诊断自闭症的试剂盒
阅读：1006发布：2020-06-04
专利汇可以提供诊断自闭症的试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及诊断和 治疗 自闭症 的方法。本发明提供了用于在 胎儿 或儿童中测定 自闭症谱系障碍 (ASD)发生 风 险的诊断方法，其通过在来自母亲的 生物 样品中检测与一种或更多种选自以下的生物标志物相结合的 抗体 来进行：乳酸脱氢酶(LDH)、 鸟 嘌呤脱 氨 酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR)。本发明还提供了 预防 或降低胎儿或儿童ASD发生风险的方法。，下面是诊断自闭症的试剂盒专利的具体信息内容。
1.用于测定后代或潜在的后代发生自闭症谱系障碍(ASD)的风险或者预防或减少胎儿ASD发生风险的试剂盒，其包含固体支持物，所述固体支持物包含两种或更多种多肽，其亚基、亚型、或抗原性片段，其中所述两种或更多种多肽选自乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、Y盒结合蛋白1(YBX1)和二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)，其中所述LDH包括人LDH-A亚基同工型1、LDH-B亚基或者人LDH-A亚基同工型1和LDH-B亚基两者，并且其中所述测定通过鉴定针对所述两种或更多种多肽的母体抗体的存在而实现。
2.权利要求1的试剂盒，其中所述两种或更多种肽包括LDH和DPYSL2。
3.权利要求1至2中任一项的试剂盒，其中所述两种或更多种肽与所述固体支持物共价连接。
4.权利要求1至3中任一项的试剂盒，其中所述固体支持物包含所述两种或更多种多肽的多肽或其抗原性片段。
5.权利要求1至4中任一项的试剂盒，其中所述固体支持物包含所述两种或更多种多肽之多肽的模拟表位。
6.权利要求1至5中任一项的试剂盒，其中所述两种或更多种多肽是合成多肽或重组多肽。
7.权利要求1至6中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒还包含阴性和阳性对照样品。
8.权利要求1至7中任一项的试剂盒，其中所述固体支持物选自多孔板、酶联免疫吸附测定(ELISA)板、微阵列、珠、渗透试片和硝化纤维素滤器。
9.权利要求1至8中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒是选自以下的测定：Western印迹、点印迹、ELISA、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀测定、电化学发光测定、微阵列和基于珠的多重测定。
10.权利要求9的试剂盒，其中所述基于珠的多重测定是 珠测定或荧光珠测定。
诊断自闭症的试剂盒
[0001] 本申请是申请号为201080044590.8的中国专利申请的分案申请，原申请是2010年8月12日提交的PCT国际申请PCT/US2010/045343于 2012年3月31日进入中国国家阶段的申请。
[0002] 与相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2009年8月14日提交的美国临时申请No.61/234,110 的权益，其全部内容对于所有目的通过引用并入本文。
[0005] 在NIEHS授予的资助1-P01-ES11269-01和EPA授予的资助 R829388的政府支持下做出本发明。政府在本发明中享有某些权益。
技术领域
背景技术
[0007] 自闭症谱系障碍(autism spectrum disorders，ASD)是在童年期显现的一组异质性神经发育疾病，其被定义为交流和交互社会关系的缺陷并且通常伴随有定型行为(stereotypical behavior)(American Psychiatric Association，Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，第4版 (″DSM-IV″)2000，Washington，D.C.)。尽管在多篇报道中已经证明了强的遗传关联(综述见Ashwood等人，J Leukoc Biol.(2006)
80(1)：1-15)，但对于ASD仍缺乏清楚的病因学基础。免疫系统在ASD发生中发挥的作用已经得到了逐渐增加的文献证据的支持(Ashwood，同上；Enstrom 等，Curr Opin Investig Drugs.(2009)10(5)：463-73；和Li等，J Neuroimmunol.(2009)207(1-2)：111-6)。已描述了在啮齿动物和人的胎儿脑组织中发现异常免疫应答、神经炎症和小胶质细胞活化，以及母亲自身抗体的存在(Vargas等，Ann Neurol.(2005)57(1)：67-81；和Singer等，J Neuroimmunol.(2009)21l(l-2)：39-48)。
80(1)：1-15)，但对于ASD仍缺乏清楚的病因学基础。免疫系统在ASD发生中发挥的作用已经得到了逐渐增加的文献证据的支持(Ashwood，同上；Enstrom 等，Curr Opin Investig Drugs.(2009)10(5)：463-73；和Li等，J Neuroimmunol.(2009)207(1-2)：111-6)。已描述了在啮齿动物和人的胎儿脑组织中发现异常免疫应答、神经炎症和小胶质细胞活化，以及母亲自身抗体的存在(Vargas等，Ann Neurol.(2005)57(1)：67-81；和Singer等，J Neuroimmunol.(2009)21l(l-2)：39-48)。
[0008] 我们之前描述了在ASD儿童的母亲中血浆抗体对人胎儿脑组织反应性之间的显著相关性。参见美国专利No.7,452,681。在ASD儿童的母亲、典型发育儿童的母亲和非ASD发育迟缓(developmentally delayed，DD) 儿童的母亲的病例对照群中，证明了对37kDa和73kDa蛋白质条带有免疫反应性的IgG之间的显著相关性。此外，对单独的37kDa条带观察到
5.69的机率比。参见Braunschweig等，Neurotoxicology.(2008) 29(2)：226-31。
5.69的机率比。参见Braunschweig等，Neurotoxicology.(2008) 29(2)：226-31。
[0009] 几个研究已表明在ASD中，妊娠期间母亲免疫环境存在异常。便利的IgG抗体传递是已经过很多研究的现象，认为其对新生儿提供一般性保护(Simister等，Vaccine.(2003)21(24)：3365-9)。但是，与具有免疫保护性的IgG抗体一起，与胎儿“自身”蛋白质反应的自身抗体也可穿过胎盘。最近的报道显示生育多个ASD患儿的母亲中母亲IgG抗体对啮齿动物Purkinje细胞有反应性，而且在妊娠期间注射她的血清的小鼠的子代存在行为缺陷(Dalton等，Ann Neurol.(2003)53(4)：533-7)。在另一研究中，发现自闭症儿童的母亲及其患病的后代具有一致的针对大鼠产前(18天) 脑蛋白的抗体反应性模式。相反，未患病儿童和对照母亲具有不同的反应性模式(Zimmerman等，Brain Behav Immun.(2007)21(3)：351-
7)。
7)。
[0010] 对于自闭症多数证据支持产前或产后早期致病，其有可能涉及错误的发育信号。对胎儿神经发育期间免疫系统成分的作用以及母亲和胎儿免疫系统之间互相影响的认识的加深，引导我们调查了自闭症儿童的母亲的自身抗体反应性特征谱，并将它与典型发育儿童的母亲和患其他发育疾病 (除自闭症外)的儿童的母亲的特征谱进行比较。
发明内容
[0011] 在一个方面，本发明提供了测定后代(例如胎儿或儿童)发生自闭症谱系障碍(ASD)之风险的方法。在一个相关方面，本发明提供了测定母亲或潜在的母亲(将)怀有会发生自闭症谱系障碍(ASD)之儿童的风险的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在来自所述后代母亲的生物样品中鉴定与选自以下的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13种或更多种生物标志物结合的母体抗体的存在：乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(guanine deaminase，GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(collapsin response mediator protein 1，CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(stress-induced phosphoprotein，STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(alpha subunit of the barbed-end actin binding protein Cap Z，CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(Y Box Binding Protein 1， YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(eukaryotic translation and elongation factor 1A1，EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(microtubule-associated protein Tau，MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(dihydropyrimidinase-like protein 2， DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(dynamin 1-like，DNM1L)、根蛋白(radixin， RDX)、膜突蛋白(moesin，MSN)和埃兹蛋白(ezrin，EZR)，其中与一种或更多种生物标志物结合的母体抗体的存在指示后代发生ASD的风险增加。
[0012] 在一些实施方案中，测定与选自以下的一种、两种、三种或全部生物标志物结合的母体抗体的存在：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1 (STIP1)。在一些实施方案中，测定与选自以下的一种、两种或全部生物标志物结合的母体抗体的存在：乳酸脱氢酶(LDH)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，测定与选自以下的一种、两种或全部生物标志物结合的母体抗体的存在：鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，测定与乳酸脱氢酶(LDH)和脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)中的一种或两种结合的母体抗体的存在。在一些实施方案中，测定与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)中的一种或两种结合的母体抗体的存在。在一些实施方案中，测定与乳酸脱氢酶(LDH)和应激诱导磷蛋白1(STIP1) 中的一种或两种结合的母体抗体的存在。在一些实施方案中，测定与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)中的一种或两种结合的母体抗体的存在。在一些实施方案中，测定与乳酸脱氢酶(LDH)结合的母体抗体的存在。在一些实施方案中，测定与鸟嘌呤脱氨酶(GDA) 结合的母体抗体的存在。在一些实施方案中，测定与脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)结合的母体抗体的存在。在一些实施方案中，测定与应激诱导磷蛋白1(STIP1)结合的母体抗体的存在。
[0013] 在一些实施方案中，测定与选自以下的一种、两种、三种或全部生物标志物结合的母体抗体的存在：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，测定与选自以下的一种、两种或全部生物标志物结合的母体抗体的存在：乳酸脱氢酶(LDH)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2) 和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，测定与选自以下的一种、两种或全部生物标志物结合的母体抗体的存在：鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，测定与乳酸脱氢酶(LDH)和二氢嘧啶酶样蛋白2 (DPYSL2)中的一种或两种结合的母体抗体的存在。在一些实施方案中，测定与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)中的一种或两种结合的母体抗体的存在。在一些实施方案中，测定与二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)结合的母体抗体的存在。
[0014] 在另一方面，本发明提供了测定后代(例如胎儿或儿童)发生自闭症谱系障碍(ASD)的风险或者测定母亲或潜在的母亲将怀有会发生自闭症谱系障碍(ASD)之儿童的风险的方法，其通过在来自所述后代之母亲的生物样品中鉴定与选自以下的一种或更多种蛋白质结合的母体抗体的存在：鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、F-肌动蛋白加帽蛋白α-2亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶和谷氨酸脱氢酶，其中与所述一种或更多种蛋白质结合的母体抗体的存在指示后代发生ASD的风险增加。针对一种或更多种选自鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、F- 肌动蛋白加帽蛋白α-2亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶的蛋白质之母体抗体的存在的测定可以与针对一种或更多种本文所述生物标志物之母体抗体的存在的测定联合进行或独立进行。
[0015] 在一些实施方案中，诊断方法包括将来自患者的生物样品与选自以下的一种或更多种生物标志物的一种或更多种多肽接触：乳酸脱氢酶 (LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基 (CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1 (EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2 (DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白 (MSN)和埃兹蛋白(EZR)或其抗原性片段，或者其模拟表位 (mimeotope)。来自所述一种或更多种生物标志物的多肽、其抗原性片段或者其模拟表位可以与固体支持物连接，所述固体支持物包括但不限于多孔板、ELISA板、微阵列芯片、珠、渗透试片(porous strip)、硝酸纤维素膜。
[0016] 在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与选自以下的一种、两种、三种或全部生物标志物的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与选自以下的一种、两种或全部生物标志物的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触：乳酸脱氢酶(LDH)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与选自以下的一种、两种或全部生物标志物的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触：鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1 (STIP1)。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与乳酸脱氢酶(LDH)和脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)中的一种或两种的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)中的一种或两种的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与乳酸脱氢酶 (LDH)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)中的一种或两种的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)中的一种或两种的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与乳酸脱氢酶(LDH)的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与应激诱导磷蛋白1 (STIP1)的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触。
[0017] 在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与选自以下的一种、两种、三种或全部生物标志物的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2 (DPYSL2)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与选自以下的一种、两种或全部生物标志物的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触：乳酸脱氢酶(LDH)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与选自以下的一种、两种或全部生物标志物的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触：鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与乳酸脱氢酶(LDH)和二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)中的一种或两种的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)中的一种或两种的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触。在一些实施方案中，将来自母亲或潜在母亲的生物样品与二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)的多肽或其抗原性片段或模拟表位接触。
[0018] 在一些实施方案中，乳酸脱氢酶是LDH-A亚基，即由人基因LDHA 编码的。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶是LDH-B亚基，即由人基因 LDHB编码的。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶是LDH-A和LDH-B亚基两者。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶是由4个LDH-A亚基或4个 LDH-B亚基构成的四聚体。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶是由LDH-A 和LDH-B亚基的组合构成的四聚体。在一些实施方案中，LDH是人LDH。
[0019] 在一些实施方案中，所述后代是新生儿(即刚出生至四周龄)。在一些实施方案中，所述后代是胎儿。在一些实施方案中，所述胎儿正在母亲体内孕育。生物样品可以在妊娠期间的任何时间从母亲中取得。在一些实施方案中，生物样品在胎儿的脑开始发育后取得，例如妊娠约12周之后。在一些实施方案中，生物样品在孕中期(the second trimester of pregnancy)取得。在一些实施方案中，生物样品在妊娠晚期(the third trimester of pregnancy)取得。
[0020] 在一些实施方案中，所述胎儿尚未被怀上。生物样品可以从任何育龄妇女中，在怀有胎儿之前或之后或者在孩子出生后取得。
[0022] 在一些实施方案中，所述母亲有患ASD的后代。在一些实施方案中，所述母亲有ASD的家族史。在一些实施方案中，所述母亲有自身免疫病的家族史。
[0023] 在一些实施方案中，所述母亲是人。
[0024] 在一些实施方案中，通过例如以下方法检测与一种或更多种本文所述生物标志物或其片段结合的抗体：Western印迹、点印迹、酶联免疫吸附测定(“ELISA”)、放射免疫测定(“RIA”)、免疫沉淀、电化学发光、微阵列或基于珠的多重测定(例如Luminex珠或荧光珠测定)。
[0025] 在另一方面，本发明提供了预防或减少胎儿ASD发生风险的方法，其包括向胎儿的母亲施用阻断母体抗体与一种或更多种选自以下的胎儿生物标志物结合的试剂：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白 (RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR)，从而通过阻断母体抗体与一种或更多种胎儿生物标志物的结合来预防或降低胎儿的ASD发生风险。
[0026] 在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与选自以下的一种、两种、三种或全部生物标志物结合的试剂：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1 (STIP1)。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与选自以下的一种、两种或全部生物标志物结合的试剂：乳酸脱氢酶(LDH)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与选自以下的一种、两种或全部生物标志物结合的试剂：鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与乳酸脱氢酶(LDH)和脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)中的一种或两种结合的试剂。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)和脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)中的一种或两种结合的试剂。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与乳酸脱氢酶(LDH)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)中的一种或两种结合的试剂。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和应激诱导磷蛋白1 (STIP1)中的一种或两种结合的试剂。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与乳酸脱氢酶(LDH)结合的试剂。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)结合的试剂。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)结合的试剂。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与应激诱导磷蛋白1(STIP1)结合的试剂。
[0027] 在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与选自以下的一种、两种、三种或全部生物标志物结合的试剂：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与选自以下的一种、两种或全部生物标志物结合的试剂：乳酸脱氢酶(LDH)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2) 和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与选自以下的一种、两种或全部生物标志物结合的试剂：鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与乳酸脱氢酶(LDH)和二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)中的一种或两种结合的试剂。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和二氢嘧啶酶样蛋白2 (DPYSL2)中的一种或两种结合的试剂。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)结合的试剂。
[0028] 在一些实施方案中，所述试剂是生物标志物的多肽或其抗原性片段。在一些实施方案中，所述试剂是生物标志物之多肽的模拟表位。
[0029] 在一些实施方案中，所述母体抗体结合LDH-A和LDH-B中的至少一个，例如作为亚基或四聚体。
[0030] 在另一方面，本发明提供了预防或减少胎儿发生ASD之风险的方法，其包括向胎儿的母亲施用阻断母体抗体与选自以下的一种或更多种胎儿蛋白质结合的试剂：鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、F- 肌动蛋白加帽蛋白α-2亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶和谷氨酸脱氢酶，其中阻断母体抗体与一种或更多种胎儿蛋白质的结合预防或降低胎儿发生 ASD的风险。对母亲蛋白质与选自鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3- 磷酸脱氢酶、F-肌动蛋白加帽蛋白α-2亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶的一种或更多种胎儿蛋白质之结合的阻断可以和对母亲抗体与一种或更多种本文所述生物标志物之结合的阻断联合进行或独立进行。
[0031] 在一些实施方案中，静脉内施用所述试剂。在一些实施方案中，口服施用所述试剂。
[0032] 所述阻断试剂可以在妊娠期间的任意时间施用给母亲。在一些实施方案中，所述阻断试剂在胎儿脑开始发育之后施用，例如妊娠的约第12周之后。在一些实施方案中，所述阻断试剂在孕中期施用。在一些实施方案中，所述阻断试剂在孕晚期施用。在一些实施方案中，所述阻断试剂按照需要在4、8、12、16、20、24周的时间长度中施用。
[0033] 在一个相关方面，本发明提供了预防或降低胎儿发生ASD之风险的方法，其包括从胎儿的母亲中除去与选自以下的一种或更多种胎儿生物标志物结合的抗体：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR)。
[0034] 在一些实施方案中，除去与选自以下的一种、两种、三种或全部生物标志物结合的抗体：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，除去与选自以下的一种、两种或全部生物标志物结合的抗体：乳酸脱氢酶(LDH)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，除去与选自以下的一种、两种或全部生物标志物结合的抗体：鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，除去与乳酸脱氢酶(LDH)和脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)中的一种或两种结合的抗体。在一些实施方案中，除去与鸟嘌呤脱氨酶(GDA) 和脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)中的一种或两种结合的抗体。在一些实施方案中，除去与乳酸脱氢酶(LDH)和应激诱导磷蛋白
1(STIP1) 中的一种或两种结合的抗体。在一些实施方案中，除去与鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)中的一种或两种结合的抗体。在一些实施方案中，除去与乳酸脱氢酶(LDH)结合的抗体。在一些实施方案中，除去与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)结合的抗体。在一些实施方案中，除去与脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)结合的抗体。在一些实施方案中，除去与应激诱导磷蛋白1(STIP1)结合的抗体。
1(STIP1) 中的一种或两种结合的抗体。在一些实施方案中，除去与鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)中的一种或两种结合的抗体。在一些实施方案中，除去与乳酸脱氢酶(LDH)结合的抗体。在一些实施方案中，除去与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)结合的抗体。在一些实施方案中，除去与脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)结合的抗体。在一些实施方案中，除去与应激诱导磷蛋白1(STIP1)结合的抗体。
[0035] 在一些实施方案中，除去与选自以下的一种、两种、三种或全部生物标志物结合的抗体：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，除去与选自以下的一种、两种或全部生物标志物结合的抗体：乳酸脱氢酶(LDH)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)和应激诱导磷蛋白1 (STIP1)。在一些实施方案中，除去与选自以下的一种、两种或全部生物标志物结合的抗体：鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2 (DPYSL2)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，除去与乳酸脱氢酶(LDH)和二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)中的一种或两种结合的抗体。在一些实施方案中，除去与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)中的一种或两种结合的抗体。在一些实施方案中，除去与二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)结合的抗体。
[0036] 在一个相关方面，本发明提供了预防或降低胎儿发生ASD的风险的方法，其包括从胎儿的母亲中除去与选自以下的一种或更多种胎儿蛋白质结合的抗体：鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、F-肌动蛋白加帽蛋白α-2亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶和谷氨酸脱氢酶。针对选自鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、F-肌动蛋白加帽蛋白α-2 亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶的一种或更多种胎儿蛋白质的母体抗体的除去可以与针对一种或更多种本文所述生物标志物的母体抗体之结合的除去联合进行或独立进行。
[0037] 在一些实施方案中，从血液、血清、血浆或乳汁中除去与所述一种或更多种生物标志物结合的抗体。
[0038] 在一些实施方案中，通过血浆置换术从血浆中除去与一种或更多种生物标志物结合的抗体。
[0039] 在一些实施方案中，将母亲的血液、血清、血浆或乳汁与连接至固体支持物的一种或更多种选自以下的胎儿生物标志物的一种或更多种多肽、其抗原性片段或其模拟表位接触：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1 (STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白 Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白 (DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR)。在一些实施方案中，将母亲的血液、血清、血浆或乳汁与连接至固体支持物的一种或更多种生物标志物的一种或更多种模拟表位接触。
[0040] 在一些实施方案中，将选自以下的一种、两种、三种或全部生物标志物的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，将选自以下的一种、两种或全部生物标志物的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触：乳酸脱氢酶(LDH)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1) 和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，将选自以下的一种、两种或全部生物标志物的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触：鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，将乳酸脱氢酶(LDH)和脑衰蛋白反应调节蛋白1 (CRMP1)中的一种或两种的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触。在一些实施方案中，将鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)中的一种或两种的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触。在一些实施方案中，将乳酸脱氢酶(LDH) 和应激诱导磷蛋白1(STIP1)中的一种或两种的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触。在一些实施方案中，将鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和应激诱导磷蛋白1(STIP1) 中的一种或两种的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触。在一些实施方案中，将乳酸脱氢酶(LDH)的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触。在一些实施方案中，将鸟嘌呤脱氨酶(GDA)的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触。在一些实施方案中，将脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触。在一些实施方案中，将应激诱导磷蛋白1(STIP1)的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触。
[0041] 在一些实施方案中，将选自以下的一种、两种、三种或全部生物标志物的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，将选自以下的一种、两种或全部生物标志物的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触：乳酸脱氢酶(LDH)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，将选自以下的一种、两种或全部生物标志物的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触：鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，将乳酸脱氢酶(LDH)和二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)中的一种或两种的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触。在一些实施方案中，将鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)和二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)中的一种或两种的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触。在一些实施方案中，将二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)的多肽、其抗原性片段或其模拟表位与固体支持物连接并与母亲的血液、血清、血浆或乳汁接触。
[0042] 在一些实施方案中，LDH是LDH-A和LDH-B中的至少一种。
[0043] 可以在妊娠期间的任意时间从母亲中除去与一种或更多种本文所述的生物标志物结合的抗体。在一些实施方案中，在胎儿脑开始发育之后除去与一种或更多种本文所述的生物标志物结合的抗体，例如妊娠的约第 12周之后。在一些实施方案中，在孕中期除去与一种或更多种本文所述的生物标志物结合的抗体。在一些实施方案中，在孕晚期除去与一种或更多种本文所述的生物标志物结合的抗体。在一些实施方案中，按照需要在 4、8、12、16、20、24周的时间长度中除去与一种或更多种本文所述的生物标志物结合的抗体。
[0044] 本发明的另一些实施方案如本文所述。
[0045] 定义
[0046] 除非另外定义，本文所用的所有科技术语一般具有本发明所属领域普通技术人员所通常理解的含义。一般地，本文所用的命名和以下描述的细胞培养、分子遗传、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验室方法是公知的，并且在本领域中常规使用。使用标准技术进行核酸和肽的合成。通常，根据制造商的说明进行酶促反应和纯化步骤。一般根据常规技术和本文件全文中提供的多种一般性参考文件(一般参见Sambrook等 MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第三版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和 Ausubel编，Current Protocols in Molecular Biology，
1990-2008，John Wiley Interscience)实施技术和程序。本文所用的命名和以下描述的合成化学和有机合成中的实验室方法是公知的，并且在本领域中常规使用。使用标准技术或其改变方案进行化学合成和化学分析。
1990-2008，John Wiley Interscience)实施技术和程序。本文所用的命名和以下描述的合成化学和有机合成中的实验室方法是公知的，并且在本领域中常规使用。使用标准技术或其改变方案进行化学合成和化学分析。
[0047] 术语“自闭症谱系障碍”、“自闭症”或“ASD”互换使用并表示一个神经发育障碍谱系，其特征为伴随重复和定型行为(repetitive and stereotyped behavior)的社交和交流缺陷。自闭症包括社交和交流缺陷的谱系，但是，该障碍可以根据社交和交流缺陷的程度被大致划分为“高功能性自闭症”或“低功能性自闭症”。诊断为患“高功能性自闭症”的个体具有程度低但可识别的社交和交流缺陷(即艾斯伯格综合征(Asperger′s syndrome))。关于自闭症谱系障碍的其他信息可见例如Autism Spectrum Disorders：A Research Review for Practitioners，Ozonoff，等编，2003，American Psychiatric Pub；Gupta，Autistic Spectrum Disorders in Children，2004， Marcel Dekker Inc；Hollander，Autism Spectrum Disorders，2003，Marcel Dekker Inc；Handbook of Autism and Developmental Disorders，Volkmar，编，2005，John Wiley；Sicile-Kira and Grandin，Autism Spectrum Disorders：The Complete Guide to Understanding Autism，Asperger′s Syndrome，PervasiVe Developmental Disorder，and Other ASDs，2004， PerigeeTrade；and Duncan，et al.，Autism Spectrum Disorders[Two Volumes]：A Handbook for Parents and Professionals，2007，Praeger。
[0048] 术语“乳酸脱氢酶”或“LDH”互换使用并且表示催化丙酮酸和乳酸相互转化的酶，其同时伴随NADH和NAD+的相互转化。乳酸脱氢酶存在 4个不同的酶类型。其中两个是细胞色素c依赖性酶，它们分别作用于 D-乳酸(EC 1.1.2.4)或L-乳酸(EC 1.1.2.3)。另两个是NAD(P）依赖性酶，它们分别作用于D-乳酸(EC 1.1.1.28)或L-乳酸(EC 1.1.1.27)。LDH 酶由四个亚基构成，其中亚基为“M”或“H”。LDHA基因编码M亚基，可互换地称为LDH-M或LDH-A。LDHB基因编码H亚基，可互换地称为LDH-H或LDH-B。有5种LDH同工酶，每种包含4个亚基。骨骼肌和肝的主要LDH同工酶LDH-5(M4)具有4个肌(M)亚基；而大部分物种中的心肌主要同工酶LDH-1(H4)具有4个心(H)亚基。其他变体同时包含这两种类型的亚基，例如网状内皮系统中的LDH-2(H3M1)、肺中的 LDH-3(H2M2)和肾中的LDH-4(H1M3)。LDH-2是血清中的主要类型。 LDHA也被称为LDH1、LDH肌亚基、LDH-M、EC 1.1.1.27、肾癌抗原 NY-REN-59、细胞增殖诱导基因19蛋白、PIG19和L-乳糖脱氢酶A链； LDHB也被称为LDH-2或LDH-H或TRG-5；LDHC是睾丸特异的。
[0049] 结构上，LDH-A氨基酸序列在至少50、100、150、200、250、300、 350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如以下氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性：GenBank登录号AAP36496.1；
BAD96798.1； NM_005566.3→NP 005557.1(同工型1)；NM_001135239.1→NP001128711.1(同工型2)；NM_001165414.1→NP_001158886.1(同工型3)； NM_001165415.1→NP_
001158887.1(同工型4)；或NM_001165416.1→NP_001158888.1(同工型5)。结构上，LDH-A核酸序列在至少300、500、 750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如以下核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％的序列同一性：GenBank登录号BC067223；CR604911； BC051361；X02152.1；NM_005566.3→NP_
005557.1(同工型1)；NM_001135239.1→NP_001128711.1(同工型2)；NM_001165414.1→NP_
001 158886.1(同工型3)；NM_001165415.1→NP_001158887.1(同工型4)；或NM_
001165416.1→NP_001158888.1(同工型5)。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的BLAST、ALIGN。
BAD96798.1； NM_005566.3→NP 005557.1(同工型1)；NM_001135239.1→NP001128711.1(同工型2)；NM_001165414.1→NP_001158886.1(同工型3)； NM_001165415.1→NP_
001158887.1(同工型4)；或NM_001165416.1→NP_001158888.1(同工型5)。结构上，LDH-A核酸序列在至少300、500、 750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如以下核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％的序列同一性：GenBank登录号BC067223；CR604911； BC051361；X02152.1；NM_005566.3→NP_
005557.1(同工型1)；NM_001135239.1→NP_001128711.1(同工型2)；NM_001165414.1→NP_
001 158886.1(同工型3)；NM_001165415.1→NP_001158887.1(同工型4)；或NM_
001165416.1→NP_001158888.1(同工型5)。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的BLAST、ALIGN。
[0050] 结构上，LDH-B氨基酸序列在至少50、100、150、200、250、300、 350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如GenBank登录号 NM_002300.6→NP_002291.1(变体1)；或NM_001174097.1 →NP_001167568.1(变体2)的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。结构上，LDH-B核酸序列在至少
300、500、750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号BC002361.1；Y00711.1；NM_002300.6→NP_002291.1(变体1)；或NM_001174097.1→ NP_
001167568.1(变体2)的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的 BLAST、ALIGN。
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。结构上，LDH-B核酸序列在至少
300、500、750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号BC002361.1；Y00711.1；NM_002300.6→NP_002291.1(变体1)；或NM_001174097.1→ NP_
001167568.1(变体2)的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的 BLAST、ALIGN。
[0051] 术语“脑衰蛋白反应调节蛋白1”或“CRMP1”(也称为DRP1；DRP-1； CRMP-1；DPYSL1；ULIP-3)是指已知在神经元分化和轴突导向中发挥作用的胞浆磷蛋白。CRMP1是仅在神经系统中表达的胞浆磷蛋白家族的成员。认为所编码的蛋白质是轴突导向因子(semaphorin)信号转导通路的一部分，该通路在神经发育过程中参与轴突导向因子诱导的生长椎瓦解。选择性剪接产生多种转录变体。结构上，CRMP1氨基酸序列在至少 50、100、150、200、250、300、
350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如GenBank登录号NM_001014809.1→NP_
001014809.1(同工型1) 或NM_001313.3→NP_001304.1(同工型2)的氨基酸序列具有至少约 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。结构上，CRMP1核酸序列在至少300、500、750、1000 个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号NM_001014809.1→NP_001014809.1(同工型1)或NM_001313.3→ NP_
001304.1(同工型2)的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的 BLAST、ALIGN。
350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如GenBank登录号NM_001014809.1→NP_
001014809.1(同工型1) 或NM_001313.3→NP_001304.1(同工型2)的氨基酸序列具有至少约 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。结构上，CRMP1核酸序列在至少300、500、750、1000 个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号NM_001014809.1→NP_001014809.1(同工型1)或NM_001313.3→ NP_
001304.1(同工型2)的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的 BLAST、ALIGN。
[0052] 术语“应激诱导磷蛋白1”或“STIP1”(也称为Hsp70/Hsp90组织蛋白 (HOP1)、STI1、STIL1、IEF-SSP-3521和P60)是指帮助HSP70和 HSP90折叠的适体蛋白。STIP1还刺激HSP70的ATP酶活性，而抑制 HSP90的ATP酶活性，这提示调节作用。此外，STIP1结合细胞朊粒蛋白PrPc，并调节短期和长期记忆巩固。结构上，STIP1氨基酸序列在至少50、100、150、200、250、300、350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如GenBank登录号NM_006819.2→NP_
006810.1的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％的序列同一性。结构上，STIP1核酸序列在至少300、500、 750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号NM 006819.2→NP 006810.1的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的 BLAST、ALIGN。
006810.1的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％的序列同一性。结构上，STIP1核酸序列在至少300、500、 750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号NM 006819.2→NP 006810.1的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的 BLAST、ALIGN。
[0053] 术语“鸟嘌呤脱氨酶”和“GDA”(也称为Cypin、鸟嘌呤酶、KIAA1258、 MGC9982和Nedasin)是指催化鸟嘌呤水解脱氨生成黄嘌呤和氨的酶。 GDA还已显示调节PSD-95突触后靶向。结构上，GDA氨基酸序列在至少50、100、150、200、250、300、350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如GenBank登录号NM_004293.3→NP_004284.1的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％的序列同一性。结构上，GDA核酸序列在至少300、500、 750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号NM_004293.3→NP_004284.1的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的 BLAST、ALIGN。
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的 BLAST、ALIGN。
[0054] 术语“二氢嘧啶酶样蛋白2”或“DPYSL2”(也称为CRMP-2或 CRMP2)是指通过在轴突特化中介导Sema3A在轴突中的排斥作用来参与轴突导向的蛋白质。结构上，DPYSL2氨基酸序列在至少50、100、150、 200、250、300、350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如GenBank 登录号NM_001386.4→NP_001377.1或BAD92432的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或 100％的序列同一性。结构上，DPYSL2核酸序列在至少300、500、750、 1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号NM_001386.4→NP_001377.1的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的 BLAST、ALIGN。
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的 BLAST、ALIGN。
[0055] 术语“刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基”或“加帽蛋白(肌动蛋白丝)肌Z-线α2”或“CAPZA2”(也称为CAPPA2、CAPZ)是指F-肌动蛋白加帽蛋白α亚基家族的成员。CAPZA2是刺端肌动蛋白结合蛋白 CapZ的α亚基。通过对肌动蛋白丝的刺端加帽，Cap Z调节肌动蛋白丝刺端的生长。结构上，CAPZA2氨基酸序列在至少50、100、150、200、 250、300、350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如GenBank登录号NM_006136.2→NP_006127.1的氨基酸序列具有至少约90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。结构上，CAPZA2核酸序列在至少300、500、750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号NM_006136.2→NP_006127.1的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的 BLAST、ALIGN。
[0056] 术语“Y盒结合蛋白1”或“YBX1”(也称为BP-8、CSDA2、CSDB、 DBPB、MDR-NF1、MGC 104858、MGC 110976、MGC117250、NSEP-1、 NSEP1、YB-1和YB1)是指介导前mRNA选择性剪接调节的蛋白质。 YBX1结合前mRNA的剪接位点并调节剪接位点的选择；结合和稳定胞质mRNA；通过调节mRNA和真核起始因子之间的相互作用来帮助翻译的调控；结合含有Y盒(5′-CTGATTGGCCAA-3′)的启动子，例如存在于HLA II类基因中的；和促进含有错配或被顺铂修饰的DNA链的分离。结构上，YBX1氨基酸序列在至少50、100、150、200、250、300、350 个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如GenBank登录号 NM_004559.3→NP_004550.2的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。结构上，YBX1核酸序列在至少300、500、750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号NM_004559.3→NP_004550.2 的核酸序列具有至少约90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的BLAST、ALIGN。
91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的BLAST、ALIGN。
[0057] 术语“真核转录和延伸因子1A1”和“EEF1A1”是指向核糖体转运氨基乙酰tRNA的延伸因子-1复合物α亚基的同工型。1A1同工型在脑、胎盘、肺、肝和胰中表达，并且在66％的Felty综合征中为自身抗原。Felty综合征的特征是类风湿性关节炎、脾肿大和中性粒细胞减少的组合。结构上， EEF1A1氨基酸序列在至少50、100、150、200、250、300、350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如GenBank登录号 NM_001402.5→NP_001393.1的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。结构上，EEF1A1核酸序列在至少300、500、750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号 NM_001402.5→NP_001393.1的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的 BLAST、ALIGN。
[0058] 术语“微管相关蛋白Tau”和“MAPT”(也称为DDPAC、FLJ31424、 MAPTL、MGC 138549、MSTD、MTBT1、MTBT2、PPND和TAU) 是指一种其转录本经历复杂调控的选择性剪接的蛋白质，该剪接根据成熟状态和神经元类型在神经元中形成多种不同的MAPT mRNA转录本。突变或缺失剪接变体与包括以下的神经退行性疾病相关：阿尔兹海默病、 Pick氏病、额颞痴呆、皮质基底核退化和进行性核上性麻痹。结构上， MAPT氨基酸序列在至少50、100、150、200、250、300、350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如以下的氨基酸序列具有至少约
90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性：NM_
016835.4→NP_058519.3(同工型1)； NM_005910.5→NP_005901.2(同工型2)；NM_016834.4→NP_058518.1 (同工型3)；NM_016841.4→NP_058525.1(同工型4)； NM_001123067.3→NP_001116539.1(同工型5)；或 NM_001123066.3→NP_001116538.2(同工型6)。结构上，MAPT核酸序列在至少300、500、750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如以下的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或
100％的序列同一性：NM_016835.4→ NP_058519.3(同工型1)；NM_005910.5→NP_005901.2(同工型2)；NM_016834.4→NP_058518.1(同工型3)；NM_016841.4→NP_058525.1 (同工型
4)；NM_001123067.3→NP_001116539.1(同工型5)；或NM_001123066.3→NP_001116538.2(同工型6)。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的BLAST、ALIGN。
90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性：NM_
016835.4→NP_058519.3(同工型1)； NM_005910.5→NP_005901.2(同工型2)；NM_016834.4→NP_058518.1 (同工型3)；NM_016841.4→NP_058525.1(同工型4)； NM_001123067.3→NP_001116539.1(同工型5)；或 NM_001123066.3→NP_001116538.2(同工型6)。结构上，MAPT核酸序列在至少300、500、750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如以下的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或
100％的序列同一性：NM_016835.4→ NP_058519.3(同工型1)；NM_005910.5→NP_005901.2(同工型2)；NM_016834.4→NP_058518.1(同工型3)；NM_016841.4→NP_058525.1 (同工型
4)；NM_001123067.3→NP_001116539.1(同工型5)；或NM_001123066.3→NP_001116538.2(同工型6)。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的BLAST、ALIGN。
[0059] 术语“发动蛋白1样蛋白”和“DNM1L”(也称为DLP1、DRP1、DVLP、 DYMPLE、HDYNIV和VPS1)是指GTP酶的发动蛋白家族的成员，其在调节线粒体形态以控制胞质中线粒体管的分布中发挥作用。DNM1L基因产生三种被选择性聚腺苷酸化的选择性剪接变体。结构上，DNM1L氨基酸序列在至少50、100、150、200、250、300、350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如以下的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性： NM_012062.3→NP_036192.2(同工型1)；NM_012063.2→NP_
036193.2 (同工型2)；NM_005690.3→NP_005681.2(同工型3)。结构上，DNM1L 核酸序列在至少300、500、750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如以下的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性：NM_012062.3→ NP_036192.2(同工型1)；NM_012063.2→NP_036193.2(同工型2)；NM_
005690.3→NP_005681.2(同工型3)。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的BLAST、ALIGN。
036193.2 (同工型2)；NM_005690.3→NP_005681.2(同工型3)。结构上，DNM1L 核酸序列在至少300、500、750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如以下的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性：NM_012062.3→ NP_036192.2(同工型1)；NM_012063.2→NP_036193.2(同工型2)；NM_
005690.3→NP_005681.2(同工型3)。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的BLAST、ALIGN。
[0060] 术语“神经丝轻多肽”和“NEFL”(也称为CMT1F、CMT2E、NF-L 和NFL)是指由轻链、中链和重链构成的IV型中间丝异源聚合物。NEFL 是外骨骼的成份，并且其功能是保持神经元形态并且可在向轴突和树状细胞的细胞内转运中起作用。NEFL中的突变导致1F型(CMT1F)和2E 型(CMT2E)的Charcot-Marie-Tooth病，这两者都是外周神经系统疾病。NEFL还与帕金森氏病和肌萎缩性侧索硬化(ALS)相关。结构上， NEFL氨基酸序列在至少50、100、150、200、250、300、350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如GenBank登录号 NM_006158.3→NP_006149.2的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％的序列同一性。结构上，NEFL核酸序列在至少300、500、750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号NM_006158.3→NP_006149.2 的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的BLAST、ALIGN。
98％、99％或100％的序列同一性。结构上，NEFL核酸序列在至少300、500、750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号NM_006158.3→NP_006149.2 的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的BLAST、ALIGN。
[0061] 术语“根蛋白”或“RDX”(也称为DFNB24)是指涉及将肌动蛋白与质膜连接的细胞骨架蛋白质。RDX与Exrin和膜突蛋白有高度的序列同一性。结构上，RDX氨基酸序列在至少50、100、150、200、250、300、 350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如GenBank登录号 NM_002906.3→NP_002897.1的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、 93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。结构上，RDX核酸序列在至少300、500、750、
1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号NM_002906.3→NP_
002897.1 的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、
99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的BLAST、ALIGN。
96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。结构上，RDX核酸序列在至少300、500、750、
1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号NM_002906.3→NP_
002897.1 的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、
99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的BLAST、ALIGN。
[0062] 术语“膜突蛋白”和“MSN”和“膜组织延伸突出蛋白”是指包括根蛋白和埃兹蛋白的ERM家族的成员。ERM蛋白的功能是作为质膜和基于肌动蛋白细胞骨架之间的交联物。膜突蛋白位于伪足和其他膜突起中，其对细胞-细胞识别和信号传递以及细胞运动是重要的。结构上，MSN氨基酸序列在至少50、100、150、200、250、300、350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如GenBank登录号NM_002444.2→NP_002435.1的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％的序列同一性。结构上，MSN核酸序列在至少300、 500、750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank 登录号NM_002444.2→NP_002435.1的核酸序列具有至少约90％、91％、 92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的BLAST、ALIGN。
95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的BLAST、ALIGN。
[0063] 术语“埃兹蛋白”和“EZR”(也称为CVL；CVIL；VIL2；MGC1584； FLJ26216；DKFZp762H157)是指在微绒毛中作为蛋白酪氨酸激酶底物发挥作用的胞质外膜蛋白。作为ERM蛋白家族的成员，该蛋白质是质膜和肌动蛋白细胞骨架之间的中间物。EZR蛋白在细胞表面结构粘附、迁移和组织中发挥作用，并且出现在多种人癌症中。结构上，EZR氨基酸序列在至少50、100、150、200、250、300、350个氨基酸序列长度上或在多肽全长上与例如GenBank登录号NM_003379.4→NP_003370.2(同工型1)或NM_001111077.1→NP_001104547.1(同工型2)的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％的序列同一性。结构上，EZR核酸序列在至少300、500、 750、1000个核酸序列长度上或在多核苷酸全长上与例如GenBank登录号NM_003379.4→NP_003370.2(同工型1)或NM_
001111077.1→ NP_001104547.1(同工型2)的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的 BLAST、ALIGN。
001111077.1→ NP_001104547.1(同工型2)的核酸序列具有至少约90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。可以使用任何本领域已知的比对算法进行序列比对，例如设置为缺省设定的 BLAST、ALIGN。
[0064] 当用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”是指核酸或蛋白质基本不合在天然状态与其相关的其他细胞组分。其优选地处于均质状态。其可以是干的或在水溶液中。纯度和均一性通常通过分析化学技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱)测定。作为制剂中的主要成分的蛋白质基本上是纯的。特别地，分离的基因与位于该基因侧翼并编码除目的基因外的蛋白质的开放阅读框分开。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳中基本上产生一个条带。特别地，其表示核酸或蛋白质至少85％纯，更优选至少 95％纯，最优选至少99％纯。
[0065] 术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸 (DNA)或核糖核酸(RNA)或其多聚体。除非特别限制，该术语涵盖含有天然核苷酸已知类似物的核酸，其与参照核酸具有类似的结合特性并以与天然核苷酸类似的方式代谢。除非另外指明，具体的核酸序列还暗含其保守修饰变体(例如简并密码子替换)、等位基因、直系同源基因、SNP 和互补序列以及明确指明的序列。特别地，简并密码子替换可以通过生成一个或更多个(或全部)选定密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧次黄嘌呤核苷残基替换的序列来进行(Batzer等，Nucleic Acid Res.19：5081 (1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Rossolini等， Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
[0066] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换，表示氨基酸残基的多聚体，或者多个氨基酸残基多聚体的组合体。该术语适用于这样的氨基酸多聚体，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学模拟物，并且适用于天然氨基酸多聚体和非天然氨基酸多聚体。
[0067] 术语“氨基酸”表示天然和合成的氨基酸，以及以与天然氨基酸相似的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码所编码的氨基酸以及其后经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物表示与天然氨基酸具有相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团相连的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这些类似物具有经修饰的 R基团(例如正亮氨酸)或者经修饰的肽骨架，但是保留了与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物表示具有与氨基酸一般化学结构不同的结构，但是以类似于天然氨基酸的方式发挥功能的化合物。
[0068] 术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特定核酸序列，保守修饰变体表示编码相同的或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，表示基本相同的序列。因为遗传密码的简并性，大量不同的核酸可编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、 GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在密码子指定为丙氨酸的每个位置，密码子可改变成任何相应密码子，而不改变所编码的多肽。这些核酸变化是“沉默变化”，是保守修饰变化的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变化。本领域技术人员会了解，核酸中的每个密码子(除了AUG和TGG之外，AUG通常是唯一的蛋氨酸密码子， TGG通常是唯一的色氨酸密码子)可经修饰而产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变化包含在每个所述序列中。
[0069] 同氨基酸序列一样，本领域技术人员会了解，核酸、肽、多肽或蛋白质序列中改变、添加或缺失所编码序列中单个氨基酸或小百分比氨基酸的各个替换、缺失或添加是“保守修饰变体”，其中所述改变导致氨基酸替换成化学相似的氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守替换表是本领域中公知的。这些保守修饰变体是多态性变体、种间同源物和本发明等位基因之外的，并且不排除上述项。
[0070] 下列八个组各含有彼此保守性替换的氨基酸：
[0071] 1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
[0072] 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
[0073] 3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
[0074] 4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
[0075] 5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；
[0076] 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
[0077] 7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
[0078] 8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)。(参见例如Creighton，Proteins(1984))。
[0079] “百分比序列同一性”通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定，其中为了两个序列的最佳比对，比较窗口中多核苷酸序列部分与不包含添加或缺失的参照序列(例如本发明的多肽)相比可包含添加或缺失 (即缺口)。如下计算百分比，确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，该结果乘以100得到百分比序列同一性。
[0080] 在两种或更多种核酸或多肽序列的情况下，术语“同一性”或百分比“同一性”表示序列相同的两种或更多种序列或子序列。如果在比较窗口或指定区域(如同使用以下的序列比较算法之一或通过人工比对和肉眼检视所测量的)上以最高对应性进行比较和比对时，两个序列具有指明百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即在指明区域上或者未指明时在全部参照序列的序列上，有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％或99％的序列同一性)，则两个序列“基本相同”。本发明提供了分别与本文示例的多肽或多核苷酸基本相同的多肽或多核苷酸(例如，选自以下的生物标志物：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR)及其抗原性片段)。任选地，同一性存在于至少约15、25或50个核苷酸长度的区域，或者更优选地存在于 100至500或1000或更多核苷酸长度的区域，或者在参照序列全长上。对于氨基酸序列，同一性或基本同一性可以存在于至少5、
10、15或20 个氨基酸长度的区域，任选地至少约25、30、35、40、50、75或100个氨基酸长度的区域，任选地至少约150、200或250氨基酸的长度，或者在参照序列的全长上。对于较短的氨基酸序列(例如20个或更少氨基酸的氨基酸序列)，当一个或两个氨基酸残基根据本文定义的保守替换被保守替换时，为基本同一的。
10、15或20 个氨基酸长度的区域，任选地至少约25、30、35、40、50、75或100个氨基酸长度的区域，任选地至少约150、200或250氨基酸的长度，或者在参照序列的全长上。对于较短的氨基酸序列(例如20个或更少氨基酸的氨基酸序列)，当一个或两个氨基酸残基根据本文定义的保守替换被保守替换时，为基本同一的。
[0081] 对于序列比较，通常将一个序列作为参考序列，用以比较测试序列。使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，指定序列算法程序参数。可使用缺省程序参数，或者可指定其他参数。然后，根据序列参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
[0082] 本文使用的“比较窗口”包括指任何连续位置数的区段，所述数目选自 20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150，其中在两个序列最佳比对后该序列可与相同个数连续位置的参考序列比较。用于比较的序列比对方法是本领域中公知的。可进行序列最佳比对用于比较，例如通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1970)的局部同源算法，通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性检索方法，通过这些算法的计算机实施形式(GAP、BESTFIT、 FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics软件包中，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)，或者通过手工比对和肉眼观察(参见例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编辑.1995，补充)。
[0083] 适于确定百分比序列同一性和序列相似性的两个算法实例有BLAST 和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等Nuc.Acids Res. 25：3389-3402(1977)和Altschul等J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。实施 BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短字节来鉴定高得分序列对(HSP)，其在与数据库序列中相同长度的字节比对时匹配或满足某正值阈值得分 T。T称为邻近字节得分阈值(Altschul等，见上文)。这些初始邻近字节名字用作引发检索的种子，以发现含有它们的更长的HSP。所述字节命中沿各个序列双向延伸，只要累计比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的奖分；总是＞0)和N(不匹配残基的罚分；总是＜0)计算累计得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累计得分。在下列情况时字节命中向各方向的延伸停止：累计比对得分比其最大实现值减少了数量X；由于一个或多个负分残基比对的积累，累计得分达到0 或更低；或者到达序列末端。BLAST算法参数的W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)缺省使用：字长(W) 11，期望(E)10，M＝5，N＝-4以及比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP 程序缺省使用：字长3，期望(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))比对 (B)50，期望(E)10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。
[0084] BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见例如 Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。 BLAST算法提供的一种相似性测量方法是最小概率相加(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间随机发生匹配的几率的指示。例如，如果在测试核酸与参照核酸的比较中最小概率相加小于约0.2(更优选小于约 0.01，最优选小于约0.001)，则认为核酸与参照序列类似。
[0085] 两个核酸序列或多肽基本相同的指示是由第一核酸编码的多肽与针对第二核酸编码之多肽产生的抗体有免疫交叉反应性，如下所述。因此，例如当两个肽的不同仅在于保守替换时，一个多肽通常与第二多肽基本相同。两个核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或其互补序列在如下所述的严格条件下彼此杂交。两个核酸序列基本相同的另一指示是可以使用相同的引物扩增该序列。
[0086] 术语“抗原性片段”是指与抗体结合的多肽的连续子序列。抗原性片段可以是或不是免疫原性的，即，其可以诱导或可以不诱导免疫应答。
[0087] 术语“构象抗原性片段”是指可以是或不是由连续子序列形成的多肽或四聚体的空间连续区域。构象抗原性片段可以是或不是免疫原性的。
[0088] 术语“表位”或“抗原性决定簇”是指多肽上的位点，B和/或T细胞对其应答。B细胞表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级或四级折叠而并排的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级或四级折叠(即由构象决定的)形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含以独特空间构象存在的至少3个、更通常的至少5个或8-10个氨基酸。确定表位空间构象的方法包括例如， x-射线晶体学或二维核磁共振。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，卷66，Glenn E.Morris，Ed.(1996)。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫测定中鉴定，该免疫测定显示一个抗体阻断另一抗体与靶抗原结合的能力(例如电化学发光测定、竞争ELISA、固相放射免疫测定(SPRIA)或封闭Western印迹)。T细胞识别连续的免疫表位，对于CD8细胞为约9个氨基酸或者对于CD4细胞为约13-15 个氨基酸。识别表位的T细胞3
可以通过测量抗原决定性增殖的体外测定鉴定，如通过致敏T细胞应答于表位的H-胸腺嘧啶掺入(Burke等，J.Inf. Dis.170，1110-19(1994))、通过抗原依赖性杀死(细胞毒性T淋巴细胞测定，Tigges等，J.Immunol.(1996)156：3901-3910)或细胞因子分泌所测定的。已从cDNA序列推导出人睾丸特异性乳酸脱氢酶的表位，参见，Millan，等，Proc.Natl Acad Sci(1987)84(15)：5311-5315。
可以通过测量抗原决定性增殖的体外测定鉴定，如通过致敏T细胞应答于表位的H-胸腺嘧啶掺入(Burke等，J.Inf. Dis.170，1110-19(1994))、通过抗原依赖性杀死(细胞毒性T淋巴细胞测定，Tigges等，J.Immunol.(1996)156：3901-3910)或细胞因子分泌所测定的。已从cDNA序列推导出人睾丸特异性乳酸脱氢酶的表位，参见，Millan，等，Proc.Natl Acad Sci(1987)84(15)：5311-5315。
[0089] 术语“结合特异性”或“特异性针对”是指T细胞受体和/或抗体的整体或部分相对于其他多肽与靶多肽或其抗原性片段的优先结合。当然已认识到的是抗体或T细胞受体与非靶多肽之间可存在一定程度的非特异性相互作用。但是特异性结合可以这样区分：其通过靶多肽或其抗原性片段的特异性识别介导。通常，相比于针对靶多肽之抗体或T细胞受体与非靶多肽之间的相互作用，特异性结合或特异靶向的免疫应答导致强得多的靶多肽与针对靶多肽之抗体或T细胞受体之间的相互作用。特异性结合通常导致与不存在靶多肽表位的细胞或组织相比，与带有靶多肽的细胞或组织结合的针对靶多肽的抗体量(每单位时间)大于其约10倍，最优选大于其约100倍。靶多肽与针对靶多肽的抗体之间的特异性结合通常意味着至少106M-1的亲和度。优选大于108M-1的亲和度。可以使用本领域已知的抗体结合测定来确定特异性结合，包括但不限于，Western印迹、点印迹、ELISA、流式细胞术、电化学发光、多重珠测定(例如使用Luminex 或荧光微珠)、免疫组织化学。特异性针对靶多肽表位的T细胞通常显示相对于应答于非靶多肽的抗原诱导增殖高约2倍(更优选高约5倍或10 倍)的应答于靶多肽的抗原诱导增殖。本领域已知T细胞增殖测定可以通过3H-胸腺嘧啶掺入。
[0090] 当用于表示与靶生物标志物特异性结合的母体抗体(如本文所述)时，术语“效价”是指将生物样品中抗体的浓度与特异性相组合的度量，其中抗体针对靶生物标志物的效价阈值可以通过高抗体浓度与中度结合常数或解离常数达到，或者可以通过较低抗体浓度与高结合常数或低解离常数达到。
[0091] 术语“发生ASD的风险增加”是指与未暴露于针对一种或更多种本文所述生物标志物(例如选自乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白 (RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR))之抗体或者暴露于水平低于预定阈值水平的针对上述一种或更多种生物标志物的抗体的胎儿或儿童发生ASD症状的风险、可能性或几率相比，暴露于结合本文所述一种或更多种生物标志物之抗体或者暴露于水平高于预定阈值水平的针对上述一种或更多种生物标志物的抗体的胎儿或儿童发生ASD症状的可能性或几率增加。
[0092] 术语“发生ASD的风险降低”是指与暴露于针对本文所述生物标志物 (例如选自乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR))之抗体或者暴露于水平高于预定阈值水平的针对上述一种或更多种生物标志物的抗体而其母亲未接受治疗性干预的胎儿或儿童发生ASD症状的可能性或几率相比，暴露于结合本文所述一种或更多种生物标志物之抗体或者暴露于水平高于预定阈值水平的针对上述一种或更多种生物标志物的抗体而其母亲已接收治疗性干预(例如阻断、失活或除去与所述生物标志物结合的抗体)的胎儿或儿童发生ASD症状的可能性或几率降低。
[0093] 术语“模拟表位(mimeotope)”是指类似于表位(例如与针对生物标志物的抗体结合)的本文所述一种或更多种生物标志物(例如选自乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基 (CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1 (EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2 (DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白 (MSN)和埃兹蛋白(EZR))的肽或多肽，尽管该模拟表位的结构或序列与天然抗原(例如本文所述的一种或更多种生物标志物)的表位之间可不存在明显的同源性。而是，模拟表位的模拟性依赖于物理化学特性的相似性和空间组织的相似性。本领域已知模拟表位的筛选和构建。例如，可以通过序列修饰来自于已知表位或者使用组合肽文库(例如与针对一种或更多种生物标志物之抗体结合的肽)从头产生。参见例如Yip和Ward， Comb Chem High Throughput Screen(1999)2(3)：125-128；Sharav等， Vaccine(2007)25(16)：3032-37；和Knittelfelder等，Expert Opin Biol Ther (2009)9(4)：493-506。
[0094] 术语“家族史”是指在家族成员中存在疾病病症(例如ASD或自身免疫疾病)。家族成员可以是直系(例如父母、子女或祖父母)或近亲(例如兄弟姐妹、姨姑、叔伯或堂表兄弟姐妹)。通常家族成员是具有共有遗传谱的血亲。
[0095] 术语“治疗可接受量”或“治疗有效剂量”可互换使用，是指足以产生期望结果(即足以阻断针对所述生物标志物之抗体与靶生物标志物结合的试剂的量)而副作用很小或没有的量。在一些实施方案中，治疗可接受量不诱发或导致不期望的副作用。治疗可接受量可以通过首先施用低剂量，然后逐渐增加剂量直到达到期望效果来确定。本发明的抗生物标志物抗体阻断剂的“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”可以分别防止ASD的发病或使 ASD的严重性降低。“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”还可以分别预防或改善由障碍和疾病(由母亲抗生物标志物抗体的活性导致)导致的损伤或残疾。
[0096] 术语“特异性抑制”是指试剂或配体抑制针对一种或更多种生物标志物(例如选自乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR))的抗体与所述一种或更多种生物标志物结合的能力。特异性抑制通常导致相对于背景至少约2倍的抑制，例如与不存在所述试剂时抗生物标志物抗体的结合相比，对抗生物标志物抗体与靶生物标志物之结合的抑制例如大于约10倍、20倍、50倍。在一些实施方案中，抗生物标志物抗体与靶生物标志物的结合被完全抑制。通常，特异性结合是使用适当统计学测试确定的与靶生物标志物结合的抗生物标志物抗体的有统计学意义的降低(例如，p≤0.05)。
[0098] 图1显示Prep细胞立春红(Ponceau)和Western印迹。(a)含有样品的立春红染色的硝酸纤维素膜，所述样品收集自Rhesus胎儿脑蛋白的 Prep细胞分离的每个第6级分。(b)用母亲血浆进行检测的(a)中膜的 Western印迹，所述母亲血浆对37kDa、39kDa和73kDa抗原有反应性。
[0099] 图2显示2-D凝胶和Western印迹图。包含母体抗体靶标的Rhesus 胎儿脑(RFB)蛋白级分被荧光标记并在2-D凝胶上分离。A)2-D分离后经标记的37kDa、39kDa或73kDa蛋白的荧光图。B)用对每种抗原有反应性的经稀释母亲血浆检测的2-D Western印迹化学发光图。圆圈表示母体抗体和同源抗原在2-D印迹上的反应性点，其用于指导从一式两份的 2-D凝胶上取点。
[0100] 图3显示重组或纯化的LDH的Western印迹。a)用来自AUM(A) 或TDM(T)的1∶400稀释的母亲血浆检测纯化人LDH的示例性Western 印迹。用1∶2000稀释的山羊抗人LDH检测带1，用1∶2000稀释的兔抗人 LDHB检测带2。b)用1∶400稀释的母亲血浆检测重组人GST标签化 LDHA(A)、重组人GST标签化LDHB(B)或纯化的天然人LDH(Enz) 的Western印迹，证实对LDH亚基的不同反应性。
[0101] 图4显示使用从人红细胞纯化的LDHA和B的示例性Western印迹。用于Western印迹和ELISA的LDH从人红细胞纯化并且包含A和B亚基两者。用重组的纯LDHA或LDHB进行Western印迹证明母亲可以对一种或两种亚基显示IgG反应性。
[0102] 图5显示使用从人红细胞纯化的LDHA和B的示例性Western印迹。用于Western印迹和ELISA的LDH从人红细胞纯化并且包含A和B亚基两者，它们具有90％的序列同源性。用重组的纯LDHA或LDHB进行 Western印迹证明母亲可以对一种或两种亚基显示IgG反应性。约30％的自闭症患儿母亲中结合LDHA和LDHB之一或两者的抗体为阳性。所有阳性母亲均与A和B亚基两者都反应。
[0103] 图6显示对猴胎脑印迹的39kDa条带显示反应性的阳性和阴性对象的示例性Western印迹。通过约39kDa条带鉴定的表现为与ASD相关的蛋白质有2种。它们是鸟嘌呤脱氨酶(“GDA”)和Y盒结合蛋白1(YBX1)。GDA阳性的那些个体均具有39kDa条带。然而，并非所有的39kDa阳性个体都是GDA阳性。约26％的自闭症患儿母亲为靶向GDA之IgG阳性的。
[0104] 图7显示对猴胎脑印迹的39kDa条带显示反应性的阳性和阴性对象的示例性Western印迹。YBX1阳性的那些个体均在39kDa有条带。然而，并非所有的39kDa阳性个体都是YBX1阳性。约11％的自闭症患儿母亲为YBX1阳性。表观分子量为39kDa并且与母体抗体结合的其他蛋白质包括真核翻译和延伸因子1A1(“EEF1A1”)、微管相关蛋白Tau (“MAPT”)。
[0105] 图8显示对猴胎脑印迹的73kDa条带显示反应性的阳性和阴性对象的示例性Western印迹。当用母体抗体染色时常常在猴胎脑Western印迹分析中观察到73kDa区域内的2条带。如放大图中可见条带形成非常紧密的双线。已证实该双线的上面一条带是应激诱导磷蛋白1(“STIP1”)。证实下面一条带是脑衰蛋白反应调节蛋白1(“CRMP1”)。市售阳性抗 STIP-1抗体显示表观分子量为63kDa的带。约32％的自闭症患儿母亲为抗CRMP1抗体阳性，约59％的自闭症患儿母亲为抗STIP1抗体阳性。
[0106] 图9显示对猴胎脑印迹的73kDa带显示反应性的阳性和阴性对象的示例性Western印迹。市售阳性抗CRMP1抗体显示表观分子量为60kDa 和63kDa的带。表观分子量为73kDa并且与母体抗体结合的其他蛋白质包括二氢嘧啶酶样蛋白2(“DPYSL2”)、发动蛋白1样蛋白(“DNM1L”)、神经丝轻多肽(“NEFL”)和根蛋白(“RDX”)。
[0107] 图10显示DPYSL2的示例性Western印迹。该条带仅在几个个体中发现。
[0108] 图11显示包含纯LDH、STIP1和CRMP1的示例性组合Western印迹。将纯化形式的靶蛋白一起作为Western印迹的底物，并用多种样品进行检测。第一泳道为仅有第二抗体的对照，每个条底部的带是存在于LDH 制剂中的残留人IgG。泳道2-4用针对相应蛋白质的阳性对照市售抗血清进行检测。泳道5(AU 153)是用于鉴定靶蛋白的阳性血浆对照。该个体对粗提猴胎脑(fetal monkey brain，FMB)的初始western印迹和纯化形式的所有3种抗原均显示反应性。个体4618AU对FMB的37kDa条带有弱阳性，而且主要结合表观分子量为37kDa和73kDa的蛋白质。对象 4618也是GDA阳性(39kDa条带)。这里也显示了多种其他带形。
具体实施方式
[0109] 1.介绍
[0110] 自闭症谱系障碍(ASD)是严重神经发育疾病，每150名儿童中就有 1名儿童患病之多。已经描述了在一部分有ASD患儿的母亲中存在对分子量为约37kDa、39kDa和73kDa的人胎儿脑蛋白有特异性的母亲IgG 抗体。参见例如美国专利No.7,452,681。本发明部分基于与母体抗体结合的生物标志物的鉴定，其指示胎儿发生ASD的风险增加。表观分子量为 37kDa的生物标志物包括乳酸脱氢酶(LDH)和刺端肌动蛋白结合蛋白 CapZ的α亚基(CAPZA2)。表观分子量为39kDa的生物标志物包括鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1 (EEF1A1)和微管相关蛋白Tau(MAPT)。表观分子量为
73kDa的生物标志物包括脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1 (STIP1)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR)。母亲或潜在母亲的生物样品中存在针对一种或更多种所鉴定的胎儿生物标志物的母体抗体指示胎儿发生ASD的风险增加。
73kDa的生物标志物包括脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1 (STIP1)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR)。母亲或潜在母亲的生物样品中存在针对一种或更多种所鉴定的胎儿生物标志物的母体抗体指示胎儿发生ASD的风险增加。
[0111] 2.接受诊断或治疗的患者
[0112] 所述方法可以对任何哺乳动物进行，例如人、非人灵长类动物、实验室哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)、家养哺乳动物(例如猫、狗) 或农业哺乳动物(例如，牛、羊、猪、马)。在一些实施方案中，所述患者是女人和人。
[0113] 任何能怀有后代的女性可以受益于本发明的诊断方法。后代可以已怀上或尚未被怀上，即女性可以但不一定怀孕。在一些实施方案中，所述女性有初生的婴儿。在一些实施方案中，所述女性是育龄女性，即已经来月经且未绝经。
[0114] 在一些实施方案中，诊断和预防和/或治疗方法可以对患有胎儿的女性(即妊娠女性)进行。所述方法可以在妊娠期间的任意时间进行。在一些实施方案中，诊断和预防和/或治疗方法对怀有脑开始发育的胎儿的女性进行。例如，胎儿可以处于妊娠的约第12周或之后。在一些实施方案中，接受治疗或诊断的女性在孕中期或孕晚期。在一些实施方案中，接受治疗或诊断的女性在妊娠早期。在一些实施方案中，女性是产后的，例如在分娩后6个月内。在一些实施方案中，女性是产后的并且在进行母乳喂养。
[0115] 会受益于本发明诊断和预防和/或治疗方法的女性可以(但不一定) 具有ASD或自身免疫疾病的家族史。例如，所述女性可患ASD或有患 ASD的家族成员(例如，父母、子女、祖父母)。在一些实施方案中，所述女性患有自身免疫疾病或有患自身免疫疾病的家族成员(例如，父母、子女、祖父母)。
[0116] 在一些实施方案中，诊断或预防/治疗方法包括确定适于患者的诊断和/或预防/治疗方法的步骤，例如根据之前的医疗史或家族医疗史或妊娠状态或任何其他相关指标。
[0117] 3.测定自闭症谱系障碍发生风险的方法
[0118] 本发明提供了测定胎儿或儿童发生自闭症谱系障碍(ASD)的可能性的方法，其包括在来自所述胎儿或儿童之母亲的生物样品中鉴定与1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13种或更多种本文所述生物标志物 (例如选自乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR))结合的母体抗体的存在，其中与一种或更多种生物标志物结合的母体抗体的存在指示胎儿或儿童发生 ASD的可能性增加。
[0119] 对于获取自母亲的生物样品，可以使用任何包含抗体的流体样品。例如，生物样品可以是血液、血清、血浆、羊水、尿液、乳汁或唾液。当然，可以评价一种或更多种不同的体液中与所述一种或更多种生物标志物特异性结合的抗体。
[0120] 评价所述生物样品中与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13种或更多种本文所述生物标志物(例如选自乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y 盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR)) 特异性结合的抗体的存在。
[0121] 在一些实施方案中，检测到抗生物标志物抗体的存在(相比于未检测到抗生物标志物抗体)指示胎儿已经或将要发生ASD。
[0122] 在一些实施方案中，将生物样品中抗生物标志物抗体的水平或效价与阈值水平或效价相比较。高于阈值水平或效价的生物样品中的抗生物标志物抗体的水平或效价指示胎儿已经或将发生ASD的几率增加。同样，低于阈值水平或效价的生物样品中的抗生物标志物抗体的水平或效价不指示胎儿已经或将会发生ASD的几率增加(即指示几率不增加)。特定生物流体中抗生物标志物抗体的阈值水平或效价可以通过以下来确定：评价在妊娠女性群体中抗生物标志物抗体的水平，将子女发生ASD的母亲的生物流体中抗生物标志物的水平和效价与子女不发生ASD的母亲的生物流体中抗生物标志物的水平或效价进行比较。还可以在妊娠的不同时间点测定阈值水平或效价，例如，在怀有胎儿期间每四周、每2周或每周。阈值抗生物标志物水平还可以在子女出生后测量，例如在出生头4周和/或在母亲母乳喂养期间。
[0123] 可以在妊娠之前、期间或之后测定抗生物标志物抗体的存在与否或者抗生物标志物抗体的定量水平。当在妊娠期间测定时，可以在妊娠期间的任何时间适当地进行1、2、3、4或更多次抗生物标志物抗体的检测。例如，可以在妊娠早期、妊娠中期和/或妊娠晚期中的一个或更多个期间进行抗生物标志物抗体的检测。在一些实施方案中，可以对怀有脑已开始发育之胎儿的母亲的生物样品进行抗生物标志物抗体的检测，例如妊娠约 12周之后。在一些实施方案中，在产后进行一次或更多次抗生物标志物抗体的存在与否或者抗生物标志物抗体的定量水平的评估，例如在出生后的头四周和/或在母亲对子女母乳喂养期间。在一些实施方案中，可以在妊娠前或对任何未怀孕的女性评估抗生物标志物抗体的存在与否或者抗生物标志物抗体的定量水平。
[0124] 可以按照需要或期望，一次或多于一次地测量抗生物标志物抗体的存在。在一些实施方案中，可以适当地在妊娠期间每4周、每2周或每周、或更经常或更不经常地评估抗生物标志物抗体的存在与否或者抗生物标志物抗体的定量水平。
[0125] 在一些实施方案中，将测试样品与对照进行比较。对照可以来自不同时间点的相同个体。例如，测试样品可以在妊娠期间取得，对照样品可以在相同个体妊娠之前取得。在一些情况中，测试样品在妊娠期中相对晚的时间取得，而对照样品从相同个体妊娠期相对早的时间取得。在这种情况下，如果与对照样品相比测试样品母亲抗生物标志物抗体的水平更高，则胎儿或儿童发生ASD的风险增加。如果在妊娠过程中评价了几个样品，则随着妊娠过程抗生物标志物抗体水平或效价的增加指示胎儿或儿童发生ASD的风险增加。类似地，在妊娠期中抗生物标志物抗体水平或效价不存在或降低指示胎儿或儿童发生ASD的风险低或降低。
[0126] 对照还可以来自抗生物标志物抗体存在状态已知的不同个体。对照还可以是抗生物标志物抗体存在状态已知的个体群体的计算值。对照可以是阳性对照或阴性对照。
[0127] 在一些实施方案中，对照是来自另一个体或个体群体的阴性对照。如果对照样品的已知状态是抗生物标志物抗体阴性，则测试样品比阴性对照样品中母亲抗生物标志物抗体水平更高表示胎儿或儿童发生ASD的风险增加。测试样品与阴性对照样品中母亲抗生物标志物抗体水平相似表示胎儿或儿童发生ASD的风险没有增加，即具有低或降低的风险。
[0128] 在一些实施方案中，对照是来自另一个体或个体群体的阳性对照，或者所述对照反映了抗生物标志物抗体的预定阈值水平。如果对照样品的已知状态是抗生物标志物抗体阳性，则测试样品与阳性对照样品中母亲抗生物标志物抗体水平相似或比其更高表示胎儿或儿童发生ASD的风险增加。测试样品比对照样品中母亲抗生物标志物抗体水平低表示胎儿或儿童发生ASD的风险没有增加或具有低或降低的风险。
[0129] 对照样品或值与测试样品之间的差异只需要足以被检测到即可。在一些实施方案中，当抗生物标志物水平相比于阴性对照或预先测量的对照为至少例如10％、25％、50％、1倍、2倍、3倍、4倍或更多时，则确定测试样品中抗生物标志物抗体水平增加，因而ASD风险增加。
[0130] 为了诊断胎儿或儿童发生ASD的可能性是否增加，可以测定针对一种或更多种生物标志物(例如选自乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1 (STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白 Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白 (DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR)) 之任何亚型、同工型或同工酶的母体抗体的存在。例如，可以测定针对 LDH-A和/或LDH-B之一或两者的抗生物标志物抗体存在与否或其定量水平。在一些实施方案中，测定针对同工酶LDH-1、LDH-2、LDH-3、 LDH-4和/或LDH-5中一种或更多种的抗生物标志物抗体存在与否或其定量水平。
[0131] 可以使用本领域任何已知方法检测抗生物标志物抗体。示例性方法包括但不限于Western印迹、点印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、电化学发光、多重珠测定(例如使用Luminex或荧光微珠)。
[0132] 抗原可以是生物标志物多肽或其抗原性片段。生物标志物多肽或其抗原性片段可以是纯化或者基本纯化自其天然来源，或者是重组或合成产生的。多肽的重组产生方法是本领域已知的。参见例如Sambrook和Russell， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，1987-2009，John Wiley Interscience。如上所述，本文所述的生物标志物的cDNA序列是已知的，并且可以在大肠杆菌中重组表达。LDH-A 和LDH-B的cDNA序列是已知的，并且已经在大肠杆菌中重组表达，发现它们保留了与分离自人组织的同工酶相同的功能和组合特性。参见例如 Barstow等，Biochim Biophys Acta.(1990)：1087(l)：73-9。多肽抗原性片段的鉴定也是本领域公知的。例如，生物标志物多肽的部分长度片段可以被构建为至少10个氨基酸的长度。可以构建例如10、20或30个氨基酸长度的重叠肽，并且鉴定生物标志物多肽的免疫显性表位。在一些实施方案中，生物标志物多肽的部分长度片段至少为生物标志物多肽全长的约 50％、60％、70％、80％、90％、95％。在一些实施方案中，生物标志物多肽的部分长度片段长约10、25、50、100、150、200、250或
300个氨基酸。部分长度片段可以是除去了生物标志物多肽N端或C端的，或者除去了部分N端或C端或两者都除去的。可检测且特异性使用的生物标志物多肽的部分长度片段与来自母亲或潜在母亲之生物样品的抗生物标志物抗体结合，例如通过任何免疫测定所检测的。
可将部分长度生物标志物多肽或抗原性片段的结合与全长生物标志物多肽的结合进行比较。生物标志物多肽可来自与患者相同或不同的物种，前提是它们可被母体抗体结合。在一些实施方案中，生物标志物多肽是人的多肽。
300个氨基酸。部分长度片段可以是除去了生物标志物多肽N端或C端的，或者除去了部分N端或C端或两者都除去的。可检测且特异性使用的生物标志物多肽的部分长度片段与来自母亲或潜在母亲之生物样品的抗生物标志物抗体结合，例如通过任何免疫测定所检测的。
可将部分长度生物标志物多肽或抗原性片段的结合与全长生物标志物多肽的结合进行比较。生物标志物多肽可来自与患者相同或不同的物种，前提是它们可被母体抗体结合。在一些实施方案中，生物标志物多肽是人的多肽。
[0133] 在一些实施方案中，生物标志物多肽或其抗原性片段与本文所述的生物标志物多肽具有至少约90％、93％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，例如，与GenBank登录号AAP36496.1；BAD96798.1；NP_005557.1 (同工型1)；NP_001128711.1(同工型2)；NP_001158886.1(同工型3)； NP_001158887.1(同工型4)；或NP_001158888.1(同工型5)的LDHA 氨基酸序列；与GenBank登录号NP_002291.1(变体1)；或 NP_001167568.1(变体2)的LDHB氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_001014809.1(同工型1)或NP_001304.1(同工型2)的CRMP1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_006810.1的STIP1氨基酸序列；与 GenBank登录号NP_
004284.1的GDA氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_001377.1或BAD92432的DPYSL2氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_006127.1的CAPZA2氨基酸序列；与GenBank登录号NP_004550.2 的YBX1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001393.1的EEF1A1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_058519.3(同工型1)；NP_005901.2(同工型2)；NP_058518.1(同工型3)；NP_058525.1(同工型4)；NP _001116539.1(同工型5)；或NP_001116538.2(同工型6)的MAPT氨基酸序列；与GenBank登录号NP_036192.2(同工型1)；NP_036193.2 (同工型2)；NP_005681.2(同工型3)的DNM1L氨基酸序列；与GenBank 登录号NP_006149.2的NEFL氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002897.1的RDX氨基酸序列；与GenBank登录号NP_002435.1的 MSN氨基酸序列；或与GenBank登录号NP_003370.2(同工型1)或 NP_001104547.1(同工型2)的EZR氨基酸序列。
004284.1的GDA氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_001377.1或BAD92432的DPYSL2氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_006127.1的CAPZA2氨基酸序列；与GenBank登录号NP_004550.2 的YBX1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001393.1的EEF1A1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_058519.3(同工型1)；NP_005901.2(同工型2)；NP_058518.1(同工型3)；NP_058525.1(同工型4)；NP _001116539.1(同工型5)；或NP_001116538.2(同工型6)的MAPT氨基酸序列；与GenBank登录号NP_036192.2(同工型1)；NP_036193.2 (同工型2)；NP_005681.2(同工型3)的DNM1L氨基酸序列；与GenBank 登录号NP_006149.2的NEFL氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002897.1的RDX氨基酸序列；与GenBank登录号NP_002435.1的 MSN氨基酸序列；或与GenBank登录号NP_003370.2(同工型1)或 NP_001104547.1(同工型2)的EZR氨基酸序列。
[0134] 在一些实施方案中，用于检测母亲或潜在母亲的生物样品中抗生物标志物抗体的抗原是生物标志物的模拟表位。生物标志物的模拟表位可以源自生物标志物的已知抗原表位，其具有一个或更多个氨基酸替换、删除或添加。可以通过在肽文库中筛选结合抗生物标志物抗体的模拟表位从头设计或鉴定生物标志物的模拟表位。
[0135] 在一些实施方案中，用于检测抗生物标志物抗体或生物标志物的模拟表位的抗原(例如生物标志物多肽或其抗原性片段)可以固定在固体支持物上。固体支持物可以是例如多孔板、微阵列芯片、珠、渗透试片、硝酸纤维素滤器。可以通过共价或非共价结合进行固定。在一些实施方案中，通过与靶生物标志物特异性结合的捕获抗体进行固定。已开发了针对 LDH的单克隆抗体和对LDH的抗原捕获免疫测定，参见例如Wang和 Smith，J Food Science(1995)60(2)：253；和Druilhe等，Am J Trop Med Hyg (2001)64(5，6)233-241。可以使用市售的LDH(Abeam，Cambridge，MA)、 GDA(Sigma)、YBX1(Abeam)、CRMP1(Abeam)、STIP1(Abeam) 和Ezrin/Radixin/Moesin(Cell Signalling)的多克隆抗体产生抗原捕获测定。可以将纯化的天然LDH(Cell Sciences，Canton，MA)、重组全长GDA (Abnova，Taipei，Taiwan)、重组全长YBX1(Abnova)、重组全长 CAPZA2(Abnova)、重组全长DPYSL2(Novus Biologicals)、重组全长 DNM1L(Abnova)、重组全长EEF1A1(Abnova)、重组全长MAPT (Abnova)、重组全长NEFL(Abnova)、重组全长CRMP1(OriGene， Rockville，MD)和重组全长STIP1(Abnova)人蛋白质固定在固体支持物上并用作抗生物标志物抗体测定。
[0136] 对于母亲抗生物标志物抗体的检测，在足以允许样品中存在的任何抗体或自身抗体特异性结合的条件(即时间、温度、样品浓度)下，将样品与生物标志物多肽、其抗原性片段或生物标志物模拟表位一起孵育。可以将生物标志物多肽、其抗原性片段或生物标志物模拟表位结合在固体支持物上。例如，生物标志物多肽、其抗原性片段或生物标志物模拟表位可以暴露于样品约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0小时，或者约8、10或12小时过夜。但是，孵育时间可以或多或少地取决于，例如抗原的组成、样品的稀释度和孵育温度。使用较少稀释的样品和较高温度的孵育可以进行较短的时间。孵育通常在室温(约25℃)或在生物温度(约37℃)下进行，而且可以在冰箱(约4℃)中进行。根据已知的免疫测定法在添加第二抗体之前洗涤以除去未结合的样品。
[0137] 通常用标记的第二抗体来检测样品中与一种或更多种生物标志物多肽、其抗原性片段或生物标志物模拟表位结合的抗体或自身抗体。第二抗体与不同类型或同种型的免疫球蛋白(IgM、IgD、IgG、IgA和IgE)的恒定区或“C”区结合。通常在本发明方法中使用针对IgG恒定区的第二抗体。还在本发明方法中使用针对IgG亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和 IgG4)的第二抗体。可以用任何直接或间接可检测部分标记第二抗体，所述部分包括荧光团(即荧光黄、藻红素、量子点、Luminex珠、荧光珠)、酶(即过氧化物酶、碱性磷酸酶)、放射性同位素(即3H、32P、125I)或化学发光部分。可以使用生物素和生物素结合部分(即亲和素、链霉亲和素、中性亲和素(neutravidin))的复合物来放大标记信号。从Molecular Probes，Eugene，OR可购得荧光标记的抗人IgG抗体。可以从 Sigma-Aldrich，St.Louis，MO和Chemicon，Temecula，CA购得酶标记的抗人IgG抗体。
[0138] 检测样品中抗体或自身抗体的存在与否或者差异性存在的方法取决于第二抗体标记的选择。例如，如果将生物标志物多肽或其抗原性片段转移到适于进行免疫印迹的膜基质上，则可以在使用酶标记的情况下使用数字成像器进行定量，或者在使用反射性同位素标记的情况下使用x射线膜显影器进行定量。在另一实施方案中，如果将生物标志物多肽或其抗原性片段转移到多孔板上，可以使用能检测并定量荧光、化学发光和/或比色信号的自动读板器来对可检测信号进行定量。这些检测方法在本领域公知。
[0139] 一般性的免疫测定技术是本领域公知的。优化参数的指南可见，例如 Wu，Quantitative Immunoassay：A Practical Guide for Assay Establishment， Troubleshooting，and Clinical Application，2000，AACC Press；Principles and Practice of Immunoassay，Price and Newman编，1997，Groves Dictionaries，Inc.；The Immunoassay Handbook，Wild编，2005，Elsevier Science Ltd.；Ghindilis，Pavlov and Atanassov，Immunoassay Methods and Protocols，2003，Humana Press；Harlow and Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，1998，Cold Spring Harbor Laboratory Press；和 Immunoassay Automation：An Updated Guide to Systems，Chan编，1996， Academic Press。
[0140] 通过免疫测定中的可检测信号(即印迹、荧光、化学发光、颜色、放射活性)指示母亲抗生物标志物抗体的存在或存在的增加，在该免疫测定中将来自母亲或潜在母亲的生物样品与生物标志物多肽、其抗原性片段或模拟表位接触。可以将该可检测信号与对照样品的信号或阈值进行比较。在一些实施方案中，当与对照样品中抗生物标记物抗体的信号或预先确定的阈值相比，测试样品中抗生物标志物抗体的可检测信号至少强约10％、 20％、30％、50％、75％时，检测到存在的增加，并且指示ASD风险的增大。在一些实施方案中，当与对照样品中抗生物标记物抗体的信号或预先确定的阈值相比，测试样品中抗生物标志物抗体的可检测信号至少为约 1倍、2倍、3倍、4倍或更多时，检测到存在的增加，并且指示ASD风险的增大。
[0141] 在一些实施方案中，抗生物标记物抗体的测定结果记录在有形介质上。例如，对本发明诊断性测定的结果(例如观察到抗生物标志物抗体存在或存在增加)和是否ASD风险增加的诊断进行测定并可以记录在，例如纸上或电子介质(例如录像带、计算机磁盘、CD、闪存等)上。
[0142] 在一些实施方案中，所述方法还包括根据抗生物标志物抗体测定的结果对患者提供以下诊断的步骤：即胎儿或儿童发生ASD的风险是否增加。
[0143] 在一些实施方案中，所述方法还包括向母亲或潜在母亲施用一种或更多种阻断剂的治疗性或预防性方案，以降低、抑制或预防抗生物标志物抗体与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13种或更多种本文所述生物标志物(例如选自乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白 (RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR))的结合。
[0144] 在另一方面，本发明提供了测定后代(例如胎儿或儿童)发生自闭症谱系障碍(ASD)的风险或者测定母亲或潜在母亲怀有会发生自闭症谱系障碍(ASD)的儿童之风险的方法，其通过鉴定来自后代母亲的生物样品中与选自以下的一种或更多种蛋白质特异性结合的母体抗体的存在进行：鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、F-肌动蛋白加帽蛋白α-2 亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶和谷氨酸脱氢酶，其中与所述一种或更多种蛋白质特异性结合的母体抗体的存在指示后代发生ASD的风险增加。针对选自鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、F-肌动蛋白加帽蛋白α-2亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶和谷氨酸脱氢酶的一种或更多种蛋白质之母体抗体的存在的测定可以与针对一种或更多种本文所述生物标志物之母体抗体的存在的测定联合进行或独立进行。诊断方法的另一些实施方案如本文所述。
[0145] 通过施用抗生物标志物抗体阻断剂来降低风险的方法
[0146] 本发明还提供了在胎儿或儿童中预防和/或降低ASD发生风险的方法，其通过向母亲体内施用阻断母体抗体与1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13种或更多种本文所述生物标志物(例如选自乳酸脱氢酶 (LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基 (CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1 (EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2 (DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白 (MSN)和埃兹蛋白(EZR))结合的一种或多种试剂。
[0147] 使用一种或多种抗生物标志物抗体阻断剂的预防和/或治疗方法可以在妊娠之前、期间或之后向女性提供。在一些实施方案中，所述抗生物标志物抗体阻断剂可以在妊娠期间的任意时间适当地施用1、2、3、4或更多次。例如，所述抗生物标志物抗体阻断剂可在妊娠早期、妊娠中期和/ 或妊娠晚期中的一个或多个期间施用。在一些实施方案中，对怀有脑已开始发育的胎儿(例如，妊娠12周后)的女性施用抗生物标志物抗体阻断剂。在一些实施方案中，在产后(例如在出生后头4周和/或在母亲母乳喂养期间)施用抗生物标志物阻断剂1次或更多次。在一些实施方案中，在妊娠前(例如，对抗生物标志物抗体测试为阳性的女性和尝试怀孕的女性)施用抗生物标志物抗体1次或更多次。
[0148] 抗生物标志物抗体阻断剂可以是生物标志物多肽或其抗原性片段。生物标志物多肽或抗原性片段可以纯化或基本纯化自天然来源，或者可以如以上所述重组或合成产生。例如，可以施用的一种或更多种生物标志物多肽的部分长度片段至少为10个氨基酸长而且与抗生物标志物抗体结合。在一些实施方案中，所施用的一种或更多种生物标志物的部分长度片段至少为生物标志物多肽全长的约50％、60％、70％、80％、90％、95％。在一些实施方案中，生物标志物的部分长度片段为约50、100、150、200、 250或300个氨基酸长。所述部分长度片段可以是除去了生物标志物多肽的N端或C端的，或者是除去了N端以及C端的一部分的。有用的一种或更多种生物标志物多肽的部分长度片段与母亲或潜在母亲的抗生物标志物抗体结合。在一些实施方案中，施用一种或更多种LDH-A和/或 LDH-B多肽。
[0149] 在一些实施方案中，施用LDH-1、LDH-2、LDH-3、LDH-4和/或 LDH-5中的一种或更多种同工酶。在一些实施方案中，LDH多肽或其抗原性片段与本文所述的LDH多肽(例如，与GenBank登录号 NP_001128711、NP_005557.1、AAP36496.1、BAD96798.1或NP_002291.1 的氨基酸序列)有至少约90％、93％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。
[0150] 在一些实施方案中，所施用的生物标志物多肽或其抗原性片段与本文所述的生物标志物多肽有至少约90％、93％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，例如与下列有上述序列同一性：GenBank登录号 AAP36496.1；BAD96798.1；NP_005557.1(同工型1)；NP_001128711.1 (同工型2)；NP_001158886.1(同工型3)；NP_001158887.1(同工型4) 或NP_
001158888.1(同工型5)的LDHA氨基酸序列；与GenBank登录号NP_002291.1(变体1)或NP_
001167568.1(变体2)的LDHB氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001014809.1(同工型1)或NP_001304.1 (同工型2)的CRMP1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_006810.1 的STIP1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_004284.1的GDA氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001377.1或BAD92432的DPYSL2氨基酸序列；与GenBank登录号NP_006127.1的CAPZA2氨基酸序列；与 GenBank登录号NP 004550.2的YBX1氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_001393.1的EEF1A1氨基酸序列；与GenBank登录号NP 058519.3 (同工型1)；NP_005901.2(同工型2)；NP_
058518.1(同工型3)； NP_058525.1(同工型4)；NP_001116539.1(同工型5)或NP_
001116538.2 (同工型6)的MAPT氨基酸序列；与GenBank登录号NP 036192.2(同工型1)；NP_
036193.2(同工型2)；NP_005681.2(同工型3)的DNM1L 氨基酸序列；与GenBank登录号NP_
006149.2的NEFL氨基酸序列；与 GenBank登录号NP_002897.1的RDX氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002435.1的MSN氨基酸序列；或与GenBank登录号NP_003370.2 (同工型1)或NP_
001104547.1(同工型2)的EZR氨基酸序列。
001158888.1(同工型5)的LDHA氨基酸序列；与GenBank登录号NP_002291.1(变体1)或NP_
001167568.1(变体2)的LDHB氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001014809.1(同工型1)或NP_001304.1 (同工型2)的CRMP1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_006810.1 的STIP1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_004284.1的GDA氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001377.1或BAD92432的DPYSL2氨基酸序列；与GenBank登录号NP_006127.1的CAPZA2氨基酸序列；与 GenBank登录号NP 004550.2的YBX1氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_001393.1的EEF1A1氨基酸序列；与GenBank登录号NP 058519.3 (同工型1)；NP_005901.2(同工型2)；NP_
058518.1(同工型3)； NP_058525.1(同工型4)；NP_001116539.1(同工型5)或NP_
001116538.2 (同工型6)的MAPT氨基酸序列；与GenBank登录号NP 036192.2(同工型1)；NP_
036193.2(同工型2)；NP_005681.2(同工型3)的DNM1L 氨基酸序列；与GenBank登录号NP_
006149.2的NEFL氨基酸序列；与 GenBank登录号NP_002897.1的RDX氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002435.1的MSN氨基酸序列；或与GenBank登录号NP_003370.2 (同工型1)或NP_
001104547.1(同工型2)的EZR氨基酸序列。
[0151] 在一些实施方案中，施用使用包含本文所述生物标志物的两种或更多种抗原性表位的多种试剂。可以单独或一起施用所述多种试剂。所述多种试剂可以是各个肽的合并物。在一些实施方案中，不同生物标志物表位的两种或更多种肽化学连接。多种抗原性表位可以来自相同或不同的生物标志物多肽。这种情况下的化学连接可以直接连接生物标志物表位或者通过使用化学支架或接头连接。在一些实施方案中，不同生物标志物表位的两种或更多种肽融合在一起。可以重组表达或化学合成表位融合物。
[0152] 在一些实施方案中，抗生物标志物抗体阻断剂可以是非肽小分子(即“小有机分子”)，其干扰或结合抗生物标志物抗体。该小分子可以直接对抗生物标志物抗体发挥作用，或者可以通过促进已与其他试剂(包括抗原性肽)结合的抗生物标志物抗体的特异性清除来间接发挥作用。
[0153] 在一些实施方案中，抗生物标志物抗体阻断剂是靶生物标志物的一种或更多种模拟表位。生物标志物模拟表位可以衍生自一种或更多种已知的抗原性表位，其具有一个或更多个氨基酸替换、缺失或添加。生物标志物模拟表位可以从头设计或鉴定，或通过在肽或小分子文库中筛选与针对一种或更多种生物标志物的抗体结合的模拟表位。
[0154] 在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与选自以下的一种、两种、三种或全部生物标志物结合的多肽或模拟表位：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与选自以下的一种、两种或全部生物标志物结合的多肽或模拟表位：乳酸脱氢酶(LDH)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与选自以下的一种、两种或全部生物标志物结合的多肽或模拟表位：鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与乳酸脱氢酶(LDH)和脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1) 中的一种或两种结合的多肽或模拟表位。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1) 中的一种或两种结合的多肽或模拟表位。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与乳酸脱氢酶(LDH)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)中的一种或两种结合的多肽或模拟表位。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)中的一种或两种结合的多肽或模拟表位。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与乳酸脱氢酶 (LDH)结合的多肽或模拟表位。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)结合的多肽或模拟表位。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)结合的多肽或模拟表位。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与应激诱导磷蛋白1 (STIP1)结合的多肽或模拟表位。
[0155] 在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与一种、两种、三种或全部选自以下的生物标志物结合的多肽或模拟表位：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、应激诱导磷蛋白1 (STIP1)。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与一种、两种或全部选自以下的生物标志物结合的多肽或模拟表位：乳酸脱氢酶(LDH)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与一种、两种或全部选自以下的生物标志物结合的多肽或模拟表位：鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2 (DPYSL2)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与乳酸脱氢酶(LDH)和二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)中的一种或两种结合的多肽或模拟表位。
在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)中的一种或两种结合的多肽或模拟表位。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)结合的多肽或模拟表位。
在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)中的一种或两种结合的多肽或模拟表位。在一些实施方案中，施用阻断母体抗体与二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)结合的多肽或模拟表位。
[0156] 所施用的抗生物标志物抗体阻断剂、多肽或小分子可以包含修饰以减少其免疫原性或使之最小化。生物标志物多肽及其抗原性片段或生物标志物模拟表位上的氨基酸修饰包括但不限于酰胺部分或焦谷氨酰基残基或添加聚乙二醇链(PEG化)。这些修饰可有利于降低形成β-片层构象的倾向或者可以促进肽的稳定性、溶解性并降低免疫原性。更稳定、溶解性更大并且免疫原性更低的肽是理想的。许多C端被CONH2(酰胺)基团修饰的肽表现出对羧肽酶攻击的抗性，许多N端具有焦谷氨酰基残基的肽对广谱特异性氨肽酶的攻击更有抗性。已证明与未修饰的肽相比，PEG 化的肽具有更长的血浆半衰期和降低的免疫原性。此外，阻断剂的序列分析使得能够通过保守性修饰将已知T细胞表位最少化。本发明肽还包括环状肽，其对羧肽酶和氨肽酶的攻击均有抗性。此外，口服施用阻断剂可有助于使免疫原性降到最低。
[0157] 在一些实施方案中，预防和/或治疗方法包括以下步骤：首先如本文所述确定与母亲或潜在母亲中一种或更多种生物标志物结合的抗体的存在或存在增加。抗生物标志物抗体检测为阳性或水平高于阈值水平的女性是接受阻止母亲抗生物标志物抗体与一种或更多种靶生物标志物结合的试剂的候选者。抗生物标志物抗体检测为阴性或水平低于阈值水平的女性不需要接受阻止母亲抗生物标志物抗体与一种或更多种靶生物标志物结合的试剂。
[0158] 适用于本发明的药物组合物包括其中包含治疗有效量活性成分的组合物。当然，所施用的组合物的量取决于所治疗的对象、对象的体重、病症的严重性、施用方式和开具处方的医师的判断。有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，尤其是在参考本文提供的详细公开后。一般地，通过以下方式确定一种或更多种抗生物标志物抗体阻断剂的生效量或有效量，即首先施用低剂量或小量的抗生物标志物抗体阻断剂，然后逐步增加施用的量或剂量，和/或按照需要添加第二抗生物标志物抗体阻断剂，直到在所治疗的对象中观察到伴随最低(或没有)毒性或不希望副作用的期望效果，例如使未结合或游离抗生物标志物抗体的存在消失或降低到预定阈值水平之下。确定用于施用本发明药物组合物的适当剂量或给药方案的适用方法描述于，例如Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1版，Brunton等编，McGraw-Hill(2006)，以及 Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，University of the Sciences in Philadelphia(USIP)，2005，Lippincott，Williams and Wilkins，它们均通过引用并入本文。
[0159] 可以单独调整剂量和间隔以提供足以保持治疗效果的抗生物标志物抗体阻断剂的血浆或组织水平。包含有效量的一种或更多种抗生物标志物抗体阻断剂之组合物的单次或多次施用可以用参诊医师所选择的剂量水平和模式进行。剂量和施用方案可以例如基于母亲或潜在母亲中抗生物标志物抗体的水平确定并调整，该水平可以采用医生通常实施的方法或本文所述的方法在整个治疗过程中监测。在一些实施方案中，通过施用每日一剂可以达到治疗水平。在一些实施方案中，给药方案可以包括每日多剂的方案。在又一些实施方案中，在本发明中包括每隔一天、每半周或每周给药。
[0160] 例如，可以按照需要每月一次、每两周一次、每周一次或每天一次施用抗生物标志物抗体阻断剂。在一些实施方案中，监测母亲中抗生物标志物抗体的水平，如果存在抗生物标志物抗体或其存在水平高于预定阈值，则施用阻断剂。适当地，可以在约1、2、3、4、5、10、12、15、20、24、 30、32、36周，或者更长或更短的时间段内施用抗生物标志物抗体阻断剂。例如，如果抗生物标志物抗体水平降到预定阈值水平之下，则可以中止施用抗生物标志物抗体阻断剂。可以在整个妊娠期间或者在妊娠早期、妊娠中期或妊娠晚期中的一个或更多个期间施用抗生物标志物抗体阻断剂。可以在妊娠之前开始施用并且可以在出生之后(例如在母亲母乳喂养儿童期间)继续施用。
[0161] 在阻断剂为多肽的实施方案中，通常的剂量范围为0.1μg/kg体重至且包含约1gm/kg体重，例如约1μg/kg体重至约500mg/kg体重。在一些实施方案中，多肽的剂量为约1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、 70、80、90或100mg/kg体重。
[0162] 在试剂为小有机分子的实施方案中，通常的剂量范围为0.1μg/kg体重至且包含约1gm/kg体重，例如约1μg/kg体重至约500mg/kg体重。在一些实施方案中，小分子有机化合物的剂量为约0.1、1、2、3、4、5、10、 20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/kg体重。
[0163] 确切剂量取决于以上讨论的多种因素，包括具体抑制剂、疾病的严重性和施用途径。医师无需进行过多实验就可以确定确切的治疗有效剂量，并且其可以包括上述范围中包含的任何剂量。
[0164] 通过使得所述试剂与抗生物标志物抗体结合并防止抗体与ASD发生风险相关的内源生物标志物结合而且对所述试剂的免疫应答最小的施用途径来施用抗生物标志物抗体阻断剂。通常全身施用所述试剂。在一些实施方案中，肠胃外施用所述试剂，例如静脉内或羊膜内(即直接进入羊膜)。此外，抗生物标志物抗体可以口服施用。
[0165] 可以将化合物配制为通过注射(例如通过推注(bolus injection)或持续输注)肠胃外施用。对于注射，可以通过将抗生物标志物抗体阻断剂溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂(如植物油或其他类似油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇)中来将它们配制成制剂；如果需要，其中可以具有常规添加剂如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。在一些实施方案中，本发明的组合可以配制成水性溶液，优选配制在生理相容性缓冲液中，如Hank’s溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。注射用制剂可以以单位剂型形式存在，例如在安瓿或多剂量容器中，其中具有添加的防腐剂。组合物可以采用油性或水性载剂中的悬液、溶液或乳液的形式，并且可以包含配制试剂(formulatory agent)如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
[0166] 用于肠胃外施用的药物制剂包括水可溶性形式的抗生物标志物抗体阻断剂的水溶液。此外，抗生物标志物抗体阻断剂的悬液可以制备为适合的油性注射悬液形式。适合的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油(如芝麻油) 或合成的脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)或者脂质体。水性注射悬液可以包含增加悬液粘稠度的物质，如羟甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬液还可以包含适合的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高浓缩溶液的试剂。或者，活性成分可以采用粉末形式，在使用前将其用适合的载剂(如无菌无热源水)重构。
[0167] 如果与施用阻断剂前相比，接受一种或更多种阻断剂的施用后，来自对象的生物样品中与一种或更多种生物标志物活性结合的抗生物标志物抗体的水平或效价减少或消除，则认为用抗生物标志物抗体阻断剂治疗有效。例如，施用一次或更多次阻断剂后，样品中与一种或更多种靶生物标志物活性结合的抗生物标志物抗体减少至少约10％、25％、50％、75％或100％指示阻断剂的施用是有效的。在建立了阈值水平的情况下，如果与一种或更多种生物标志物活性结合的抗生物标志物抗体的水平或效价降低至阈值水平之下，则认为用抗生物标志物抗体阻断剂治疗有效。可以使用本领域已知方法(包括本文所述的那些)测量与一种或更多种生物标志物活性结合的抗生物标志物抗体。
[0168] 在一些实施方案中，抗生物标志物抗体阻断剂与另一免疫抑制治疗共同施用。所述共同施用的免疫抑制治疗可以是抗原特异的(例如免疫抑制性DNA疫苗接种)或者是抗原非特异的(例如糖皮质激素、针对CD20、 CTLA-4、LFA-1的抗体)。在一些实施方案中，抗生物标志物抗体阻断剂与用于选择性耗尽B细胞类群的抗CD-20抗体共同施用。临床上用于耗尽B细胞的抗CD20抗体可以购得，包括例如Rituximab、ocrelizumab 和ofatumumab。
[0169] 在另一方面，本发明提供了预防或降低胎儿发生ASD风险的方法，其包括向胎儿的母亲施用阻断母体抗体与选自以下的一种或更多种胎儿蛋白质结合的试剂：鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、F- 肌动蛋白加帽蛋白α-2亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶和谷氨酸脱氢酶，由此通过阻断一种或更多种蛋白质结合的母体抗体的结合来预防或降低胎儿发生ASD的风险增加。阻断与针对选自鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、F-肌动蛋白加帽蛋白α-2亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶的一种或更多种蛋白质之母体抗体的结合可以和阻断与针对一种或更多种本文所述生物标志物之母体抗体的结合联合进行或独立进行。阻断方法的另一些实施方案如本文所述。
[0170] 4.通过免疫抑制性DNA疫苗接种降低ASD风险的方法
[0171] 在一个备选实施方案中，施用编码生物标志物多肽、其抗原性片段或其模拟表位的一种或更多种多核苷酸来进行抑制性疫苗接种。可从具有低 CG二核苷酸数的载体(例如质粒载体)表达多核苷酸，以降低免疫刺激活性或者将其减小到最低程度。对抗自身免疫应答的免疫抑制性接种在如美国专利7,030,098和7,544,669中描述。
[0172] 多核苷酸可以编码生物标志物多肽或其抗原性片段。例如，施用编码至少10个氨基酸长的生物标志物多肽的部分长度片段而且与抗生物标志物抗体结合的多核苷酸。在一些实施方案中，施用编码生物标志物多肽全长的约50％、60％、70％、80％、90％、95％的生物标志物多肽部分长度片段的多核苷酸。在一些实施方案中，施用编码约10、25、50、100、 150、200、250或300个氨基酸长的一种或更多种生物标志物部分长度片段的多核苷酸。部分长度片段可以是除去了生物标志物多肽的N端或C 端的，或者是除去了N端以及C端的一部分的。可使用编码与抗生物标志物抗体结合的一种或更多种生物标志物多肽的部分长度片段的多核苷酸。
[0173] 在一些实施方案中，施用编码LDH-A和/或LDH-B中一种或更多种的多核苷酸。在一些实施方案中，施用编码LDH-1、LDH-2、LDH-3、 LDH-4和/或LDH-5同工酶中一种或更多种的多核苷酸。在一些实施方案中，施用这样的多核苷酸，其编码与本文所述的LDH多肽(例如，与 GenBank登录号NP_001128711、NP_005557.1、AAP36496.1、BAD96798.1 或NP_002291.1的氨基酸序列)有至少约90％、93％、95％、97％、99％或100％的序列同一性的LDH多肽或其抗原性片段。
[0174] 在一些实施方案中，所施用的多核苷酸编码生物标志物多肽或其抗原性片段，其与本文所述的生物标志物多肽有至少约90％、93％、95％、 97％、99％或100％的序列同一性，例如，与GenBank登录号AAP36496.1； BAD96798.1；NP_005557.1(同工型1)；NP_001128711.1(同工型2)； NP_001158886.1(同工型3)；NP_001158887.1(同工型4)或 NP_
001158888.1(同工型5)的LDHA氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002291.1(变体1)或NP_
001167568.1(变体2)的LDHB氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001014809.1(同工型1)或NP_001304.1(同工型2)的CRMP1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_006810.1的STIP1 氨基酸序列；与GenBank登录号NP_004284.1的GDA氨基酸序列；与 GenBank登录号NP_001377.1或BAD92432的DPYSL2氨基酸序列；与 GenBank登录号NP_006127.1的CAPZA2氨基酸序列；与GenBank登录号NP 004550.2的YBX1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001393.1 的EEF1A1氨基酸序列；与GenBank登录号NP 058519.3(同工型1)； NP_005901.2(同工型2)；NP_
058518.1(同工型3)；NP_058525.1(同工型4)；NP_001116539.1(同工型5)或NP_
001116538.2(同工型6)的 MAPT氨基酸序列；与GenBank登录号NP_036192.2(同工型1)； NP_036193.2(同工型2)；NP_005681.2(同工型3)的DNM1L氨基酸序列；与GenBank登录号NP_
006149.2的NEFL氨基酸序列；与GenBank 登录号NP_002897.1的RDX氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002435.1的MSN氨基酸序列；或与GenBank登录号NP_003370.2 (同工型1)或NP_
001104547.1(同工型2)的EZR氨基酸序列。
001158888.1(同工型5)的LDHA氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002291.1(变体1)或NP_
001167568.1(变体2)的LDHB氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001014809.1(同工型1)或NP_001304.1(同工型2)的CRMP1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_006810.1的STIP1 氨基酸序列；与GenBank登录号NP_004284.1的GDA氨基酸序列；与 GenBank登录号NP_001377.1或BAD92432的DPYSL2氨基酸序列；与 GenBank登录号NP_006127.1的CAPZA2氨基酸序列；与GenBank登录号NP 004550.2的YBX1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001393.1 的EEF1A1氨基酸序列；与GenBank登录号NP 058519.3(同工型1)； NP_005901.2(同工型2)；NP_
058518.1(同工型3)；NP_058525.1(同工型4)；NP_001116539.1(同工型5)或NP_
001116538.2(同工型6)的 MAPT氨基酸序列；与GenBank登录号NP_036192.2(同工型1)； NP_036193.2(同工型2)；NP_005681.2(同工型3)的DNM1L氨基酸序列；与GenBank登录号NP_
006149.2的NEFL氨基酸序列；与GenBank 登录号NP_002897.1的RDX氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002435.1的MSN氨基酸序列；或与GenBank登录号NP_003370.2 (同工型1)或NP_
001104547.1(同工型2)的EZR氨基酸序列。
[0175] 在一些实施方案中，所述多核苷酸编码与抗生物标志物抗体结合的生物标志物模拟表位。所述生物标志物模拟表位可以来自一种或更多种生物标志物的已知抗原性表位，其中一个或更多个氨基酸被替换、缺失或添加。生物标志物模拟表位可以通过在肽文库中筛选结合针对一种或更多种生物标志之抗体的模拟表位来从头设计或鉴定。
[0176] 通过实现抑制性疫苗接种的途径施用多核苷酸，例如肌内、静脉内、皮下或鼻内。通常，肌内施用多核苷酸。
[0177] 首先测试母亲或潜在母亲以确定抗生物标志物抗体的存在或者抗生物标志物抗体的存在是否超过预定阈值水平。然后可开始进行抑制性免疫方案。可以适当地在妊娠之前、期间或之后开始免疫抑制性接种方案。
[0178] 可以按照需要施用下述载体1、2、3、4或更多次，即CpG程度很低或去除了CpG的并且编码一种或更多种生物标志物多肽、其抗原性片段或生物标志物模拟表位的载体，以选择性抑制母亲针对所述一种或更多种生物标志物的免疫应答。低CpG载体可以这样递送，例如每月施用一次，持续6-12个月，然后每3-12个月施用一次以维持剂量。可以开发替代性的治疗方案，根据疾病严重性、患者年龄、施用的一种或更多种生物标志物多肽或其抗原性片段以及普通参诊医师考虑的这样的其他因素，治疗方案的范围可以是每天一次、每周一次、每两周一次、每隔一个月一次、每年一次至一次性施用。抑制性免疫疗程可以以较频繁的施用起始，然后以后续加强维持。
[0179] 低CpG载体的治疗有效量范围为约0.001微克至约1克。优选的载体治疗量范围为约10微克至约5毫克。最优选的自身载体的治疗量范围为约0.025mg至5mg。
[0180] 如果与施用载体前相比，接受一次或更多次编码所述一种或更多种生物标志物多肽或抗原性片段的载体施用后，来自个体的生物样品中与所述一种或更多种生物标志物活性结合的抗生物标志物抗体的水平或效价减少或消除，则认为免疫抑制性疫苗接种是有效的。例如，施用一次或更多次编码所述生物标志物多肽或其抗原性片段的载体后，样品中与一种或更多种生物标志物活性结合的抗生物标志物抗体减少至少约10％、25％、 50％、75％或100％指示载体施用是有效的。在已建立阈值水平的情况下，如果与一种或更多种生物标志物活性结合的抗生物标志物抗体的水平或效价降低至阈值水平之下，则认为用包含编码一种或更多种所述生物标志物多肽或其抗原性片段的多核苷酸的载体进行治疗是有效的。可以使用本领域已知的任何方法(包括本文所述的那些)测量与一种或更多种生物标志物多肽活性结合的抗生物标志物抗体。
[0181] 在一些实施方案中，低CpG载体含有编码选自以下的一种或更多种胎儿蛋白质的多核苷酸：鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、 F-肌动蛋白加帽蛋白α-2亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶和谷氨酸脱氢酶。编码一种或更多种所述胎儿蛋白质的多核苷酸可以与编码本文所述生物标志物多肽或其抗原性片段的多核苷酸同时或独立施用。施用编码胎儿蛋白质的多核苷酸的另一些实施方案在本文中描述。
[0182] 5.通过除去抗生物标志物抗体来降低风险的方法
[0183] 可以通过以下方式来降低或消除胎儿或儿童发生ASD的风险：离体地从母亲的生物流体中除去母亲抗生物标志物抗体，然后将具有水平降低或消除的抗生物标志物抗体的生物流体返回到母亲。
[0184] 离体地除去抗生物标志物抗体可以在妊娠之前、期间或之后对女性进行。在一些实施方案中，可以适当地在妊娠期间的任意时间1、2、3、4 或更多次地从生物流体中除去抗生物标志物抗体。例如，抗生物标志物抗体可以在妊娠早期、妊娠中期和/或妊娠晚期的一个或更多个期间除去。在一些实施方案中，从怀有脑已开始发育的胎儿(例如，妊娠约12周后) 的女性中除去抗生物标志物抗体。在一些实施方案中，在产后(例如在出生后头4周和/或在母亲母乳喂养期间)除去抗生物标志物抗体1次或更多次。在一些实施方案中，在妊娠前(例如，对抗生物标志物抗体测试为阳性的女性和尝试怀孕的女性)1次或更多次地除去抗生物标志物抗体。
[0185] 离体地除去抗生物标志物抗体的过程可以按照需要进行1、2、3、4 或更多次，以从母亲消除或减少抗生物标志物抗体。离体地除去抗生物标志物抗体可以适当地每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次地进行。在一些实施方案中，监测母亲中抗生物标志物抗体的水平，如果存在抗生物标志物抗体或其存在水平高于预定阈值，则进行抗生物标志物抗体的离体除去。离体地除去抗生物标志物抗体可以适当地进行 1、2、3、4、5、10、12、15、20、25、35、36周，或者更长或更短的时间。例如，如果抗生物标志物抗体水平降到预定阈值水平之下，则可以中止抗生物标志物抗体的离体除去。可以在整个妊娠期间或者在妊娠早期、妊娠中期或妊娠晚期的一个或更多个期间进行生物标志物抗体的离体除去。可以在妊娠之前开始并且可以在出生之后(例如在母亲母乳喂养儿童期间)继续除去抗生物标志物抗体。
[0186] 生物流体包含母亲抗生物标志物抗体。通常，生物流体是血液、血清、血浆或乳汁。在一些实施方案中，生物流体是羊水。
[0187] 包含抗生物标志物抗体的母亲生物流体与一种或更多种生物标志物多肽或其抗原性片段相接触。一种或更多种生物标志物多肽或其抗原性片段可纯化或基本纯化自天然来源，或者是如以上所述重组或合成产生的。例如，可以将至少10个氨基酸长而且与抗生物标志物抗体结合的一种或更多种生物标志物多肽的部分长度片段与生物流体接触。在一些实施方案中，可以将为生物标志物多肽全长至少约50％、60％、70％、80％、90％、 95％的一种或更多种生物标志物多肽的部分长度片段与生物流体接触。在一些实施方案中，一种或更多种生物标志物多肽的部分长度片段约1、25、 50、100、150、200、250或300个氨基酸长。部分长度片段可以是除去了生物标志物多肽的N端或C端的，或者是除去了N端以及C端的一部分的。可用的一种或更多种生物标志物多肽的部分长度片段与抗生物标志物抗体结合。
[0188] 在一些实施方案中，所述生物流体与LDH-A和/或LDH-B中的一种或更多种接触。在一些实施方案中，所述生物流体与LDH-1、LDH-2、 LDH-3、LDH-4和/或LDH-5同工酶中的一种或更多种接触。在一些实施方案中，LDH多肽或其抗原性片段与本文所述的LDH多肽(例如，与 GenBank登录号NP_001128711、NP_005557.1、AAP36496.1、BAD96798.1 或NP_002291.1的氨基酸序列)有至少约90％、93％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。
[0189] 在一些实施方案中，所述生物流体与一种或更多种和本文所述的生物标志物多肽有至少约90％、93％、95％、97％、99％或100％序列同一性的生物标志物多肽或其抗原性片段相接触，例如，与GenBank登录号 AAP36496.1；BAD96798.1；NP_005557.1(同工型1)；NP_001128711.1 (同工型2)；NP_001158886.1(同工型3)；NP_001158887.1(同工型4) 或NP_
001158888.1(同工型5)的LDHA氨基酸序列；与GenBank登录号NP_002291.1(变体1)或NP_
001167568.1(变体2)的LDHB氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001014809.1(同工型1)或NP_001304.1 (同工型2)的CRMP1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_006810.1 的STIP1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_004284.1的GDA氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001377.1或BAD92432的DPYSL2氨基酸序列；与GenBank登录号NP_006127.1的CAPZA2氨基酸序列；与 GenBank登录号NP 004550.2的YBX1氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_001393.1的EEF1A1氨基酸序列；与GenBank登录号NP 058519.3 (同工型1)；NP_005901.2(同工型2)；NP_
058518.1(同工型3)； NP_058525.1(同工型4)；NP_001116539.1(同工型5)或NP_
001116538.2 (同工型6)的MAPT氨基酸序列；与GenBank登录号NP 036192.2(同工型1)；NP_
036193.2(同工型2)；NP_005681.2(同工型3)的DNM1L 氨基酸序列；与GenBank登录号NP_
006149.2的NEFL氨基酸序列；与 GenBank登录号NP_002897.1的RDX氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002435.1的MSN氨基酸序列；或与GenBank登录号NP_003370.2 (同工型1)或NP_
001104547.1(同工型2)的EZR氨基酸序列。
001158888.1(同工型5)的LDHA氨基酸序列；与GenBank登录号NP_002291.1(变体1)或NP_
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058518.1(同工型3)； NP_058525.1(同工型4)；NP_001116539.1(同工型5)或NP_
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001104547.1(同工型2)的EZR氨基酸序列。
[0190] 在一些实施方案中，除去抗生物标志物抗体的试剂是生物标志物的模拟表位。所述生物标志物模拟表位可来自于靶生物标志物的已知抗原性表位，其具有一个或更多个氨基酸替换、缺失或添加。可以通过在肽文库中筛选与针对一种或更多种生物标志物的抗体结合的模拟表位来从头设计或鉴定生物标志物的模拟表位。
[0191] 在一些实施方案中，来自母亲或潜在母亲的生物流体与固体支持物上的生物标志物多肽或其抗原性片段或生物标志物模拟表位相接触。固体支持物可以是例如珠、柱、滤器。可以通过共价或非共价结合进行固定。在一些实施方案中，通过与靶生物标志物特异性结合的捕获抗体进行固定。与固体支持物连接的生物标志物多肽或其抗原性片段或生物标志物模拟表位是固定相，其捕获生物流体中的抗生物标志物抗体，允许抗生物标志物抗体水平降低或消除的生物流体与固体支持物分离(即作为流动相)，并返回母亲或潜在母亲。
[0192] 在一些实施方案中，离体处理的生物流体是血浆，并且通过本领域公知的方法血浆置换术除去抗生物标志物抗体。将血浆与固定了一种或更多种生物标志物多肽或其抗原性片段或固定了生物标志物模拟表位的固体支持物相接触。血浆中的抗生物标志物抗体与固定化的生物标志物多肽或其抗原性片段或者固定化的生物标志物模拟表位结合。然后将抗生物标志物抗体水平降低或消除的血浆返回到母亲或潜在母亲。
[0193] 在一个相关方面，本发明提供预防或降低胎儿ASD发生风险的方法，其包括除去与选自以下的一种或更多种胎儿蛋白质特异性结合的抗体：鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、F-肌动蛋白加帽蛋白α-2 亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶和谷氨酸脱氢酶。除去针对选自鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、F-肌动蛋白加帽蛋白α-2亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶和谷氨酸脱氢酶的一种或更多种胎儿蛋白质的母体抗体可以与消除针对所述一种或更多种生物标志物之母体抗体的结合同时或独立进行。除去母体抗体的另一些方法在本文中描述。
[0194] 6.试剂盒
[0195] 本发明还提供用于诊断或预测胎儿或儿童ASD发生风险是否增加的试剂盒。相关地，所述试剂盒也用于诊断或预测母亲或潜在母亲怀有ASD 患儿的风险是否增加。在一些实施方案中，所述试剂盒包含固体支持物，其包含一种或更多种生物标志物或其抗原性片段的一种或更多种亚基或一种或更多种亚型(isotype)(例如固体支持物包含选自乳酸脱氢酶 (LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基 (CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1 (EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2 (DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白 (MSN)和埃兹蛋白(EZR)的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13种或更多种生物标志物)。
[0196] 在一些实施方案中，固体支持物包含选自以下的一种、两种、三种或全部生物标志物：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，固体支持物包含选自以下的一种、两种或全部生物标志物：乳酸脱氢酶(LDH)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白 1(STIP1)。在一些实施方案中，固体支持物包选自以下的含一种、两种或全部生物标志物：鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1 (CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，固体支持物包含乳酸脱氢酶(LDH)和脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)中的一种或两种。在一些实施方案中，固体支持物包含鸟嘌呤脱氨酶(GDA) 和脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)中的一种或两种。在一些实施方案中，固体支持物包含乳酸脱氢酶(LDH)和应激诱导磷蛋白1(STIP1) 中的一种或两种。在一些实施方案中，固体支持物包含鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)中的一种或两种。在一些实施方案中，固体支持物包含乳酸脱氢酶(LDH)。在一些实施方案中，固体支持物包含鸟嘌呤脱氨酶(GDA)。在一些实施方案中，固体支持物包含脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)。在一些实施方案中，固体支持物包含应激诱导磷蛋白1(STIP1)。
[0197] 在一些实施方案中，固体支持物包含选自以下的一种、两种、三种或全部生物标志物：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，固体支持物包含选自以下的一种、两种或全部生物标志物：
乳酸脱氢酶(LDH)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，固体支持物包含选自以下的一种、两种或全部生物标志物：鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，固体支持物包含乳酸脱氢酶 (LDH)和二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)中的一种或两种。在一些实施方案中，固体支持物包含鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和二氢嘧啶酶样蛋白2 (DPYSL2)中的一种或两种。在一些实施方案中，固体支持物包含二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)。
乳酸脱氢酶(LDH)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，固体支持物包含选自以下的一种、两种或全部生物标志物：鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)。在一些实施方案中，固体支持物包含乳酸脱氢酶 (LDH)和二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)中的一种或两种。在一些实施方案中，固体支持物包含鸟嘌呤脱氨酶(GDA)和二氢嘧啶酶样蛋白2 (DPYSL2)中的一种或两种。在一些实施方案中，固体支持物包含二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)。
[0198] 固体支持物可以是例如多孔板、ELISA板、微阵列芯片、珠、渗透试片、硝化纤维素滤器。可以通过共价或非共价结合进行固定化。在一些实施方案中，通过与一种或更多种生物标志物特异性结合的捕获抗体进行固定化。试剂盒中提供的固体支持物上制备有一种或更多种固定化的生物标志物多肽、其抗原性片段或生物标志物模拟表位。
[0199] 在一些实施方案中，将一种或更多种生物标志物多肽或其抗原性片段固定在固体支持物上。生物标志物多肽或其抗原性片段可以纯化或基本纯化自天然来源，或如上所述重组或合成产生的。例如，可以固定一种或更多种生物标志物的部分长度片段，其至少10个氨基酸长而且与抗生物标志物抗体结合。在一些实施方案中，固定的一种或更多种生物标志物的部分长度片段至少为生物标志物多肽全长的约50％、60％、70％、80％、 90％、95％。在一些实施方案中，一种或更多种生物标志物多肽的部分长度片段约10、25、50、100、150、
200、250或300个氨基酸长。所述部分长度片段可以是除去了生物标志物多肽的N端或C端的，或者是除去了N端以及C端的一部分的。所使用的一种或更多种生物标志物多肽的部分长度片段与抗生物标志物抗体结合。
200、250或300个氨基酸长。所述部分长度片段可以是除去了生物标志物多肽的N端或C端的，或者是除去了N端以及C端的一部分的。所使用的一种或更多种生物标志物多肽的部分长度片段与抗生物标志物抗体结合。
[0200] 在一些实施方案中，在固体支持物上固定LDH-A和/或LDH-B中的一种或更多种。在一些实施方案中，在固体支持物上固定LDH-1、LDH-2、 LDH-3、LDH-4和/或LDH-5同工酶中的一种或更多种。在一些实施方案中，LDH多肽或其抗原性片段与本文所述的LDH多肽(例如，与GenBank 登录号NP_001128711、NP_005557.1、AAP36496.1、BAD96798.1或 NP_002291.1的氨基酸序列)有至少约90％、93％、95％、97％、99％或 100％的序列同一性。
[0201] 在一些实施方案中，固体支持物包含与本文所述生物标志物多肽有至少约90％、93％、95％、97％、99％或100％序列同一性的一种或更多种生物标志物多肽或其抗原性片段，例如，与GenBank登录号AAP36496.1； BAD96798.1；NP_005557.1(同工型1)；NP_
001128711.1(同工型2)； NP_001158886.1(同工型3)；NP_001158887.1(同工型4)或 NP_
001158888.1(同工型5)的LDHA氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002291.1(变体1)或NP_
001167568.1(变体2)的LDHB氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001014809.1(同工型1)或NP_001304.1(同工型2)的CRMP1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_006810.1的STIP1 氨基酸序列；与GenBank登录号NP_004284.1的GDA氨基酸序列；与 GenBank登录号NP_001377.1或BAD92432的DPYSL2氨基酸序列；与 GenBank登录号NP_006127.1的CAPZA2氨基酸序列；与GenBank登录号NP 004550.2的YBX1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001393.1 的EEF1A1氨基酸序列；与GenBank登录号NP 058519.3(同工型1)； NP_005901.2(同工型2)；NP_
058518.1(同工型3)；NP_058525.1(同工型4)；NP_001116539.1(同工型5)或NP_
001116538.2(同工型6)的 MAPT氨基酸序列；与GenBank登录号NP 036192.2(同工型1)；NP_
036193.2(同工型2)；NP_005681.2(同工型3)的DNM1L氨基酸序列；与GenBank登录号NP_
006149.2的NEFL氨基酸序列；与GenBank 登录号NP_002897.1的RDX氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002435.1的MSN氨基酸序列；或与GenBank登录号NP_003370.2 (同工型1)或NP_
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001158888.1(同工型5)的LDHA氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002291.1(变体1)或NP_
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001116538.2(同工型6)的 MAPT氨基酸序列；与GenBank登录号NP 036192.2(同工型1)；NP_
036193.2(同工型2)；NP_005681.2(同工型3)的DNM1L氨基酸序列；与GenBank登录号NP_
006149.2的NEFL氨基酸序列；与GenBank 登录号NP_002897.1的RDX氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002435.1的MSN氨基酸序列；或与GenBank登录号NP_003370.2 (同工型1)或NP_
001104547.1(同工型2)的EZR氨基酸序列。
[0202] 在一些实施方案中，固体支持物包含与抗生物标志物抗体结合的一种或更多种生物标志物模拟表位。生物标志物模拟表位可以来自于生物标志物的已知抗原性表位，其具有一个或更多个氨基酸替换、缺失或添加。可以通过在肽文库中筛选与针对生物标志物的抗体结合的模拟表位来从头设计或鉴定生物标志物的模拟表位。
[0203] 在一些实施方案中，所述试剂盒还包含标记的第二抗体，其用来检测样品中与一种或更多种生物标志物多肽、其抗原性片段或者生物标志物模拟表位结合的抗体或自身抗体。第二抗体与不同类型或同种型的免疫球蛋白(IgM、IgD、IgG、IgA和IgE)的恒定区或“C”区结合。通常在试剂盒中包含针对IgG恒定区的第二抗体，例如针对IgG亚类(例如IgG1、 IgG2、IgG3和IgG4)之一的第二抗体。可以用任何直接或间接可检测部分标记第二抗体，所述部分包括荧光团(即荧光黄、藻红素、量子点、 Luminex珠、荧光珠)、酶(即过氧化物酶、碱性磷酸酶)、放射性同位素 (即3H、32P、125I)或化学发光部分。可以使用生物素和生物素结合部分 (即亲和素、链霉亲和素、中性亲和素(neutravidin))的复合物来放大标记信号。从Molecular Probes、Eugene、OR可购得荧光标记的抗人IgG 抗体。可以从Sigma-Aldrich，St.Louis，MO和Chemicon，Temecula，CA 购得酶标记的抗人IgG抗体。
[0204] 所述试剂盒还包含关于以下的说明：将固体支持物与来自母亲或潜在母亲的生物样品接触，并且将母亲抗生物标志物抗体的存在或母亲抗生物标志物抗体水平高于阈值水平与胎儿或儿童发生ASD的可能性增加相关联。
[0205] 在一些实施方案中，试剂盒还包含用于检测抗生物标志物抗体的阴性和阳性对照样品。在一些实施方案中，试剂盒包含样品，其用以制备样品中抗生物标志物抗体的滴定曲线，从而帮助评价测试生物样品中抗生物标志物抗体的定量水平。
[0206] 试剂盒可用于对任何育龄女性提供诊断或预测。可以在妊娠之前、期间或之后进行诊断或预测测定。如上所述，可以在妊娠早期、妊娠中期和 /或孕晚期中的一个或更多个期间进行抗生物标志物抗体的检测。在一些实施方案中，可以对怀有脑已开始发育的胎儿(例如妊娠约12周以后) 的女性的生物样品进行抗生物标志物抗体检测。在一些实施方案中，在产后(在出生后的头4周和/或在母亲母乳喂养儿童期间)一次或更多次地评价抗生物标志物抗体的存在与否或者抗生物标志物抗体的定量水平。在一些实施方案中，可以在妊娠前或在未妊娠的任意女性中一次或更多次地评价抗生物标志物抗体的存在与否或者抗生物标志物抗体的定量水平。
[0207] 在一些实施方案中，试剂盒包含具有一种或更多种选自以下的固定化蛋白质(包括其抗原性片段或模拟表位)的固体支持物：鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、F-肌动蛋白加帽蛋白α-2亚基、尿嘧啶 DNA糖基化酶和谷氨酸脱氢酶。支持物还可以具有固定的生物标志物多肽、其抗原性片段或其模拟表位。还可以在试剂盒中提供关联针对一种或更多种胎儿蛋白质的母体抗体之存在的说明，以及阳性和阴性对照样品。试剂盒的另一些实施方案如本文所述。
[0208] 7.筛选阻断剂
[0209] 可以使用多种体外测定(包括本文所述的那些)来评估对抑制抗生物标志物抗体与靶生物标志物结合之试剂的鉴定。这些测定可用于测试抗生物标志物抗体的抑制剂(例如针对1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13种或更多种选自乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)、刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白 (RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR)的生物标志物)，然后测试可用于预防、降低或抑制ASD发生的试剂。
[0210] 在一些实施方案中，所述筛选测定使用生物标志物抗原，例如生物标志物多肽或其抗原性片段。生物标志物多肽或其抗原性片段可纯化或基本纯化自天然来源，或如上所述重组或合成产生的。例如，使用一种或更多种生物标志物的部分长度片段，其至少10个氨基酸长而且与抗生物标志物抗体结合。在一些实施方案中，使用至少为生物标志物多肽全长约 50％、60％、70％、80％、90％、95％的一种或更多种生物标志物的部分长度片段。在一些实施方案中，一种或更多种生物标志物多肽的部分长度片段约10、25、50、100、150、200、250或300个氨基酸长。部分长度片段可以是除去了生物标志物多肽的N端或C端的，或者是除去了N端以及C端的一部分的。所使用的生物标志物多肽的部分长度片段与抗生物标志物抗体结合。
[0211] 在一些实施方案中，使用LDH-A和/或LDH-B中的一种或更多种。在一些实施方案中，使用LDH-1、LDH-2、LDH-3、LDH-4和/或LDH-5 中的一种或更多种同工酶。在一些实施方案中，LDH多肽或其抗原性片段与本文所述的LDH多肽(例如，与GenBank登录号NP_001128711、 NP_005557.1、AAP36496.1、BAD96798.1或NP_002291.1的氨基酸序列) 有至少约90％、93％、95％、97％、99％或100％的序列同一性。LDH 抗原还可以是LDH模拟表位。
[0212] 在一些实施方案中，筛选测定使用与本文所述生物标志物多肽有至少约90％、93％、95％、97％、99％或100％序列同一性的一种或更多种生物标志物多肽或其抗原性片段，例如，与GenBank登录号AAP36496.1； BAD96798.1；NP_005557.1(同工型1)；NP_
001128711.1(同工型2)；NP_001158886.1(同工型3)；NP_001158887.1(同工型4)或 NP_
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001128711.1(同工型2)；NP_001158886.1(同工型3)；NP_001158887.1(同工型4)或 NP_
001158888.1(同工型5)的LDHA氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002291.1(变体1)或NP_
001167568.1(变体2)的LDHB氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001014809.1(同工型1)或NP_001304.1(同工型2)的CRMP1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_006810.1的STIP1 氨基酸序列；与GenBank登录号NP_004284.1的GDA氨基酸序列；与 GenBank登录号NP_001377.1或BAD92432的DPYSL2氨基酸序列；与 GenBank登录号NP_006127.1的CAPZA2氨基酸序列；与GenBank登录号NP 004550.2的YBX1氨基酸序列；与GenBank登录号NP_001393.1 的EEF1A1氨基酸序列；与GenBank登录号NP 058519.3(同工型1)； NP_005901.2(同工型2)；NP_
058518.1(同工型3)；NP_058525.1(同工型4)；NP_001116539.1(同工型5)或NP_
001116538.2(同工型6)的 MAPT氨基酸序列；与GenBank登录号NP 036192.2(同工型1)； NP_036193.2(同工型2)；NP_005681.2(同工型3)的DNM1L氨基酸序列；与GenBank登录号NP_
006149.2的NEFL氨基酸序列；与GenBank 登录号NP_002897.1的RDX氨基酸序列；与GenBank登录号 NP_002435.1的MSN氨基酸序列；或与GenBank登录号NP_003370.2 (同工型1)或NP_
001104547.1(同工型2)的EZR氨基酸序列。
[0213] 用于鉴定抑制抗生物标志物抗体与一种或更多种生物标志物结合的化合物的测定可以是固态或可溶形式的。优选地，生物标志物多肽、其抗原性片段或生物标志物模拟表位被以共价或非共价形式固定在固体支持物上。体外筛选测定可以是非竞争性或竞争性的。检测抗体或抗体集合与抗原结合的技术是本领域已知的，包括利用包含可检测标记或区域的抗生物标志物抗体或生物标志物抗原(即一种或更多种生物标志物的多肽、其抗原性片段、其模拟表位)的那些，以及涉及免疫沉淀或“拉下 (pull-down)”与靶生物标志物结合的抗生物标志物抗体的那些。实施免疫测定的参考文献在以上描述。
[0214] 可以采用的多种测定形式包括FACS分析、邻近闪烁测定 (scintillation proximity assay，“SPA”)和夹心法抗体测定。另外，膜包被的固体支持物(例如珠和阵列表面)可用于筛选抑制抗生物标志物抗体与靶生物标志物结合的化合物。参见例如Baksh等，Nature(2004)427： 139；Winter and Groves，Anal Chem(2006)78：17-80；Moura和 Carmona-Ribeiro，Cell Biochem Biophys(2006)44：446-52；和美国专利 No.6,228,326。在高通量筛选方法中使用这些膜包被表面。
[0215] 实施SPA的技术是本领域公知的。可以使用包被了闪烁体流体和放射性标记分子的珠或板来进行SPA。放射性标记分子接近闪烁体流体刺激光发射。可以使用SPA来测量抗生物标志物抗体与靶生物标志物的结合，例如通过将抗生物标记物抗体或生物标志物多肽或其抗原性片段和SPA 珠放在一起，分别将结合伴侣(即生物标志物多肽或其抗原性片段或抗生物标志物抗体)进行放射性标记，以及测量测试化合物抑制放射性标记多肽产生光的能力。
[0216] 在一个实施方案中，使用固相免疫测定(例如ELISA、电化学发光) 来筛选抗生物标志物抗体与一种或更多种ASD生物标志物的结合抑制剂。在一些固相免疫测定中，可以用来自生物样品的抗生物标志物抗体、单克隆抗生物标志物抗体、生物标志物多肽或其抗原性片段或者生物标志物模拟表位中的至少一种来直接或间接包被珠或多孔板(例如96孔、384 孔、1536孔)。所述抗体可以是完整抗体或抗体片段，例如Fab或单链可变区。所述抗体或抗原直接包被在多孔板上，或者通过捕获抗体间接地包被。然后将固定的抗体或抗原暴露于候选阻断化合物。在竞争性测定中，然后使用未固定的经标记(例如酶、放射同位素、荧光团等)结合伴侣(例如生物标志物抗原或抗生物标志物抗体)来检测候选阻断剂是否抑制抗体和抗原的结合。在非竞争性测定中，可以标记候选阻断剂，并评价与固定化抗生物标志物抗体或固定生物标志物抗原的直接结合。
[0217] 在一个实施方案中，使用FRET测定来测量抗生物标志物抗体和生物标志物抗原之间的直接结合相互作用。FRET是两个染料分子的电子激发态之间依赖于距离的相互作用，其中激发从供体分子转移到受体分子而没有发射光子。激发的转移是距离依赖的，并且可用于测定两个染料标记大分子之间的接近性。为发生能量转移，供体和受体分子必须很接近(通常 )。而且，受体的吸收谱必须覆盖供体的荧光放射谱，所以必须使用用于大分子标记的相容染料对，例如Cy3/Cy5和Cy5/Cy5.5。实践中，成对蛋白质(如抗生物标志物抗体和生物标志物抗原)之间的相互作用可以通过以下来测定：分别地用所述相容染料对中第一染料标记抗生物标志物，并用所述相容染料对中第二染料标记生物标志物抗原，然后可以通过在蛋白质于测定中混合时受体的荧光放射或供体的荧光淬灭来检测 FRET。如果标记的抗生物标志物抗体和生物标志物抗原显示可测得的 FRET，则表明抗生物标志物抗体和生物标志物抗原之间存在直接相互作用。FRET测定形式还可以用标记的候选阻断剂与标记的抗生物标志物抗体或标记的生物标志物抗原进行。
[0218] 抗生物标志物抗体抑制剂的高通量筛选
[0219] 可以方便地使用高通量方法实施抗生物标志物抗体与生物标志物抗原的结合阻断剂的筛选方法。
[0220] 在一些实施方案中，高通量筛选法涉及提供包含大量潜在治疗性化合物(潜在调节物或配体化合物)的组合化学品或肽文库。然后在本文所述的一种或更多种测定中筛选这种“组合化学品文库”或“配体文库”，以鉴定显示期望特征性活性的那些文库成员(尤其是化学品种类或亚类)。这样鉴定的化合物可作为常见的“先导化合物(lead compound)”或者它们自身可用于潜在或实际的治疗。
[0221] 组合化学品文库是通过化学合成或生物合成，通过组合多种化学“构建块(building block)”(如试剂)来产生的不同化合物的集合。例如，通过对于给定化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数)以各种可能方式组合一组化学构建块(氨基酸)来形成线形组合化学文库，如多肽文库。通过化学构建块的组合性混合可以合成数百万的化合物。
[0222] 制备和筛选组合化学品文库是本领域技术人员公知的。这些组合化学品文库包括但不限于肽文库(参见例如美国专利5,010,175，Furka，Int.J. Pept.Prot.Res.37：487-493(1991)和Houghton等，Nature 354：84-88 (1991))。也可以使用其他化学物来生成化学多样性文库。这些化学物包括但不限于：拟肽(例如，PCT公开No.WO 91/19735)、编码的肽(例如PCT公开WO 93/20242)、随机生物寡聚物(例如PCT公开No.WO 92/00091)、苯并二氮杂(例如美国专利No.5,288,514)、diversomer如海因、苯并二氮杂 和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：6909-6913(1993))、vinylogous多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc. 114：6568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽肽模拟物(Hirschmann等，J. Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))、小化合物文库的有机类似合成物(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))、寡聚氨基甲酸盐(Cho 等，Science 261：1303(1993))和/或肽基膦酸酯(Campbell等，J.Org. Chem.59：658(1994))、核酸文库(参见Ausubel、Berger和Sambrook，全部同上)、肽核酸文库(参见例如美国专利5,539,083)、抗体文库(参见例如Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)：309-314(1996)和 PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(参见例如Liang等，Science，274： 1520-1522(1996)和美国专利5,593,
853)、小有机分子文库(参见例如苯并二氮杂卓，Baum C&EN，Jan 18，page 33(1993)；异戊二烯，美国专利 5,569,588；噻唑烷酮和甲噻嗪酮，美国专利5,549,974；吡咯烷，美国专利
5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮杂 ，5,288,514等)。
853)、小有机分子文库(参见例如苯并二氮杂卓，Baum C&EN，Jan 18，page 33(1993)；异戊二烯，美国专利 5,569,588；噻唑烷酮和甲噻嗪酮，美国专利5,549,974；吡咯烷，美国专利
5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮杂 ，5,288,514等)。
[0223] 制备组合文库的装置是市售的(参见例如357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA， 433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050Plus，Millipore，Bedford， MA)。此外，多种组合文库本身是市售的(参见例如ComGenex，Princeton， NJ.，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD等)。
[0224] 固相和可溶性高通量测定
[0225] 在本发明的高通量测定中，可以在一天内筛选几千个不同的调节剂或配体。尤其地，微滴定板的每个孔可用于运行针对选定潜在调节剂的独立测定，或者，如果要观察浓度或孵育时间的作用，每种调节剂可测试5～10 个孔。因此，单个标准微滴定板可以测定约100(即96)种调节剂。如果使用1536孔板，则单个板可以容易地测定约100至约1500种不同的化合物。每天可以测定几个不同的板；使用本发明的整合系统可以进行筛选多至约6,000～20,000种不同化合物的测定。最近，开发了用于操纵试剂的微流体方法。
[0226] 目的分子可以通过共价或非共价连接(例如通过标签)直接或间接地与固态组分结合。标签可以是多种成分中的任意一种。一般地，将结合标签(标签结合物)的分子固定到固体支持物上，通过标签与标签结合物的相互作用将带标签的目的分子(例如抗生物标志物抗体或生物标志物抗原)连接到固体支持物。
[0227] 根据文献中详细记载的已知的分子相互作用，可以使用多种标签和标签结合物。例如，当标签具有天然结合物(例如生物素、蛋白A或蛋白 G)时，它可以与适当的标签结合物(例如链霉亲和素、中性亲和素、免疫球蛋白的Fc区)联合使用。具有天然结合物(例如生物素)的分子的抗体也可购得(SIGMA Immunochemicals 1998catalogue SIGMA，St. Louis MO)。
[0228] 类似地，任何半抗原或抗原性化合物可以与适当的抗体联合使用来形成标签/标签结合物对。可购得数千种特异性抗体，许多另外的抗体在文献中描述。例如，在一种常见配置中，标签是第一抗体，标签结合物是识别第一抗体的第二抗体。除了抗体-抗原相互作用外，受体-配体相互作用也适于作为标签和标签结合物对，如细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如细胞受体-配体相互作用，如转铁蛋白、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘蛋白家族、整合素家族、选择素家族等，参见例如Pigott&Power，The Adhesion Molecule Facts Book I(1993))。类似地，毒素和毒液(venom)、病毒表位、激素(例如鸦片、类固醇等)、细胞内受体(例如介导多种小配体(包括类固醇、甲状腺激素、类视色素和维生素D、肽)作用的细胞内受体)、药物、凝集素、糖、核酸(线性和环状聚合物构型)、寡糖、蛋白质、磷脂和抗体都可以与多种细胞受体相互作用。
[0229] 常见接头(如肽、聚醚等)也可作为标签，并且包括多肽序列(如约 5至200个氨基酸的多聚Gly序列)。这些柔性接头是本领域技术人员已知的。例如，可以从Shearwater Polymers，Inc.、Huntsville，Alabama购得聚乙二醇接头。这些接头任选地具有酰胺键、巯基键或杂异功能性键。
[0230] 使用目前已有的多种方法中的任一种将标签结合物固定到固体基质。通常通过将全部或部分基质暴露于化学试剂来衍生化或功能化固体基质，所述化学试剂将化学基团固定到与标签结合物部分反应的表面。例如，适于结合长链部分的基团包括胺、羟基、巯基和羧基。氨基烷基硅烷和羟基烷基硅烷可用于对多种表面(例如玻璃表面)进行功能化。这种固相生物聚合物阵列的构建在文献中详细描述(参见例如Merrifield，J.Am.Chem. Soc.85：2149-2154(1963)(描述例如肽的固相合成)；Geysen等，J.Immun. Meth.102：259-274(1987)(描述针上的固相组分合成)；Frank和Doring， Tetrahedron 44：60316040(1988)(描述纤维素盘片上的多种肽序列合成)； Fodor等，Science，251：767-777(1991)；
Sheldon等，Clinical Chemistry 39(4)：718-719(1993)；和Kozal等，Nature Medicine 2(7)：753759(1996)(全部描述固定到固体基质的生物聚合物阵列))。将标签结合物固定到基质的非化学方法包括其他常用方法，如热、通过UV放射交联等。
Sheldon等，Clinical Chemistry 39(4)：718-719(1993)；和Kozal等，Nature Medicine 2(7)：753759(1996)(全部描述固定到固体基质的生物聚合物阵列))。将标签结合物固定到基质的非化学方法包括其他常用方法，如热、通过UV放射交联等。
[0231] 本发明提供了以高通量形式鉴定可以调节抗生物标志物抗体和生物标志物抗原之相互作用的化合物的体外测定。在不存在潜在调节剂或存在已知调节剂的情况下测量抗生物标志物抗体和生物标志物抗原相互作用的对照反应是任选的，因为该测定是高度均一的。但是这种任选的对照反应可以是适合的，并且增加测定的可靠性。
[0232] 基于计算机的测定
[0233] 对调节抗生物标志物抗体和生物标志物抗原之相互作用的化合物的另一测定涉及计算机辅助药物设计，其中计算机系统用于根据生物标志物多肽的氨基酸序列的结构信息产生其三维结构。输入的氨基酸序列与计算机程序中预先确定的算法直接有效地配合以产生蛋白质的二级、三级和四级结构模型。可以对抗生物标志物抗体的结合位点进行类似分析。然后检查蛋白质结构模型以鉴定结构中有能力与抗生物标志物抗体或生物标志物抗原(按照需要)结合的区域。然后用这些区域鉴定与抗生物标志物抗体或生物标志物抗原结合的多肽或其他分子。用于结构分析的适合程序包括Pyol Molecular Graphic Systems，published by Delano Scientific，Palo Alto，CA。
[0234] 在一些实施方案中，通过本文所述的筛选方法鉴定阻断母体抗体与选自以下的一种或更多种胎儿蛋白质结合的试剂：鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、F-肌动蛋白加帽蛋白α-2亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶和谷氨酸脱氢酶。对阻断母体抗体与一种或更多种胎儿蛋白质(选自鸟嘌呤核苷酸结合蛋白1、甘油醛3-磷酸脱氢酶、F-肌动蛋白加帽蛋白α-2亚基、尿嘧啶DNA糖基化酶和谷氨酸脱氢酶)结合的试剂的筛选可以与阻断母体抗体与一种或更多种本文所述生物标志物结合的试剂的筛选同时或独立进行。
[0235] 实施例
[0236] 以下实施例提供说明，但不限制本发明。
[0237] 实施例1：鉴定另外的胎儿脑抗原
[0238] 本实施例汇总了母体抗体所结合的表观分子量为37kDa、39kDa和 73kDa的胎儿脑抗原的鉴定。
[0239] 材料和方法
[0240] 研究对象
[0241] 如之前所述(Hertz-Picciotto，et al.，Environ Health Perspect，(2006) 114(7)：1119-25)作为Davis加州大学M.I.N.D.研究所正在进行的 CHARGE(Childhood Autism Risks from Genetics and Environment)研究的一部分，通过儿童环境健康中心(Center for Children′s Environmental Health，CCEH)招募知情同意的母亲。CHARGE研究人群来自三种类型：认为患自闭症或自闭症谱系障碍(ASD)的儿童、选自典型发育(typically developing，TD)的一般人群的儿童以及具有非自闭症的发育异常(developmental disability，DD)儿童。该研究中家庭的招募没有任何医学或人口统计学因素偏向性。如之前所述(Hansen等， Ambul Pediatr，(2008)8(l)：25-31)在UC Davis M.I.N.D.研究所确认对所招募儿童的诊断。
[0242] 样品收集
[0243] 在黄盖柠檬酸葡萄糖管(BD Diagnostic，Franklin Lakes，NJ)中收集母亲血液。将血浆与细胞分离，编号并分成等分试样以将冻融循环减到最少，于-80℃储存备用。
[0244] 抗原制备
[0245] 从加利福尼亚国家灵长类研究中心(California National Primate Research Center)获取恒河猴胎儿脑(妊娠152天)并用于制备蛋白质提取物。在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物(Roche Complete)的去污剂缓冲液中匀浆组织并进行超声处理。通过离心除去不溶物质，用含有1％ LDS的50mM Tris-HCl进行缓冲液替换。使用二辛可宁酸(BCA)反应 (Pierce，Rockford，IL)测定蛋白质浓度，并调整至4.5mg/ml。
[0246] Western印迹
[0247] 对于母亲血浆样品的初始筛选，在制备好的4～12％梯度的 SDS-PAGE mini-gel(Invitrogen，Carlsbad，CA)中于还原条件下分离 300μg制备的恒河猴胎儿脑蛋白(FRB)，电泳转移至0.2μm孔径的硝酸纤维素上。将MagicMark分子量标记(Invitrogen)上样到单独的标记泳道上，使标记的带能通过化学发光观察。用立春红S(MP Biomedicals， Solon，Ohio)对印迹进行染色，以确认蛋白质上样、迁移和转移的均一。然后将硝化纤维素膜切成3mm宽的带，并用1∶400稀释的母亲血清作探针。在洗涤后，用1∶20,000稀释的HRP缀合山羊抗人IgG(Invitrogen) 孵育所述带。然后洗涤带，用SuperSignal West
Chemilluminescent Substrate(Thermo Scientific)孵育并排布在玻璃板上进行成像。使用 AlphaEaseFC软件(Alpha Innotech，San Leandro，CA)通过FluorChem 8900成像仪获取化学发光图像。随后对所发现的对FRB反应的母亲进行抗原鉴定。
Chemilluminescent Substrate(Thermo Scientific)孵育并排布在玻璃板上进行成像。使用 AlphaEaseFC软件(Alpha Innotech，San Leandro，CA)通过FluorChem 8900成像仪获取化学发光图像。随后对所发现的对FRB反应的母亲进行抗原鉴定。
[0248] Prep细胞
[0249] 使用Prep Cell装置(Bio Rad，Hercules，CA)利用分子量分离100mg FRB。简言之，以12瓦经过28mm圆柱形10％聚丙烯酰胺凝胶对FRB 进行电泳17小时。连接到凝胶下方的槽的蠕动泵将迁移出凝胶的蛋白质运送到级分收集器，其在染料前沿到达槽时开始收集。以0.75ml/分钟的流速以5分钟为间隔收集总共110个级分。利用具有Ultracel-10k膜的 Amicon Ultra-4(Millipore，Co.Cork，Ireland)将级分浓缩到5mg/ml，通过Western印迹测定以测量分子量并确认抗原反应性(图1)。Western 印迹膜的Ponceau染色证实蛋白质通过分子量显著富集，产生约5kDa范围的级分，这有利于后续分析。选择含有37kDa、39kDa或
73kDa蛋白质的级分进行蛋白质鉴定。
73kDa蛋白质的级分进行蛋白质鉴定。
[0250] 2-D电泳
[0251] 通过2-D电泳分离来自Prep Cell分离物的蛋白质级分，其富含被母体抗体识别的抗原。用Cy2(GE Life Sciences)标记各30μg的37kDa、 39kDa或73kDa级分，准备用于2-D凝胶电泳。所有2-D凝胶一式两份进行。将15μg的每种样品上样到两个pH 3-10等电位聚焦带(Amersham BioSciences)的每个上，分离至平衡。然后润洗所述带，并上样到10.5％ (37kD和39kD)或8.5％(73kD)的聚丙烯酰胺凝胶(Amersham BioSciences)上进行第二维电泳。电泳后，获取凝胶的荧光图像并用Image Quant软件(6.0版，Amersham BioSciences)确认一致性。将凝胶之一电泳转移到0.2μm孔径的硝酸纤维素膜(Whatman)上。使用母亲血浆样品(用于印迹的抗原样品为阳性)在转移的膜上进行Western印迹，用 FluorChem 8900成像仪(Alpha Innotech)对所得印迹进行采集。使用内部标记调整图像大小，以与另一未转移的2-D凝胶完全匹配以对齐选点。使用Ettan选点器(Amersham BioSciences)从2D凝胶上选取Western 印迹图像上鉴定的点。
[0252] 质谱
[0253] 将通过Western印迹和图谱比对鉴定而且从一式两份的2-D凝胶上选取并洗涤的点用胰酶(Promega)消化。用Zip-tip C 18(Millipore) 对胰酶消化的肽进行脱盐，从Zip-tip洗脱并点在MALDI板(model ABI 01-192-6-AB)上。在ABI 4700质谱仪(Applied Biosystems，Framingham， MA)上进行MALDI-TOF MS和TOF/TOF串联MS/MS。对每个样品获得MALDI-TOF质谱和TOF/TOF串联MS碎片谱，每个样品中10个丰度最高的离子中每个碎片谱均有平均4000个激光发射。通过装备有 MASCOT搜索引擎的GPS Explorer工作站(Matrix science)分析所得的肽和相关的碎片谱，并用于查询National Center for Biotechnology Information non-redundant(NCBInr)数据库。在不限制蛋白质分子量和等电点的情况下进行搜索，在检索参数中允许可变的半胱氨酸脲基甲基化和甲硫氨酸残基的氧化以及一个缺少的切割。认为蛋白质分数C.I.％或 Ion C.I.％大于95的候选物是有意义的。
[0254] 抗原确定
[0255] Western印迹
[0256] 使用对RFB蛋白有反应性的母亲血浆作为第一抗体，通过Western 印迹分别测试纯化的天然LDH(Cell Sciences，Canton，MA)、重组全长 CYP(Abnova，Taipei，Taiwan)、重组全长YBX1(Abnova)、重组全长 CRMP1(OriGene，Rockville，MD)和重组全长STIP1(Abnova)人蛋白。用市售的针对LDH(Abeam，Cambridge，MA)、CYP(Sigma)、YBX1 (Abeam)、CRMP1(Abeam)和STIP1(Abeam)的多克隆抗体作为阳性对照。
[0257] 阻断研究
[0258] 将对LDH显示反应性的母亲血浆以及对照血浆样品1∶400稀释，于 4℃在单独的缓冲液或含有100μg纯化的LDH的缓冲液中孵育20小时。然后用这些样品检测含有RFB的Western印迹带(图4)。对于LDH反应性为阳性的母亲，用LDH蛋白预孵育的样品中带的强度显著降低。用 LDH预孵育没有影响母亲血浆对其他抗原的反应性。
[0259] ELISA
[0260] 在碳酸盐包被缓冲液中稀释纯化的人红细胞来源的LDH，向96孔板的每个孔添加2μg LDH，在4℃孵育16小时。然后浸洗板并用5％牛血清白蛋白封闭，用1∶600稀释的母亲血浆在室温下孵育1小时。然后洗涤板并用1∶25000稀释的辣根过氧化物酶缀合山羊抗人IgG(Invitrogen) 孵育1小时。然后洗涤板，用Ultra TMB-ELISA底物(Thermo Scientific) 孵育，在450nm读数。
[0261] LDH酶抑制
[0262] 用BioSpec 1600分光光度计(Shimadzu)340nm处吸光度的减少监测母体抗体对LDH酶功能的作用。将来自具有LDH反应性之母亲的40μg 纯化的母亲IgG抗体以及对照在室温下与1.5μg纯化的人LDH一起孵育 30分钟。将抗体/酶混合物添加到3ml Acryl-Cuvette(Sarstedt)的比色杯中，其中包含在2.8ml 0.125M Tris-HCl pH 8.0中稀释的100μl 6.6mM 还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Sigma)和100μl 30mM丙酮酸钠(Sigma)。用含有Tris-HCl的比色杯作为空白。记录每个样品2分钟中的吸光度变化。
[0263] 结果
[0264] 抗原鉴定
[0265] 对含有37kDa、39kDa或73kDa的Prep细胞级分进行分开的2-D Western印迹(图2)。用1∶400稀释的母亲血浆检测每个印迹，所述母亲血浆来自对相应带显示反应性的随机选择的AUM。在每个2-D Western 印迹上观察到多个点，选择所有清楚确定的点进行质谱。质谱数据分析得到每个点的蛋白质，选择具有100％CI的那些进行确认(表1)。
[0266] 表1.质谱结果
[0267]
[0268] 抗原确认
[0269] 乳糖脱氢酶
[0270] 通过Western印迹用纯化的天然LDH和全长重组LDHA和LDHB 亚基确认母亲IgG反应性(图3)。LDHA和LDHB亚基具有约90％的序列同源性，尽管对A和B亚基的反应性有一些变化，但对LDH有反应性的所有母体抗体均识别两种亚基。因此用包含两种亚基的纯化的LDH进行全部母亲血浆样品的筛选。
[0271] 讨论
[0272] 在几个研究中已经指出妊娠期间母亲免疫环境的异常与AU有关。其中主要的是与胎儿蛋白质反应的母体抗体的报道。便利的IgG抗体传递是众所周知的现象，认为其对新生儿提供一般性保护(Garty等，Clin Diagn Lab Immunol，(1994)1(6)：667-9)；已知这些抗体在在出生后保持多达6个月(Heininger等，Vaccine，(2006)24(16)：3258-60)。但是，与免疫保护性IgG抗体一起，与胎儿“自身”蛋白质反应的自身抗体也可以穿过胎盘。最近的报道证实了在有多个ASD患儿的母亲中对啮齿类 Purkinje细胞有反应性的母亲IgG抗体，以及在妊娠期间用她的血清注射的小鼠后代存在行为缺陷(Dalton等，Ann Neurol，(2003)53(4)：533-7)。在另一研究中，发现自闭症患儿的母亲和她患病的孩子针对大鼠出生前 (18天)脑蛋白有一致的抗体反应模式。相反，未患病的儿童和对照母亲具有另外的反应性模式(Zimmerman等，Brain Behav Immun，(2007) 21(3)：351-7)。
[0273] 应理解本文所述的实施例和实施方案仅为说明目的，参照它们本领域技术人员被提示了多种变化或改变，并且其被包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、序列登录号、专利、专利申请和序列登录号通过对所有目的整体引用并入本文。
[0275] 1.用于测定后代发生自闭症谱系障碍(ASD)之风险的方法，其包括鉴定来自所述后代之母亲的生物样品中与选自以下的一种或更多种生物标志物结合的母体抗体的存在：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶 (GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1 (STIP1)，其中与所述一种或更多种生物标志物结合的母体抗体的存在指示所述后代发生ASD的风险增加。
[0276] 2.项1的方法，其还包括从所述母亲获得生物样品的步骤。
[0277] 3.项1至2中任一项的方法，其中所述生物样品选自血液、血清、血浆、羊水、乳汁和唾液。
[0278] 4.项1至3中任一项的方法，其中所述乳酸脱氢酶是LDH-A (LDH-A)。
[0279] 5.项1至3中任一项的方法，其中所述乳酸脱氢酶是LDH-B (LDH-B)。
[0280] 6.项1至3中任一项的方法，其中所述乳酸脱氢酶是LDH-A和 LDH-B两者。
[0281] 7.项1至6中任一项的方法，其中检测与选自LDH、GDA、CRMP1 和STIP1的一种或更多种生物标志物结合的母体抗体的存在。
[0282] 8.项1至6中任一项的方法，其中检测与选自LDH、CRMP1和STIP1 的一种或更多种生物标志物结合的母体抗体的存在。
[0283] 9.项1至6中任一项的方法，其中检测与选自LDH和CRMP1的一种或更多种生物标志物结合的母体抗体的存在。
[0284] 10.项1至6中任一项的方法，其中检测与选自LDH和STIP1的一种或更多种生物标志物结合的母体抗体的存在。
[0285] 11.项1至6中任一项的方法，其中检测与选自GDA、CRMP1和 STIP1的一种或更多种生物标志物结合的母体抗体的存在，其还指示多动症和/或交流障碍的风险增加。
[0286] 12.项1至6中任一项的方法，其中检测与选自GDA和CRMP1的一种或更多种生物标志物结合的母体抗体的存在，其还指示多动症和/或交流障碍的风险增加。
[0287] 13.项1至6中任一项的方法，其中检测与选自GDA和STIP1的一种或更多种生物标志物结合的母体抗体的存在，其还指示多动症和/或交流障碍的风险增加。
[0288] 14.项1至12中任一项的方法，其还包括检测与选自以下的一种或更多种生物标志物结合的母体抗体的存在：刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ 的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2 (DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白 (MSN)和埃兹蛋白(EZR)。
[0289] 15.项1至14中任一项的方法，其中所述后代是新生儿。
[0290] 16.项1至14中任一项的方法，其中所述后代是胎儿。
[0291] 17.项16的方法，其中所述胎儿正在所述母亲体内孕育。
[0292] 18.项16的方法，其中所述胎儿尚未被怀上。
[0293] 19.项1至14中任一项的方法，其中所述母亲是人。
[0294] 20.项1至14中任一项的方法，其中所述母亲有患ASD的后代。
[0295] 21.项1至14中任一项的方法，其中所述母亲有ASD或自身免疫疾病的家族史。
[0296] 22.用于预防或降低胎儿发生ASD之风险的方法，其包括向所述胎儿的母亲施用一种或更多种阻断母体抗体与选自以下的一种或更多种胎儿生物标志物结合的试剂：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)和应激诱导磷蛋白1(STIP1)，其中阻断所述母体抗体与所述一种或更多种胎儿生物标志物的结合预防或降低所述发生ASD的风险。
[0297] 23.项22的方法，其中所述一种或更多种试剂是所述一种或更多种胎儿生物标志物的多肽或其抗原性片段。
[0298] 24.项22的方法，其中所述一种或更多种试剂是所述一种或更多种胎儿生物标志物的多肽的模拟表位。
[0299] 25.项22至24中任一项的方法，其中所述试剂通过静脉内施用。
[0300] 26.项22至25中任一项的方法，其中所述母体抗体与LDH-A和 LDH-B中至少一种结合。
[0301] 27.项22至26中任一项的方法，其中所述母体抗体与选自LDH、 GDA、CRMP1和STIP1的一种或更多种生物标志物结合，并且向所述母亲施用阻断母体抗体与LDH、GDA、CRMP1和STIP1结合的试剂。
[0302] 28.项22至26中任一项的方法，其中所述母体抗体与选自LDH、 CRMP1和STIP1的一种或更多种生物标志物结合，并且向所述母亲施用阻断母体抗体与所述一种或更多种生物标志物结合的试剂。
[0303] 29.项22至26中任一项的方法，其中所述母体抗体与选自LDH和 CRMP1的一种或更多种生物标志物结合，并且向所述母亲施用阻断母体抗体与所述一种或更多种生物标志物结合的试剂。
[0304] 30.项22至26中任一项的方法，其中所述母体抗体与选自LDH和 STIP1的一种或更多种生物标志物结合，并且向所述母亲施用阻断母体抗体与所述一种或更多种生物标志物结合的试剂。
[0305] 31.项22至26中任一项的方法，其中所述母体抗体与选自GDA、 CRMP1和STIP1的一种或更多种生物标志物结合，并且向所述母亲施用阻断母体抗体与所述一种或更多种生物标志物结合的试剂。
[0306] 32.项22至26中任一项的方法，其中所述母体抗体与选自GDA和 CRMP1的一种或更多种生物标志物结合，并且向所述母亲施用阻断母体抗体与所述一种或更多种生物标志物结合的试剂。
[0307] 33.项22至26中任一项的方法，其中所述母体抗体与选自GDA和 STIP1的一种或更多种生物标志物结合，并且向所述母亲施用阻断母体抗体与所述一种或更多种生物标志物结合的试剂。
[0308] 34.项22至32中任一项的方法，其还包括向所述母亲施用阻断母体抗体与选自以下的一种或更多种胎儿生物标志物结合的一种或更多种试剂：刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白 1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1(EEF1A1)、微管相关蛋白Tau (MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2(DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白(MSN)和埃兹蛋白(EZR)。
[0309] 35.项22至34中任一项的方法，其中所述胎儿正在所述母亲体内孕育。
[0310] 36.项22至34中任一项的方法，其中所述胎儿尚未被怀上。
[0311] 37.用于预防或降低胎儿发生ASD之风险的方法，其包括从所述胎儿之母亲的血浆中除去与选自以下的一种或更多种胎儿生物标志物结合的抗体：乳酸脱氢酶(LDH)、鸟嘌呤脱氨酶(GDA)、脑衰蛋白反应调节蛋白1(CRMP1)、应激诱导磷蛋白1(STIP1)。
[0312] 38.项37的方法，其中通过血浆置换术从所述血浆中除去与所述一种或更多种生物标志物结合的所述抗体。
[0313] 39.项37至38中任一项的方法，其中使所述母亲的血浆与连接到固体支持物的一种或更多种生物标志物的多肽或模拟表位相接触。
[0314] 40.项37至39中任一项的方法，其中所述LDH是LDH-A和LDH-B 中的至少一种。
[0315] 41.项37至40中任一项的方法，其中除去与选自LDH、GDA、 CRMP1和STIP1的一种或更多种生物标志物结合的抗体。
[0316] 42.项37至40中任一项的方法，其中除去与选自LDH、CRMP1和 STIP1的一种或更多种生物标志物结合的抗体。
[0317] 43.项37至40中任一项的方法，其中除去与选自LDH和CRMP1 的一种或更多种生物标志物结合的抗体。
[0318] 44.项37至40中任一项的方法，其中除去与选自LDH和STIP1的一种或更多种生物标志物结合的抗体。
[0319] 45.项37至40中任一项的方法，其中除去与选自GDA、CRMP1和 STIP1的一种或更多种生物标志物结合的抗体。
[0320] 46.项37至40中任一项的方法，其中除去与选自GDA和CRMP1 的一种或更多种生物标志物结合的抗体。
[0321] 47.项37至40中任一项的方法，其中除去与选自GDA和STIP1的一种或更多种生物标志物结合的抗体。
[0322] 48.项37至46中任一项的方法，其还包括除去与选自以下的一种或更多种胎儿生物标志物结合的抗体：刺端肌动蛋白结合蛋白CapZ的α亚基(CAPZA2)、Y盒结合蛋白1(YBX1)、真核翻译和延伸因子1A1 (EEF1A1)、微管相关蛋白Tau(MAPT)、二氢嘧啶酶样蛋白2 (DPYSL2)、发动蛋白1样蛋白(DNM1L)、根蛋白(RDX)、膜突蛋白 (MSN)和埃兹蛋白(EZR)。
[0323] 49.项37至48中任一项的方法，其中所述胎儿正在所述母亲体内孕育。
[0324] 50.项37至48中任一项的方法，其中所述胎儿尚未被怀上。
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