容器中。
46.如在权利要求1或8至13中任一项限定的赋形剂以及可选地一种或多种糖类在生产病毒或多肽的药用水性溶液期间保护所述病毒颗粒或多肽的应用。
47.一种用于保存取自人或动物的样品的方法，所述方法包括提供（i）所述样品，（ii）如在权利要求1或8至13中任一项限定的赋形剂，以及（iii）可选地一种或多种糖类的水溶液。
48.一种用于获得和保存来自人或动物的样品的方法，所述方法包括（a）获得来自所述人或动物的所述样品，以及（b）制备所述样品、如在权利要求1或8至13中任一项限定的赋形剂、和可选地一种或多种糖类的水溶液。
49.一种水性溶液，所述水性溶液包括（i）取自人或动物的样品，（ii）如在权利要求1或8至13中任一项限定的赋形剂，以及（iii）可选地一种或多种糖类。
50.根据权利要求49所述的水溶液，所述水溶液密封在容器中，并可选地储存在冰箱或冷冻器中。
51.如权利要求1或8至13中任一项限定的赋形剂和可选地一种或多种糖类用于保存取自人或动物的样品的应用。
52.如权利要求1或8至13中任一项限定的赋形剂和可选地一种或多种糖类在冷冻干燥包含病毒颗粒的溶液之前用于保存所述溶液的应用。
用于稳定病毒颗粒、多肽或生物材料的赋形剂
技术领域
背景技术
[0002] 一些生物分子足够稳定，可以分离、纯化它们，然后在室温下储存在溶液中。然而，这对于许多材料和涉及在低温下储存的技术是不可行的，已经试图加入稳定剂、冷冻干燥、真空形成和自然干燥以确保货架保存。尽管这些技术的可用性，但是一些生物材料在储存期间仍然显示出令人不满意的稳定性水平，并且一些技术导致增加的成本和不便。例如，冷冻运输和储存是昂贵的。而且，在发展中世界的国家中，对于运输诸如疫苗的药物，冷冻运输通常是不可用的。
[0003] 特别地，冷冻干燥或冻干作用的应力对一些生物材料可能是破坏性非常大的。生物药品的冷冻干燥涉及冷冻热敏性生物材料的溶液或悬浮液，之后是一次和二次干燥。该技术是基于在没有溶液融化的情况下，在真空下和零度以下的温度下升华。冷冻干燥代表了生产固体蛋白质和疫苗药物的关键步骤。从冻结的生物材料中的水蒸汽扩散的速率非常低，因此该过程很费时。另外，冷冻和干燥阶段都引入了能够使蛋白质解折叠或变性的应力。
[0004] 蛋白质是具有定义的一级、二级、三级以及在某些情况下四级结构的分子。该结构在赋予蛋白质其特定生物功能中发挥重要作用。不幸的是，诸如蛋白质的生物药物的结构复杂性使得它们易受各种过程的影响，这些过程导致其结构的和功能的不稳定性。必须防止构象完整性和官能团的降解。
[0005] 各种共价和非共价反应或溶液中的改变（改性，修饰）可以导致不稳定性。通常，降解分为两种主要的类型：首先物理降解或非共价途径降解，和其次共价降解途径。
[0006] 蛋白质可以经由诸如界面吸附和团聚的物理过程降解，其可以显著降低蛋白质药物的潜能和稳定性。第二个后果是，由在界面处的吸附介导的解折叠通常可以是溶液中的对于蛋白质不可避免的团聚的引发步骤。由于搅拌、温度或pH引发的应力，蛋白质的核心暴露在疏水表面可以导致吸附；其所有可以导致团聚。
[0007] 蛋白质可以经受化学修饰的影响，如氧化、异构化、水解、不规则二硫化（disulfide scrambling）、β-消除、脱酰胺以及加合物的形成。降解的主要水解机制包括肽键水解、天冬酰胺和谷氨酰胺的脱酰胺和天冬氨酸的异构化。水解降解途径的共同特点是对于反应速率，一个重要的配制品（制剂）变量是pH。
[0009] 由于不稳定性和团聚的问题，目前蛋白质最稳定的配制品不是液体配制品。典型地，冷冻干燥（冻干）蛋白质以提供蛋白质的稳定配制品。填充剂通常存在于配制品中。以干燥的形式分配和储存冷冻干燥的配制品，典型地作为密封的小瓶、安瓿或注射器中的粉剂。例如，WO 97/04801描述了抗-IgE抗体的稳定的冻干配制品，其必须在使用之前即时重建（重新溶解配成原来的溶度）。
[0010] WO-A-2006/0850082报道了包含糖类、诸如组蛋白蛋白质的载质（charged material）以及干燥敏感性或热敏感性生物组分的经干燥的或经保存的产物。糖类形成非晶固体基体。然而，如果将保存的生物组分给予人或动物，组蛋白可以具有免疫学后果。
[0011] WO 2008/114021描述了用于保存病毒颗粒的方法。该方法包括，干燥一种或多种糖类、聚乙烯亚胺和病毒颗粒的水性溶液以形成包含病毒颗粒的非晶固体基体。基于聚乙烯亚胺的数均摩尔质量（数均分子量，Mn），水性溶液包含浓度为15μM以下的聚乙烯亚胺，并且糖类的浓度，或者如果存在多种糖类，总的糖类浓度大于0.1M。
[0012] WO 2010/035001描述了用于保存多肽的方法，其中，在一种或多种糖类和聚乙烯亚胺（PEI）存在下，干燥多肽的水溶液，例如冷冻干燥。得到的干燥组合物典型地以密封小瓶、安瓿或注射器中的稳定干燥粉剂提供。由粉剂重建溶液以给予患者多肽，例如通过注射。
[0013] 然而，干燥，特别是冷冻干燥是昂贵和费时的过程。如果可以避免使用它们，将是有利的。生物活性材料在加热和干燥之后通常经受活性损失。另外，在使用多肽之前需要在溶剂中重建冷冻干燥的粉剂，这很不方便。实际上，进行重建步骤的患者或医疗专业人员如果没有正确的进行该步骤，可能带来风险。
[0014] 因此，提供不需要重建的液体病毒和蛋白质配制品以便使用是有利的。因此，对于稳定的液体可注射病毒和蛋白质配制品具有需要。对于高度浓缩的稳定的液体可注射抗体配制品具有需要。
发明内容
[0015] 目前出乎意料地发现了，通过使用某些赋形剂和可选地一种、二种或多种糖类，可以提供病毒颗粒或多肽的稳定储存的即用水性溶液。这些配制品保持长期稳定性。它们可以在没有干燥或冷冻干燥步骤的情况下制备。它们避开了在使用之前由冷冻干燥的粉剂重建溶液的需要。还发现，这些赋形剂和可选地一种、二种或多种糖类在生产期间可以保存（防腐）病毒颗粒或多肽。而且，已经发现，这些赋形剂和可选地一种、二种或多种糖类可以保护取自人或动物的样品。
[0016] 因此，本发明提供了无菌的药用水性溶液，典型地适于非肠道（肠道外）给予，该溶液提供在密封容器中，并且包括：
[0017] -药用水性溶剂；
[0018] -病毒颗粒或生理活性多肽；
[0019] -选自以下的赋形剂：聚乙烯亚胺；化学式（I）的化合物或其生理可接受的盐或酯；或化学式（II）的化合物或其生理可接受的盐或酯；
[0020]
[0021] 其中：
[0022] R1表示氢或C1-6烷基；以及
[0023] R4表示氢；或
[0024] R1和R4与和它们连接的原子一起形成吡咯烷环；
[0025] R2表示氢、C1-6烷基或-(CH2)2-5NHC(O)(CH2)5-15CH3；以及
[0026] R3表示C1-6烷基；或者
[0027]
[0028] 其中：+ -
[0029] X表示-S(O)2-或-S(Rc) ；
[0030] Ra和Rb独立地表示C1-6烷基；以及
[0031] Rc表示用羧酸根阴离子和用胺（-NH2）部分取代的C1-6烷基；以及
[0032] -可选地，一种或多种糖类。
[0033] 本发明还提供无菌的药用水性溶液，该溶液包括：
[0034] -药用水性溶剂；
[0036] -N-(C1-6烷基)-甘氨酸、N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯；以及
[0037] -化学式（IIC）的砜化合物：
[0038]
[0039] 其中，Ra和Rb独立地表示C1-6烷基；以及
[0040] -可选地，一种或多种糖类。
[0041] 本发明进一步提供：
[0042] ·一种用于制备根据本发明的无菌药用溶液的方法，该方法包括：
[0043] （a）提供在药用水性溶液中的病毒颗粒、赋形剂和可选地一种或多种糖类的无菌溶液；
[0044] （b）密封容器中的溶液；
[0045] ·一种制备根据本发明的无菌药用溶液的进一步的方法，该方法包括：
[0046] （a）密封容器中的药用水性溶剂中的病毒颗粒、赋形剂、和可选地一种或多种糖类的溶液；以及
[0047] （b）将容器中的溶液灭菌；
[0048] ·提供一种在封闭的容器中即用的（随时可用的，ready-to-use）、储存稳定的水性溶液，并且包括：
[0049] -水性溶剂；
[0050] -病毒颗粒或生理活性多肽；
[0051] -本发明的赋形剂；以及
[0052] -可选地，一种或多种糖类；
[0053] ·一种用于制备本发明的即用的、储存稳定的水性溶液的方法，该方法包括：
[0054] （a）提供水性溶剂中的病毒颗粒或多肽、赋形剂和可选地一种或多种糖类的溶液；
[0055] （b）密封容器中的溶液；
[0056] ·一种用于制备本发明即用的、储存稳定的水性溶液的进一步的方法，该方法包括：
[0057] （a）密封在容器中水性溶剂中的病毒颗粒或多肽、赋形剂、和可选地一种或多种糖类的溶液；以及
[0058] （b）将容器中的溶液灭菌；
[0059] ·一种在其中提供即用的、储存稳定的水性溶液的密封容器，所述容器包括：
[0060] -水性溶剂；
[0061] -病毒颗粒；
[0062] -N-(C1-6烷基)-甘氨酸、N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯；
[0063] -本发明的砜化合物；以及
[0064] -可选地，一种或多种糖类；以及
[0065] ·一种用于生产密封容器的方法，该方法包括提供在药用水性溶剂中的病毒颗粒；N-(C1-6烷基)-甘氨酸、N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯；本发明的化学式（IIC）的砜化合物；和可选地一种或多种糖类的溶液；以及密封容器中的溶液。
[0066] 本发明进一步提供了：
[0067] -一种用于制备病毒颗粒或多肽的药用水性溶液的方法，该方法包括：（a）提供病毒颗粒或生理活性多肽、本发明的赋形剂和可选地一种或多种糖类的溶液；以及（b）去除赋形剂；
[0068] -本发明的赋形剂、和可选地一种或多种糖类在生产所述病毒或多肽的药用水性溶液期间用于保存病毒颗粒或多肽的应用；
[0069] -一种用于保存取自人或动物的样品的方法，所述方法包括提供（i）所述样品，（ii）本发明的赋形剂，以及（iii）可选地一种或多种糖类的水性溶液。
[0070] -一种用于获得和保存取自人或动物的样品的方法，所述方法包括（a）获得取自人或动物的样品，以及（b）制备所述样品、本发明的赋形剂和可选地一种或多种糖类的水性溶液；
[0071] -一种水溶液，其包括（i）取自人或动物的样品，（ii）本发明的赋形剂，以及（iii）可选地一种或多种糖类；
[0072] -本发明的赋形剂和可选地一种或多种糖类用以保存取自人或动物的样品的应用；以及
[0074] 图1显示了在冷冻干燥之前4小时，在室温下和在液体中评估赋形剂是否增强腺病毒稳定性的实验结果。Suc=蔗糖。Raf=棉子糖。使用单向ANOVA进行统计分析，之后用**Bonfferoni后测试。P值概述，指定为P<0.01。误差条（误差线，error bar）显示标准误差的平均值（n=3）。
[0075] 图2显示了研究在37°C下热激发（热对抗，heat challenge）持续一周之后腺病毒的液体稳定性的实验结果。
[0076] 图3显示了研究以液体形式的赋形剂在稳定流感血凝素（HA）中的效果的实验结果。
[0077] 图4a显示了保持在4°C下持续一周测试配制品对于腺病毒配制品的恢复活性的影响。灰色和白色的柱表示测试配制品。在X轴上的数字指的是以M（表示）的浓度。黑色柱表示对照样品。“开始”=用于储存的输入病毒的滴定度，“PBS”=不包含其他赋形剂的配制品，“糖类”=包含1M蔗糖、100mM棉子糖的配制品。误差条=平均值的标准（误差），n=3。
[0078] 图4b显示了保持在4°C下持续一周测试配制品对于包含糖类的腺病毒配制品的恢复活性的影响（1M蔗糖，100mM棉子糖）。灰色和白色的柱表示测试配制品。在X轴上的数字指的是以M（表示）的浓度。黑色柱表示对照样品，“开始”=储存之前输入病毒的滴定度，“PBS”=不包含其他赋形剂的配制品，“糖类”=包含1M蔗糖、100mM棉子糖的配制品。误差条=平均值的标准误差，n=3。
[0079] 图4c显示了保持在37°C下持续一周测试的配制品对于不包含糖类的腺病毒配制品的恢复活性的影响。灰色和白色的柱表示测试配制品。在X轴上的数字指的是以M（表示）的浓度。黑色柱表示对照样品，“开始”=储存之前输入病毒的滴定度，“PBS”=不包含其他赋形剂的配制品，“糖类”=包含1M蔗糖、100mM棉子糖的配制品，误差条=平均值的标准误差，n=3。
[0080] 图4d显示了保持在37°C下持续一周，测试的配制品对于包含糖类（1M蔗糖，100mM棉子糖）的腺病毒配制品的恢复活性的影响。灰色和白色的柱表示测试配制品。在X轴上的数字指的是以M（表示）的浓度。黑色柱表示对照样品，“开始”=储存之前输入的病毒的滴定度，“PBS”=不包含其他赋形剂的配制品，“糖类”=包含1M蔗糖、100mM棉子糖的配制品，误差条=平均值的标准误差，n=3。
[0081] 图5显示了抗T（抗-TNF-α-抗体）对TNF-α的中和。在室温下孵育样品10天后进行试验。
[0082] 图6显示了在液体配制品中赋形剂对于IgG稳定性的影响的研究结果。柱表示相对于来自于实施例6的每一种可比较的热处理的仅（含）PBS的配制品（因此仅由PBS调节纯度至100%），在新型赋形剂配制品中IgG的百分纯度。所表示的处理包括仅糖类（白色）、仅DMG（灰色）以及DMG和糖类（黑色），全部都在实验的第1天采样。误差条表示以百分点（表示）的每一种处理液的平均IgG纯度的标准误差（n=3）。
[0083] 图7显示了在实施例6中制备的配制品储存在4°C下，在第1、5和31天的平均单体峰值。
[0084] 图8显示了在实施例6中制备的配制品储存在37°C下，在第1、5和31天的平均单体峰值。
[0085] 图9显示了实施例7中获得的结果，其中在37°C下7天之后评估了11种配制品用于稳定腺病毒对抗热激发（热对抗）的能力。
[0086] 图10显示了实施例8中获得的结果，其中评估了在37°C下持续7天后11种配制品用于稳定MVA对抗热激发的能力。
[0087] 图11显示了在实施例9中的设计空间的3D示意图。球体表示在测试的设计空间内的配制品。这种设计是Doehlert RSM设计。
[0088] 图12汇总了在实施例9中用于表示支化PEI（枝状PEI）（P-Bra）数据的模型统计。
[0089] 图13显示了在精细调整之后实施例9中的模型中保留的项目。
[0090] 图14绘制了使用实施例9中的模型，在三个不同水平的棉子糖下，P-Bra和蔗糖的配制品中预测的恢复的病毒滴定度的表面响应。使用的棉子糖的水平是：“低的”=在0mM下的棉子糖，“中间的”=在150mM下的棉子糖，“棉子糖”=在300mM下的棉子糖。
[0091] 图15显示了基于实施例9中的数据的模型，使用蒙特-卡罗（Monte-Carlo）模拟法生成的，来自最佳预测的设置和输出的屏幕截图。预测的最佳值突出显示：蔗糖=0.74M，支化PEI（枝状PEI）（P-Bra）=14nm，棉子糖=162.13mM。
[0092] 图16显示了实施例10中设计空间的示意图。编号的圆圈表示在测试的设计空间内的配制品。该设计是CCF RSM设计。圆圈中的数字指的是表7中的样品身份（样品标识，sample ID）。
[0093] 图17汇总了用于表示实施例10中的数据的模型统计。
[0094] 图18显示了在实施例10中精细调整之后，在模型中保持的项目。不与原点交叉的误差条表示95%置信度下的显著性因子（significant factor）。
[0095] 图19是预测在实施例10中的TMG和甘露醇的配制品中恢复的病毒滴定度的表面响应图。
[0096] 图20是基于实施例10中的数据的模型，使用蒙特-卡罗模拟法生成的，来自最佳预测的设置和输出的屏幕截图。确定了突出显示的配制品（第4行）是最佳的。
[0097] 图21显示了实施例11中的设计空间的3D示意图。球体表示测试的设计空间内的配制品。该设计是Doehlert RSM设计。
[0098] 图22汇总了用于表示实施例11中的数据的模型统计。
[0099] 图23显示了在实施例11中精细调整之后在模型中保留的项目。不与原点交叉的误差条表示在90%置信度下的显著性因子。
[0100] 图24显示了模型的等值线图，其描述在实施例11中，在MSM、蔗糖和棉子糖中配制并在+37°C下持续1周的腺病毒的恢复率。棉子糖没有显示为变量，因为它对滴定度没有影响，因而从该模型中除去。显示的响应是恢复的病毒滴定度作为阳性对照（初始滴定度）的百分数。
[0101] 图25显示了基于在实施例11中的数据的模型，使用蒙特-卡罗模拟法生成的，来自最佳预测的设置和输出的屏幕截图。突出显示了预测的最佳值为浓度为1M的蔗糖和浓度为0.95M的MSM。
[0102] 图26显示了在实施例12中的设计空间的3D示意图。球体表示在测试的设计空间中的配制品。该设计是Doehlert RSM设计。
[0103] 图27汇总了用于表示实施例12中的数据的模型统计。
[0104] 图28显示了在精细调整之后在实施例12的模型中保留的项目。不与原点交叉的误差条表示在95%的置信度下的显著性因子。
[0105] 图29是使用在实施例12的模型，在棉子糖的三个不同水平下DMG和蔗糖的配制品中预测的病毒滴定度的表面响应图，这三个不同水平即：“低的”=在0mM下的棉子糖，“中间的”=在150mM下的棉子糖，“高的”=在300mM下的棉子糖。
[0106] 图30显示了基于在实施例12中的数据的模型，使用蒙特-卡罗模拟法生成的，来自最佳预测的设置和输出的屏幕截图。突出显示了预测的最佳值为浓度为0.5M的蔗糖、浓度为0.4M的DMG和浓度为272.5mM的棉子糖。
[0107] 图31显示了使用来自于实施例12的模型的最佳区域图。图31A是等值线图，其中交叉标志预测的最佳值。着色表示变量的水平。图31B是模型的突出显示区域的图，其中预测的恢复的病毒活性大于或等于输入值。
[0108] 图32显示了在实施例13中，各种配制品在+4°C下储存6个月之后恢复的病毒活性。
[0109] 图33显示了实施例13中‘最佳’配制品在每个时间点和热激发下恢复的病毒活性，该配制品包含1M的蔗糖、100mM的棉子糖和0.7M的DMG。
[0110] 图34显示了在实施例13中的各种配制品中，在+37°C热激发下恢复的病毒活性随时间的降低。
[0111] 图35显示了在实施例14中的设计空间的示意图。编号的圆圈表示在测试的设计空间内的配制品。该设计是CCF RSM设计。
[0112] 图36汇总了用于表示在实施例14中的数据的模型统计。
[0113] 图37显示了在精细调整之后在实施例14中保留的项目。不与原点交叉的误差条表示在95%的置信度下的显著性因子。
[0114] 图38显示了在实施例14中的DMG和甘露醇的配制品中预测的恢复的病毒滴定度的等值线图。
[0115] 图40显示了在+56°C下热激发后24小时、5天和7天保留的残余F(ab')2活性（以2μg/ml）。
[0116] 图41显示了热激发后14天、在+40°C下1天和在+56°C下13天之后实施例16在各个时间点保留的残余F(ab')2活性（以0.5μg/ml）。
[0117] 图42显示了在样品注射和未触及的（未改变的，untouched）阳性对照样品第一次注射之前，在实施例17中获得的y-标准化（归一化）的重叠的标准迹线。恰好在第三个重量标记之前洗脱Fab，给出其估计的流体力学重量大于44kDa。该值与单价Fab一致。
[0118] 图43至45显示了在实施例17中，相应于每一条件的第一次注射的7个HPLC迹线的重叠。在图44中在13分钟的大峰（标记为b）是由于赋形剂，同时在10分钟的较小峰（标记为a）是由于Fab。黑色矩形突出显示了在图45中放大并显示的区域。
[0119] 图46显示了在实施例17中的一系列经积分的HPLC迹线，如下所示：图46A：条件1：未触及（未改变）的Fab（阳性对照）；图46B：条件2：在56°C下130h之后在PBS中的Fab（阴性对照）；图46C：条件3：在56°C下130h之后在SR混合液中的Fab；图46D：条件4：在56°C下130h之后在SR混合液和低的（0.1M）DMG中的Fab；图46E：条件5：在
56°C下130h之后在SR混合液和高的（1.0M）DMG中的Fab；图46F：条件6：在56°C下
130h之后在SR混合液和低的（0.1M）TMG中的Fab；图46G：条件7：在56°C下130h之后在SR混合液和高的（1.0M）TMG中的Fab。
56°C下130h之后在SR混合液和高的（1.0M）DMG中的Fab；图46F：条件6：在56°C下
130h之后在SR混合液和低的（0.1M）TMG中的Fab；图46G：条件7：在56°C下130h之后在SR混合液和高的（1.0M）TMG中的Fab。
[0120] 图47汇总了在实施例17中的7个条件中的每一个的纯度（浅灰色）和单体保留率（深灰色）参数。所有样品为167μg/ml。未触及（未改变）的是未经热激发的阳性对照。其他所有样品在56°C（因此以56C（表示））下热激发130h。方括号表示样品的组成。
具体实施方式
[0121] 概述
[0122] 根据本发明提供了病毒颗粒或多肽的稳定水性溶液。这些溶液是无菌的药用液体，其在使用之前可以不必要即时由例如干燥粉末重建而给予患者。
[0123] 在一个实施方式中，本发明涉及通过N-烷基化的甘氨酸衍生物或其盐或酯以及化学式（IIC）的砜化合物保存病毒颗粒。N-烷基化的甘氨酸衍生物和砜化合物可以相互协同作用以在液体设置（环境，setting）中稳定病毒颗粒。
[0124] 溶液可以采取小体积肠道外（注射剂）的100ml以下的形式或大体积肠道外（注射剂）的100ml以上的形式。溶液是无菌药用液体，其在使用之前可以不必要即时由例如干燥的粉末重建而给予患者。
[0125] 溶液能够显示长期储存的稳定性。因此它们可以在冰箱，即2至8°C的温度下储存6至18个月以上。在某些情况下，溶液可以在室温下储存这样的期间。因而溶液具有足够的稳定性，以使得它们在制造厂中生产，分发例如至药品批发商和药房，以及在使用之前在没有不能接受的水平的降解发生的情况下储存。
[0126] 典型地，溶液是以澄清的液体提供的。溶液通常是无色的。它们可以另外包括生理可接受的缓冲剂（缓冲液）和/或张力调节剂和/或防腐剂。因而溶液可以是等渗的。溶液密封在小瓶、安瓿、注射器、药筒（药壳，cartridge）、柔性袋或玻璃瓶的适当的容器中。因而它们在制造厂以即用的形式生产。因此不必要在使用之前即时由固体组合物（如冻干粉）重建它们。
[0127] 此外，本发明的赋形剂可以在生产病毒颗粒或多肽的溶液期间保存所述病毒颗粒或多肽。而且，本发明的赋形剂可以保存取自人或动物的样品的溶液。
[0128] 病毒颗粒
[0129] 用于本发明的病毒颗粒可以是整个病毒（全病毒），如活病毒、死病毒、减活病毒、失活病毒（如化学失活的病毒）、或强毒病毒（烈性病毒）或非强毒病毒（非烈性病毒）。活病毒能够感染宿主细胞并在宿主细胞中复制。死病毒是失活的（灭活的），并且不能够在宿主细胞中复制。颗粒可以是病毒样颗粒（VLP）或核衣壳。病毒可以感染原核或真核细胞。病毒可以是人类或动物病毒。
[0130] 病毒颗粒可以是或可以源于dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒、（+）ssRNA病毒、（-）ssRNA病毒、ssRNA-RT病毒或dsDNA-RT病毒。例如，但不用来限制，病毒颗粒可以是或可以源于下列家族的病毒：
[0131] 腺病毒科(Adenoviridae)，如人腺病毒A、B、C、D、E或F，包括人类Ad5、Ad2、Ad4、Ad6、Ad24、Ad35、Ad36血清型；
[0132] 杯状病毒科(嵌杯病毒科，Caliciviridae)，如诺沃克病毒；
[0133] 冠状病毒科(Coronaviridae)，如人冠状病毒299E或OC43和非典型性肺炎冠状病毒（SARS-coronavirus）；
[0134] 纤丝病毒科(线状病毒科，Filoviridae)，如埃博拉病毒；
[0135] 黄病毒科(Flaviviridae)，如黄热病病毒、西尼罗病毒、登革病毒、丙型肝炎病毒；
[0136] 嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)，如乙型肝炎病毒；
[0137] 疱疹病毒科(Herpesviridae)，如单疱疹病毒（例如HSV1或HSV2），人类疱疹病毒1、3、4、5或6；
[0138] 正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，如流感病毒A、B、C，包含但不限于甲型流感病毒血清型H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9H2、H7N2、H7N3和N10N7；
[0139] 乳头状瘤病科(Papillomaviridae)，如人乳头状瘤病毒；
[0140] 副粘病毒科(副粘液病毒科，Paramyxoviridae)，如人副流感病毒1、麻疹病毒和腮腺炎病毒；
[0141] 细小病毒科(Parvoviridae)，如腺伴随病毒；
[0142] 小核糖酸病毒科(细小RNA病毒科，Picornaviridae)，如人脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒（包括血清型O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3和亚洲型-1（Asia-1））；
[0144] 呼肠病毒科(呼肠孤病毒科，Reoviridae)，如蓝舌病毒组（bluetongue virus group）；
[0146] 披膜病毒科(披衣病毒科，Togaviridae)，如风疹病毒。
[0147] 在优选的实施方式中，病毒颗粒可以是或可以源于腺病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、细小病毒科、小核糖核酸病毒科或痘病毒科病毒。在特别优选的实施方式中，病毒颗粒可以是或可以源于腺病毒、痘苗病毒、流感病毒或麻疹病毒。
[0148] 病毒样颗粒（VLP）包括源于病毒的结构蛋白的病毒蛋白，但是缺乏病毒的核酸。当过表达时，这些病毒的结构蛋白自发地自组装成颗粒。VLP是不能复制的。在一些实施方式中，VLP是在脂质双层内嵌入的病毒蛋白。VLP的实例包括噬菌体衍生的VLP、人乳头状瘤病毒（HPV）L1主要衣壳蛋白VLP、诺沃克病毒衣壳蛋白VLP和由诸如M1蛋白、HA血凝素蛋白和N1神经氨酸酶蛋白的流感病毒结构蛋白组装的VLP。
[0149] 本领域的技术人员已知使用标准技术可以制备病毒颗粒。例如，可以通过以下方法制备病毒：用要使用的病毒株感染培养的宿主细胞，使得感染进行以便病毒在培养的细胞中复制，并且可以通过本领域已知的标准方法释放病毒以收获和纯化病毒。
[0150] 多肽
[0151] 诸如生理活性多肽的任何多肽适宜用于本发明。例如，多肽可以是小于15个氨基酸的小肽，如6至14个氨基酸（例如催产素、环孢菌素），15至50个氨基酸的较大的肽（例如降钙素、生长激素释放激素1-29（GHRH）），50至250个氨基酸的小蛋白质（例如胰岛素、人生长激素）、长度大于250个氨基酸的较大的蛋白质或包括两个以上多肽链的复合物的多亚基蛋白质。多肽可以是肽类激素、生长因子或细胞因子。其可以是抗原结合的多肽、受体抑制剂、配体模拟物或受体阻滞剂。典型地，多肽是以基本纯的形式的。因而其可以是经分离的多肽。例如，可以在产生重组体之后分离多肽。
[0152] 例如，多肽可以是激素，该激素选自生长激素（GH）、催乳素（PRL）、人胎盘催乳激素（hPL）、促性腺激素（例如促黄体激素、促卵泡激素）、促甲状腺激素（TSH）、前阿片黑素细胞皮质激素（POMC）家族中的成员、抗利尿激素和催产素、利尿钠激素、甲状旁腺激素（PTH）、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、生长激素抑制素和胃肠激素。
[0153] 多肽可以是速激肽（例如P物质、肛褶蛙肽、神经激肽A、依来多辛（唾液腺十一肽，Eledoisin）、神经激肽B）、血管活性肠肽（例如VIP（血管活性肠肽；PHM27）、PACAP（垂体腺苷酸环化酶激活肽）、肽PHI 27（肽组氨酸异亮氨酸27）、GHRH 1-24（生长激素释放激素1-24）、胰高血糖素、分泌素、胰多肽相关肽（例如NPY、PYY（肽YY）、APP（鸟胰多肽）、PPY（胰多肽）、阿片肽（例如前阿片黑素细胞皮质激素（POMC）肽、脑啡肽五肽、强啡肽原肽、降钙素肽（例如降钙素、淀粉状蛋白毒素（淀粉不溶素，Amylin）、AGG01）或另外的肽（例如B-型钠尿肽（BNP））。
[0154] 多肽可以是生长因子，选自表皮生长因子（EGF）家族、血小板衍生的生长因子家族（PDGF）、成纤维细胞生长因子家族（FGF）、转化生长因子-β家族（TGF-β）、转化生长因子-α（TGF-α）、促红细胞生成素（EPO）、类胰岛素生长因子-I（IGF-I)、类胰岛素生长因子-II（IGF-II)。典型地，生长因子是转化生长因子-β（TGF-β）、神经生长因子（NGF）、神经营养因子（Neurotrophin）、血小板衍生的生长因子（PDGF）、促红细胞生成素（EPO）、血小板生成素（TPO）、筒箭毒碱（肌松药，Myostatin）（GDF-8）、生长分化因子-9（GDF9）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF或FGF-1）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF或FGF-2）、表皮生长因子（EGF）或肝细胞生长因子（HGF）。
[0155] 多肽可以是细胞因子，选自白介素-1（IL-1）、白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、肿瘤坏死因子-β（TNF-β）、干扰素-γ（INF-γ）和集落刺激因子（CSF）。典型地，细胞因子是粒细胞-集落刺激因子（G-CSF）或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。
[0157] 抗体
[0158] 用于本发明的抗体可以是全抗体或其抗原结合片段或配体结合片段。
[0159] 全抗体
[0160] 在一个实施方式中，抗体是免疫球蛋白（Ig）单体、二聚体、四聚体、五聚体或其他寡聚体（低聚体）。每一种抗体单体可以包括四条多肽链（例如，由两条相同的重链和两条相同的轻链构成的常规抗体）。可替代地，每一种抗体单体由两条多肽链构成（例如，由两条相同的重链构成的重链抗体）。
[0161] 抗体可以是抗体的任何类别或同种型（例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE）或抗体的任何子类（例如IgG的子类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA的子类IgA1或IgA2）。典型地，抗体是IgG，如IgG1、IgG2或IgG4抗体。通常，抗体是IgG1或IgG2抗体。
[0162] 典型地，抗体或抗原结合片段是来源于哺乳动物的。因而抗体可以是灵长类、人类、啮齿类动物（例如小鼠或大鼠）、兔子、绵羊（ovine）、猪、马或骆驼科的抗体或抗体片段。抗体或抗体片段可以来源于鲨鱼或鸡。
[0163] 抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体是由大量基本上同源的抗体获得的，这些抗体靶向抗原上的单一抗原决定簇。大量多克隆抗体包括靶向不同表位的抗体混合物。
[0164] 抗原结合片段或配体结合片段
[0165] 抗原结合片段可以是保持抗原结合能力或配体结合能力的抗体的任何片段，例如Fab、F(Ab')2、Fv、二硫化物连接的Fv、单链Fv（scFv）、二硫化物连接的scFv、双特异抗体（diabody）、线性抗体、结构域（区域）抗体或多特异性抗体。这样的片段包括一个或多个抗原或配体结合部位。在一个实施方式中，抗原或配体结合片段包括四个框架区（例如FR1、FR2、FR3和FR4）和三个互补性决定区（例如CDR1、CDR2和CDR3）。适宜用于检测片段结合抗原或配体的能力的方法是本领域熟知的，例如免疫测定和噬菌体展示。
[0166] 抗体或结合片段可以是单特异性、双特异性或多特异性抗体。多特异性抗体具有结合至少一种、至少两种、至少三种、至少四种以上的不同表位、抗原或配体的特异性。双特异性抗体能够结合至两种不同表位、抗原或配体。例如，双特异性抗体可以包括两对VH和VL，每一对VH/VL结合至单一抗原或表位。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的，例如包括两对免疫球蛋白重-轻链共表达、抗体可变区以期望的结合特异性与免疫球蛋白恒定区序列的融合、或抗体片段的化学连接。
[0167] 双特异性抗体“双特异抗体（diabody）”包括在同一条多肽链（VH-VL）中结合至轻链可变区的重链可变区。可以使用连接子（例如肽连接子）生成双特异抗体，该连接子太短而使得相同链上的两个区域（结构域）之间不能成对，以便迫使这些区域（结构域）与另一条链的互补区成对，并且产生具有两个抗原结合位点或配体结合位点的二聚分子。
[0168] 适宜的scFv抗体片段可以包括抗体的VH和VL区，其中这些区存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽进一步包括VH和VL区之间的多肽连接子，其使得scFv能够与抗原结合以形成期望的结构。
[0169] 用于本发明的方法的结构域抗体（domain antibody）可以基本上由轻链可变区（例如VL）或重链可变区（例如VH）构成。重链可变区可以来源于常规的四链抗体或源自重链抗体（例如骆驼科VHH）。
[0170] 修饰(改性，Modification）
[0171] 全抗体或其片段可以与其他部分，如连接子结合（缔合），该连接子可以用于使两个以上的片段或抗体结合在一起。这样的连接子可以是化学连接子，或者可以以与片段或全抗体的融合蛋白的形式存在。因而连接子可以用于使全抗体或片段结合在一起，这些全抗体或片段具有相同或不同的结合特异性。
[0172] 在进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段或配体结合片段与其它部分连接，其它部分如毒素、治疗药物（例如化学治疗药物）、放射性同位素、脂质体或前药活化酶。其它部分的类型将取决于抗体或抗原结合片段的最终用途。
[0173] 抗体或抗原结合片段或配体结合片段可以连接至一个或多个小分子毒素（例如卡奇霉素、美登素、单端孢霉烯族化合物（trichothene）和CC1065）或酶活性毒素或其片段（例如白喉毒素、来自绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的外毒素A链、蓖麻蛋白A链、相思豆毒蛋白A链（红豆因A链，abrin A chain）、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白（Aleurites fordii protein）、石竹素蛋白（香石竹毒蛋白，dianthin protein）、泻果素、巴豆毒蛋白、白树毒素、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素或单端孢霉烯族（tricothecenes））。
[0174] 适宜用于连接抗体结合片段或抗原结合片段的放射性同位素包括，但不限于Tc99、211 131 125 90 186 188 153 212 32
At 、I 、I 、Y 、Re 、Re 、Sm 、Bi 和P 。
At 、I 、I 、Y 、Re 、Re 、Sm 、Bi 和P 。
[0175] 例如，抗体或抗原结合片段或配体结合片段可以连接至将前药转化成或能够将前药转化成活性抗癌药的前药活化酶。例如，碱性磷酸酶可以用于将包含磷酸盐的前药转化成自由药物（游离药物），芳基硫酸酯酶可以用于将包含硫酸盐的前药转化成自由药物，胞嘧啶脱氨酶可以用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药5-氟尿嘧啶；以及诸如沙雷氏菌属蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶的蛋白酶可用于将包含肽的前药转化成自由药物。酶可以是硝基还原酶，已经确定其在抗癌基因疗法中的大量前药代谢中是有用的。可替代地，具有酶活性的抗体或抗原结合片段或配体结合片段可以用于将前药转化为自（游离）由的活性药物。
[0176] 适宜的化学治疗剂可以包括，但不局限于，烷化剂，如塞替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯（alkyl sulfonate），如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；氮芥（nitrogen mustard），如苯丁酸氮芥、萘氮芥、异环磷酰胺、美法仑；亚硝基尿（nitrosurea），如卡莫司汀和福莫司汀；抗代谢物，如甲氨蝶呤（methotrexate）和5-氟尿嘧啶（5-FU）；叶酸类似物，如二甲叶酸（denopterin）和蝶罗呤；嘌呤类似物，如氟达拉滨和硫咪嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、卡莫氟和去氧氟尿苷；紫杉烷（类紫杉醇，taxoid），如紫杉醇和多西紫杉醇（多西他赛，doxetaxel）；任何以上化合物的药用盐、酸或衍生物。
[0177] 在另一个实施方式中，抗体或抗体片段可以是PEG化的（聚乙二醇化的，PEGylated）。因此，一个或多个聚乙二醇分子可以共价连接至抗体分子或抗体片段分子。从1至3个聚乙二醇分子可以共价连接至每一个抗体分子或抗体片段分子。这样的PEG化主要用于降低抗体或抗体片段的免疫原性，和/或提高抗体或抗体片段的循环半衰期（circulating half-life）。
[0178] 嵌合的、人化的或人类抗体
[0179] 在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段或配体结合片段是嵌合抗体或其片段，包括来自不同天然抗体的序列。例如，嵌合抗体或抗体片段可以包括同一于或同源于特定种类或抗体种类的抗体中相应序列的重链和/或轻链的部分，同时链的剩余部分同一于或同源于其他种类或抗体种类的抗体中的相应序列。典型地，嵌合抗体或抗体片段包括鼠和人抗体组分的嵌合体。
[0180] 非人类抗体的人化形式是包含来源于非人类免疫球蛋白中的最小序列的嵌合抗体。适宜的人化抗体或抗体片段可以包括例如，免疫球蛋白，其中受体抗体或抗原结合片段或配体结合片段的高变区（例如来源于CDR）的残基由非人类物种（给体抗体）的高变区的残基所取代，这些非人类物种如具有期望的特异性、亲和力和/或能力的小鼠、大鼠、兔子或非人类的灵长类。在某些情况下，人类免疫球蛋白的一些框架区残基可以由相应的非人类残基取代。
[0181] 作为对于人化的替代物，可以产生人类抗体或抗原结合片段。例如，可以产生转基因动物（例如小鼠），其免疫后能够在没有内源免疫球蛋白的产生情况下产生全系列（谱系）的人类抗体。例如，在嵌合和种系突变型小鼠的抗体重链连接区（JH）的同合型缺失（纯合子缺失，homozygous deletion）可以致使完全抑制内源抗体产生。人种系免疫球蛋白基因可以转移至这样的种系突变型小鼠中，以在抗原免疫性试验（challenge）后致使人类抗体的产生。使用噬菌体展示技术，也可以在体外产生人类抗体或抗原结合片段。
[0182] 靶标（目标，Target）
[0183] 能够结合任何靶标（目标）抗原的抗体或抗原结合片段或配体结合片段适宜用于本发明的方法。抗体或抗体片段可以能够结合至与自身免疫性疾病（例如I型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩氏病和重症肌无力）相关的抗原或配体、与癌症或炎症状态相关的抗原或配体、与骨质疏松症相关的抗原、与阿尔茨海默氏症相关的抗原、或细菌或病毒抗原。
[0184] 特别是，抗体或抗原结合片段或配体结合片段可以结合的靶标可以是CD抗原、生长因子、生长因子受体、细胞表面受体（如凋亡受体）、蛋白激酶或癌蛋白。因而抗体或抗原结合片段，例如嵌合的、人化的或人类IgG1、IgG2或IgG4单克隆抗体或抗体片段，可以能够结合至肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、糖蛋白IIb/IIIa、CD33、CD52、CD20、CD11a、CD3、RSV F蛋白、HER2/neu（erbB2）受体、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子受体（EGFR），抗-TRAILR2（抗-肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体受体2）、补体系统蛋白C5、α4整联蛋白或IgE。
[0185] 更具体地，在抗癌单克隆抗体的情况下，抗体或抗原结合片段可以是，能够结合上皮细胞粘附分子（EpCAM）抗体或抗体片段、粘蛋白-1（MUC1/Can-Ag）、EGFR、CD20、癌胚抗原（CEA）、HER2、CD22、CD33、Lewis Y和前列腺特异性膜抗原（PMSA）。此外，典型地，抗体是嵌合的、人化的或人类IgG1、IgG2或IgG4单克隆抗体。
[0186] 适宜的单克隆抗体包括，但不局限于，英利昔单抗（嵌合抗体，抗-TNFα）、阿达木单抗（人类抗体，抗-TNFα）、巴利昔单抗（嵌合抗体，抗-IL-2）、阿昔单抗（嵌合抗体，抗-GpIIb/IIIa）、达克珠单抗（人化抗体，抗-IL-2）、吉妥珠单抗（人化抗体，抗-CD33）、阿仑单抗（人化抗体，抗-CD52）、依决洛单抗（鼠Ig2a，抗-EpCAM）、利妥昔单抗（嵌合抗体，抗-CD20）、帕利珠单抗（人化抗体，RSV靶标）、曲妥珠单抗（人化抗体，抗-HER2/neu（erbB2）受体）、贝伐单抗（人化抗体，抗-VEGF）、西妥昔单抗（嵌合抗体，抗-EGFR）、依库珠单抗（eculizumab）（人化抗体，抗-补体系统蛋白C5）、依法珠单抗（人化抗体，抗-CD11a）、替伊莫单抗（鼠抗体，抗-CD20）、莫罗单抗-CD3（鼠抗体，抗-T细胞CD3受体）、那他珠单抗（人化抗体，抗-α4-整联蛋白）、尼妥珠单抗（nimotuzumab）（人化IgG1，抗-EGF受体）、奥马珠单抗（人化抗体，抗-IgE）、帕尼单抗（panitumumab）（人类抗体，抗-EGFR）、雷珠单抗（兰尼单抗，ranibizumab）（人化抗体，抗-VEGF）、雷珠单抗（人化抗体，抗-VEGF）以及I-131托西莫单抗（人化抗体，抗-CD20）。
[0187] 抗体的制备
[0188] 可以获得适宜的单克隆抗体，例如通过杂交瘤方法（例如如首先由Kohler et al Nature 256:495(1975)描述的)、通过重组DNA方法和/或接着从噬菌体或其他抗体库中分离。
[0189] 杂交瘤技术包括用期望的免疫原免疫宿主动物的（例如小鼠、大鼠或猴子）以诱发（elicit）淋巴细胞，这些淋巴细胞生产或能够产生特异性结合至免疫原的抗体。可替代地，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用适宜的融合试剂，如聚乙二醇，与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。
[0190] 作为分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的替代方案，也可以从抗体噬菌体库中分离抗体或抗体片段。特别地，噬菌体展示可以用于鉴定抗原结合片段或配体结合片段，以用于本发明的方法。通过使用噬菌体展示用于高通量筛选抗原-抗体结合相互作用或配体-抗体结合相互作用，可以从噬菌体展示库中分离在噬菌体外壳蛋白（外被蛋白，coat proteins）上展示的抗体片段。通过在固体载体上固定靶标抗原或配体，展示能够结合该抗原或配体的抗体的噬菌体将保留在载体上而其它的可以通过洗涤去除。然后可以洗脱和分离那些保持结合的噬菌体，例如在选择或淘选（panning）的重复循环之后。在最后的选择中洗脱的噬菌体可以用于感染适宜的细菌宿主，从该宿主中可以收集噬菌粒和离体的相关DNA序列，并测序以鉴定相关的抗原结合片段或配体结合片段。
[0191] 使用本领域已知的技术从动物中分离包含期望的抗体的多克隆抗血清。可以使用诸如绵羊、兔子或山羊的动物，例如，通过向动物注射关注的抗原（免疫原），有时在多次注射之后，用于产生针对这种抗原的抗体。在收集抗血清之后，使用免疫吸附剂纯化或在本领域中已知的其他技术，可以纯化抗体。
[0192] 可以由天然产生的核苷酸序列或合成序列重组产生本发明的方法中使用的抗体或抗原结合片段或配体结合片段。这样的序列可以是，例如，通过PCR从适宜的天然产生的模板分离的（例如从细胞中分离的DNA或RNA）、从库（例如表达库）中分离的核苷酸序列、通过向天然产生的核苷酸序列中引入突变体制备的核苷酸序列（使用任何适宜的已知技术，例如错配PCR）、通过PCR使用重叠引物制备的核苷酸序列、或已经使用用于DNA合成技术制备的核苷酸序列。也可以使用诸如亲和成熟（例如，从合成的、随机的或天然产生的免疫球蛋白序列开始）、CDR接枝、镶饰（veneering）、组合来源于不同免疫球蛋白序列的片段的技术、以及其他用于工程设计免疫球蛋白序列的其他技术。
[0193] 根据本领域技术人员熟知的技术，关注的这样的核苷酸序列可以在体外或体内用于产生抗体或抗原结合片段。
[0194] 对于重组产生单克隆抗体或抗体片段，分离编码其的核酸并将其插入至可复制的载体中用于进一步克隆或用于表达。载体组分通常包括，但不局限于一种或多种下列各项：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。用于克隆或表达载体中的DNA的适宜宿主细胞是原核生物、酵母或更高级的真核生物细胞（如大肠杆菌）以及哺乳动物细胞（如CHO细胞）。用于表达糖基化的抗体的适宜宿主细胞来源于多细胞生物体。用表达或克隆载体转化宿主细胞用以产生抗体，并在适当的情况下使培养在常规营养培养基中的宿主细胞修饰（改性），用以引入启动子、选择转化剂、或扩增编码期望的序列的基因。
[0195] 当使用重组技术时，可以在细胞内产生抗体或直接将抗体分泌至培养基中。如果抗体是在细胞内产生的，作为第一步，去除宿主细胞或溶解细胞的颗粒状碎片，例如，通过离心或超滤。在抗体分泌至培养基中的情况下，通常首先使用商购的蛋白浓缩过滤器浓缩来自表达系统的上清液。例如，使用羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析，可以纯化由细胞制备的抗体组合物。
[0196] 然后可以分离纯化的抗体，并且可选地将纯化的抗体制成抗原结合片段或配体结合片段和/或衍生化。
[0197] 酶
[0198] 任何蛋白酶适宜用于本发明。这样的酶包括活性部位并且能够结合底物。酶可以是由一条多肽链构成的单体。可替代地，酶可以是由多条多肽链构成的二聚体、四聚物或寡聚体（低聚体）。二聚体、四聚物或寡聚体可以分别是同源或异源的二聚体、四聚物或寡聚体。例如，酶在赋予完全的生物活性或酶功能之前，可能需要形成聚集体（例如二聚体、四聚物或寡聚体）。酶可以是变构酶、脱辅基酶或全酶。
[0200] 酶结合的部分可以包括植物凝集素（凝集素，lectin）、抗生物素蛋白、代谢物、激素、核苷酸序列、类固醇、糖蛋白、糖脂或这些组分的任何衍生物。
[0201] 辅因子包括无机化合物（例如金属铁如铁、锰、钴、铜、锌、硒、钼）或有机化合物（例如黄素或血红素）。适宜的辅酶包括核黄素、硫胺（硫胺素，thiamine）、叶酸，这些辅酶可以+ -携带由NAD或NADP 携带的氢离子（H）、由辅酶A携带的乙酰基、由叶酸携带的甲酰基、次甲基或甲基、以及由S-腺苷甲硫氨酸携带的甲基。
[0202] 在另一个实施方式中，酶可以是PEG化的，特别是如果酶是给予患者的治疗性酶。因此，一个或多个聚乙二醇分子可以共价连接至酶分子。1至3个聚乙二醇分子可以共价连接至每一个酶分子。这样的PEG化主要用于降低酶的免疫原性，和/或提高酶的循环半衰期。
[0203] 适宜的酶包括归类于国际生物化学与分子生物学酶联盟（International Union of Biochemistry and Molecular Biology Enzyme）分类系统的EC号下的任何酶，包括氧化还原酶（EC1）、转移酶（EC2）、水解酶（EC3）、裂合酶（EC4）、异构酶（EC5）或连接酶（EC6）。典型的酶是工业上使用的任何酶。
[0204] 对于任何类型的底物特异性的酶适宜用于本发明。适宜的酶的实例包括α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、丝氨酸蛋白酶、内肽酶（例如半胱氨酸内肽酶）、半胱天冬酶（caspase）、胃促胰酶、胰凝乳蛋白酶、内肽酶、颗粒酶、木瓜蛋白酶、胰弹性蛋白酶、水稻素（oryzin）、纤维蛋白溶酶（纤溶酶，plasmin）、肾素、枯草杆菌蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶（trypsin）、类胰蛋白酶、尿激酶、淀粉酶（例如α-淀粉酶）、木聚糖酶、脂肪酶、谷氨酰胺转移酶、细胞壁降解酶、葡聚糖酶（例如β-葡聚糖酶）、葡糖淀粉酶、凝结酶、乳蛋白质水解产物（milk protein hydrolysate）、细胞壁降解酶、血凝固酶、裂纤酶（hementin）、溶菌酶、纤维降解酶、肌醇六磷酸酶（植酸酶，phytase）、纤维素酶、半纤维素酶、聚合酶、蛋白酶、甘露聚糖酶或葡糖淀粉酶。
[0205] 因而根据本发明保存的酶可以是，用于治疗疾病或其他医学病症的治疗性酶，在生产诸如葡萄糖或果糖的散装产品工业中、在食品处理和食品分析中、在洗衣店和自动洗碗盘去污剂中、在纺织品、纸浆、纸和动物饲料工业中使用的酶，作为在合成或精细化学品中、在诸如临床诊断的诊断应用中、在生物传感器或基因工程中的催化剂。
[0206] 本发明可以应用的治疗性酶包括：
[0207] -脱氧核糖核酸酶（DNA酶），例如重组脱氧核糖核酸酶I（如在患有囊肿性纤维症的儿童的肺部粘液中裂解DNA的阿法脱氧核糖核酸酶（阿法链道酶，Pulmozyme）或链道酶（Dornase））；
[0208] -胃脂肪酶（如Meripase），其是用于治疗与外分泌胰脂肪酶不足相关的脂类吸收不良的重组哺乳动物胃脂肪酶；
[0209] -甘露糖封端的（mannose-terminated）葡糖脑苷脂酶，如伊米苷酶（Cerezyme），其是用于治疗戈谢病（Gaucher disease）的甘露糖封端（终止）的葡糖脑苷脂酶，戈谢病是由酶葡糖脑苷脂酶缺陷引发的遗传紊乱；
[0210] -α-半乳糖苷酶，其用于治疗相关的糖原储存疾病法布里病；
[0211] -腺苷脱氨酶（ADA），如用于治疗ADA缺陷的培加酶，ADA缺陷其为一种严重的合并性免疫缺陷；
[0212] -苯丙氨酸氨裂合酶，如用于治疗苯丙酮尿的PEG化的重组苯丙氨酸氨裂合酶科望（Kuvan）；
[0215] -L-天冬酰胺酶，其用于治疗幼年急性成淋巴细胞白血病；
[0216] -因子VIIa，患有血友病的患者使用；
[0217] -因子IX，其用于治疗血友病B；以及
[0218] -超氧化物歧化酶，如用于治疗家族性肌肉萎缩性侧索硬化的牛超氧化物歧化酶奥古蛋白。
[0219] 用于诸如烘焙的食品应用的酶包括淀粉酶、木聚糖酶、氧化还原酶、脂肪酶、蛋白酶和谷氨酰胺转移酶（转谷氨酰胺酶，transglutaminase）。用于果汁生产和水果加工的酶包括细胞壁降解酶。用于酿造的酶包括在打浆（淀粉糖化，mashing）中的细菌α-淀粉酶、β-葡聚糖酶和葡糖淀粉酶，在发酵中的真菌α-淀粉酶，和在发酵后中的半胱氨酸内肽酶。用于乳制品应用的酶包括凝结酶、脂肪酶、溶菌酶、乳蛋白水解产物、谷氨酰胺转移酶和β-半乳糖苷酶。用于去污剂组合物的酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶和甘露聚糖酶。用于动物饲料的酶包括纤维降解酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶和淀粉酶。用于纸浆和纸加工的酶包括纤维素酶和半纤维素酶。
[0220] 可替代地，酶可以是用于研究与开发应用的酶。例如，荧光素酶可以用于在细胞培养液、单独的细胞和整个生物体中的基因表达的实时成像。而且，荧光素酶可以用作分子研究中的报告蛋白质，例如测试用荧光素酶转染的细胞中特定启动子转录活性。酶也可以用于药物设计，例如在实验室中测试酶抑制剂。而且，酶可能用于生物传感器（例如，使用葡糖氧化酶的血糖生物传感器）。
[0221] 荧光素酶可以是萤火虫、甲虫或铁路虫（railroad worm，苹实蝇或铁路蝇）萤光素酶或其衍生物。特别地，荧光素酶可以来源于北美洲萤火虫（（北美萤火虫，Phorinus pyralis））、源氏萤（Luciola cruciata）（日本萤火虫）、平家萤（Luciola lateralis）（日本萤火虫）、Luciola mingelica（俄罗斯萤火虫）、Beneckea hanegi（海洋细菌荧光素酶）、Pyrophorus plagiophthalamus（叩头虫（磕头虫，click beetle））、Pyrocelia miyako（萤火虫）、大场雌光萤（Ragophthalamus ohbai）（铁路虫）、Pyrearinus termitilluminans（叩头虫）、Phrixothrix hirtus（铁路虫）、Phrixothrix vivianii、姬萤（Hotaria parvula）和Photuris pensilvanica，以及它们的突变体。
[0222] 典型地，α-半乳糖苷酶或β-半乳糖苷酶来源于细菌（如大肠埃希氏菌）、哺乳动物（如人、小鼠、大鼠）或其他真核生物。
[0223] 酶可以是天然产生的酶或合成酶。这样的酶可以来源于宿主动物、植物或微生物。
[0224] 用于产生酶的微生物株可以是原始株（天然株，native strain）或突变株，该突变株来源于原始株，通过连续培养及选择，或使用重组DNA技术诱变和选择。例如，微生物可以是真菌，例如，嗜热真菌属（Thermomyces）、枝顶孢属（acermonium）、曲霉菌属（Aspergillus）、青霉菌属（Penicillium）、毛霉菌属（Mucor）、脉孢菌属（链孢霉属，Neurospora）和木霉属（Trichoderma）。诸如酿酒酵母（Saccharomyces cereviseae）或毕赤酵母（Pishia pastoris）的酵母也可以用于产生在本发明的方法中使用的酶。
[0225] 使用诸如合理设计（rational design）、导向演化（directed evolution）和DNA改组（DNA shuffling）的在本领域中熟知的蛋白质工程技术可以得到合成酶。
[0226] 可以用编码期望的酶的核苷酸序列转化宿主生物体，并且在有助于产生酶以及促进来自细胞和/或培养基的酶回收的条件下培养宿主生物体。
[0227] 疫苗免疫原
[0228] 适宜用于本发明的疫苗免疫原包括疫苗的任何免疫原性组分。在用作针对特定疾病或医学病症（医疗条件，medical condition）的疫苗时，疫苗免疫原包括可以在个体中引发免疫应答（免疫反应）的抗原。在配制疫苗制剂之前可以以自身提供，或者其可以作为疫苗制剂的一部分提供疫苗免疫原。疫苗免疫原可以是亚单位疫苗、作为疫苗或类毒素是有用的结合物（缀合物）。疫苗免疫原可以是蛋白质、细菌特异性蛋白、粘蛋白、糖蛋白、肽、脂蛋白、多糖、肽聚糖、核蛋白或融合蛋白。
[0229] 疫苗免疫原可以来源于微生物（如细菌、病毒、真菌）、原生动物、肿瘤、恶性细胞、植物、动物、人或过敏原。优选疫苗免疫原不是病毒颗粒。因此，优选疫苗免疫原不是整个病毒或病毒粒、病毒样颗粒（VLP）或病毒核衣壳。在WO 2008/114021中描述了这样的病毒颗粒的保存。
[0230] 疫苗免疫原可以是合成的，例如，如使用重组DNA技术得到的。免疫原可以是与疾病相关的抗原，如与病原体相关的抗原、与肿瘤相关的抗原、与过敏反应相关的抗原、与神经缺陷相关的抗原、心血管疾病抗原、与风湿性关节炎相关的抗原。
[0231] 特别地，疫苗免疫原来自的病原体可以包括人乳头状瘤病毒（HPV）、人免疫缺陷病毒（HIV）、HSV2/HSV1、流感病毒（A、B和C型）、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、RSV病毒、鼻病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、诺瓦克病毒、肠道病毒、星状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、腺病毒、风疹病毒、人T细胞淋巴瘤I型病毒（HTLV-I)、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、痘病毒、痘苗病毒、沙门氏菌属、奈瑟氏菌属、疏螺旋体属、衣原体属（Clamydia）、博德特氏菌属（如百日咳博德特氏菌）、疟原虫属、弓形虫属（Coxoplasma）、肺炎双球菌属、脑膜炎球菌属、隐球菌属、链球菌属、霍乱弧菌、耶尔森氏菌属（特别是鼠疫耶尔森菌）、葡萄球菌属、嗜血杆菌属、白喉、破伤风、百日咳、埃希氏菌属、假丝酵母属（念球菌属，Candida）、曲霉菌属、内阿米巴属、贾第虫属和锥虫属（Trypanasoma）。疫苗可以进一步用于针对多种牲畜疾病提供适宜的免疫应答，如口蹄疫（包括血清型O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3和Asia-1）、冠状病毒、蓝舌病、猫白血病病毒、禽流感、亨德拉和尼帕病毒（hendra and nipah virus）、瘟病毒属、犬细小病毒、以及牛病毒性腹泻病毒。
[0233] 与过敏原有关的抗原包括适宜用于疫苗的任意过敏原抗原，以抑制给予疫苗的个体中的过敏反应（例如源于花粉、尘螨（dust mite）、昆虫、食物过敏原、灰尘、毒物、和寄虫生（parasites）的抗原）。
[0234] 亚单位疫苗免疫原(Subunit vaccine immunogen）
[0235] 适宜的亚单位疫苗免疫原包括来源于微生物（例如病毒或细菌）的蛋白质、脂蛋白或糖蛋白的任何免疫原性的亚基（亚单位，subunit）。可替代地，亚单位疫苗免疫原可以来源于与疾病相关的抗原，如肿瘤相关蛋白质。亚单位疫苗免疫原可以是天然产生的分子或合成的蛋白质亚基（亚单位）。疫苗免疫原可以是全长病毒或细菌的蛋白质，糖蛋白或脂蛋白，或全长病毒或细菌的蛋白质、糖蛋白或脂蛋白的片段。
[0236] 适宜作为亚单位疫苗免疫原的病毒蛋白质可以来源于结构的或非结构的病毒蛋白质。适宜的病毒亚单位免疫原即使在缺乏该病毒的其他部分时也能够刺激对象的免疫系统。适宜的病毒亚单位疫苗免疫原包括衣壳蛋白质、表面糖蛋白、包膜蛋白、六邻体蛋白（hexon protein）、纤维蛋白、外壳蛋白（coat protein）或免疫原性片段或这样的蛋白质或糖蛋白的衍生物。
[0237] 例如，病毒亚单位疫苗免疫原可以由流感A、B或C病毒的表面蛋白质构成。特别地，疫苗免疫原可以是凝血素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白、M1、M2、NS1、NS2（NEP）、PA、PB1、PB1-F2和/或PB2蛋白，或任何这些蛋白的免疫原性衍生物或片段。免疫原可以是HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15和/或HA16，任何其免疫原性片段或衍生物，以及HA蛋白质、片段或衍生物的任何组合。神经氨酸酶可以是神经氨酸酶1（N1）或神经氨酸酶2（N2）。
[0238] 病毒亚单位疫苗免疫原可以是乙型肝炎病毒的病毒包膜蛋白或其片段或衍生物。例如，亚单位疫苗免疫原可以是乙型肝炎表面抗原（HbsAg）或其免疫原性片段或衍生物。
[0239] 典型地，细菌亚单位疫苗免疫原是细菌细胞壁蛋白（例如鞭毛蛋白、外膜蛋白、外表面蛋白质）、多糖抗原（例如来自于脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitis）、肺炎链球菌（链球菌性肺炎，Strptococcus pneumonia））、毒素，或这样的蛋白质、多糖或毒素的免疫原性片段或衍生物。
[0240] 天然产生的蛋白质的衍生物包括具有一个或多个氨基酸的添加、替换和/或缺失的蛋白质。可以使用本领域已知的技术产生这样的氨基酸修饰，如定点突变（定向诱变，site-directed mutagenesis）。
[0241] 亚单位疫苗免疫原可以是融合蛋白质，包括与例如细菌或病毒的蛋白质或其免疫原性片段或衍生物连接的融合蛋白伴侣。适宜的融合蛋白伴侣可以防止在融合蛋白表达之后病毒融合蛋白组装成多聚体形式。例如，如果在缺乏融合蛋白伴侣的情况下重组表达病毒蛋白，融合蛋白伴侣可以防止可能自发形成的病毒样结构（类病毒结构，virus-like structure）的形成。适宜的融合伴侣也可以促进融合蛋白的纯化，或提高融合蛋白产物的重组表达。融合蛋白可以是结合麦芽糖的蛋白质、能够结合金属离子的多组氨酸区段、结合至抗体的抗原、S-标签、谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、β-半乳糖苷酶、表位标签、绿色荧光蛋白、链霉亲和素或二氢叶酸还原酶。
[0242] 可以使用本领域已知的技术制备亚单位疫苗免疫原，用于制备例如，经分离的肽、蛋白质、脂蛋白或糖蛋白。例如，编码关注的重组蛋白的基因是可以确定（识别）的，且可以从病原体中分离，并且在大肠杆菌或一些其他适宜的宿主中表达以大量产生蛋白质。然后从宿主细胞中分离和纯化关注的蛋白质（例如使用亲和层析纯化）。
[0243] 在病毒亚基（亚单位）免疫原的情况下，亚基（亚单位）可以在分离病毒颗粒之后从病毒颗粒中纯化，或通过在适宜的宿主细胞中病毒亚基（亚单位）蛋白的重组DNA克隆和表达。用于制备病毒颗粒的适宜宿主细胞必须能够用病毒感染并且能够产生期望的病毒抗原。这样的宿主细胞可以包括微生物、培养的动物细胞、转基因植物或昆虫幼虫。可以从宿主细胞中分泌作为可溶性蛋白质的一些关注的蛋白质。在病毒包膜或表面蛋白的情况下，这样的蛋白质可能需要用去污剂溶解，以从病毒包膜中提取它们，之后相分离，以便去除去污剂。
[0244] 亚单位疫苗免疫原可以在同一种制剂中结合，并且与一种、两种、三种以上其他亚单位疫苗免疫原一起保存。
[0245] 类毒素
[0246] 本发明可以应用于类毒素。类毒素是一种毒素，例如来自于病原体、动物或植物，其为免疫原性的，但是是已经失活的（例如通过基因突变、化学处理或通过与另外的部分结合）以消除对目标对象的毒性。毒素可以是例如，蛋白质、脂蛋白、多糖、脂多糖或糖蛋白。因而类毒素可以是已经类毒素化（toxoided）的内毒素或外毒素。
[0247] 类毒素可以是来源于细菌毒素的类毒素，如破伤风毒素、白喉毒素、百日咳毒素、肉毒杆菌毒素、艰难梭菌（C.difficile）毒素、霍乱毒素、志贺毒素、炭疽毒素、细菌溶细胞素类或肺炎球菌溶血素，和其片段或衍生物。因此类毒素可以是破伤风类毒素、白喉类毒素或百日咳类毒素。类毒素可来源的其他毒素包括从动物或植物中分离的毒物（毒素，poison），例如，从西部菱斑响尾蛇（西部菱背响尾蛇，Crotalis atrox）中。典型地，类毒素来源于肉毒杆菌毒素或炭疽毒素。例如，肉毒毒素可以来源于血清型A、B、C、D、E、F或G的肉毒梭菌（Clostridium botulinum）。来源于肉毒杆菌毒素的疫苗免疫原可以在同一种制剂中结合，并且与一种或多种来源于肉毒杆菌毒素（例如来源于肉毒杆菌血清型A、B、C、D、E、F或G的免疫原的组合，如例如A、B和E）的其他疫苗免疫原一起保存。
[0248] 炭疽毒素可以来源于炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）株。类毒素可以由炭疽毒素的一种或多种组分、或这样的组分的衍生物中的一种或多种组分构成，如保护性抗原（PA）、水肿因子（EF）和致死因子（LF）。典型地，来源于炭疽毒素的类毒素由保护性抗原（PA）构成。
[0249] 类毒素可以结合至另外的部分，例如，作为融合蛋白，用作类毒素疫苗。结合类毒素（conjugate toxoid）中的适宜部分包括有助于类毒素纯化的（例如组氨酸标签）或对目标对象降低毒性的物质。可替代地，通过增加附着在类毒素上的抗原的免疫原性，类毒素可以充当佐剂。例如，流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的B多糖可以与白喉类毒素相结合。
[0250] 疫苗免疫原可以在同一种制剂中结合，并且与一种、两种、或三种以上的疫苗免疫原一起保存。例如，白喉类毒素可以用于与破伤风类毒素和百日咳疫苗一起保存（DPT）。白喉类毒素可以仅与破伤风类毒素一起保存（DT），或者白喉类毒素可以与白喉类毒素、破伤风类毒素和无细胞百日咳（acellular Pertussis）一起保存（DTaP）。
[0251] 用于制备类毒素的技术对本领域的技术人员是熟知的。可以在适宜的宿主细胞中克隆和表达毒素基因。然后纯化毒素产物，并且毒素产物可以化学转化为类毒素，例如，使用甲醛（福尔马林）或戊二醛。可替代地，可以工程化设计毒素基因，以使其编码具有降低的或没有毒性的毒素，例如通过一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或替换。然后修饰的毒素可以在适宜的宿主细胞中表达并分离。也可以通过将毒素基因或其片段通过结合至另外的部分（例如多糖或多肽）使毒素基因的毒性失活。
[0252] 结合的疫苗免疫原
[0253] 结合的疫苗免疫原可以是将抗原（例如多糖或其他半抗原）结合至刺激附着在其上的抗原的免疫原性的载体部分（例如肽、多肽、脂蛋白、糖蛋白、粘蛋白或其任何免疫刺激衍生物或片段）。例如，结合的疫苗免疫原可以是将重组蛋白、重组脂蛋白或重组糖蛋白结合至关注的免疫原（例如多糖）。
[0254] 结合的疫苗免疫原可以使用在针对肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌（A、B、C、X、Y和W135株）或肺炎球菌（肺炎双球菌，pneumococcal）株的疫苗中。例如，疫苗可以是例如，七价肺炎双球菌CRM197结合疫苗（PCV7）、MCV-4或流感嗜血杆菌b型（Hib）疫苗。
[0255] 结合的疫苗免疫原可以在同一种制剂中结合，并且与一种、两种、三种以上结合的疫苗免疫原一起保存。
[0256] 用于制备结合的多糖-蛋白质结合物的方法是本领域熟知的。例如，经由连接子（例如B-丙酰胺基、硝基苯基乙胺、卤代烷基卤化物、糖苷键）可以发生结合。
[0257] 聚乙烯亚胺
[0258] PEI是一种脂肪族多胺，以指定的-(CH2-CH2-NH)-重复化学单元为特征。在本文中提及的PEI由聚乙烯亚胺均聚物或共聚物。聚乙烯亚胺共聚物可以是无规的或嵌段共聚物。例如，PEI可以由聚乙烯亚胺与另外的诸如聚乙二醇（PEG）的聚合物的共聚物构成。聚乙烯亚胺可以是直链的或支链的（支化的）。
[0259] 提及的PEI也包括聚乙烯亚胺的衍生形式。聚乙烯亚胺包含在各种位置的氮原子。氮原子存在于氨基末端，例如R-NH2，并存在于内部基团（如中断聚合物结构中的烷基或亚烷基），例如R-N(H)-R'，以及存在于聚合物支链的交叉点处，例如R-N(-R')-R″，其中R、R'和R″可以是例如，亚烷基基团。除了氢原子之外或替代氢原子，烷基或芳基基团可以连接至氮中心。这样的烷基和芳基基团可以是取代或未取代的。烷基基团典型地是C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基或叔丁基。芳基基团典型地是苯基。
[0260] PEI可以是已经共价连接至各种其他聚合物（如聚乙二醇）的聚乙烯亚胺。已产生了PEI的其他改性的结构（版本，version），并且一些是商用的：支链的（支化）PEI 25kDa、LMW-PEI 5.4kDa、假树枝状（假枝状，Pseudodendrimeric）PEI、PEI-SS-PEI、PEI-SS-PEG、PEI-接枝-PEG（PEI-g-PEG）、PEG-共聚-PEI（PEG-co-PEI）、PEG-接枝-PEI（PEG-g-PEI）、PEI-共聚-L-乳酰胺-共聚-琥珀酰胺、PEI-共聚-N-(2-羟乙基-乙烯亚胺）、PEI-共聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、PEI-接枝-PCL-嵌段-PEG、PEI-SS-PHMPA、PEI-接枝-葡聚糖10,000以及PEI-接枝-转铁蛋白-PEG、
-接枝-PEI。PEI可以是预甲基化的聚乙烯亚胺或聚乙烯亚胺-乙磺酸。
-接枝-PEI。PEI可以是预甲基化的聚乙烯亚胺或聚乙烯亚胺-乙磺酸。
[0261] PEI具有大范围的数均摩尔质量（数均分子量）（Mn），例如，在300Da至800kDa之间。优选地，数均摩尔质量为300至2000Da、在500至1500Da、1000至1500Da、10至100kDa、20至100kDa、30至100kDa、40至100kDa、50和100kDa、60至100kDa、50至70kDa或55至
65kDa之间。PEI的大约60kDa的相对高Mn或1200Da的相对低的Mn是适宜的。
65kDa之间。PEI的大约60kDa的相对高Mn或1200Da的相对低的Mn是适宜的。
[0262] 优选地，PEI的重均摩尔质量（重均分子量）（Mw）为500Da至1000kDa。最优选地，PEI的Mw为500Da至2000Da、1000Da至1500Da、或1至1000kDa、100至1000kDa、250至1000kDa、500至1000kDa、600至1000kDa、750至1000kDa、600至800kDa、700至800kDa。大约750kDa的相对高的Mw或大约1300Da的相对低的Mw是适宜的。
[0263] 可以由本领域技术人员熟知的方法测定PEI的重均摩尔质量（重均分子量）（Mw）和数均摩尔质量（数均分子量）（Mn）。例如，Mw可以由光散射、小角度中子散射（SANS）、X-射线散射或沉降速度测定。可以例如，通过凝胶渗透色谱法、粘度测定法（马克-霍温克方程）以及诸如蒸汽压渗透法或端基滴定的依数性方法测定Mn。
[0264] PEI的各种形式是商购的（例如Sigma、Aldrich）。例如，在本文中使用的PEI的支链的、相对高的分子量形式（Mn约为60kDa而Mw约为750kDa）是商购的（Sigma P3143）。该PEI可以由以下化学式表示：
[0265]
[0266] 本文中使用的PEI的相对低的分子量形式也是商购的（例如Aldrich482595），其具有1300Da的Mw和1200Da的Mn。
[0267] 化学式（I）的化合物或其生理可接受的盐或酯以及化学式（II）的化合物或其生理可接受的盐或酯
[0268] 化学式（I）和（II）的化合物可以是以其生理可接受的盐或酯存在的。
[0270] 典型地，酯是C1-6的烷基酯，优选C1-4烷基酯。因此酯可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁酯。优选的是乙基酯。
[0271] 如在本文中使用的，C1-6烷基优选的是C1-4烷基。优选的烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。特别优选的是甲基和乙基。
[0272] 为了避免疑议，化学式（I）和化学式（II）的化合物的定义也包括其中羧酸根阴离子是质子化的以给出-COOH以及铵或锍阳离子与药用阴离子结合（缔合）的化合物。此外，为了避免疑议，可以以任何互变异构或对映体的形式使用上文中定义的化合物。
[0273] 化学式(I）的化合物
[0274] 典型地，R1表示氢或C1-6烷基，并且R4表示氢。典型地，R2表示氢或C1-6烷基。优选地，R1表示氢或C1-6烷基，R4表示氢，并且R2表示氢或C1-6烷基。更优选地，R1表示氢或C1-6烷基，R4表示氢，并且R2表示C1-6烷基。
[0275] 优选地，化学式（I）的化合物是N-C1-6烷基-甘氨酸、N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯，更优选的是N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯。典型地，烷基是C1-4烷基基团。优选的烷基基团选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。甲基和乙基是特别优选的。
[0276] 优选的化学式（I）的化合物是N-甲基甘氨酸、N,N-二甲基甘氨酸或N,N,N-三甲基甘氨酸或其生理可接受的盐或酯。N-甲基-甘氨酸也称为肌氨酸。N,N-二甲基甘氨酸也称为二甲基甘氨酸（DMG）或2-(二甲氨基)-乙酸。N,N,N-三甲基甘氨酸也称为三甲基甘氨酸（TMG）。
[0277] 可替代地，化学式（I）的化合物典型地是化学式（IA）的甘氨酸衍生物或其生理可接受的盐或酯：
[0278]
[0279] 其中，R5和R6独立地表示C1-6烷基，例如C1-4烷基（如甲基或乙基）；并且R7表示C1-6烷基，例如C1-4烷基（如甲基或乙基），或-(CH2)2-5NHC(O)(CH2)5-15CH3。优选的化学式（IA）的化合物是三甲基甘氨酸（TMG）和椰油酰胺丙基甜菜碱（CAPB）或其生理可接受的盐或酯。优选的是三甲基甘氨酸。
[0280] 可替代地，化学式（I）的化合物典型地是化学式（IB）的脯氨酸衍生物或生理可接受的盐或酯：
[0281]
[0282] 其中，R8和R9独立地表示C1-6烷基，例如C1-4烷基，如甲基或乙基。优选地，化学式（IB）的化合物是S-脯氨酸衍生物。优选地，R8和R9都表示甲基；这种化合物称为脯氨酸甜菜碱。特别优选的是S-脯氨酸甜菜碱或其生理可接受的盐或酯：
[0283]
[0284] 化学式（IA）的化合物或其生理可接受的盐或酯是优选的。
[0285] 优选地，化学式（I）的化合物是N,N-二甲基甘氨酸或N,N,N-三甲基甘氨酸或其生理可接受的盐或酯。最优选地，化学式（I）的化合物是N,N-二甲基甘氨酸或其生理可接受的盐或酯。
[0286] 化学式(II）的化合物
[0287] 典型地，Rc的羧酸盐取代基和胺取代基被连接至Rc烷基部分的相同碳原子。典型地，Rc是C2-4或C2-3烷基部分。典型地，Rc是C2-4或C2-3烷基部分。
[0288] 典型地，化学式（II）的化合物是化学式（IIA）的砜化合物或其生理可接受的盐或酯：
[0289]
[0290] 其中，Rc和Rd独立地表示C1-6烷基，例如C1-4烷基。优选的烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。甲基和乙基是特别优选的。优选的砜化合物是甲磺酰基甲烷（MSM），也称为二甲基砜（DMSO2）。
[0291] 典型地，化学式（II）的化合物是化学式（IIB）的化合物或其生理可接受的盐或酯：
[0292]
[0293] 其中，Re和Rf独立地表示C1-6烷基，例如C1-4烷基（如甲基或乙基），并且Rg表示用羧酸根阴离子以及用胺（-NH2）部分取代的C1-6烷基，例如C1-4烷基（如甲基或乙基）。优选地，羰酸盐取代基和胺取代基被连接在相同的碳原子上。优选的化学式（IIB）的化合物是S-甲基-L-甲硫氨酸（SMM）或其生理可接受的盐或酯。
[0294] 甘氨酸衍生物
[0295] 赋形剂可以是N-烷基-甘氨酸、N,N-二烷基-甘氨酸或N,N,N-三烷基-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯。烷基典型地是C1-6烷基，如C1-4烷基。优选的烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。特别优选的是甲基和乙基。
[0296] 本发明中使用的优选的甘氨酸衍生物是N-甲基甘氨酸、N,N-二甲基甘氨酸、N,N,N-三甲基甘氨酸和其生理可接受的盐和酯。N-甲基-甘氨酸也称为肌氨酸。N,N-二甲基甘氨酸也称为二甲基甘氨酸（DMG）或2-(二甲氨基)-乙酸。N,N,N-三甲基甘氨酸简称为三甲基甘氨酸（TMG），并且已经在上文中作为甜菜碱化合物提及。
[0297] 典型地，盐是具有生理可接受的酸的盐，因此包括用诸如盐酸或硫酸的无机酸或诸如柠檬酸、酒石酸、苹果酸、马来酸、扁桃酸、富马酸（反丁烯二酸）或甲磺酸的有机酸形成的那些。优选的是盐酸盐。
[0298] 典型地，酯是C1-6烷基酯，优选C1-4烷基酯。因此酯可以是甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯、异丁酯或叔丁酯。优选的是乙酯。
[0299] 包含N-烷基化的甘氨酸衍生物和砜化合物的溶液
[0300] 1、N-烷基化的甘氨酸衍生物
[0301] N-烷基化的甘氨酸衍生物是N-C1-6烷基-甘氨酸，N,N-二(C1-6烷基)-甘氨酸或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸。典型地，烷基基团是C1-4烷基基团。优选的烷基基团选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。特别优选的是甲基和乙基。
[0302] 本发明中使用的优选的甘氨酸衍生物是N-甲基甘氨酸、N,N-二甲基甘氨酸、N,N,N-三甲基甘氨酸。N-甲基-甘氨酸也称为肌氨酸。N,N-二甲基甘氨酸也称为二甲基甘氨酸（DMG）或2-(二甲氨基)-乙酸。N,N,N-三甲基甘氨酸称为三甲基甘氨酸（TMG）。
[0303] 可以采用N-烷基化的甘氨酸衍生物的生理可接受的盐或酯。因此：
[0304] -典型地，盐是具有生理可接受的酸的盐，因此包括可接受的诸如盐酸或硫酸的无机酸或诸如柠檬酸、酒石酸、苹果酸、马来酸、扁桃酸、富马酸（反丁烯二酸）或甲磺酸的有机酸形成的那些。优选的是盐酸盐。
[0305] -典型地，酯是C1-6烷基酯，优选C1-4烷基酯。因此，酯可以是甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯、异丁酯或叔丁酯。优选的是乙基酯。
[0306] 2、砜化合物
[0307] 砜化合物是化学式（IIC）的化合物：
[0308]
[0309] 其中，Ra和Rb独立地表示C1-6烷基，例如C1-4烷基。优选的烷基基团选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。特别优选的是甲基和乙基。优选的砜化合物是甲磺酰基甲烷（MSM），也称为二甲基砜（DMSO2）。
[0310] 糖类
[0311] 适宜用于本发明的糖类包括还原糖，如葡萄糖、果糖、甘油醛、乳糖、阿拉伯糖和麦芽糖；优选非还原糖，如蔗糖和棉子糖。糖类可以是单糖、二糖、三糖或其他低聚糖（寡糖）。术语“糖类”包括糖醇。
[0312] 单糖，如半乳糖和甘露糖；二糖如蔗糖、乳糖和麦芽糖；三糖如棉子糖；以及四糖如水苏糖是预期的。海藻糖、伞形糖、毛蕊花糖、异麦芽糖、纤维二糖、麦芽酮糖、松二糖、松三糖和蜜二糖也适宜用于本发明。适宜的糖醇是甘露醇。
[0313] 当使用两种或多种糖类时，对保持病毒的活性是特别有效的。可以使用两种、三种或四种糖。优选地，使用两种糖类，蔗糖和棉子糖。蔗糖是葡萄糖和果糖的二糖。棉子糖是由半乳糖、果糖和葡萄糖构成的三糖。
[0314] 水性溶剂
[0315] 水性溶剂通常是水。通常使用诸如注射用水的纯水。可替代地，可以使用生理盐水。
[0316] 其他组分
[0317] 水性溶液可以是缓冲的。可以使用任何适宜的生理用缓冲液，如磷酸盐缓冲液。典型地，pH将调节至4至9，优选5至8，特别地从约6.5至7.5。例如，精确的pH将取决于在病毒颗粒的水性溶液中的稳定性。
[0318] 为了稳定的目的，本发明的溶液应当防止微生物污染和增长。因此，可以存在防腐剂，例如以按重量计0.001%至1%的量。在配合品中可以使用的药用抗微生物剂的实例包括：
[0319] -季铵化合物（例如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵（十六烷基三甲基溴化铵，cetrimide）和西吡氯铵）；
[0320] -含汞药剂（例如硝酸苯汞、乙酸苯汞和硫柳汞）；
[0321] -醇类药剂（例如氯丁醇、苯乙醇和苯甲醇）；
[0322] -抗菌酯类（例如对羟基苯甲酸的酯）；
[0323] -螯合剂，如依地酸二钠（EDTA）；以及
[0324] -其他抗微生物剂，如氯己定、氯甲酚、山梨酸及其盐以及多粘菌素。
[0325] 有时期望存在张力调节剂以达到与体液的等渗性（等张性），使得对患者的给予时（具有）降低水平的刺激。适宜的张力调节剂的实例是氯化钠、葡萄糖和氯化钙。期望地，将以充足的量加入以实现该功能。优选地，存在按重量计0.1至10%的张力调节剂。
[0326] 也可以存在其他添加剂，如共溶剂（共增溶剂，co-solubilising agent）和佐剂。当本发明的溶液以疫苗存在时，通常存在佐剂。使用佐剂以便增加疫苗的潜能和/或调节体液的和细胞的免疫响应（免疫应答）。
[0327] 适宜的佐剂包括，但不局限于，矿物盐（无机盐）（例如氢氧化铝（“alum（铝盐）”）、磷酸铝、磷酸钙）、颗粒状佐剂（例如病毒颗粒（病毒体，virosome）、ISCOMS（皂角苷和脂类的结构化复合物））、微生物的衍生物（例如MPL（单磷酰基脂类A）、CpG基序、改性的毒素（包括诸如鞭毛蛋白的TLR佐剂）、植物衍生物（例如皂角苷（QS-21））和
[0328] 内源性免疫刺激性佐剂（例如细胞因子和任何其它充当免疫刺激剂以增强疫苗的效力的物质）。
[0329] 本发明的溶液的产生
[0330] 可以制备本发明的溶液，通过以任何方便的顺序，在选定的水性溶剂中混合病毒颗粒或多肽以及其他成分。以需要的量提供病毒颗粒或多肽，例如，以单位剂量的量。因而，可以提供溶液中的药物有效量的病毒颗粒或多肽。
[0331] 通常，病毒颗粒或多肽的制剂与（多种）赋形剂的水性溶液以及可选地一种或多种糖类混合。可以在无菌条件下混合溶液的组分。可替代地，可以首先混合溶液的组分并将得到的溶液灭菌。例如，在生产病毒颗粒或多肽期间可以加入（多种）赋形剂和/或可选的糖类，以便病毒颗粒或多肽在生产期间以及在最终产物中是稳定的。然而，在某些情况下，在配制最终产物之前在纯化步骤中，可以期望去除（多种）赋形剂和/或可选的糖类。
[0332] 混合有病毒颗粒或多肽的溶液可以是缓冲的，或者该溶液可以是在与病毒颗粒混合之后缓冲的。其可以是HEPES、磷酸盐缓冲的、Tris-缓冲的或纯水溶液。根据需要可以调节pH。典型地，溶液将具有4至9的pH，优选5至8以及特别是约6.5至7.5的pH。
[0333] 可选地，赋形剂或一种或多种糖类以向需要储存的溶液提供稳定性的浓度的存在。如在本文中限定（定义）的，赋形剂可以是本发明的赋形剂。通过常规实验可以测定和优化适宜的浓度。用于特定实例中的浓度将取决于多种因素，包括：
[0334] -特定的病毒颗粒或多肽；
[0335] -待使用的赋形剂；
[0336] -是否存在一种或多种糖类，如果存在，每一种糖类的特性（身份，类型，identity）。
[0337] 可以存在使得赋形剂和（多种）糖类协同相互作用的量的赋形剂和（多种）糖类。例如，协同相互作用可以在（a）诸如MSM和棉子糖的砜类以及（b）诸如DMG和蔗糖的N,N-二烷基甘氨酸之间出现。通过常规实验可以测定和优化适宜的浓度。
[0338] 然而，一般而言，基于Mn，PEI的浓度在20μM以下或优选15μM以下的范围内。基于Mw，PEI的浓度可以是10μM以下。PEI的这样的浓度对保持生物活性是特别有效的。
[0339] 在本发明的优选实施方式中，基于Mn，以以下浓度提供PEI：低于5μM、低于500nm、低于400nm、低于300nm、低于200nm、低于100nm、低于40nm、低于25nm、低于10nm、低于5nm、低于1nm、低于0.5nm、低于0.25nm、低于0.1nm、低于0.075nm、低于0.05nm、低于
0.025nm或低于0.0025nm。典型地，基于Mn的PEI浓度是0.0025nm以上、0.025nm以上或
0.1nm以上。基于Mn的适宜的PEI浓度范围是0.0025nm至5μM，或0.025至200nm。进一步优选的浓度范围是0.1nm至5μM以及0.1nm至200nm。
0.025nm或低于0.0025nm。典型地，基于Mn的PEI浓度是0.0025nm以上、0.025nm以上或
0.1nm以上。基于Mn的适宜的PEI浓度范围是0.0025nm至5μM，或0.025至200nm。进一步优选的浓度范围是0.1nm至5μM以及0.1nm至200nm。
[0340] 优选地，基于Mw的PEI浓度低于5μM、低于1μM、低于500nM、低于400nM、低于300nM、低于200nM、低于0.1μM，低于0.01μM、低于5nM、低于4nM、低于2nM、低于1nM、低于0.5nM、低于0.25nM、低于0.1nM、低于0.05nM、低于0.02nM、低于0.002nM或低于0.1nM。
典型地，基于Mw的PEI浓度是0.00001nM以上、0.001nM以上或0.01nM以上。基于Mw的适宜的PEI浓度范围是0.00001至20nM、0.0001至20nM或0.0001至5nM。
典型地，基于Mw的PEI浓度是0.00001nM以上、0.001nM以上或0.01nM以上。基于Mw的适宜的PEI浓度范围是0.00001至20nM、0.0001至20nM或0.0001至5nM。
[0341] 在一些情况下，发现在相对较低的浓度下，相对高的分子量的PEI比相对低的分子量的PEI是有效的。因此：
[0342] -在使用相对高Mw的PEI的情况下，例如20至1000kDa，优选基于Mw的PEI浓度为0.001至500nM、或0.001至400nM、或0.001至300nM、或0.001至200nM、或0.001至100nM、或0.001至50nM、或0.001至5nm。在使用相对低Mw的PEI的情况下，例如在300Da至10kDa的范围内，优选PEI的浓度为0.0001至10μM。
[0343] -在使用相对高Mn的PEI的情况下，例如在20至1000kDa的范围内，优选基于Mn的PEI的浓度为0.001至500nm、或0.001至400nm、或0.001至300nm、或0.001至200nm、或0.001至100nm、或0.001至50nm。在使用相对低Mn的情况下，例如在1Da至10kDa的范围内，使用的PEI浓度为0.0001至10μM。
[0344] 水性溶液中化学式（I）的化合物或其生理可接受的盐或酯或化学式（II）的化合物或其生理可接受的盐或酯的浓度通常在0.001M至2.5M的范围内，更特别地从0.01M至2.5M。例如，浓度范围可以是从0.1M至2.5M。采用的化学式（I）的化合物或其生理可接受的盐或酯或化学式（II）的化合物或其生理可接受的盐或酯的特定浓度将取决于若干因素，包括病毒颗粒或多肽；使用的特定化学式（I）的化合物或其生理可接受的盐或酯或化学式（II）的化合物或其生理可接受的盐或酯；是否存在一种、两种以上的糖类以及（多种）糖类的特点（种类）。因此：
[0345] -其中X表示-S(O)2-的化学式（II）的化合物、或诸如MSM的化学式（IIA）的化合物或其生理可接受的盐或酯的浓度优选从0.2mM至1M，如从0.35mM至1M、从3.5mM至0.5M、从0.035M至0.5M或从0.035M至0.25M。
[0346] -化学式（I）的化合物或化学式（IA）的化合物或诸如TMG的化学式（IB）的化合物的浓度或其生理可接受的盐或酯的浓度优选从0.01M至2M，如从0.07M至2M、从0.2M至1.5M、从0.23M至1.5M或从0.07M至0.7M。
[0347] -优选，其中X表示-S+(Rc)-的化学式（II）的化合物或诸如S-甲基-L-甲硫氨酸的化学式(IIB)的化合物或其生理可接受的盐或酯的浓度是从0.005M至2M，如从0.007M至2M、从0.02M至2M、从0.023M至1.5M或从0.07M至1M。
[0348] 在水溶液中N-烷基-甘氨酸、N,N-二烷基-甘氨酸或N,N,N-三烷基-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯的浓度通常在0.1mM至3M或从1mM至2M的范围内。浓度可以是从1mM至1.5M或从5mM至1M。优选的浓度是从7mM至1.5M或从0.07M至0.7M。采用的N-烷基-甘氨酸、N,N-二烷基-甘氨酸或N,N,N-三烷基-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯的特定浓度将取决于多种因素，包括病毒颗粒或多肽；是否使用了一种或多种糖类，如果使用，使用的（多种）糖类的特定类型。因此：
[0349] -当糖类不存在时，N-烷基-甘氨酸、N,N-二烷基-甘氨酸或N,N,N-三烷基-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯的优选浓度是从5mM至1.5M或从7mM至1M或至0.7M。更优选的浓度是从0.023M至0.7M、或从0.07M至0.7M，如约0.07M。
[0350] -当存在一种或多种糖类时，N-烷基-甘氨酸、N,N-二烷基-甘氨酸或N,N,N-三烷基-甘氨酸或其生理可接受的盐或酯的优选浓度通常是较低的，并且在从1mM至1M或从5mM至1M的范围内。更优选的浓度是从0.007M至0.7M，如约0.007M。
[0351] 当溶液包含N-烷基化甘氨酸衍生物或其盐或酯、化学式（IIC）的砜化合物、以及可选地，一种或多种糖类时，各组分以向需要储存的溶液提供稳定性的浓度存在。通过常规实验可以测定和优化适宜的浓度。因而可以存在导致协同的量的N-烷基化甘氨酸衍生物或其盐或酯以及化学式（IIC）的砜化合物。在特定实例中使用的浓度将取决于多种因素，包括：
[0352] -要稳定的特定病毒颗粒；
[0353] -要使用的赋形剂；
[0354] -是否存在一种或多种糖类，如果存在，每一种糖类的特点（类型）。
[0355] 特别地：
[0356] -在用于干燥的水性溶液中N-烷基化甘氨酸衍生物或其盐或酯的浓度通常在0.1mM至3M或从1mM至2M的范围内。浓度可以从1mM至1.5M或从5mM至1M。优选的浓
度是从7mM至1.5M、从0.07M至0.7M、0.1M至1.5M或从0.5M至1.25M，和/或
度是从7mM至1.5M、从0.07M至0.7M、0.1M至1.5M或从0.5M至1.25M，和/或
[0357] -用于干燥的水性溶液中化学式（IIC）的砜化合物的浓度通常在0.1mM至3M、从1mM至2M或从0.2mM至1M的范围内，如从0.35mM至1M、从3.5mM至0.5M、从0.035M至
0.5M或从0.035M至0.25M。浓度可以是从0.1M至1.5M或从0.5M至1.25M。
0.5M或从0.035M至0.25M。浓度可以是从0.1M至1.5M或从0.5M至1.25M。
[0358] 当存在于本发明的溶液中时，糖类的浓度或糖类的总浓度是至少0.01M，典型地直至饱和。通常，糖类的浓度是至少0.1M，至少0.2M或至少0.5M直至饱和，例如在室温下饱和，或直至3M、2.5M或2M。因此糖类的浓度可以是，例如从0.1M至3M或0.2M至2M的范围内。可替代地，因此，存在的糖类浓度或如果存在多种糖类，总的糖类浓度可以在0.08M至3M、从0.15M至2M或从0.2M至1M的范围内。适宜的范围是从0.05至1M。
[0359] 当本发明的溶液中存在多种糖类时，优选那些糖类中的一种是蔗糖。可以存在浓度为从0.05M、0.1M、0.25M或0.5M直至饱和的蔗糖，例如在室温下饱和或至3M、2.5M或2M。
[0360] 典型地，蔗糖的摩尔浓度相对于其他（多种）糖类的摩尔浓度之比是从1:1至20:1，如从5:1至15:1。在存在两种糖类并且特别地存在蔗糖和棉子糖的情况下，因此，典型地，蔗糖的摩尔浓度之比是从1:1至20:1，如从5:1至15:1以及优选约10:1。
[0361] 特别地，优选的溶液包含以下组分：
[0362] -浓度为0.8M至1.2M的蔗糖，例如约1M；浓度为0.8至1.2M的TMG，例如约1M；和/或浓度为200至400mM的棉子糖，例如约300mM。典型地，这样的溶液包括MVA。
[0363] -浓度为0.25至1.5M的蔗糖和/或浓度为0.1至1000nM的PEI。典型地，这样的溶液包含腺病毒。
[0364] -浓度为0.25至1.5M的蔗糖，例如约0.85M；浓度为0.1至1000nM的PEI，例如约0.55nM；和/或浓度为可多至500mM的棉子糖，例如约250mM。典型地，这样的溶液包含腺病毒。
[0365] -浓度为0.8M至1.2M的蔗糖，例如约1M；和/或浓度为0.75至1.15M的MSM，例如约0.95M。在这些浓度中，MSM和蔗糖之间可以产生协同相互作用。典型地，这样的溶液包含腺病毒。
[0366] -浓度为0.3M至0.7M的蔗糖，例如约0.5M；浓度为0.2至0.6M的DMG，例如约0.4M；和/或浓度为200至400mM的棉子糖，例如约275mM。在这些浓度中，DMG和棉子糖之间可以产生协同相互作用。典型地，这样的溶液包含腺病毒。
[0367] 根据需要可以调节本发明的溶液的pH。典型地，溶液将具有从4至9的pH，优选从5至8以及特别是约6.5至7.5的pH。
[0368] 本发明的溶液是无热原的。因而将溶液灭菌。通过使溶液通过无菌过滤器（灭菌过滤器）可以使其无菌（灭菌）。然后可以将无菌（灭菌）的溶液引入容器，如小瓶，然后密封该小瓶。可替代地，在已经密封容器中的溶液之后，例如通过高压灭菌可以进行灭菌。
[0369] 因而，溶液可以提供在密封的小瓶、安瓿、注射器、药筒（药壳）、柔性袋或玻璃瓶中。在小体积肠道外注射剂（SVP）的情况下，其可以提供在一次性药筒、一次性注射器、小瓶、安瓿或柔性袋中。当大体积肠道外注射剂（LVP）的情况下，其可以提供在小瓶、柔性袋、玻璃瓶中，或者在一些情况下，作为一次性注射器提供。
[0371] 通常药筒、注射器、小瓶和安瓿由I型或II型玻璃或聚丙烯构成。典型地，柔性袋以多层塑料构造成。典型地，药筒、注射器和小瓶中的瓶塞和隔膜由弹性材料构成。柔性袋的输入口（药物）和输出（给药）口可以是塑料和/或弹性材料。外包装可以与柔性袋一起使用以减缓溶剂损失，并且保护柔性包装系统免于草率搬运（粗略操作）（的损害）。
[0372] 依赖于溶液中的病毒颗粒或多肽，可以根据需要使用本发明的溶液。可以将溶液从密封容器中抽出，例如通过适宜的途径用注射器并注射入患者中。因此，通过皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内注射可以给予溶液。可替代地，通过输注可以给予溶液。在给予之前可以稀释溶液。
[0373] 在生产期间病毒颗粒或多肽的保存
[0374] 在一些情况中，在生产病毒颗粒或多肽的溶液期间，可能需要使用本发明的赋形剂，以便在生产过程期间保存或稳定病毒颗粒或多肽。这可以提高该过程的产率。
[0375] 典型地，本发明的赋形剂将在病毒颗粒或多肽的溶液中进而保留在最终产物中。这可以是有利的，因为本发明的赋形剂将继续稳定最终产物中的病毒颗粒或多肽。
[0376] 可替代地，可以有一些情况，其中优选在纯化步骤中去除本发明的赋形剂。可以通过本领域技术人员已知的任何适宜的纯化技术进行这样的去除，如层析。精确纯化方法将取决于待使用的赋形剂，并且本领域的技术人员可以容易地选择适宜的技术。
[0377] 一旦已去除赋形剂，典型地将病毒颗粒或多肽的溶液密封在容器中，如小瓶、安瓿、注射器、药筒、柔性袋或玻璃瓶中。
[0378] 优选溶液是灭菌的，例如在向容器中引入溶液之前，通过使溶液通过灭菌（无菌化）过滤器。可替代地，在无菌条件下进行生产过程和纯化可以是优选的，以便终产物是无菌的。
[0379] 本发明的赋形剂的浓度优选是如在上文中的“本发明的溶液的产生”之下给出的。在存在的情况下，优选（多种）糖类的浓度也是如在上文中的“本发明的溶液的产生”之下给出的。
[0380] 取自人或动物的样品的保存
[0381] 通过本发明的赋形剂和可选地一种或多种糖类可以保存取自人或动物的样品。当样品取自人或动物时，通常需要将该样品转移至另一位置，在该位置试验或测试该样品。即使当样品是冻结的或冷藏的，通常在运输期间也发生样品的降解。这可以导致在对样品的试验和测试中的阴性的或差的结果。
[0382] 在取自人或动物的样品的溶液中存在本发明的赋形剂和可选的一种或多种糖类通常保护样品。
[0383] 典型地，在体外对从人或动物获得的样品进行本发明。典型地，样品包括人或动物的体液。样品优选是血液、血浆、血清、尿液、脑脊液或关节液（joint f1uid）样品。样品最优选的是血液样品。来自人的样品，如人血液样品是优选的。样品可以携带（保持）在药签上。
[0384] 取自人或动物的样品可以是感染的或非感染的。特别优选的是保存包含病毒颗粒的感染样品，因为病毒颗粒是由赋形剂和可选地一种或多种糖类保护的。
[0385] 可以以任何方便的顺序向水性溶液中加入取自人或动物的样品、本发明的赋形剂以及可选地一种或多种糖类。例如：
[0386] -可以向赋形剂和可选地一种或多种糖类的溶液中加入样品；或
[0387] -可以向水性溶液中同时加入样品、赋形剂以及可选地一种或多种糖类；或[0388] -可以向样品的水性溶液中加入赋形剂和可选地一种或多种糖类。
[0389] 优选本发明的赋形剂的浓度是如在上文中的“本发明的溶液的产生”之下给出的。当存在的情况下，优选（多种）糖类的浓度也是如在上文中的“本发明的溶液的产生”之下给出的。
[0390] 典型地将包含取自人或动物的样品、本发明的赋形剂和可选地一种或多种糖类的水溶液储存在冰箱（冷藏库）或制冷器（冷冻器）中。典型地，冰箱（冷藏库）的温度是2至8°C，优选4至6°C，或例如约4°C。典型地，制冷器（冷冻器）的温度是-10至-80°C，优选-10至-30°C，例如约-20°C。
[0391] 典型地将包含取自人或动物的样品、本发明的赋形剂和可选地一种或多种糖类的水溶液储存在密封容器中，如小瓶、安瓿、注射器、药筒、柔性袋或玻璃瓶中。
[0392] 一旦保存的样品到达其要测试或试验的位置，通常在不事先去除赋形剂或糖类（当存在时）的情况下测试或试验样品。
[0393] 测定病毒颗粒的保存
[0394] 涉及病毒颗粒的保存指的是抵抗病毒颗粒的物理或化学降解和/或生物活性的损失。
[0395] 对于诸如感染性和/或免疫原性的病毒活性的试验方法是本领域技术人员熟知的，这些方法包括，但不限于，在细胞培养液中使病毒生长、检测血液中的病毒特异性抗体、诱发T和/或B细胞响应的能力、检测病毒抗原、检测病毒编码的DNA或RNA、或使用显微镜观测病毒颗粒。
[0396] 此外，病毒的存在引发宿主细胞的形态改变，可以测量该形态改变以给出病毒活性的指示。诸如这些的由于病毒感染导致宿主细胞的可检测的改变称为细胞病变效应。细胞病变效应可以包括细胞变圆、定向障碍（disorientation）、肿胀（膨胀）或收缩、死亡和脱离表面。通过诸如TUNEL（末端尿苷脱氧核苷酰转移酶dUTP缺口末端标记）试验以及本领域技术人员熟知的其他技术的可测得的许多病毒在受感染的细胞中引发凋亡（程序性细胞死亡）。
[0397] 病毒也可以影响宿主细胞基因的表达规律，并且可以分析这些基因以给出病毒活性是否存在的指示。这样的技术可以涉及向细胞培养液中加入试剂，以完成用病毒表达产物的酶促或化学反应。此外，可以修饰病毒的基因组以便增强病毒感染性的检测。例如，可以基因修饰病毒的基因组以表达标记物，该标记物可以通过相差显微镜法、荧光显微镜法或通过射电成像法（放射性成像法，radioimaging）容易地检测。标记物可以是表达的荧光蛋白，如GFP（绿色荧光蛋白）或可以参与比色的或放射性标记反应的表达的酶。标记物也可以是中断或抑制被测试的细胞的特定功能的基因产物。
[0398] 针对蚀斑形成单位的试验可以用于测定病毒的感染性并用于表明病毒的滴定度。在该试验中，在平的表面上培养适宜的宿主细胞直至它们形成覆盖塑料瓶或皿的单层细胞。特定宿主细胞的选择将取决于病毒的类型。适宜的宿主细胞的实例包括，但不限于CHO、BHK、MDCK、10T1/2、WEHI细胞，COS、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、WI38、MRC5、A549、HT1080、
293、B-50、3T3、NIH3T3、HepG2、Saos-2、Huh7、HEK293以及海拉（HeLa）细胞。然后用病毒颗粒感染宿主细胞的单层。用半固体培养基替换液体培养基，以便产生任何病毒颗粒，因为感染的结果不能远离它们产生的部位。当病毒颗粒感染细胞、复制，然后杀死该细胞时，产生蚀斑。蚀斑指的是单层中的细胞区，其显示细胞病变效应，例如在显微镜下显示圆形并且比其他细胞更暗（深），或者当目测时呈现为白点；由于病毒引发的溶解，蚀斑中心可能缺乏细胞。新复制的病毒感染周围的细胞，并且还将他们杀死。可以重复几次该过程。然后细胞用诸如亚甲基蓝的染料对细胞染色，亚甲基蓝仅对活细胞染色。蚀斑中的死细胞不染色，并且呈现为在着色背景上的未染色区域。
293、B-50、3T3、NIH3T3、HepG2、Saos-2、Huh7、HEK293以及海拉（HeLa）细胞。然后用病毒颗粒感染宿主细胞的单层。用半固体培养基替换液体培养基，以便产生任何病毒颗粒，因为感染的结果不能远离它们产生的部位。当病毒颗粒感染细胞、复制，然后杀死该细胞时，产生蚀斑。蚀斑指的是单层中的细胞区，其显示细胞病变效应，例如在显微镜下显示圆形并且比其他细胞更暗（深），或者当目测时呈现为白点；由于病毒引发的溶解，蚀斑中心可能缺乏细胞。新复制的病毒感染周围的细胞，并且还将他们杀死。可以重复几次该过程。然后细胞用诸如亚甲基蓝的染料对细胞染色，亚甲基蓝仅对活细胞染色。蚀斑中的死细胞不染色，并且呈现为在着色背景上的未染色区域。
[0399] 每一个蚀斑是由一个病毒感染一个细胞，之后该病毒复制并铺展的结果。然而，不杀死细胞的病毒可以不产生蚀斑。蚀斑指的是单层中的细胞区，其显示细胞病变效应，例如在显微镜下显示圆形并且比其他细胞更暗（深），或者当目测时呈现为白点；由于病毒引发的溶解，蚀斑中心可能缺乏细胞。通过测定“蚀斑形成单位（PFU）”给出了病毒滴定度的指示。根据本发明，病毒感染性水平可以在保存的生物材料样品中测定，并与对照样品相比较，该对照样品如在没有加入本发明的保护混合液的情况下，经受干燥（脱水）和/或热改变（突变）新收获的病毒或样品。
[0400] 本发明的一些类型的病毒颗粒，如病毒蛋白VLP，或一些失活的病毒在蚀斑试验中不具有形成蚀斑的能力。在这种情况下，通过诸如本领域技术人员熟知的用于测定免疫原性的方法的其他方法可以测定保存。例如，本领域已知用于测定抗体或细胞介导的宿主免疫响应的体内和体外试验，并且这些技术适宜用于本发明。例如，通过在动物模型中，使用本发明保存的病毒颗粒在免疫前后通过比较血清抗体的量、亲合力以及同种型分布，可以测定基于免疫响应的抗体。
[0401] 本发明保存的病毒颗粒的应用
[0402] 根据需要可以使用本发明的溶液。可以将溶液，例如用注射器从密封容器抽出并通过适宜的途径注射至患者体内。因而，可以通过皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内注射给予溶液。可替代地，可以通过输注给予溶液。在给予之前可以稀释溶液。
[0403] 疫苗
[0404] 本发明的溶液可以用作疫苗。例如，包含全部的死病毒、减毒病毒、化学失活病毒、VLP或活病毒载体的溶液适宜用作疫苗。作为疫苗，病毒颗粒可以用作抗原或编码诸如病毒蛋白的抗原，用于治疗或预防大量病症，包括，但不限于，病毒感染、病毒感染的后遗症（包括但不限于病毒引发的毒性、癌症和过敏症）。这样的抗原包括将刺激宿主的免疫系统以产生体液和/或细胞的抗原特异性响应的一个或多个表位。
[0405] 本发明的疫苗可以用于预防或治疗由以下病毒（引起的）感染，如人乳头瘤病毒（HPV）、人免疫缺陷病毒（HIV）、HSV2/HSV1、流感病毒（A、B和C型）、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、RSV病毒、鼻病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、诺瓦克病毒、肠道病毒、星状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、腺病毒、风疹病毒、人T细胞淋巴瘤I型病毒（HTLV-I)、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、痘病毒和痘苗病毒。疫苗可以进一步用于提供适宜的免疫响应对抗许多牲畜疾病，如口蹄疫病毒（包括血清型O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3和Asia-1）、冠状病毒、蓝舌病病毒、猫白血病病毒、禽流感病毒、亨德拉和尼帕病毒（hendra and nipah virus）、犬细小病毒和牛病毒性腹泻病毒。在一个实施方式中，疫苗是亚基（亚单位）、结合物或多价疫苗。例如，本发明的疫苗可以用于治疗由两种以上不同类型的病毒（如麻疹、腮腺炎和风疹）（引起的）感染（例如MMR疫苗）。
[0406] 为了测定根据本发明制备的疫苗的保存的稳定性，使用本领域技术人员熟知的技术可以测定疫苗的潜能。例如，通过在适当的动物模型中监测抗体的产生或免疫细胞对疫苗的响应，可以测试细胞或体液免疫响应的产生。疫苗样品引发免疫响应的能力可以与不经受相同保存技术的疫苗相比较。
[0407] 病毒载体
[0408] 根据本发明，可以使用病毒或病毒载体以将异源基因或其他核酸序列转移至靶细胞中。适当地，异源序列（即转基因）编码能够在靶细胞中表达的蛋白质或基因产物。适宜的转基因包括期望的报告基因、治疗基因以及编码免疫原性多肽的基因（用作疫苗）。基因疗法，一种用于治疗或预防与缺陷基因表达相关的疾病的方法，包括向细胞中插入治疗基因，之后表达和产生需要的蛋白质。该方法能够置换受损基因或抑制表达不期望的基因。特别地，病毒或病毒载体可以用于基因疗法，以将治疗性转基因或编码免疫原性多肽的基因转移至患者中。
[0409] 在优选的实施方式中，病毒颗粒是活病毒载体。“活病毒载体”意味着对于靶标物种是非病原性的或低病原性的活病毒载体，并且其中已插入了一种或多种刺激免疫响应防止其它病毒或微生物的编码抗原的基因、报告基因或治疗性蛋白质。特别地，以这样的方式将核酸引入病毒载体中，即在受感染的宿主动物中，其仍然能够在其中复制，从而表达由插入的核酸序列编码的多肽，并且在疫苗的情况下，引发免疫响应。在一个实施方式中，活病毒载体是减毒活病毒载体，即被修饰成比野生型病毒低病毒性（致病）的。
[0410] 使用重组病毒作为潜在疫苗的基础，包括将来自致病生物体的特定基因合并入非病原的或减毒的病毒的基因组中。然后重组病毒可以在体内或在体外感染特定真核细胞，并且引发它们表达重组蛋白质。
[0411] 相比于减活疫苗（活减毒疫苗）、灭活疫苗、亚基（亚单位）或DNA途径，可以优选的是源于插入来自疾病生物体的基因编码序列的活病毒载体疫苗。活病毒载体最重要的安全特点之一是，接受者（受体，recipient）可以针对来自病原生物体的特定抗原免疫而不暴露于疾病抗原本身。通过选择病毒载体进一步调节安全性，该病毒载体对宿主是减毒的或者虽然仍然能够表达关注的异源抗原但不能够在宿主中复制。在靶标物种中具有安全性历史的疫苗株提供额外的安全特点。已开发了几种系统，其中载体删除了必要基因，并且在提供该失去的功能的细胞系统中进行疫苗的制备。
[0412] 诸如逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒载体的各种载体可以用于向靶细胞传递异源基因。可以将关注的异源基因插入病毒载体中。本发明的病毒载体可以包括例如，提供有复制起点、可选地用于表达异源基因的启动子以及可选的该启动子的调控子（regulator）的病毒载体。例如，在实施本发明中有用的腺病毒可以删除E1和/或E3和/或E4区，否则可以最大化以接收异源DNA。
[0413] 病毒载体可以包括构成的启动子，如巨细胞病毒（CMV）启动子、SV40大T抗原启动子、鼠乳腺瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子（MLP）、鼠乳房瘤病毒LTR启动子、SV40早期启动子，诸如腺病毒主要晚期启动子（Ad MLP）的腺病毒启动子、（诸如HSV IE启动子的）HSV启动子、诸如HPV上游调控区（URR）的HPV启动子、或劳斯肉瘤病毒（rous sarcoma virus）启动子，与其他病毒核酸序列可操作地连接至关注的异源基因。组织特异性或可诱导的启动子也可以用于控制关注的异源基因的表达。也可以选择启动子以与设计用于表达的宿主细胞相容。
[0414] 病毒载体也可以包括其他转录调控元件，如增强子。增强子广义上定义为顺式作用剂，当可操作地连接至启动子/基因序列时，其将增加该基因序列的转录。相比于其他表达控制元件（例如启动子），增强子可以从非常远离关注的序列的位置起作用，并且当相对于关注的序列位于任一方向时都可以操作。已经从大量病毒来源鉴别了增强子，包括多瘤病毒、BK病毒、巨细胞病毒（CMV）、腺病毒、猿病毒40（SV40）、莫洛尼肉瘤病毒、牛乳头瘤病毒和劳斯肉瘤病毒。适宜的增强子的实例包括SV40早期基因增强子、来源于劳斯肉瘤病毒的长末端重复序列（LTR）的增强子/启动子、来源于人或鼠CMV的元件，例如，包括在CMV内含子A序列中的元件。
[0415] 然后根据本发明的方法，在储存之前可以保存包含关注的异源基因的病毒载体，经受诸如冻干的进一步的保存技术或给予患者或宿主细胞。
[0416] 本发明的病毒载体可以包含用于编码已知显示抗病毒活性的多肽的核酸、诸如细胞因子的免疫调节分子（例如TNF-α、诸如IL-6和IL-2的白介素、干扰素、诸如GM-CSF的集落刺激因子（CSF））、佐剂和协同刺激物以及辅助分子。可替代地，可以单独地提供这样的多肽，例如在本发明的保存混合物中，或可以用本发明的病毒载体同时地、连续地或分别地给予这样的多肽。
[0417] 优选地，使用本领域已知的各种病毒技术可以将本发明保存的病毒载体引入适宜的宿主细胞中，如例如用重组病毒载体（如逆转录病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒）感染。优选地，包含关注的基因的本发明保存的病毒载体的给予是通过靶细胞的病毒感染介导的。
[0418] 已开发了大量基于病毒的系统用于转染哺乳动物的细胞。
[0419] 例如，使用本领域已知的技术，选定的重组核酸分子可以插入载体中并且组装成逆转录病毒颗粒。然后可以分离重组病毒并在体内或离体地将其转移至受体的细胞中。逆转录病毒载体可以基于莫洛尼鼠白血病病毒（Mo-MLV）。在逆转录病毒载体中，通常将一个或多个病毒基因（gag、pol和env）替换成关注的基因。
[0420] 已知大量腺病毒载体。腺病毒副族C血清型2和5通常用作载体。腺病毒可以是人类或非人类的腺病毒。野生型腺病毒基因组大约为35kb，其达30kb可以用外源DNA替换。
[0421] 有四个早期转录单元（E1、E2、E3以及E4），其具有调控功能，以及晚期转录，其编码结构蛋白。腺病毒载体可以具有失活的E1和/或E3基因。然后可以由辅助病毒、质粒或整合至辅助细胞基因组中以反向（in trans）提供缺失的（多个）基因。腺病毒载体可以使用E2a温度敏感性突变体或E4缺失体。最小的腺病毒载体可以在转基因周围仅包含反向末端重复（ITR）以及包装序列，所有必要的病毒基因以反向或通过辅助病毒提供。因而适宜的腺病毒载体包括Ad4、Ad5、Ad7、Ad11、Ad14、Ad26、Ad35和Ad36载体和猿腺病毒载体，优选Ad4、Ad5、Ad7、Ad35和Ad36载体。Ad5是最常用的。
[0422] 病毒载体也可以来源于病毒的痘家族，包括痘苗（牛痘）病毒和鸟痘病毒，如鸡痘疫苗。例如，修饰的痘苗病毒安卡拉（MVA）是牛痘病毒株，其在多数细胞型中不复制，包括正常的人类组织。因此重组MVA载体可以用于输送本发明的多肽。
[0423] 病毒的添加型（如腺病毒伴随病毒（AAV）和单纯疱疹病毒（HSV））也可以用于开发适宜的载体系统。
[0424] 给予
[0425] 使用各种已知的途径和技术，可以在体内给予对象（受试者）根据本发明的溶液。溶液适宜肠道外给予。例如，可以以可注射的溶液、悬浮液或乳液提供疫苗，并且使用常规的针和注射器、或使用液体喷射注射系统经由肠道外、皮下、经口、经表皮、皮内、肌肉内、动脉内、腹膜内、静脉内注射给予。可以局部地对皮肤或粘膜组织给予疫苗，如鼻、气管内、肠内、舌下、直肠内或阴道内，或以适宜呼吸或肺部给予的微细（细分，finely divided）喷雾提供。
[0426] 下列实施例示出了本发明。
[0427] 统计学
[0428] 在一些实施例中，计算了下列统计值：
[0429] R2=决定系数。拟合优度的量度。R2<0.5=低的模型显著性。
[0430] Q2=预测精度的估值。预测优度的量度。
[0431] 对于显著性模型，Q2应当>0.1。对于良好的模型，Q2应当>0.5。R2-Q2<0.2至0.3。
[0432] 模型效度（MV）=“不同模型问题的测试”。模型效度<0.25=统计学显著性模型问题的指示，例如异常值，不正确的模型/转化。
[0433] 再现性（Rep）=相比于整体可变性复制之间变化的量度。再现性>0.5意指显著性。
[0434] 除非另有说明，在实施例1至4中采用下列材料、设备和技术：
[0435] 材料
[0436] HEK-293细胞（ECACC 85120602）
[0437] DMSO（Sigma D1435，批次118K1455）
[0438] 蔗糖（Sigma 16104，批次70040）
[0439] 棉子糖（Sigma R0250，批次039K0016）
[0440] PBS（Sigma D8662，批次118K2339）
[0441] 水（Sigma W3500，批次8M0411）
[0442] 5ml玻璃小瓶（Adelphi Tubes VCD005）
[0443] 2ml玻璃小瓶（Adelphi Tubes VCDIN2R）
[0444] 14mm冷冻干燥瓶塞（Adelphi Tubes FDIA14WG/B）
[0445] 14mm帽（Adelphi Tubes CWPP14）
[0446] 腺病毒GFP（Vector Biolabs cat.1060）
[0447] 甘氨酸（Sigma，G7126，118K00181）
[0448] N,N-DMG（Sigma D1156，批次077K1856）
[0449] SMM（Sigma，64382，1339210）
[0450] TMG（Sigma，B2629，1089K1201）
[0451] 设备
[0452] Modulyo D冷冻干燥机（Thermofisher）
[0453] HERA II级安全柜（Thermofisher）
[0454] Binder CO2培养箱（Binder）
[0455] Binder APT线性TM MK热循环测试箱（Binder）
[0456] Thermo Scientific MaxQ 4450培养箱（Thermofisher）
[0457] KERN EW220-3NM天平（VWR）
[0458] Elcold-45°C制冷器（VWR）
[0459] Forma 900系列-80°C制冷器（Thermofisher）
[0460] Synergy HT微量板读数器（全自动定量绘图酶标仪，microplate reader）（Biotek）
[0461] 实施例1
[0462] 样品的制备
[0463] 由于长的填装时间可以增加批次的变化，因此冷冻干燥之前小瓶的装载时间可以影响病毒的恢复和疫苗的效能。测试了仅用糖类或糖类与PEI组合的赋形剂，以观察它们在冷冻干燥之前的静置期间是否能够保护病毒。在2ml玻璃小瓶中制备样品三份。最终糖类浓度是1M蔗糖100mM棉子糖。最终PEI浓度是1nM。在一半的样品中加入表达绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒，并在室温下留置（保持）4小时。在孵育之后，向剩余的小瓶中加入腺病毒。使用冷凝器设置为-80°C以及真空度为200mTorr的Modulyo D冷冻干燥机进行冷冻干燥3天。在冷冻干燥完成之后塞住小瓶。
[0464] 腺病毒滴定度的测定
[0465] 通过用表达GFP的腺病毒感染细胞计算病毒滴定度。用HEK 293细胞（ECACC5
85120602）以每毫升10 个细胞（每孔100μl）接种96-孔平底细胞培养皿（Jencons，UK），并保持在37°C和5%的CO2下。在达到90%汇合之后，在1ml的杜尔贝科最低必需培养基（DMEM）加5%胎牛血清（FBS）中重建包含腺病毒加赋形剂的小瓶。然后通过从重建的小瓶中取100μl并加入至900ml的DMEM中进行1:10的稀释步骤。然后将100μl得到的经稀释的病毒加入至平板的第一排中，并沿着平板进行1:2稀释。用下一种赋形剂重复该过程。
在另外的48小时之后，利用荧光显微镜法计数每个孔中表达GFP的细胞的数量。由稀释液倍增的表达GFP的细胞的数量计算每毫升的蚀斑形成单位（PFU）。利用具有单向ANOVA的Prism graphpad测定病毒制剂之间的显著性，之后用turkey事后测试。**=P<0.01。
85120602）以每毫升10 个细胞（每孔100μl）接种96-孔平底细胞培养皿（Jencons，UK），并保持在37°C和5%的CO2下。在达到90%汇合之后，在1ml的杜尔贝科最低必需培养基（DMEM）加5%胎牛血清（FBS）中重建包含腺病毒加赋形剂的小瓶。然后通过从重建的小瓶中取100μl并加入至900ml的DMEM中进行1:10的稀释步骤。然后将100μl得到的经稀释的病毒加入至平板的第一排中，并沿着平板进行1:2稀释。用下一种赋形剂重复该过程。
在另外的48小时之后，利用荧光显微镜法计数每个孔中表达GFP的细胞的数量。由稀释液倍增的表达GFP的细胞的数量计算每毫升的蚀斑形成单位（PFU）。利用具有单向ANOVA的Prism graphpad测定病毒制剂之间的显著性，之后用turkey事后测试。**=P<0.01。
[0466] 结果与讨论
[0467] 在这个实施例的实验中研究了PEI和糖类是否在冷冻干燥之前增强液体中病毒的稳定性。在冷冻干燥之前使腺病毒、糖类和PEI或腺病毒和糖类的混合物孵育4小时，并与制备的并立即冷冻干燥的样品相比较。结果证明，在仅有病毒的对照中，在冷冻干燥之前孵育4小时的样品和立即冷冻干燥的的样品中，腺病毒完全损失（图1）。在仅有糖类的样品中，虽然病毒滴定度比仅有病毒的对照高，但是相比于立即冷冻干燥的糖类赋形剂相比，在4小时孵育之后病毒滴定度显著损失。在糖类PEI样品中，相比于立即冷冻干燥的糖类PEI浓聚液相比，在室温下孵育4小时之后病毒没有显著损失。结果证实了在冷冻干燥之前糖类和PEI的组合对于稳定病毒具有益处。
[0468] 实施例2
[0469] 将250μl的每一种赋形剂和50μl的腺病毒加入每一个小瓶中以给出一系列最终浓度的PEI（参见下表1）。在涡旋之后，将玻璃小瓶置入37°C的培养箱1周。在孵育之后，如上文给出的，使用腺病毒GFP试验测定病毒的滴定度。
[0470] 表1
[0471]
[0472] 结果与讨论
[0473] 在这个实施例的实验中检测了在37°C下热激发（挑战，challenge）1周后水溶液中腺病毒的稳定性。PBS对照显示滴定度的显著损失，然而糖类加0.26μM的PEI在热激发后显示腺病毒的良好保存（参见图2）。如上显示的，PEI浓度的上限为2.6μM，没有发现该浓度的病毒感染性。
[0474] 实施例3
[0475] 样品的制备
[0476] 用475μl无菌蒸馏水重建1x 57μg参照小瓶的失活的所罗门群岛流感H1N1（influenza H1N1 Solomon Islands）（NIBSC），以给出浓度为120μg/ml的血凝素（HA）。然后将该溶液以1/6进一步稀释至水、PBS以及包含蔗糖/棉子糖/聚乙烯亚胺的赋形剂溶液中，获得PBS中的最终浓度为1M蔗糖/100mM棉子糖/1.6μM PEI和20μg/ml血凝素（HA）。将PBS和赋形剂溶液的复制样品置于-20°C、+4°C和+45°C下，同时H2O样品保持在+4°C的推荐储存温度下。所有的样品保持在这些温度下5天。
[0477] 在孵育所有样品的等分试样之后，与用新鲜的水重建的标准参照小瓶一起，用ELISA试验（图3中的实心柱形）。剩余的样品冷藏在+4°C下，并与另外的新鲜重建的标准参照样品一起在1个月之后再次试验（图3中的阴影柱形）。
[0478] ELISA方案
[0479] 以1/20稀释样品以给出PBS中浓度为1μg/ml的HA。50μl体积的每一种溶液用于涂覆ELISA板（Nunc maxisorb）的六个复制孔，然后在PBS中洗涤3次之前在37°C下孵育每一种溶液1小时。
[0480] 在包含PBS/0.1%吐温20/5%无脂干燥奶粉（PBSTM）的封闭缓冲液中以1/200稀释的单特异性多克隆羊抗所罗门群岛H1（NIBSC）。每一个试验孔中加入50μl体积，并将板在37°C下孵育1小时。用PBS洗涤板3次，向每孔中加入在PBSTM中的辣根过氧化物酶结合的多克隆兔抗绵羊免疫球蛋白（Abcam）的1/1000稀释液。在用PBS洗涤4次之前在37°C下温育另外的1小时。
[0481] 实验通过加入50μl/孔的包含0.4μl/ml的30%H2O2溶液（Sigma）和0.05M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液（pH 5.0）中的0.4mg/ml对苯二胺（OPD）（Sigma）的底物/发色团溶液显影。在室温下温育板10分钟。通过加入50μl/孔的1M H2SO4终止反应。在带有490nm干扰滤波器的Synergy HT微滴定板读数器（Biotek）上对板读数。
[0482] 结果与讨论
[0483] 对于溶解在水、PBS或分析的赋形剂混合物中的HA，在+4°C和-20°C下5天孵育期之后识别主要损失，PBS中的HA显示最大的劣化（参见图3）。
[0484] 然而，在孵育5天之后，赋形剂组合物与水组合物（其为推荐的储存介质）显示类似的结果，然而，在+4°C下孵育另外数月之后，赋形剂组合物的识别明显好于水组合物，如果有，仅有非常小的进一步劣化。而且，保持在+4°C和-20°C下的冻融的赋形剂组合物之间几乎没有差异。不推荐流感病毒HA的冻融（因此在该实验中不包括水组合物），因为已知发生团聚。
[0485] 实施例4
[0486] 病毒配制品
[0487] 在试验期间，使用在CMV启动子下表达增强的GFP（绿色荧光蛋白）的重组腺病毒（Vector Biolabs），以便于检测。
[0488] 在该研究中，在与糖类（1M蔗糖，100mM棉子糖）的共配制品中（co-formulation）和它们不存在时，各自测试了最终浓度为0.07-0.70M的四种甘氨酸的化合物和一种噻亭作为（腺病毒的）防腐剂的效能。测试的甘氨酸的化合物是甘氨酸、肌氨酸（单甲基甘氨酸）、DMG（二甲基甘氨酸）、TMG（三甲基甘氨酸）。测试的噻亭是SMM（S-甲基-甲硫氨酸）。与赋形剂混合物一起配制病毒，以便通过热激发期间测试它们在保持（保存）病毒活性中的效能。将每一种赋形剂加病毒的混合物（参见下表2）制成在PBS中的储备液，并且向适当标记的5ml玻璃小瓶中加入300μl。
[0489] 表2—处理的汇总，每一种设置为三份。Y=是，N=否。其中糖类存在浓度=1M蔗糖，100mM棉子糖。
[0490]
[0491] 热激发
[0492] 将每一种处理液的三份置于4°C下，以及另外的3份置于37°C下，持续7天的时间段。在此时间，将所有样品置于4°C下直至对它们进行试验。
[0493] 腺病毒试验
[0494] 将对腺病毒（HEK 293，ECACC 85120602）相容的（permissive）细胞以每毫升105个细胞（每孔100μl）接种至96-孔平底细胞培养皿（VWR，UK）中，并保持在37°C和5%CO2下。在达到90%汇合之后，将包含腺病毒加赋形剂的小瓶取出冰箱（fridge），并且通过连续稀释产生DMEM中的10比1和100比1稀释液。然后向包含HEK 293细胞的板的孔中加入100μl的每一种得到的稀释液（10比1和100比1）。另外，融化用于赋形剂处理的来自相同来源并具有相同滴定度的腺病毒的另外的样品（储存于-80°C），并用于产生10比16
的稀释液系列（在DMEM中）。将范围从10比1至10 比1的稀释液也加入包含HEK 293的各个孔中。在48小时后，在孵育后利用荧光显微镜法计数每一个孔中的GFP（绿色荧光蛋白）细胞的数量，随后考虑到施加的体积和接种物的稀释，将该数量转化成经处理的样品的pfu/ml。
的稀释液系列（在DMEM中）。将范围从10比1至10 比1的稀释液也加入包含HEK 293的各个孔中。在48小时后，在孵育后利用荧光显微镜法计数每一个孔中的GFP（绿色荧光蛋白）细胞的数量，随后考虑到施加的体积和接种物的稀释，将该数量转化成经处理的样品的pfu/ml。
[0495] 结果与讨论
[0496] 在4°C下1周之后恢复的病毒活性（图4a和b）(甘氨酸类(glycinergics）和SMM分别不含加入的糖类或含有加入的糖类)
[0497] 在4°C下1周之后，在仅PBS中配制腺病毒样品，恢复的病毒活性是初始滴定度的46%。然而，与糖类（1M蔗糖，100mM棉子糖）一起的配制品致使恢复率提高至69%。不存在糖类的情况下，与甘氨酸类或SMM一起的腺病毒的所有配制品导致52-71%的恢复率。虽然，这表示高于PBS的显著改进，但是即使最佳的甘氨酸类或SMM配制品才获得仅等于糖类的恢复率（参见图4a）。在甘氨酸类或SMM与糖类一起配制时，并没有进一步提高恢复的病毒活性（50-72%）。在两种情况下（即甘氨酸类或SMM在存在或不存在糖类下），没有明显的剂量依赖性，也就是说恢复的病毒活性和甘氨酸类或SMM的浓度之间没有明显的相关性（参见图4b）。
[0498] 在37°C下1周之后恢复的病毒活性(图4c和d)(甘氨酸类和SMM分别不含加入的糖类或含有加入的糖类)
[0499] 在37°C下1周之后，在仅PBS中配制腺病毒样品，恢复的病毒活性是初始滴定度的25%。与糖类（1M蔗糖，100mM棉子糖）一起配制，恢复率提高至38%。
[0500] 在测试的浓度范围的较高端使用氨基酸类以及将其作为唯一的赋形剂导致高于仅PBS的改善的效能，并且在每一种情况下，在甘氨酸类的浓度和恢复的病毒活性之间观测到强的正相关性。在测试的浓度范围内（0.07至0.70M），在甘氨酸的情况下活性从29%提高至45%，对于肌氨酸从29%至49%，对于DMG从27%至41%，对于TMG从21至45%。对于每一种甘氨酸类，在测试的浓度范围中，在测试的最高浓度下达到最佳的结果，并且与使用糖类作为唯一的配制剂（formulant）时相比，一样高或更高的恢复病毒活性是可能的（参见图4c）。
[0501] 使用下列甘氨酸类，甘氨酸、肌氨酸和DMG，在与糖类一起的全部测试的浓度范围内导致高于仅PBS的改善的效能。除了最低的肌氨酸和DMG浓度之外，恢复率也高于仅有糖类的。在每一种情况下，在甘氨酸类浓度和恢复的病毒活性之间观测到强的正相关性。在测试的浓度范围（0.07至0.70M）内，在甘氨酸的情况下活性从41%提高至54%，对于肌氨酸从37%至56%，对于DMG从37%至52%（参见图4d）。
[0502] 一种例外是当TMG与糖类共同配制时观测到某种反协同效应（拮抗效应，antagonistic effect）。这导致TMG浓度和恢复的活性之间的负相关。随着TMG的浓度（改变）活性从0.07M时的45%变化至0.70M时的38.7%。该数据提出糖类改变TMG的最适浓度，因为在0.07M下观测到TMG和糖类之间的正相互作用，以及在0.70M下的负相互作用，但是已观测到恢复的活性从不超过仅TMG可能的（恢复活性）（参见图4d）。最终，当在0.07M至0.23M的范围内用作唯一的配制剂时，SMM保持（保存）腺病毒的活性（恢复的活性分别是33%和43%）。
[0503] 实施例5
[0504] 除非另有说明，在实施例5中采用下列的材料、设备和技术：
[0505] 材料
[0506] DMSO（Sigma D1435，批次118K1455）
[0507] 蔗糖（Sigma 16104，批次70040）
[0508] 棉子糖（Sigma R0250，批次039K0016）
[0509] PBS（Sigma D8662，批次118K2339）
[0510] 水（Sigma W3500，批次8M0411）
[0511] 5ml玻璃小瓶（Adelphi Tubes VCD005）
[0512] 14mm冷冻干燥瓶塞（Adelphi Tubes FDIA14WG/B）
[0513] 14mm帽（Adelphi Tubes CWPP14）
[0514] L929细胞（ECCAC 85011426）
[0515] 抗-人TNF-α纯化的抗体（Invitrogen RHTNFAOO、批次555790A和477758B）[0516] 人TNF-α（Sigma T6674）
[0517] 溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓（Sigma M5655批次MKBB4411）
[0518] 放线菌素D（SigmaA1410）
[0519] 设备
[0520] HERA II级安全柜（Thermo Fisher）
[0521] Binder CO2培养箱（Binder）
[0522] Binder APT线性TM MK热循环测试箱（Binder）
[0523] Thermo Scientific MaxQ 4450培养箱（Thermofisher）
[0524] KERN EW220-3NM天平（VWR）
[0525] Elcold-45°C制冷器（VWR）
[0526] Forma 900系列-80°C制冷器（Thermofisher）
[0527] Synergy HT微量板读数器（全自动定量绘图酶标仪，microplate reader）（Biotek）
[0528] 样品制备
[0529] 在2ml玻璃小瓶中制备样品三份。最终糖类浓度是1M蔗糖、100mM棉子糖。在1ml的PBS中200μg的鼠抗TNF-α抗体用作中和抗体（批次555790A和47758B）。将储备液储存在2-8°C下直至使用。
[0530] 稀释溶液以给出一系列的糖类浓度（参见下表3）。在进行L929TNF-α中和试验之前将玻璃小瓶在室温下保留10天（参见下文）。包括在试验中的是新鲜的液体储备液，该储备液用于表明初始的抗体活性和冻融对照。
[0531] 表3
[0532]小瓶编号 赋形剂浓度
1、2 1.25M蔗糖
3、4 1.125M蔗糖，50mM棉子糖
5、6 1M蔗糖，10mM棉子糖
7、8 0.875M蔗糖，150mM棉子糖
9、10 0.75M蔗糖，50mM棉子糖
11、12 0.625M蔗糖，200mM棉子糖
13、14 0.5M蔗糖，250mM棉子糖
15、16 0.375M蔗糖，300mM棉子糖
17、18 0.25M蔗糖，350mM棉子糖
19、20 0.125M蔗糖，400mM棉子糖
21、22 450mM棉子糖
23、24 PBS
1、2 1.25M蔗糖
3、4 1.125M蔗糖，50mM棉子糖
5、6 1M蔗糖，10mM棉子糖
7、8 0.875M蔗糖，150mM棉子糖
9、10 0.75M蔗糖，50mM棉子糖
11、12 0.625M蔗糖，200mM棉子糖
13、14 0.5M蔗糖，250mM棉子糖
15、16 0.375M蔗糖，300mM棉子糖
17、18 0.25M蔗糖，350mM棉子糖
19、20 0.125M蔗糖，400mM棉子糖
21、22 450mM棉子糖
23、24 PBS
[0533] 用于评估TNF-α中和作用的L929试验
[0534] 从HPA cultures购买L929细胞（cat no.85011425）。在RPMI培养基中的2%FBS5
（胎牛血清）中制备密度为每毫升3.5x 10 个细胞的细胞悬浮液。将100μl的细胞悬浮液加入96孔板的每一个孔中，并在37°C、5%CO2下孵育过夜。
（胎牛血清）中制备密度为每毫升3.5x 10 个细胞的细胞悬浮液。将100μl的细胞悬浮液加入96孔板的每一个孔中，并在37°C、5%CO2下孵育过夜。
[0535] 在独立的96孔板中，建立重组TNF-α的中和作用。以1:2连续稀释来自每一个样品的人抗TNF-α。加入重组人TNF-α，在37°C下将得到的抗体/细胞因子混合物孵育2小时。在孵育之后，将50μl/孔的抗体细胞因子溶液转移至包含L929细胞的板的相应孔中。向每一个孔中加入50μl的0.25μg/ml放线菌素D。
[0536] 在增湿的培养箱中，在37°C、5%CO2下使板孵育24小时。将10μl的5mg/ml的MTT（溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓，一种四唑）溶液加入至每一个孔中，并使板孵育4小时。然后弃去培养基，并向每一个孔中加入100μl DMSO。将板置于摇床上5分钟以使甲 （formazan）彻底混合至溶剂中。最后，在560nm下在synergy HT板读数器上测定光密度，减去在670nm下的背景。
[0537] 结果与讨论
[0538] 为了优化蔗糖和棉子糖的浓度，使用抗-TNF-α抗体进行液体稳定性研究（图5）。观察到最高水平的TNF-α中和作用是（发生）在抗-TNF-α抗体的新鲜液体储备液中。冷冻对照也显示出良好水平的中和作用。储存在PBS中的抗体显示没有TNF-α的中和作用。
蔗糖和棉子糖的最佳浓度呈现为0.5M蔗糖和300mM棉子糖。
蔗糖和棉子糖的最佳浓度呈现为0.5M蔗糖和300mM棉子糖。
[0539] 实施例6
[0540] 下列实验材料和设备用于实施例6中。
[0541] 材料
[0542] 14mm帽（Adelphi Tubes，CWPP14）
[0543] 14mm冷冻干燥瓶塞（Adelphi Tubes，FDIA14WG/B）
[0544] 5ml玻璃小瓶（Adelphi Tubes，VCD005）
[0545] 12x33mm总回收小瓶（Waters，186000384C）
[0546] N,N-DMG（Sigma，D1156，批次077K1856）
[0547] PBS（Sigma，D8662，批次118K2339）
[0548] 棉子糖（Sigma，R0250，批次039K0016）
[0549] 无水磷酸氢二钠（Sigma，71640，批次0001433297）
[0550] 无水硫酸钠（Sigma，71960，批次90500）
[0551] 蔗糖（Sigma，16104，批次80650）
[0552] TSK gel G3000SWXL 7.8mm I.D.30.0cm L（Waters，8541，系列号3SWX04PNMP6228）[0553] TSK gel SWXL 6.0mm I.D.4.0cm L（Waters，8543，系列号SWXP1448）
[0554] 水（Sigma，W3500，批次8M0411）
[0555] 成年绵羊血清（Sigma S2263）
[0556] 设备
[0558] Alliance series e2695分离模块（Waters）
[0559] Alliance series色谱柱加热器（Waters）
[0560] Binder CO2培养箱（Binder）
[0561] Ceti倒置荧光显微镜（VWR）
[0563] Forma 900系列-80°C制冷器（Thermofisher）
[0564] HERA II级安全柜（Thermo Fisher）
[0565] KERN EW220-3NM天平（VWR）
[0566] Thermo Scientific MaxQ 4450培养箱（Thermofisher）
[0567] IgG的配制
[0568] 通过硫酸钠沉淀作用从成年绵羊血清（Sigma）中纯化绵羊IgG，用于研究糖类和DMG作为免疫球蛋白的液体储存的赋形剂的效能。在使用之前将浓度为46μg/μl的绵羊IgG储存在4°C下（正如由Brandford试验测定的）。在PBS中稀释的IgG等分试样，并将选择的新型赋形剂稀释至300μl的体积中的4.6μg/μl的浓度。如在下表4中所示的，新型赋形剂的组分变化。每一种配制品处理复制12次。
[0569] 表4
[0570]
[0571] 热激发
[0572] 在第0天将每一种赋形剂处理（液）的三份平行测定置于每种温度下激发（-80°C、+4°C、+37°C、+56°C）中。在实验的第1、5和31天从热激发中取出60μl的子样品用于通过HPLC测试。
[0573] 基于HPLC的试验
[0574] 将60μl的子样品以单独单位置于最大恢复小瓶中并保持在4°C下。将尺寸排阻层析（SEC）柱（TSK gel G3000SWXL）和相容的保护柱（TSK gel SWXL）串联（首先保护（柱））连接至分离单元，并在25°C下设置流速为1.0ml/min的流动相（0.1M磷酸钠，0.1M硫酸钠，pH 6.8）。一旦设置基线，将每一种样品的50μl注射液注射至移动相。针对每一种样品的运行时间是20分钟，并通过分辨率为2.4mm的检测在280nm下的PDA（光电二极管阵列检测器）检测分离的分子。
[0575] 封闭
[0576] 对每一种赋形剂处理液中的一个平行测定进行样品的每一次封闭，并通过凝胶过滤标准将每一个封闭液归类以确定数据的稳健性（robustness）。
[0577] 结果的分析
[0578] 利用EmPower2软件测量具有5至20分钟的保留时间的所有显著峰下的面积。曲线下的总面积包括空白峰下的面积，因此直接流过柱的并且不能被测定尺寸的分子也包括在计算中。
[0579] 通过计算在单体峰下的面积作为已识别的峰（单体、团聚体和空白）下的总面积的百分数测定IgG的纯度。
[0580] 然后相对于来自相同的天数和温度设置的PBS样品的纯度，转化每一种处理（液）的IgG%纯度。
[0581] 对于每一种赋形剂处理（液），通过从第5天的平均值中减去第1天的平均值，计算前者与后者之间的IgG%纯度的百分点改变。
[0582] 结果与讨论
[0583] 第1天-仅糖类配制品(参见图6）
[0584] 在实验的第一天（24小时热激发），与仅糖类一起配制的样品具有仅与PBS一起配制的那些（样品）的95-105%的平均%纯度（保持在相等的温度下）。冷藏在+4°C下的那些仅糖类的配制品没有显著不同于仅PBS的（样品），表明在该温度下，在仅1天之后仅含有糖类的配制品没有显著的优势。事实上，保持在-80°C下（即一次冻融循环）的糖类配制品显著地比仅含PBS的差（95%）。然而，保持在+37°C和+56°C下的那些糖类配制品显著地比仅含PBS的好（分别为102%和105%）。而且，通过升高的温度引起的IgG的初始解聚无法解释这种增加，因为数据是相对于保持在相等温度下的PBS配制品的。这种改进是含有糖类的配制品的真正优势。
[0585] 第1天-DMG配制品(参见图6）
[0586] 与DMG一起配制的所有样品相对于与PBS一起配制的那些获得了显著改善的纯度（102-106%）。检测到这些改善中最差的是储存在-80°C（即一次冻融）下的样品（102%），但是这以及保持在+4°C（106%）和37°C（106%）下的那些（样品）显示了对仅含糖类配制品的改进。保持在56°C（105%）下的DMG配制品仅等于仅与糖类一起配制品的那些（样品）。
[0587] 第1天-DMG和糖类配制品(参见图6）
[0588] 相比于仅PBS的处理，与糖类和DMG一起共同配制的所有样品给出改善收率的IgG纯度（100-108%）。这些样品中保持在-80°C（100%）、+4°C（104%）和+37°C（104%）下的那些高于仅含糖类的改进。保持在+56°C（108%）下的那些配制品获得了高于仅含DMG的配制品（105%）和仅含糖类的配制品（105%）两者的改进。
[0589] 第1天-概述(参见图6）
[0590] 上文中讨论的结果可以参见图6。该图示出了明显的趋势。差异是微小的；然而，时间刻度很短。第5天和第1天之间的差异或许是更重要的和被关注的。
[0591] 单体峰的面积
[0592] 图7和8分别显示了对于所有配制品储存在4°C和37°C下，随着时间（第1、5和31天）的单体峰的面积。单体峰的面积视为恢复的单体IgG的估算。
[0593] 第1天-在4°C下
[0594] 图3显示了早在第1天保持在4°C下的配制品显示了它们单体峰面积的差异。赋形剂特异性解聚可以介导这些差异。用DMG和糖类配制的处理最大的单体峰，并因此具有最高的恢复的单体IgG。用仅糖类一起配制的处理显示最小的单体IgG，并因此具有最小的恢复的单体IgG。与仅PBS或仅DMG一起配制的样品没有显著地不同，并且在这些的中间。
[0595] 在4°C下的第1天至第5天以及第5天至第31天
[0596] 在储存在4°C下的所有配制品中，恢复的单体IgG有可比较的数量级的下降。随后，在第5天和第31天之间，没有进一步损失单体IgG。
[0597] 在37°C 下的第1天
[0598] 图7和8的比较显示保持在37°C下的处理液比保持在4°C下的相等的配制品全部具有更高的量或恢复的单体IgG。这是温度介导的解聚的证据。
[0599] 在37°C下第1天至第5天
[0600] 在37°C下，除了仅有DMG之外，任何处理液中的第1天和第5天之间没有损失单体。这种没有损失可能是由于热介导的解聚平衡了降解。
[0601] 在37°C下的第5天至第31天
[0602] 与PBS、或仅糖类、或仅DMG一起配制的样品在第5天和第31天之间全都显示单体IgG的显著降低。实际上，这些处理液中仅DMG显示最急剧的下降，之后是PBS。含有仅糖类的配制品稍微提高了超过PBS的单体IgG的恢复率，但是如上所述仍然遭受显著损失。然而，含有DMG和糖类的配制品在这个时间范围内没有显示单体IgG的显著下降。这样的DMG和糖类的共同配制品提供作为赋形剂的提高的IgG的热稳定性的重要潜能。
[0603] 实施例7-腺病毒的稳定性
[0604] 除非另有说明，在实施例7和实施例8中采用下列材料、设备和技术：
[0605] 材料
[0606] 化学品
[0607]
[0608] 生物体
[0609] 腺病毒 （Vector Biolabs cat.1060）
[0610] BHK-21细胞系 （ECCAC CB2857）
[0611] HEK 293 （ECACC 85120602）
[0612] 其他
[0613] 5ml玻璃小瓶 （Adelphi Tubes VCD005）
[0614] 14mm冷冻干燥瓶塞 （Adelphi Tubes FDIA14WG/B）
[0615] 14mm帽 （Adelphi Tubes CWPP14）
[0616] 设备
[0617]
[0618] 液体病毒制剂的制备5
[0619] 将在CMV启动子下表达增强的GFP（绿色荧光蛋白）的、并具有6.7x10pfu/ml的滴定度（预冷冻）的在SSC中的重组人腺病毒Ad5（Vector Biolabs）从在-80°C的储存中取出，并且使得其融化。向5ml玻璃小瓶中加入50μl的等分试样。向这些50μl的病毒样品中加入250μl的由DMG、MSM和可选的蔗糖组成的配制品混合物。每一种配制品混合物是配制在SSC中的。在加入病毒样品之后在每一种配制品中DMG、MSM和蔗糖的浓度显示在表5中：
[0620] 表5—测试的配制品
[0621]配制品 蔗糖（M） MSM（M） DMG（M）
1 0.00 0.10 0.10
2 0.15 0.10 0.10
3 0.00 1.00 0.10
4 0.15 1.00 0.10
5 0.08 0.55 0.55
6 0.08 0.55 0.55
7 0.08 0.55 0.55
8 0.00 0.10 1.00
9 0.15 0.10 1.00
10 0.00 1.00 1.00
11 0.15 1.00 1.00
1 0.00 0.10 0.10
2 0.15 0.10 0.10
3 0.00 1.00 0.10
4 0.15 1.00 0.10
5 0.08 0.55 0.55
6 0.08 0.55 0.55
7 0.08 0.55 0.55
8 0.00 0.10 1.00
9 0.15 0.10 1.00
10 0.00 1.00 1.00
11 0.15 1.00 1.00
[0622] 在将其置于37°C下进行热激发之前，将小瓶塞住并盖上（螺旋帽）。热激发持续7天，在这之后，将所有小瓶放回至4°C下直至对它们进行实际试验。
[0623] 对于感染性腺病毒的试验5
[0624] 用HEK 293（ECACC 85120602）细胞以每毫升10 个细胞（100μl每孔）接种96孔平底细胞培养皿（VWR，UK），并保持在具有5%CO2的37°C下。在达到90%汇合之后，接种细胞。
[0625] 在300μl SSC中重建包含腺病毒加赋形剂的小瓶。通过从重建的小瓶中取出20μl、并加入至180μl的杜尔贝科改良的伊格尔培养基（DMEM）中进行10比1的稀释步骤。通过取出20μl的10比1的稀释度并将其加入至180μl的DMEM中进行进一步的（原始样品的）100比1的稀释。然后将100μl的每一种得到的稀释液（10比1和100并1）加入至包含HEK293细胞的板的孔中。
[0626] 另外，用于赋形剂处理液中的来自相同来源并具有相同滴定度的腺病毒的进一步样品（储存在-80°C下），将其融化并用于产生10比1的稀释度系列（在DMEM+10%FBS中）。6
将范围从10比1至10 比1的稀释液也加入至包含HEK 293的各个孔中。在接种后48小时，利用荧光显微镜法计算每孔中的GFP（绿色荧光蛋白）细胞，随后考虑到施加的体积和接种物的稀释度将其转化为经处理的样品的pfu/ml。
将范围从10比1至10 比1的稀释液也加入至包含HEK 293的各个孔中。在接种后48小时，利用荧光显微镜法计算每孔中的GFP（绿色荧光蛋白）细胞，随后考虑到施加的体积和接种物的稀释度将其转化为经处理的样品的pfu/ml。
[0627] 结果
[0628] 在图9中显示了结果。使用MODDE 9.0程序（Umetrics，Sweden）通过多元线性回归（MLR）分析法分析了数据，当MSM和DMG结合使用时检测到了协同效应。
[0629] 实施例8：MVA的稳定性
[0630] 液体病毒制剂的制备
[0631] 从-80°C的储存中恢复并融化MVA。向5ml玻璃小瓶中加入50μl等分试样。向这些小瓶中加入250μl的在以上表1中列举的配制品混合物。塞住小瓶，并旋紧螺旋帽以密封。立即将小瓶置于37°C下进行热激发。热激发持续7天，在这之后，将所有小瓶放回至4°C下直至对它们进行实际试验。
[0632] 对于传染性MVA的试验
[0633] 用BHK-21细胞（每孔100μl，105个细胞/ml）接种试验板（96孔）。在以10%FBS和1%PS补充的DMEM中稀释细胞。将板置于+37°C、+5%CO2下持续1至2小时。
[0634] 同时，（在相同的生长培养基中）制备经配制的MVA样品的稀释度系列，范围从10-1-4至10 。每一个稀释度系列制备4份。将35μl的每一种稀释液应用至包含BHK-21细胞的各个孔中，并用另外的65μl的培养基将孔加满。
[0635] 在接种之后的第6天，在存在或不存在细胞病变效应（CPE）下对孔打分，并且计算TCID50。然后将这些用于估算在经热激发的小瓶中每毫升感染性MVA的浓度。
[0636] 结果
[0637] 在图10中显示了结果。
[0638] 实施例9
[0639] 材料
[0640] 化学品
[0641]
[0642] 生物体
[0643] 供应商 目录编号
[0644] 腺病毒 Vector Biolabs Ad-CMV-GFP
[0645] HEK 293 ECACC 85120602
[0646] 其他
[0647]
[0648] 设备
[0649]
[0650] 方法
[0651] 实验设计
[0652] 将MODDE 9.0（Umetrics）用于产生Doehlert实验设计（参见图11）。Doehlert设计是由规则的单形构建的响应面模型化设计。它们在不同的方向上是易于延伸的，并且可以向现有设计中加入新的因素。与常规的配制品设计不同，可以从分析中排除不显著的因素以使不成为混淆因素。
[0653] 而且，在不同数量的水平上测试设计中的不同因素，因此向我们怀疑是极为重要的因素分配更多的测试水平是可能的。因此，在七个水平上测试PEI，同时在五个（水平）上测试蔗糖并在三个（水平）上测试棉子糖。该模型保持对于二阶效应和相互作用的模型化的能力。包括三个因素和三个复制中心点的设计得到15个试样。
[0654] 在0和1M之间测试蔗糖。在0至300mM范围内测试棉子糖，虽然Doehlert设计的本质意味着测试的水平不包括0mM。替换地，测试下列范围：27.5、150.0、和272.5mM。
[0655] 在从0.04-4000nM的对数范围内测试PEI。
[0656] 在液体设置（环境，setting）中腺病毒的稳定性
[0657] 液体设置(环境，setting）中配制的腺病毒的制剂和热激发5
[0658] 将在CMV启动子下表达增强的GFP的、具有6.7x10pfu/ml的滴定度（预冷冻）的在SSC中的重组腺病毒从-80°C的储存中取出，并且使得其融化。随后，向15个5ml玻璃小瓶中加入50μl等分试样的病毒。向每一个小瓶中混合入250μl的赋形剂混合物。在表6中描述了并且在SSC中制备了与病毒混合的赋形剂混合物配制品。
[0659] 在将其置于+37°C热激发下1周之前，将小瓶塞住并盖上（螺旋帽），之后转移至+4°C下直至对它们进行实际试验。
[0660] 表6
[0661]
[0662] 腺病毒试验
[0663] 通过以每ml105个细胞（每孔100μl）接种并保持在具有5%CO2的37°C下，制备96孔平底细胞培养皿中的HEK 293细胞用于接种。在2小时之后，如下接种细胞。
[0664] 热激发的病毒样品以在DMEM+10%FBS+1%PS中的10比1和100比1稀释。然后向试验板的各个孔中加入100μl的每一种得到的经稀释的样品。另外，从-80°C融化SSC中的原始腺病毒的第二等分试样，并且也制备DMEM+10%FBS+1%PS中的10倍稀释度系列（从10比1至100,000比1）。向使用的每一个96孔板中接种两份阳性对照稀释度系列。在另外的48小时之后，使用荧光显微镜法计数每孔中GFP细胞的数量。
[0665] 结果
[0667] 模型中的重要项目（参见图13）包括所有的三种赋形剂的一阶和二阶效应，但是它们之间没有相互作用。
[0668] 表面相应（响应面，Surface response）图（图14）最清晰地示出了蔗糖和支化PEI（P-Bra）的效应。每一张图表上的峰表示在每一种规定的棉子糖浓度（0、150和300mM）下的最佳配制品。三张图表显示棉子糖几乎不改变P-Bra（支化PEI）或蔗糖的最佳浓度，但是确实改变可达到的最大恢复的病毒活性。
[0669] 与试样一起已经试验了阳性对照。用作对照的病毒是在该试验中使用的相同病毒5
的另外的等分试样，其已经储存在-80°C下。该样品试验的滴定度是6.7x10pfu/ml。蒙特-卡罗（Monte-Carlo）模拟法用于预测最佳配制品。阳性对照用作用于优化的目标，因为模型预测一些配制品将产生大于100%恢复的病毒活性（参见下文）。
的另外的等分试样，其已经储存在-80°C下。该样品试验的滴定度是6.7x10pfu/ml。蒙特-卡罗（Monte-Carlo）模拟法用于预测最佳配制品。阳性对照用作用于优化的目标，因为模型预测一些配制品将产生大于100%恢复的病毒活性（参见下文）。
[0670] 预测的最佳配制品是：蔗糖=0.74M，P-Bra（支化PEI）=14nm，棉子糖=162mM（参见5
图15）。预测在此确定的最佳配制品产生5.1x10pfu/ml的恢复的病毒滴定度，或仅为24%的病毒活性损失率。
图15）。预测在此确定的最佳配制品产生5.1x10pfu/ml的恢复的病毒滴定度，或仅为24%的病毒活性损失率。
[0671] 实施例10
[0672] 腺材料
[0673] 化学品
[0674]
[0675] 生物体
[0676] 供应商 产品代码
[0677] BHK-21 细胞系ECACC CB2857
[0678] MVA ATCC VR-1508
[0679] 其他
[0680]
[0681] 设备
[0682]
[0683] 方法
[0684] 实验设计
[0685] MODDE 9.0用于产生中心复合表面（Central Composite Face-Centred）（CCF）设计（参见图16）。CCF设计是响应面模型（Response Surface Modelling）（RSM）设计的一种形式，其测试每一个因素的仅三个水平，但是仍然支持二次式模型。与常规的配制品设计不同，可以从分析中排除不显著因素以使不成为混淆因素。
[0686] 在液体设置（环境，setting）中配制的MVA的制剂和热激发
[0687] 从储存在-80°C下恢复并融化MVA。向15个5ml玻璃小瓶中加入50μl等分试样的MVA。随后，向15个5ml玻璃小瓶中加入50μl等分试样的病毒。向每一个小瓶中混合入250μl的赋形剂混合液。在表7中描述并且在SSC中制备了曾经与病毒混合的赋形剂混合配制品。
[0688] 表7
[0689]
[0690]
[0691] 在将其置于+37°C下热激发1周之前，将小瓶塞住并盖上（螺旋帽），之后转移至+4°C下直至对它们进行实际试验。
[0692] MVA试验
[0693] 用BHK-21细胞（每孔100μl，105个细胞/ml）接种试验板（96孔）。在以10%FBS和1%PS补充的DMEM中稀释细胞。将板置于+37°C、+5%CO2下持续1-2小时。
[0694] （在相同的生长培养基中）制备经配制的MVA样品的10倍稀释系列，范围从10比1至10,000比1。每一个稀释系列制备5份。将100μl的每一种稀释液施加至包含BHK-21细胞（上文描述的）的各个孔中。
[0695] 在接种后（p.i.）第6天，在存在或不存在CPE下对孔打分并计算TCID50。然后将这些用于估算在经热激发的小瓶中每毫升感染性MVA的浓度。
[0696] 随后，制备范围从2,000比1至32,000比1的经配制的MVA样品的2倍稀释系列。单独地但是如前述地试验这些稀释液。
[0697] 结果
[0698] 在上表7中显示在该研究中搜集的原始数据。响应（应答）在7.6x104至5
7.6x10TCID50/ml的范围内，或为初始滴定度的7.4-74.0%（参见表7）。由该数据产生的模型
2 2
适当地对所有的四个模型评估参数打分（R=0.79，Q=0.49，模型效度=0.90，再现性=0.59）（参见图17）。
7.6x10TCID50/ml的范围内，或为初始滴定度的7.4-74.0%（参见表7）。由该数据产生的模型
2 2
适当地对所有的四个模型评估参数打分（R=0.79，Q=0.49，模型效度=0.90，再现性=0.59）（参见图17）。
[0699] 预测了蔗糖、TMG和棉子糖对测试的浓度范围内病毒恢复率全部具有1阶（1次）正效应（影响）。虽然棉子糖的效应仅在90%置信度下是显著的，但在模型中保留了它，因为其改善了模型的强度，并且需要保留模型的层级（复杂性，hierarchy）。这是需要的，因为也预测了TMG和棉子糖的相互作用。最终，观测到蔗糖的2阶（2次）非线性效应。在模型中保持的系数的总结（汇总）参见图18。
[0700] 图19清晰地示出相互作用的4D等值线图。可以看出最佳蔗糖浓度是一致的，在0.6至0.8M之间，其他赋形剂没有显著地改变这个范围。通常TMG的浓度越高，病毒活性的恢复率越大。
[0701] 蒙特-卡罗模拟法（Monte-Carlo simulations）（在图20中示出）指出了针对测试范围的最佳极值（1M蔗糖、1M TMG、300mM棉子糖）。这提示测试的范围没有覆盖最佳配制品。然而，模拟（结果）预测，接近该最佳值的配制品应当获得初始滴定度的94%的恢复的病毒活性。
[0702] 实施例11
[0703] 材料
[0704] 化学品
[0705]
[0706] 生物体
[0707] 供应商 目录编号
[0708] 腺病毒 Vector Biolabs Ad-CMV-GFP
[0709] HEK 293 ECACC 85120602
[0710] 其他
[0711]
[0712]
[0713] 设备
[0714]
[0715] 方法
[0716] 实验设计
[0717] MODDE 9.0（Umetrics）用于产生Doehlert实验设计（参见图21），正如在实施例9中描述的。因此，在七个水平上测试MSM，同时在五个（水平）上测试蔗糖并在三个（水平）上测试棉子糖。该模型保持对于模拟二阶（二次）效应和相互作用的能力。包括三个因素和三个平行测定（replicate）中点的设计得到15个试样。
[0718] 在0和1M之间测试蔗糖。在0至300mM范围内测试棉子糖，虽然Doehlert设计的本质意味着测试的水平不包括0mM。替换地，测试下列范围：27.5、150.0、和272.5mM。在0至2M的线性范围内测试MSM。
[0719] 液体设置(环境，setting）中腺病毒的稳定性5
[0720] 将在CMV启动子下表达增强的GFP、具有6.7x10pfu/ml的滴定度（预冷冻）的在SSC中的重组腺病毒从-80°C的储存中取出，并且使得其融化。随后，向15个5ml玻璃小瓶中加入50μl等分试样的病毒。向每一个小瓶中混合入250μl的赋形剂混合液。在表8中描述并且在SSC中制备了曾经与病毒混合的赋形剂混合配制品。
[0721] 表8
[0722]
[0723]
[0724] 在将其置于+37°C的热激发下1周之前，将小瓶塞住并盖上（螺旋帽），之后转移至+4°C下直至对它们进行实际试验。腺病毒试验正如在实施例9中描述的。
[0725] 结果
[0726] 在表8中给出了原始数据。对数据的分析产生了相对强的模型（参见图22）。R2（0.84）表明良好的显著性，再现性（0.94）是高的，并且模型效度（0.60）显著地高于表明了模型问题的水平（0.25）。
[0727] 图23显示在模型精细调整之后保持的模型系数。MSM和蔗糖两者都是1阶（1次）效应的显著性因素（置信度=95%）。在95%置信度下没有检测到其他的显著性因素。然而，在精细调整期间的分析提示具有一定的曲率（弯曲，curvature）。通过包括仅在90%置信度下是显著性的两个其他因素得到更强的模型。首先，MSM的2阶（2次）效应以及MSM和蔗糖之间的相互作用。在该分析中观测到棉子糖没有影响，并从模型中将其消除。
[0728] 模型的3D图（参见图24）证明增加的蔗糖浓度致使恢复的病毒活性增加。在此测试的范围不包括最佳蔗糖浓度。在高的蔗糖水平下，MSM的中间浓度（~1M）增强保护效应。通常，存在的蔗糖越多，最佳MSM的浓度越高。
[0729] 蒙特-卡罗模拟法（图25）用于预测赋形剂的最适浓度。确定了最佳的1M蔗糖和0.95M MSM。因为棉子糖对模型没有影响，其在最佳配制品中是不需要的。然而，如果由于
5
任何其它原因需要棉子糖，其也不会有负面效应（影响）。预测最佳配制品获得3.8x10pfu/
5
ml的恢复的病毒活性或初始病毒滴定度的88.4%（相比于4.3x10pfu/ml的阳性对照）。
5
任何其它原因需要棉子糖，其也不会有负面效应（影响）。预测最佳配制品获得3.8x10pfu/
5
ml的恢复的病毒活性或初始病毒滴定度的88.4%（相比于4.3x10pfu/ml的阳性对照）。
[0730] 实施例12
[0731] 材料
[0732] 化学品
[0733]
[0734] 生物体
[0735] 供应商 产品代码
[0736] 腺病毒 Vector Biolabs Ad-CMV-GFP
[0737] HEK 293 ECACC 85120602
[0738] 其他
[0739]
[0740] 设备
[0741]
[0742] 方法
[0743] 实验设计
[0744] MODDE 9.0（Umetrics）用于产生Doehlert实验设计（参见图26），正如在实施例9中描述的。在七个水平上测试DMG，同时在五个（水平）上测试蔗糖并在三个（水平）上测试棉子糖。该模型保持模拟二阶（二次）效应和相互作用的能力。包括三个因素和三个平行测定中点的设计得到15个试样。
[0745] 在0和1M之间测试蔗糖。在0至300mM范围内测试棉子糖，虽然Doehlert设计的本质意味着测试的水平不包括0mM。替换地，测试下列范围：27.5、150.0、和272.5mM。在0至2M的线性范围内测试DMG。
[0746] 液体设置(setting）中腺病毒的稳定性5
[0747] 将在CMV启动子下表达增强的GFP、具有6.7x10pfu/ml的滴定度（预冷冻）的在SSC中的重组腺病毒从-80°C的储存中取出，并且使得其融化。随后，向15个5ml玻璃小瓶中加入50μl等分试样的病毒。向每一个小瓶中混合入250μl的赋形剂混合液。在表9中描述并且在SSC中制备了曾经与病毒混合的赋形剂混合配制品。
[0748] 表9
[0749]
[0750] *表示从模型中除去的异常值
[0751] 在将其置于+37°C下热激发1周之前，将小瓶塞住并盖上（螺旋帽），之后转移至+4°C下直至对它们进行实际试验。腺病毒试验正如在实施例9中描述的。
[0752] 结果
[0753] 由该数据产生了非常强的模型（参见表9）。模型的所有四个指标得到高分2 2
（R=0.97，Q ＝0.90，模型效度=0.89，再现性=0.96）（参见图27）。通过除去一个平行测定在精细调整期间增强了模型。软件将该配制品标记为明显的异常值。
（R=0.97，Q ＝0.90，模型效度=0.89，再现性=0.96）（参见图27）。通过除去一个平行测定在精细调整期间增强了模型。软件将该配制品标记为明显的异常值。
[0754] 该模型中显示配制品中所有的三种赋形剂是显著性因素（参见图28）。蔗糖和棉子糖仅具有1阶（1次）效应，然而DMG具有1阶（1次）和2阶（2次）效应。此外，棉子糖和DMG之间有相互作用。
[0755] 图29显示最佳蔗糖浓度超出了测试的浓度。然而，由于对产物的同渗容摩（渗透性）的限制将不可能显著地增加蔗糖浓度。在一些水平上，DMG提高了配制品的保护性效应，为了此目的，棉子糖改变了最佳DMG浓度。
[0756] 蒙特-卡罗模拟法用于预测最佳配制品（参见图30）。设置该程序以使恢复的病5
毒活性最大化至4.3x10pfu/ml的极限（阳性对照的滴定度）。预测的最佳配制品是0.5M蔗
5
糖、0.4M DMG、272nM棉子糖，并预期这获得3.6x10pfu/ml或初始滴定度的84%的滴定度（基于阳性对照）。
毒活性最大化至4.3x10pfu/ml的极限（阳性对照的滴定度）。预测的最佳配制品是0.5M蔗
5
糖、0.4M DMG、272nM棉子糖，并预期这获得3.6x10pfu/ml或初始滴定度的84%的滴定度（基于阳性对照）。
[0757] 图31a显示研究数据的可替代方式。等值线图显示在大量不同的棉子糖浓度下，针对蔗糖浓度绘制的DMG浓度。该图显示，随着棉子糖的增加，黑色区域（较高的病毒活性恢复率）沿Y轴（DMG浓度）向下移动。黑色交叉标志着预测的最佳配制品。图31b显示其中预测的恢复率是100%以上的区域。
[0758] 实施例13
[0759] 材料
[0760] 化学品
[0761]
[0762] 生物体
[0763] 供应商 产品代码
[0764] 腺病毒 Vector Biolabs Ad-CMV-GFP
[0765] HEK 293 ECACC 85120602
[0766] 其他
[0767]
[0768] 设备
[0769]
[0770] 方法5
[0771] 将在CMV启动子下表达增强的GFP、具有10.2x 10pfu/ml的滴定度（预冷冻）的在PBS中的重组腺病毒从-80°C的储存中取出，并且使得其融化。随后，向15个5ml玻璃小瓶中加入50μl等分试样的病毒。向每一个小瓶中混合入250μl的赋形剂混合液。在表10中描述了并且在PBS中制备了曾经与病毒混合的赋形剂混合配制品。
[0772] 表10
[0773]
[0774] 从此处以上使用了下列处理液名称：
[0775] “缓冲液（缓冲剂）”=仅含PBS缓冲液而没有赋形剂
[0776] “蔗糖”=PBS中的1M蔗糖
[0777] “棉子糖”=PBS中的100mM棉子糖
[0778] “糖类”=在PBS中的1M蔗糖、100mM棉子糖
[0779] "NE"=在PBS中的0.7M DMG，
[0780] “最佳”=在PBS中的1M蔗糖、100mM棉子糖、0.7M DMG。
[0781] 在表11中给出的条件下，在热激发（对抗）之前将小瓶塞住并盖上（螺旋帽）。在适当的时间点，如在实施例9中描述的进行腺病毒试验。
[0782] 结果
[0783] 搜集的很多数据点在试验的检测限以下（参见表11）。
[0784] 表11
[0785]
[0786] *数据点在检测限以下
[0787] 为了方便，已经指定了这些数据点的阈值，因为这是它们可以具有的最大可能值。很可能这将对结果解释几乎没有影响，因为获得这样低的病毒活性恢复率的任何配制品除了（作为）比较器之外几乎没有实际用途。对于该试验的检测限是600pfu/ml，其等于0.03%的恢复活性。
[0788] 对于保持在+4°C下的样品，仅测试了一个时间点。在这个温度下6个月后病毒活性的收率（恢复率）可以参见图32。仅含缓冲液的处理给出了50.1%初始滴定度的恢复率，并且给出了明显的指示，即使用的腺病毒在这种液体设置（setting）中是固有地适当稳定的。该研究结果也显示需要加速的稳定性试验。
[0789] 在6个月后恢复92.1%活性的“蔗糖”处理（液）是对仅含缓冲液的重大改进。相比之下，仅“棉子糖”获得55.5%（恢复的活性），对“仅（含）缓冲液”（具有）些微的改进，但比“蔗糖”差。结合的“糖类”处理（液）给出了仅86.4%的恢复的病毒活性。
[0790] 仅DMG的处理（液）（"NE"）保存仅65.1%的病毒活性，但是在与糖类共同使用时观测到99.3%的恢复活性。该研究结果接近在+4°C之下6个月之后腺病毒的零损失。
[0791] 在每一个时间点和温度激发下在这种“最佳”配制品中恢复的病毒活性显示在图33中。正如之前讨论的，在+4°C下6个月之后接近零损失。
[0792] 在+25°C和+37°C下热激发的结果（参见表11和图34）证明，与构成其的组分相比，“最佳”配制品在稳定腺病毒中是更有效的。
[0793] 实施例14
[0794] 材料
[0795] 化学品
[0796]
[0797] 生物体
[0798] 供应商 产品代码
[0799] BHK-21 细胞系ECACC CB2857
[0800] MVA ATCC VR-1508
[0801] 其他
[0802]
[0803]
[0804] 设备
[0805]
[0806] 方法
[0807] 实验设计
[0808] MODDE 9.0用于产生中心复合平面（CCF）设计。CCF设计是响应面模型化（RSM）设计的一种形式，其测试每一个因素的仅三个水平，但是仍然支持二次式模型。（参见图35）。与常规的配制品设计不同，可以从分析中排除不显著因素以使不成为混淆因素。
[0809] 液体设置(环境，setting）中配制的MVA的制备和热激发
[0810] 从储存在-80°C下恢复并融化MVA。随后，向15个5ml玻璃小瓶中加入50μl等分试样的病毒。向每一个小瓶中混合入250μl的赋形剂混合液。在下表12中描述了并且在SSC中制备了曾经与病毒混合的赋形剂混合配制品。在将其置于+37°C的热激发下1周之前，在真空下塞住小瓶，并盖上（螺旋帽），之后置于+4°C下直至对它们进行实际试验。
[0811] MVA试验
[0812] 用BHK-21细胞（每孔100μl，105个细胞/ml）接种试验板（96孔）。在以10%FBS和1%PS补充的DMEM中稀释细胞。将板置于+37°C、+5%CO2下持续1-2小时。
[0813] 同时，（在相同的生长培养基中）制备经配制的MVA样品的10倍稀释系列，范围从10比1至10,000比1。每一个稀释系列制备5份。将100μl的每一种稀释液施加至包含BHK-21细胞（上文描述的）的各个孔中。
[0814] 在接种后（p.i.）第6天，在存在或不存在CPE下对孔打分并计算TCID50。然后将这些用于估算在经热激发的小瓶中每毫升感染性MVA的浓度。
[0815] 结果
[0816] 来自该研究中的原始TCID50数据显示在表12中。
[0817] 表12
[0818]
[0819] *在精细调整期间从模型中除去作为明显异常值的数据点
[0820] 响应（应答）从初始滴定度的0.5变化至74.1%。模型预测两种赋形剂的1阶（1次）效应（参见图36和37）。在DMG和甘露醇两者的情况下，随着浓度的增加，增加了病毒的保存（保持）。这由在图38中的等值线图清晰地示出。此外，确定了DMG和甘露醇之间的相互作用。
[0821] 蒙特-卡罗模拟法提示，对于高浓度的每一种测试的赋形剂，可以预期在+37°C下热激发1周后达到超过初始滴定度的66%以上，这表示低于0.2log的损失。
[0822] 实施例15
[0823] 材料
[0824] 化学品
[0825]
[0826]
[0827] 生物体
[0828]
[0829] 其他
[0830] 生产商 产品代码
[0831] 2ml Eppendorf管（微量离心管） VWR 16466-058
[0832] ELISA免疫板NUNC 439454
[0833] 设备
[0834]
[0835] 方法
[0836] 在各种浓度的赋形剂存在下热激发二价F(ab')2，并在不同的点试验。ELISA试验用于评估剩余的F(ab')2的活性-这用于测量保持的破坏程度。
[0837] 含有赋形剂的液体设置(环境)中二价F(ab′)2的制备和热激发
[0838] 从-80°C的储存中取出PBS中的二价F(ab')2，并且使得在室温下融化。为了测定液体设置中赋形剂的保护性质，配制含有抗体浓度为4μg/ml的900μl的每一种配制品-该数量足以试验三个独立的时间点。参见表13的针对每一种配制品的详细信息。
[0839] 表13：赋形剂配制品的详细信息
[0840]
[0841] 建立两小瓶的-SR/-P（对照）配制品—一个储存在+4°C下（作为阳性对照-预期没有破坏），并且将第二个与其他配制品置于+56°C下（作为阴性对照；预期在升高的温度下在24小时之后该配制品不会保持稳定和保持活性）。
[0842] 二价F(ab′)2的活性试验
[0843] 通过ELISA试验二价F(ab')2的活性。将在PBS中稀释至0.5μg/ml的抗原（鼠IgG2b-κ）以100μl/孔涂覆在96-孔板的A至G排中，以及H排的两个额外的孔用于+4°C的对照条件。将以1:400,000稀释度的正常鼠血清也加入至H排的两个孔中作为阳性对照。这些对照用于之后使数据标准化（归一化）。在+4°C下孵育板18小时，然后用包含0.05%吐温20的PBS（洗涤缓冲液）洗涤三次。
[0844] 通过印迹至纸巾上使板干燥。这种印迹的方法用于每一个洗涤步骤。用包含5%脱脂奶粉和0.05%吐温20的PBS封闭板1.5小时。在加入样品之前用洗涤缓冲液洗涤板三次。
[0845] 在热激发（或对于对照小瓶的+4°C）下孵育之后，从培养箱/冰箱中取出F(ab')2配制品，并从每一个中取出250μl。将其用洗涤缓冲液以1:2稀释。将两份的每一种稀释样品加入至板中并且沿着板稀释2倍（最终浓度在2μg/ml至0.0625μg/ml的范围内）。也包括不含二价F(ab')2的条件以测定背景信号。在室温下孵育板1.5小时，在该时间之后，用洗涤缓冲液洗涤板五次。
[0846] 以1:5000在洗涤缓冲液中稀释山羊抗人HRP结合的抗体，并将100μl加入至所有包含F(ab')2的孔中。以1:1000在洗涤缓冲液中稀释兔抗鼠HRP结合物，并将100μl加入至包含正常鼠血清对照的孔中。在室温下孵育板1.5小时然后用洗涤缓冲液洗涤板五次。
[0847] 将100μl的TMB稳定的发色团加入至每一个孔中，并使得在室温下反应10分钟，在该时间之后加入100μl的200mM硫酸以终止反应。使用Synergy HT微量板读数器在450nm下读出板。
[0848] 统计学分析
[0849] 对每一种的两份（样品）取平均值和标准偏差，并将数据点绘制成线性图或作为在指定的F(ab')2浓度下的柱状图。
[0850] 结果
[0851] 在+56°C下热处理24小时之后二价F(ab′)2片段的活性
[0852] 在初步研究中，将储备液F(ab')（2 如由AbD Serotec提供的-浓度为0.73mg/ml）储存在+56°C下以评估在升高的温度下的初始稳定性。发现在56°C下抗体是极度易热分解的，在24小时之后几乎没有活性剩余，为测试赋形剂对稳定该抗体的能力提供了极好的起点（图39）。
[0853] 在+56°C以及含有和不含赋形剂下热处理之后二价F(ab′)2片段的活性
[0854] 在存在各种浓度的赋形剂下，热激发二价F(ab')2，并且在不同的点试验（参见图40）。在+56°C下储存24小时之后大部分样品保持其大部分F(ab′)2活性（当相比于储存在+4°C下的对照样品时），然而，与低的或没有糖类一起配制的样品在5天之后，当相比于24小时之后剩余的活性时，剩余的F(ab')2活性下降至21%至33%之间。包含高糖浓度的样品在+56°C下储存5天之后保留了至少44%的活性-加入PEI后这增加至63%至
94%。
94%。
[0855] 在+56°C下热激发7天后取得最终的时间点。如预期的，对照样品没有失去任何活性。与低的或没有糖类一起配制的样品损失了其大部分F(ab′)2活性。包含高糖浓度的样品保持了24小时样品的至少27%（的活性），当加入10μg/ml的PEI时这增加至79%。
[0856] 结论
[0857] 如预期的，储存在+4°C下7天的样品未受到F(ab′)2活性的任何损失。含有或不含PEI的包含低糖浓度的样品，在+56°C下5天之后损失了大部分F(ab′)2活性。最具有保护性的配制品包含高糖浓度，并且加入10μg/ml的PEI显著增加保护性。在5天的热激发（TC）之后，所有低糖浓度的样品损失了大部分的F(ab′)2活性，然而包含高糖浓度和PEI的那些（样品）仍然保持了显著水平的F(ab')2活性。
[0858] 实施例16
[0859] 材料
[0860] 化学品
[0861]
[0862] 生物体
[0863]
[0864] 其他
[0865] 生产商 产品代码
[0866] 2ml eppendorf管（微量离心管） VWR 16466-058
[0867] ELISA免疫板 NUNC 439454
[0868] 设备
[0869]
[0870] 方法
[0871] 研究的设计
[0872] 在各种浓度的赋形剂存在下热激发二价F(ab')2，并在不同的点试验。ELISA试验用于评估剩余的F(ab')2活性-这用于测量保持的破坏程度。
[0873] 含有赋形剂的液体设置(环境)中二价F(ab′)2的制备和热激发
[0874] 从-80°C的储存中取出PBS中的二价F(ab')2，并且使得在室温下融化。为了测定液体设置（环境）中赋形剂的保护性能，配制含有抗体浓度为4μg/ml的1050μl的每一种配制品-该数量足以试验四个独立的时间点。参见表14对于每一种配制品的详细信息。
[0875] 表14：赋形剂配制品的详细信息
[0876]
[0877] 建立两小瓶的-SR/-P（对照）配制品—一个储存在+4°C下（作为阳性对照-预期没有破坏），并且将第二个与其他配制品置于+40°C下（作为阴性对照；预期在升高的温度下在24小时之后该配制品不会保持稳定）。在24小时之后，热激发的样品被放置在+56°C以加速破坏。
[0878] 二价F(ab′)2的活性试验
[0879] 如在实施例15中给出的，试验二价F(ab′)2的活性。
[0880] 统计学分析
[0881] 对每一种的两份（样品）取平均值和标准偏差，并将数据点绘制成线性图或作为在指定的F(ab')2浓度下的柱状图。
[0882] 结果
[0883] 在含有和不含赋形剂的热处理之后二价F(ab′)2片段的活性
[0884] 在图41中显示了结果。在+40°C下储存24小时之后，相比于储存在+4°C的对照条件，F(ab')2没有明显的破坏。在+56°C下热激发另外的4天之后，未保护的F(ab')2的活性下降至5%的24小时之后的活性。包含低糖类浓度的样品保留了6%（无DMG）至26%（高的DMG）的24小时之后的活性。包含高糖类的样品保留至少37%的24小时之后的剩余活性，而当加入DMG，这增加至60%-81%。
[0885] 取最后的时间点为14天热激发后（在+40°C下24小时，然后在+56°C下13天）。每一个经热激发样品都失去了其大部分活性（具有3%至14%的剩余活性），表明赋形剂不足以在+56°C的这些苛刻的降解条件下充分保护F(ab')2持续14天。
[0886] 结论
[0887] 如预期的，储存在+4°C下持续两周的样品没有受到F(ab')2的任何损失。在含有或不含DMG的情况下，在+56°C下包含低糖浓度的样品在5天之后失去大部分F(ab')2活性。最具有保护性的配制品包含DMG和高糖浓度。
[0888] 实施例17
[0889] 材料
[0890]
[0891]
[0892] 设备
[0893]
[0894] 方法
[0895] 样品制备
[0896] 以在PBS中的167μg Fab制备阳性和阴性对照样品（在HPLC分析之前即时制备新鲜的阳性对照）。以PBS中的167μg Fab以及0.15M蔗糖和0.015M棉子糖制备仅含蔗糖-棉子糖的混合液。以PBS中的167μg Fab与0.15M蔗糖和0.015M棉子糖以及下列0.1M（低的）或1.0M（高的）的DMG或TMG中的一种制备试样。除阳性对照之外，所有样品都经受在56°C下130h的热激发。这样得到总共七个样品。
[0897] 在激发之后，在将所有样品在室温下经受在16.3k·g下的离心持续5分钟以去除任何不溶物质之前，如上文所述制备阳性对照。谨慎地倾析上清液，以免干扰任何颗粒物。然后如下文所述，将倾析的上清液用于HPLC分析。
[0898] HPLC
[0899] 样品的装载和注射
[0900] 使样品箱保持在5°C下，而柱保持在25°C。作为封闭液注射样品两次。每一次封闭前后运行GFC分子量标准（BioRAD#151-1901）以确保HPLC设置的正确功能。
[0901] 以1.0ml/min的流速使用25μl注射体积的0.1M Na2SO4和0.1MNa2HPO4缓冲液，在25°C下用浓硫酸溶液将该缓冲液平衡至pH 6.8。18分钟的运行时间用于样品和标样。
[0903] 在214nm下绘制洗脱曲线。使用Empower2软件包对所有样品使用自动积分法。如下所示为HPLC方法的说明。以30.00的峰宽和50.000的阈值使用传统的（一阶导数）积分算法。将最小面积和最小高度都设为零。抑制积分事件设置在零至7.5分钟的洗脱时间。在7.5分钟的洗脱时间后，使用峰事件强制基线（Force Baseline by Peak）。不调用其他事件。
[0904] 建立了四个峰：（1）在8.670±0.434分钟处的团聚体（聚集体）；（2）在10.100±0.465分钟处的单体；（3）在10.574±0.529分钟的肩（峰），以及（4）在
11.200±0.500的片段。废弃所有另外的峰，即在洗脱12分钟之后的峰。针对所有峰的峰拾取（标定）参数如下：峰匹配设置为最接近的；Y值设置为面积；拟合设置为线性并关闭加权。
11.200±0.500的片段。废弃所有另外的峰，即在洗脱12分钟之后的峰。针对所有峰的峰拾取（标定）参数如下：峰匹配设置为最接近的；Y值设置为面积；拟合设置为线性并关闭加权。
[0905] 纯度及单体保留率参数(Monomer Retention Parameters）
[0906] 将从上文描述的处理中得到的峰面积用于对每一个条件产生纯度和单体保留率参数。纯度定义为单体峰面积除以每一个样品中的总峰（面积）。单体保留率定义为单体峰面积除以阳性对照（未经热激发的）样品中的单体峰面积。
[0907] 结果
[0908] 样品和标准迹线
[0909] 图42为分子量标准（BioRAD，151-1901；浅灰色）和未触及（未改变）的单价Fab（深灰色）的Y-标准化的HPLC重叠迹线。分子量标准的特点是：初始的空白（void）峰（如标记的）、五种标准组分（编号为1至5）和未知蜂（如标记的）。五种标准组分的确认（身份，identity）和大小如下所示：（1）牛甲状腺球蛋白-670kDa；（2）牛球蛋白-158kDa；（3）鸡卵清蛋白-44kDa；（4）马肌红蛋白-17kDa以及（5）维生素B121.35kDa。如可以看出的，Fab峰在第三种标样之前洗脱，表明了大于44kDa的流体力学等效尺寸，如对单价Fab所预期的。因此，恰好在第三种重量标记之前洗脱Fab，赋予其估计的大于44kDa的流体力学重量。该值与单价Fab是一致的。
[0910] 图43至45都显示了相应于每一个条件的第一次注射的7个HPLC迹线的重叠。图43中在13分钟处（标记为b）的大峰是由于赋形剂（产生的），同时在10分钟的小峰（标记为a）是由于Fab（产生的）。黑色的矩形突出显示了在图44中放大并显示的区域。
[0911] 图43是在正文中描述的所有七个条件的全量度HPLC迹线。在10分钟处的小峰（标记为a）是抗体片段（Fab）峰。在13分钟处的大峰（标记b）是由于赋形剂（产生的）。黑色框突出显示了在图44中放大和显示的区域。
[0912] 图44显示了如图43所示的所有七个条件的第一次注射的相同的重叠。然而，在12分钟后终止图44中的迹线。图44突出显示了Fab峰并且表明了一些而不是所有样品在单体峰的尾部包括肩峰。以注释的形式在图45中突出显示了Fab峰本身。
[0913] 图44显示了在正文中描述的所有七个条件的HPLC迹线。迹线显示至12分钟处（抗体片段（Fab）峰出现在10分钟处）。可以看出七个条件之间的峰的大小和肩部的区别。在图45中突出显示了Fab峰本身。
[0914] 图45是上文描述的所有七个条件的带注释的HPLC迹线。放大显示迹线，以突出显示在10分钟处的抗体片段（Fab）峰。在图中注释了七个条件中每一个的确认（身份）。SR是糖类混合液（0.15M蔗糖和0.015M棉子糖），DMG是二甲基甘氨酸，而TMG是三甲基甘氨酸。前缀‘lo’指的是低浓度的赋形剂且为0.1M。前缀‘hi’指的是高浓度的赋形剂且为1.0M。
[0915] 图45指出了所有经热激发的样品，具有1.0M DMG或TMG（加SR混合液）的那些（样品）产生最接近阳性对照（未经热激发的）样品的迹线。在另一端，在仅PBS中经热激发的Fab经受最大的损失，并且也经历肩峰的显著增大。下一个最低的单体高度出现在仅SR中激发的Fab中。SR混合液加0.1M的DMG或TMG提供了中等保护，其比仅SR混合液好，但是比SR混合液加1.0M DMG（较好）或1.0M TMG（最好）差。
[0916] 总之，最大的单体峰高度伴随存在的最小的肩峰以该顺序呈现：
[0917] 未触及（未改变）的>SR+HiTMG>SR+HiDMG>SR+LoTMG≈SR+LoDMG>SR>PBS
[0918] 这种定量的视觉检测反映了下文讨论的定量积分结果。
[0919] 积分的样品迹线
[0920] 上文描述的HPLC处理方法用于对图46中显示的所有七个HPLC迹线积分（仅显示每一个样品的两次注射中的一次的迹线）。箭头突出显示了基线至基线（三角形）以及沿着基线显示在x-轴上的弯曲变化（形变，inflection change）（钻石形，diamond）的峰事件。
[0921] -图46A：条件1：未触及（未改变）的Fab（阳性对照）。
[0922] -图46B：条件2：在PBS中在56°C下130h之后的Fab（阴性对照）。
[0923] -图46C：条件3：在SR混合液中在56°C下130h之后的Fab。
[0924] -图46D：条件4：在SR混合液和低的（0.1M）DMG中在56°C下130h之后的Fab。
[0925] -图46E：条件5：在SR混合液和高的（1.0M）DMG中在56°C下130h之后的Fab。
[0926] -图46F：条件6：在SR混合液和低的（0.1M）TMG中在56°C下130h之后的Fab。
[0927] -图46G：条件7：在SR混合液和高的（1.0M）TMG中在56°C下130h之后的Fab。
[0928] 概述（汇总）
[0929] 图47汇总了上文描述的七个条件中的每一个的纯度（浅灰色）和单体保留率（深灰色）参数。所有样品为167μg/ml。未触及（未改变）的是未经热激发的阳性对照。所有其他样品在56°C下热激发130小时。方括号表示样品的组成：
[0930] -PBS-用PBS稀释的Fab；
[0931] -SR-含有0.15M蔗糖和0.015M棉子糖的Fab；
[0932] -SR+lo.DMG-含有0.15M蔗糖和0.015M棉子糖以及0.1M DMG的Fab；
[0933] -SR+hi.DMG-含有0.15M蔗糖和0.015M棉子糖以及1.0M DMG的Fab；
[0934] -SR+lo.TMG—含有0.15M蔗糖和0.015M棉子糖以及0.1M TMG的Fab；
[0935] -SR+hi.TMG—含有0.15M蔗糖和0.015M棉子糖以及1.0M TMG的Fab。
[0936] 误差条为±1的标准偏差，其来自于在HPLC柱上的重复注射。
[0937] 结论
[0938] 图47定量地反映了图45中的定量顺序结果，并且表明在HC（热激发）之前，将Fab简单稀释至PBS中，在56°C下HC（热激发）持续130h引起纯度损失三分之一以及单体含量损失三分之二。通过与SR混合液（0.15M蔗糖和0.015M棉子糖）一起温育稍微降低了这些损失。通过与SR混合液以及0.1M DMG或TMG一起温育进一步使损失最小化。
[0939] 然而，最恰当的结果是，通过在热激发之前向Fab溶液中加入SR混合液以及1.0M的DMG或TMG可以基本上完全避免纯度和单体两者的损失。
[0940] 实施例18—液体设置（环境，setting）中诊断样品的保持
[0941] 方法
[0942] 用等体积的a）PBS；b）0.7M DMG或c）0.7M DMG/0.1M蔗糖稀释人血液样品；在25°C下储存30分钟后，在eppendorf管（微量离心管）中将5μl的血液样品与250μl的 试剂混合。在室温下温育混合物5分钟。在温育之后，使用
Guava 细胞分析仪分析白细胞组分的活力。
Guava 细胞分析仪分析白细胞组分的活力。
[0943] 结果与结论
[0944] 由Guava 细胞分析仪得到的结果显示，在测试时间段内和在测试浓度下，测试的DMG和DMG/蔗糖赋形剂混合物显示对血液样品中的白细胞活力（生存力）没有不利的影响。因此可以推断，这样的赋形剂将最小限度地影响较低敏感性的诊断样品（例如尿液、唾液）的完整性，并且将提高存在于流体中的病毒或蛋白质的稳定性。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株及其制法和采用该细胞株制备的抗原及疫苗 | 2020-05-13 | 380 |
| 一种细胞膜肿瘤疫苗及制备方法与应用 | 2020-05-13 | 211 |
| 选择性裂解的全细胞疫苗 | 2020-05-11 | 776 |
| 一种放射抗拒性肺癌全细胞疫苗及其制备方法和应用 | 2020-05-12 | 648 |
| 具有全细胞百日咳的联合疫苗 | 2020-05-11 | 418 |
| 一种全悬浮ST细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法 | 2020-05-11 | 613 |
| 紫杉醇及多西紫杉醇的用途 | 2020-05-13 | 257 |
| 马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的全长基因序列 | 2020-05-12 | 288 |
| 基于表达HBsAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗 | 2020-05-12 | 255 |
| 适应全悬浮无血清培养的MDCK细胞系及其在培养流感病毒、生产流感病毒疫苗中的应用 | 2020-05-13 | 402 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈