用于治疗神经元障碍的纳米粒子
阅读：62发布：2020-07-08
专利汇可以提供用于治疗神经元障碍的纳米粒子专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及医学领域，特别涉及神经系统障碍的 治疗 。更具体而言，本发明涉及一种 纳米粒子 或纳米粒子聚集体，其在该纳米粒子或纳米粒子聚集体暴露于 电场 时用于 预防 或治疗对象的神经系统 疾病 或其至少一种症状，其中该纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料选自导体材料、 半导体 材料、 介电常数 (εijk)等于或高于200的绝缘体材料、和介电常数(εijk)等于或低于100的绝缘体材料。它还涉及包含这样的纳米粒子和/或纳米粒子聚集体的组合物和 试剂 盒 以及其用途。，下面是用于治疗神经元障碍的纳米粒子专利的具体信息内容。
1.一种纳米粒子或纳米粒子聚集体，其在所述纳米粒子或纳米粒子聚集体暴露于电场时用于预防或治疗对象的神经系统疾病或其至少一种症状，其中所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料选自导体材料、半导体材料、介电常数εijk等于或高于200的绝缘体材料、和介电常数εijk等于或低于100的绝缘体材料。
2.根据权利要求1所述的供使用的纳米粒子或纳米粒子聚集体，其中所述电场通过深脑刺激、经颅电刺激或经颅磁刺激来施加。
3.根据权利要求1或2所述的供使用的纳米粒子或纳米粒子聚集体，其中所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料是导体材料，所述导体材料选自标准还原电位E°高于0.2的金属和在其结构中具有邻接的sp2杂化碳中心的有机材料。
4.根据权利要求3所述的供使用的纳米粒子或纳米粒子聚集体，其中所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料选自金属纳米粒子，其中所述金属元素是Ir、Pd、Pt、Au或其混合物，以及由聚苯胺、聚吡咯、聚乙炔、聚噻吩、聚咔唑和/或聚芘组成的有机纳米粒子。
5.根据权利要求1或2所述的供使用的纳米粒子或纳米粒子聚集体，其中所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料是带隙Eg低于3.0eV的半导体材料。
6.根据权利要求5所述的供使用的纳米粒子或纳米粒子聚集体，其中所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料由门捷列夫周期表的IVA族元素组成，或者是门捷列夫周期表的III和V族元素的混合组合物，或者是门捷列夫周期表的II和VI族元素的混合组合物。
7.根据权利要求6所述的供使用的纳米粒子或纳米粒子聚集体，其中所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料由门捷列夫周期表的IVA族元素组成并掺杂有选自Al、B、Ga、In和P的电荷载体。
8.根据权利要求1或2所述的供使用的纳米粒子或纳米粒子聚集体，其中所述材料是带隙Eg等于或高于3.0eV的绝缘体材料并且所述相对介电常数εijk在20℃和30℃之间以及在
102Hz直至红外频率之间测量。
9.根据权利要求8所述的供使用的纳米粒子或纳米粒子聚集体，其中所述材料是带隙Eg等于或高于3.0eV的绝缘体材料并且所述相对介电常数εijk等于或高于200，并且所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料是介电材料，所述介电材料是选自BaTiO3、KTaNbO3、KTaO3、SrTiO3和BaSrTiO3的混合金属氧化物。
10.根据权利要求8所述的供使用的纳米粒子或纳米粒子聚集体，其中所述材料是带隙Eg等于或高于3.0eV的绝缘体材料并且所述相对介电常数εijk等于或低于100，并且所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料是介电材料，所述介电材料选自金属氧化物；混合金属氧化物，其金属元素来自门捷列夫周期表的第3、5或6周期或者是镧系元素；和碳材料。
11.根据权利要求1至10任一项所述的供使用的纳米粒子，其中所述神经系统疾病选自帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、癫痫、强迫症、自闭症谱系障碍、抑郁症、肌张力障碍、Tourette综合征、精神分裂症、中风、失语症、痴呆、耳鸣、亨廷顿氏病、特发性震颤、双相障碍、焦虑症、成瘾症、意识植物状态及其至少一种症状。
12.一种用于预防或治疗暴露于电场的对象的神经系统疾病或其至少一种症状的组合物，其中所述组合物包含纳米粒子和/或纳米粒子聚集体和可药用的载体，并且其中所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料选自导体材料、半导体材料、介电常数εijk等于或高于200的绝缘体材料、和介电常数εijk等于或低于100的绝缘体材料。
13.根据权利要求12所述的供使用的组合物，其中所述组合物包含至少两种不同的纳米粒子和/或纳米粒子聚集体，每种纳米粒子或纳米粒子聚集体由不同材料组成，所述材料选自导体材料、半导体材料、介电常数εijk等于或高于200的绝缘体材料、和介电常数εijk等于或低于100的绝缘体材料。
14.一种试剂盒，其包含至少两种不同的纳米粒子和/或纳米粒子聚集体，每种纳米粒子或纳米粒子聚集体由不同材料组成，所述材料选自导体材料、半导体材料、介电常数εijk等于或高于200的绝缘体材料、和介电常数εijk等于或低于100的绝缘体材料。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其用于预防或治疗对象的神经系统疾病或其至少一种症状。
用于治疗神经元障碍的纳米粒子
[0001] 本发明涉及医学领域，特别涉及神经系统障碍的治疗。更具体地，本发明涉及一种纳米粒子或纳米粒子聚集体，其在所述纳米粒子或纳米粒子聚集体暴露于电场/刺激时用于预防或治疗对象的神经系统疾病或其至少一种症状，其中所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料选自导体材料、半导体材料、介电常数εijk等于或高于200的绝缘体材料、和介电常数εijk等于或低于100的绝缘体材料。它还涉及包含这样的纳米粒子和/或纳米粒子聚集体的组合物和试剂盒以及其用途。
背景技术
[0002] 神经系统障碍是一个重大的健康问题(神经系统障碍对公共卫生的挑战(Neurological disorders public health challenges).WHO，2006)。神经网络功能的受损可以有不同的起源。帕金森氏病(Parkinson's disease)是由位于中脑的黑质中的多巴胺神经元死亡引起的运动障碍。中风对应于脑血液供应的阻断。在没有氧的情况下，受影响的区域中的神经元死亡，而由那些细胞控制的身体部分也无法发挥功能。亨廷顿氏病(Huntington's disease)是一种遗传障碍。癫痫是由各个脑区中大批神经元的异常兴奋引起的障碍。阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)是一种神经变性障碍，以海马、大脑皮质和其他脑区中的神经元死亡为特征。自闭症谱系障碍的原因是多因素的：遗传，环境等。
[0003] 神经系统障碍可以根据影响患者的主要症状进行分类。观察到三种主要类型的症状：运动障碍、精神(情绪/社交)障碍和认知障碍，如下文进一步解释的。
[0004] 运动障碍包括震颤、运动功能减退例如运动迟缓或运动异常、肌肉扭曲、僵硬、姿势不稳、步态冻结等。表现出运动障碍的疾病通常包括帕金森氏病、肌张力障碍、癫痫、亨廷顿氏病和Tourette综合征。
[0005] 精神障碍构成了表现出情绪/社交障碍症状的各种疾病。一个非详尽的清单包括自闭症谱系障碍、精神分裂症、双相障碍、抑郁症、焦虑症、强迫症、物质相关和/或成瘾性障碍(定义来自《心智障碍诊断和统计手册》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)，2013，第五版，美国精神病学会(the American Psychiatric Association))。一些患有运动障碍如帕金森氏病和肌张力障碍的患者可在疾病后期发展为精神障碍。
[0006] 许多(即便不是全部的话)心智障碍(例如，精神分裂症、双相障碍)中都存在认知障碍。只有核心特征是认知的障碍才被包括在认知障碍类别中。认知障碍影响患者的日常生活：简单的任务实现起来变得复杂。痴呆是一种代表性的认知障碍，它是严重到足以干扰日常生活的心智能力下降的上位术语。阿尔茨海默氏病是一种特殊类型的痴呆，有神经变性的一面。
[0007] 在可能的情况下，用调节脑中神经递质水平并控制与其特异性神经递质受体的相互作用的药物来治疗神经系统障碍。所涉及的主要神经递质是：谷氨酸，γ-氨基丁酸(GABA)，多巴胺，和乙酰胆碱。谷氨酸和GABA神经递质特别令人感兴趣，因为它们分别在增加(Platt等人，The Veterinary Journal，2007，173，278-286：谷氨酸在中枢神经系统健康和疾病中的作用–综述(The role of glutamate in central nervous system health and disease–a review))和降低神经元兴奋性中起主要作用(Holmes等人，Mental Retardation and Developmental Disabilities，1995，1，208-219：谷氨酸和GABA在癫痫病理生理学中的作用(Role of glutamate and GABA in the pathophysiology of epilepsy))。多巴胺参与若干脑功能：经由基底神经节控制运动(基底神经节中不合适的多巴胺水平导致不受控制的运动)，快乐奖励寻求行为(失调可能导致功能失常的成瘾)，认知(额叶中多巴胺紊乱可能导致神经认知功能下降)，等等(Alcaro等人，Brain Res.Rev.，2007，56(2)，283-321：中脑边缘多巴胺能系统的行为功能：情感神经行为学观点(Behavioral functions of the mesolimbic dopaminergic system:an affective neuroethological perspective))。乙酰胆碱是在中枢神经系统水平下参与学习和记忆的一种神经递质(Hasselmo等人，Curr Opin Neurobiol，2006，16(6)，710-715：乙酰胆碱在学习和记忆中的作用(The role of acetylcholine in learning and memory))。
[0008] 减轻帕金森氏病的运动症状的常用药物是左旋多巴，它在脑中转变为多巴胺并通过这种方式帮助平衡多巴胺不足。左旋多巴与卡比多巴联合，这有助于避免全身中左旋多巴转变为多巴胺。左旋多巴治疗的一个问题是“开-关”现象，其导致与抑郁相关的不动和丧失能力的阶段与欢欣的缓和阶段交替(Lees等人，J Neurology Neurosurgery Psychiatry，特别增补刊，1989，29-37：开-关现象(The on-off phenomenon))。晚期帕金森氏病患者对该治疗的无反应性是一个问题(Fabbri等人，《帕金森病及相关障碍》(Parkinsonism and related disorders)，2016：晚期帕金森病患者对左旋多巴仍有反应吗？(Do patients with late-stage Parkinson’s disease still respond to levodopa？))。在精神分裂症中治疗神经精神障碍症状如“阳性”症状、错觉和幻觉的其他常见药物是抗精神病药物。
[0009] 然而，用药物治疗性治疗神经系统障碍症状是非特异性的，因此，它们可能引起严重的不良事件。另外，可能出现对使用过的药物的不应性。
[0010] 随着对神经科学的理解进步，脑可以被认为是一个电网络，通过它的电线——神经元编码和传输信息。神经元之间的连接性是简单，同时又复杂的：简单是因为它在于神经元内部离子的流入/流出，产生动作电位(或电活动的“峰电位”)；复杂是因为脑网络由数千亿计的神经元构成，其形成节点、集线器和模块，以各种空间和时间尺度展示协调的相互作用(Fornito等人，Nature Reviews Neuroscience，2015，16，159-172：脑障碍的连接组学(The connectomics of brain disorders))。神经通信取决于连接各个神经元的解剖学组成部分(结构)和传递信息的过程(功能)。这两个方面影响神经系统的整体性能。脑电活动模式的振荡有损于神经元相互作用，该振荡通常可通过脑电图(EEG)来测量。观察到不同的振荡频段：δ，θ，α，β，γ(Ward等人，Trends in Cognitive Sciences，2003，7(12)，553-559：同步神经振荡和认知过程(Synchronous neural oscillations and cognitive
processes))。在结构上，脑最醒目的神经解剖学特征是神经元之间丰富的连接性，其反映了神经通信的重要性。一个脑区与另一个脑区之间的振荡的同步化(“同步”)似乎通过引入空间-时间协调而构成信息编码的最后一级[第一级(神经元)：动作电位；第二级(神经元网络)：神经元振荡](Engel等人，Nature Reviews Neuroscience，2001，2，704-716：动态预测：自上而下处理中的振荡和同步(Dynamic predictions:oscillations and synchrony in top-down processing))。重要的是，出现的证据表明，在空间和时间上同步化和去同步化的微妙平衡模式是神经系统功能性能的根本(Schnitzler等人，Nature Reviews Neuroscience，2005，6，285-296：脑中的正常和病理振荡通信(Normal and pathological oscillatory communication in the brain))。
processes))。在结构上，脑最醒目的神经解剖学特征是神经元之间丰富的连接性，其反映了神经通信的重要性。一个脑区与另一个脑区之间的振荡的同步化(“同步”)似乎通过引入空间-时间协调而构成信息编码的最后一级[第一级(神经元)：动作电位；第二级(神经元网络)：神经元振荡](Engel等人，Nature Reviews Neuroscience，2001，2，704-716：动态预测：自上而下处理中的振荡和同步(Dynamic predictions:oscillations and synchrony in top-down processing))。重要的是，出现的证据表明，在空间和时间上同步化和去同步化的微妙平衡模式是神经系统功能性能的根本(Schnitzler等人，Nature Reviews Neuroscience，2005，6，285-296：脑中的正常和病理振荡通信(Normal and pathological oscillatory communication in the brain))。
[0011] 同步过程异常(过高和/或过长的同步，即也称为超同步，或同步太低，即也称为同步受损)与几种脑障碍有关，例如癫痫、精神分裂症、痴呆和帕金森氏病(Schnitzler等人，Nature Reviews Neuroscience，2005，6，285-296：脑中的正常和病理振荡通信(Normal and pathological oscillatory communication in the brain))。
[0012] 如今，可以通过电刺激诱导神经元的电活动模式的调制(神经调制)。当前产生电刺激进入脑的技术利用直接电刺激或通过施加电流通过磁线圈来感生电场。因为某些神经系统障碍影响深脑中的区域并且由于电场的穿透深度弱，所以已经实施了在脑内手术植入电极来持续传递电刺激并构成了“深脑刺激”(DBS)技术。其功效取决于用于刺激的参数，尤其是频率。1987年，发现用植入电极高频刺激(≥100Hz)腹中间核(VIM)缓解了患有帕金森氏病的患者的震颤症状(Benabid等人，Applied Neurophysiology，1987，50，344-346：对VIM丘脑核的联合(丘脑切开术和刺激)立体定向手术治疗双侧帕金森病(Combined(thalamotomy and stimulation)stereotactic surgery of the VIM thalamic nucleus for bilateral Parkinson disease))。还有，已在猴子中表明，与低频刺激(<50Hz)相比，高频刺激(>100Hz)允许苍白球外侧(GPe)和苍白球内侧(GPi)中神经元的时间发放模式发生变化(刺激同步的规则发放模式)，其阻断了在基底神经节中改变的神经元活动模式传送到它在丘脑和脑干中的靶结构，从而减轻运动迟缓和僵硬症状(Hashimoto等人，The Journal of Neuroscience，2003，23(5)，1916-1923：丘脑下核的刺激改变苍白球神经元的发放模式(Stimulation of the subthalamic nucleus changes the firing pattern of pallidal neurons))。DBS现在被批准治疗几种运动障碍(帕金森氏病，肌张力障碍，特发性震颤，癫痫)和精神障碍(强迫症，抑郁症)。
[0013] 然而，几个缺点可能与DBS有关，首先是该技术的侵入性和各种并发症如出血、癫痫发作、感染、导线迁移、导线断裂等的风险(Fenoy等人，J Neurosurg，2014，120，132-139：DBS手术中常见并发症的风险：管理和避免(Risks of common complications in DBS surgery：management and avoidance))。
[0014] 靶标中产生的电场的聚焦性(Focality)(即空间分辨率)是另一个问题。电刺激的传播也与副作用例如抑郁有关联。许多研究致力于设计新类型的电极，这些电极可以在一定区域内移动和限制刺激(Luan等人，Frontiers in Neuroengineering，2014，7(27)，1-9：神经调制：现在和新兴的方法(Neuromodulation：present and emerging methods))。其他技术方面正在评估：电极(或导线)，它们的尺寸，DBS装置的侵入性，构成导线的材料，与(磁共振)成像技术的相容性，与持续刺激需求相关的内部脉冲发生器(IPG)电池寿命。
[0015] 主要的其他现有类型的电刺激，即经颅电刺激或经颅磁刺激，具有不侵入的优点，但是电场的穿透深度弱。因此，它们的应用限于大脑皮质的刺激(无法到达深脑)。而且，空间分辨率仍然差。
[0016] 脑的电刺激仍然是治疗神经元障碍的相关方法。然而，需要更局部化地传递电刺激，并在不影响周围脑区的情况下增加穿透深度，以避免副作用例如精神病副作用；最终增加治疗效益/风险比。
[0017] 最近，已经设想了非侵入性神经刺激技术，例如使用光或超声来直接刺激神经元。但是，这些技术的问题在于空间分辨率差。
[0018] 有趣的是，已经探究了具有独特性质的纳米材料作为介质，在纳米材料-神经元界面处将无线传输的一级刺激转换为局部化的二级刺激，主要是电场或热(Wang Y.&Guo L.Frontiers in Neuroscience.2016；第10卷，论文69，纳米材料实现的神经刺激(Nanomaterial-enabled neural stimulation))。因此，已经使用了量子点、利用金纳米材料的光热转换、利用磁电纳米粒子的磁电转换、利用超顺磁性纳米粒子的磁热转换和利用压电纳米材料的声电转换来显示光电转换。
[0019] 这些使用纳米材料的新兴技术中的大部分需要同时开发能源来提供神经刺激。此外，需要将进入的能量转换为有效的二级刺激，这需要明确限定的纳米粒子结构和组成以及纳米粒子的结构和组成随时间的持久性。
[0020] 例如，磁电(ME)纳米粒子是表现出压电性质和磁致伸缩性质的复合纳米粒子。具体地，例如由CoFe2O4-BaTiO3纳米粒子提供的ME效应是由两种不同材料、即磁致伸缩材料(CoFe2O4)和压电材料(BaTiO3)的组合作用产生的。更确切地说，当CoFe2O4-BaTiO3纳米粒子暴露于磁场时：首先，所述磁致伸缩材料改变其长度(体积)，从而引起局部应力，其次，所述压电材料产生电极化(电荷)作为对该局部应力的反应。所述磁致伸缩材料或所述压电材料当暴露于磁场时本身都不能产生ME效应或电极化，如 R.等人所解释的(R.等人，Journal of Magnetism and Magnetic Materials，2008，320，1972-
1977：磁电复合材料的物理(The physics of magnetoelectric composites))。
1977：磁电复合材料的物理(The physics of magnetoelectric composites))。
[0021] 本发明涉及纳米粒子和/或纳米粒子聚集体(纳米粒子的聚集体)，其在所述纳米粒子或纳米粒子聚集体暴露于电场时用于预防或治疗神经系统疾病(通常是神经元网络障碍)或其至少一种症状。所述电场通常通过深脑刺激(DBS)、经颅电刺激(TES)或经颅磁刺激(TMS)来施加。
[0022] 所述纳米粒子或纳米粒子聚集体使神经元网络内和/或之间、以及脑的不同区域内和/或之间的神经元振荡的同步化正常化(改善同步)，并在使用标准的电刺激技术的同时，提高电刺激的空间分辨率(聚焦性)。本发明人在在本文中描述的纳米粒子或纳米粒子聚集体因此帮助对象/患者恢复健康状态。
发明内容
[0024] 本文首次有利地描述了纳米粒子或纳米粒子聚集体，其在所述纳米粒子或纳米粒子聚集体暴露于电场/刺激/被电场/刺激激发或激活时用于预防或治疗有此需要的对象的神经系统疾病或其至少一种症状。所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料通常选自导体材料、半导体材料、介电常数εijk等于或高于200的绝缘体材料、和介电常数εijk等于或低于100的绝缘体材料。
[0025] 本文还描述了纳米粒子或纳米粒子聚集体在制备用于在有此需要的对象中预防或治疗本文所述的神经系统疾病或其至少一种症状的组合物中的用途。
[0026] 本文还描述了用于在暴露于电场的对象中预防或治疗神经系统疾病或其至少一种症状的组合物，其中所述组合物包含纳米粒子和/或纳米粒子聚集体和可药用的载体，或由纳米粒子和/或纳米粒子聚集体和可药用的载体组成，并且其中所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料通常选自导体材料、半导体材料、介电常数εijk等于或高于200的绝缘体材料、和介电常数εijk等于或低于100的绝缘体材料。
[0027] 本文还描述了包含至少两种不同的纳米粒子和/或纳米粒子聚集体的试剂盒，每种纳米粒子或纳米粒子聚集体由通常选自导体材料、半导体材料、介电常数εijk等于或高于200的绝缘体材料、和介电常数εijk等于或低于100的绝缘体材料的不同材料组成，及其通常在对象中预防或治疗神经系统疾病或其至少一种症状中的用途/在预防或治疗神经系统疾病或其至少一种症状的方法中的用途。
[0028] 详细描述
[0029] 人类神经系统据估计由大约800-1200亿个神经细胞组成(Herculano-Houzel S.Frontier in Human Neuroscience(2009)，3(31)：1-11，数字中的人脑：线性放大的灵长类脑(The human brain in numbers:a linearly scaled-up primate brain))。神经元(或神经细胞)的定义特征是其以动作电位的形式传输电信号的能力。
[0030] 神经元/神经细胞构成脑的基本节点。神经细胞可以以高度结构化的方式彼此通信，形成神经元网络。神经元经由突触连接进行通信。在神经元内，纳回路构成了用于介导关键神经元性质例如学习和记忆以及神经元节律性的发生的基础生化机制。
[0031] 只要几个相互连接的神经元就可以形成微回路，并且可以执行复杂的任务，例如介导反射、处理感觉信息、启动运动以及学习和记忆介导。宏回路是由多个嵌入的微回路组成的更复杂的网络。宏回路介导更高级脑功能，例如物体识别和认知。因此，多级网络占据了神经系统。
[0032] 神经网络兴奋性
[0033] 神经元以电化学方式发送消息(即化学物质/离子引起电信号)。神经系统中的重要离子是钠和钾，钙和氯。当神经元不发送信号时，它是“静息的”。当神经元处于静息时，神经元内部相对于外部是负的。虽然不同离子的浓度试图在膜的两侧平衡，但它们不能，因为细胞膜仅允许一些离子通过通道(离子通道)。除了这些选择性离子通道外，还有泵，其使用能量针对每放入两个钾离子就将三个钠离子移出神经元。最后，当所有这些力平衡，并测量神经元内部和外部之间的电压差时，神经元的静息膜电位(也称“静息电位”)为约-70mV。这意味着神经元的内部比外部低70mV。静息时，神经元外部的钠离子相对较多，神经元内部的钾离子相对较多。当神经元沿轴突向远离细胞体发送信息时，发生动作电位(也鉴定为“峰电位”或“脉冲”)。这意味着某些事件(刺激)导致静息电位向0mV移动。当去极化达到约-55mV时，神经元发放动作电位。如果去极化没有达到该临界阈值水平，则没有动作电位发放(开/关机制)。此外，当达到阈值水平时，始终发放固定幅度的动作电位。因此，要么是去极化没有达到阈值，要么是产生完整动作电位。
[0034] 在动作电位的传播速度中发现了很大的变化性。实际上，神经中动作电位的传播速度可以从100米/秒到小于十分之一米/秒不等。然而，时间常数是膜在时间上对刺激做出响应的快速程度的指标，空间常数(也是长度常数)是电位沿轴突扩散的良好程度的指标，其是距离的函数。
[0035] 神经元网络内部和之间的连接性
[0036] 有三种连接性网络类型用于研究脑内部和跨脑的通信。结构连接性是基于物理连接脑区的纤维径迹的检测。这些是指示信号可在脑中行进的可能途径的解剖网络图。功能连接性鉴定具有相似频率、相位和/或幅度的相关活动的脑区中的活动。有效连接性使用功能连接性信息且更进一步，并确定一个神经系统对另一个可能具有的直接或间接影响，更具体地说是脑中动态信息流的方向(Bowyer等人，Neuropsychiatric Electrophysiology，2016，2(1)，1-12：相干性——脑网络的量度：过去和现在(Coherence a measure of the brain networks:past and present))。
[0037] 神经元网络内的同步活动可以通过脑磁图(MEG)、脑电图(EEG)、功能磁共振成像(FMRI)或正电子发射断层扫描(PET)来检测，然后使用网络连接性分析图像。MEG(脑磁图)或EEG(脑电图)是优选的，因为它们具有高时间分辨率来分辨动态的信息流。进行脑的连接性分析以绘制出脑运行所需的通信网络。脑中的特定区域专门用于处理某些类型的信息。成像技术已揭示这些区域与跨越脑中网络的其他专门区域连接和通信。“相干性”(Bowyer等人，Neuropsychiatric Electrophysiology，2016，2(1)，1-12：相干性——脑网络的量度：过去和现在(Coherence a measure of the brain networks:past and present))是一种数学技术，其对振荡型脑活动的神经元模式的同步性(处于同步或正在同步的状态)的频率和幅度进行量化。检测神经元的同步激活可用于确定人脑中功能连接性的健全或完整性。将功能连接性图叠加到结构连接性图像上以及利用从有效连接性获得的信息流的方向提供了对脑如何运行的全面了解。这些技术有助于基于治疗前和治疗后脑连接性成像来评价治疗方法。
[0038] 完整的脑表达与生物体的不同‘状态’相关的复杂的同步活动模式，从慢δ节律(0.5-4Hz)、到θ(4-8Hz)、α(8-12Hz)、β(15-30Hz)和γ(30-70Hz)振荡。有趣的是，皮质结构的分散培养物提供了一个方便的系统，用于检查密集互连的神经元群体中网络发放(峰电位)和爆发(峰电位簇)的出现、产生和传播的支配规则。网络活动可以使用多电极阵列以非侵入方式并以有限时间分辨率来长时间记录。所述二维分散培养物可以用作一种可行的测试系统，用于研究脑中网络活动的形成和维持的支配规则，允许测试在完整的脑中无法解决的假设(Cohen E.等人，Brain Research，2008，1235，21-30：培养的海马网络中自发活动的决定因素(Determinants of spontaneous activity in networks of cultured hippocampus))。
[0039] 本文首次有利地描述了纳米粒子或纳米粒子聚集体，其在所述纳米粒子或纳米粒子聚集体暴露于电场时用于在有此需要的对象中预防或治疗神经系统疾病或其至少一种症状。所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料通常选自导体材料、半导体材料、介电常数εijk等于或高于200的绝缘体材料、和介电常数εijk等于或低于100的绝缘体材料。
[0040] 术语“治疗”是指能够预防、减轻或治愈如本文所述的疾病、障碍或功能失常状态的治疗性治疗或措施。这样的治疗旨在用于哺乳动物对象，优选有此需要的人类对象。对此考虑的是已经鉴定(诊断)为患有如本文所述的疾病、障碍或功能失常状态的对象，或被认为有那些疾病、障碍或功能失常状态的“发生风险”的对象，对于后者所述治疗是防止性或预防性治疗。
[0041] 神经元之间振荡通信的异常调制确实存在于不同类型的神经系统疾病或障碍(在本文中也称为“神经疾病或障碍”)中(Uhlhaas等人，Neuron，2006，52，155-168：脑障碍的神经同步：认知功能失常和病理生理学的相关性(Neural synchrony in brain disorders：relevance for cognitive dysfunctions and pathophysiology)；Basar E.等人International Journal of Psychophysiology 103(2016)135-148，破坏的脑对神经科学家说了些什么？精神分裂症、阿尔茨海默氏病和双相障碍的振荡和连接性(What does the broken brain say to the neuroscientist？Oscillations and connectivity in schizophrenia，Alzheimer’s disease，and bipolar disorder))。
[0042] 人体神经系统分为中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)。CNS又分为脑和脊髓，它们分别位于颅骨的颅腔和椎管中。CNS和PNS协同工作，整合感官信息并控制运动和认知功能。图1显示了脑结构的简化图。
[0043] 神经元网络内和/或之间、脑的不同区域内和/或之间的同步(或同步化)，通过及时协调神经元振荡来进行(Buzsaki等人，Science，2004，304，1926-1929：皮质网络中的神经元振荡(Neuronal oscillations in cortical networks))。运动障碍通常是由于超同步引起的，其意味着在脑的不同区域内和/或之间的神经元网络内和/或之间的振荡的同步化太高和/或太长。精神障碍和认知障碍通常是由于同步受损，这意味着在脑的不同区域内和/或之间的神经元网络内和/或之间的振荡的同步化降低(通常表现出活动降低)或甚至消失(参见表1：神经系统障碍中的异常神经同步(改编自Uhlhaas等人，Neuron，2006，52，155-168：脑障碍的神经同步：认知功能失常和病理生理学的相关性(Neural synchrony in brain disorders：relevance for cognitive dysfunctions and pathophysiology))。
[0044] 表1：
[0045]
[0046]
[0047] 由于“相干性”是一种数学技术，其对振荡型脑活动的神经元模式的同步性(处于同步或正在同步的状态)的频率和幅度进行量化，可以认为过高和过低的相干性分别涉及运动障碍和精神/认知障碍(Bowyer等人，Neuropsychiatric Electrophysiology，2016，2(1)，1-12：相干性——脑网络的量度：过去和现在(Coherence a measure of the brain networks：past and present))(参见图2)。
[0048] 在一个特定方面，本发明的情形中所靶向的神经系统疾病或障碍选自帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、癫痫、强迫症、自闭症谱系障碍、抑郁症、肌张力障碍、Tourette综合征、精神分裂症、中风、失语症、痴呆、耳鸣、亨廷顿氏病、特发性震颤、双相障碍、焦虑症、成瘾症、意识植物状态，例如选自帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、癫痫、强迫症、自闭症谱系障碍、抑郁症、肌张力障碍、Tourette综合征、精神分裂症、中风、失语症、痴呆、耳鸣、亨廷顿氏病、特发性震颤、双相障碍、成瘾症、意识植物状态及其至少一种症状。
[0049] 如上文已经解释的，神经系统疾病或障碍可以根据影响患者的主要症状进行分类，所述主要症状是运动障碍、精神(情绪/社交)障碍和认知障碍，如下文进一步详述。
[0050] 运动障碍的实例
[0051] 帕金森氏病
[0052] 帕金森氏病(PD)影响全世界约700万至1000万人，其特征是震颤、运动异常、运动迟缓、步态冻结等。PD是一种缓慢进展的脑变性疾病。它影响脑中被称为基底神经节和黑质的区域的神经细胞。黑质中的神经细胞产生多巴胺，这是一种在脑回路中充当化学信使的神经递质，对计划和控制身体运动非常重要。在PD中，产生多巴胺的黑质神经细胞在一些个体中过早死亡(Corti等人，Physiol Rev，2011，91，1161-1218：关于帕金森氏病的病因和机制遗传学告诉了我们什么(What genetics tells us about the causes and mechanisms of Parkinson’s disease))。当纹状体中的多巴胺受体未被适当刺激时，部分基底神经节受到刺激不足或刺激过度。特别是，丘脑下核(STN)变得过度活跃并且充当苍白球内侧部(GPi)的加速器。GPi的过度刺激对丘脑具有过度抑制效应，这又减少了其输出并导致运动减慢和僵硬(Guo等人，Frontiers in Computational Neuroscience，2013，7，124，1-11：帕金森氏病和肌张力障碍中丘脑皮质中继的基底神经节调制(Basal ganglia modulation of thalamocortical relay in Parkinson’s disease and dystonia))。
[0053] PD中缺乏多巴胺与整个皮质-基底神经节运动网络中β频率的过度振荡同步化有关。实际上，基底神经节中的多巴胺水平预计会抑制β同步，这又介导了运动预期所必需的多巴胺能参与(Jenkinson等人，Trends in Neuroscience，2011，34(12)，611-618：关于多巴胺、β振荡和运动功能之间关系的新见解(New insights into the relationship between dopamine，beta oscillations and motor function))。如果基底神经节中的多巴胺水平不够高，则不再控制β振荡同步，并且可能出现运动缓慢。在帕金森病患者中的另一项观察得出结论：β频段中的皮质振荡导致并驱动基底神经节中的皮质振荡(Lalo等人，The Journal of Neuroscience，2008，28(12)，3008-3016：帕金森病患者运动期间皮质与基底神经节之间的双向通信模式(Patterns of bidirectional communication between cortex and basal ganglia during movement in patients with Parkinson disease))。
[0054] 深脑刺激(DBS)可用于治疗震颤和僵硬的症状(Eusebio等人，J Neurol Neurosurg Psychiatry，2011，82，569-573：深脑刺激可抑制帕金森病患者的病理同步化(Deep brain stimulation can suppress pathological synchronization in
parkinsonian patients))。通过DBS治疗PD症状自2002年获得FDA批准(特发性震颤自1997年)。可在本发明的情形中结合本文描述的纳米粒子使用的最常用的刺激参数是：频率130至185Hz，脉冲宽度60至210μs，和电压幅度1至3.5V(Kuncel等人，Clinical
Neurophysiology，2004，115，2431-2441：对DBS刺激参数的选择(Selection of stimulus parameters for DBS))。电刺激通常在基底神经节中、STN中和GPi中进行。如上所述，皮质β振荡也参与所述疾病的病理生理学，因此皮质的经颅刺激(例如经颅磁刺激-TMS)也可用于治疗帕金森氏病的症状(Cantello等人，Brain Research Reviews，2002，38，309-327：经颅磁刺激和帕金森氏病(Transcranial magnetic stimulation and Parkinson’s
disease))。
parkinsonian patients))。通过DBS治疗PD症状自2002年获得FDA批准(特发性震颤自1997年)。可在本发明的情形中结合本文描述的纳米粒子使用的最常用的刺激参数是：频率130至185Hz，脉冲宽度60至210μs，和电压幅度1至3.5V(Kuncel等人，Clinical
Neurophysiology，2004，115，2431-2441：对DBS刺激参数的选择(Selection of stimulus parameters for DBS))。电刺激通常在基底神经节中、STN中和GPi中进行。如上所述，皮质β振荡也参与所述疾病的病理生理学，因此皮质的经颅刺激(例如经颅磁刺激-TMS)也可用于治疗帕金森氏病的症状(Cantello等人，Brain Research Reviews，2002，38，309-327：经颅磁刺激和帕金森氏病(Transcranial magnetic stimulation and Parkinson’s
disease))。
[0055] 肌张力障碍
[0056] 肌张力障碍是一种神经系统障碍，以异常、不自主的迂曲和转向运动为特征，反映了运动系统功能受损。取决于受症状影响的身体部位、它们的遗传起源、所涉及的神经递质类型等，存在几种形式的肌张力障碍。肌张力障碍的中枢神经系统(CNS)表现出抑制缺陷，这引起相对肌肉之间交互脊柱抑制的丧失。例如，在上肢肌张力障碍的情况下，向前臂拮抗肌提供输入信号的神经元/神经的异常同步化导致这些拮抗肌的共同收缩(肌张力障碍症状)(Farmer等人，Brain，1998，121，801-814：拮抗肌的异常运动单位同步化是上肢肌张力障碍病理性共同收缩的根基(Abnormal motor unit synchronization of antagonist muscles underlies pathological co-contraction in upper limb dystonia))。
[0057] 显示出令人感兴趣的抗肌张力障碍效果的DBS靶点是苍白球内侧部(GPi-DBS)。GPi-DBS于2003年被FDA批准用于慢性、医学难治性肌张力障碍患者(Hu等人，
Translational Neurodegeneration，2014，3(2)，1-5：深脑刺激治疗肌张力障碍(Deep brain stimulation for dystonia))。刺激丘脑的腹中间(VIM)核(VIM-DBS)产生的效果要不稳固得多。使用丘脑下核的刺激(STN-DBS)已经进行了实验。GPi-DBS提供了肌张力障碍的主要症状的缓解，但可能要花数周到数月才能完全产生治疗效果(Dressler等人，J Neural Transm，2015，DOI10.1007/s00702-015-1453-x：治疗肌张力障碍的策略(Strategies for treatment of dystonia))。可在本发明的情形中与本文描述的纳米粒子组合使用的最常用的刺激参数是：频率130-185Hz；脉冲宽度60-210μs；幅度2-5伏。
Translational Neurodegeneration，2014，3(2)，1-5：深脑刺激治疗肌张力障碍(Deep brain stimulation for dystonia))。刺激丘脑的腹中间(VIM)核(VIM-DBS)产生的效果要不稳固得多。使用丘脑下核的刺激(STN-DBS)已经进行了实验。GPi-DBS提供了肌张力障碍的主要症状的缓解，但可能要花数周到数月才能完全产生治疗效果(Dressler等人，J Neural Transm，2015，DOI10.1007/s00702-015-1453-x：治疗肌张力障碍的策略(Strategies for treatment of dystonia))。可在本发明的情形中与本文描述的纳米粒子组合使用的最常用的刺激参数是：频率130-185Hz；脉冲宽度60-210μs；幅度2-5伏。
[0058] 癫痫
[0059] 癫痫是一种脑障碍，影响全世界大约5000万人，其特征主要是正常脑功能的反复和不可预测的中断，称为癫痫发作。癫痫不是一种单一的疾病实体，而是反映可由许多不同原因(基因突变，脑肿瘤，头部创伤，中风，酒精中毒，脑部炎症，感染例如脑膜炎、HIV或病毒脑炎，等等)引起的深层脑功能失常的多种障碍(Fisher等人，Neurology，2015，28(2)，130-135：重新定义癫痫(Redefining epilepsy))。
[0060] 癫痫发作被定义为由于脑中过度的同步神经元活动引起体征和/或症状短暂发生(Fisher等人，Epilepsia，2005，46(4)，470-472：癫痫发作和癫痫：国际抗癫痫联盟(ILAE)和国际癫痫局(IBE)提出的定义(Epileptic seizures and epilepsy:definitions proposed by the International League Against Epilepsy(ILAE)and the International Bureau for Epilepsy(IBE)))。大脑皮质是产生癫痫发作的主要单位：许多人被诊断为局灶性额叶或内侧颞叶发作(国立神经系统障碍和中风学会(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)：http://www.ninds.nih.gov/disorders/epilepsy/detail_epilepsy.htm#3109_7)。在皮质中鉴定出局部同步升高或“超同步”的区域提示局部超同步可能是发作产生区域的标志(Schevon等人，Neuroimage，
2007，35(1)，140-148：通过局部EEG同步揭示的癫痫皮质异常(Cortical abnormalities in epilepsy revealed by local EEG synchrony))。
2007，35(1)，140-148：通过局部EEG同步揭示的癫痫皮质异常(Cortical abnormalities in epilepsy revealed by local EEG synchrony))。
[0061] 用于治疗癫痫的神经刺激可采取周围神经刺激的形式，例如迷走神经刺激(VNS)；脊髓刺激；经颅脑刺激(TES或TMS)；或深脑刺激(DBS)。响应性神经刺激是另一种策略，其中仅在检测到发作开始时才传递刺激。2004年，发表了一项在三名癫痫患者中反应性神经刺激的原理验证研究，其中两名患者通过皮质栅网电极或条状电极治疗，一名患者通过海马深度电极治疗。在刺激开始时可以截断个体发作，并且总体发作频率降低50-75％(Kossoff等人，Epilepsia，2004，45，1560-1567：硬膜下电极监测期间外部响应性神经刺激器对癫痫发作和电磁放电的影响(Effect of an external responsive neurostimulator on seizures and electromagnetic discharges during subdural electrode
monitoring))。VNS和响应性神经刺激在美国均已被FDA批准用于治疗某些类型的癫痫。丘脑前核(ANT)的DBS已在欧盟国家获得批准(Fisher等人，Nature Reviews Neurology，
2014，10，261-270：脑部电刺激治疗癫痫(Electrical brain stimulation for epilepsy))。在110例成人患者中进行了一项双侧刺激丘脑前核治疗癫痫(SANTE)的多中心随机对照试验，所述患者每月至少6次、但每天不超过10次部分发作，伴有或不伴有继发性全身发作。记录基线发作频率3个月，然后进行DBS导线植入，恢复1个月，然后进行3个月盲法期的主动刺激或不刺激(安慰剂)。刺激参数为145Hz下90μs的5V脉冲1分种，继之以5分钟无刺激。在1个月的恢复期期间，发作频率从基线中位数降低了20％。之后，两个治疗组的发作频率显著分化，活性组中位数改善为40.4％，安慰剂组为14.5％。活性组经历了复杂部分性发作显著减少，并且前瞻性地被患者指示为“最严重”的发作类型显著减少(Fisher等人，Epilepsia，2010，51，899-908：电刺激丘脑前核以治疗难治性癫痫(Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy))。本文描述的电刺激/治疗的条件可以与本文描述的纳米粒子组合用于本发明的情形中。
monitoring))。VNS和响应性神经刺激在美国均已被FDA批准用于治疗某些类型的癫痫。丘脑前核(ANT)的DBS已在欧盟国家获得批准(Fisher等人，Nature Reviews Neurology，
2014，10，261-270：脑部电刺激治疗癫痫(Electrical brain stimulation for epilepsy))。在110例成人患者中进行了一项双侧刺激丘脑前核治疗癫痫(SANTE)的多中心随机对照试验，所述患者每月至少6次、但每天不超过10次部分发作，伴有或不伴有继发性全身发作。记录基线发作频率3个月，然后进行DBS导线植入，恢复1个月，然后进行3个月盲法期的主动刺激或不刺激(安慰剂)。刺激参数为145Hz下90μs的5V脉冲1分种，继之以5分钟无刺激。在1个月的恢复期期间，发作频率从基线中位数降低了20％。之后，两个治疗组的发作频率显著分化，活性组中位数改善为40.4％，安慰剂组为14.5％。活性组经历了复杂部分性发作显著减少，并且前瞻性地被患者指示为“最严重”的发作类型显著减少(Fisher等人，Epilepsia，2010，51，899-908：电刺激丘脑前核以治疗难治性癫痫(Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy))。本文描述的电刺激/治疗的条件可以与本文描述的纳米粒子组合用于本发明的情形中。
[0062] 精神障碍(情绪/社交障碍)的实例
[0063] 强迫症(OCD)
[0064] 强迫症(OCD)是一种常见的精神障碍，经常是慢性、严重和极度使人衰弱的。它通常也很难治疗，相当比例的患者没有反应或只获得部分缓解。
[0065] 功能性神经影像研究已经证明眼窝前额皮质、基底神经节和纹状体中的功能失常。
[0066] 一项研究表明，急性OCD症状可能与丘脑下核(STN)中的异常高振荡活动有关，特别是在左半球和在δ-α(1-12Hz)频率范围内(Bastin等人，Cortex，2014，60，145-150：强迫症症状期间丘脑下核振荡活动的变化：2个病例报告(Changes of oscillatory activity in the subthalamic nucleus during obsessive-compulsive disorder symptoms：two case reports))。此外，在验证工作期间，当发生疑问时，一些丘脑下神经元特异性地增加了它们的发放率(Burbaud等人，brain，2013，136(1)，304-317：神经元活动与强迫症患者丘脑下核中检查性行为相关(Neuronal activity correlated with checking behavior in the subthalamic nucleus of patients with obsessive-compulsive disorder))。
[0067] 内囊(VC)和邻近腹侧纹状体(VS)的腹侧前肢的DBS在欧盟被批准用于治疗严重和高度治疗抗性的OCD(VC/VS-DBS)。为了证明该程序的治疗前景，四个临床中心在小规模研究中进行了8年的最密切合作，并分析了他们的数据(Greenberg等人，Molecular Psychiatry，2010，15，64-79：腹侧内囊/腹侧纹状体的深脑刺激治疗强迫症：全球经验(Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder：worldwide experience))。双侧植入DBS导线以刺激前囊的背侧-腹侧范围。电刺激频率为100-130Hz，脉冲宽度在90至最大值450μs的范围内。DBS强度通常在2至8V的范围内，导致电流取决于电极阻抗(通常500-1000Ω)在大约2至15mA的范围内。在这些组合数据的结论中，在约三分之二的高度治疗抗性患者(总共26名患者)中见到临床显著性症状减轻和功能改善，表明在VC/VS-DBS之后有令人鼓舞的治疗效果。本文描述的电刺激/治疗的条件可以与本文描述的纳米粒子组合用于本发明的情形中。
[0068] 自闭症谱系障碍
[0069] 自闭症是一种神经发育综合征，由社交互动和沟通缺陷以及由反常的限制性、重复性行为来定义。自闭症是一种通常在婴儿期开始、最迟在生命的前三年开始的障碍。自闭症是一种异质性病症(没有两个患有自闭症的儿童或成人具有相似的情况)，这导致了“自闭症谱系障碍”的概念，根据语言缺陷或一般认知延迟的程度，以及根据社交或行为症状的严重程度，来分类疾病的几个等级(Lord等人，Neuron，2000，28，355-363：自闭症谱系障碍(Autism spectrum disorders))。在该谱系的一端，自闭症个体的机能很高，使他们能够独立生活并保持就业。特征为低机能的个体表现出更严重的症状：语言困难(或甚至无口头语言)，社交沟通差，自我伤害行为(SIB)，发脾气，和可潜在危及生命的攻击性。自闭症的脑结构和功能研究中的一个重要趋势是社会情感处理的网络参与：边缘系统、面部处理系统和镜像神经元网络。已显示γ-频段振荡同步化的缺陷与症状的出现有关(Sinha等人，Neurosurgery Focus，2015，38(6)，E3：深脑刺激治疗严重自闭症：从病理生理学到手术(Deep brain stimulation for severe autism：from pathophysiology to procedure))。
[0070] 在严重自闭症中可能需要治疗的两个主要症状范畴是社交缺陷，包括无言语和对语言没有反应，以及可能危及生命的SIB。杏仁核似乎在这些异常的病理生理中起重要作用。兴奋性或抑制性控制的改变与自闭症病理生理的异常有牵连。通过DBS对杏仁核靶标进行神经调制可以代表对患有严重自闭症的患者的治疗干预。文献报道了三例DBS治疗。治疗的目的主要是减轻运动障碍如刻板症(重复动作模式)和与疾病相关的自我伤害行为(SIB)(Sinha等人，Neurosurgery Focus，2015，38(6)，E3：深脑刺激治疗严重自闭症：从病理生理学到手术(Deep brain stimulation for severe autism：from pathophysiology to procedure)；Stocco等人，Parkinsonism and related disorders，2014，20，1035-1036：深脑刺激治疗严重的继发性刻板症(Deep brain stimulation for severe secondary stereotypies))。可以在本发明的情形中与本文描述的纳米粒子组合使用的DBS参数是：频率80至130Hz，脉冲宽度120至210μs，和电压幅度2.5至6.5V(Sinha等人，Neurosurgery Focus，2015，38(6)，E3：深脑刺激治疗严重自闭症：从病理生理学到手术(Deep brain stimulation for severe autism：from pathophysiology to procedure))。在这三例的一例中，据报道，基底外侧核中的DBS导致自闭症相关症状如社交接触、情感调制和夜间睡眠的显著改善(Sturm等人，Frontiers in Human Neuroscience，2013，6，341，1-10)。
[0071] 精神分裂症
[0072] 精神分裂症是一种慢性精神病，其特征在于包括以下症状：阳性症状，反映了异常的心智活动(幻觉和错觉)；阴性症状，对应于正常存在的心智功能缺陷(思维障碍，感情迟钝，语言贫乏)。关于生命中失能的原因，精神分裂症位于前十名之内。
[0074] 在精神分裂症患者中，已经证明观察到的受损神经回路是由于γ-频段同步化的失败(Spencer等人，The Journal of Neuroscience，2003，23(19)，7407-7411：精神分裂症中的神经同步异常(Abnormal neural synchrony in schizophrenia)；Gallinat等人，Clinical Neurophysiology，2004，115，1863-1874：在未治疗的精神分裂症患者中振荡γ-频段反应降低表明额叶网络处理受损(Reduced oscillatory gamma-band responses in unmedicated schizophrenic patients indicate impaired frontal network processing))。
[0075] 电惊厥疗法(ECT)，即休克治疗，已被证明是精神分裂症的最成功的非药物治疗之一(Payne等人，J.Psychiatr.Pract.，2009，15(5)，346-368：电惊厥疗法第I部分：关于ECT演变和现行实践的看法(Electroconvulsive therapy part I：a perspective on the evolution and current practice of ECT))，并且在本文中可与本文描述的纳米粒子组合用于本发明的情形中。它涉及向脑连续施加电流，这引起与癫痫发作相当的发作。
[0076] 也可以通过DBS进行精神分裂症对症疗法的电刺激。例如，在抑郁症中伏隔核(NAcc)的DBS(频率145Hz，脉冲宽度90μs，电压幅度为4V)导致了快感缺失的缓解，即恢复享乐乐趣(Schlaepfer等人，Neuropsychopharmacology，2008，33，368-377：对奖赏回路的深脑刺激减轻难治性重度抑郁症的快感缺失(Deep brain stimulation to reward circuitry alleviates anhedonia in refractory major depression))，并且可在本发明的情形中与本文描述的纳米粒子组合使用。
[0077] 认知障碍的实例
[0078] 阿尔茨海默氏病
[0079] 阿尔茨海默氏病(AD)是一种神经变性障碍，它导致心智、行为、功能衰退和学习能力的进行性丧失。大约200 000名年龄小于65岁的AD患者构成了年轻发作的AD人群；年龄在65岁以上的有500万人。
[0080] 最近的证据表明，阿尔茨海默氏病中所见的认知缺陷与神经认知网络的功能性断开有关。对全面EEG同步化的分析揭示了α、β和γ频段同步化的普遍减少，伴随着δ频段同步化的增加。在患有轻度阿尔茨海默氏病的患者中，已显示β频段同步化丧失与认知受损相关(Schnitzler等人，Nature Reviews Neuroscience，2005，6，285-296：脑中的正常和病理振荡通信(Normal and pathological oscillatory communication in the brain))。正在进行临床研究以评价DBS治疗阿尔茨海默氏病的潜力。通常可在本发明的情形中与本文描述的纳米粒子组合使用的刺激参数是：频率130Hz，脉冲宽度60或90μs，电压幅度3至5V(Laxton等人，World Neurosurgery，2013，80，S28.E1-S28.E8：深脑刺激治疗阿尔茨海默病和痴呆(Deep brain stimulation for the treatment of Alzheimer disease and dementias))。
[0081] 电刺激
[0082] 在本发明的情形中，优选通过深脑刺激、经颅电刺激或经颅磁刺激施加电场。迷走神经刺激(VNS)和脊髓刺激也可以应用于本发明的情形中，例如在癫痫情形中。任何其他已知的不同电刺激方法可用于本发明的情形中，例如在Grossman N.等人(Cell，2017，169，1029-1041：通过时间干扰电场的非侵入性深脑刺激(Noninvasive deep brain
stimulation via temporally interfering electric fields))中描述的方法，这是一种通过时间干扰电场进行的非侵入性深脑刺激。
stimulation via temporally interfering electric fields))中描述的方法，这是一种通过时间干扰电场进行的非侵入性深脑刺激。
[0083] 在本发明的情形中，用于电刺激的两个主要脑区是深脑和大脑皮质。
[0084] 得益于手术植入电极，电刺激可以到达深脑[电极在皮肤表面下的穿透深度等于或大于10cm并且所述电极产生的电场的穿透范围是几毫米：深脑刺激(DBS)]。
[0085] 当要到达大脑皮质时，在表面上进行电刺激(电场的穿透深度通常等于或小于皮肤表面下方2cm；用经颅磁刺激的特定技术-特定线圈–电场可达到5cm深度)。提供这样的电场的技术通常包括经颅磁刺激(TMS)、重复经颅磁刺激(rTMS)、经颅直流电刺激(tDCS)、高清晰度经颅直流电刺激(HD-tDCS)、经颅电刺激(TES)、经颅交流电刺激(tACS)、经颅脉冲电流刺激(tPCS)和经颅随机噪声刺激(tRNS；交流电伴随随机的振幅和频率)。TMS和tDCS是最广泛用于临床试验中的，并且在本发明的情形中优选的。
[0086] 深脑刺激
[0087] DBS装置包括三个关键组件：刺激电极(也称为导线)，延长电缆，以及可编程脉冲发生器(PG)，其类似于心脏起搏器。所述装置分两个阶段植入。在第一阶段期间，将单侧或双侧导线立体定向植入深脑中的特定治疗靶标中。在可以在同一天或之后进行的第二阶段期间，将脉冲发生器植入在前胸壁(锁骨下方)或腹部的皮肤下，并通过皮下穿入的延长电缆与所述导线连接。导线长度一般为40cm，直径为1.27mm，并且它取决于指征而存在多个接触电极(大多数情况下，导线上有4个接触电极–即四极电极)，宽度为1.5mm或3mm，在导线上间隔0.5至4mm。可以刺激一个或两个接触电极(当使用两个电极时，一个是阳极，另一个是阴极)。通过所述接触电极，将电刺激直接施加到深脑区域，更特别地是基底神经节。可用于本发明的情形中的典型电流是脉冲式的，具有高频[在100和200Hz之间，最常用的是130Hz)，脉冲宽度在60和120μs之间，低电压(低于4V)和低电流(低于2mA)]。
[0088] 对于几种行动/运动障碍例如帕金森氏病、肌张力障碍、癫痫、强迫症(OCD)和Tourette综合征而言，向基底神经节施加高频电刺激通常是被批准的(至少在美国和/或欧盟)并可用于本发明的情形中。
[0089] 经颅磁刺激(TMS)
[0090] 经颅磁刺激(TMS)是一种非侵入性技术，其针对许多研究和治疗应用而被使用或研究，包括正常和病理性脑功能的研究以及神经障碍的治疗，并可用于本发明的情形中。TMS使用传递到放置在对象头部的线圈的短暂、强烈的电流脉冲，以通过电磁感应在脑中产生电场。感应的电场调制神经跨膜电位，从而调制神经活动。脑中的激活位点大致位于感应电场最大的区域；该位置又取决于刺激线圈的几何形状和布置。感兴趣的两个电场空间特征是穿透深度和聚焦性，二者均取决于线圈几何形状并且可由技术人员容易地确定。重复性TMS(rTMS)通常用于抑郁症、疼痛、中风等。
[0091] 经颅直流电刺激(tDCS)
[0092] 经颅直流电刺激(tDCS)是一种非侵入性技术，可用于本发明的情形中，其中由于直流电进行脑刺激，导致皮质兴奋性改变。tDCS使用低强度(0.5-2mA)恒定电流，其通过两个通常为20-35cm2的电极(阳极/阴极)直接施加于头部。一个电极(参比电极)可放在前额上方(眶上脊上方)，另一个(活性电极)可取决于设计而放在对侧半球上方，通常在运动皮质(M1)或背外侧前额叶皮质上方。刺激持续时间的范围最经常在20到40分钟之间。一部分电流穿透脑部，产生每施加1mA约0.3V/m的峰值电场。在tDCS期间产生的持续电场改变跨膜神经元电位并且可以影响兴奋性水平和对突触输入的响应性，并调制各个神经元的发放率。阳极刺激发生兴奋性增加，而阴极刺激通常发生兴奋性降低。
[0093] tDCS可用于治疗自闭症(Chi等人，Medical Hypotheses，2014，83，614-618：通过靶向颞叶来治疗自闭症(Treating autism by targeting the temporal lobes))、中风后运动康复(Gillick等人，Frontiers in Human Neuroscience，2014，8(739)，1-9：小儿中风和tDCS：合理个体化剂量优化的方法(Pediatric stroke and tDCS：method for rational individualized dose optimization))、严重抑郁症(Croarkin等人，Frontiers in Human Neuroscience，2014，8(669)，1-9：抑郁和健康青年皮质兴奋性和抑制的发育状况：探索性研究(Developmental aspects of cortical excitability and inhibition in depressed and healthy youth：an exploratory study))。
[0094] 纳米粒子
[0095] 本文描述了一种本发明的供使用的纳米粒子或纳米粒子聚集体，其在所述纳米粒子或纳米粒子聚集体暴露于电场时用于预防或治疗对象的神经系统疾病或其至少一种症状，其中所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料通常选自导体材料、半导体材料、介电常数εijk等于或高于200的绝缘体材料、和介电常数εijk等于或低于100的绝缘体材料。
[0096] 纳米粒子的组成
[0097] 由导体材料制备的纳米粒子
[0098] 由导体材料制备的纳米粒子是有机纳米粒子或无机纳米粒子。
[0099] 由导体材料制备的无机纳米粒子通常用金属元素制备，当通常在25℃和1atm的压力下相对于标准氢电极测量时，所述金属元素的标准还原电位E°值等于或高于约0.01(见表2“E°值比标准氢电极更正的还原反应(reduction reactions having E°values more positive than that of the standard hydrogen electrode)”，8-25，《化学和物理手册》(Handbook of chemistry and physics)；David R.Lide；第88版)，更优选等于或高于约0.1、0.2、0.4或0.5。用于制备纳米粒子的典型金属元素可选自Tl、Po、Ag、Pd、Ir、Pt、Au，及其混合物。优选地，可用作制备所述纳米粒子的导体材料的金属元素选自Ir、Pd、Pt、Au，及其混合物。
[0100] 由导体材料制备的有机纳米粒子通常用在其结构中具有邻接的sp2杂化碳中心(即碳双键或在芳族环内或芳族环外包含杂原子、通常为N或S的芳族环)的有机材料制备。优选的有机材料选自聚苯胺、聚吡咯、聚乙炔、聚噻吩、聚咔唑、聚芘、聚(3,4-亚乙基二氧基噻吩)和/或聚(3,4-亚乙基二氧基噻吩)聚苯乙烯磺酸酯。
[0101] 由半导体材料制备的纳米粒子
[0102] 由半导体材料制备的纳米粒子通常是无机纳米粒子。
[0103] 无机纳米粒子通常用在其价带和导带之间表现出相对小的能带隙(Eg)的半导体材料制备。通常，当通常在室温(25℃)下测量时，所述半导体材料具有低于3.0eV的带隙Eg。在一个特定方面，所述材料是如下文进一步描述的本征半导体材料或非本征半导体材料。
[0104] 本征半导体材料通常由门捷列夫(Mendeleev)周期表的IV A族元素例如硅(Si)或锗(Ge)组成，是门捷列夫周期表的III和V族元素的混合组合物例如AlSb、AlN、GaP、GaN、InP、InN等，或者是门捷列夫周期表的II和VI族元素的混合组合物例如ZnSe、ZnTe、CdTe等。
[0105] 非本征半导体材料通常包含以高化学纯度制备的本征半导体或由所述本征半导体组成，其中所述本征半导体材料包含掺杂剂。在一个特定方面，当所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的非本征半导体材料由门捷列夫周期表的IVA族元素组成时，其掺杂有选自Al、B、Ga、In和P的电荷载体。这样的非本征半导体材料可以是其中负电荷载体占优势的n型，或者是其中正电荷载体占优势的p型。典型的非本征p型半导体材料由掺杂有选自铝(Al)、硼(B)、镓(Ga)和铟(In)的带电荷载体的硅(Si)或锗(Ge)组成；典型的非本征p型半导体材料由通常掺杂磷(P)的硅(Si)或锗(Ge)组成。
[0106] 由具有高相对介电常数(相对电容率)、即等于或高于200的绝缘体材料制备的纳米粒子
[0107] 由具有高相对介电常数εijk(也称为相对电容率)的绝缘体材料制备或由所述绝缘体材料组成的纳米粒子通常用带隙Eg等于或高于3.0eV和相对介电常数εijk等于或高于200的材料制备，所述带隙Eg通常在室温(25℃)下测量，而所述相对介电常数εijk通常在20℃和30℃之间以及在102Hz直至红外频率之间测量(参见例如表12-45“无机固体的电容率(介电常数)(Permittivity(dielectric constant)of inorganic solid)”；《化学和物理手册》(Handbook of chemistry and physics)；David R.Lide；第88版；无机固体静电介电常数汇编(Compilation of the static dielectric constant of inorganic solid)
.K.F.Young和H.P.R.Frederikse.J.Phys.Chem.Ref.Data，第2卷，第2期，1973)。
.K.F.Young和H.P.R.Frederikse.J.Phys.Chem.Ref.Data，第2卷，第2期，1973)。
[0108] 这样的纳米粒子通常用介电材料制备，所述介电材料是优选选自BaTiO3、KTaNbO3、KTaO3、SrTiO3、BaSrTiO3等的混合金属氧化物。
[0109] 由具有低相对介电常数(相对电容率)、即等于或低于100的绝缘体材料制备的纳米粒子
[0110] 由具有低相对介电常数的绝缘体材料制备或由所述绝缘体材料组成的纳米粒子通常用带隙Eg等于或高于3.0eV和相对介电常数εijk等于或低于100、优选低于50或低于20的材料制备，所述带隙Eg通常在室温(25℃)下测量，而所述相对介电常数εijk通常在20℃和30℃之间以及102Hz直至红外频率之间测量(参见例如表12-45“无机固体的电容率(介电常数)(Permittivity(dielectric constant)of inorganic solid)”；《化学和物理手册》(Handbook of chemistry and physics)；David R.Lide；第88版；无机固体静电介电常数汇编(Compilation of the static dielectric constant of inorganic solid)
.K.F.Young和H.P.R.Frederikse.J.Phys.Chem.Ref.Data，第2卷，第2期，1973)。
.K.F.Young和H.P.R.Frederikse.J.Phys.Chem.Ref.Data，第2卷，第2期，1973)。
[0111] 这样的纳米粒子通常用介电材料制备，所述介电材料选自金属氧化物，混合金属氧化物，其金属元素来自门捷列夫周期表的第3、5或6周期或者是镧系元素，以及碳材料。所述介电材料优选选自Al2O3、LaAlO3、La2O3、CeO2、SiO2、SnO2、Ta2O5、ZrO2、HfO2、Y2O3和碳金刚石。
[0112] 纳米粒子或纳米粒子聚集体的形状
[0113] 由于所述粒子或聚集体的形状可以影响其“生物相容性”，因此优选形状非常均匀的粒子或聚集体。出于药代动力学原因，因此优选形状基本上为球形、圆形或卵圆形的纳米粒子或聚集体。这样的形状也有利于所述纳米粒子或聚集体与细胞的相互作用或被细胞摄取。球形或圆形形状是特别优选的。
[0114] 所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的形状通常使用透射电子显微术(TEM)来评价。
[0115] 纳米粒子或纳米粒子聚集体的尺寸或大小
[0116] 在本发明的精神中，术语“纳米粒子”或“纳米粒子聚集体”是指尺寸在纳米范围内、通常在1nm和500nm之间的产品，特别是合成产品。
[0117] 术语“纳米粒子的聚集体”或“纳米粒子聚集体”是指纳米粒子强有力地、通常共价地彼此结合的组装体。
[0118] 透射电子显微术(TEM)可用于测量纳米粒子或纳米粒子聚集体的尺寸。动态光散射(DLS)也可用于测量溶液中纳米粒子或纳米粒子聚集体的流体动力学直径。这两种方法还可以一个接一个地使用以比较尺寸量度并确认所述尺寸。优选的方法是DLS(参考国际标准ISO22412粒度分析-动态光散射(Particle Size Analysis-Dynamic Light Scattering)，国际标准化组织(ISO)2008(International Organisation for
Standardisation(ISO)2008))，而溶液中纳米粒子或纳米粒子聚集体的平均流体动力学直径以强度给出。
Standardisation(ISO)2008))，而溶液中纳米粒子或纳米粒子聚集体的平均流体动力学直径以强度给出。
[0119] 通常，最大尺寸或大小是圆形或球形形状的纳米粒子的直径，或卵圆形或椭圆形形状的纳米粒子的最长长度。
[0120] 如本文定义的纳米粒子或聚集体的最大尺寸通常在约2nm和约250nm之间，优选在约4nm或10nm和约100nm或约200nm之间，更加优选在约10nm和约150nm之间。
[0121] 纳米粒子或纳米粒子聚集体的生物相容性包覆层
[0122] 在一个优选实施方式中，在本发明的情形中用于制备目标组合物的纳米粒子或纳米粒子聚集体可以用选自表现出隐形性质的试剂的生物相容性材料包覆。表现出隐形性质的试剂可以是展现空间基团的试剂。这样的基团可以选自例如聚丙烯酸酯；聚丙烯酰胺(聚(N-异丙基丙烯酰胺))；聚酰胺(polycarbamide)；生物聚合物；多糖例如葡聚糖或木聚糖；和胶原。在另一个优选实施方式中，所述纳米粒子或纳米粒子聚集体可以用选自允许与生物靶标相互作用的试剂的生物相容性材料包覆。这样的试剂通常可以在所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的表面上带上正或负电荷。在所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的表面上形成正电荷的试剂可以是例如氨丙基三乙氧基硅烷或聚赖氨酸。在所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的表面上形成负电荷的试剂可以是例如磷酸(盐/酯)(例如多磷酸(盐/酯)、偏磷酸(盐/酯)、焦磷酸(盐/酯)等)、羧酸(盐/酯)(例如柠檬酸(盐/酯)或二羧酸，特别是琥珀酸)或硫酸(盐/酯)。
[0123] 在一个优选实施方式中，用于本发明的情形中的纳米粒子或纳米粒子聚集体呈现亲水性中性表面电荷或包覆有生物相容性材料(即包覆剂)，所述包覆剂选自向纳米粒子赋予中性表面电荷的亲水剂。实际上，当将本发明的纳米粒子施用于对象时，呈现亲水性中性表面电荷的纳米粒子或包覆有选自向纳米粒子赋予中性表面电荷的亲水剂的生物相容剂的纳米粒子特别有利于优化所述纳米粒子在暴露于电刺激/场时在治疗神经系统疾病或其至少一种症状中的用途。
[0124] 向纳米粒子或纳米粒子聚集体赋予中性表面电荷的亲水剂可以是展现选自醇(R-OH)、醛(R-COH)、酮(R-CO-R)、酯(R-COOR)、酸(R-COOH)、硫醇(R-SH)、糖(例如葡萄糖、果糖、核糖)、酸酐(RCOOOC-R)和吡咯的官能团的试剂。所述向纳米粒子或纳米粒子聚集体赋予中性表面电荷的亲水剂可以是单体、二聚体、低聚物、聚合物或共聚物。当所述试剂是低聚物时，它可以是寡糖，例如环糊精。当所述试剂是聚合物时，它可以是聚酯(例如聚(乳酸)或聚羟基链烷酸)、聚醚、聚环氧乙烷、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚己内酯、聚乙烯吡咯烷酮、多糖例如纤维素、聚吡咯等。
[0125] 另外，向纳米粒子或纳米粒子聚集体赋予中性表面电荷的亲水剂可以是展现能够与所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的表面相互作用的特定基团(R-)的试剂。R通常选自硫醇、硅烷、羧基和磷酸基团。
[0126] 当所述纳米粒子或纳米粒子聚集体是导体或半导体和金属纳米粒子时，R优选是硫醇、硫醚、硫酯、二硫戊环或羧基。优选地，所述亲水性中性包覆剂选自硫代葡萄糖、2-巯基乙醇、1-硫代甘油、硫代二甘醇和羟基丁酸。
[0127] 当所述纳米粒子或纳米粒子聚集体是绝缘体、和氧化物或混合氧化物纳米粒子时，R优选是硅烷或磷酸基团。优选地，所述亲水性中性包覆剂是羟甲基三乙氧基硅烷、6-磷酸果糖或6-磷酸葡萄糖化合物。
[0128] 向纳米粒子或纳米粒子聚集体赋予中性表面电荷的亲水剂可以是两性离子化合物，例如氨基酸、肽、多肽、维生素或磷脂。
[0129] 如本领域技术人员所公知的，纳米粒子或纳米粒子聚集体的表面电荷通常通过ζ电位测量，通常在水中、纳米粒子浓度在0.2和10g/L之间、pH在6和8之间、并通常通过添加在水中的浓度为0.001和0.2M例如0.01M或0.15M的电解质来确定。在上述限定的条件下，所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的表面电荷通常包含在-10mV和+10mV之间(对应于中性表面电荷)、-20mV和+20mV之间、或-35mV和+35mV之间。
[0130] 所述纳米粒子或聚集体的完全生物相容性包覆层在本发明的情形中可能是有利的，以便当所述纳米粒子呈现亲水性中性表面电荷时避免所述纳米粒子表面上的任何电荷。“全包覆层”意味着存在非常高密度/紧密度的生物相容性分子，其能够在所述粒子的表面上产生至少完整的单层。
[0132] 稳定性可以通过使用干燥烘箱进行干提取物定量来确认并在过滤之前和之后的纳米粒子悬液上进行测量，所述过滤通常在0.45μm过滤器上进行。
[0133] 有利地，所述包覆层保持所述粒子的体内完整性、确保或改善其生物相容性、并促进其任选的官能化(例如用间隔分子、生物相容性聚合物、靶向剂、蛋白质等)。
[0134] 本发明的生物相容性纳米粒子或纳米粒子聚集体应当既不在体内施用后(即在生理pH下)溶解和释放有毒物质，也不在没有电刺激的情况下表现出氧化还原行为。
[0135] 本文描述的另一特定目的涉及组合物，特别是药物组合物，其包含纳米粒子和/或纳米粒子聚集体，例如上文所定义的，优选与可药用的载体或媒介物一起。
[0136] 特别地，本文描述了一种组合物，所述组合物用于在暴露于电场的对象中预防或治疗如本文所述的神经系统疾病或其至少一种症状，其中所述组合物包含纳米粒子和/或纳米粒子聚集体和可药用的载体，或由纳米粒子和/或纳米粒子聚集体和可药用的载体组成，并且其中所述纳米粒子或纳米粒子聚集体的材料通常选自如上文所解释的导体材料、半导体材料、介电常数εijk等于或高于200的绝缘体材料、和介电常数εijk等于或低于100的绝缘体材料。
[0137] 在一个优选的方面，所述组合物包含至少两种不同的纳米粒子和/或纳米粒子聚集体或由至少两种不同的纳米粒子和/或纳米粒子聚集体组成，每种纳米粒子或纳米粒子聚集体由不同材料组成，所述材料通常选自导体材料、半导体材料、介电常数εijk等于或高于200的绝缘体材料、和介电常数εijk等于或低于100的绝缘体材料。
[0138] 在一个特定方面，所述组合物可包含本发明的纳米粒子或纳米粒子聚集体以及治疗剂。所述治疗剂可选自用于神经系统障碍治疗的任何药物。所述治疗剂通常选自抗精神病药、抗多巴胺能药、多巴胺能药、抗胆碱能药、胆碱能药、抗谷氨酸能药、谷氨酸能药、乙酰胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂、γ-氨基丁酸(GABA)激动剂、肉毒杆菌毒素、抗肌张力障碍药物、抗癫痫药物、抗惊厥药物、情绪稳定剂、抗抑郁药和镇静剂。
[0139] 所述组合物可以是固体、液体(悬浮粒子)、气溶胶、凝胶、糊剂等的形式。优选的组合物是液体或凝胶形式。特别优选的组合物是液体形式。
[0140] 所采用的可药用的承载体或载体可以是对技术人员而言的任何经典载体，例如盐水、等渗、无菌、缓冲溶液、非水性介质溶液等。
[0142] 它可以通过使用本领域技术人员已知的药物制剂技术配制为例如安瓿、气溶胶、瓶子、片剂、胶囊。
[0144] 适当时，可以进行纳米粒子的重复注射或施用。
[0145] 本文描述的纳米粒子或纳米粒子聚集体和包含这样的纳米粒子或纳米粒子聚集体的组合物用于对象，通常用于动物，优选哺乳动物，更加优选用于人类，通常是人类患者，它的年龄或性别不论。
[0146] 在对象的大脑皮质中施用的纳米粒子或纳米粒子聚集体的典型量是在105和1015之间，优选在107和1014之间，更优选在109和1012之间。并且，在对象的大脑皮质中施用的纳米粒子或纳米粒子聚集体的典型量是在102和1012纳米粒子或纳米粒子聚集体/cm3之间。
[0147] 在对象的深脑中施用的纳米粒子或纳米粒子聚集体的典型量是在104和1014之间，优选在106和1012之间，更优选在108和1011之间。并且，在对象的深脑中施用的纳米粒子或纳1 11 3
米粒子聚集体的典型量是在10和10 纳米粒子或纳米粒子聚集体/cm之间。
米粒子聚集体的典型量是在10和10 纳米粒子或纳米粒子聚集体/cm之间。
[0148] 在本发明的情形中，将纳米粒子或纳米粒子聚集体暴露于电场/刺激等同于将已施用纳米粒子或纳米粒子聚集体的对象暴露于电场/刺激。
[0149] 本文还描述了用于在对象中预防或治疗神经系统疾病或其至少一种症状的方法，其中所述方法包括向所述对象施用任何一种本文所述的纳米粒子或纳米粒子聚集体的步骤和将所述对象暴露于电场/刺激的步骤。
[0150] 本文所述的另一个目的涉及包含如本文所述的至少两种不同的纳米粒子和/或至少两种不同的纳米粒子聚集体的试剂盒，每种纳米粒子或纳米粒子聚集体由通常选自如本文所述的导体材料、半导体材料、介电常数εijk等于或高于200的绝缘体材料、和介电常数εijk等于或低于100的绝缘体材料的不同材料组成。
[0151] 在一个特定实施方式中，所述试剂盒在不同的容器中包含如本文所述的不同纳米粒子和/或纳米粒子聚集体(它们被定为在原位、即在靶位点上、或在体外或离体接触，通常是混合，然后将所述混合物沉积在靶位点上)。
[0152] 另一个目的涉及试剂盒，其还包含至少一种不同于本文所述的纳米粒子或纳米粒子聚集体的另外的治疗剂，例如抗精神病药、抗多巴胺能药、多巴胺能药、抗胆碱能药、胆碱能药、抗谷氨酸能药、谷氨酸能药、乙酰胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂、γ-氨基丁酸(GABA)激动剂、肉毒杆菌毒素、抗肌张力障碍药物、抗癫痫药物、抗惊厥药、情绪稳定剂、抗抑郁药和镇静剂，本领域技术人员能够根据所靶向的疾病的性质对其进行选择。
[0153] 本文还描述了这样的试剂盒在用于在对象中预防或治疗本文所述的神经系统疾病或其至少一种症状的方法中的体内、体外或离体用途。本文还公开了如本文所述的试剂盒，其用于预防或治疗对象的神经系统疾病或其至少一种症状。
[0154] 本发明旨在得益于使用暴露于电刺激/场的纳米粒子或纳米粒子聚集体来治疗神经系统疾病或其至少一种症状。
[0155] 在神经元水平，已经描述了纳米粒子提高或抑制神经元的电兴奋性。例如，发现氧化锌、碳纳米管和金纳米粒子会提高神经元的电兴奋性，而发现氧化铜、银、炭黑、氧化铁和氧化钛会抑制神经元的电兴奋性(Polak P&Shefi O.Nanomedicine:Nanotechnology，Biology and Medicine 11(2015)1467-1479，神经科学服务中的纳米级试剂：使用纳米粒子操纵神经元生长和活动(Nanometric agents in the service of neuroscience：Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles))。
[0156] 使用两亲性聚合物聚乙二醇包覆的银纳米粒子(cAgNP)–[cAgNP在纯水中的流体动力学直径为13nm±2nm(动态光散射技术)，ζ电位为-69mV(Zetasizer Nano)])对神经元系统的系统性影响研究显示，纳米粒子诱导影响兴奋性的机制的改变。此外，神经元网络模拟显示，局部cAgNP诱导的改变导致整个网络中网络活动的改变，表明局部应用cAgNP可影响整个网络的活动(Busse M.等人International Journal of Nanomedicine 2013:8 3559-3572，使用计算放大估计纳米粒子对神经元回路的调制效应(Estimating the modulatory effects of nanoparticles on neuronal circuits using computational upscaling))。
[0157] 还有，已经描述了与细胞内金纳米粒子相关的神经元兴奋性增加可能对病理条件例如癫痫发作下的神经元具有有害效应(Jung S等人PLOS ONE 2014，9(3)e91360，细胞内金纳米粒子增加神经元兴奋性并加重小鼠脑中的癫痫发作活动(Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain))。
[0158] 当暴露于电场/刺激时，本发明的纳米粒子或纳米粒子聚集体通过对脑的不同区域内和/或之间的神经元网络内和/或之间的振荡同步化进行正常化而用于预防或治疗神经系统疾病或其至少一种症状。
[0159] 如图2和3所示，在神经系统疾病中，脑的不同区域内和/或之间的通信受影响。根据神经系统障碍和相关症状，将脑的特定区域暴露于本发明的纳米粒子(参见表2)，当与电刺激组合时，将通过对脑的不同区域内和/或之间的神经元网络内和/或之间的振荡同步化进行正常化(即，相干性的正常化)来改善通信(图4和5以及表2)。
[0160] 表2：一种类型的纳米粒子与一种类型的电刺激技术的组合用于治疗不同的神经系统障碍。
[0161]
[0162]
[0163] 如技术人员容易理解的，电刺激对神经网络的效果与脑靶区域内电场的穿透深度和空间分辨率有关。空间分辨率和穿透深度差是电刺激的重要缺点。现在，本发明的纳米粒子或纳米粒子聚集体的存在有利地允许所述纳米粒子定位处电场的空间分辨率(聚焦性)提高以及电流穿透深度提高(增加其治疗效果)。
[0164] 纳米粒子或纳米粒子聚集体在所述靶组织中的存在还允许降低神经元刺激所需的外加/感应电刺激阈值，即，它减小所应用的参数如电流、电压、脉冲宽度和/或频率的值。此效果还降低了与外加/感应电流相关的潜在毒性。这也可具有技术影响，例如增加内部脉冲发生器(IPG)电池的寿命或修改(减小)DBS电极的尺寸和几何形状。
附图说明
[0166] 图1.脑的示意图(矢状面)。
[0167] 图2.两个神经元网络之间的超同步和同步受损。
[0168] 图3.各种神经系统疾病所涉及的脑区。
[0169] 图4.纳米粒子(NP1)当暴露于电场(E)时对超同步(运动障碍)正常化的效应。
[0170] 图5.纳米粒子(NP2)当暴露于电场(E)时对同步受损(精神和认知障碍)正常化的效应。
[0171] 图6.用MPP+处理诱导帕金森氏病和电活动记录的实验方案。
[0172] 从E14.5NMRI小鼠制备小鼠腹侧中脑/皮质共培养物，并在48孔MEA上培养3周(培+养期)。培养7天后(第7天)用纳米粒子的悬液(“纳米粒子”组)或水(“对照”组和“MPP”组)处理培养物，在第8天用MPP+(20μM)(“纳米粒子”组和“MPP+”组)或水(“对照”组)处理。在第
21天记录自发活动。在第21天记录后，在一个电极上电刺激培养物，并在未刺激的电极上进行活动记录。
21天记录自发活动。在第21天记录后，在一个电极上电刺激培养物，并在未刺激的电极上进行活动记录。
[0173] 图7.两个简化爆发的方案概况了可以从电活动记录中提取的一些参数。指示了描述一般活动(峰电位(spike)，爆发(burst)，爆发间隔(IBI)和爆发期)和爆发结构(爆发持续时间，爆发平台，爆发幅度，爆发峰电位间隔(ISI)和爆发面积)的参数。这些参数的标准偏差(SD)分别是一般活动和爆发结构的规律性的度量。时间变化系数(CV时间)反映了每个单元的活动模式的时间规律性。CV时间由参数的标准偏差和平均值之比计算。网络之间的变化系数(CV网络)反映了网络内神经元之间的同步化。CV网络通过网络上参数的标准偏差与平均值之比计算。大的CV网络值暗示跨网络的活动变化范围广，意味着同步化较低。
[0174] 图8.与“对照”组(在电刺激下)和“MPP+”组(在电刺激下)相比，在电刺激下的“纳米粒子”组中观察到的对中脑/皮质网络活动的功能效应。在电刺激下在测试的纳米粒子存在或不存在时以及“对照”组(在电刺激下)所有MPP+诱导的对网络活动的功能效应被归一化为“刺激前”活动，即在第21天测量的活动，设定为各实验的100％。数据显示在电刺激下MPP+诱导的功能效应，并证明本发明的纳米粒子在电刺激下的预防/拯救功效(即，能够将功能效应预防/拯救到与“对照”组相似的水平)。
[0175] 图9.对“纳米粒子”组、“对照”组(效应评分＝0)和“MPP+”组(效应评分＝1)的效应评分分析。
[0176] 图10.用淀粉样蛋白β1-42(Aβ1-42)诱导阿尔茨海默氏病的实验方案，治疗和电活动记录。在培养4周(培养期)后，将Aβ1-42(100nM)(“纳米粒子”组和“Aβ”组)或水(“对照”组)(T0)添加到神经元网络中。四(4)小时后，添加所述纳米粒子悬液(“纳米粒子”组)或水(“对照”组和“Aβ”组)。如下记录自发活动：
[0177] --T0时(添加Aβ1-42之前)
[0178] --T0+1h、T0+2h、T0+3h、T0+4h(添加纳米粒子或水之前)、T0+5h和T0+6h时[0179] 图11.与“对照”组(在电刺激下)和“Aβ1-42”组(在电刺激下)相比，在电刺激下的“纳米粒子”组中观察到的对皮质活动的功能效应。在电刺激下在测试的纳米粒子存在或不存在时以及“对照”组(在电刺激下)所有Aβ1-42-诱导的对网络活动的功能效应被归一化为“刺激前”活动，即在T0+6小时时测量的活动，设定为各实验的100％。
[0180] 数据显示在电刺激下Aβ1-42功能效应，并证明本发明的纳米粒子在电刺激下的拯救功效(即，能够将功能效应拯救到与“对照”组相似的水平)。
[0181] 图12.对“纳米粒子”组、“对照”组(效应评分＝0)和“Aβ”组(效应评分＝1)的效应评分分析。实施例
[0182] 模拟
[0183] 可使用模拟来评估暴露于电刺激(电场)的纳米粒子对神经元网络的效应。
[0184] 神经元的体外研究
[0185] 在神经元水平下，膜片钳技术对于检测动作电位非常有用，因为它允许同时直接测量和控制神经元的膜电位。
[0186] 该技术用于评估纳米粒子对单个神经元的效应。
[0187] 神经元网络的体外研究
[0188] 多电极阵列(MEA)允许刺激和记录大量神经元(神经元网络)。MEA上的分散神经元培养物提供了简化的模型，其中可以通过阵列的多个电极用电刺激序列操纵网络活动。该技术对于评估网络和细胞水平的生理相关问题非常有用，引起对脑功能和功能失常的更好了解。
[0189] 与MEA耦合的分散神经元培养物确实被广泛用于更好地了解脑网络的复杂性。另外，使用分散神经元组装体允许操纵和控制网络的连接性。使用与MEA偶合的分散神经元培养物允许其中可以通过装置的相同电极传递的电脉冲来细胞外刺激神经元的实验设计。以这种方式，研究如何可通过电刺激调制新兴的神经元动力学，以及因此，是否修改了根本的功能连接性，将变得合理(Poli D.等人，Frontiers in Neural Circuits，2015，9(article 57)，1-14：体外神经元组装体中的功能连接性(Functional connectivity in in vitro neuronal assemblies))。
[0190] 所述MEA系统使得能够实时地从神经元网络中的多个位点进行非侵入性、持久、同时的细胞外记录，增加空间分辨率，从而提供稳健的网络活动量度。长时间同时收集动作电位和场电位数据允许监测由负责时空模式生成的所有细胞机制的相互作用产生的网络功能(Johnstone A.F.M.等人，Neurotoxicology(2010)，31：331-350，微电极阵列：21世纪基于生理学的神经毒性测试平台(Microelectrode arrays：a physicologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century))。与膜片钳和其他单电极记录技术相比，MEA测量整个网络的响应，整合了网络中存在的所有受体、突触和神经元类型相互作用的总体信息(Novellino A.等人，Frontiers in Neuroengineering.(2011)，4(4)，1-14，开发基于微电极阵列的神经毒性测试：用神经活性化学物质评估实验室间重复性(Development of micro-electrode array based tests for neurotoxicity：
assessment of interlaboratory reproducibility with neuroactive chemicals))。因此，MEA记录已被用于了解神经元培养物中的神经元通信、信息编码、传播和处理(Taketani,M.和Baudry,M.(2006)《. 网络电生理学进展》(Advances in Network Electrophysiology).New York，NY：Springer；Obien等人，Frontiers in Neurosciences，
2015，8(423)：通过微电极阵列记录揭示神经元功能(Revealing neuronal functions through microelectrode array recordings))。MEA技术是一种复杂的表型高内涵筛选法，用于表征电活性细胞培养物中网络活动的功能变化，并且它对神经发生以及神经再生和神经变性方面非常敏感。此外，已知在MEA上生长的神经元网络能够对改变完整哺乳动物神经系统功能的大致相同浓度范围内的神经活性或神经毒性化合物做出反应(Xia等人，Alcohol，2003，30，167-174：培养的神经元网络对乙醇的组织型电生理反应(Histiotypic electrophysiological responses of cultured neuronal networks to ethanol)；
Gramowski等人，European Journal of Neuroscience，2006，24，455-465：用在多电极神经芯片上生长的原代皮质神经元网络功能性筛选传统抗抑郁药(Functional screening of traditional antidepressants with primary cortical neuronal networks grown on multielectrode neurochips)；Gramowski等人，Frontiers in Neurology，2015，6(158)：
通过用交替10和16Hz调制进行脉冲的150MHz载波电磁场刺激来提高体外皮质网络活动和促进GABA能神经发生(Enhancement of cortical network activity in vitro and promotion of GABAergic neurogenesis by stimulation with an electromagnetic field with 150MHz carrier wave pulsed with an alternating 10and 16Hz
modulation))。
assessment of interlaboratory reproducibility with neuroactive chemicals))。因此，MEA记录已被用于了解神经元培养物中的神经元通信、信息编码、传播和处理(Taketani,M.和Baudry,M.(2006)《. 网络电生理学进展》(Advances in Network Electrophysiology).New York，NY：Springer；Obien等人，Frontiers in Neurosciences，
2015，8(423)：通过微电极阵列记录揭示神经元功能(Revealing neuronal functions through microelectrode array recordings))。MEA技术是一种复杂的表型高内涵筛选法，用于表征电活性细胞培养物中网络活动的功能变化，并且它对神经发生以及神经再生和神经变性方面非常敏感。此外，已知在MEA上生长的神经元网络能够对改变完整哺乳动物神经系统功能的大致相同浓度范围内的神经活性或神经毒性化合物做出反应(Xia等人，Alcohol，2003，30，167-174：培养的神经元网络对乙醇的组织型电生理反应(Histiotypic electrophysiological responses of cultured neuronal networks to ethanol)；
Gramowski等人，European Journal of Neuroscience，2006，24，455-465：用在多电极神经芯片上生长的原代皮质神经元网络功能性筛选传统抗抑郁药(Functional screening of traditional antidepressants with primary cortical neuronal networks grown on multielectrode neurochips)；Gramowski等人，Frontiers in Neurology，2015，6(158)：
通过用交替10和16Hz调制进行脉冲的150MHz载波电磁场刺激来提高体外皮质网络活动和促进GABA能神经发生(Enhancement of cortical network activity in vitro and promotion of GABAergic neurogenesis by stimulation with an electromagnetic field with 150MHz carrier wave pulsed with an alternating 10and 16Hz
modulation))。
[0191] 该技术用于评估纳米粒子对神经元网络的效应。
[0192] 神经元网络的体内研究
[0193] 考虑适当的动物模型来评估本发明的纳米粒子在暴露于电刺激时对动物的神经元网络的效应。
[0194] 例如，帕金森氏病的小鼠模型用于评估由tDCS(经颅直流电刺激)刺激的纳米粒子对缓解行为损害(运动障碍)的效应。此外，阿尔茨海默氏病的大鼠模型用于评估由tDCS刺激的纳米粒子对动物的空间学习和记忆功能失常(认知障碍)的效应。
[0195] 实施例1.用导体材料制备的纳米粒子：用具有中性表面电荷的生物相容性包覆层包覆的金纳米粒子的合成。
[0196] 通过用封端剂(柠檬酸钠)还原氯化金盐(HAuCl4)来合成金纳米粒子(方案改编自G.Frens Nature Physical Science 241(1973)21)。在典型的实验中，将HAuCl4溶液加热至沸。随后，添加柠檬酸钠溶液。将所生成的溶液在沸腾下再维持5分钟。
[0197] 进行所述纳米粒子悬液的0.22μm过滤(滤膜：聚(醚砜)(PES))，并通过紫外-可见光谱测定法于530nm确定悬液中的金浓度。
[0198] 使用α-甲氧基-ω-巯基聚(乙二醇)20kDa(“硫醇-PEG20kDa”)进行表面包覆。将足量的“硫醇-PEG 20kDa”添加到所述纳米粒子悬液中，以在所述金纳米粒子表面上达到至少2
半单层覆盖度(2.5分子/nm)。将pH调节至7和7.2之间，并将所述纳米粒子悬液搅拌过夜。
半单层覆盖度(2.5分子/nm)。将pH调节至7和7.2之间，并将所述纳米粒子悬液搅拌过夜。
[0199] 通过将所述纳米粒子悬液在水中稀释(终浓度：0.1g/L)，用Nano-Zetasizer(Malvern)用在633nm下发射的激光以173°散射角进行动态光散射(DLS)，确定流体动力学直径(以强度进行量度)。发现如此获得的生物相容性金纳米粒子在悬液中的流体动力学直径等于118nm，多分散指数(纳米粒子群体在尺寸上的分散度)为0.13。
[0200] 通过将所述纳米粒子悬液在pH 7的1mM NaCl溶液中稀释(终浓度：0.1g/L)来测量所述纳米粒子的电泳迁移率(Nano-Zetasizer，Malvern)，确定ζ电位。发现pH 7下的ζ电位等于-1mV。
[0201] 实施例2.用导体材料制备的纳米粒子：用具有负表面电荷的生物相容性包覆层包覆的金纳米粒子的合成。
[0202] 如实施例1中所述制备金纳米粒子(相同的金无机核)。
[0203] 在PES膜滤器上进行0.22μm过滤并通过紫外-可见光谱测定法于530nm确定悬液中的金浓度。
[0204] 使用内消旋-2,3-二巯基琥珀酸(DMSA)进行生物相容性表面包覆。将足量的DMSA2
添加到所述纳米粒子悬液中，以在表面上达到至少半单层覆盖度(2.5分子/nm)。将pH调节至7和7.2之间，并将所述纳米粒子悬液搅拌过夜。
添加到所述纳米粒子悬液中，以在表面上达到至少半单层覆盖度(2.5分子/nm)。将pH调节至7和7.2之间，并将所述纳米粒子悬液搅拌过夜。
[0205] 通过将所述纳米粒子悬液在水中稀释(终浓度：0.1g/L)，用Nano-Zetasizer(Malvern)用在633nm下发射的激光以173°散射角进行动态光散射(DLS)，确定流体动力学直径(以强度进行量度)。如此获得的纳米粒子在悬液中的流体动力学直径等于76nm，多分散指数(纳米粒子群体在尺寸上的分散度)为0.46。
[0206] 通过将所述纳米粒子悬液在pH 7的1mM NaCl溶液中稀释(终浓度：0.1g/L)来测量所述纳米粒子的电泳迁移率(Nano-Zetasizer，Malvern)，确定ζ电位。发现pH 7下的ζ电位等于-23mV。
[0207] 实施例3.用具有等于或低于100的低相对介电常数的绝缘体材料制备的纳米粒子：用具有中性表面电荷的生物相容性包覆层包覆的氧化锆纳米粒子的合成。
[0208] 通过在碱性pH下用四甲基氢氧化铵(TMAOH)沉淀氯化锆(ZrCl4)来合成氧化锆(ZrO2)纳米粒子。将所生成的悬浮液转移到高压釜中并在高于110℃的温度下加热。冷却后，将悬液用去离子水洗涤并酸化。
[0209] 在PES膜滤器上进行0.22μm过滤，并通过将所述水溶液干燥成粉末并称量所得的质量来确定(ZrO2)纳米粒子的浓度。
[0210] 使用硅烷-聚(亚乙基)二醇2kDa(“Si-PEG 2kDa”)制备生物相容性包覆层。将足量的“Si-PEG 2kDa”添加到所述纳米粒子悬液中，以在表面上达到至少半单层覆盖度(2.5分子/nm2)。将所述纳米粒子悬液搅拌过夜，随后将pH调节至7。
[0211] 通过将所述纳米粒子悬液在水中稀释(终浓度：0.1g/L)，用Nano-Zetasizer(Malvern)用在633nm下发射的激光以173°散射角进行动态光散射(DLS)，确定流体动力学直径(以强度进行量度)。发现所述纳米粒子的流体动力学直径等于55nm，多分散指数(纳米粒子群体在尺寸上的分散度)为0.1。
[0212] 通过将所述纳米粒子悬液在pH 7的1mM NaCl溶液中稀释(终浓度：0.1g/L)来测量所述纳米粒子的电泳迁移率(Nano-Zetasizer，Malvern)，确定ζ电位。发现pH 7下的ζ电位等于-1mV。
[0213] 实施例4.用具有等于或低于100的低相对介电常数的绝缘体材料制备的纳米粒子：用具有负表面电荷的生物相容性包覆层包覆的氧化锆纳米粒子的合成。
[0214] 如实施例3中所述制备氧化锆纳米粒子(相同的无机核)。
[0215] 在PES膜滤器上进行0.22μm过滤，并通过将所述水悬液干燥成粉末并称量所得的质量来确定(ZrO2)纳米粒子的浓度。
[0216] 使用六偏磷酸钠进行表面官能化。将足够质量的六偏磷酸钠添加到所述纳米粒子悬液中，以在表面上达到至少半单层覆盖度(2.5分子/nm2)。将所述纳米粒子悬液搅拌过夜，随后将pH调节至7。
[0217] 通过将所述纳米粒子悬液在水中稀释(终浓度：0.1g/L)，用Nano-Zetasizer(Malvern)用在633nm下发射的激光以173°散射角进行动态光散射(DLS)，确定流体动力学直径(以强度进行量度)。发现所述纳米粒子的流体动力学直径等于70nm，多分散指数(纳米粒子群体在尺寸上的分散度)为0.11。
[0218] 通过将所述纳米粒子悬液在pH 7的1mM NaCl溶液中稀释(终浓度：0.1g/L)来测量所述纳米粒子的电泳迁移率(Nano-Zetasizer，Malvern)，确定ζ电位。发现pH 7下的ζ电位等于-33mV。
[0219] 实施例5.用半导体材料制备的纳米粒子：用具有负表面电荷的生物相容性包覆层包覆的硅纳米粒子。
[0220] 硅(Si)纳米粒子(粉末)获自US Research Nanomaterials Inc.。将它们在超声处理(用探头)下以30g/L分散在水中。
[0221] 在PES膜滤器上进行0.22μm过滤，并通过将所述悬液干燥成粉末并称量所得的质量来确定(Si)纳米粒子的浓度。
[0222] 通过将所述纳米粒子悬液在水中稀释(终浓度：0.1g/L)，用Nano-Zetasizer(Malvern)用在633nm下发射的激光以173°散射角进行动态光散射(DLS)，确定流体动力学直径(以强度进行量度)。发现所述纳米粒子的流体动力学直径等于164nm，多分散指数(纳米粒子群体在尺寸上的分散度)为0.16。
[0223] 通过将所述纳米粒子悬液在pH 7的1mM NaCl溶液中稀释(终浓度：0.1g/L)来测量所述纳米粒子的电泳迁移率(Nano-Zetasizer，Malvern)，确定ζ电位。发现pH 7下的ζ电位等于-19mV。
[0224] 实施例6.用具有等于或高于200的高相对介电常数的绝缘体材料制备的纳米粒子：用具有负表面电荷的生物相容性包覆层包覆的钛酸钡纳米粒子。
[0225] 钛酸钡(BaTiO3)纳米粒子悬液(20wt％，在水中)得自US Research Materials Inc.(US3835)。
[0226] 使用硅烷-聚(亚乙基)二醇10kDa(“Si-PEG 10kDa”)进行表面官能化。简而言之，首先将“Si-PEG 10kDa”溶解在乙醇/水溶液(1/3v/v)中并添加到BaTiO3悬液(20wt％，在水中)中以实现纳米粒子表面上的完整单层覆盖度。将悬液超声处理，随后搅拌过夜。在0.22μm过滤(过滤膜：聚(醚砜))之后，进行洗涤步骤以消除未反应的“Si-PEG10kDa”聚合物。
[0227] 通过将所述纳米粒子悬液在水中稀释(终浓度：0.1g/L)，用Nano-Zetasizer(Malvern)用在633nm下发射的激光以173°散射角进行动态光散射(DLS)，确定流体动力学直径(以强度进行量度)。发现所述纳米粒子的流体动力学直径等于164nm，多分散指数(纳米粒子群体在尺寸上的分散度)为0.16。
[0228] 通过将所述纳米粒子悬液在pH 7的1mM NaCl溶液中稀释(终浓度：0.1g/L)来测量所述纳米粒子的电泳迁移率(Nano-Zetasizer，Malvern)，确定ζ电位。发现pH 7下的ζ电位为-11mV。
[0229] 实施例7.使用表型MEA筛选技术评估暴露于电刺激的来自实施例1、2、5和6的纳米粒子对MPP+诱导的神经元网络的预防/拯救功效。
[0230] 在48孔MEA上培养3周的MPP+处理的小鼠中脑腹侧/皮质共培养物上测试本发明的纳米粒子的预防/拯救功效。该模型代表了用于筛选化合物的体外帕金森模型，其基于使用在MEA上生长的受攻击的中脑/皮质培养物的多巴胺能神经元功能拯救。中脑是脑的一个区域，包含黑质，所述黑质是基底神经节的一部分并含有大多数多巴胺能神经元。通过测量铺在微电极阵列(MEA)芯片上的神经元共培养物的细胞外电活动来进行纳米粒子的预防/拯救效果评价。
[0231] 用1-甲基-4-苯基碘化吡啶鎓(MPP+)体外诱导小鼠神经元中的帕金森症表型。有+强有力的证据表明线粒体损伤在帕金森氏病(PD)的发病机制中发挥作用。发现MPP是线粒体毒物，其通过阻断电子传递酶复合物I(NADH：泛醌氧化还原酶)来抑制细胞呼吸。几个实验室报道了PD患者尸检组织的黑质中线粒体电子传递链复合物I存在选择性缺陷，并且早期PD患者血小板复合物I活性也有降低(Peng J.等人，Journal of Biomolecular screening，2013，18(5)，522-533：使用人多能干细胞衍生的多巴胺能神经元在MPP+和鱼藤酮模型中评价候选帕金森氏病治疗剂(Using human pluripotent stem cell-derived dopaminergic neurons to evaluate candidate Parkinson’s disease therapeutic agents in MPP+and rotenone models.))。
[0232] 材料和方法
[0233] 原代细胞培养，治疗条件和电刺激
[0234] 从胚胎第14.5天chr:NMRI小鼠(Charles River)收获中脑组织。通过颈脱位处死小鼠。将组织通过酶消化(133,3Kunitz单位/ml DNase；10单位/ml木瓜蛋白酶)和机械研磨进行解离，计数，活力控制，并在含有层粘连蛋白(10μg/ml)、10％胎牛血清和10％马血清的20μl DMEM液滴中在MEA上铺板。在MEA上的培养物在37℃下10％CO2气氛中温育直至准备使用。每周两次用含有10％马血清的DMEM补充培养基。
[0235] 在“纳米粒子”组中，在第7天用来自实施例1、2、5的纳米粒子悬液(800μM)和来自实施例6的纳米粒子悬液(2000μM)、然后在第8天用20μM MPP+处理孔。在“对照”组中，在第7天将水添加到孔中，然后在第8天添加水。在“MPP+”组中，在第7天向孔添加水，然后在第8天添加20μM MPP+。加入MPP+(或“对照”组的水)后二十四(24)小时，改变培养基以实现洗去MPP+。随后每周更换培养基两次。
[0236] 在第21天，记录120分钟的神经元活动，并分析30分钟的稳定活动。在第21天记录后，通过电刺激在主动峰电位发放电极之一处激活所有孔。所述刺激进行30分钟(48孔MEA中每孔1个电极的刺激，最小刺激持续时间＝100μs，脉冲后2ms的伪迹消除，脉冲10x双相+/-500mV)。将未刺激的电极的响应进行平均并针对刺激前活动进行归一化(图6)。
[0237] 微电极阵列神经芯片
[0238] 48孔微电极阵列神经芯片购自Axion Biosystems Inc.。这些芯片每孔具有16个被动电极。用聚乙烯亚胺(PEI，50％，在硼酸盐缓冲液中)包被表面1小时，洗涤并晾干。
[0239] 多通道记录和多参数数据分析
[0240] 为了记录，使用Axion Biosystems(USA)的多通道MAESTRO记录系统。对于细胞外记录，将48孔MEA置于MAESTRO记录站中并维持在37℃。在DMEM/10％热灭活的马血清中进行记录。用有10％CO2的过滤的加湿气流连续流将pH维持在7.4。
[0241] 每个单元代表源自在一个电极处记录的一个神经元的活动。单元在记录开始时分开。对于每个单元，动作电位(即峰电位)被记录为峰电位序列，其群集成所谓的“爆发”。使用Spike Wrangler和NPWaveX程序(均为NeuroProof GmbH，Rostock，德国)通过直接峰电位序列分析定量描述爆发。爆发由短的峰电位事件的开始和结束来限定(图7)。
[0242] 通过对网络活动模式的多参数高内涵分析，提取了204个描述活动的峰电位序列参数。这些参数允许获得以下四类活动变化的精确描述：一般活动，爆发结构，振荡行为和同步性。
[0243] -“一般活动参数”的变化以爆发之间的时间描述了对动作电位发放率(峰电位率)、爆发率和爆发期的影响。
[0244] -“爆发结构参数”不仅定义了高频峰电位发放期(“爆发”)内的峰电位内部结构，例如爆发中的峰电位频率、爆发中的峰电位率和爆发峰电位密度，而且还定义了爆发的整体结构，例如持续时间、面积和平台。
[0245] -“振荡参数”量化了爆发发生或结构的规律性，其通过描述实验事件内参数(一般活动，爆发结构)变化性的主要活动参数的变化系数来计算(Gramowski A.等人，Eur.J.Neurosci.，2004，19，2815-2825：通过定量表征微电极阵列上小鼠脊髓网络中的振荡器活动进行物质鉴定(Substance identification by quantitative
characterization of oscillator activity in murine spinal cord networks on microelectrode arrays))。越高的值指示越不规则的爆发结构或越不规则的一般活动(例如，峰电位发放，爆发发放)。
characterization of oscillator activity in murine spinal cord networks on microelectrode arrays))。越高的值指示越不规则的爆发结构或越不规则的一般活动(例如，峰电位发放，爆发发放)。
[0246] -作为峰电位序列中同步性的度量，“CV网络参数”反映了网络内神经元之间的“同步化”(Gramowski A.等人，Eur.J.Neurosci.，2004，19，2815-2825：通过定量表征微电极阵列上小鼠脊髓网络中的振荡器活动进行物质鉴定(Substance identification by quantitative characterization of oscillator activity in murine spinal cord networks on microelectrode arrays))。CV网络是网络上的变异系数。大的CV网络值暗示着跨网络活动的变化范围很大，意味着同步化较低。(Gramowski A.等人，Frontiers in Neurology，2015，6(158)：通过用交替10和16Hz调制进行脉冲的150MHz载波电磁场刺激来提高体外皮质网络活动和促进GABA能神经发生(Enhancement of cortical network activity in vitro and promotion of GABAergic neurogenesis by stimulation with an electromagnetic field with 150MHz carrier wave pulsed with an alternating
10and 16Hz modulation))。
10and 16Hz modulation))。
[0247] 通过上述参数评价在电刺激下MPP+诱导的对神经元网络的功能效应和本发明的纳米粒子在电刺激下的预防/拯救功效(在下面的表3中也概括了其中的一些)。
[0248] 表3：来自多参数数据分析的活动描述参数在以下四个类别中：一般活动，爆发结构，振荡行为和同步性。
[0249]
[0250]
[0251] 在存在或不存在测试的纳米粒子的情况下，在电刺激下MPP+诱导的对网络活动的功能效应被归一化为“刺激前”活动，即在第21天测量的活动，设定为各实验的100％。与自发天然活动相关的值来源于在30分钟活动稳定后从30分钟跨度取得的60秒bin数据。结果(参数值)表示为独立网络的平均值±SEM。所述分析中包括每个“纳米粒子”组至少8个有效孔、“对照”组至少30个有效孔、“MPP+”组至少26个有效孔(“有效”意指具有足够数量测量电活动的电极的孔)。测试绝对参数的分布的正态性，并通过单向ANOVA评估组间的统计学显著性。
[0252] 图8示出了以下类别的一些代表性参数：振荡行为和同步性。这些参数表征了在电刺激下MPP+诱导的功能效应以及本发明的纳米粒子在电刺激下提供的预防/拯救功效(即，能够将功能效应预防/拯救到与“对照”组相似的水平)。
[0253] 为了评价复合效应，将选择的204个参数的多参数结果投射到称为“效果评分”的单个参数中。它是所选特征的线性组合，将数据集转换为矢量，其中“对照”组暴露于平均值为“0”的电场，而“MPP+”组暴露于平均值为“1”的电场。通过所测量的204个参数中的18个的特征选择进行效应评分的Z因子的计算，优化以找到“对照”组和“MPP+”组之间的最佳区分(Kümmel A等人.J Biomol Screen.，2010，15(1),95-101：将多个读数整合到z'因子中以进行分析质量评估(Integration of multiple readouts into the z'factor for assay quality assessment))。效应评分分析在图9中显示。
[0254] 表4中显示了暴露于电刺激的本发明纳米粒子的预防/拯救功效。表4：暴露于电场的本发明纳米粒子对MPP+诱发的对于只暴露于电场的神经元网络的效应的效应评分和预防/拯救功效的总结。
[0255]
[0256]
[0257] DBS对帕金森氏病症状的治疗自2002年起获得FDA批准。在本发明的情形中结合本文描述的纳米粒子可用的最常用的刺激参数是：频率130至185Hz；脉冲宽度60至210μs和电压振幅1至3.5V。在本文所述的实验中，在神经元网络共培养物上进行30分钟刺激，刺激＝10个双相脉冲(脉冲持续时间＝100μs)，脉冲幅度＝+/-500mV，脉冲频率＝20Hz，并且脉冲序列周期＝0.2Hz。
[0258] 图12、13和表4显示用本发明的纳米粒子预处理神经元网络并暴露于电场，防止/拯救了在电场下MPP+诱导的对神经元网络的功能效应。有趣的是，对于与振荡行为和同步性相关的类别中的参数，观察到所述预防/拯救功效，并且其可以达到直至“对照”组中观察到的水平。监测这些振荡行为和同步化参数，作为网络发展改变的度量。在暴露于电刺激的本发明的纳米粒子存在下，可以有利地拯救这些参数。
[0259] 这些结果突出了本申请中描述的纳米粒子在暴露于电场时，在拯救在电场下MPP+诱导的对神经元网络的功能效应中的有利性能。
[0260] 实施例8：使用表型MEA筛选技术评价暴露于电刺激的来自实施例2、3、4和5的纳米粒子对淀粉样蛋白β1-42诱导的对原代小鼠神经元网络的功能效应的效应
[0261] 暴露于电刺激的本发明纳米粒子的拯救功效在小鼠神经元的额叶皮质培养物中在淀粉样蛋白β1-42(Aβ1-42)诱导的阿尔茨海默病模型上通过MEA进行体外测试。
[0262] 为了诱导阿尔茨海默病相关的功能表型，将合成的HFIP(六氟异丙醇)处理的Aβ1-42肽(HFIP处理产生淀粉样蛋白β的单体)以亚毒性剂量(100nM)使用。高水平的淀粉样蛋白-β(Aβ)减少谷氨酸能突触传递并引起突触损失(Palop等人，Nat Neurosci.，2010，13(7)，812-818：淀粉样蛋白-β诱导阿尔茨海默病的神经元功能失常：从突触到神经网络(Amyloid-beta induced neuronal dysfunction in Alzheimer’s disease：from synapses toward neural networks)；Hsia等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，1999，96，3228-
3233：阿尔茨海默病小鼠模型中斑块不依赖性神经回路破坏(Plaque-independent disruption of neural circuits in Alzheimer’s disease mouse models))。Aβ的产生及其向细胞外空间的分泌受到体外和体内神经元活动的严格调节。增加神经元活动提高了Aβ产生，而阻断神经元活动具有相反的效应。Aβ的这种突触调节至少部分是由突触前端的表面淀粉样前体蛋白(APP)的网格蛋白依赖性内吞作用、APP的内体蛋白水解切割和突触末梢的Aβ释放介导的。(Cirrito等人，Neuron，2005，48，913-922：突触活动调节体内间质液β淀粉样蛋白水平(Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo))。
3233：阿尔茨海默病小鼠模型中斑块不依赖性神经回路破坏(Plaque-independent disruption of neural circuits in Alzheimer’s disease mouse models))。Aβ的产生及其向细胞外空间的分泌受到体外和体内神经元活动的严格调节。增加神经元活动提高了Aβ产生，而阻断神经元活动具有相反的效应。Aβ的这种突触调节至少部分是由突触前端的表面淀粉样前体蛋白(APP)的网格蛋白依赖性内吞作用、APP的内体蛋白水解切割和突触末梢的Aβ释放介导的。(Cirrito等人，Neuron，2005，48，913-922：突触活动调节体内间质液β淀粉样蛋白水平(Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo))。
[0263] 材料和方法
[0264] 原代细胞培养
[0265] 从胚胎第15/16日chr:NMRI小鼠(Charles River)收获额叶皮质组织。通过颈脱位处死小鼠。将组织通过酶消化(133,3Kunitz单位/ml DNase；10单位/ml木瓜蛋白酶)解离并机械研磨，计数，活力控制，并在含有层粘连蛋白(10μg/ml)、10％胎牛血清和10％马血清的20μl DMEM液滴中在MEA上铺板。在MEA上的培养物在37°下10％CO2气氛中温育直至准备使用。每周两次用含有10％马血清的DMEM补充培养基。在接种后第5天用有丝分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷(25μM)和尿苷(63μM)处理发育中的共培养物，以防止进一步的神经胶质增殖。
[0266] 在“纳米粒子”组中，首先在T0时用Aβ1-42(合成的HFIP处理的淀粉样蛋白-β1-42肽)处理孔(T0在28天体外培养期结束时)。然后在独立和平行实验中用来自实施例2、3、4和5的纳米粒子悬液(每种悬液的浓度为800μM)在T0+4小时时处理孔。在“对照”组中，在T0时、然后在T0+4小时时向孔添加水。在“Aβ”组中，在T0时将Aβ1-42添加到孔中，然后在T0+4小时时向孔中添加水。
[0267] 如下记录神经元活动：
[0268] --在T0时，添加Aβ1-42(或“对照”组中的水)之前
[0269] --在T0+1h、T0+2h、T0+3h、T0+4h(在“纳米粒子组”中添加纳米粒子或在对照组中添加“水”之前)、T0+5h和T0+6h。
[0270] 数值源自于在30分钟活动稳定后从30分钟跨度取得的60秒bin数据。
[0271] 在T0+6h时记录后，通过电刺激在所述主动峰电位发放电极之一处激活所有孔。所述刺激进行30分钟(48孔MEA中每孔1个电极的刺激，最小刺激持续时间＝100μs，脉冲后2ms的伪迹消除，脉冲10x双相+/-500mV)。将未刺激的电极的响应进行平均并针对刺激前活动进行归一化(图10)。
[0272] 微电极阵列神经芯片
[0273] 48孔微电极阵列神经芯片购自Axion Biosystems Inc.。这些芯片每孔具有16个被动电极。用聚乙烯亚胺(PEI，50％，在硼酸盐缓冲液中)包被表面1小时，洗涤并风干。
[0274] 多通道记录和多参数数据分析
[0275] 为了记录，使用来自Axion Biosystems(USA)的多通道MAESTRO记录系统。对于细胞外记录，将48孔MEA置于MAESTRO记录站中并维持在37℃。在DMEM/10％热灭活的马血清中进行记录。用有10％CO2的过滤的加湿气流连续流将pH维持在7.4。所述动作电位，或“峰电位”，是在峰电位序列中记录的并群集成所谓的“爆发”。使用Spike Wrangler和NPWaveX程序(均为NeuroProof GmbH，Rostock，德国)通过直接峰电位序列分析定量描述爆发。爆发由短的峰电位事件的开始和结束来限定(图7)。
[0276] 通过对网络活动模式的多参数高内涵分析，提取了204个描述活动的峰电位序列参数。这些参数允许获得如下四类中活动变化的精确描述：一般活动，爆发结构，振荡行为和同步性。
[0277] 通过上述参数评价淀粉样蛋白β1-42对暴露于电刺激的神经元网络的功能效应以及暴露于电刺激的本发明纳米粒子对神经元网络的功能效应的拯救功效(它们中的一些也概括在下表5中)。
[0278] 表5：来自多参数数据分析的活动描述参数在以下四个类别中：一般活动，爆发结构，振荡行为和同步性。
[0279]
[0280] 将刺激下的网络活动针对相关的自发天然活动(T0+6小时记录)归一化，设定为每个实验的100％。与自发天然活动相关的值来源于在30分钟活动稳定后从30分钟跨度取得的60秒bin数据。结果(参数值)表示为独立网络的平均值±SEM。所述分析中包括每个“纳米粒子”组至少9个有效孔、“对照”组至少18个有效孔、“Aβ”组至少18个有效孔(“有效”意指具有足够数量测量电活动的电极的孔)。测试绝对参数的分布的正态性，并通过单向ANOVA评估组间的统计学显著性。
[0281] 图11显示了来自以下类别的一些代表性参数：一般活动，爆发结构，振荡行为和同步性。
[0282] 这些参数表征了在电刺激下Aβ1-42-诱导的功能效应以及本发明的纳米粒子在电刺激下提供的拯救功效(即，能够将功能效应预防/拯救到与“对照”组相似的水平)。
[0283] 为了评价复合效应，将选择的204个参数的多参数结果投射到称为“效果评分”的单个参数中。它是所选特征的线性组合，将数据集转换为矢量，其中“对照”组暴露于平均值为“0”的电场，而“Aβ”组暴露于平均值为“1”的电场。通过所测量的204个参数中15个的特征选择进行效果评分的Z因子的计算，优化以找到“对照”组和“Aβ”组之间的最佳区分(Kümmel A等人，J Biomol Screen.，2010，15(1),95-10：将多个读数整合到z'因子中以进行分析质量评估(Integration of multiple readouts into the z'factor for assay quality assessment))。效果评分分析在图12中显示。
[0284] 表6中显示了暴露于电刺激的本发明纳米粒子的拯救功效。
[0285] 表6：暴露于电场的本发明纳米粒子对Aβ1-42-诱发的对于仅暴露于电场的神经元网络的效应的效应评分和拯救功效总结。
[0286]
[0287]
[0288] 正在进行临床研究以评价DBS治疗阿尔茨海默氏病的潜力。通常可在本发明的情形中结合本文描述的纳米粒子使用的刺激参数是：频率130Hz，脉冲宽度60或90μs，电压幅度3至5V。在本文所述的实验中，在神经元网络共培养物上进行30分钟刺激，其中刺激＝10个双相脉冲，最小脉冲持续时间＝100μs，脉冲幅度＝+/-500mV，脉冲频率＝20Hz，并且脉冲序列周期＝0.2Hz。
[0289] 图11和12以及表6显示，用本发明的纳米粒子在暴露于电场时处理神经元网络，在神经元网络的电场下拯救了Aβ1-42诱导的功能效应。有趣的是，对于与振荡行为和同步性相关的类别中的参数，观察到所述拯救功效，并且其可以达到直至“对照”组中观察到的水平。
[0290] 监测这些振荡行为和同步化参数，作为网络发展改变的度量。在暴露于电刺激的本发明纳米粒子存在下，可以有利地拯救这些参数。
[0291] 这些结果突出了本申请中描述的纳米粒子在暴露于电场时，在拯救Aβ1-42在电场下诱导的对神经元网络的功能效应中的有利性能。
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