诊断方法、治疗药物及其用途
阅读：128发布：2021-01-21
专利汇可以提供诊断方法、治疗药物及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供具有式(I)的化合物或其盐，以及其作为 生物 标记物用于评估或监测受试者中肾功能、确定肾功能降低的发展倾向、根据肾功能 水 平对受试者进行分类、诊断或监测慢性肾病的用途。还描述了组合物和制备具有式(I)的化合物的方法。，下面是诊断方法、治疗药物及其用途专利的具体信息内容。
1.一种由下式表示的化合物或其盐：
其中，所述化合物的纯度至少为60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％或99.9％。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物由下式表示或者为其盐：
3.根据权利要求2所述的化合物，其中，所述化合物的光学纯度至少为60％、70％、
80％、90％、95％、99％、99.5％或99.9％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中，所述化合物是同位素标记的。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中，所述化合物是氘化的、用碳13(13C)、氮15(15N)或其组合标记。
6.一种确定受试者中由下式表示的化合物或其盐的水平的方法，
所述方法包括：
(1)从获自所述受试者的生物样品制备分析样品；
(2)使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定所述化合物的水平。
7.一种用于评估受试者中肾功能的方法，其包括：使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从所述受试者获得的生物样品中由下式表示的化合物或其盐的水平：
其中，与参考水平相比，所述生物样品中所述化合物的水平升高指示所述受试者中肾功能的降低。
8.一种用于确定受试者中肾功能降低的发展倾向的方法，其包括：使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从所述受试者获得的生物样品中由下式表示的化合物或其盐的水平：
其中，与参考水平相比，所述生物样品中所述化合物的水平升高指示所述受试者中肾功能降低的发展倾向。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述方法用于确定慢性肾病(CKD)的发展倾向。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述方法用于确定急性肾损伤(AKI)的发展倾向。
11.一种用于根据肾功能水平对受试者进行分类的方法，其包括：使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从所述受试者获得的生物样品中由下式表示的化合物或其盐的水平：
其中，与参考水平相比，所述生物样品中所述化合物的水平用于根据肾功能水平对所述受试者进行分类。
12.一种用于监测受试者中肾功能的方法，其包括：
(1)在第一时间点确定从所述受试者获得的第一生物样品中由下式表示的化合物或其盐的水平：
以及
(2)在第二时间确定从所述受试者获得的第二生物样品中所述化合物或其盐的水平，其中所述第二时间晚于所述第一时间，并且其中使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定所述化合物的水平；
其中，所述第二生物样品中所述化合物的水平相较于所述第一生物样品中的所述水平的变化指示肾功能的变化。
13.一种用于诊断受试者中慢性肾病(CKD)的方法，其包括：使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从所述受试者获得的生物样品中由下式表示的化合物或其盐的水平：
其中，与参考水平相比，所述生物样品中所述化合物的水平升高指示慢性肾病。
14.一种用于监测受试者中慢性肾病(CKD)的进展或消退的方法，其包括：
(1)在第一时间点确定从所述受试者获得的第一生物样品中由下式表示的化合物或其盐的水平：
(2)在第二时间确定从所述受试者获得的第二生物样品中所述化合物或其盐的水平，其中所述第二时间晚于所述第一时间，
其中，所述第二生物样品中所述化合物的水平相较于所述第一生物样品中的所述水平的变化指示所述受试者中疾病的进展或消退，并且其中使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定所述化合物的水平。
15.一种用于诊断受试者中急性肾损伤(AKI)的方法，其包括：使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从所述受试者获得的生物样品中由下式表示的化合物或其盐的水平：
其中，与处于参考水平的所述化合物水平相比，所述生物样品中所述化合物的水平升高指示慢性肾病。
16.一种用于监测受试者中急性肾损伤(AKI)的进展或消退的方法，其包括：
(1)在第一时间点确定从所述受试者获得的第一生物样品中由下式表示的化合物或其盐的水平：
(2)在第二时间确定从所述受试者获得的第二生物样品中所述化合物或其盐的水平，其中所述第二时间晚于所述第一时间，
其中，所述第二生物样品中所述化合物的水平相较于所述第一生物样品中的所述水平的变化指示所述受试者中疾病的进展或消退，并且其中使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定所述化合物的水平。
17.一种评估受试者中肾功能响应于组合物的方法，其包括：使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从用所述组合物处理的受试者获得的生物样品中由下式表示的化合物或其盐的水平：
其中，与未用所述组合物处理的受试者中所述化合物的水平相比，所述生物样品中所述化合物的水平升高指示肾功能降低。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述组合物是造影剂。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述组合物是治疗剂。
20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述组合物是化学治疗剂。
21.根据权利要求17所述的方法，其中，所述组合物是抗生素。
22.根据权利要求6-21中任一项所述的方法，其还包括比较从所述受试者获得的生物样品中所述化合物的水平与参考样品中所述化合物的水平。
23.一种用于治疗患有慢性肾病(CKD)的受试者的方法，其包括：
(1)使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从所述受试者获得的生物样品中由下式表示的化合物或其盐的水平：
(2)如果与参考水平相比，所述受试者具有升高的所述化合物的水平，则向所述受试者施用适于治疗慢性肾病的有效疗法。
24.一种用于治疗患有慢性肾病(CKD)的受试者的方法，其包括向所述受试者施用适于治疗慢性肾病的有效疗法，其中，与参考水平相比，所述受试者具有升高的由下式表示的化合物或其盐的水平：
25.根据权利要求23或24的方法，其中，所述慢性肾病由糖尿病或高血压引起。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述有效疗法包括向所述受试者施用有效量的抗糖尿病药。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述抗糖尿病药选自包括二甲双胍、吡格列酮、罗格列酮、阿卡波糖、四氢脂抑素(tetrahydrolipstatin)、芬特明/托吡酯、安非他酮/纳曲酮、氯卡西林(lorcaserin)、利拉鲁肽和卡格列净(canagliflozin)的组。
28.根据权利要求25所述的方法，其中，所述有效疗法包括所述受试者的生活方式改变。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，饮食改变和/或活动或锻炼增加。
30.根据权利要求25所述的方法，其中，所述有效疗法包括向所述受试者施用有效量的用于降低高血压的治疗剂。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述治疗剂是血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂或血管紧张素II受体阻断剂。
32.根据权利要求23或24的方法，其中，所述有效疗法是透析或肾移植。
33.一种用于治疗患有急性肾损伤的受试者的方法，其包括：
(1)确定从所述受试者获得的生物样品中由下式表示的化合物或其盐的水平：
(2)如果与参考水平相比，所述受试者具有升高的所述化合物水平，则向所述受试者施用适于治疗急性肾损伤的有效疗法。
34.一种用于治疗患有急性肾损伤的受试者的方法，其包括向所述受试者施用适于治疗所述急性肾损伤的有效疗法，其中，与参考水平相比，所述受试者具有升高水平的由下式表示的化合物或其盐：
35.根据权利要求33或34的方法，其中，所述急性肾损伤由化学治疗剂引起。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述有效疗法包括对所述受试者停止施用所述化学治疗剂或减少施用于所述受试者的所述化学治疗剂的剂量。
37.根据权利要求34所述的方法，其中，所述有效疗法是透析或肾移植。
38.根据权利要求6-37中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括将所确定的所述化合物水平用于数学模型中来评估肾功能。
39.根据权利要求6-38中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括分析所述生物样品以确定与肾功能评估相关的一种或多种其它生物标记物的水平。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述其它生物标记物选自由假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-乙酰丙氨酸、N6-氨基苏氨酰腺苷、4-乙酰氨基丁酸酯、赤藓糖醇、肌醇、赤藓酸盐、尿素、阿拉伯糖醇、N2，N2-二甲基鸟苷、N1-甲基腺苷、3-甲基戊二酸肉碱、S-腺苷高半胱氨酸、N-乙酰蛋氨酸、N6-乙酰赖氨酸、犬尿氨酸、阿拉伯糖酸盐、琥珀酰肉碱、核糖、木糖酸盐、N-甲酰基蛋氨酸、O-甲基儿茶酚硫酸盐、2-甲基丁酰基肉碱、苯乙酰谷氨酰胺、N2，N5-二乙酰鸟氨酸、色氨酸、肌酸酐、尿酸盐、3-吲哚硫酸酯和对甲酚硫酸盐组成的组。
41.根据权利要求39所述的方法，其中，所述其它生物标记物选自由假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸、苯乙酰谷氨酰胺、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸、犬尿氨酸、肌醇和肌酸酐组成的组。
42.根据权利要求39所述的方法，其中，所述其它生物标记物选自由假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸、苯乙酰谷氨酰胺和肌酸酐组成的组。
43.根据权利要求39所述的方法，其还包括分析所述生物样品以确定假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸、苯乙酰谷氨酰胺和肌酸酐的水平。
44.根据权利要求6-43中任一项所述的方法，其中，确定肾功能评分并用于评估肾功能。
45.根据权利要求6-44中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括确定选自由BUN、血清肌酸酐、尿白蛋白、β-2微球蛋白、β-TRACE和2-C-吡喃甘露糖基色氨酸组成的组中的肾功能的一种或多种临床措施或其它措施。
46.一种用于计算受试者中估计的肾小球滤过率(eGFR)的方法，其包括以下步骤：
(1)使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从所述受试者获得的生物样品中由下式表示的化合物或其盐的水平：
以及
(2)使用算法计算eGFR，所述算法利用所确定的所述化合物水平。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所计算的eGFR用于评估所述受试者的肾功能。
48.根据权利要求46所述的方法，其中，所计算的eGFR用于确定在所述受试者中肾功能降低的发展倾向。
49.根据权利要求46所述的方法，其中，所计算的eGFR用于根据肾功能水平对所述受试者进行分类。
50.根据权利要求46所述的方法，其中，所计算的eGFR用于监测所述受试者的肾功能。
51.根据权利要求46所述的方法，其中，所计算的eGFR用于诊断所述受试者中的慢性肾病(CKD)或急性肾损伤(AKI)。
52.根据权利要求46所述的方法，其中，所计算的eGFR用于监测CKD或AKI的进展或消退。
53.根据权利要求46-52中任一项所述的方法，其中，利用选自假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-乙酰丙氨酸、N6-氨基苏氨酰腺苷、4-乙酰氨基丁酸酯、赤藓糖醇、肌醇、赤藓酸盐、尿素、阿拉伯糖醇、N2，N2-二甲基鸟苷、N1-甲基腺苷、3-甲基戊二酸肉碱、S-腺苷高半胱氨酸、N-乙酰蛋氨酸、N6-乙酰赖氨酸、犬尿氨酸、阿拉伯糖酸盐、琥珀酰肉碱、核糖、木糖酸盐、N-甲酰基蛋氨酸、O-甲基儿茶酚硫酸盐、2-甲基丁酰基肉碱、苯乙酰谷氨酰胺、N2，N5-二乙酰鸟氨酸、色氨酸、肌酸酐、尿酸盐、3-吲哚硫酸酯和对甲酚硫酸盐的一种或多种其它生物标记物计算所述eGFR。
54.根据权利要求46-53中任一项所述的方法，其中，所述eGFR算法进一步利用血清胱抑素C水平。
55.根据权利要求46-54中任一项所述的方法，其中，所述eGFR算法进一步利用选自由年龄、性别和种族组成的组中的一个或多个人口统计学参数。
56.根据权利要求6-55中任一项所述的方法，其中，所述化合物由下式表示或者为其盐：
57.根据权利要求6-56中任一项所述的方法，其中，通过串联液相色谱-质谱(LC-MS/MS)测定所述化合物的水平。
58.根据权利要求6-57中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是血液、血液血浆、血清、唾液或尿液。
59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述生物样品是血清或血浆血液。
60.根据权利要求6-59中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，所述受试者没有肾功能受损的症状。
62.根据权利要求60所述的方法，其中，所述受试者表现出发展慢性肾病的风险因素。
63.根据权利要求60所述的方法，其中，所述受试者先前已被诊断患有高血压。
64.根据权利要求60所述的方法，其中，所述受试者先前已被诊断患有糖尿病。
65.根据权利要求60所述的方法，其中，所述受试者具有慢性肾病的家族史。
66.根据权利要求60所述的方法，其中，所述受试者具有肾功能受损的症状。
67.根据权利要求60所述的方法，其中，所述受试者是使用常规方法难以进行肾功能评估的受试者。
68.根据权利要求60所述的方法，其中，所述受试者选自由以下组成的组：肥胖者、非常瘦的人、素食者、慢性病人和老年人。
69.根据权利要求60所述的方法，其中，所述受试者是肾供体的候选者。
70.根据权利要求60所述的方法，其中，所述受试者已经用或可能正在考虑用可能对肾脏具有毒性作用的药剂进行治疗。
71.根据权利要求70所述的方法，其中，所述药剂是造影剂。
72.根据权利要求70所述的方法，其中，所述药剂是治疗剂。
73.根据权利要求70所述的方法，其中，所述药剂是化学治疗剂。
74.根据权利要求70所述的方法，其中，所述药剂是抗生素。
75.根据权利要求60所述的方法，其中，所述受试者没有已知的肾功能受损的危险因素。
76.根据权利要求6-75中任一项所述的方法，其中，在用允许直接测量肾小球滤过率的药剂治疗之前从所述受试者获得所述样品。
77.一种试剂盒，其包含由下式表示的化合物或其盐：
以及用于测量生物样品中所述化合物水平的说明书。
78.一种试剂盒，其包含由下式表示的化合物或其盐：
以及说明书，所述说明书用于基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平评估或监测所述受试者中的肾功能。
79.一种试剂盒，其包含由下式表示的化合物或其盐：
以及说明书，所述说明书用于基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平确定所述受试者中肾功能降低的发展倾向。
80.一种试剂盒，其包含由下式表示的化合物或其盐：
以及说明书，所述说明书用于基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平根据肾功能水平对所述受试者进行分类。
81.一种试剂盒，其包含由下式表示的化合物或其盐：
以及说明书，所述说明书用于基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平诊断或监测所述受试者中的慢性肾病(CKD)。
82.一种试剂盒，其包含由下式表示的化合物或其盐：
以及说明书，所述说明书用于基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平诊断或监测所述受试者中的急性肾损伤(AKI)。
83.一种试剂盒，其包含由下式表示的化合物或其盐：
以及说明书，所述说明书用于基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平计算所述受试者中估计的肾小球滤过率(eGFR)。
84.根据权利要求77-83中任一项所述的试剂盒，其中，所述化合物的纯度至少为60％、
70％、80％、90％、95％、99％、99.5％或99.9％。
85.根据权利要求77-84中任一项所述的试剂盒，其中，所述化合物由下式表示或者为其盐：
86.根据权利要求85所述的试剂盒，其中，所述化合物的光学纯度至少为60％、70％、
80％、90％、95％、99％、99.5％或99.9％。
87.根据权利要求77-86中任一项所述的试剂盒，其中，所述化合物是同位素标记的。
88.根据权利要求77-86中任一项所述的试剂盒，其中，所述化合物是氘化的、用碳13(13C)、氮15(15N)或其组合标记。
89.根据权利要求88所述的试剂盒，其中，所述化合物是N，N，N-三甲基-13C3-L-丙氨酰-L-脯氨酸。
90.根据权利要求77-89中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括与肾功能评估相关的一种或多种其它生物标记物。
91.根据权利要求90所述的试剂盒，其中，所述其它生物标记物选自由假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-乙酰丙氨酸、N6-氨基苏氨酰腺苷、
4-乙酰氨基丁酸酯、赤藓糖醇、肌醇、赤藓酸盐、尿素、阿拉伯糖醇、N2，N2-二甲基鸟苷、N1-甲基腺苷、3-甲基戊二酸肉碱、S-腺苷高半胱氨酸、N-乙酰蛋氨酸、N6-乙酰赖氨酸、犬尿氨酸、阿拉伯糖酸盐、琥珀酰肉碱、核糖、木糖酸盐、N-甲酰基蛋氨酸、O-甲基儿茶酚硫酸盐、2-甲基丁酰基肉碱、苯乙酰谷氨酰胺、N2，N5-二乙酰鸟氨酸、色氨酸、肌酸酐、尿酸盐、3-吲哚硫酸酯和对甲酚硫酸盐组成的组。
92.根据权利要求91所述的试剂盒，其中，所述其它生物标记物选自由假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸、苯乙酰谷氨酰胺、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸、犬尿氨酸、肌醇和肌酸酐组成的组。
93.根据权利要求91所述的试剂盒，其中，所述其它生物标记物选自由假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸、苯乙酰谷氨酰胺和肌酸酐组成的组。
94.根据权利要求91所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸、苯乙酰谷氨酰胺和肌酸酐。
95.一种用于制备由下式表示的化合物或其盐的方法：
其包括使由下式表示的化合物或其盐与甲基化试剂CH3X或(CH3)2SO4反应：
其中，X是Cl、Br、I或OSO2CF3。
96.根据权利要求95所述的方法，其中，所述化合物由下式表示或者为其盐：
并且所述方法包括使L-丙氨酰-L-脯氨酸与CH3X或(CH3)2SO4反应。
97.一种用于制备由下式表示的化合物或其盐的方法：
其包括使由下式表示的化合物或其盐与甲基化试剂CH3X或(CH3)2SO4反应：
其中，X是Cl、Br、I或OSO2CF3，并且(a)R1是H且R2是CH3；或(b)R1和R2均为CH3。
98.根据权利要求97所述的方法，其中，所述化合物由下式表示或者为其盐：
并且所述方法包括使由下式表示的化合物或其盐与甲基化试剂CH3X或(CH3)2SO4反应：
99.根据权利要求95-98中任一项所述的方法，其中，所述甲基化试剂是碘甲烷。
100.根据权利要求95-99中任一项所述的方法，其中，所述反应在氧化银存在下进行。
101.根据权利要求95-99中任一项所述的方法，其中，所述反应在碳酸钾存在下进行。
102.根据权利要求95-101中任一项所述的方法，其中，所述反应在甲醇和水的溶剂混合物中进行。
103.一种抗体或抗体片段，其结合由下式表示的化合物或其盐：
104.根据权利要求103所述的抗体或抗体片段，其中，所述化合物由下式表示或者为其盐：
105.一种多肽，其包括根据权利要求103或104所述的抗体的VH和VL序列。
106.根据权利要求105所述的多肽，其中，所述多肽是融合蛋白。
107.一种细胞，其产生根据权利要求103或104所述的抗体或根据权利要求105或106所述的多肽。
108.一种生产根据权利要求103或104所述的抗体或根据权利要求105或106所述的多肽的方法，其包括：
(1)培养根据权利要求107所述的细胞；以及
(2)从所述培养细胞中分离所述抗体或其抗体结合片段或多肽。
109.根据权利要求108所述的方法，其中，所述细胞是真核细胞。
110.一种试剂盒，其包括根据权利要求103或104所述的抗体或其抗体结合片段或根据权利要求105或106所述的多肽，以及说明书，所述说明书用于确定从所述受试者获得的生物样品中所述化合物的水平。
111.一种试剂盒，其包括根据权利要求103或104所述的抗体或根据权利要求105或106所述的多肽，以及说明书，所述说明书用于基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平评估或监测所述受试者中的肾功能。
112.一种试剂盒，其包括根据权利要求103或104所述的抗体或其抗体结合片段或根据权利要求105或106所述的多肽，以及说明书，所述说明书用于基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平确定所述受试者中肾功能降低的发展倾向。
113.一种试剂盒，其包括根据权利要求103或104所述的抗体或其抗体结合片段或根据权利要求105或106所述的多肽，以及说明书，所述说明书用于基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平根据肾功能水平对所述受试者进行分类。
114.一种试剂盒，其包括根据权利要求103或104所述的抗体或其抗体结合片段或根据权利要求105或106所述的多肽，以及说明书，所述说明书用于基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平诊断或监测所述受试者中的慢性肾病(CKD)。
诊断方法、治疗药物及其用途
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2016年7月28日提交的美国临时申请号62/367,839的在35 U.S.C.§119(e)下的申请日的权益，其全部内容(包括所有附图、公式、说明书和权利要求)通过引用并入本文。
背景技术
[0003] 对于评估肾脏排泄功能(肾小球滤过率，GFR)的灵敏、准确和方便的测试存在显著未满足的临床需求。肾功能的最准确测量是测量的肾小球滤过率(mGFR)，其需要使用理想的过滤标记物(例如菊粉、碘酞酸盐、碘海醇)。由于其复杂性，该测量是昂贵的，难以在常规临床实践中进行，并且通常仅用于研究性学习或用于潜在的肾脏供体。因此，基于诸如血清肌酸酐的标记物的肾功能的替代测量被用于等式中以得出估计的GFR(eGFR)。例如，目前用于获得eGFR的MDRDcr、CKD-EPIcr和CKD-EPIcrcys等式结合人口统计学信息(例如年龄、性别/性、种族)使用血清肌酸酐。这种方法的优点是易于在常规临床实践中用于评估肾功能。然而，这些确定GFR的方法在真正评估肾功能中具有局限性；在一些患者中，某些等式有时会低估GFR，而在其它患者中有时会高估GFR，尤其是当它处于“正常”范围时。这些限制中的一些可能是由于血清肌酸酐水平的变化可能受到肌肉质量、饮食和一些药物(包括抗生素)的影响，这导致个体之间和随时间的水平不同。这种不准确的临床后果导致患者的误诊。在某些情况下，患有慢性肾病(CKD)的个体未通过现有方法诊断，因此他们未接受适当的治疗(假阴性)。在其它情况下，个体可能被诊断为患有CKD，而实际上他们没有CKD(假阳性)；然后将对这些个体治疗他们没有的疾病。此外，由于毒性剂(例如某些抗生素、化学治疗剂、毒物、毒素)而导致的肾功能降低的早期检测对于检测急性肾损伤(AKI)和采取措施以防止进一步的肾损伤是必要的。最近胱抑素C血清水平已被用于评估肾功能，但这种肾功能测量的效用受限于个体中胱抑素C血清水平的变化。因此，需要比目前可用的肾功能评估测试更方便和更准确的测试，以减少假阴性和假阳性诊断的数量。
[0004] 此外，目前对肾功能(例如血清肌酸酐，胱抑素C eGFR计算，BUN，尿白蛋白)的评估对于检测急性肾损伤(AKI)、早期肾病或监测其进展不够灵敏和/或准确，尤其是在个体无症状时在AKI和CKD的早期阶段。早期检测肾功能下降可以防止在用现有方法检测到问题之前可能发生的肾功能显著恶化。在使用当前方法检测AKI和CKD之前，具有评估和监测个体肾功能的灵敏读数的新型测试将允许更早地检测AKI和/或CKD。因此，治疗和管理AKI和CKD以及相关并发症的总成本将降低。通过早期检测CKD，可以更有效地治疗甚至可以预防并发症，包括心血管疾病、贫血、营养不良和骨病。早期检测CKD可以改变生活方式，例如健康饮食、戒烟、减轻体重和治疗高血压，这可以预防或减少进一步的肾脏损伤，从而减少透析和肾移植的需要，透析和肾移植是与肾功能减退和CKD相关的常见结果。
[0005] 因此，在基于血液或尿液的测试中存在未满足的需求，该测试在无症状患者中，在患有CKD或AKI危险因素(例如年龄超过60岁，高血压，糖尿病，心血管疾病，CKD家族史)的患者中，以及响应于组合物或治疗干预的患者中，通过测量一种或多种生物标记物代谢物的水平，可以评估和/或监测患者的肾功能。例如，该测试可以定量测量一组生物标记物代谢物的水平，其中该组中每种生物标记物的水平相对于标准参考水平的增加或减少指示肾功能。此类生物标记物测试组可以替代或补充当前的肾功能测试结果，并使医生能够最初更好地评估肾功能和/或随时间监测患者的肾功能。这种测试也可用于评估治疗干预对减缓肾功能衰退的影响。发明内容
[0006] 本发明提供了新型化合物和组合物及其在评估和监测肾功能中的用途以及肾病的诊断方法。
[0007] 在一个实施方式中，本发明提供了由式(I)表示的化合物或其盐：
[0008]
[0009] 其中化合物的纯度至少为60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％或99.9％。
[0010] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于确定受试者中具有式(I)的化合物或其盐的水平的方法，包括：(1)从获自受试者的生物样品制备分析样品；(2)使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定所述化合物的水平。
[0011] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于评估受试者中肾功能的方法，包括：使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从受试者获得的生物样品中由式(I)表示的化合物或其盐的水平，其中与参考水平相比，生物样品中所述化合物的水平升高指示受试者中肾功能的降低。
[0012] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于确定受试者中肾功能降低的发展倾向的方法，包括：使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从受试者获得的生物样品中由式(I)表示的化合物或其盐的水平，其中与参考水平相比，生物样品中所述化合物的水平升高指示受试者中肾功能降低的发展倾向。
[0013] 在又一个实施方式中，本发明提供了一种用于根据肾功能水平(或阶段)对受试者进行分类(或分阶段)的方法，包括：使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从受试者获得的生物样品中由式(I)表示的化合物或其盐的水平，其中与参考水平相比，生物样品中所述化合物的水平用于根据肾功能水平对受试者进行分类。
[0014] 在又一个实施方式中，本发明提供了一种用于监测受试者中肾功能的方法，包括：
[0015] (1)在第一时间点确定从受试者获得的第一生物样品中由式(I)表示的化合物或其盐的水平；以及
[0016] (2)在第二时间确定从受试者获得的第二生物样品中所述化合物或其盐的水平，其中第二时间晚于第一时间，并且其中使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定化合物的水平；
[0017] 其中第二生物样品中所述化合物水平相较于第一生物样品中所述化合物水平的变化指示肾功能的变化。
[0018] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于诊断受试者中慢性肾病(CKD)的方法，包括：使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从受试者获得的生物样品中由式(I)表示的化合物或其盐的水平，其中与参考水平相比，生物样品中所述化合物的水平升高指示慢性肾病。
[0019] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于监测受试者中慢性肾病(CKD)的进展或消退的方法，包括：
[0020] (1)在第一时间点确定从受试者获得的第一生物样品中由式(I)表示的化合物或其盐的水平；
[0021] (2)在第二时间确定从受试者获得的第二生物样品中所述化合物或其盐的水平，其中第二时间晚于第一时间，
[0022] 其中第二生物样品中所述化合物水平相较于第一生物样品中所述化合物水平的变化指示受试者中疾病的进展或消退，并且其中使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定所述化合物的水平。
[0023] 在又一个实施方式中，本发明提供了一种用于诊断受试者中急性肾损伤(AKI)的方法，包括：使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从受试者获得的生物样品中由式(I)表示的化合物或其盐的水平，其中与参考水平相比，生物样品中所述化合物的水平升高指示慢性肾病。
[0024] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于监测受试者中急性肾损伤(AKI)的进展或消退的方法，包括：
[0025] (1)在第一时间点确定从受试者获得的第一生物样品中由式(I)表示的化合物或其盐的水平；
[0026] (2)在第二时间确定从受试者获得的第二生物样品中所述化合物或其盐的水平，其中第二时间晚于第一时间，
[0027] 其中第二生物样品中所述化合物水平相较于第一生物样品中所述化合物水平的变化指示受试者中疾病的进展或消退，并且其中使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定所述化合物的水平。
[0028] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种评估受试者中肾功能响应于组合物的方法，包括：使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从用组合物处理的受试者获得的生物样品中由式(I)表示的化合物或其盐的水平，其中与未用所述组合物处理的受试者中所述化合物的水平相比，所述生物样品中所述化合物的水平升高指示肾功能降低(并且可以指示AKI)。
[0029] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于治疗患有慢性肾病(CKD)的受试者的方法，包括：
[0030] (1)使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从受试者获得的生物样品中由式(I)表示的化合物或其盐的水平；
[0031] (2)如果与参考水平相比，受试者具有升高的所述化合物的水平，则向受试者施用适于治疗慢性肾病的有效疗法。
[0032] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于治疗患有慢性肾病(CKD)的受试者的方法，包括向受试者施用适于治疗慢性肾病的有效疗法，其中与参考水平相比，受试者具有升高的由式(I)表示的化合物或其盐的水平。
[0033] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于治疗患有急性肾损伤(AKI)的受试者的方法，包括向受试者施用适于治疗AKI的有效疗法，其中与参考水平相比，受试者具有升高的由式(I)表示的化合物或其盐的水平。
[0034] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于治疗患有AKI的受试者的方法，包括：
[0035] (1)使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从受试者获得的生物样品中由式(I)表示的化合物或其盐的水平；
[0036] (2)如果与参考水平相比，受试者具有升高的所述化合物的水平，则向受试者施用适于治疗AKI的有效疗法。
[0037] 在一些情况下，AKI可能是由于治疗(例如化学疗法、用治疗剂治疗)造成。在这种情况下，治疗干预将是停止化学疗法或药物治疗或使用代用药品或替代药物进行治疗。
[0038] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于治疗患有急性肾损伤(AKI)的受试者的方法，包括向受试者施用适于治疗AKI的有效疗法，其中与参考水平相比，受试者具有升高的由式(I)表示的化合物或其盐的水平。
[0039] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于计算受试者中估计的肾小球滤过率(eGFR)的方法，包括以下步骤：
[0040] 1)使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合确定从受试者获得的生物样品中由式(I)表示的化合物或其盐的水平；以及
[0043] 在另一个实施方式中，本发明的试剂盒包含具有式(I)的化合物或其盐，以及说明书，所述说明书用于测量生物样品中具有式(I)的化合物的水平。
[0044] 在另一个实施方式中，试剂盒包括内标，其包含标记的具有式(I)的化合物或其盐，以及说明数，所述说明书用于测量生物样品中具有式(I)的化合物或其盐的水平。
[0045] 在又一个实施方式中，试剂盒包括具有式(I)化合物或其盐，标记的具有式(I)的化合物或其盐，以及说明书，所述说明书用于测量生物样品中具有式(I)的化合物的水平。
[0046] 在一个实施方式中，本发明的试剂盒包含具有式(I)的化合物或其盐，以及说明书，所述说明书基于在从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物的水平评估或监测受试者中肾功能。
[0047] 在另一个实施方式中，本发明的试剂盒包含具有式(I)的化合物或其盐，以及说明书，所述说明书基于在从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物的水平确定受试者中肾功能降低的发展倾向。
[0048] 在另一个实施方式中，本发明的试剂盒包含具有式(I)的化合物或其盐，以及说明书，所述说明书基于在从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物的水平根据肾功能水平对受试者进行分类。
[0049] 在另一个实施方式中，本发明的试剂盒包含具有式(I)的化合物或其盐，以及说明书，所述说明书基于在从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物的水平诊断或监测受试者中慢性肾病(CKD)。
[0050] 在另一个实施方式中，本发明的试剂盒包含具有式(I)的化合物或其盐，以及说明书，所述说明书基于在从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物的水平诊断或监测受试者中急性肾损伤(AKI)。
[0051] 在另一个实施方式中，本发明的试剂盒包含具有式(I)的化合物或其盐，以及说明书，所述说明书基于在从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物的水平计算受试者中估计的肾小球滤过率(eGFR)。
附图说明
[0053] 图2显示了扩增的血浆样品中化合物A的产物离子光谱(MS2)。
[0054] 图3显示了在Q-Exactive质谱仪上收集的血浆样品中化合物A的产物离子光谱(MS2)。
[0055] 图4显示了化合物A的m/z 142的MS3光谱。
[0056] 图5显示了化合物A的m/z 170的MS3光谱。
[0057] 图6显示了化合物A的m/z 114.09的MS4光谱。
[0058] 图7显示了氘交换的化合物A的全扫描MS谱。
[0059] 图8显示了氘交换的化合物A的MS2光谱。
[0060] 图9显示了氘交换的化合物A的m/z 143的MS3光谱。
[0061] 图10显示了血浆样品(上图)、合成TMAP(中图)及其共注射(下图)中化合物A的LC-MS/MS色谱图。
[0062] 图11显示了血浆样品(左图)和合成TMAP(右图)中化合物A的MS2光谱。
[0063] 图12显示了血浆样品(左图)和合成TMAP(右图)中化合物A的子离子m/z 142的MS3光谱。
[0064] 图13显示了血浆样品(左图)和合成TMAP(右图)中化合物A的子离子m/z 170的MS3光谱。
[0065] 图14显示了血浆样品(上图)和合成TMAP(下图)中化合物A的子离子m/z 114.09的4
MS光谱。
MS光谱。
[0066] 图15显示了血浆样品(左图)和合成TMAP(右图)中化合物A的氘交换的全扫描MS光谱。
[0067] 图16显示了血浆样品(左图)和合成TMAP(右图)中化合物A的氘交换的MS2光谱[0068] 图17显示了化合物A(左)和合成TMAP(右)的m/z 143的氘交换的MS3光谱。
[0069] 图18A和18B显示了未标记的TMAP(图18A)和13C标记的TMAP(图18B)的13C-NMR谱。
[0070] 图19A和19B显示了未标记的TMAP(图19A)和13C标记的TMAP(图19B)的质谱。
具体实施方式
[0071] 定义
[0072] 除非另有说明，否则本文使用的下列术语定义如下：
[0073] 本发明化合物可以盐的形式存在。任何合适的有机或无机盐都包括在本发明中。在某些实施方式中，本发明化合物的盐是指无毒的“药学上可接受的盐”。本文使用的术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，那些化合物、材料、组合物和/或剂型适用于与人类和动物组织接触，而没有过多的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，并且与合理的利益/风险比相称。
[0074] 如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中通过制备其酸或碱盐来修饰母体化合物。药学上可接受的盐形式包括药学上可接受的酸性/阴离子或碱性/阳离子盐。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱或有机盐；等等。
[0075] 例如，这些盐包括乙酸盐、抗坏血酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、丙二酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、乙烷二磺酸盐、乙醇盐、乙磺酸盐、富马酸盐、甘氨酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酸盐、乙二醇苯甲酸盐、己基异烟肼、水杨酸胺、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基马来酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲烷磺酸盐、甲磺酸盐、甲基溴盐、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、苯乙酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、亚乙酸盐、琥珀酸盐、磺胺、硫酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙碘化物、铵盐、苄星、氯普鲁卡因、胆碱(colline)、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺和普鲁卡因盐。其它药学上可接受的盐可以由金属如铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌等的阳离子形成。(还参见Pharmaceutical salts，Birge,S.M.等人，J.Pharm.Sci.，(1977)，66，1-19)。
[0076] 本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，这些盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与足量的适当碱或酸在水中或在有机稀释剂如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈或其混合物中反应来制备。
[0077] 例如，用于纯化或分离本发明化合物的除上述酸之外的其它酸的盐(例如三氟乙酸盐)也包括在本发明的一部分中。
[0078] 本发明化合物可以通过异构体特异性合成制备成单独的异构体，或者从异构体混合物中拆分。常规拆分技术包括使用光学活性酸形成异构体对的每种异构体的游离碱的盐(随后分级结晶并再生游离碱)，使用光学活性胺形成异构对的每种异构体的酸形式的盐(随后分级结晶并再生游离酸)，使用光学纯的酸、胺或醇形成异构体对的每种异构体的酯或酰胺(随后色谱分离和除去手性辅助剂)，或使用各种熟知的色谱方法拆分原料或最终产物的异构体混合物。
[0079] 当通过结构命名或描绘所公开化合物的立体化学时，相对于其它立体异构体，所命名或描绘的立体异构体为至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％重量的纯度。当通过结构命名或描绘单一对映体时，所描绘或命名的对映体为至少60％、70％、80％、
90％、95％、99％或99.9％重量的光学纯度。光学纯度重量百分比是对映体重量与对映体重量加上其光学异构体重量的比值。
90％、95％、99％或99.9％重量的光学纯度。光学纯度重量百分比是对映体重量与对映体重量加上其光学异构体重量的比值。
[0080] 当公开的化合物通过结构命名或描绘而没有表明立体化学，并且该化合物具有至少一个手性中心时，应理解该名称或结构包括该化合物的一种对映体(不含相应的光学异构体)，该化合物的外消旋混合物，以及相对于其相应的光学异构体富含一种对映体的混合物。
[0081] 当公开的化合物通过结构命名或描绘而没有表明立体化学且具有至少两个手性中心时，应理解名称或结构包括不含其它非对映异构体的非对映异构体，不含其它非对映异构体对的一对非对映异构体，非对映异构体的混合物，非对映异构体对的混合物，其中一种非对映异构体相对于其它非对映异构体富集的非对映异构体的混合物，以及其中一种非对映异构体对相对于其它非对映异构体对富集的非对映异构体对的混合物。
[0082] 当具有一个或多个立体中心的化合物被描绘为对于至少一个立体中心具有特定的立体化学时，本发明还包括在相应的立体中心具有相反立体化学的化合物和在相应的立体中心不具有特定立体化学的化合物。
[0083] “治疗”病症或疾病是指治愈以及改善病症或疾病的至少一种症状。
[0085] 如本文所用，“有效量”是指在受试者中引发所需生物反应的活性化合物试剂的量。这种反应包括减轻所治疗的疾病或病症的症状。在这种治疗方法中，本发明化合物的有效量为约0.01mg/kg/天至约1000mg/kg/天或约0.1mg/kg/天至约100mg/kg/天。
[0087] 如本文所用，“2型糖尿病”是指两种主要类型的糖尿病中的一种，其中胰腺的β细胞产生胰岛素的类型，至少在疾病的早期阶段，而身体不能有效使用它，因为身体的细胞抵抗胰岛素的作用。在疾病的后期阶段，β细胞可能会停止产生胰岛素。2型糖尿病也称为胰岛素抵抗性糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病和成人型糖尿病。
[0088] 如本文所用，术语“生物标记物”是指与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或受试者组的生物样品相比，在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或受试者组的生物样品中差异存在(即增加或减少)的化合物，优选代谢物。生物标记物可以任何水平差异存在，但通常以增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少
130％、至少140％、至少150％或更多的水平存在；或者通常以减少至少5％、至少10％、至少
15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或
100％(即不存在)的水平存在。生物标记物优选以统计学显著性的水平差异存在(例如使用Welch's T-检验或Wilcoxon's秩和检验测定，p值小于0.05和/或q值小于0.10)。替代地，生物标记物显示出与肾功能的相关性。可能的相关范围在负(-)1和正(+)1之间。负(-)1的结果意味着完美的负相关，而正(+)1意味着完美的正相关，0意味着完全没有相关性。“基本正相关”是指与疾病或与临床测量(例如mGFR)具有+0.25至+1.0的相关性的生物标记物，而“基本性负相关”是指与给定疾病或临床测量具有-0.25至-1.0的相关性。“显著正相关”是指与给定病症或临床测量(例如mGFR)具有+0.5至+1.0的相关性的生物标记物，而“显著负相关”是指与给定病症或临床测量具有-0.5至-1.0的疾病相关性。
130％、至少140％、至少150％或更多的水平存在；或者通常以减少至少5％、至少10％、至少
15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或
100％(即不存在)的水平存在。生物标记物优选以统计学显著性的水平差异存在(例如使用Welch's T-检验或Wilcoxon's秩和检验测定，p值小于0.05和/或q值小于0.10)。替代地，生物标记物显示出与肾功能的相关性。可能的相关范围在负(-)1和正(+)1之间。负(-)1的结果意味着完美的负相关，而正(+)1意味着完美的正相关，0意味着完全没有相关性。“基本正相关”是指与疾病或与临床测量(例如mGFR)具有+0.25至+1.0的相关性的生物标记物，而“基本性负相关”是指与给定疾病或临床测量具有-0.25至-1.0的相关性。“显著正相关”是指与给定病症或临床测量(例如mGFR)具有+0.5至+1.0的相关性的生物标记物，而“显著负相关”是指与给定病症或临床测量具有-0.5至-1.0的疾病相关性。
[0089] 本发明化合物或一种或多种其它生物标记物的“水平”是指样品中测量的生物标记物的绝对或相对量或浓度。
[0090] “样品”或“生物样品”是指从受试者分离的生物材料。生物样品可含有适合于检测所需生物标记物的任何生物材料，并且可包含来自受试者的细胞和/或非细胞材料。样品可以从任何合适的生物组织或流体中分离，例如肾组织、血液、血液血浆(血浆)、血液血清(血清)、尿液、唾液或脑脊髓液(CSF)。优选地，生物样品是血液、血液血浆、血清、唾液或尿液。在另一个优选的实施方式中，生物样品是血液血清或血液血浆。
[0091] “参考水平”是指指示特定疾病状态、表型或缺乏它以及疾病状态、表型或缺乏它的组合的本发明化合物或其它生物标记物的水平。“参考水平”可以是本发明化合物或其它生物标记物的绝对或相对量或浓度，本发明化合物或其它生物标记物的存在或不存在，本发明化合物或其它生物标记物的范围量或浓度，本发明化合物或其它生物标记物的最小和/或最大量或浓度，本发明化合物或其它生物标记物的平均量或浓度，和/或本发明化合物或其它生物标记物的中值量或浓度；且此外，本发明化合物和其它生物标记物的组合的“参考水平”也可以是两种或更多种生物标记物相对于彼此的绝对或相对量或浓度的比率。可以通过测量一种或多种适当受试者中本发明化合物或所需生物标记物的水平来确定本发明化合物或其它生物标记物对特定疾病状态、表型或缺乏它的适当参考水平，并且这样的参考水平可以适合于特定的受试者群体(例如参考水平可以是年龄匹配的，使得可以在来自某个年龄的受试者的样品中的生物标记物水平与在某个年龄组中的其特定疾病状态、表型或缺陷的参考水平之间进行比较)。“阳性”参考水平是指指示特定疾病状态或表型的水平。“阴性”参考水平是指指示缺乏特定疾病状态或表型的水平。例如，“CKD阳性参考水平”是指本发明化合物或其它生物标记物的水平，其指示受试者中CKD的阳性诊断，并且“CKD阴性参考水平”意指水平本发明化合物或其它生物标记物，其指示受试者中CKD的阴性诊断(即正常肾功能，不存在CKD)。同样地，“肾功能参考水平”可以指示受试者中存在肾功能的程度。例如，“正常肾功能参考水平”是指本发明化合物或其它生物标记物的水平，其指示受试者中的正常肾功能，“适度降低的肾功能参考水平”是指本发明化合物或其它生物标记物的水平，其指示肾功能适度降低，“严重降低的肾功能参考水平”是指本发明化合物或其它生物标记物的水平，其指示受试者中的肾功能严重降低。
[0092] 如本文所用，“参考样品”是指含有生物标记物参考水平的样品。例如，参考样品可以从没有特定疾病、疾病状态或表型的受试者获得，例如CKD或急性肾损伤。
[0093] “非生物标记化合物”是指与来自具有第二表型(例如没有第一疾病)的受试者或受试者组的生物样品相比，在来自具有第一表型(例如具有第一疾病)的受试者或受试者组的生物样品中不差异存在的化合物。然而，与第一表型(例如具有第一疾病)或第二表型(例如没有第一疾病)相比，此类非生物标记物化合物可以是来自具有第三表型(例如具有第二疾病)的受试者或受试者组的生物样品中的生物标记物。
[0094] 如本文所用，术语“代谢物”或“小分子”是指存在于细胞中的有机和无机分子。该术语不包括大高分子，例如大蛋白质(例如分子量超过2000，3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000的蛋白质)、大核酸(例如分子量超过2000、3000、4000、5000、6000、7000、
8000、9000或10000的核酸)或大多糖(例如分子量超过2000、3000、4000、5000、6000、7000、
8000、9000或10000的多糖)。细胞的小分子通常被发现在细胞质或在其它细胞器如线粒体的溶液中游离，其中它们形成一个中间体库，可以进一步代谢或用于产生大分子，称为高分子。术语“小分子”包括化学反应中的信号分子和中间体，其将从食物获得的能量转化为可用的形式。小分子的实例包括糖、脂肪酸、氨基酸、核苷酸、在细胞过程中形成的中间体、以及在细胞内发现的其它小分子。
8000、9000或10000的核酸)或大多糖(例如分子量超过2000、3000、4000、5000、6000、7000、
8000、9000或10000的多糖)。细胞的小分子通常被发现在细胞质或在其它细胞器如线粒体的溶液中游离，其中它们形成一个中间体库，可以进一步代谢或用于产生大分子，称为高分子。术语“小分子”包括化学反应中的信号分子和中间体，其将从食物获得的能量转化为可用的形式。小分子的实例包括糖、脂肪酸、氨基酸、核苷酸、在细胞过程中形成的中间体、以及在细胞内发现的其它小分子。
[0095] “肾小球滤过率”或“GFR”是每单位时间从肾小球毛细血管过滤到鲍曼氏囊中的液体体积。GFR是肾功能的度量，其中GFR等于或高于某一阈值表明正常肾功能，而GFR低于阈值表明肾功能损伤或受损。通常，高GFR值表明更好的肾功能，而低GFR表明肾功能受损(例如慢性肾病、急性肾损伤)。
[0096] “测量的肾小球滤过率”或“mGFR”是指使用过滤标记物如菊粉、碘酞酸盐或碘海醇测定的实际肾小球滤过率。mGFR在临床环境中进行，是肾功能的最准确测量。
[0097] “估计的肾小球滤过率”或“eGFR”意指实际肾小球滤过率的计算估计值。计算的值可以基于一种或多种生物标记物的水平，并且可以包括其它变量，例如人口统计学信息(例如年龄或性别)。目前计算eGFR的一种方法是基于血清肌酸酐浓度。用于计算eGFR的其它现有方法使用单独或与血清肌酸酐组合的胱抑素C的量。通常，低eGFR值与肾功能降低有关。
[0098] “SrCr eGFR”或“eGFRscr、eGFRcr”是指基于血清肌酸酐水平的eGFR估计。
[0099] “CKD-EPI”或“慢性肾病流行病学协作”得出两个用于计算eGFR的等式。一个等式是：CKD-EPIcr GFR＝141×min(SCr/κ，l)α×max(SCr/κ，l)-1.209×0.993年龄×1.018[如果是女性]×1.159[如果是黑种人]，其中SCr是女性血清肌酸酐(mg/dL)，κ对女性为0.7、男性为0.9，α对于女性为-0.329、男性为-0.411，min表示SCr/κ的最小值或1，max表示SCr/κ的最大值或1。第二等式(CKD-EPIcrcys eGFR)除SCr量和人口统计学变量外还包括胱抑素C的量。
[0100] “MDRD”或“改变肾脏疾病中的饮食eGFR”是计算eGFR的另一个等式。等式为：MDRDcr eGFR＝186×(SCr)-1.154×(年龄)-0.203×(0.742如果是女性)×(1.212如果是黑种人)，其中SCr是血清肌酸酐(mg/dL)。目前，MDRDcr eGFR通常被认为是计算eGFR的标准护理方法。
[0101] “尿白蛋白”是测量尿液中白蛋白量的测试，也用于检测肾脏疾病。
[0102] “血清肌酸酐”或“SCr”是指血清中肌酸酐的测量值，通常用于估计GFR。
[0103] “血尿素氮”或“BUN”是指以尿素形式测量血液中的氮量。BUN是用于测量肾功能的测试。
[0104] “慢性肾病”或“CKD”包括损害肾脏的条件，其导致肾脏从体内排出废物的能力降低，这导致体内高水平的废物，并导致疾病风险增加和并发症的发生，例如高血压、贫血、营养不良和神经损伤。肾功能异常至少三个月的患者可能被诊断为CKD。CKD导致的肾脏损害是永久性的。
[0105] “急性肾损伤”或“AKI”是指肾功能迅速丧失的病症。AKI引起的肾脏损害可能是可逆的。
[0106] “慢性肾病阶段”或“CKD阶段”是指使用测量或估计的肾小球滤过率(mGFR、eGFR)目前评估的肾损伤程度。临床上，5个阶段的CKD通常被认为肾功能在第1阶段被视为正常(GFR>90)，在第2阶段最少地降低(GFR 60-89)，在3A和3B阶段中度降低(GFR 30-59)，在第4阶段严重降低(GFR 15-29)，以及在第5阶段非常严重或终末期肾衰竭，也称为确定的肾功能衰竭(GFR<15，或正在透析)。肾功能阶段可用于意指存在任何时间量的肾损伤(即由AKI或CKD引起的肾损伤)。
[0107] 通过参考以下详细描述和实施例可以更全面地理解本发明，其旨在举例说明本发明的非限制性实施方式。
[0108] 化合物和组合物
[0109] 本发明提供了新型化合物、组合物及其在诊断方法和治疗方法中的用途。
[0110] 在第一实施方式中，本发明提供了由下式表示的化合物或其盐：
[0111]
[0112] 在某些实施方式中，第一实施方式中的具有式(I)的化合物由下式或其盐表示：
[0113]
[0114] 在一个实施方式中，具有式(II)的化合物或其盐为至少60％光学纯度、至少70％光学纯度、至少80％光学纯度、至少90％光学纯度、至少95％光学纯度、或至少99％光学纯度。
[0115] 在各种实施方式中，本文所述的本发明化合物(例如由式(I)或(II)表示的化合物或其盐)基本上不含杂质。
[0116] 在各种实施方式中，本文所述的本发明化合物(例如由式(I)或(II)表示的化合物或其盐)为至少60％纯度、至少70％纯度、至少80％纯度、至少90％纯度、至少95％纯度或至少99％纯度。
[0117] 在某些实施方式中，本文所述的本发明化合物(例如由式(I)或(II)表示的化合物或其盐)是同位素标记的。在一个实施方式中，具有式(I)或(II)的化合物或其盐是放射性标记的，例如用氚(3H)或碳14(14C)。在另一个实施方式中，具有式(I)或(II)的化合物或其盐用氘、碳13(13C)或氮15(15N)或其组合标记。可以使用用于同位素标记本发明化合物的任何合适方法。
[0118] 如本文所用，当本发明的化合物(例如由式(I)或(II)表示的化合物或其盐)被同位素标记时，其是指携带同位素标记的位置所具有的指定同位素的丰度是天然丰度的至少10倍、50倍、100倍或1000倍。例如，当本发明的化合物(例如由式(I)或(II)表示的化合物或其盐)用碳13(13C)标记时，携带13C标记的位置在该位置处具有至少10％、20％、30％、40％、
50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％13C掺入。类似地，当本发明的化合物(例如由式(I)或(II)表示的化合物或其盐)用氘标记时，携带氘的位置在该位置处具有至少10％、20％、
30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％氘掺入。
50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％13C掺入。类似地，当本发明的化合物(例如由式(I)或(II)表示的化合物或其盐)用氘标记时，携带氘的位置在该位置处具有至少10％、20％、
30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％氘掺入。
[0119] 上述化合物例如具有式(I)或(II)的化合物或其盐(例如药学上可接受的盐)可用于本文所述的任何方法中。例如，本发明的化合物可用于评估受试者中的肾功能，计算受试者中肾小球滤过率的估计值，监测受试者以检测肾功能的变化(例如功能降低可以指示急性肾损伤或早期CKD)，根据肾功能的程度对受试者进行分类(例如正常、轻度降低、中度降低、严重降低、终末期肾衰竭)，并区分患有CKD的受试者与没有被诊断出患有CKD的对照受试者。此外，该化合物可用于监测肾功能随时间或响应于药物治疗、疾病(例如II型糖尿病)或生活方式干预(例如饮食、运动)的变化，并且识别或排除受试者作为药物治疗和/或肾移植的合适候选人。
[0120] 本发明还包括特异性结合本文所述化合物的抗体或抗体片段(例如具有式(I)或(II)的化合物或其盐(例如药学上可接受的盐))。产生特异性结合小分子的抗体的方法是本领域已知的。还包括抗体衍生物，例如包含上述抗体的VH和VL序列的多肽。在某些实施方式中，多肽是融合蛋白。本发明还包括用于产生本文所述的抗体或抗体片段和抗体衍生物的细胞。在一个实施方式中，该细胞是真核细胞。
[0121] 方法
[0122] 在第二实施方式中，本发明提供了一种用于测定受试者中本发明的化合物(例如具有式(I)或(II)的化合物或其盐)的水平的方法，包括：(1)获得来自受试者的生物样品；以及(2)确定所述化合物的水平。
[0123] 可以使用任何合适的方法分析生物样品，以确定样品中本发明的化合物(例如具有式(I)或(II)的化合物或其盐)的水平。合适的方法包括色谱法(例如HPLC、气相色谱、液相色谱)、质谱法(例如MS、MS-MS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学技术及其组合。
[0124] 在一个实例中，可以在质谱法之前对生物样品进行液相色谱(LC)。LC方法可包括例如超高效LC(UHPLC或UPLC)。在一些实例中，UPLC可以使用反相柱色谱系统、亲水作用色谱(HILIC)、离子交换色谱或混合相柱色谱系统进行。
[0125] 使用质谱仪进行质谱分析，该质谱仪包括离子源，用于电离分级的样品并产生带电分子用于进一步分析。样品的电离可以通过例如加热的电喷雾电离(HESI-II)进行。样品可以正或负模式电离。
[0126] 在样品已被电离后，可以分析带正电或带负电的离子以确定质荷比。用于确定质荷比的示例性的合适的分析仪包括四极分析仪、离子阱分析仪、傅里叶变换质谱(FTMS)分析仪和飞行时间分析仪。
[0127] 分析结果可能包括串联MS产生的数据。在一些示例中，串联MS可以是精确质量串联MS。例如，精确质量串联质谱可以使用四极杆飞行时间(Q-TOF)分析仪。在其它示例中，串联MS可以是FTMS。串联MS允许创建表示复杂混合物中化学成分的亲子关系的数据结构。该关系可以由树状结构表示，该树状结构示出了母离子和子离子彼此的关系，其中子离子表示母离子的子组分。
[0128] 此外，本发明的化合物的水平可以间接测量，例如，通过使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合，使用测量与需要测量的本发明的化合物水平相关的化合物(或多种化合物)水平的测定。
[0129] 在第三实施方式中，本发明的化合物可用于评估(或有助于评估)受试者中的肾功能。应当理解，本发明的化合物可用于评估任何受试者，并且包括评估无症状受试者、由于症状或风险因素(例如高血压、糖尿病、CKD家族史、暴露于某些化学/环境条件等)而存在CKD或AKI风险的受试者、以及响应于组合物或治疗干预(例如肾移植、生活方式改变)的受试者中的肾功能。还应理解，受试者可以进行一次或多次肾功能评估。
[0130] 在示例性方法中，评估受试者中的肾功能包括确定从受试者获得的生物样品中具有式(I)的化合物或其盐的水平：
[0131]
[0132] 其中与参考水平相比，生物样品中该化合物的水平升高表明受试者的肾功能降低。可以使用任何合适的方法来确定该化合物的水平。在一个实施方式中，该化合物的水平使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。
[0133] 当这种方法用于帮助评估肾功能时，该方法的结果可以与其它方法(或其结果)和/或在临床确定受试者是否具有正常肾功能或肾功能受损(可由急性肾损伤(AKI)或CKD引起)以及肾功能水平(例如正常、轻度受损、中度受损、严重受损、终末期肾衰竭)中有用的患者元数据一起使用。
[0134] 在某些实施方式中，对作为潜在肾脏供体的受试者的肾功能的准确评估将帮助医生确定潜在供体是否适合捐献肾脏。
[0135] 在第四实施方式中，本发明的化合物可用于确定受试者中肾功能降低的发展倾向的方法。在一个实施方式中，该方法包括确定从受试者获得的生物样品中具有式(I)的化合物或其盐的水平，其中与参考水平相比，生物样品中该化合物的升高水平指示受试者中肾功能降低的发展倾向。可以使用任何合适的方法来确定化合物的水平。在一个实施方式中，化合物的水平使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。
[0136] 在第五实施方式中，本发明的化合物可用于根据肾功能水平(例如正常、轻度降低、中度降低、严重降低、终末期肾衰竭)对受试者进行分类的方法。在一个实施方式中，该方法包括确定从受试者获得的生物样品中具有式(I)的化合物或其盐的水平，其中与参考水平相比，生物样品中该化合物的水平用于根据肾功能水平对受试者进行分类。可以使用任何合适的方法来确定该化合物的水平。在一个实施方式中，该化合物的水平使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。
[0137] 在第六实施方式中，本发明的化合物可用于监测受试者中肾功能的方法。在一个实施方式中，该方法包括：(1)在第一时间点确定从受试者获得的第一生物样品中具有式(I)的化合物或其盐的水平；(2)在第二时间确定从受试者获得的第二生物样品中该化合物或其盐的水平，其中第二时间晚于第一时间，并且其中第二生物样品中该化合物的水平相比于第一生物样品中该化合物的水平的变化指示肾功能的变化。可以使用任何合适的方法来确定该化合物的水平。在一个实施方式中，该化合物的水平使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。
[0138] 该化合物的水平随时间的变化(如果有的话)(即在第一时间点来自受试者的第一样品相比于在第二时间点从受试者获得的第二样品)可以指示患者中肾功能随时间的改变。为了表征受试者中肾功能随时间的变化，可以将第一样品中该化合物的水平、第二样品中该化合物的水平、和/或第一和第二样品中该化合物水平的比较结果与该化合物的参考水平进行比较。如果比较表明该化合物的水平随时间增加或减少(例如在第二样品中与第一样品相比)以变得更类似于低肾功能参考水平(或更不类似于高肾功能参考水平)，则结果表明肾功能下降。如果比较表明化合物的水平随着时间增加或减少以变得更类似于高肾功能参考水平(或更不类似于低肾功能参考水平)，则结果表明正常肾功能。例如，受试者可能在第一时间点具有正常肾功能(例如该化合物的水平类似于高肾功能参考水平或与低肾功能参考水平不相似)并且在第二时间点保持在正常范围内(例如保持类似于高肾功能参考水平或与低肾功能参考水平不相似)，表明肾功能没有变化。在另一个示例中，肾功能在第一时间点可能是正常的(例如化合物的水平类似于高肾功能参考水平或与低肾功能参考水平不类似)然后在第二时间点降低但仍然保持在肾功能的正常范围内，表明虽然仍处于正常范围，但肾功能降低。在另一个示例中，可以通过基于在第二时间点的生物标记物的水平来诊断在第一时间点具有临界正常肾功能的受试者患有CKD，其中第二时间点的生物标记物的水平指示受试者中肾功能的恶化。
[0139] 该化合物的相对量和参考水平之间的差异也可用于评估肾功能随时间的变化。例如，如果比较表明该化合物水平与高肾功能参考水平之间随时间存在较大差异(或该化合物水平与低肾功能参考水平之间随时间存在较小差异)，则结果表明患者肾功能下降。
[0140] 在获得第一样品之后，可以在稍后的时间点从受试者获得一个或多个其它样品。在一个方面，在第一样品后的1、2、3、4、5、6或更多天时获得一种或多种其它样品。在另一个方面，在第一样品后或者在用组合物开始治疗后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周时获得一种或多种其它样品。在另一个方面，可以在第一样品后或者在用组合物开始治疗后的1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月时获得一个或多个其它样品。
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月时获得一个或多个其它样品。
[0141] 在某些实施方式中，所述化合物的水平可用于监测肾移植受体中的肾功能。
[0142] 在第七实施方式中，本发明的化合物可用于诊断或帮助诊断受试者中慢性肾病(CKD)的方法。应当理解，本发明化合物可用于诊断或帮助诊断任何受试者中的CKD，包括无症状受试者、表现出与存在CKD一致的一种或多种症状的那些受试者和/或可能患有CKD的那些受试者(例如慢性疾病、药物治疗、造影剂的使用等)。在一个实施方式中，该方法包括确定从受试者获得的生物样品中具有式(I)的化合物或其盐的水平，其中与参考水平相比，生物样品中该化合物的水平升高指示慢性肾病。可以使用任何合适的方法来确定该化合物的水平。在一个实施方式中，该化合物的水平使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。
[0143] 在某些实施方式中，本发明的化合物允许评估(或用于帮助评估)肾功能以在使用确定肾功能的当前标准(例如SCr、MDRDcr-eGFR、CKD-EPIcr-eGFR，胱抑素C尿白蛋白和/或BUN测量)可诊断CKD之前检测初期CKD。临床测量可能不足以灵敏检测肾功能的早期变化，或者由于例如慢性疾病、肥胖、高龄、素食和/或通常减少的肌肉质量而在某些受试者中可能是不准确的。例如，在患有2型糖尿病的受试者中，本发明的化合物可用于诊断或帮助诊断CKD。CKD的准确早期诊断可以允许较早的治疗干预，其可以延迟或预防进一步的肾损伤的发展和更严重CKD。
[0144] 在某些实施方式中，在确定样品中具有式(I)或(II)的化合物和任选的一种或多种其它生物标记物的水平之后，将此水平与CKD阳性和/或CKD阴性参考水平进行比较以诊断或帮助诊断受试者是否患有CKD。具有式(I)或(II)的化合物的水平和任选的一种或多种其它生物标记物参考水平(例如该水平与参考水平相同，与参考水平基本相同，略高于和/或低于参考水平的最小值和/或最大值，和/或在参考水平的范围内)指示在受试者中诊断为有CKD。在与CKD阴性参考水平匹配的样品中具有式(I)或(II)的化合物和任选的一种或多种其它生物标记物的水平(例如该水平与参考水平相同，与参考水平基本相同，略高于和/或低于参考水平的最小值和/或最大值，和/或在参考水平的范围内)指示在受试者中诊断为无CKD的诊断。此外，与CKD阴性参考水平相比，样品中具有式(I)或(II)的化合物和任选的一种或多种其它生物标记物的水平的差异存在(特别是统计学显著的水平)指示在受试者中诊断为有CKD。与CKD阳性参考水平相比，样品中具有式(I)或(II)的化合物和任选的一种或多种其它生物标记物的水平的差异存在(特别是统计学显著的水平)指示在受试者中诊断为无CKD。
[0145] 可以使用各种技术将具有式(I)或(II)的化合物和任选的一种或多种其它生物标记物的水平与CKD阳性和/或CKD阴性参考水平进行比较，包括简单比较(例如手动比较)生物样品中一种或多种生物标记物的水平与CKD阳性和任选的CKD阴性参考水平。还可以使用一种或多种统计学分析(例如t检验、Welch's T检验、Wilcoxon's秩和检验、相关分析、随机森林、T评分、Z评分)或使用数学模型(例如算法、统计模型)将生物样品中具有式(I)或(II)的化合物和/或一种或多种其它生物标记物的水平与CKD阳性和/或CKD阴性参考水平进行比较。
[0146] 例如，包括单个算法或多个算法的数学模型可用于评估受试者中的肾功能。可以使用数学模型来计算估计的肾小球滤过率(eGFR)。数学模型也可用于确定受试者是否患有CKD。数学模型也可用于区分CKD阶段。示例性数学模型可以使用从受试者测量的本发明的化合物和/或与评估肾功能相关的任何数量(例如2、3、5、7、9个等)的其它生物标记物的水平，使用基于所测量的生物标记物水平之间的数学关系的算法或一系列算法，以确定受试者是否具有正常的肾功能或CKD，受试者是否倾向于发展CKD，CKD是否在受试者中进展，受试者是否具有高阶段(严重或非常严重的肾功能降低)、中阶段(中度降低功能)或低阶段(轻度降低功能)CKD等。不同的示例性数学模型可以使用从受试者测量的本发明的化合物和/或与任何数量(例如2、3、5、7、9个等)的其它生物标记物的水平，以基于肾功能的水平或阶段(例如高度、中度、轻度)对受试者进行分类。在一个实例中，用于估计GFR而生成的数学模型用于评估肾功能，监测肾功能，确定受试者是否患有CKD或AKI，区分CKD阶段，和/或确定CKD或AKI的倾向。
[0147] 在某些实施方式中，本发明的方法允许在先前未诊断患有CKD的受试者中诊断CKD。例如，在具有CKD风险因素(例如年龄超过60岁、高血压、糖尿病、心血管疾病和/或CKD家族史等)的受试者中，本文所述的生物标记物可用于诊断或辅助诊断CKD。
[0148] 在某些实施方式中，本发明的方法允许在使用当前用于确定肾功能的标准(例如SCr、MDRDcr-eGFR、CKD-EPIcr-eGFR、CKD-EPIcrcys、尿白蛋白、胱抑素C和/或BUN测量)可诊断CKD之前进行早期检测和诊断。CKD的早期诊断可以允许更早的治疗干预，这可以延迟或预防进一步的肾损伤的发展和更严重CKD。
[0149] 在某些实施方式中，本发明的方法可用于诊断或帮助诊断患者中的CKD，其中用于确定受试者中CKD的当前标准(例如SCr、MDRDcr-eGFR、CKD-EPIcr-eGFR、CKD-EPIcrcys、尿白蛋白、胱抑素C、和/或BUN测量)由于例如慢性疾病、肥胖症、高龄、素食和/或通常减少的肌肉量而在受试者中是不准确的。例如，在患有2型糖尿病的受试者中，本文所述的生物标记物可用于诊断或帮助诊断CKD。
[0150] 当使用上述方法来辅助CKD的诊断时，该方法的结果可以与其它方法和测量(或其结果)和/或在临床确定受试者是否具有CKD中有用的患者元数据一起使用。用于临床确定受试者是否患有CKD的方法是本领域已知的。例如，用于临床确定受试者是否患有CKD的方法包括例如SCr、BUN、eGFR、mGFR、尿白蛋白和胱抑素C。用于确定受试者是否患有CKD的其它测量包括例如β-2微球蛋白、β-TRACE和/或2-C-吡喃甘露糖基色氨酸。在临床确定受试者是否患有CKD中有用的患者元数据包括例如年龄、体重、性别和种族。
[0151] 在第八实施方式中，本发明的化合物可用于监测受试者中慢性肾病(CKD)进展或消退的方法。在一个实施方式中，该方法包括：(1)在第一时间点确定从受试者获得的第一生物样品中具有式(I)的化合物或其盐的水平；(2)在第二时间确定从受试者获得的第二生物样品中该化合物或其盐的水平，其中第二时间晚于第一时间，并且其中第一生物样品中该化合物水平相比于第二生物样品中该化合物水平的变化指示受试者中疾病的进展或消退。可以使用任何合适的方法来确定该化合物的水平。在一个实施方式中，该化合物的水平使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。
[0152] 在第九实施方式中，本发明化合物可用于诊断或帮助诊断受试者中急性肾损伤(AKI)的方法。该方法包括测定从受试者获得的生物样品中具有式(I)的化合物或其盐的水平，其中与参考水平相比，生物样品中化合物的水平升高指示AKI。可以使用任何合适的方法来确定该化合物的水平。在一个实施方式中，该化合物的水平使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。
[0153] 在第十实施方式中，本发明化合物可用于监测受试者中AKI进展或消退的方法。在一个实施方式中，该方法包括：(1)在第一时间点确定从受试者获得的第一生物样品中具有式(I)的化合物或其盐的水平；(2)在第二时间确定从受试者获得的第二生物样品中该化合物或其盐的水平，其中第二时间晚于第一时间，并且其中第一生物样品中该化合物水平相比于第二生物样品中该化合物水平的变化指示受试者中疾病的进展或消退。可以使用任何合适的方法来确定该化合物的水平。在一个实施方式中，该化合物的水平使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。
[0154] 在第十一实施方式中，本发明化合物可用于评估受试者中肾功能响应于组合物或治疗干预(例如肾移植、生活方式改变)的方法。在一个实施方式中，该方法包括：确定从用该组合物或治疗干预处理的受试者获得的生物样品中具有式(I)的化合物或其盐的水平，其中与未用组合物或治疗干预处理的受试者中该化合物的水平相比，生物样品中该化合物的水平升高指示肾功能降低。可以使用任何合适的方法来确定该化合物的水平。在一个实施方式中，该化合物的水平使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。
[0155] 组合物可以是给予受试者以治疗任何疾病或病症的任何组合物、药物或治疗剂。该组合物另外可以是给予患有疾病或病症的患者的任何组合物。在一个实施方式中，该组合物是造影剂。在另一个实施方式中，该组合物是治疗剂，例如化学治疗剂。在另一个实施方式中，该组合物是抗生素。
[0156] 在某些实施方式中，第十一实施方式中描述的方法允许评估受试者对改变肾功能的组合物的响应，以及评估患者对改变肾功能的两种或更多种组合物的相对响应。例如，这种评估可用于选择用于治疗某些受试者的癌症的组合物，或选择用于治疗过程或包括在临床试验中的受试者。此类评估还可用于在药物开发过程之前、之间和/或之后(即上市后)来监测肾功能组合物的响应。
[0157] 在某些实施方式中，本发明的方法允许评估(或用于帮助评估)使用造影剂进行造影测试的患者的肾功能，其中造影剂可能是有毒的，并因此可能导致肾损伤。例如，在肾功能降低的患者(例如第2阶段CKD或第3阶段或第3A阶段CKD)中，准确测量肾功能将帮助患者和临床医生评估造影测试的风险效益比，并将允许做出更完善的决定。
[0158] 在第十二实施方式中，本发明提供了治疗患有慢性肾病(CKD)的受试者的方法，包括：(1)确定从受试者获得的生物样品中具有式(I)化合物或其盐的水平；以及(2)如果与参考水平相比，受试者具有升高的化合物水平，则向受试者施用适于治疗慢性肾病的有效疗法。可以使用任何合适的方法来确定该化合物的水平。在一个实施方式中，该化合物的水平使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。
[0159] 在第十三实施方式中，本发明提供了治疗患有慢性肾病(CKD)的受试者的方法，包括向受试者施用适于治疗慢性肾病的有效疗法，其中与参考水平相比，受试者具有升高水平的具有式(I)的化合物或其盐。在一个实施方式中，该化合物的水平使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。
[0160] 慢性肾病通常由潜在的疾病或病症引起。例如，高血液压力(高血压)或糖尿病可导致慢性肾病。慢性肾病的其它原因可能包括：(1)肾脏疾病和感染，如多囊肾病、肾盂肾炎和肾小球肾炎；(2)肾动脉狭窄或阻塞；(3)由诸如前列腺肥大、肾结石和癌症的病症导致的泌尿道长期阻塞；(4)膀胱输尿管反流，导致尿液回到肾脏的病症；(5)长期使用可损害肾脏的药物(例如非类固醇类抗炎药(NSAID)，如塞来昔布和布洛芬)。
[0161] 慢性肾病通常用针对引起CKD的潜在病症或疾病的有效治疗进行治疗。在某些实施方式中，CKD由糖尿病引起，并且在第十二或第十三实施方式中治疗CKD的方法包括向受试者施用适于治疗糖尿病的有效疗法。糖尿病可以用抗糖尿病药治疗。示例性抗糖尿病药包括但不限于二甲双胍、吡格列酮、罗格列酮、阿卡波糖、四氢脂抑素(tetrahydrolipstatin)、芬特明/托吡酯、安非他酮/纳曲酮、氯卡西林(lorcaserin)、利拉鲁肽和卡格列净(canagliflozin)。在某些实施方式中，可通过生活方式改变来治疗糖尿病。示例性的生活方式改变包括但不限于饮食改变和/或活动或锻炼的增加。饮食改变可包括，例如，限制卡路里摄入量、份量、糖和淀粉类碳水化合物含量和/或选择低脂肪和低卡路里以及高纤维含量的食物。
[0162] 在某些实施方式中，CKD由高血液压力(高血压)引起，并且在第十二或第十三实施方式中治疗CKD的方法包括向受试者施用适于治疗高血压的有效疗法。在某些实施方式中，第十二或第十三实施方式中描述的方法包括向受试者施用有效量的治疗剂以降低血压。示例性治疗剂包括但不限于血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂或血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)。合适的ACE抑制剂包括但不限于苯那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利和群多普利。合适的ARB包括但不限于坎地沙坦、依普罗沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦、替米沙坦和缬沙坦。在某些实施方式中，利尿剂和/或低盐饮食也用于降低血压。
[0163] 在某些实施方式中，第十二或第十三实施方式中描述的治疗CKD包括生活方式改变，例如饮食改变和/或活动或锻炼的增加。饮食改变可包括低盐饮食、选择低钾含量的食物和/或限制每日蛋白质摄入量。
[0165] 在某些实施方式中，CKD可以发展为终末期肾衰竭，其可以通过透析或肾移植来治疗。
[0166] 在第十四实施方式中，本发明提供了治疗患有急性肾损伤的受试者的方法，包括：(1)确定从受试者获得的生物样品中具有式(I)的化合物或其盐的水平；(2)如果与参考水平相比，受试者具有升高的该化合物的水平，则向受试者施用适于治疗急性肾损伤的有效疗法。可以使用任何合适的方法来确定该化合物的水平。在一个实施方式中，该化合物的水平使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。
[0167] 在第十五实施方式中，本发明提供了治疗患有急性肾损伤的受试者的方法，包括向受试者施用适于治疗急性肾损伤的有效疗法，其中与参考水平相比，受试者具有升高水平的具有式(I)的化合物或其盐。在一个实施方式中，该化合物的水平使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。
[0168] 急性肾损伤(AKI)可由各种病症引起，例如肾脏血流减缓、直接损害肾脏和/或阻塞输尿管的病症。损害肾脏血流的病症包括但不限于血液或流体损失、血压药物、心脏病发作、心脏病、感染、肝功能衰竭、使用阿司匹林、布洛芬(Advil，Motrin IB、其它)、萘普生(Aleve，其它)或相关药物、严重过敏反应(过敏症)、严重烧伤和严重脱水。可能对肾脏造成直接损害的疾病、病症和药剂包括但不限于肾脏内和周围的静脉和动脉中的血凝块、阻断肾脏血流的胆固醇沉积物、肾小球肾炎、肾脏微小的过滤器(肾小球)的炎症、溶血性尿毒综合症、由红细胞过早破坏引起的病症、感染、狼疮、引起肾小球肾炎的免疫系统疾病、药物如某些化疗药物、抗生素、造影测试中使用的染料和唑来膦酸(Reclast，Zometa)、用于治疗骨质疏松症和高血钙水平(高钙血症)、多发性骨髓瘤、浆细胞癌、硬皮病、影响皮肤和结缔组织的罕见疾病组、血栓性血小板减少性紫癜、罕见的血液疾病、毒素如酒精、重金属和可卡因、血管炎、血管炎症。可引起尿路阻塞并导致AKI的疾病和病症包括但不限于膀胱癌、泌尿道血栓、宫颈癌、结肠癌、前列腺肥大、肾结石、涉及控制膀胱的神经的神经损伤和前列腺癌。
[0169] AKI通常用针对潜在病因的有效疗法进行治疗。在某些实施方式中，AKI由药物(例如化学治疗剂)引起，并且在受试者中治疗AKI的方法包括停止对受试者施用药物施或减少施用于受试者的药物(例如化学治疗剂)的剂量。
[0170] 在某些实施方式中，AKI由高血压或糖尿病引起，并且在受试者中治疗AKI的方法包括针对在第十二或第十三实施方式中上述的高血压或糖尿病施用有效疗法。
[0171] 在某些实施方式中，治疗受试者中AKI的方法包括生活方式改变，例如饮食改变和/或活动或锻炼的增加。饮食改变可包括低盐饮食、选择低钾含量的食物和/或限制每日蛋白质摄入量。
[0172] 在某些实施方式中，通过透析或肾移植治疗AKI。
[0173] 在第十六实施方式中，本发明提供了一种计算患者中估计的肾小球滤过率(eGFR)的方法，包括以下步骤：(1)确定从受试者获得的生物样品中具有式(I)的化合物或其盐的含量；以及(2)使用利用测量的化合物水平的算法计算eGFR，其中使用外源过滤标记测量的GFR用于发展算法。可以使用任何合适的方法来确定该化合物的水平。在一个实施方式中，该化合物的水平使用色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。
[0174] 在某些实施方式中，使用与肾功能评估相关的一种或多种其它生物标记物计算eGFR。在一个实施方式中，一种或多种其它生物标记物选自假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-乙酰丙氨酸、N6-氨基苏氨酰腺苷、4-乙酰氨基丁酸酯、赤藓糖醇、肌醇、赤藓酸盐、尿素、阿拉伯糖醇、N2,N2-二甲基鸟苷、N1-甲基腺苷、3-甲基戊二酸肉碱、S-腺苷高半胱氨酸、N-乙酰蛋氨酸、N6-乙酰赖氨酸、犬尿氨酸、阿拉伯糖酸盐、琥珀酰肉碱、核糖、木糖酸盐、N-甲酰基蛋氨酸、O-甲基儿茶酚硫酸盐、2-甲基丁酰基肉碱、苯乙酰谷氨酰胺、N2,N5-二乙酰鸟氨酸、色氨酸、肌酸酐、尿酸盐、3-吲哚硫酸酯和对甲酚硫酸盐。在另一个实施方式中，eGFR算法进一步利用血清胱抑素C水平。在又一个实施方式中，eGFR算法还利用选自由年龄、性别和种族组成的组中的一个或多个人口统计学参数。
[0175] 在第十七实施方式中，对于第二至第十六实施方式中描述的方法，具有式(I)的化合物由式(II)或其盐表示：
[0176]
[0177] 在第十八实施方式中，对于第二至第十六实施方式中描述的方法，该化合物的水平通过串联液相色谱-质谱(LC-MS/MS)确定。
[0178] 在第十九实施方式中，第二至第十八实施方式中描述的方法还包括在数学模型中使用所确定的化合物水平来评估肾功能。
[0179] 在第二十实施方式中，第二至第十九实施方式中描述的方法还包括分析生物样品以确定与肾功能评估相关的一种或多种其它生物标记物的水平。所述一种或多种生物标记物可选自以下生物标记物：假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-乙酰基丙氨酸、N6-氨基甲酰基乙酰基腺苷、4-乙酰氨基丁酸、赤藓糖醇、肌醇、赤藓酸盐、尿素、阿拉伯糖醇、N2,N2-二甲基鸟苷、N1-甲基腺苷、3-甲基戊二酸半胱氨酸、S-腺苷高半胱氨酸、N-乙酰蛋氨酸、N6-乙酰赖氨酸、犬尿氨酸、阿拉伯糖酸盐、琥珀酰肉碱、核糖、木糖酸盐、N-甲酰基蛋氨酸、O-甲基儿茶酚硫酸酯、2-甲基丁酰基肉碱、苯乙酰谷氨酰胺，N2,N5-二乙酰鸟氨酸、色氨酸、肌酸酐、尿酸盐、3-吲哚硫酸酯和对甲酚硫酸盐，及其组合。
[0180] 在某些实施方式中，在第二十实施方式中描述的方法中确定两种、三种、四种、五种、六种、七种、九种、十种、十一种、十二种或更多种其它生物标记物的水平。
[0181] 在某些实施方式中，对于第二十实施方式中描述的方法，一种或多种其它生物标记物选自假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸、苯乙酰谷氨酰胺、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸、犬尿氨酸、肌醇和肌酸酐。
[0182] 在某些实施方式中，对于第二十实施方式中描述的方法，一种或多种其它生物标记物选自假尿苷、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸、色氨酸、N-乙酰基苏氨酸和肌酸酐。
[0183] 在某些实施方式中，对于第二十实施方式中描述的方法，一种或多种其它生物标记物选自假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸、苯乙酰谷氨酰胺和肌酸酐。
[0184] 在某些实施方式中，对于第二十实施方式中描述的方法，一种或多种其它生物标记物选自N-乙酰基苏氨酸、肌醇、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸和肌酸酐。
[0185] 在某些实施方式中，对于第二十实施方式中描述的方法，一种或多种其它生物标记物选自N-乙酰基苏氨酸、肌醇、犬尿氨酸和肌酸酐。
[0186] 在某些实施方式中，对于第二十实施方式中描述的方法，一种或多种其它生物标记物选自假尿苷、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸、N-乙酰基苏氨酸和肌醇。
[0187] 在某些实施方式中，对于第二十实施方式中描述的方法，一种或多种其它生物标记物选自假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、肌醇和肌酸酐。
[0188] 在某些实施方式中，第二十实施方式中描述的方法还包括分析生物样品以确定假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸、苯乙酰谷氨酰胺和肌酸酐的水平。
[0189] 确定本发明的化合物和一种或多种其它生物标记物的水平可以在所述方法中允许更高的灵敏度和特异性。例如，生物样品中两种生物标记物的成对分析或某些生物标记物(和非生物标记物化合物)水平的比率可以在评估肾功能和帮助评估肾功能方面提供更高的灵敏度和特异性。
[0190] 可以使用各种技术将具有式(I)或(II)的化合物和/或一种或多种其它生物标记物的水平与肾功能参考水平进行比较，包括简单比较(例如手动比较)。还可以使用一种或多种统计分析(例如，t-检验、Welch's T检验、Wilcoxon's秩和检验、相关分析、随机森林、T评分、Z评分)或使用数学模型(例如算法、统计模型)将生物样品中具有式(I)或(II)的化合物和/或一种或多种其它生物标记物的水平与参考水平进行比较。例如，包括单个算法或多个算法的数学模型可用于评估受试者的肾功能。
[0191] 该方法的结果可以与用于评估受试者肾功能的其它方法和测量(或其结果)一起使用。例如，临床参数如BUN、SCr和/或尿白蛋白测量；肾功能标记物如β-2微球蛋白、β-TRACE、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸；以及患者信息，例如CKD的家族史或其它风险因子可以与生物标记物一起使用。
[0192] 在某些实施方式中，本发明的化合物和/或一种或多种其它生物标记物的水平可以用于数学或统计模型或公式中以向医生提供指示肾功能水平和/或受试者肾功能受损概率(这可能指示AKI或CKD)的数值分数(“肾功能评分”)。该评分基于临床上显著改变的生物标记物和/或生物标记物组合的参考水平。该参考水平可以从算法得出或者从GFR受损的指数计算。用于确定受试者的肾功能评分的方法可以包括将样品中的一种或多种肾功能生物标记物的水平与一种或多种生物标记物的肾功能参考水平进行比较，以确定受试者的肾功能评分。该方法可以使用选自以下列表的任何数量的生物标记物：假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-乙酰基丙氨酸、N6-氨基甲酰基乙酰基腺苷、4-乙酰氨基丁酸、赤藓糖醇、肌醇、赤藓酸盐、尿素、阿拉伯糖醇、N2,N2-二甲基鸟苷、N1-甲基腺苷、3-甲基戊二酸肉碱、S-腺苷高半胱氨酸、N-乙酰基甲硫氨酸、N6-乙酰基赖氨酸、犬尿氨酸、阿拉伯糖酸盐、琥珀酰肉碱、核糖、木糖酸盐、N-甲酰基蛋氨酸、O-甲基儿茶酚硫酸盐、2-甲基丁酰基肉碱、苯乙酰谷氨酰胺、N2,N5-二乙酰鸟氨酸、色氨酸、肌酸酐、尿酸盐、3-吲哚硫酸酯和对甲酚硫酸盐。多种生物标记物可以通过任何方法与肾功能相关，包括统计方法，例如回归分析。
[0193] 肾功能评分可用于将受试者置于肾功能范围内，从正常(即无肾功能损害)到轻度降低、中度降低、严重降低或终末期肾衰竭。肾功能评分的非限制性示例用途包括：肾功能评估；GFR的估计；肾功能分类；发展CKD的易感性；发展AKI的易感性；CKD的诊断和分期；通过定期确定和监测肾功能评分监测CKD进展；监测肾移植受者的肾功能状态；确定对治疗干预的响应；评估药物疗效；以及确定治疗和/或造影剂的耐受性。
[0194] 在某些实施方式中，对于本文所述的本发明方法，生物样品是血液、血液血浆、血清、唾液或尿液。在一个实施方式中，生物样品是血液血浆。在另一个实施方式中，生物样品是血清。
[0195] 在某些实施方式中，对于本文所述的本发明方法，在用允许直接测量肾小球滤过率的试剂处理之前从受试者获得生物样品。
[0196] 在某些实施方式中，对于本文所述的本发明方法，受试者是人。
[0197] 在某些实施方式中，对于本文所述的本发明方法，受试者没有肾功能受损的症状或没有已知的肾功能受损的风险因素。在其它实施方式中，受试者表现出发展慢性肾病的风险因素(例如年龄超过60岁、高血压、糖尿病、心血管疾病、CKD家族史)。在某些实施方式中，所述受试者先前已被诊断患有高血压或糖尿病。在某些实施方式中，所述受试者具有慢性肾病的家族史。在某些实施方式中，受试者具有肾功能受损的症状。在某些实施方式中，受试者是使用常规方法难以进行肾功能评估的受试者。
[0198] 在某些实施方式中，受试者选自由以下组成的组：肥胖的人、非常瘦的人、素食者、慢性病和老年人。
[0199] 在某些实施方式中，受试者是肾供体的候选者。
[0200] 在某些实施方式中，受试者已经用或可能正在考虑用可能对肾脏具有毒性作用的药剂进行治疗。在一个实施方式中，此药剂是造影剂。在另一个实施方式中，此药剂是用于治疗疾病或病症的治疗剂，例如化学治疗剂。在另一个实施方式中，此药剂是抗生素。
[0201] 在某些实施方式中，该方法可用于监测患有CKD的受试者或怀疑有倾向发展CKD的受试者(例如由于CKD家族史、药物治疗、慢性疾病等而处于风险的受试者)的肾功能。在一个实例中，本发明的化合物可用于监测未患有CKD的受试者的肾功能。例如，在怀疑有倾向发展CKD的受试者中，本文所述的生物标记物可用于监测CKD的发展。
[0202] 试剂盒
[0203] 本发明包括用于测量生物样品中具有式(I)或式(II)的化合物水平的试剂盒。
[0204] 本发明的试剂盒可用于评估或监测受试者的肾功能，确定肾功能降低的发展倾向，根据肾功能水平对受试者进行分类，诊断或监测慢性肾病，估计受试者的GFR。
[0205] 在某些实施方式中，本发明的试剂盒包含具有式(I)的化合物或其盐。在一个实施方式中，本发明的试剂盒包含具有式(II)的化合物或其盐。
[0206] 在某些实施方式中，本发明的试剂盒包含具有式(I)的化合物或其盐和用于测量生物样品中具有式(I)的化合物水平的说明书。在一个实施方式中，试剂盒包含具有式(II)的化合物或其盐和用于测量生物样品中具有式(II)的化合物水平的说明书。
[0207] 在某些实施方式中，本发明的试剂盒可包含标记的化合物(例如内标)或能够检测生物样品中的具有式(I)或(II)的化合物的试剂。
[0208] 在某些实施方式中，本发明的试剂盒可包含标记的化合物(例如内标)或能够检测生物样品中的具有式(I)或(II)的化合物的试剂和用于测量生物样品中具有式(I)或(II)的化合物水平的说明书。
[0209] 在一个实施方式中，上述试剂盒中的内标是标记的具有式(I)或式(II)的化合物。在另一个实施方式中，上述试剂盒中的内标是N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸-13C3(13C3-L、L-TMAP)。
[0210] 在一个实施方式中，本发明的试剂盒包含未标记的具有式(I)的化合物或其盐，作为内标的标记的具有式(I)的化合物和用于测量生物样品中具有式(I)的化合物水平的说明书。
[0211] 在另一个实施方式中，本发明的试剂盒包含未标记的具有式(II)的化合物或其盐，作为内标的标记的具有的式(II)的化合物和用于测量生物样品中具有式(II)的化合物水平的说明书。在一个实施方式中，标记的具有式(II)的化合物是N,N,N-三甲基-13C3-L-丙氨酰-L-脯氨酸(13C3-L、L-TMAP)。
[0212] 在另一个实施方式中，本文描述的13C3-L、L-TMAP由下式表示：
[0213]
[0214] 在某些实施方式中，本发明的试剂盒可包含标记的化合物(例如内标)或能够检测生物样品中具有式(I)或(II)的化合物的试剂和用于确定样品中该化合物的量的方法(例如针对具有式(I)或(II)的化合物的抗体)。
[0215] 在某些实施方式中，生物样品中具有式(I)或(II)的化合物的量可以使用本文所述的本发明试剂盒通过色谱法、质谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体连接、免疫印迹、免疫组织化学(IHC)、其它免疫化学方法或其组合来确定。在某些实施方式中，生物样品中式(I)或(II)化合物的量可通过色谱法、质谱法或其组合来确定。在某些实施方式中，生物样品中具有式(I)或(II)的化合物的量可以使用本发明的试剂盒通过LC-MS来确定。
[0216] 试剂盒还可包含例如缓冲剂、防腐剂或稳定剂。试剂盒还可含有对照样品或对照样品组，可对其进行测定并与测试样品进行比较。试剂盒的每个组分通常封装在单独的容器内，并且所有各种容器以及用于确定受试者是否患有或有风险发展与相关小分子相关的病症的说明书都在单个包装内。
[0217] 在第二十一实施方式中，本发明的试剂盒包含上述本发明的化合物(例如具有式(I)或(II)的化合物或其盐)，以及基于从受试者获得的生物样品中检测到的该化合物水平评估或监测受试者中肾功能的说明书。
[0218] 在第二十二实施方式中，本发明的试剂盒包含上述本发明的化合物(例如具有式(I)或(II)的化合物或其盐)，以及基于从受试者获得的生物样品中检测到的该化合物水平确定受试者中肾功能降低的发展倾向的说明书。
[0219] 在第二十三实施方式中，本发明的试剂盒包含上述本发明的化合物(例如具有式(I)或(II)的化合物或其盐)，以及基于从受试者获得的生物样品中检测到的该化合物水平根据肾功能水平对受试者进行分类的说明书。
[0220] 在第二十四实施方式中，本发明的试剂盒包含上述本发明的化合物(例如具有式(I)或(II)的化合物或其盐)，以及基于从受试者获得的生物样品中检测到的该化合物水平诊断或监测受试者中慢性肾病(CKD)的说明书。
[0221] 在第二十五实施方式中，本发明的试剂盒包含上述本发明的化合物(例如具有式(I)或(II)的化合物或其盐)，以及基于从受试者获得的生物样品中检测到的该化合物水平诊断或监测受试者中急性肾损伤(AKI)的说明书。
[0222] 在第二十六实施方式中，本发明的试剂盒包含上述本发明的化合物(例如具有式(I)或(II)的化合物或其盐)，以及基于从受试者获得的生物样品中检测到的该化合物水平估计受试者中GFR的说明书。
[0223] 在某些实施方式中，对于第二十一至第二十六实施方式中描述的试剂盒，具有式(I)或(II)的化合物是同位素标记的。在一个实施方式中，具有式(I)或(II)的化合物是放射性标记的，例如用氚(3H)或碳14(14C)。在另一个实施方式中，具有式(I)或(II)的化合物是氘化的、用碳13(13C)或氮15(15N)或其组合标记。在一个实例中，标记的具有式(II)的化13 13
合物是N,N,N-三甲基- C3-L-丙氨酰-L-脯氨酸( C3-L、L-TMAP)，其可以用作内标。
合物是N,N,N-三甲基- C3-L-丙氨酰-L-脯氨酸( C3-L、L-TMAP)，其可以用作内标。
[0224] 本发明还提供了包含特异性结合上述具有式(I)或(II)的化合物或其盐(例如药学上可接受的盐)的抗体或抗体片段的试剂盒，用于评估或监测受试者的肾功能，确定肾功能降低的发展倾向，根据肾功能水平对受试者进行分类，诊断或监测慢性肾病，估计受试者的GFR。在某些实施方式中，本发明的试剂盒包含抗体衍生物，例如包含上述抗体的VH和VL序列的多肽。在一个实施方式中，多肽是融合蛋白。
[0225] 在第二十七实施方式中，本发明的试剂盒包含上述抗体、抗体片段或抗体衍生物，以及基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平评估或监测受试者中肾功能的说明书。
[0226] 在第二十八实施方式中，本发明的试剂盒包含上述抗体、抗体片段或抗体衍生物，以及基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平确定受试者中肾功能降低的发展倾向的说明书。
[0227] 在第二十九实施方式中，本发明的试剂盒包含上述抗体、抗体片段或抗体衍生物，以及基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平根据肾功能水平对受试者进行分类的说明书。
[0228] 在第三十实施方式中，本发明的试剂盒包含上述抗体、抗体片段或抗体衍生物，以及基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平诊断或监测受试者中慢性肾病(CKD)的说明书。
[0229] 在第三十一实施方式中，本发明的试剂盒包含上述抗体、抗体片段或抗体衍生物，以及基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平诊断或监测受试者中急性肾损伤(AKI)的说明书。
[0230] 在第三十二实施方式中，本发明的试剂盒包含上述抗体、抗体片段或抗体衍生物，以及基于从受试者获得的生物样品中检测到的所述化合物水平估计受试者中GFR的说明书。
[0231] 在某些实施方式中，上述试剂盒(例如第二十一至二十六实施方式中描述的试剂盒)包含除所述化合物之外的一种或多种其它生物标记物，其中所述一种或多种其它生物标记物与肾功能的评估相关。本文描述的任何生物标记物可以用于本发明的试剂盒中。
[0232] 在某些实施方式中，上述试剂盒(例如第二十七至三十二实施方式中描述的试剂盒)包含一种或多种其它生物标记物，其中所述一种或多种其它生物标记物与肾功能的评估相关。本文描述的任何生物标记物可以用于本发明的试剂盒中。
[0233] 在各种实施方式中，一种或多种其它生物标记物选自假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-乙酰基丙氨酸、N6-氨基苏氨酰腺苷、4-乙酰氨基丁酸、赤藓糖醇、肌醇、赤藓酸盐、尿素、阿拉伯糖醇、N2,N2-二甲基鸟苷、N1-甲基腺苷、3-甲基戊二酸肉碱、S-腺苷高半胱氨酸、N-乙酰蛋氨酸、N6-乙酰赖氨酸、犬尿氨酸、阿拉伯糖酸盐、琥珀酰肉碱、核糖、木糖酸盐、N-甲酰基蛋氨酸、O-甲基儿茶酚硫酸盐、2-甲基丁酰基肉碱、苯乙酰谷氨酰胺、N2,N5-二乙酰鸟氨酸、色氨酸、肌酸酐、尿酸盐、3-吲哚硫酸酯和对甲酚硫酸盐。在一个实施方式中，其它生物标记物选自假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸、苯乙酰谷氨酰胺、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸、犬尿氨酸、肌醇和肌酸酐。在另一个实施方式中，其它生物标记物选自假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸、苯乙酰谷氨酰胺和肌酸酐。
[0234] 在某些实施方式中，所述一种或多种其它生物标记物选自N-乙酰基苏氨酸、肌醇、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸和肌酸酐。
[0235] 在某些实施方式中，所述一种或多种其它生物标记物选自N-乙酰基苏氨酸、肌醇、犬尿氨酸和肌酸酐。
[0236] 在某些实施方式中，所述一种或多种其它生物标记物选自假尿苷、2-C-吡喃甘露糖基色氨酸、N-乙酰基苏氨酸和肌醇。
[0237] 在某些实施方式中，所述一种或多种其它生物标记物选自假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、肌醇和肌酸酐。
[0238] 在某些实施方式中，本发明的试剂盒包含上述本发明化合物(具有式(I)或(II)的化合物或其盐)、假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸、苯乙酰谷氨酰胺和肌酸酐。
[0239] 制备方法
[0240] 可以参考以下参考文献以获得合适的合成方法，例如March，Advanced Organic Chemistry，第3版，John Wiley&Sons，1985，或Greene和Wuts Protective groups in organic synthesis第2版，John Wiley&sons 1991，以及Richard Larock，comprehensive organic transformations，第4版，VCH出版社，1989中所述。
[0241] 在一个实施方式中，具有式(I)的化合物可通过使具有式(III)的化合物或其盐与甲基化试剂反应来制备：
[0242]
[0243] 在另一个实施方式中，本发明提供了制备具有式(II)的化合物的方法，包括使具有式(IV)的化合物或其盐与甲基化试剂反应：
[0244]
[0245] 在另一个实施方式中，具有式(I)的化合物可通过使具有式(V)的化合物或其盐与甲基化试剂反应来制备：
[0246]
[0247] 其中R1是H，且R2是CH3；或R1和R2均为CH3。
[0248] 在另一个实施方式中，具有式(II)的化合物可通过使具有式(VI)的化合物或其盐与甲基化试剂反应来制备：
[0249]
[0250] 其中R1是H，且R2是CH3；或R1和R2均为CH3。
[0251] 在某些实施方式中，上述方法中的甲基化试剂是CH3X或(CH3)2SO4，其中X是Cl、Br、I或OSO2CF3。在另一个实施方式中，甲基化试剂是碘甲烷(CH3I)。
[0253] 在一个实施方式中，上述方法中的甲基化反应在氧化银存在下进行。
[0254] 在另一个实施方式中，上述方法中的甲基化反应在碳酸钾存在下进行。
[0255] 在某些实施方式中，上述方法的甲基化反应在水和有机溶剂的混合物中或在100％水中进行。可以使用任何合适的有机溶剂，其可以包括但不限于甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜等。例如，甲基化反应在甲醇和水的混合物中进行。甲醇与水的体积比可为1:10至10:1、1:5至5:1；5:1至1:1、4:1至1:1。在一个实施方式中，甲醇与水的体积比为约4:1。
[0256] 实施例
[0257] 材料和方法
[0258] 试剂和仪器
[0259] 氧化银、碳酸钾、碘甲烷和质谱级(98％)甲酸从Sigma-Aldrich获得；HPLC级甲醇和水来自Fisher Scientific；氧化氘(99.8％)来自Acros；L-丙氨酰-L-脯氨酸来自Tokyo Chemical Industry。使用Fisher Scientific涡旋混合器进行混合，使用Sorvall Legend Micro 21R微量离心机离心1.5mL Eppendorf管。康宁实验室搅拌器用于混合化学反应。人血浆(K2-EDTA)从Bioreclamation获得并储存在-80℃。使用Argonaut SPE DRYTM 96DUAL蒸发器进行溶剂蒸发。
[0260] 色谱
[0261] Waters Acquity UPLC系统配备有二元溶剂管理器、冷藏样品管理器(设置为12℃)和柱管理器(设置为40℃)，用于带反相色谱柱的液相色谱(Waters BEH C18，1.7μm，2.1×100mm)。流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸的甲醇溶液。
对于氘交换实验，流动相A替换为0.1％甲酸的氧化氘溶液。在0％流动相B的初始条件下进行线性梯度洗脱，保持2.00分钟。然后将流动相B在0.50分钟内增加至98％并保持0.90分钟。流动相B在0.10分钟内恢复到0％，用于下一次注射的平衡。流速为350μL/min，总运行时间为4.50min。对每个样品注入5.0μL最终样品溶液的环固定等分试样。将洗脱液直接引入质谱仪的电喷雾源中。强针头洗涤是纯甲醇，而弱针头洗涤是甲醇和水的混合物(0.5：
99.5)。密封洗涤是甲醇和水的混合物(10：90)。
对于氘交换实验，流动相A替换为0.1％甲酸的氧化氘溶液。在0％流动相B的初始条件下进行线性梯度洗脱，保持2.00分钟。然后将流动相B在0.50分钟内增加至98％并保持0.90分钟。流动相B在0.10分钟内恢复到0％，用于下一次注射的平衡。流速为350μL/min，总运行时间为4.50min。对每个样品注入5.0μL最终样品溶液的环固定等分试样。将洗脱液直接引入质谱仪的电喷雾源中。强针头洗涤是纯甲醇，而弱针头洗涤是甲醇和水的混合物(0.5：
99.5)。密封洗涤是甲醇和水的混合物(10：90)。
[0262] 质谱
[0263] Thermo Scientific Orbitrap Elite质谱仪配备有加热电喷雾电离(HESI-II)探针，用于该研究的阳性模式。该仪器由Orbitrap EliteTM 2.7和XCaliburTM 2.2软件控制。加热的电喷雾源设定加热器温度为430℃，鞘气为3，辅助气体流速为12，吹扫气体为0，离子喷雾电压为4.20kV，毛细管温度为350℃，S-透镜射频水平为65％。分辨率为30000，用于收集质量范围在m/z 100和300之间的全扫描FTMS(傅里叶变换质谱)光谱。对于所有MS片段化实验，使用的分辨率为15000，以及活化Q为0.250和活化时间为10.0ms。MS2实验的归一化碰撞能量为31.0eV，隔离宽度为1.0m/z，扫描范围在m/z 60和240之间。对于m/z 229.1547/
142.0860(或氘交换为230.1610/143.0925)的MS3实验，第一和第二级片段化的归一化碰撞能量分别为31.0和25.0eV，两个级的隔离宽度为m/z 2.0，扫描范围在m/z 50和240之间。对于m/z229.1547/170.0810(或氘交换为230.1610/171.0878)的MS3实验，第一和第二级片段化的归一化碰撞能量分别为31.0和30.0eV。第一和第二级片段化的隔离宽度分别为m/z
3.0和2.0，扫描范围在m/z 50和240之间。对于m/z 229.1547/142.0860/114.0911(或氘交换为230.1610/143.0925/115.0976)的MS4实验，第一至第三级片段化的归一化碰撞能量为
31.0、20.0和20.0eV。所有三个级的隔离宽度为m/z 2.0，扫描范围在m/z 50和240之间。
142.0860(或氘交换为230.1610/143.0925)的MS3实验，第一和第二级片段化的归一化碰撞能量分别为31.0和25.0eV，两个级的隔离宽度为m/z 2.0，扫描范围在m/z 50和240之间。对于m/z229.1547/170.0810(或氘交换为230.1610/171.0878)的MS3实验，第一和第二级片段化的归一化碰撞能量分别为31.0和30.0eV。第一和第二级片段化的隔离宽度分别为m/z
3.0和2.0，扫描范围在m/z 50和240之间。对于m/z 229.1547/142.0860/114.0911(或氘交换为230.1610/143.0925/115.0976)的MS4实验，第一至第三级片段化的归一化碰撞能量为
31.0、20.0和20.0eV。所有三个级的隔离宽度为m/z 2.0，扫描范围在m/z 50和240之间。
[0264] 实施例1.N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸(TMAP)的合成
[0265] 方法1.在带有磁力搅拌棒的4mL玻璃小瓶中加入L-丙氨酰-L-脯氨酸(20.0mg，0.108mmol)、氧化银(100mg，0.432mmol)和1.0mL甲醇/水(4：1)。在室温下在磁力搅拌器上搅拌混合物并加入75μL碘甲烷(171mg，1.2mmol)。将小瓶盖上盖子，将混合物在室温下在黑暗中搅拌过夜。将所得混合物在温和的氮气流下在40℃下蒸发至干燥。将水(1.0mL)加入到残余物中，并将混合物超声处理2分钟。然后将混合物转移至1.5mL Eppendorf管中并在室温下以14000rpm离心10分钟。将澄清的上清液用0.1％甲酸水溶液稀释10000倍，并转移到样品瓶中进行LC/MS分析。为了合成N,N,N-三甲基-13C3-L-丙氨酰-L-脯氨酸(13C3-L，L-TMAP)，使用相同的合成方法，不同之处在于用碘甲烷-13C代替碘甲烷。
[0266]
[0267] 图18A和18B显示了13C标记的TMAP(13C3-L，L-TMAP)与未标记的TMAP相比的13C-NMR谱。图19A和19B显示了13C标记的TMAP(13C3-L，L-TMAP)与未标记的TMAP相比的质谱。
[0268] 方法2.在带有磁力搅拌棒的4mL玻璃小瓶中加入L-丙氨酰-L-脯氨酸(20.0mg，0.108mmol)、碳酸钾(50.0mg，0.362mmol)和1.0mL甲醇/水(4：1)。在室温下在磁力搅拌器上搅拌溶液混合物并加入75μL碘甲烷(171mg，1.2mmol)。将小瓶盖上盖子，将混合物在室温下在黑暗中搅拌过夜。将所得混合物在温和的氮气流下在40℃下蒸发至干燥。将残余物溶于
1.0mL水中。将溶液用0.1％甲酸水溶液稀释10000倍，并转移到样品瓶中进行LC/MS分析。
1.0mL水中。将溶液用0.1％甲酸水溶液稀释10000倍，并转移到样品瓶中进行LC/MS分析。
[0269] 方法3.下面介绍第三种合成方法的一般策略。具有受保护的羧基的二肽可用作起始分子。可以使用任何合适的羧基保护基团(T.W.Green，P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Wiley-Interscience，New York，1999)。在一个实施方式中，保护基团X可以是烷基，例如甲基、乙基、叔丁基或苄基。在另一个实施方式中，保护基团是甲硅烷基，例如三酰基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基)。保护基团X的去除取决于保护基团X的性质。在一个实施方式中，可以通过用酸处理去除保护基团。
[0270]
[0271] 在该一般策略的一个实例中，可以使用具有被叔丁基酯保护的羧基的二肽。甲基化反应然后去除保护基团将产生TMAP，如下所示。该方法对于更好的反应产率和更高的产物纯度可能是有利的，因为起始材料的较低极性可促进反应过程。
[0272]
[0273] 方法4.第四种合成方法的一般策略如下所示。使用N,N,N-三甲基-L-丙氨酸和具有羧基保护的L-脯氨酸作为起始分子。可以使用上述任何合适的羧基保护基团。偶联反应可以通过用活化剂活化羧基来完成。在一个实施方式中，活化剂是碳二亚胺、脲、活性酯、鏻、2-烷基-1-烷基羰基-1,2-二氢喹啉、2-烷氧基-1-烷氧基羰基-1,2-二氢喹啉或氯甲酸烷基酯。在一个具体实施方式中，活化剂是碳二亚胺，例如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或二异丙基碳二亚胺(DIC)。在另一个实施方式中，可以使用例如SOCl2、草酰氯或其它合适的试剂通过形成酰卤来活化羧基。保护基团X的去除取决于保护基团X的性质。在一个实施方式中，通过用酸处理去除保护基团。
[0274]
[0275] 在该一般策略的一个实例中，可以使用N,N,N-三甲基-L-丙氨酸和具有被叔丁基酯保护的羧基的L-脯氨酸。N,N,N-三甲基-L-丙氨酸和羧基保护的L-脯氨酸的偶联可以通过EDC或上述任何其它合适的活化剂来完成。去除保护基团将产生TMAP。
[0276]
[0277] 方法5.在另一个实例中，起始材料可以是N-甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸(R1＝H且R2＝CH3)或N,N-二甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸(R1＝R2＝CH3)，可以使用方法1中描述的反应条件。
[0278]
[0279] 实施例2.血浆代谢物化合物A的结构说明
[0280] 样品制备
[0281] 在1.5mL Eppendorf管中加入100μL人血浆(在冰上解冻)和500μL甲醇。将混合物涡旋2分钟并在室温下以14000rpm离心5分钟。将上清液转移到新管中并在温和的氮气流下在40℃下干燥。向残余物中加入200μL含0.1％甲酸的水，将混合物涡旋1分钟并在室温下以14000rpm离心10分钟。然后将上清液转移到样品瓶中用于LC/MS分析。
[0282] 结构阐释
[0283] Orbitrap Elite质谱仪用于获取高分辨率质谱。通过精确质量测量，将质子化假分子离子的分子式先确定为C11H21O3N2+。目前的研究通过优化色谱条件开始，以实现代谢物化合物A的更长保留时间(1.48分钟)，而不太强调其峰形状，如提取离子色谱图所示(图1)。假分子离子的碰撞诱导解离(CID)产生如图2所示的七个子离子，其是m/z 170、142、126、
124、114.09、114.05和70(均以精确质量收集，但为简单起见在下文中省略)。在Q-Exactive质谱仪上先收集的代谢物的产物离子光谱(MS2)显示了m/z 96和58的另外两个子离子(图
3)。主要离子m/z 142的进一步片段化(MS3，图4)产生m/z 70，114.09和m/z 96离子，其在
2
Orbitrap CID MS光谱中未检测到。m/z 114.05离子未从m/z 142的片段化中检测到，而是通过m/z 170的片段化形成(MS3，图5)。当m/z 114.09进一步片段化时检测到m/z 70离子(MS4，图6)。
124、114.09、114.05和70(均以精确质量收集，但为简单起见在下文中省略)。在Q-Exactive质谱仪上先收集的代谢物的产物离子光谱(MS2)显示了m/z 96和58的另外两个子离子(图
3)。主要离子m/z 142的进一步片段化(MS3，图4)产生m/z 70，114.09和m/z 96离子，其在
2
Orbitrap CID MS光谱中未检测到。m/z 114.05离子未从m/z 142的片段化中检测到，而是通过m/z 170的片段化形成(MS3，图5)。当m/z 114.09进一步片段化时检测到m/z 70离子(MS4，图6)。
[0284] 这些片段及其形成途径的合理化允许化合物A的化学结构提议如下所示：
[0285]
[0286] 对化合物A进行立体化学分析，确定该式由以下结构表示：
[0287]
[0288] 如方案1中所示，提出了来自化合物A的质子化假分子离子的可能片段化途径。
[0289] 方案1.可能的片段化途径
[0290]
[0291] 氘交换的结构验证
[0292] 提出的化合物A结构首先通过氘交换实验验证。简而言之，将色谱的流动相改变为氘化溶剂并再次分析血浆提取物。获得全扫描质谱，并且检测到新的m/z 230.16079离子(离C11H20DN2O3+的计算值为-0.7ppm)作为氘化化合物A的主要物质(图7)，与所提出结构的单个可交换质子一致。m/z 230离子的产物离子光谱(MS2)和相应的m/z 143离子的MS3光谱示于图8和9中。在171、143、127、115.09、115.06和71处检测到相应的氘化片段，而124和96的片段保持不变。所有这些离子可以令人满意地合理化为最初提出的片段化途径(参见方案2)，为所提出的化合物A结构的有效性提供了令人信服的证据。
[0293] 方案2.氘化类似物的可能片段化途径。
[0294]
[0295] 通过与合成标准的直接比较进一步证实了所提出的结构(参见实施例1)。通过方法1和方法2制备的合成TMAP分别在1.44分钟时产生洗脱物，分子离子为m/z 229.15415(计算值为-2.3ppm)和229.15403(计算值为-2.8ppm)。选择通过方法1制备的产物用于进一步与化合物A比较。
[0296] 合成TMAP(图10中的中图)的保留时间与化合物A(上图)的保留时间完全匹配，因为它们在色谱条件下共洗脱(下图)。作为意外的奖励，合成TMAP的特征峰拖尾也与化合物A2
的特征峰拖尾相似。合成TMAP的产物离子谱(MS)与化合物A的片段及其相对强度的一致性非常好(图11)。合成TMAP的142和170子离子的进一步片段化产生MS3光谱，其分别与图12和
13中并排比较的化合物A基本相同。m/z 114离子上的合成TMAP的MS4光谱显示了m/z 70片段，与化合物A的片段一致(图14)。此外，在氘交换后分析合成TMAP，并且得到的MS、MS2和MS3光谱也非常好地匹配化合物A的光谱，如图15-17所示。所有这些色谱和MS光谱数据都有力地支持化合物A是TMAP。
的特征峰拖尾相似。合成TMAP的产物离子谱(MS)与化合物A的片段及其相对强度的一致性非常好(图11)。合成TMAP的142和170子离子的进一步片段化产生MS3光谱，其分别与图12和
13中并排比较的化合物A基本相同。m/z 114离子上的合成TMAP的MS4光谱显示了m/z 70片段，与化合物A的片段一致(图14)。此外，在氘交换后分析合成TMAP，并且得到的MS、MS2和MS3光谱也非常好地匹配化合物A的光谱，如图15-17所示。所有这些色谱和MS光谱数据都有力地支持化合物A是TMAP。
[0297] 实施例3.化合物A作为肾功能的生物标记物
[0298] 通过分析来自健康和患病个体的大量血浆和血清样品进行了广泛的研究(参见WO2014/186311)。结果显示化合物A的血清水平与肾小球滤过率(GFR)相关，具有统计学显著性(参见例如WO 2014/186311中的表1、2和4)，特别是在具有中等eGFR的患者中。对于具有中等eGFR的患者，使用传统诊断方法评估肾功能的和诊断CKD是不确定的。
[0299] TMAP与CKD-EPIcr eGFR的相关性为-0.648，与MDRDcr eGFR的相关性为-0.582。血清肌酸酐与CKD-EPIcr eGFR的相关性为-0.673，与MDRDcr eGFR的相关性为-0.632。
[0300] 实施例4.化合物A的LC-MS/MS测量
[0301] 进行反相液相色谱以测量化合物A。使用配备有二元溶剂管理器、冷藏样品管理器(设定在12℃)和柱管理器(设定在40℃)的Waters Acquity UPLC系统用于使用反相色谱柱(Waters ACQUITY BEHC18，1.7μm，2.1×100mm)进行液体色谱。流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸的甲醇溶液。在0％流动相B的初始条件下进行线性梯度洗脱，保持2.00分钟。然后将流动相B在0.50分钟内增加至98％并保持0.90分钟。流动相B在0.10分钟内恢复到0％，用于下一次注射的平衡。流速为350μL/min，总运行时间为4.50min。对每个样品注入5.0μL最终样品溶液的环固定等分试样。将洗脱液直接引入质谱仪的电喷雾源中。强针头洗涤是纯甲醇，弱针头洗涤是甲醇和水的混合物(0.5：99.5)。密封洗涤是甲醇和水的混合物(10：90)。
[0302] 使用配备有加热电喷雾电离(HESI-II)探针操作正模式的Thermo Scientific Orbitrap Elite质谱仪进行质谱分析。该仪器由Orbitrap EliteTM 2.7和XCaliburTM 2.2软件控制。加热的电喷雾源设定加热器温度为430℃，鞘气为3，辅助气体流速为12，吹扫气体为0，离子喷雾电压为4.20kV，毛细管温度为350℃，S-透镜射频水平为65％。分辨率为30000，用于收集质量范围在m/z 100和300之间的全扫描FTMS(傅里叶变换质谱)光谱。对于所有MS片段化实验，使用的分辨率为15000，以及活化Q为0.250和活化时间为10.0ms。母离子MS2实验的归一化碰撞能量为31.0eV，隔离宽度为1.0m/z，扫描范围在m/z 60和240之间。
对于m/z 229.1547/142.0860的MS3实验，第一和第二级片段化的归一化碰撞能量分别为
31.0和25.0eV，两个级的隔离宽度为m/z 2.0，扫描范围在m/z 50和240之间。对于m/z
229.1547/170.0810的MS3实验，第一和第二级片段化的归一化碰撞能量分别为31.0和
30.0eV。第一和第二级片段化的隔离宽度分别为m/z 3.0和2.0，扫描范围在m/z 50和240之间。对于m/z 229.1547/142.0860/114.0911的MS4实验，第一至第三级片段化的归一化碰撞能量为31.0、20.0和20.0eV。所有三个级的隔离宽度为m/z2.0，扫描范围在m/z 50和240之间。
对于m/z 229.1547/142.0860的MS3实验，第一和第二级片段化的归一化碰撞能量分别为
31.0和25.0eV，两个级的隔离宽度为m/z 2.0，扫描范围在m/z 50和240之间。对于m/z
229.1547/170.0810的MS3实验，第一和第二级片段化的归一化碰撞能量分别为31.0和
30.0eV。第一和第二级片段化的隔离宽度分别为m/z 3.0和2.0，扫描范围在m/z 50和240之间。对于m/z 229.1547/142.0860/114.0911的MS4实验，第一至第三级片段化的归一化碰撞能量为31.0、20.0和20.0eV。所有三个级的隔离宽度为m/z2.0，扫描范围在m/z 50和240之间。
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