氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒在制备肿瘤血管阻
断剂中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 目前癌症已经成为继心
血管疾病之后，威胁人类生存健康的第二大杀手。肿瘤的生长和转移都依赖血管网的存在，肿瘤血管是癌细胞的营养通道和转移途径。通过选择性破坏已形成的肿瘤血管网快速切断肿瘤血供，诱发肿瘤细胞发生缺血
坏死，是一种切实有效的抑制肿瘤生长，阻止转移的方法，这个概念由Juliana Denekamp于1982年提出，相应的药物称为血管阻断剂(Vascular disrupting agents，VDAs)。其它任何直接攻击肿瘤细胞的方法，在很大程度上只能暂时缓解病情，复发很难避免，这也是目前手术、
放化疗的局限所在。
[0003] 现代医学证明，正常血管需要一年时间才能够长成，是由内膜、中膜和外膜构成的三层密实结构，而肿瘤血管只用4天即可形成，结构上为由内皮细胞构成的
单层薄膜。而由于构成肿瘤血管的内皮细胞间隙较大、结构不完整，导致肿瘤血管通常包含有大量纳米尺度的小孔，使小分子和一些纳米颗粒能够透孔而出。肿瘤血管阻断剂正是利用了肿瘤血管和正常血管的差异，目前有
抗体和小分子两类。例如，3G4抗体Tarvacin通过结合肿瘤血管内皮细胞的磷脂酰丝氨酸杀伤胰腺癌细胞。小分子血管阻断剂又分为微管解聚物和黄
酮两类药物，微管解聚物通过结合血管内皮细胞微管蛋白β亚基的秋水仙
碱结合位点，导致微管解聚、肌动蛋白和微管蛋白分离，进而破坏血管内皮细胞骨架。秋水仙碱和鬼臼毒素就是经典的微管解聚药物。
[0004] 由于肿瘤血管较正常组织血管有很大不同，肿瘤血管的内皮细胞间隙较大、结构不完整，导致肿瘤血管通常包含有大量纳米尺度的小孔，由于肿瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)，纳米颗粒能嵌入这些小孔破坏肿瘤血管，从而导入肿瘤内部大量出血，切断了肿瘤组织的营养供应，进而抑制了肿瘤的生长。血管阻断剂已经成为目前肿瘤血管靶向
治疗领域的研究热点之一，随着科学研究的不断发展，其必将进入临床应用，成为肿瘤治疗的突破性技术。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒在制备肿瘤血管阻断剂中的应用，本发明氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒应用于制备肿瘤血管阻断剂中，其制备的肿瘤血管阻断剂生物安全性更高，对正常
生物组织无毒
副作用，用于治疗的效果好。
[0006] 本发明提供的氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒在制备肿瘤血管阻断剂中的应用；
[0007] 所述氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒的结构通式为metallofullerene-(OH)x(Amino Acid)y；
[0008] 其中，metallofullerene为金属富勒烯；
[0009] 0≤x<50；0≤y<20；
[0010] Amino Acid为水溶性氨基酸。
[0011] 上述的应用中，所述金属富勒烯包括；M@C2n、M2@C2n、MA@C2n、M3N@C2n、M2C2@C2n、M2S@C2n、M2O@C2n和MmA3-mN@C2n中的至少一种；其中，M、A均为金属元素，所述M、A均选自Sc、Y和镧系金属元素中的至少一种，30≤n≤60，0≤m≤3，且n、m均为整数；
[0012] 所述水溶性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸和天
门氨酸中的至少一种。
[0013] 本发明中，镧系金属元素为镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)；
[0014] 所述
稀土金属具体可为Gd，所述金属富勒烯具体可为Gd@C82、Gd3N@C80。
[0015] 上述的应用中，所述纳米颗粒的水合直径可为1～1000nm，具体可为100-150nm。
[0016] 上述的应用中，制备所述氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒包括如下步骤：将所述水溶性氨基酸的碱溶液与金属富勒烯混合，进行亲核加成反应，即得到所述氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒；
[0017] 所述水溶性氨基酸的碱溶液中碱的
质量分数可为10～50％，具体可为14％、10～14％、14～50％或11～25％；所述碱具体可为氢
氧化钠；
[0018] 所述水溶性氨基酸与所述金属富勒烯的摩尔比可为1～100：1。
[0019] 上述的应用中，所述亲核加成反应的
温度可为50～100℃，具体可为50℃；所述亲核加成反应的时间可为1～30h，具体可为1.5h、1～1.5h、1.5～7h或1～5h；
[0020] 所述制备方法中，在所述亲核加成反应之后还包括过滤除去杂质的步骤。
[0021] 本发明还提供了一种肿瘤血管阻断剂，该肿瘤血管阻断剂的活性成分为所述氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒。
[0022] 上述的肿瘤血管阻断剂中，所述肿瘤血管阻断剂的剂型为药学可接受的剂型。
[0023] 上述的肿瘤血管阻断剂中，当所述肿瘤血管阻断剂的剂型为注射剂时，其
溶剂为水、生理盐水、PBS缓冲液和Tris-HCl溶液中的至少一种；所述生理盐水的浓度具体可为0.85～0.90％；PBS缓冲液的浓度具体可为0.01～0.1mol/L，PBS缓冲液组成的组分具体可为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl；Tris-HCl溶液的浓度具体可为0.05mol/L；
[0024] 所述水溶性氨基酸修饰的金属富勒烯
纳米材料的浓度可为0.5～10mmol/L，具体可为1mmol/L、0.5～1mmol/L、1～10mmol/L或0.5～5mmol/L。
[0025] 本发明进一步提供了一种高效阻断肿瘤血管的肿瘤治疗方法，包括如下步骤：1)向患肿瘤生物体给予有效剂量的所述肿瘤血管阻断剂；
[0026] 2)用与所述水溶性氨基酸富勒烯纳米材料相匹配的
辐射能量源对所述患肿瘤生物体的肿瘤部位进行射频辐照。
[0027] 上述的肿瘤治疗方法中，所述肿瘤为肝癌、
肺癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、
乳腺癌、卵巢癌、
前列腺癌、食管癌、胃癌、
口腔癌、鼻癌、喉癌、胆管癌、
宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、脑膜瘤、
皮肤癌、黑色素瘤和肉瘤中的至少一种；
[0028] 所述肿瘤血管阻断剂的
给药量可为1mg/kg～100mg/kg，具体可为2mg/kg；具体的所述患肿瘤生物体总给药量按照所述荷瘤生物体的体重进行换算；
[0029] 所述药物的给药方式采用静脉注射、
腹腔注射、口服和局部给药中的至少一种；
[0030] 所述射频辐照的
频率可为1～1000MHz，具体可为200MHz、1～200MHz、200～1000MHz或50～500MHz，发射功率为1mW～10kW，具体可为5mW、1mW～5mW、5mW～10kW或1mW～
100mW，所述辐照的时间可为10min～2h，具体可为30min、10min～30min、30min～2h或20min～1h；
[0031] 所述患肿瘤生物体为
哺乳动物；具体可为人、鼠、兔、猪、猴和狗中的至少一种。
[0032] 本发明中，所述有效剂量是指当通过本发明的方法给予所述药物时，足以有效传递用于治疗肿瘤的活性成分的量。
[0033] 本发明中，注射所述药物在0～1h后进行所述辐照；具体可为10min～2h。
[0034] 本发明在抗肿瘤治疗中，通过将药物注射入生物体后，通过血液循环到达肿瘤部位，随后施加射频辐照，使肿瘤部位的纳米颗粒在血管中发挥作用，达到快速治疗肿瘤的目的；由于肿瘤血管较正常组织血管有很大不同，肿瘤血管的内皮细胞间隙较大、结构不完整，导致肿瘤血管通常包含有大量纳米尺度的小孔，由于肿瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)，金属富勒烯纳米颗粒能嵌入这些小孔破坏肿瘤血管，阻断血流，切断了肿瘤组织的营养供应，进而抑制了肿瘤的生长。
[0035] 本发明还提供了一种高效阻断肿瘤血管的肿瘤的套装，该套装包括所述肿瘤血管阻断剂和产生辐射能量源的设备。
[0036] 上述的套装中，所述产生辐射能量源的设备发射的频率为所使用的射频源辐照的频率可为1～1000MHz，发射功率可为1mW-10kW，生物体吸收的辐照的功率可为1～1000mW，射频辐照源可为脉冲模式。
[0037] 本发明具有以下优点：
[0038] 1、本发明借助穿透性很强的射频作用，不受肿瘤在生物体分布的限制，即可治疗生物体表附近的肿瘤，也可治疗生物体深部器官或组织的肿瘤。
[0039] 2、本发明针对肿瘤血管和正常血管的差异，特异性阻断肿瘤血管治疗肿瘤，从而具有广谱性。
[0040] 3、本发明中氨基酸修饰的金属富勒烯
碳笼完整性更强，生物安全性更高，对正常生物组织无毒副作用。
[0041] 4、与目前临床普遍使用的环磷酰胺、紫杉醇等比较，本发明肿瘤血管阻断剂给药剂量小，毒性低，单次治疗就能达到高抑瘤率；相比于同类金属富勒醇药物，本发明肿瘤血管阻断剂在其
基础上更加降低了给药剂量，以及给药后射频照射时间更短，治疗速度更快，疗效高。
附图说明
[0042] 图1、本发明
实施例1中制备得到的Gd@C82(OH)13(NHCH2CH2COOH)6(简写为GF-Ala)热重分析及微商热重分析曲线。
[0043] 图2、本发明实施例2水溶性羟基修饰的Gd@C82纳米颗粒(简写为GF-OH)的热重分析及微商热重分析曲线。
[0044] 图3、GF-Ala及GF-OH两种药物的磁化曲线及磁化强度-温度曲线。
[0045] 图4、GF-Ala及GF-OH两种药物的高分辨
原子力显微镜图片。
[0046] 图5、GF-Ala及GF-OH两种药物的
荧光猝灭拟合曲线，由此计算可得两种药物的蛋白结合率，其中F0是不加富勒烯时蛋白的荧光，F是加富勒烯后蛋白的荧光，Q是富勒烯浓度。
[0047] 图6、GF-Ala及GF-OH两种药物在pH＝7时的平均水合半径和Zeta电势比较。
[0048] 图7、本发明实施例2中GF-Ala药物在治疗前、治疗后及治疗后24h的
磁共振成像图片。
[0049] 图8、本发明实施例2中两种药物的抑瘤率比较，在长期观察12天期间，小鼠肿瘤在不同时间点的肿瘤状态变化，以及12天后小鼠的肿瘤体积和重量对比。
[0050] 图9、本发明实施例2中两种药物在治疗后24h后肿瘤血管的环境扫描照片(其中a为GF-Ala加射频，b为a的局部放大图，c为GF-OH加射频，d为GF-Ala不加射频，e为生理盐水加射频，f为只注射生理盐水)。
具体实施方式
[0051] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0052] 下述实施例中所用的材料、
试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053] 下述实施例中，水溶性羟基修饰的Gd@C82纳米颗粒，结构简式为Gd@C82(OH)26(简写为GF-OH)，其制备方法参照文献Carbon，2013,65,175。
[0054] 实施例1、金属富勒烯丙氨酸纳米颗粒Gd@C82(OH)13(NHCH2CH2COOH)6的制备[0055] 把约10mg Gd@C82固体加入10ml单口瓶中，加入6ml NaOH质量分数为14％的β-丙氨酸碱溶液(β-丙氨酸与NaOH的摩尔比为1:2)，50℃下剧烈搅拌1.5h，黑色固体逐渐溶解生成棕黑色溶液。过滤除去未反应的少量固体粉末，滤液使用Mw＝3500
透析袋透析除去小分子杂质，使用220nm微孔滤
膜过滤后得到的棕黑色溶液即为本发明的氨基酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒Gd@C82(OH)13(NHCH2CH2COOH)6(又称为β-丙氨酸修饰的金属富勒烯纳米颗粒，结构简式为Gd@C82(OH)13(NHCH2CH2COOH)6，简写为GF-Ala)。
[0056] 表1β-丙氨酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒元素分析结果
[0057]
[0058] 对本发明β-丙氨酸修饰的金属富勒烯水溶性纳米颗粒进行元素分析所得碳、氮、氢元素比，如表1所示。由表1可知，根据热重曲线分析可以得出原固体粉末中含11.5％的水，经过计算约为13个H2O分子，再结合元素分析，进一步推测得到该物质的平均分子式为Gd@C82(OH)13(NHCH2CH2COOH)6。
[0059] 如图1所示为Gd@C82(OH)13(NHCH2CH2COOH)6(简写为GF-Ala)热重分析及微商热重分析曲线，经计算固体中含11.5％的水份，结合元素分析中C、H、N含量可推测平均分子式为Gd@C82(OH)13(NHCH2CH2COOH)6。
[0060] 由图6和表2可知，本发明Gd@C82(OH)13(NHCH2CH2COOH)6在pH＝7的水中平均粒径为127.7nm，Zeta电势为-44.7mV。
[0061] 表2纳米颗粒在pH＝7的水中的平均粒径及Z电势
[0062]
[0063] 实施例2、β-丙氨酸修饰的金属富勒烯纳米颗粒在射频作用下肿瘤治疗及效果对比
[0064] 1、建立荷瘤鼠动物模型：
[0065] 选取5周周龄体重在16.0～20.0g的雌性BALB/c小鼠，皮下接种100μL浓度为5×107/ml的H22肝癌细胞。生长约5-7天后，肿瘤尺寸达到50-100mm3进行实验。
[0066] 2、肿瘤治疗及不同药物效果对比实验
[0067] 对比药物：水溶性羟基修饰的Gd@C82纳米颗粒，其表面修饰了大量的羟基基团，如图2所示为其热重分析TGA及DTG曲线，结合元素分析C、H、N含量(C 36.95％，H 2.36％，N<0.3％)推测其平均分子式为Gd@C82(OH)26。
[0068] 通过尾静脉注射β-丙氨酸衍生化GF-Ala和羟基化GF-OH这两种药物(浓度为1mmol/L，2mg/kg)于荷瘤鼠体内，随后施加射频(200MHz，5mW)治疗30min。分别采集治疗前、治疗后和治疗后24h的T2磁共振成像，并长期观察两种药物的抑瘤效果。设置三个对照组，分别为只注射生理盐水(Saline)、注射生理盐水和施加射频(Saline+RF)，只注射β-丙氨酸修饰的金属富勒烯药物(GF-Ala)。
[0069] 由图3可知，经测试计算本发明金属富勒烯氨基酸纳米颗粒的有效磁矩为8.9μ，高于同类金属富勒醇8.5μ；由图4可知，同时改变碳笼表面修饰的官能团或分子，改善了纳米颗粒的分散性和均一性，有利于药物的
稳定性；其次其与体内蛋白等的
亲和性也因表面修饰的不同而发生了变化，根据荧光猝灭机理，按照F0/(F0-F)＝1/faKa[Q]+1/fa计算药物与蛋白的结合常数，如图5所示，得到本发明金属富勒烯氨基酸纳米颗粒与蛋白的结合常数为0.98×105L·mol-1，同类金属富勒醇仅为0.13×105L·mol-1。由上述实验证明，使用本发明所的氨基酸修饰的金属富勒烯纳米颗粒GF-Ala相比于同类金属富勒醇GF-OH在肿瘤治疗中的效果更为优异。具体表现为丙氨基酸修饰的金属富勒烯纳米颗粒GF-(Ala)是羟基修饰的金属富勒烯纳米颗粒GF-(OH)的使用剂量的1/5～1/10，可能的原因是改变了金属富勒烯水溶化制备方法，反应条件更为温和，碳笼表面修饰的官能团或小分子更少，碳笼的完整性更强，使得金属富勒烯纳米颗粒的
磁性更强。
[0070] 图7所示为本发明GF-Ala药物在治疗前、治疗后及治疗后24h时肿瘤部位的T2磁共振成像状况。从图7中可以看出，治疗后肿瘤中心区域出现大面积坏死情况，在成像上表现为变黑，治疗后24h坏死比例大幅度提高。
[0071] 图8为本发明GF-Ala药物与GF-OH药物在同等剂量下长期抑瘤率的比较。本发明GF-Ala药物治疗后肿瘤组织呈现明显的坏死变黑现象，经过12天的连续观察，肿瘤部位几乎结痂脱落；而GF-OH药物相比于对照组表现出一定的治疗效果，其治疗后12天时肿瘤体积和重量约为本发明GF-Ala药物的两倍。
[0072] 图9为本发明GF-Ala药物、GF-OH药物及对照组在治疗后24h时肿瘤血管的环境扫描照片。从图中可以观察到本发明GF-Ala药物在射频
辅助治疗后肿瘤血管内皮细胞出现大范围的脱落，露出血管基膜，说明本发明GF-Ala药物可以快速靶向摧毁肿瘤血管，切断肿瘤部位的营养供应。而GF-OH药物内皮细胞脱落较少，在同等剂量下对肿瘤血管的攻击力不如本发明GF-Ala药物。
