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自闭症谱系障碍的诊断和预测

阅读：1023发布：2020-05-12

专利汇可以提供自闭症谱系障碍的诊断和预测专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且用于检测单核苷酸多态性(SNP)的方法和组合物，以确定受试者是否患有自闭症谱系障碍 (ASD)，是否可能发展ASD，或将受试者归类为具有特定的ASD亚型。将一个或多个SNP的存在和/或不存在与至少一个样本训练集中SNP的存在和/或不存在相比较，其中比较步骤包括应用统计算法，这种统计算法包括确定获自样本的SNP数据与来自至少一个训练集的SNP数据之间的相关性。，下面是自闭症谱系障碍的诊断和预测专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种将来自人类受试者的样本诊断为ASD阳性或ASD阴性的方法，其包括在核酸水平上通过使用对表1、表2、表3、表6或表7中的一个或多个单核苷酸多态性(SNP)分类器生物标志物具特异性的引物进行聚合酶链反应(PCR)来检测所述分类器生物标志物的存在；
将表1、表2、表3、表6或表7的所述一个或多个SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在与至少一个样本训练集中所述SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在相比较，其中所述至少一个样本训练集包含(i)来自ASD阳性样本的表1、表2、表3、表6或表7的所述一个或多个SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在的数据，或(ii)来自ASD阴性样本的表1、表
2、表3、表6或表7的所述一个或多个SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在的数据，并且所述比较步骤包括应用统计算法，所述统计算法包括确定获自所述样本的所述SNP分类器生物标志物数据与来自所述至少一个训练集的所述SNP分类器生物标志物数据之间的相关性；以及
基于所述统计算法的结果将所述样本诊断为ASD阳性或ASD阴性。
2.一种将来自人类受试者的样本归类为特定的ASD亚型的方法，其包括
在核酸水平上通过使用对表1、表2、表3、表6或表7中的一个或多个SNP分类器生物标志物具特异性的引物进行聚合酶链反应(PCR)来检测所述分类器生物标志物的存在；
将表1、表2、表3、表6或表7的所述一个或多个SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在与至少一个样本训练集中所述SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在相比较，其中所述至少一个样本训练集包含(i)来自第一ASD亚型阳性样本的表1、表2、表3、表6或表7的所述一个或多个SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在的数据，或(ii)来自第二ASD亚型阳性样本的表1、表2、表3、表6或表7的所述一个或多个SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在的数据，
并且所述比较步骤包括应用统计算法，所述统计算法包括确定获自所述样本的所述SNP分类器生物标志物数据与来自所述至少一个训练集的所述SNP分类器生物标志物数据之间的相关性；以及
基于所述统计算法的结果将所述样本诊断为特定的ASD亚型。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述一个或多个SNP分类器生物标志物包含两个或更多个SNP分类器生物标志物、三个或更多个SNP分类器生物标志物、四个或更多个SNP分类器生物标志物、五个或更多个SNP分类器生物标志物、六个或更多个SNP分类器生物标志物、七个或更多个SNP分类器生物标志物、八个或更多个SNP分类器生物标志物、九个或更多个SNP分类器生物标志物、十个或更多个SNP分类器生物标志物、十一个或更多个SNP分类器生物标志物、十二个或更多个SNP分类器生物标志物、十三个或更多个SNP分类器生物标志物、十四个或更多个SNP分类器生物标志物、十五个或更多个SNP分类器生物标志物、二十个或更多个SNP分类器生物标志物、二十五个或更多个SNP分类器生物标志物、或三十个或更多个SNP分类器生物标志物。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中杂交试验是微阵列试验。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中杂交试验是测序试验。
6.如权利要求1所述的方法，其中来自所述人类受试者的所述样本是颊样本。
7.如权利要求1和4至6中任一项所述的方法，其进一步包括基于所述统计算法的结果鉴别所述人类受试者用于ASD疗法。
8.如权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述第一ASD亚型和第二ASD亚型选自由自闭性障碍(典型自闭症)、阿斯伯格氏症(阿斯伯格综合症)、待分类的广泛性发展障碍(PDD-NOS)以及儿童期崩解症(CDD)组成的群组，其中所述第一ASD亚型和第二ASD亚型是不同的。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述一个或多个SNP分类器生物标志物包含RAB11FIP5、ABP1以及JMJD7-PLA2G4B基因中的SNP。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述RAB11FIP5SNP位于chr2:73302656(hg19)处，所述ABP1SNP位于chr7:150554592(hg19)处，并且所述JMJD7-PLA2G4B SNP位于chr15:
42133295(hg19)处。
11.如权利要求5所述的方法，其中所述测序试验是高通量测序试验。

说明书全文

自闭症谱系障碍的诊断和预测

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2013年12月20日提交的美国临时申请序列号61/919,151的优先权益，这个临时申请的公开内容以其全文引用的方式并入。

[0003] 关于序列表的声明

[0004] 与本申请相关的序列表以文本格式代替纸印本提供，并且特此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是LINE_007_01WO_ST25.txt。文本文件是12KB，
2014年12月22日创建，并且经由EFS-Web以电子方式提交。

背景技术

[0005] 儿童发育的病症，也称为发育迟缓症，是一组日益增长的病症。儿童发育的许多病症与特定亚染色体区域的异常拷贝数(即，拷贝数的增益或损失)相关。根据国家心理健康研究所(National Institute of Mental Health，NIMH)，自闭症包括于一组大脑发育障碍中，统称作自闭症谱系障碍(ASD)。由于术语“谱系”表明，ASD包涵广泛范围的削弱的症状、技能和水平、或无能，因此患有这种病症的儿童可以具有并且是特征为社会互动和沟通的
削弱以及重复和定型的行为和兴趣的复杂、异质、行为界定的病症。第四版-文本修订的《心理障碍诊断与统计手册(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)》
定义了五种病症，有时称为广泛性发育障碍(PDD)，如同ASD一样。这些包括：自闭性障碍(典型自闭症)、阿斯伯格氏症(Asperger's disorder)(阿斯伯格综合症(Asperger
syndrome))、待分类的广泛性发展障碍(PDD-NOS)、雷特氏症(Rett's disorder)(雷特综合症(Rett syndrome))以及儿童期崩解症(CDD)。

[0006] ASD的当前技术现状的诊断是一系列的各种行为问卷。因为ASD表型是如此复杂的，所以基于分子的测试在较早的年龄当表型/行为评估不可能时，或与表型/行为评估相
结合将大大改善诊断的准确性。而且，早期诊断将允许在较早的年龄起始ASD治疗，这可能对短期和长期结果有益。具体地说，对于儿童发育的ASD和其它病症的遗传标志物和生物标志物的鉴别将允许在婴儿期或胎儿期鉴别现在通常在三岁与五岁之间诊断的疾病。

[0007] 罹患儿童发育障碍的受试者的遗传评价还可以帮助预测药理与行为疗法的结果。因此，迫切需要一种可靠地鉴别患有儿童发育的ASD或其它病症的受试者的方法。特别地，需要一种关于引起ASD或其它儿童发育迟缓症的多态性的更准确的测试。具有受影响的成
员的家族将得益于知晓其是否携带可以影响未来妊娠的突变。临床医师需要测试作为诊断
的辅助，并且研究者将使用测试以根据其疾病的病原学将受试者归类。本发明解决这个和
其它需要。

[0008] 遗传因素在儿童发育的病症中起到实质性作用(Abrahams等(2008)《.自然综述遗传学(Nat.Rev.Genet.)》9,第341-355页；Matsunami等(2014)《. 分子自闭症(Molecular Autism)》5,第5页；Matsunami等(2013)《.公共科学图书馆期刊(PLOS one)》8(1),第e52239页，其中每一者的公开内容出于所有目的以其全文引用的方式并入)。在儿童发育的病症中起作用的遗传突变和染色体异常可以是缺失或重复变体，包括拷贝数变体(CNV)或单核苷
酸多态性(SNP)。先前的基因组广泛连锁和关联研究已经牵涉到可能涉及于自闭症和ASD中
的多个遗传区域。这样的异质性增加了包括大扩展系谱的研究的价值。许多自闭症研究已
经集中于小家族(同胞对，或双亲和受影响的后代)以试图定位自闭症易感基因。小家族的
这些集合可以包括具有许多不同敏感基因座的病例。作为大扩展家族的成员的受ASD影响
的受试者更有可能经由其共同的祖先共享相同的遗传原因。在这样的家族内，自闭症可能
是更加遗传上同质的。

发明内容

[0009] 在一个方面，本发明涉及一种将来自人类受试者的样本诊断为ASD阳性或ASD阴性的方法，和用于进行这种方法的组合物。在一个实施方案中，这种方法包括在核酸水平上通过使用对表1、表2、表3、表6或表7中的一个或多个SNP分类器生物标志物具特异性的引物进行包括聚合酶链反应(PCR)的杂交试验来检测所述分类器生物标志物的存在；将表1、表2、表3、表6或表7的一个或多个SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在与至少一个样本训
练集中所述SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在相比较，其中至少一个样本训练集包
含(i)来自ASD阳性样本的表1、表2、表3、表6或表7的一个或多个SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在的数据，或(ii)来自ASD阴性样本的表1、表2、表3、表6或表7的一个或多个SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在的数据。在一个实施方案中，比较步骤包括应用
统计算法，这种统计算法包括确定获自样本的SNP分类器生物标志物数据与来自至少一个
训练集的SNP分类器生物标志物数据之间的相关性。基于统计算法的结果将样本诊断为ASD
阳性或ASD阴性。

[0010] 在另一个方面，提供了一种将来自人类受试者的样本归类为特定的ASD亚型的方法。在一个实施方案中，这种方法包括在核酸水平上通过使用对表1、表2、表3、表6或表7中的一个或多个SNP分类器生物标志物具特异性的引物进行包括聚合酶链反应(PCR)的杂交
试验来检测所述分类器生物标志物的存在；将表1、表2、表3、表6或表7的一个或多个SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在与至少一个样本训练集中所述SNP分类器生物标志物
的存在和/或不存在相比较。至少一个样本训练集包含(i)来自第一ASD亚型阳性样本的表
1、表2、表3、表6或表7的一个或多个SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在的数据，或(ii)来自第二ASD亚型阳性样本的表1、表2、表3、表6或表7的一个或多个SNP分类器生物标志物的存在和/或不存在的数据。比较步骤包括应用统计算法，这种统计算法包括确定获自样本的SNP分类器生物标志物数据与来自至少一个训练集的SNP分类器生物标志物数据之
间的相关性。基于统计算法的结果将样本诊断为特定的ASD亚型。

[0011] 在另一个实施方案中，第一ASD亚型和第二ASD亚型选自由自闭性障碍(典型自闭症)、阿斯伯格氏症(阿斯伯格综合症)、待分类的广泛性发展障碍(PDD-NOS)以及儿童期崩
解症(CDD)组成的群组，其中第一ASD亚型和第二ASD亚型是不同的。

[0012] 在一个实施方案中，关于上述方面，一个或多个SNP分类器生物标志物包含来自表1、2、3、6或7的两个或更多个SNP分类器生物标志物、三个或更多个SNP分类器生物标志物、四个或更多个SNP分类器生物标志物、五个或更多个SNP分类器生物标志物、六个或更多个
SNP分类器生物标志物、七个或更多个SNP分类器生物标志物、八个或更多个SNP分类器生物标志物、九个或更多个SNP分类器生物标志物、十个或更多个SNP分类器生物标志物、十一个或更多个SNP分类器生物标志物、十二个或更多个SNP分类器生物标志物、十三个或更多个
SNP分类器生物标志物、十四个或更多个SNP分类器生物标志物、十五个或更多个SNP分类器生物标志物、二十个或更多个SNP分类器生物标志物、二十五个或更多个SNP分类器生物标
志物、或三十个或更多个SNP分类器生物标志物。

[0013] 在一个实施方案中，杂交试验是微阵列试验、高通量测序试验、定量PCR试验或其组合。在一个实施方案中，来自人类受试者的样本是颊样本。

[0014] 在一个实施方案中，本文所提供的方法和组合物检测RAB11FIP5、ABP1以及JMJD7-PLA2G4B基因中的每一者中的SNP。在另一个实施方案中，RAB11FIP5SNP位于chr2:73302656(hg19)处，ABP1SNP位于chr7:150554592(hg19)处，并且JMJD7-PLA2G4B SNP位于chr15:
42133295(hg19)处。

[0015] 在一个方面，本文所提供的方法可以进一步包括基于统计算法的结果鉴别人类受试者用于ASD疗法。
附图说明

[0016] 图1：序列变体发现和分析的工作流程。只有种族和性别匹配的无关病例和对照用于关联测试。

[0017] 图2：RAB11FIP5变体的共分离。具有受自闭症影响的三个男性同胞的两代系谱(系谱1)。在家族中鉴别的序列变体示于黑色方框中。开放方框-未受影响的男性家族成员；开放圆圈-未受影响女性家族成员；填充方框-受影响的男性家族成员。示出了在病例/对照研究中观测到的变体的优势比。只有在高风险家族中观测到不具有优势比的变体。测试所有
家族成员的所有变体。

[0018] 图3：C14orf2变体的分离。具有三个受影响的女性和两个受影响的男性同胞以及受影响的男性半同胞的两代系谱(系谱2)。C14ORF2变体分离至六个受影响儿童中的五个。
系谱符号在图2的图例中描述。在家族中鉴别的序列变体示于黑色方框中。在受影响的半同胞中发现的CNV[27]示于红色方框中。在病例/对照研究中观测到的变体的优势比示于圆括
号中。只有在高风险家族中观测到不具有优势比的变体。除非无DNA可用，否则测试所有家族成员的所有变体。指示不具有可用的DNA的个体。

[0019] 图4：KLHL6、SPATA5L1以及ITPK1变体的分离。具有五个受影响的男性同胞的两代系谱(系谱3)。在家族中鉴别的序列变体示于黑色方框中。系谱符号在图2的图例中描述。只有在高风险家族中观测到不具有优势比的变体。测试所有家族成员的所有变体。

[0020] 图5：多代系谱中DEFB124变体的分离。系谱4具有受自闭症影响的七个儿童。这个系谱与其它高风险自闭症系谱之间的联系由蓝色方框指示。在家族中鉴别的序列变体示于
黑色方框中。由两个个体继承的CNV[27]示于红色方框中。系谱符号在图2的图例中描述。在病例/对照研究中观测到的变体的优势比示于圆括号中。只有在高风险家族中观测到不具
有优势比的变体。除非无DNA可用，否则测试所有家族成员的所有变体。指示不具有可用的DNA的个体。

[0021] 图6：多代系谱中包括AKAP9中的序列变体和NRXN1中的拷贝数变体的多个变体的分离。系谱5具有受自闭症影响的九个儿童。这个系谱与另一个高风险自闭症系谱之间的联系由蓝色方框指示。在家族中鉴别的序列变体示于黑色方框中。在4个个体中鉴别的CNV
[27]示于红色方框中。系谱符号在图2的图例中描述。在病例/对照研究中观测到的变体的
优势比示于圆括号中。只有在高风险家族中观测到不具有优势比的变体。除非无DNA可用，否则测试所有家族成员的所有变体。指示不具有可用的DNA的个体。

[0022] 图7.在高风险自闭症系谱中共享的单体型。这些图示出了在系谱中受影响的个体当中共享的单体型的图形表示，使用HapShare程序创建。X轴代表指定染色体的染色体坐
标。Y轴代表在系谱中受影响的个体当中共享的单体型的各种组合，由迭代次数任意地列
出。Y轴上的最低值代表在系谱中全部N个受影响的个体当中共享，并且在全部N个个体共享的情况下，仅存在一个可能的组合。在更低程度的共享下，存在更多的可能性。举例来说，在具有6个受影响的个体的系谱10中，对于全部6个共享相同的单体型来说，仅存在一个可能
的途径。在6个中仅5个共享单体型的情况下，存在6个不同的途径得到这个结果，其中6个受影响的个体中的每一者排除在所示出的6个迭代中的每一者中共享。在更低程度的共享下，存在更多的可能性，并且每种可能性在Y轴上作为独立的行示出。共享区域由有色块指示。
红色指示在系谱中N个受影响的个体中的N个当中共享，并且其它颜色代表更低程度的共
享。画面(a)由系谱10中全部6个受影响的个体共享的染色体2的两个区域；画面(b)在染色
体14区域的系谱10中全部6个受影响的个体当中共享；画面(c)在系谱5中染色体7上8个受
影响的个体中的5个当中共享和在系谱4中染色体20上7个受影响的个体中的4个当中共享。
在这些单体型上发现的变体(如果有的话)由图中的基因名称指示。注意，在系谱5中鉴别为在8个受影响的个体当中共享的染色体7区域稍后示出不由额外受影响的家族成员共享，得
到在9个受影响的个体中的5个当中共享的最终计数。

[0023] 图8.SNP基因型聚类。示出了在病例/对照研究中观测到的所有SNP的基因型聚类(表3)。

[0024] 图9.RAB11FIP5、AUP1、SCN3A、ATP11B、KLHL6、C7orf10、AKAP9、HEPACAM2、PDK4、RELN、ABP1、ALX1、AP1G2、DCAF11、RNF31、IRF9、SDR39U1以及PRKD1基因中的变体的桑格(Sanger)序列确认。杂合位置由每个画面中央的蓝色线指示。

[0025] 图10.SEC23A、ITPK1、CLMN、CCDC85C、MOK、C14orf2、TRPM1、FMN1、PGBD4、OIP5、JMJD7、JMJD7-PLA2G4B、CASC4、SPATA5L1、PYGO1、PRTG、NUDT7、DEFB124以及EPB41L1基因中的变体的桑格序列确认。杂合位置由每个画面中央的蓝色线指示。

[0026] 图11.小系谱中第二AKAP9变体的分离。系谱6具有单个受影响的儿童。系谱符号在图2的图例中描述。这个系谱与其它高风险自闭症系谱之间的联系由蓝色方框指示。在家族中鉴别的序列变体示于黑色方框中。在病例/对照研究中观测到的变体的优势比示于圆括
号中。只有在高风险家族中观测到不具有优势比的变体。除非无DNA可用，否则测试所有家族成员的所有变体。指示不具有可用的DNA的个体。

[0027] 图12.小两代系谱中ALX1变体的分离。系谱6具有受自闭症影响的两个同胞。单个ALX1变体由两个同胞共享。这个系谱与另一个高风险自闭症系谱之间的联系由蓝色方框指
示。系谱符号在图2的图例中描述。在家族中鉴别的序列变体示于黑色方框中。在病例/对照研究中观测到的变体的优势比示于圆括号中。只有在高风险家族中观测到不具有优势比的
变体。测试所有家族成员的所有变体。

[0028] 图13.具有多个序列变体和重叠的损失与增益拷贝数变体的多代系谱。系谱8具有5个受影响的男性儿童。这个家族中潜在的致病变体并不分离至多于一个受影响的个体。在
4个个体中鉴别的CNV[27]示于红色方框中。系谱符号在图2的图例中描述。在家族中鉴别的序列变体示于黑色方框中。在病例/对照研究中观测到的变体的优势比示于圆括号中。只有在高风险家族中观测到不具有优势比的变体。除非无DNA可用，否则测试所有家族成员的所有变体。指示不具有可用的DNA的个体。

[0029] 图14.两代系谱中两个序列变体的分离。系谱九具有三个受影响的女性同胞。系谱符号在图2的图例中描述。在家族中鉴别的序列变体示于黑色方框中。测试所有家族成员的所有变体。

[0030] 图15.系谱10中SCN3A和OIP5中的序列变体和涉及LINGO2的CNV的分离。系谱10具有6个受影响的男性同胞。最低一代中的女性同胞具有三染色体21并且包括自闭症的一些
特征。LINGO2损失CNV在我们的病例/对照研究中显示具有3.74的优势比，而LINGO2增益CNV在广泛ASD群体中不具有临床上相关的优势比。在我们的病例/对照研究中未观测到SCN3A
序列变体，而OIP5变体得到2.25的优势比。系谱符号在图2的图例中描述。在家族中鉴别的序列变体示于黑色方框中。测试具有可用的DNA的所有家族成员的所有变体。

[0031] 图16.RAB11FIP5P652L对RAB11结合的影响。(A)将P652L突变体FIP5(490-653)的野生型与各种GST标记的Rab或GST标记的FIP一起孵育。然后洗涤小珠并且用1％SDS洗脱结
合的FIP5(490-653)。然后通过用抗Rab11FIP5抗体进行免疫印迹来分析洗脱液。(B-G)用野生型FIP5-GFP(A和D)或FIP5-GFP-P652L(E和G)转导HeLa细胞。然后固定细胞并且用抗转铁
蛋白受体抗体染色(C、D、F以及G)。D和E是合并的图像，其中黄色代表Rab11FIP5与转铁蛋白受体之间重叠的程度。(H)将表达FIP5-GFP或FIP5-GFP-P652L的HeLa细胞与1μg/ml转铁蛋
白-Alexa488一起孵育。然后洗涤细胞并且在血清补充的培养基中孵育不同的时间量。使用流式细胞术测量细胞相关(未再循环)的转铁蛋白-Alexa488。所示出的数据是两个独立实
验的平均值。

具体实施方式

[0032] 当比较两个个体的人类基因组时，其为99.9％一致的(Kwok和Chen(2003)《. 分子生物学当前问题(Curr.Issues Mol.Biol.)》5,第43-60页，以其全文引用的方式并入)。然而，因为人类基因组的大小为约32亿个碱基对，所以一个基因组与另一个存在约320万个碱基对差异。大多数差异归因于单碱基替换多态性，普遍称为单核苷酸多态性(SNP)。(Kwok和Chen(2003)《.分子生物学当前问题(Curr.Issues Mol.Biol.)》5,第43-60页)。一小部分多态性具有功能意义并且据信是在人类当中发现的多样性的基础(Collins等(1997)《.科学
(Science)》278,第1580-1581页，以其全文引用的方式并入)。在本发明的情况下，样本获自受试者并且分析特定的SNP以评估受试者是否处于发展自闭症谱系障碍(ASD)的风险下或
诊断受试者患有ASD。

[0033] 在一些方面，本文所提供的方法针对(i)诊断受试者患有ASD，(ii)预测受试者是否处于ASD的风险下或评估受试者发展ASD，例如自闭症的可能性，(iii)诊断受试者具有特定的ASD亚型，或(iv)选择受试者用于ASD的治疗。这些方法部分地包括确定以下基因中的
一者或多者中的一个或多个SNP，例如在表1所提供的位置处的SNP的存在：RAB11FIP5、
AUP1、SCN3A、ATP11B、KLHL6、C7orf10、AKAP9、HEPACAM2、PDK4、RELN、ABP1、ALX1、AP1G2、DCAF11、RNF31、IRF9、SDR39U1、PRKD1、SEC23A、ITPK1、CLMN、CCDC85C、MOK、C14orf2、TRPM1、FMN1、PGBD4、OIP5、JMJD7、JMJD7-PLA2G4B、CASC4、SPATA5L1、PYGO1、PRTG、NUDT7、DEFB124、EPB41L1。在另一个实施方案中，确定前述基因的两个或更多个SNP的存在或不存在。在甚至另一个实施方案中，确定前述基因的五个或更多个SNP的存在或不存在。在甚至另一个实施方案中，确定前述基因的十个或更多个SNP的存在或不存在。

[0034] 在本发明的上下文中，提及任何特定的SNP集中所列的SNP中的“一个或多个”、“两个或更多个”、“五个或更多个”等等意指所列的SNP中的任一者或任何和所有组合。

[0035] 在一个实施方案中，本文所提供的方法和组合物检测RAB11FIP5、ABP1以及JMJD7-PLA2G4B基因中的每一者中的SNP。在另一个实施方案中，RAB11FIP5SNP位于chr2:73302656(hg19)处，ABP1SNP位于chr7:150554592(hg19)处，并且JMJD7-PLA2G4B SNP位于chr15:
42133295(hg19)处。

[0036] 在一个实施方案中，一个或多个SNP包含上文所提供的基因中的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、或35个或更多个SNP，例如表1、2、3、6或7中的SNP，例如RAB11FIP5、ABP1以及JMJD7-PLA2G4B基因中的一个或多个SNP。在另一个实施方案中，使用本文所提供的方法和组合物可检测的一个或多个(例如，两个或更多个、或五个或更多个)SNP可以与其它标志物组合用于诊断ASD、预测受试者中的ASD、诊断特定的ASD亚
型。举例来说，与美国专利申请公布号2010/0210471(出于所有目的以其全文引用的方式并入)和国际PCT公布号2014/055915(出于所有目的以其全文引用的方式并入)中所公开的
ASD相关的单核苷酸多态性(例如，两个或更多个、或五个或更多个)中的一个或多个(例如，两个或更多个、或五个或更多个)可以与本文在组合物或方法中的一者或多者中所描述的
一个或多个SNP组合检测。另外，与美国专利申请公布号2010/0210471(出于所有目的以其
全文引用的方式并入)中所公开的ASD相关的CNV中的一个或多个(例如，两个或更多个、或
五个或更多个)和/或国际PCT公布号2014/055915(出于所有目的以其全文引用的方式并
入)中所描述的CNV中的一个或多个(例如，两个或更多个、或五个或更多个)可以与本文在
组合物或方法中的一者或多者中所描述的SNP组合检测。

[0037] 因此，本发明的方面涉及用于检测受试者中的一个或多个SNP的方法和组合物以(i)诊断受试者患有ASD，(ii)预测受试者是否处于ASD的风险下或评估受试者发展ASD，例
如自闭症的可能性，(iii)诊断受试者具有特定的ASD亚型，或(iv)选择受试者用于ASD的治疗。在这些方面的一个实施方案中，样本获自人类受试者并且分析表1、2、3、6或7中所阐述的SNP中的一者或多者。然后将结果与参考值相比较，并且取决于这个比较，诊断受试者患有ASD，预测处于ASD的风险下，诊断特定的ASD亚型，或选择受试者用于ASD的治疗。在一个实施方案中，ASD亚型是自闭性障碍。

[0038] 第四版-文本修订的《心理障碍诊断与统计手册(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)》当前定义了五种病症(本文中也称作“ASD亚型”)，有时称为广泛性发育障碍(PDD)，如同ASD一样。这些包括：自闭性障碍(典型自闭症)、阿斯伯格氏症(阿斯伯格综合症(AS))、待分类的广泛性发展障碍(PDD-NOS)、雷特氏症(雷特综合症)以及儿童期崩解症(CDD)。注意，已知大多数雷特综合症病例由MeCP2基因或CDKL5基因的突变引起并且预期《心理障碍诊断与统计手册(Diagnostic and Statistical Manual of
Mental Disorders)》的更新修订将雷特综合症独立于ASD归类。因此，在某些实施方案中，ASD不包括雷特综合症。自闭性障碍应理解为在3岁前呈现出的削弱的社会互动和沟通与受
限的重复和定型模式的行为、兴趣以及活动的任何病状，达到健康可能受损的程度。阿斯伯格综合症与自闭性障碍的区别在于在表征ASD的削弱的社会互动和受限的重复行为、兴趣
以及活动存在下临床上显著的语言发育迟缓的缺乏。PDD-NOS用于将不满足严格的自闭症
标准，但通过表现非典型自闭症或通过近乎满足关键区中的两者或三者中的诊断标准而接
近满足的个体分类。本文所提供的方法和组合物可用于诊断受试者患有ASD谱系上的病症
中的任一者，或预测受试者是否将发展ASD谱系上的病症中的任一者。

[0039] “单核苷酸多态性(SNP)”是核酸序列中的单碱基对变异。多态性可以例如由变异所存在的核苷酸位置，由核苷酸变异所引起的氨基酸序列的变化，或由与变异(例如，诸如茎环的二级结构的变更，或核酸对相关分子，诸如聚合酶、RNase等等的结合亲和力的变更)相联系的核酸分子的某种其它特征的变化来提及。举例来说，在本文所阐述的基因的区域
中的本文所公开的SNP可以由其在相应的基因或染色体中的位置，例如，基于变体残基或染色体位置的数位来提及。通过方法和组合物可检测的SNP提供于表1、2、3、6以及7中。在另一个实施方案中，在表1中所提供的染色体位置处的任何SNP用于本文所描述的方法中并且使
用本文所提供的组合物可检测。

[0040]

[0041]

[0042]

[0043]

[0044]

[0045]

[0046] 如本文所用的“样本”或“生物样本”指的是获自人类受试者或患者的样本，其可以针对特定的分子，例如本文所阐述的单核苷酸多态性(SNP)或拷贝数变体(CNV)中的一者或多者，诸如表1、2、3、6或7中所阐述的SNP中的一者或多者进行测试。样本可以包括(但不限于)细胞，颊拭子样本，体液，包括血液、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊髓液、泪液、胸膜液，等等。

[0047] 适合用于本文所描述的方法中的样本含有遗传物质，例如基因组DNA(gDNA)。样本来源的非限制性实例包括尿液、血液以及组织。样本本身将通常由从受试者中移出的有核
细胞(例如，血液或颊细胞)、组织等等组成。受试者可以是成人、儿童、胎儿或胚胎。在一些实施方案中，样本在产前获自胎儿或胚胎，或获自母体(例如，获自母系循环中的胎儿或胚胎细胞)。在本领域中已知方法和试剂用于获得、处理以及分析样本。在一些实施方案中，样本在卫生保健提供者的帮助下获得，例如，抽取血液。在一些实施方案中，样本在没有卫生保健提供者的帮助下获得，例如，在非侵入性地获得样本的情况下，诸如包含使用颊拭子或刷子获得的颊细胞的样本，或漱口液样本。

[0048] 样本可以在检测步骤之前进一步处理。举例来说，可以使细胞或组织样本中的DNA与样本的其它组分分离。可以浓缩和/或纯化样本以分离DNA。可以使用本领域中已知的标
准技术从生物样本收集细胞。举例来说，可以通过使细胞样本离心并且使成团的细胞再悬
浮来收集细胞。可以使细胞再悬浮于诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)的缓冲溶液中。使细胞悬浮液离心以获得细胞团块之后，可以溶解细胞以提取DNA，例如基因组DNA。获自受试者的所有样本，包括经受任何种类的进一步处理的那些，都被认为获自受试者。

[0049] 一旦获得样本，即询问本文所阐述的SNP中的一者或多者，例如表1、2、3、6或7中所阐述的SNP中的一者或多者。

[0050] 一般来说，可以使用单独或与扩增试验(即，在检测之前扩增样本中的核酸)组合的寡核苷酸杂交试验来鉴别SNP中的一者或多者。在一个实施方案中，如下文详细描述，对样本的基因组DNA进行测序或杂交至阵列。然后确定样本是否包括一个或多个SNP，还是包
括“正常”或“野生型”序列(也称作“参考序列”或“参考等位基因”)。在本文所描述的SNP的情况下，在一个实施方案中，“参考等位基因”提供于表2中。

[0051] 一般来说，如果杂交试验揭示测序区域与参考序列之间的差异，那么已经鉴别多态性。如本文所描述，某些统计算法可以有助于这种确定。在特定的位点处鉴别核苷酸序列的差异的事实确定多态性存在于那个位点处。在大多数情况下，特别是在SNP的情况下，可以存在至多四个变体，这是因为DNA中存在四个天然存在的核苷酸。

[0052] 举例来说，寡核苷酸或寡核苷酸对可以用于本领域中已知的方法中，例如微阵列或聚合酶链反应试验中，以检测一个或多个SNP。

[0053] 术语“寡核苷酸”指的是相对短的多核苷酸(例如，100个、50个、20个或更少的核苷酸)，包括(但不限于)单股脱氧核糖核苷酸、单股或双股核糖核苷酸、RNA:DNA杂交体以及双股DNA。寡核苷酸，诸如单股DNA探针寡核苷酸，常常通过化学方法，例如使用可商购的自动寡核苷酸合成器合成。然而，寡核苷酸可以通过多种其它方法，包括体外重组DNA介导的技术，以及通过在细胞和生物体中表达DNA而制得。

[0054] 在本发明的上下文中，“分离”或“纯化”的核酸分子，例如DNA分子或RNA分子，是与其原生环境分开存在并且因此不是自然的产物的DNA分子或RNA分子。分离的DNA分子或RNA分子可以按纯化的形式存在或可以存在于非原生环境，诸如转基因宿主细胞中。举例来说，“分离”或“纯化”的核酸分子当通过重组技术产生时实质上不含其它细胞物质或培养基，或当化学合成时实质上不含化学前体或其它化学品。在一个实施方案中，“分离”的核酸不含在核酸所来源的生物体的基因组DNA中天然地侧接核酸的序列(即，位于核酸的5'和3'末端
处的序列)。

[0055] 如本文所用的一组寡核苷酸可以包含约2个至约100个寡核苷酸，其全部特异性地杂交至与ASD相关的特定遗传标志物(包括例如表1、2、3、6或7中的一者或多者中所阐述的SNP)。在一个实施方案中，一组寡核苷酸包含约5个至约30个寡核苷酸、约10个至约20个寡核苷酸，并且在一个实施方案中包含约20个寡核苷酸，其全部特异性地杂交至与ASD相关的特定遗传标志物。因此，一组寡核苷酸可以包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、
41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、
150、160、170、180、190、200个或更多个寡核苷酸，其全部特异性地杂交至与ASD相关的特定SNP。在一个实施方案中，一组寡核苷酸包含DNA探针。在一个实施方案中，DNA探针包含重叠的DNA探针。在另一个实施方案中，DNA探针包含不重叠的DNA探针。在一个实施方案中，DNA探针提供覆盖与ASD相关的SNP遗传标志物的长度的检测。在另一个实施方案中，一组寡核
苷酸包含扩增与ASD相关的SNP遗传标志物的扩增引物。在这点上，包含扩增引物的寡核苷
酸组可以包含多重扩增引物。在另一个实施方案中，寡核苷酸组或DNA探针可以在阵列上提供，诸如固相阵列、染色体/DNA微阵列或微珠阵列。阵列技术在本领域中是众所周知的。预期用于本发明中的说明性阵列包括(但不限于)可得自Affymetrix(Santa Clara,CA)和
Illumina(San Diego,CA)的阵列。

[0056] 在一个实施方案中，在微阵列上的杂交用于检测患者的样本中一个或多个SNP的存在。术语“微阵列”指的是在衬底上可杂交阵列元素，例如多核苷酸探针的有序排列。

[0057] 在本发明的另一个实施方案中，恒定变性毛细管电泳(CDCE)可以与高保真PCR(HiFi-PCR)组合以检测一个或多个SNP的存在。在另一个实施方案中，使用高保真PCR。在另一个实施方案中，采用变性HPLC、变性毛细管电泳、循环温度毛细管电泳、等位基因特异性PCR、定量实时PCR方法(诸如 )来检测SNP。可用于本发明的检测一个或多个SNP
的存在的其它方法包括使用聚合酶克隆测序法(polony sequencing approach)、微阵列
法、质谱法、高通量测序法，例如在单分子水平上。

[0058] 在一个实施方案中，用于检测一个或多个SNP，例如两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个SNP的试剂包含一个或多个寡核苷酸，其中每个寡核苷酸特异性地杂交至与ASD相关的SNP遗传标志物。如本领域的一般技术人员将了解，一个或多个寡核苷酸经过
设计以杂交至一个位置处的基因。

[0059] 杂交检测方法是基于互补核酸序列之间特异性杂交体的形成，这些杂交体用来检测核酸序列突变。用以检测多态性和/或多态变体的核酸分析方法包括例如微阵列分析和
实时PCR。还可以使用杂交方法，诸如南方分析(Southern analysis)、北方分析(Northern analysis)或原位杂交(参看《分子生物学现行方案(Current Protocols in Molecular
Biology)》,Ausubel等编,John Wiley&Sons 2003，以其全文引用的方式并入)。

[0060] 举例来说，其它方法包括直接人工测序(Church和Gilbert《, 美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》81:1991-1995(1988)；Sanger等《, 美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》74:5463-5467(1977)；Beavis等美国专利号5,288,644，各自出于所有目的以其全文引用的方式并入)；自动荧光测序；单股构象多态性试验(SSCP)；夹持变性凝胶电泳(CDGE)；二维凝胶电泳(2DGE或TDGE)；构象敏感性凝胶电泳(CSGE)；变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Sheffield等《,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》86:
232-236(1989 ))；迁移率变动分析(Orita等 ,《美国国家科学院院刊
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》86:2766-2770(1989)，以其全文引用的方式并入)；限制酶分析(Flavell等,《细胞(Cell)》15:25(1978)；Geever等,《美国国家科学院院刊
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》78:5081(1981)，以其全文引用的方式并入)；定量实时PCR
(Raca等《, 遗传学测试(Genet Test)》8(4):387-94(2004)，以其全文引用的方式并入)；异源双链分析；化学错配裂解(CMC )( Cotton等 ,《美国国家科学院院刊
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:4397-4401(1985)，以其全文引用的方式并入)；RNase保护试验(Myers等《,科学(Science)》230:1242(1985)，以其全文引用的方式并入)；识别核苷酸错配的多肽的使用，例如大肠杆菌mutS蛋白；等位基因特异性PCR。参看例如美国专利公布号2004/0014095，以其全文引用的方式并入本文中。

[0061] 为了检测多态性和/或多态变体，在一个实施方案中，首先扩增存在于获自受试者的样本中的含有多态位点的基因组DNA(gDNA)或其一部分。在一个实施方案中，多态变体是表1、2、3、6或7之一中所阐述的SNP中的一者或多者。这样的区域可以通过使用基于侧接位点的基因组和/或cDNA序列而设计的寡核苷酸引物进行PCR来扩增和分离。参看例如《PCR引物：实验室手册(PCR Primer:A Laboratory Manual)》,Dieffenbach和Dveksler,(编)；
McPherson等《, PCR基础：从背景到实验台(PCR Basics:From Background to Bench)》
(Springer Verlag,2000，以其全文引用的方式并入)；Mattila等《, 核酸研究(Nucleic
Acids Res.)》,19:4967(1991)，以其全文引用的方式并入；Eckert等《,PCR方法和应用(PCR Methods and Applications)》,1:17(1991)，以其全文引用的方式并入；PCR(McPherson等编,IRL Press,Oxford)，以其全文引用的方式并入；以及美国专利号4,683,202，以其全文引用的方式并入。可以采用的其它扩增方法包括连接酶链反应(LCR)(Wu和Wallace《,基因
组学(Genomics)》,4:560(1989)；Landegren等《, 科学(Science)》,241:1077(1988))、转录扩增(Kwoh等《, 美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,86:1173(1989))、自我持续序列复制(Guatelli等《, 美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》,87:1874
(1990))，以其全文引用的方式并入，以及基于核酸的序列扩增(NASBA)。选择用于PCR扩增的引物的准则为本领域的一般技术人员所知。参看例如McPherson等《, PCR基础：从背景到实验台(PCR Basics:From Background to Bench)》,Springer-Verlag,2000，以其全文引
用的方式并入。用于设计引物的多种计算机程序是可用的。

[0062] 在一个实例中，样本(例如，包含基因组DNA的样本)获自受试者。然后检查样本中的DNA以确定如本文所描述的SNP型态和任选地CNV型态。这种型态通过本文所描述的任何
方法确定，例如，通过测序或通过基因组DNA、RNA或cDNA中的基因杂交至核酸探针，例如DNA探针(包括cDNA和寡核苷酸探针)或RNA探针。核酸探针可以经过设计以特异性地或优先与
特定的多态变体杂交。

[0063] 在一些实施方案中，如果多态性的替代性多态变体得以创建或消除限制性位点，那么限制性消化分析可以用于检测多态性的多态变体的存在。含有基因组DNA的样本获自
个体。聚合酶链反应(PCR)可以用于扩增包含多态位点的区域，并且进行限制性片段长度多态性分析(参看《分子生物学现行方案(Current Protocols in Molecular Biology)》,
Ausubel等编,John Wiley&Sons 2003，以其全文引用的方式并入)。相关DNA片段的消化模
式指示多态性的特定多态变体的存在或不存在并且因此指示对SZ的敏感性的存在或不存
在。

[0064] 序列分析也可以用于检测一个或多个SNP，例如表1、2、3、6或7中所阐述的一个或多个SNP。包含DNA或RNA的样本获自受试者。必要时，PCR或其它适当方法可以用于扩增包涵多态位点的部分。然后使用任何标准方法查明序列，并且确定多态变体的存在。

[0065] 等位基因特异性寡核苷酸也可以用于检测多态变体的存在，例如，经由使用扩增的寡核苷酸与等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针的斑点印迹杂交(参看例如Saiki等《,自
然(Nature)》(London)324:163-166(1986))。“等位基因特异性寡核苷酸”(本文中也称作“等位基因特异性寡核苷酸探针”)通常是约10-50个碱基对、优选地约15-30个碱基对的寡核苷酸，其特异性地杂交至含有多态性的核酸区域。对特定的多态性具特异性的等位基因
特异性寡核苷酸探针可以使用标准方法制备(参看《分子生物学现行方案(Current
Protocols in Molecular Biology)》,Ausubel等编,John Wiley&Sons 2003，以其全文引
用的方式并入)。

[0066] 一般来说，为了确定多个SNP变体中的哪个存在于受试者中，包含DNA的样本获自受试者。PCR或另一个扩增程序可以用于扩增包涵多态位点的部分。

[0067] 实时焦磷酸DNA测序是用以检测多态性和多态变体的另一种方法(Alderborn等,(2000《) 基因组研究(Genome Research)》,10(8):1249-1258，以其全文引用的方式并入)。
额外的方法包括例如PCR扩增与变性高效液相色谱法(dHPLC)组合(Underhill等《, 基因组
研究(Genome Research)》,第7卷,第10期,第996-1005页,1997，出于所有目的以其全文引
用的方式并入)。

[0068] 高通量测序或下一代测序也可以用于检测本文所描述的SNP中的一者或多者。这样的方法在本领域中是已知的(参看例如Zhang等,《遗传基因组学杂志(J Genet
Genomics)》.2011年3月20日；38(3):95-109，出于所有目的以其全文引用的方式并入；
Metzker《, 自然综述遗传学(Nat Rev Genet)》.2010年1月；11(1):31-46，出于所有目的以其全文引用的方式并入)，并且包括(但不限于)以下技术：诸如ABI SOLiD测序技术(现在归属于Life Technologies,Carlsbad,CA)；Roche 454FLX，其使用通过合成技术进行的测序，称为焦磷酸测序(Roche,Basel Switzerland)；Illumina基因组分析仪(Illumina,San
Diego,CA)；Dover Systems Polonator G.007(Salem,NH)；赫利克斯(Helicos)(Helicos
BioSciences Corporation,Cambridge Mass.,USA)和桑格。在一个实施方案中，DNA测序可以使用本领域中熟知的方法进行，包括质谱技术和全基因组测序技术、单分子测序等等。

[0069] 在一个实施方案中，核酸，例如基因组DNA，使用纳米孔测序进行测序，以确定一个或多个SNP并且在一些情况下一个或多个CNV的存在(例如，如Soni等(2007)《. 临床化学(Clin Chem)》53,第1996-2001页所描述，出于所有目的以其全文引用的方式并入)。纳米孔测序是单分子测序技术，借此当DNA的单分子通过纳米孔时直接测序。纳米孔是直径约1纳
米的小孔洞。纳米孔浸入传导流体中并且跨越其施加电势(电压)由于离子穿过纳米孔传导
而产生微小的电流。流动的电流量对纳米孔的大小和形状敏感。当DNA分子通过纳米孔时，DNA分子上的每个核苷酸不同程度地阻塞纳米孔，在不同程度上改变穿过纳米孔的电流的
量值。因此，当DNA分子通过纳米孔时电流的这种变化代表DNA序列的读取。如美国专利号5,
795,782、6,015,714、6,627,067、7,238,485和7,258,838以及美国专利申请公布美国专利申请公布号2006/003171和2009/0029477(各自出于所有目的以其全文引用的方式并入)中
所公开的纳米孔测序技术可用于本文所描述的方法。

[0070] 核酸探针可以用于检测和/或定量核酸序列的样本内特定靶核酸序列(例如，作为杂交探针)的存在，或扩增样本内的特定靶序列(例如，作为引物)。探针具有选择性地杂交至靶核酸序列的互补核酸序列。为了探针杂交至靶序列，杂交探针必须与靶序列具有足够
的一致性，即，与靶序列至少70％，例如80％、90％、95％、98％或更高一致。探针序列还必须足够长，以使得探针对靶序列展现优于非靶序列的选择性。举例来说，探针的长度将为至少
10个，例如15个、20个、25个、30个、35个、50个、100个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，探针的长度不大于30个、50个、100个、200个、300个或500个核苷酸。探针包括引物，其一般指的是可以充当使用诸如PCR(聚合酶链反应)、LCR(连接酶链反应)等等用于扩增靶序列的
方法进行模板引导的DNA合成的起始点的单股寡核苷酸探针。

[0071] 在一些实施方案中，探针是测试探针，例如，可以用于检测本文所描述的区域中的多态性的探针，这些多态性例如本文所描述的多态性，例如，表1、2、3、6或7之一中所阐述的一个或多个、两个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、或二十个或更多个SNP。在一些实施方案中，探针可以杂交至通过限定如表1中的特定基因所指定的SNP(SNP1和SNP2包括在内)或者表1、2、3、6或7的SNP而限定的区域内的靶序列。

[0072] 还可以使用对照探针。举例来说，结合更少可变序列，例如与染色体的着丝粒相关的重复DNA的探针，或展现差异性结合至所询问的多态位点的探针，可以用作对照。与各种着丝粒DNA和基因座特异性DNA杂交的探针可购自例如Vysis,Inc.(Downers Grove,Ill.)、Molecular Probes,Inc.(Eugene,Oreg.)或Cytocell(Oxfordshire,UK)。

[0073] 在一些实施方案中，探针用“可检测标记”作标记，例如，通过直接标记。在各种实施方案中，用于检测本文所描述的与ASD相关的一个或多个SNP遗传标志物的寡核苷酸偶联至可以直接或间接检测的可检测标记。在本发明中，寡核苷酸可以全部共价连接至可检测
标记。

[0074] “可检测标记”是可以产生指示样本中标记的存在和/或浓度的可检测(诸如视觉上、以电子方式或以其它方式)信号的分子或物质。当偶联至诸如DNA探针的核酸时，可检测标记可以用于定位和/或定量特异性探针所针对的靶核酸序列。从而，可以通过检测由可检测标记产生的信号来检测样本中标靶的存在和/或量。可以直接或间接检测可检测标记，并且可以组合使用偶联至不同探针的若干不同的可检测标记以检测一个或多个标靶。

[0075] 一种类型的“可检测标记”是荧光团，一种在吸收更低波长/更高能量的光之后发荧光的有机分子。直接标记的荧光团允许探针在没有二级检测分子的情况下显现。使荧光
团共价附接至核苷酸之后，可以使用诸如缺口平移、随机引发以及PCR标记的标准技术将核苷酸直接并入探针中。或者，可以用连接子使探针内的脱氧胞苷核苷酸转氨。然后使荧光团共价附接至转氨的脱氧胞苷核苷酸。参看例如美国专利号5,491,224，以其全文引用的方式并入。

[0076] 荧光标记的实例包括5-(和6)-羧基荧光素、5-或6-羧基荧光素、6-(荧光素)-5-(和6)-甲酰胺基己酸、异硫氰酸荧光素、若丹明(rhodamine)、四甲基若丹明
(tetramethylrhodamine)，以及染料，诸如Cy2、Cy3和Cy5，任选地被取代的香豆素，包括AMCA、PerCP，藻胆蛋白，包括R-藻红蛋白(RPE)和别藻红蛋白(allophycoerythrin，APC)，德克萨斯红(Texas Red)，普林斯顿红(Princeton Red)，绿色荧光蛋白(GFP)和其类似物，以及R-藻红蛋白或别藻红蛋白的偶联物，无机荧光标记，诸如基于半导体材料，如包覆的CdSe纳米微晶的粒子。

[0077] 可以直接检测的可检测标记的其它实例包括放射性物质和金属粒子。相比之下，间接检测需要在应用初级探针或抗体之后应用一个或多个额外的探针或抗体，即，二级抗
体。因此，在某些实施方案中，如熟练的技术人员将了解，通过检测二级探针或结合剂与初级可检测探针的结合进行检测。需要添加二级结合剂或抗体的初级可检测结合剂或探针的
实例包括酶促可检测结合剂和半抗原可检测结合剂或抗体。

[0078] 在一些实施方案中，可检测标记偶联至包含第一结合剂的核酸聚合物(例如，在ISH、WISH或FISH工艺中)。在其它实施方案中，可检测标记偶联至包含第一结合剂的抗体
(例如，在IHC工艺中)。

[0079] 在本公开的方法中使用的可以偶联至寡核苷酸的可检测标记的实例包括荧光标记、酶标记、放射性同位素、化学发光标记、电化学发光标记、生物发光标记、聚合物、聚合物粒子、金属粒子、半抗原以及染料。

[0080] 聚合物粒子标记的实例包括可以与荧光染料一起包埋的聚苯乙烯、PMMA或二氧化硅的微粒子或乳胶粒子，或含有染料、酶或底物的聚合物胶束或胶囊。

[0081] 金属粒子标记的实例包括金粒子和包覆的金粒子，其可以通过银染而转化。半抗原的实例包括DNP、异硫氰酸荧光素(FITC)、生物素以及地高辛(digoxigenin)。酶标记的实例包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP或AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶以及葡糖氧化酶(GO)。辣根过氧化物酶的通常所用的底物的实例包括3,3'-二氨基联苯胺
(DAB)、镍加强的二氨基联苯胺、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、联苯胺二盐酸盐(BDHC)、汉克-耶茨试剂(Hanker-Yates reagent，HYR)、靛酚蓝(Indophane blue，IB)、四甲基联苯胺
(TMB)、4-氯-1-萘酚(CN)、α-萘酚派若宁(α-naphtol pyronin，α-NP)、邻联茴香胺(OD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、氯化2-(对碘苯基)-3-对硝基苯基-5-苯基四唑(INT)、四硝基蓝四唑(TNBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷/氰亚铁酸亚铁(BCIG/FF)。

[0082] 碱性磷酸酶的通常所用的底物的实例包括萘酚-AS-B1-磷酸/坚牢红TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸/坚牢红TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸/-坚牢红TR(NABP/FR)、萘
酚-AS-MX-磷酸/坚牢红TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸/新品红(NABP/NF)、溴氯吲哚基磷
酸/硝基蓝四唑(BCIP/NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-d-吡喃半乳糖苷(BCIG)。

[0083] 发光标记的实例包括鲁米诺(luminol)、异鲁米诺(isoluminol)、吖啶酯(acridinium ester)、1,2-二氧杂环丁烷以及吡啶并哒嗪。电化学发光标记的实例包括钌
衍生物。放射性标记的实例包括碘、钴、硒、氚、碳、硫以及磷的放射性同位素。

[0084] 可检测标记可以连接至特异性地结合至所关注的生物标志物的任何分子，例如抗体、核酸探针或聚合物。此外，本领域的一般技术人员将了解可检测标记还可以偶联至第二和/或第三和/或第四和/或第五结合剂、核酸或抗体等等。此外，熟练的技术人员将了解用于表征所关注的生物标志物(例如，如表1、2、3、6或7中的一者或多者中所阐述的与ASD相关的一个或多个SNP遗传标志物)的每个额外的结合剂或核酸可以充当信号扩增步骤。可以使
用例如光学显微术、荧光显微术、电子显微术视觉上检测生物标志物，其中可检测物质是例如染料、胶体金粒子、发光试剂。还可以使用分光光度计检测结合至生物标志物的视觉上可检测的物质。在可检测物质是放射性同位素的情况下，可以通过自动射线照相术视觉上，或使用闪烁计数器非视觉上进行检测。参看例如Larsson,1988《,免疫细胞化学：理论和实践(Immunocytochemistry:Theory and Practice)》(CRC Press,Boca Raton,Fla.)；《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,第80卷1998,John D.Pound(编)(Humana
Press,Totowa,N.J.)，各自出于所有目的以其全文引用的方式并入。

[0085] 在其它实施方案中，探针可以用例如生物素或地高辛间接作标记，或用诸如32P和3H的放射性同位素作标记。举例来说，可以由偶联至可检测标志物的抗生物素蛋白检测用
生物素间接作标记的探针。举例来说，抗生物素蛋白可以偶联至诸如碱性磷酸酶或辣根过
氧化物酶的酶标志物。可以在标准比色反应中使用酶的底物和/或催化剂检测酶标志物。碱性磷酸酶的催化剂包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸和硝基蓝四唑。二氨基苯甲酸酯可以用作
辣根过氧化物酶的催化剂。

[0086] 展现差异性或选择性结合至多态位点的寡核苷酸探针可以由本领域的一般技术人员容易地设计。举例来说，与包涵多态位点的序列(即，在内部或在一个末端处包括多态位点的序列)完美互补的寡核苷酸一般将优先杂交至包含那个序列的核酸，与包含替代性
多态变体的核酸相反。

[0087] 在另一个方面，本发明特征在于包括具有多个可寻址区的衬底的阵列，和使用其的方法。这多个中的至少一个区包括特异性地结合至包含表1、2、3、6或7中所列的多态性的序列，并且可以用于检测所述多态性，例如，如本文所描述的一个或多个SNP的不存在或存在的核酸探针。举例来说，阵列可以包括可以用于检测表1或2中所列的多态性的一个或多
个核酸探针。在一些实施方案中，阵列进一步包括至少一个区，其包括可以用于特异性地检测与ASD相关的另一个标志物，例如拷贝数变体(CNV)，例如美国专利申请公布号2010/
0210471和/或国际PCT公布号2014/055915(各自出于所有目的以其全文引用的方式并入)
中所描述的CNV中的一者或多者的核酸探针。衬底可以是例如本领域中已知的二维衬底，诸如玻璃载片、晶片(例如，二氧化硅或塑料)、质谱板，或三维衬底，诸如凝胶垫。在一些实施方案中，探针是核酸捕获探针。

[0088] 产生阵列的方法在本领域中是已知的并且包括例如光刻法(参看例如美国专利号5,143,854、5,510,270以及5,527,681，其中每一者以其全文引用的方式并入)、机械法(例如，如美国专利号5,384,261中所描述的导向流法)、基于栓销的方法(例如，如美国专利号
5,288,514中所描述，以其全文引用的方式并入)、以及基于小珠的技术(例如，如PCT US/
93/04145中所描述，以其全文引用的方式并入)。阵列通常包括能够特异性地杂交至不同多态变体的寡核苷酸探针。根据这种方法，使所关注的核酸，例如包涵多态位点的核酸(其通常经过扩增)与阵列杂交并扫描。杂交和扫描一般根据标准方法进行。杂交和洗涤之后，扫描阵列以确定阵列上来自样本的核酸杂交的位置。获自扫描的杂交数据通常呈随着阵列上
的位置而变的荧光强度的形式。

[0089] 阵列可以包括多个检测块(即，设计用于检测特定多态性的多组探针)。这样的阵列可以用于分析多个不同的多态性，例如，在相同多态位点处的相异多态性或在不同染色
体位点处的多态性。检测块可以在单个阵列内或在多个独立阵列中分组以使得在杂交期间
可以使用变化的条件(例如，针对特定多态性而优化的条件)。

[0090] 寡核苷酸阵列用于检测多态性的用途的额外描述可以例如在美国专利号5,858,659和5,837,832中找到，其中每一者以其全文引用的方式并入。

[0091] 对来自受试者的样本(测试样本)进行的SNP和/或CNV分型的结果可以与已知或疑似正常的生物样本(“参考样本”或“正常样本”)或来源于这类生物样本的数据相比较。在一些实施方案中，参考样本是不获自患有ASD的个体，或将在SNP分型试验中对于评价下的一
个或多个SNP测试呈阴性的样本。参考样本可以在与测试样本相同的时间或在不同的时间
进行试验。

[0092] 对测试样本的试验的结果可以与对参考样本的相同试验的结果相比较。在一些情况下，对参考样本的试验的结果来自数据库或参考文献。在一些情况下，对参考样本的试验的结果是本领域的技术人员已知或一般接受的值或值的范围。在一些情况下，比较是定性
的。在其它情况下，比较是定量的。在一些情况下，定性或定量比较可以涉及(但不限于)以下一者或多者：比较荧光值、光点强度、吸光度值、化学发光信号、直方图、临界阈值、统计显著值、SNP存在或不存在、拷贝数变异。

[0093] 在一个实施方案中，计算每个个别的SNP测量的优势比(OR)。这里，OR是SNP的存在或不存在与结果，例如ASD阳性或ASD阴性之间的关联的量度。优势比在病例-对照研究中是最常用的。举例来说，参看《加拿大儿童和青少年精神病学学会杂志(J.Can.Acad.Child Adolesc.Psychiatry)》2010；19(3):227-229，出于所有目的以其全文引用的方式并入。可以组合每个SNP的优势比以作出最终的ASD诊断。

[0094] 在一个实施方案中，可以确定指定的统计置信水平以提供诊断置信水平。举例来说，可以确定高于90％的置信水平可以是ASD的存在或受试者将发展ASD的可能性的有用预
测因子。在其它实施方案中，可以选择更大或更小严格度的置信水平。举例来说，可以选择约或至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或99.9％的置信水平作为有用的表型预测因子。在一些情况下，所提供的置信水平可能与样本的质
量、数据的质量、分析的质量、所使用的特定方法和/或所分析的SNP和任选地CNV的数目有关。用于提供诊断的指定的置信水平可以在假阳性或假阴性的预期数目和/或成本的基础
上选择。选择用于达成指定的置信水平或用于鉴别具有诊断力的标志物的参数的方法包括
(但不限于)接受者工作特征(ROC)曲线分析、双正态ROC、主分量分析、优势比分析、偏最小二乘分析、奇异值分解、最小绝对值收缩和选择算子分析、最小角回归以及阈值梯度导向正则化方法。

[0095] 在一些情况下，SNP和CNV检测可以经由应用经过设计以标准化和/或改善数据的可靠性的算法来改善。在本公开的一些实施方案中，数据分析由于所处理的大量个别数据
点而需要用于应用本文所描述的各种算法的计算机或其它装置、机器或设备。“机器学习算法”指的是基于计算的预测方法，也被本领域的技术人员称为“分类器”，用于表征SNP或SNP/CNV型态。在一个实施方案中，通过例如基于微阵列的杂交试验获得的对应于某些SNP
或SNP/CNV的信号经受算法以将型态归类。监督式学习一般涉及“训练”分类器以识别种类(例如，ASD阳性、ASD阴性、特定的ASD亚型)当中的区别并且然后在独立测试集上“测试”分类器的准确性。对于新的未知样本，分类器可以用于预测样本所属的种类(例如，ASD阳性、ASD阴性、特定的ASD亚型)。

[0096] 在一些实施方案中，稳健多阵列平均(RMA)方法可以用于标准化原始数据。RMA方法通过计算许多微阵列上的每个匹配单元的背景校正强度而开始。在一个实施方案中，背
景校正值局限于如Irizarry等(2003)《.生物统计学(Biostatistics)》4月4日(2):249-64
(出于所有目的以其全文引用的方式并入)所描述的阳性值。在背景校正之后，然后获得每
个背景校正的匹配单元强度的以2为底的对数。然后使用分位数标准化方法来标准化每个
微阵列上的背景校正、对数变换的匹配强度，其中对于每个输入阵列和每个探针值，阵列百分位探针值被所有阵列百分位点的平均值替换，这种方法由Bolstad等《生物信息学
(Bioinformatics)》2003(以其全文引用的方式并入)更全面地描述。在分位数标准化之后，然后可以使标准化的数据与线性模型拟合以获得每个微阵列上的每个探针的强度量度。然
后可以使用杜凯氏中位数平滑算法(Tukey's median polish algorithm)(Tukey,J.W.,
《探索性数据分析(Exploratory Data Analysis)》.1977，以其全文引用的方式并入)确定标准化的探针组数据的对数级强度水平。

[0097] 可以执行各种其它软件程序。在某些方法中，可以通过使用glmnet以lasso惩罚进行逻辑回归来进行特征选择和模型估计(Friedman等(2010)《. 统计软件杂志(Journal of statistical software)》33(1):1-22，以其全文引用的方式并入)。可以使用TopHat比对原始读出(Trapnell等(2009)《. 生物信息学(Bioinformatics)》25(9):1105-11，以其全文引用的方式并入)。在方法中，顶部特征(N在10至200的范围内)用于使用e1071文库(Meyer D.支持向量机：程序包中与libsvm的界面(Support vector machines:the interface to
libsvm in package)e1071.2014，以其全文引用的方式并入)训练线性支持向量机(SVM)
(Suykens JAK,Vandewalle J.最小二乘支持向量机分类器(Least Squares Support
Vector Machine Classifiers)《. 文字的神经处理(Neural Processing Letters)》1999；9(3):293-300，以其全文引用的方式并入)。可以使用pROC包计算置信区间(Robin X,Turck N,Hainard A等pROC：用于R和S+以分析和比较ROC曲线的开源包(pROC:an open-source
package for R and S+to analyze and compare ROC curves)《. BMC生物信息学(BMC
bioinformatics)》2011；12:77，以其全文引用的方式并入)。

[0098] 另外，可以过滤数据以去除可能被认为可疑的数据。在一些实施方案中，来源于具有少于约4个、5个、6个、7个或8个鸟苷+胞嘧啶核苷酸的微阵列探针的数据由于其异常的杂交倾向或二级结构问题而可能被认为是不可靠的。类似地，来源于具有多于约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个鸟苷+胞嘧啶核苷酸的微阵列探针的数据由于其异常的杂交倾向或二级结构问题而可能被认为是不可靠的。

[0099] 在本发明的一些实施方案中，来自探针组的数据如果在可检测水平上(高于背景)不能鉴别，那么其可以从分析中排除。

[0100] 在本公开的一些实施方案中，不展现或展现低方差的探针组可以从进一步分析中排除。低方差探针组经由卡方检验(Chi-Square test)从分析中排除。在一个实施方案中，如果探针组的变换方差在具有(N-l)自由度的卡方分布(Chi-Squared distribution)的
99％置信区间的左边，那么这个探针组被认为是低方差。(N-l)×探针组方差/(基因探针组
方差)。关于Chi-Sq(N-l)，其中N是输入CEL文件的数目，(N-l)是卡方分布的自由度，并且“基因的探针组方差”是跨越基因的探针组方差的平均值。在本发明的一些实施方案中，给定的SNP或SNP群组的探针组如果含有少于最少数目的通过先前所描述的GC含量、可靠性、
方差等过滤步骤的探针，那么其可以从进一步分析中排除。举例来说，在一些实施方案中，给定的基因或转录物聚类的探针组如果含有少于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或少于约20个探针，那么其可以从进一步分析中排除。

[0101] SNP和任选地CNV数据分析的方法可以进一步包括如本文所提供的特征选择算法的使用。在本发明的一些实施方案中，特征选择通过使用LIMMA 软件包而提供(Smyth,G.K.
(2005).Limma：微阵列数据的线性模型(Limma:linear models for microarray data).
《使用R和生物导体的生物信息学和计算生物学解决方案(Bioinformatics and
Computational Biology Solutions using R and Bioconductor)》,R.Gentleman,
V.Carey,S.Dudoit,R.Irizarry,W.Huber(编),Springer,New York,第397-420页，出于所
有目的以其全文引用的方式并入)。

[0102] SNP和任选地CNV数据分析的方法可以进一步包括预分类器算法的使用。举例来说，算法可以使用特定的分子指纹以根据其组成将样本预分类并且然后应用校正/标准化
因子。然后可以将这个数据/信息输进最终分类算法中，这个算法将合并那个信息以有助于最终诊断。

[0103] SNP和任选地CNV数据分析的方法可以进一步包括如本文所提供的分类器算法的使用。在本发明的一些实施方案中，提供对角线线性判别分析、k最近邻算法、支持向量机(SVM)算法、线性支持向量机、随机森林算法或基于概率模型的方法或其组合用于微阵列数据的分类。在一些实施方案中，区分样本(例如，区分ASD阳性与正常)的所鉴别的标志物是基于所关注的种类之间的表达水平的差异的统计显著性来选择。在一些情况下，统计显著
性通过应用假发现率(FDR)的本杰明-霍奇伯格(Benjamin Hochberg)或另一种校正来调
整。

[0104] 在一些情况下，分类器算法可以用元分析方法补充，诸如由Fishel和Kaufman等2007《生物信息学(Bioinformatics)》23(13):1599-606(出于所有目的以其全文引用的方
式并入)所描述。在一些情况下，分类器算法可以用诸如可重复性分析的元分析方法补充。

[0105] 得出事后概率并且将其应用于微阵列数据分析的方法在本领域中是已知的并且已经描述于例如Smyth ,G .K .2004《遗传学和分子生物学统计应用
(Stat.Appi.Genet.Mol.Biol.)》3:第3节(出于所有目的以其全文引用的方式并入)中。在
一些情况下，事后概率可以用于本发明的方法中以将分类器算法所提供的标志物分级。

[0106] 分子分型的结果的统计评价可以提供指示以下一者或多者的定量值：ASD的诊断准确的可能性；特定ASD(例如，自闭性障碍对比AS)的可能性；特定治疗性干预成功的可能性。在一个实施方案中，数据以其最有用的形式直接呈递给医师以指导患者护理。分子分型的结果可以使用本领域中已知的许多方法在统计上评价，包括(但不限于)：司徒登氏T检验(students T test)、双侧T检验、皮尔森秩和分析(pearson rank sum analysis)、隐马尔可夫模型分析(hidden markov model analysis)、q-q图分析、主分量分析、单因素ANOVA、两因素ANOVA、LIMMA等等。

[0107] 在一些情况下，准确性可以通过随着时间追踪受试者以确定原始诊断的准确性来确定。在其它情况下，准确性可以按确定的方式或使用统计方法来确立。举例来说，接受者工作特征(ROC)分析可以用于确定最佳试验参数以达成特定水平的准确性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或假发现率。

[0108] 在一些情况下，将SNP试验的结果加入数据库中以供分子分型业务的代表或代理商、个体、医疗提供者或保险提供者访问。在一些情况下，试验结果包括由业务的代表、代理商或咨询者，诸如医疗人员进行的样本分类、鉴别或诊断。在其它情况下，自动地提供数据的计算机或算法分析。在一些情况下，分子分型业务可以针对以下一者或多者给个体、保险提供者、医疗提供者、研究者或政府实体开账单：所进行的分子分型试验、咨询服务、数据分析、结果报告或数据库访问。

[0109] 在本发明的一些实施方案中，SNP分型的结果作为计算机屏幕上的报告或作为纸质记录而呈现。在一些实施方案中，报告可以包括(但不限于)诸如以下一者或多者的信息：
与参考样本相比所鉴别的SNP的数目、原始样本的适宜性、诊断、诊断的统计置信度、特定ASD的可能性以及所提议的疗法。

[0110] SNP分型的结果可以归类为以下之一：ASD阳性、特定类型的ASD、非ASD样本、或非诊断的(提供关于ASD的存在或不存在的不足信息)。

[0111] 在本发明的一些实施方案中，使用训练算法将结果归类。本发明的训练算法包括已经使用一组参考的已知ASD和正常样本，例如，来自诊断出具有特定的ASD亚型、ASD或未诊断出具有ASD(ASD阴性)的个体的样本开发的算法。在一些实施方案中，训练包括将来自
第一ASD阳性样本的SNP与第二ASD阳性样本中的SNP相比较，其中第一组SNP包括第二组中
没有的至少一个SNP，并且SNP选自表1、2、3、6或7中所提供的SNP。

[0112] 适用于样本分类的算法包括(但不限于)k最近邻算法、支持向量机、线性判别分析、对角线线性判别分析、上下法(updown)、朴素贝叶斯算法(naive Bayesian
algorithm)、神经网络算法、隐马尔可夫模型算法、遗传算法或其任何组合。

[0113] 当将生物样本归类用于ASD诊断时，通常存在来自二元分类器的两种可能的结果。当将二元分类器与实际真值(例如，来自生物样本的值)相比较时，通常存在四种可能的结
果。如果来自预测的结果是p(其中“p”是阳性分类器输出，诸如ASD或特定ASD的存在)并且实际值也是p，那么其被称为真阳性(TP)；然而，如果实际值是n，那么其被称为假阳性(FP)。
相反地，当预测结果与实际值都是n(其中“n”是阴性分类器输出，诸如无ASD)时真阴性已经出现，并且当预测结果是n而实际值是p时是假阴性。在一个实施方案中，考虑试图确定个人是否患有某种ASD的诊断测试。在这种情况下，当个人测试呈阳性，但实际上不患有ASD时假阳性出现。另一方面，当个人测试呈阴性，表明其健康时假阴性出现，此时其实际上确实患有疾病(ASD)。

[0114] 疾病的阳性预测值(PPV)或精确率或验后概率是正确诊断的具有阳性测试结果的受试者的比例。其反映了阳性测试反映所测试的基础病状的概率。然而，其值取决于疾病的流行率，这可能有变化。在一个实例中，提供以下特征：FP(假阳性)；TN(真阴性)；TP(真阳性)；FN(假阴性)。假阳性率(α)＝FP/(FP+TN)-特异性；假阴性率(β)＝FN/(TP+FN)-敏感性；
功率＝敏感性＝1-β；阳性似然比＝敏感性/(1-特异性)；阴性似然比＝(1-敏感性)/特异
性。阴性预测值(NPV)是正确诊断的具有阴性测试结果的受试者的比例。

[0115] 在一些实施方案中，主题方法的SNP分析的结果提供了所给出的诊断是正确的统计置信水平。在一些实施方案中，这样的统计置信水平为至少约或大于约85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高。

[0116] 在一个实施方案中，取决于SNP杂交试验和数据分析的结果，选择受试者用于特定ASD的治疗。

[0117] 在一个实施方案中，选择受试者用于典型自闭症的治疗。治疗包括例如基因疗法、RNA干扰(RNAi)、行为疗法(例如，应用行为分析(ABA)、单一尝试训练(DTT)、早期集中行为干预(EIBI)、关键反应训练(PRT)、言语行为干预(VBI)以及基于发育个体差异关系的方法(DIR))、物理疗法、职业疗法、感觉统合疗法、口语疗法、图片交换沟通系统(PECS)、膳食治疗以及药物(例如，抗精神病剂、抗抑郁剂、抗惊厥剂、刺激剂)。

[0118] 在另一个实施方案中，选择受试者用于阿斯伯格氏症的治疗。治疗包括例如基因疗法、RNAi、职业疗法、物理疗法、沟通和社会技能训练、认知行为疗法、口语或语言疗法以及药物(例如，阿立哌唑(aripiprazole)、胍法辛(guanfacine)、选择性血清素再吸收抑制剂(SSRI)、利培酮(riseridone)、奥氮平(olanzapine)、纳曲酮(naltrexone))。

[0119] 在一个实施方案中，选择受试者用于雷特氏症的治疗。治疗包括例如基因疗法、RNAi、职业疗法、物理疗法、口语或语言疗法、营养补充剂以及药物(例如，SSRI、抗精神病剂、β-阻断剂、抗惊厥剂)。

[0120] 在一个实施方案中，选择受试者用于CDD的治疗。治疗包括例如基因疗法、RNAi、行为疗法(例如，ABA、DTT、EIBI、PRT、VBI以及DIR)、感觉强化疗法、职业疗法、物理疗法、口语或语言疗法、营养补充剂以及药物(例如，抗精神病剂和抗惊厥剂)。

[0121] 在另一个实施方案中，选择受试者用于PDD-NOS的治疗。治疗包括例如基因疗法、RNAi、行为疗法(例如，ABA、DTT、EIBI、PRT、VBI以及DIR)、物理疗法、职业疗法、感觉统合疗法、口语疗法、PECS、膳食治疗以及药物(例如，抗精神病剂、抗抑郁剂、抗惊厥剂、刺激剂)。

[0122] 在一个实施方案中，选择治疗受试者用于基因疗法以校正、置换或补偿靶基因，例如，表1中的基因之一的野生型等位基因。

[0123] 在一个方面，本发明提供了一种诊断测试。在一个实施方案中，诊断测试包含一个或多个用于杂交试验中的寡核苷酸。一个或多个寡核苷酸经过设计以杂交至表1、2、3、6或7中所阐述的一个或多个SNP(例如，两个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、或二十个或更多个)。在另一个实施方案中，一个或多个寡核苷酸(例如，两个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、或二十个或更多个)存在于微阵列上。在一个实施方案中，诊断测试包含一个或多个装置、工具以及装备，其经过配置以收集来自个体的遗传样本。在诊断测试的一个实施方案中，收集遗传样本的工具可以包括拭子、解剖刀、注射器、刮刀、容器以及其它装置和试剂中的一者或多者，其经过设计以有助于遗传样本的收集、储存和运输。在一个实施方案中，诊断测试可以包括用于收集、稳定、储存和处理遗传样本的试剂或溶液。用于收集、稳定、储存和处理遗传物质的这样的试剂和溶液为本领域的技术人员所熟知。在另一个实施方案中，如本文所公开的诊断测试可以包含微阵列设备和相关试剂、流动池设备和相关试剂、多重下一代核酸测序仪和相关试剂，以及针对某些遗传标志物的存在分析遗传样本以及检测和显现某些遗传标志物所必需的额外硬件
和软件。

[0124] 实施例

[0125] 本发明通过参考以下实施例进一步说明。然而，应注意，这些实施例，如同上文所描述的实施方案一样，是说明性的并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。实施例中所引用的参考文献出于所有目的以其全文引用的方式并入。

[0126] 除了可以通过DNA测序而鉴别的单核苷酸变体和小插入/缺失以外，更大的缺失或重复(拷贝数变体、CNV)已经显示在ASD的病原学中起作用[15-27]。尽管观测到许多ASD易
感CNV继承自未受影响的亲本，但扩展的多代系谱的缺乏已经阻碍ASD易感CNV和SNP的分离
的全面分析以及其表达所必需的其它遗传因素的表征。Utah中可用的大家族结合家族成员
自愿参与遗传研究中已经得以鉴别孟德尔(Mendelian)与复杂疾病的大量疾病易感基因。

[0127] 这项研究中所用的系谱是先前所公布的70家族连锁研究的一部分[28]和评价这个集合的家族中的单个扩展系谱的两个更小研究[29、30]。在这个实施例中，通过进行单体型共享分析以鉴别潜在地具有ASD易感基因的染色体区域来分析26个扩展多代ASD家族和
四个两代多重ASD家族的成员。然后采用共享区域中的所有基因和额外的自闭症风险基因
的DNA捕获和测序以鉴别这些家族中可能易感ASD的SNP。在大的病例/对照研究中并且针对
这些家族中的分离来分析这些SNP。还评价这些家族中先前所报道的CNV的分离[27]。

[0128] 方法

[0129] DNA样本

[0130] 在这项研究中使用来自26个扩展多代和四个两代Utah多重ASD系谱的总共386个DNA样本。查明家族并且使用如先前所描述的Utah人口数据库(UPDB)募集[28]。如先前所描述[27]，使用自闭症诊断访谈修订版(ADI-R)和自闭症诊断观察量表(ADOS)针对家族性ASD
病例与无关ASD病例确定影响状态。每个系谱中受影响的个体的平均数是7.9。此处所描述
的系谱是先前所描述的那些的子组[28]。系谱细节示于表9中。

[0131] 先前在病例/对照研究中所描述的总共9,000个DNA样本[27]，包括3,000个ASD个体和6,000个对照，用于评价更广泛的群体中的这些变体。在犹他大学机构审查委员会
(Institutional Review Board，IRB)(犹他大学IRB#：6042-96)和费城儿童医院
(Children's Hospital of Philadelphia)IRB(CHOP IRB#：IRB 06-004886)批准的方法下
收集用于此处所描述的工作的所有样本。经由犹他大学精神科或费城儿童医院门诊部或
CHOP外展门诊部募集患者和其家族。在录入项目中之前使用IRB批准的同意书形式从参与
者或其父母获得书面知情同意书。对于选择不参与研究的个体或家族不存在歧视。匿名分
析所有数据并且根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)中所表述的原则进行所有
临床调查。

[0132] SNP微阵列基因分型

[0133] 使用制造商推荐的程序对全部386个DNA样本进行Affymetrix 250K NspI SNP芯片基因分型。由Affymetrix基因分型控制台软件使用BRLMM[31]基因型调用算法调用基因
型。只有调用率大于或等于99％的SNP用于进一步分析。使用PedCheck[32]也鉴别展示孟德尔错误的SNP并且将其排除在外。

[0134] 共享单体型分析

[0135] 对每个系谱进行共享单体型分析，以鉴别那个系谱中在受影响的个体当中具有显著共享的基因组区域。HapShare算法[33]用于基于孟德尔继承进行单体型定相并且鉴别共
享基因组区段。比较包括N个受影响的个体中的N个、N个中的(N-1)个、N个中的(N-2)个、N个中的(N-3)个等等(参看[33]中的图4)。在两代系谱中，在一些情况下，在所分析的所有受影响的个体中观测到单体型的共分离，但共享区域很大，包括多达一半的染色体。因此，不选择来自核心家族的共享区域用于测序，除非其与额外家族中所观测的区域重叠。

[0136] 定制靶向外显子组DNA测序

[0137] NimbleGen定制序列捕获阵列经过设计以捕获在转录起始位点上游的2,000个碱基对以及在共享基因组区段内的基因的所有外显子和外显子-内含子边界。来自单体型共
享区域外部的额外23个基因从文献中基于其在自闭症或神经元功能中的潜在作用而选择
(参看表10)。捕获总共约1,800个基因。由范德堡大学微阵列共享资源设施对来自显示基因组区段共享的11个家族的26个受影响的个体的DNA进行捕获和Illumina DNA测序。将短读
出与国家生物技术信息中心(NCBI)参考人类基因组构建36(GRCh36/hg18)比对，并且使用
表4中所描述的软件比对和变体调用方法调用变体[34-36]。选择通过至少两种方法检测的
潜在变体用于进一步分析。

[0138] 变体注释

[0139] 最初使用cSNP分类器，稍后并入VAAST[37]中的初步程序进行硅片内功能分析，以将变体归类为同义、保守性错义、非保守性错义、无义、框移或剪接位点突变。稍后，使用ANNOVAR程序[38]重注释变体。来自UCSC基因组浏览器的KnownGene和RefSeq基因踪迹用于
注释功能变体，并且LiftOver工具用于将人类基因组构建36(GRCh36/hg18)坐标转换成人
类基因组构建37(GRCh37/hg19)坐标[39、40]。

[0140] 定制微阵列设计和阵列处理

[0141] 先前描述了包括用于2,799个功能SNP的探针和7,134个CNV探针的定制iSelect InfiniumTM II BeadChip阵列(Illumina Inc.)的设计[27]。先前在费城儿童医院(CHOP)的应用基因组学中心(Center for Applied Genomics)对3,000个病例和6,000个对照样本处
理定制iSelect阵列[27]。

[0142] 相同的阵列还用于在犹他大学基因组学核心设施处分析来自196个Utah发现组群家族成员的DNA以供家族中SNP分离的变体验证和分析。

[0143] 阵列数据质量控制

[0144] 样本QC

[0145] 如果以下任一者是真实的，那么受试者从SNP分析中扣除：(1)在基因分型之后，DNA样本具有明显很差的质量，由极低调用率证明(N＝134)；(2)受试者被鉴别为三染色体
21(N＝51)；(3)受试者在通过主分量分析(PCA)鉴别的高加索受试者的中心聚类之外(N＝
903)[27]。

[0146] 亲缘关系估计进一步指示，病例受试者和对照中的一些是数据中所表现的具有多个亲属的家族的一部分。所使用的样本组群中的家族结构的再评价随后鉴别额外的关系。
因此，仅使用每个已知家族的一个成员进行后续关联测试以降低由于亲缘关系所致的统计
混淆的可能性。对于这些测试，选自每个家族的受试者是位于前两个主分量的中位数质心
最近处的个体。由于亲缘关系而去除的受试者的数目是688。这使得用于关联测试的最终样本集包含7326个受试者，其中1541个是病例并且5785个是对照。

[0147] 主分量分析(PCA)用于避免由于群体分层所致的人为结果。在Golden Helix SNP和Variation Suite(SVS)中使用默认设置计算主分量。所有受试者都包括于计算中，样本
QC不合格的那些除外。在计算主分量之前，根据以下标准过滤SNP：对于在50个SNP的移动窗口内的所有SNP对，仅常染色体，调用率>0.95，次要等位基因频率(MAF)>0.05，连锁不平衡R2<25％。2008个SNP，包括CNV分析所用的那些，用于主分量计算。没有基因型数据可用于参考群体。然而，自我报告的种族变量可用于大多数受试者。前两个主分量的图示出了受试者的主要中心聚类，其中离群组沿着两个轴延伸。这些大致对应于如在表型数据中自我报告
的亚洲人和非裔美国人祖先。应用简单的离群点检测算法以将受试者分层为代表最可能的
高加索人和非高加索人的两个组。这通过首先计算来自前两个主分量向量的中位数质心的
每个受试者的笛卡尔距离(Cartesian distance)来完成。在确定距离的第三四分位数(Q3)
和四分位数间距(IQR)之后，距离超过Q3+1.5×IQR的任何受试者被确定为在主聚类之外，
并且因此是非高加索人。682个受试者处于非高加索人类别中。先前报道了这个PCA分析的
结果的图形表示[27]。

[0148] SNP质量控制(QC)

[0149] 在关联测试之前，评价SNP的调用率、哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)以及等位基因频率。调用率低于99％的所有SNP从进一步分析中去除。没有SNP具有显著的哈迪-温伯格不平衡(Hardy-Weinberg disequilibrium)。

[0150] SNP和CNV的实验室确认

[0151] 对于SNP的分子验证，首先通过LightScanner高分辨率熔解曲线分析(BioFire Diagnostics Inc.)针对序列变体的存在来筛选PCR产物。PCR引物序列示于表3中。使用桑
格法对给出异常溶解型态的任何样本进行测序以确认序列变体的存在。对于CNV，如先前所描述使用预先或定制设计的TaqMan拷贝数试验(Applies Biosystems Inc.)[27]。

[0152] 蛋白质结合试验

[0153] 如先前所描述表达和纯化所有GST标记的蛋白质[41]。为了测试Rab11FIP5与各种Rab GTPase的结合，在1μm GMP-PNP存在下将纯化的重组FIP5(490-653)或FIP5(490-653)-P652L与涂布有GST、GST-Rab11a、GST-Rab4a或GST-Rab3a的谷胱甘肽小珠一起孵育。然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤小珠并且用1％SDS洗脱。然后通过用抗Rab11FIP5抗体进行免疫印迹
针对FIP5(490-653)的存在来分析洗脱液。还使用类似的试验测试Rab11FIP5(野生型或
P652L突变体)二聚的能力。

[0154] 转铁蛋白再循环的流式细胞术分析

[0155] 为了测试Rab11FIP5-P652L突变体对内吞再循环的影响，如先前所描述使用转铁蛋白再循环试验[42]。简单地说，将表达野生型FIP5-GFP或FIP5-GFP-P652L的HeLa细胞与
偶联至Alexa488的转铁蛋白一起孵育。然后洗涤细胞并且与血清补充的培养基一起孵育不
同的时间量。通过流式细胞术分析细胞相关(未再循环)的Tf-Alexa488。

[0156] 结果

[0157] 为了鉴别多重ASD家族中易感ASD的基因，采取单体型共享/定制DNA捕获和测序方法。采取图1中所概述的工作流程，首先鉴别在多重ASD家族中受影响的个体当中过度共享
的染色体区域。然后使用序列捕获以鉴别处于共享区域中的基因中的潜在功能序列变体，
以及鉴别额外的ASD基因。最后，评价ASD家族中的那些变体的分离，并且在一大组ASD病例和一大组对照中确定其流行率。这个工艺的细节描述于下文。

[0158] Affymetrix 250K SNP基因分型和单体型共享

[0159] 对来自26个扩展多代和4个两代Utah多重ASD系谱的386个DNA样本进行SNP基因分型。不具有映射位置的SNP不包括于分析中。对于整个数据集的平均调用率是99.1％。

[0160] HapShare方法[33]用于鉴别在我们研究的30个系谱中的每一者中受影响的个体当中具有显著共享的基因组区域。基于孟德尔继承仅使用信息标志物确定父系和母系单体
型。然后在每个扩展或核心家族内受影响的个体当中比较这些单体型。基于扩展系谱中的
共享选择单体型共享的十八个区域用于进一步分析。我们在受影响的个体当中观测到的共
享程度和选择用于DNA捕获和测序的区域的坐标示于表5中。基于所公布的连锁分析使用一
组重叠的家族选择两个额外的区域用于DNA捕获和测序[28]。

[0161] 序列捕获、序列分析以及变体鉴别

[0162] 使用来自显示基因组区段的最佳共享的11个家族的26受影响的个体的DNA进行捕获和DNA测序。这些样本包括来自具有与扩展系谱中所鉴别的区域重叠的共享单体型的两
代系谱的个体。八百万至九百万个36碱基短读出获自每个样本。短读出与国家生物技术信
息中心(NCBI)参考人类基因组构建36的比对揭示经过设计的捕获区的86％至97％的覆盖
率，其中在经过设计的捕获区上的平均读出深度是30至47X。

[0163] 以定向方式构造捕获文库，所有捕获探针代表相同的DNA股，并且仅从一个方向对文库进行测序。因此，可能存在一些基因中未检测到的额外变体。举例来说，在分离至染色体2和14上的系谱10中的所有受影响的个体的单体型上未鉴别到变体(图7A和7B、图15)。尽管如此，使用表4中所示的三种方法的变体调用鉴别超过一百万个通过三种方法中的至少
两种调用的序列变体。使用cSNP分类器的分析得以检测2,825个SNP，包括210个无义变体、
1,614个非保守性错义变体、35个框移变体以及966个剪接位点变体。

[0164] 定制微阵列经过设计以评价通过测序鉴别的变体以便(1)询问发现家族中的整组功能SNP以供验证，和(2)进行大规模病例/对照研究以确定变体中的任一者是否鉴别对患
有ASD的儿童的广泛群体重要的易感基因(图1)。在阵列设计和制造之后，成功地创建用于
2,413个变体的探针。Utah发现和CHOP病例/对照样本的定制微阵列实验揭示2,413个变体
中的584个是多态的。多态变体的完整清单示于表11中。剩余的阵列探针(1,829个变体)并
未检测非参考序列等位基因。因此，这1,829个变体由于单一末端序列数据的变体调用和比对工艺被解释为假阳性。

[0165] 在病例/对照研究中使用等位基因关联测试来测试所有常染色体SNP变体与自闭症的关联。使用费希尔氏精确检验(Fisher's exact test)与卡方检验评估每一者的统计
显著性。等位基因关联测试检测与作用方向无关的任何显著结果。十一个SNP(参看图8中的聚类)是病例所特有的或具有大于1.5的优势比(次要等位基因)(表6)。基于1.5的优势比截
止优先考虑在病例/对照研究中所观测的变体用于额外的工作。还包括病例所特有的变体。
选择这种方法而不使用p值，因为这些变体太罕见以致无法基于p值选择，并且对于相对罕
见的疾病，优势比大约相当于相对风险值。另外，仅在Utah发现组群中而非CHOP病例或对照中检测到28个SNP(表7)。这28个SNP被认为是潜在的ASD风险等位基因，这是因为(i)其在一般群体中是罕见的或不存在并且因此可以代表“私有突变”，(ii)其可能影响蛋白质功能，以及(iii)其分离至高风险自闭症系谱中的一个或多个患有自闭症的儿童。因此，在36个不同基因中发现的这39个SNP被表征为潜在的自闭症风险变体。这39个变体中的每一者定位
至我们的靶向区域(表5)，并且预测39个变体中的30个通过至少一个嵌入ANNOVAR[35]中的
程序，包括SIFT、Polyphen2、LRT以及MutationTaster而损坏。这些变体的分析的细节示于表12中。通过PCR扩增子的桑格DNA测序进一步确认全部39个SNP(对于序列色谱图，参看图
9-10)。用于变体注释的转录物在表12中找到。

[0166] 高风险系谱中变体的分离

[0167] 为了确定所鉴别的变体的潜在显著性，提高相关系谱中这些变体的分离模式。在选择个体用于DNA捕获和测序的11个系谱中的10个中鉴别潜在有害的序列变体。系谱中的
几个分离多于一个变体，指示高风险ASD系谱中的基础遗传学的复杂性。此外，这些系谱中有许多还具有在先前的工作中鉴别的CNV[27]。增添遗传复杂性，这些CNV中有许多还分离
至受影响的个体。此处示出了展示这些复杂继承模式的五个家族(图2-6)。具有多个变体的五个额外系谱示于图11-15中。

[0168] 系谱1(图2)示出了共分离RAB11FIP5中的错义变体的两代家族(表7)。这个变体存在于母体中并且分离至家族中全部三个男性受影响的儿童，并且不分离至未受影响的女性
儿童。RAB11FIP5先前基于其在诊断出待分类的广泛性发展障碍(PDD-NOS)的10岁男性儿童
中观测到的易位而破坏已经作为ASD风险基因牵涉在内[41]。在系谱1中检测的变体引起
P652L取代。脯氨酸在迄今测序的所有哺乳动物RAB11FIP5基因中的这个残基处保守，表明
其对于蛋白质功能是重要的。在病例/对照研究(表6)中使用定制微阵列检测具有P652H变
体的第二个体。P652L取代和P652H取代在ESP6500、1000个基因组项目或dbSNP137数据库中都未观测到(表12)。通过桑格测序确认这些变体中的每一者(对于色谱图，参看图9-10)。非欧洲血统并且因此不包括于病例/对照研究中的额外受影响的个体也携带P652H变体(数据
未示出)。患有自闭症并且不在任何对照中的额外个体中P652H变体的存在进一步支持
RAB11FIP5中的变体对自闭症风险有贡献的可能性。

[0169] 系谱2(图3)是具有来自两个父体的六个受影响的个体的两代家族。在这个系谱中，六个受影响的个体中的五个继承C14orf2中引起I26T取代的变体。两个额外的序列变
体，在PDK4和SDR39U1基因中各一个，分别分离至三个和两个受影响的个体。另外，先前所描述的CNV增益(OR＝3.37)[27]存在于一个受影响的个体中。C14orf2和PDK4变体母系继承，
而C7orf10和CNV是父系起源的或作为新生变体出现。在这个家族中检测的变体当中，在我
们的病例/对照研究中仅观测到C7orf10变体。然而，这个变体具有1.62的优势比(95％置信区间1.04-2.53)，表明在一般群体中易感自闭症中起作用的可能性。

[0170] 系谱3(图4)也是两代家族，具有五个受自闭症影响的男性儿童。在这个系谱中，五个受影响的个体中的四个展现KLHL6基因中F154L变体的母系继承。这个A/G核苷酸变体也在外显子的第一核苷酸处发现并且因此也可能影响KLHL6主要转录物的剪接。除了这个变
体以外，五个后代中的三个具有SPATA5L1基因中父系继承的D303H错义变体，而五个中的两个也具有ITPK1基因中母系继承的P238L变化。一个受影响的儿童并不继承这些变体中的任
一者。值得关注的是，在群体研究中在任何病例或对照中未观测到在这个小家族中观测到
的变体，表明其不是常见的自闭症易感基因座。

[0171] 系谱4(图5)是具有全部7个受自闭症影响的男性儿童的共同祖先的六代家族。这些儿童全部处于系谱的第五或第六代中。先前使用Affymetrix10K SNP基因型数据对这个
家族进行连锁分析[29、30]，并且鉴别显著连锁的三个区域。这些包括3q13.2-q13.31、
3q26.31-q27.3以及20q11.21-q13.12。在这项研究中通过单体型共享也鉴别这三个区域
(图5，对于染色体20单体型共享，参看图7C)。这个家族中七个受影响的个体中的四个共享P49L变体，这是染色体20q11.21上DEFB124基因中的A/G转换的结果，与我们所观测的单体
型共享(图7c)并且与所公布的连锁结果一致。在我们的群体研究中在病例或对照中未观测
到这个变体。这个系谱中一个受影响的个体并不共享DEFB124变体，而替代地具有从其父体继承的染色体3q增益CNV，在我们的先前研究中具有3.74的优势比[27]。提高的优势比表明这个CNV是自闭症风险基因座。

[0172] 系谱4中两个额外受影响的个体不携带在我们的家族中所检测的任何变体。然而，如图5中所指示，这两个个体中的每一个从具有自闭症的强家族史的结婚配偶遗传，表明额外未检测的变体的可能性。

[0173] 最后，一个携带DEFB124变体的受影响的个体携带HEPACAM2基因(在我们的群体研究中优势比1.83，表6)、AP1G2基因(优势比1.67、表6)、PYGO1基因以及RELN基因中的变体。
RELN变体和PYGO1变体在病例/对照研究中都未观测到(表7)。RELN中的纯合或复合杂合突
变与无脑回症相关联[44、45]，但这个RELN缺失是具有可能归因于这个基因座处的单倍不
足的发育表型的个体的首次描述。

[0174] 系谱5(图6)是具有九个受自闭症影响的个体(7个男性、2个女性)的四代家族。两个变体在这个家族中特别受关注。第一个是包括NRXN1α基因的5'侧接区域的CNV。这个CNV从在第二代的家族中结婚的父体继承。这个CNV分离至诊断患有自闭症的这个个体的四个
后代中的三个。重叠的NRXN1αCNV在我们的先前工作中显示具有14.96的优势比[27]，与表明NRXN1α相关变体在自闭症以及其它神经病症中的作用的先前工作一致[46-48]。然而，那个CNV显示延伸至NRXN1α的编码区域中，而TaqMan CNV分析展示系谱5中的CNV并不如此(数据未示出)。因此，在这个家族中所观测的NRXN1αCNV的显著性是不确定的。

[0175] 在由家族的两个分支中的全部五个受影响的个体共享的单体型上发现的在这个家族中鉴别的第二变体(图7c)是引起R3233C错义取代的AKAP9基因中的C/T转换。家族的这
两个分支中无一个体携带NRXN1αCNV。在我们的群体研究中在4/1541病例和4/5785对照中
观测到AKAP9变体(3.76的优势比，95％置信区间0.94-15.03)(表6)。在核心家族中单个受
影响的个体中观测到AKAP9基因中的第二错义变体(系谱6，图11)。在病例/对照研究中未观测到这个第二AKAP9变体(表7)。蛋白质的AKAP家族已经表明连接神经系统发育中所涉及的
不同生物路径[49]。

[0176] 系谱5还分离由多个受自闭症影响的儿童继承的其它变体。系谱的一个分支分离引起P158A错义取代的CLMN基因中的G/C颠换。这个变体在我们的病例/对照研究中得到
1.67的优势比(95％置信区间0.73-3.84)，表明其为ASD风险等位基因。在家族的单个分支
中两个受影响的个体中观测到ABP1基因中的变体，也是G/C颠换的结果并且引起R345P错义
取代。这个变体母系继承并且在系谱中别处不可见。然而，这个变体在群体研究中在1/1541病例和0/5785对照中观测到(表6)并且在ESP6500、1000个基因组或dbSNP137数据库中未观
测到(表12)，指示其可能是很罕见的ASD风险变体。最后，引起R64L错义取代的ALX1基因中的G/T颠换由单个个体父系继承。这个变体也在系谱7中可见(图12)并且在我们的群体研究
中多次观测到(27/1541病例和58/5785对照)，得到1.75的优势比(95％置信区间1.11-
2.77)(表6)。这个基因的表达还可以通过与易位分离的具有智力迟钝、语言迟缓以及小头
畸形的家族中的下游平衡易位而增加[50]。

[0177] 系谱8-10示于图13-15中。这些系谱之一，系谱10，携带两个单体型(染色体2和14)，其分离至全部六个受影响的个体(图7a-7b)。由这些区域包涵的基因的测序并不鉴别
潜在的致病变体。这可能归因于基因的一些部分的较差序列覆盖率。然而，这些家族中受影响的个体的测序得以鉴别可以是自闭症风险等位基因的变体。这些变体之一，引起单个受
影响的个体中所观测到的MOK基因中的Q22*变化并且从其父体继承的G/A转换，在我们的群
体研究中观测到并且得到3.76的优势比(95％置信区间0.53-26.67)(表6)。还鉴别系谱8-
10中的其它变体(图13-15)，包括仅在Utah家族中所见的一些和在家族中与我们的群体研
究中所见的其它者。这些变体包括于表6和表7中。

[0178] RAB11FIP的功能分析

[0179] 为了揭露Rab11FIP5-P652L变体的功能结果，Rab11FIP5结合至Rab11。Rab11是介导Rab11FIP5募集至内吞膜并且为Rab11FIP5功能所需的小单体GTPase，对其进行评价
[41]。如图16A中所示，P652L取代并不影响Rab11FIP5结合至Rab11，也不影响其对
Rab11GTPase的特异性。先前显示Rab11FIP5形成同型二聚体并且其二聚的能力也为
Rab11FIP5细胞功能所需[41]。因此，测试P652L取代对Rab11FIP5二聚能力的影响。如图16B中所示，Rab11FIP5-P652L突变体仍然能够形成二聚体。与体外结合数据一致，FIP5-GFP-
P652L在HeLa细胞中的内吞定位也不受影响(图16B-16E)。

[0180] 已经报道Rab11FIP5通过调控内吞再循环而发挥功能[51]。为了那个目的，测试Rab11FIP5-P652L对HeLa细胞中转铁蛋白受体的再循环的潜在影响。发现P652L取代并不改
变再循环(图16H)。因此，未检测到Rab11FIP5-P652L取代的功能结果，表明核心Rab11FIP5特性不受影响。

[0181] 采用基于鉴别两代至六代ASD家族中继承的遗传变体的发现/验证策略，继之以来自患有自闭症的无关儿童和正常发育的儿童的DNA样本中的那些变体的病例/对照分析以
鉴别家族性ASD易感基因。使用单体型分析鉴别家族内共享的基因组区段，并且DNA测序和
CNV分析用于鉴别那些单体型上的潜在致病突变。随后采用大的病例/对照研究以确定我们
所鉴别的变体中的任一者是否可能在患有ASD的个体的一般群体中起作用。

[0182] 先前显示基于家族的发现组群中CNV的鉴别可以鉴别与一般ASD群体相关的拷贝数变体[27]。

[0183] 鉴别可能影响蛋白质功能的39个SNP，其具有表明在易感ASD中的作用的分离模式和ASD病例等位基因频率。这些变体中的三十一个引起非保守性氨基酸取代，预测五个影响剪接(预测这些当中的3个影响剪接与蛋白质编码)，并且三个引入提前终止密码子。在
AKAP9基因和JMJD7(或JMJD7-PLA2G4B融合基因)中鉴别两个变体，并且鉴别影响RAB11FIP5
基因中的相同氨基酸残基的两个不同变体，因此总的来说这些SNP鉴别36个潜在的ASD风险
基因。

[0184] 除了两代家族以外，并且与我们的单体型共享结果一致，没有作为ASD易感基因座牵涉在内的序列变体或CNV分离至系谱中所有受影响的个体。这与先前的遗传研究一致，这些研究迄今不能展示扩展家族中单个ASD风险基因座的分离(例如参看[52])。在系谱5(图
6)中，两个独立的风险变体，AKAP9中的单个核苷酸变体和NRXN1中或附近的缺失CNV，分离至家族的不同分支。在这个家族中患有ASD的个体中还发现其它风险变体，包括在我们的群体研究中具有大于1.5的优势比的两个序列变体。这些结果表明甚至在可能预测分离具有
降低的外显率的单个风险等位基因的扩展家族中，不同ASD易感基因座中的多个风险等位
基因可能是必需的。结果进一步表明应小心探讨当评价大家族中的自闭症遗传学时特定继
承模型的使用。

[0185] 在我们的高风险家族中所鉴别的十一个自闭症风险变体由来自我们的病例/对照研究的数据进一步支持。这些变体中的三个各自在单个ASD病例(出自1541个总病例)中可
见并且在5785个对照中无一可见。我们在八个额外基因中检测的家族性变体在ASD病例中
比在对照中更常见，并且各自具有大于1.5的优势比。尽管这些变体是罕见的(在我们的病
例/对照研究中全部具有<0.01的频率)，但其在我们的ASD家族中受影响的个体中的鉴别和
其在无关受影响的个体中增加的流行率支持其作为ASD风险基因座的作用。

[0186] 若干有趣的观测结果来自于这36个基因和其编码的蛋白质中的每一者的功能和机械作用的大量文献综述。许多基因先前已经与自闭症或其它神经病症相联系或具有已知
的神经功能(表8)(36个基因中的11个，或31％)。若干其它基因的功能属于通常被引述为与自闭症具有相关性的路径。这些包括编码具有免疫功能(发炎反应)的蛋白质的基因，和编
码对能量代谢和线粒体功能重要的蛋白质的基因。这些群组占清单上的36个基因中的19个
(53％)。其它基因具有尚未开发的功能，仅可以与基于序列相似性的功能相联系，或在许多其它细胞或生物体过程，诸如细胞周期控制、血管生成、蛋白质降解或金属蛋白酶活性中具有零散作用。

[0187] RAB11FIP5

[0188] RAB11FIP5是RAS GTPase的支架蛋白的家族Rab11的成员。具体地说，RAB11FIP5已经表征为顶端内涵体再循环、质膜再循环以及胞吞转运中的关键作用物[55、56]。我们鉴别在六个成员的家族中三个受影响的同胞中的P652L变体，其中母体是未受影响的P652L携带
者。在1/1541高加索ASD病例和正常发育的0/5785高加索儿童中还检测到引起P652H取代的
额外变体(表6)。这些变体修改RAB11FIP5的C端内的保守脯氨酸。

[0189] 先前在具有仅破坏RAB11FIP5基因的平衡易位[46，XY，t(2；9)(p13；p24)]的十岁男孩中观测到RAB11FIP5的杂合破坏[41]。这个个体具有自闭症谱系障碍PDD-NOS的临床诊断。这种易位促使作者提出RAB11FIP5的单倍不足对受试者的ASD有贡献[43]。已经在突触
前与突触后致密物中检测到与RAB11和其存在紧密相结合的RAB11FIP5工作，其中Rab11在
确定长期抑郁的突触强度中起关键作用[57]，调控去甲肾上腺素转运体运输[58]，实现突
触谷氨酸受体再循环[59]，并且响应BDNF调控树突分支[60、61]。所有这些功能已经表明是ASD的病原学的显著贡献者[62、63]并且进一步支持突变在作为ASD风险等位基因的
RAB11FIP5中的作用。

[0190] AKAP9

[0191] AKAP9是充当PKA、其效应物以及磷酸化标靶的支架伴侣的超过50个蛋白质的家族的成员。AKAP9，也称为Yotiao，主要在心脏和脑中表达，其中编码的蛋白质充当PKA、蛋白磷酸酶I、NMDA受体、心脏钾通道亚单位KCNQ1、IP3R1以及特定同种型的腺苷酸环化酶的支架[64-68]。由AKAP介导的这些多聚蛋白支架的亚细胞定位和组装据信是功能所必需的，因为AKAP与其效应物之间的相互作用的破坏导致活性损失。在KCNQ1的情况下，AKAP9与KCNQ1之间的相互作用的损失导致潜在致命的心脏病状、长QT综合症，其也在KCNQ1本身的功能损失突变的情况下发生[69]。

[0192] 我们鉴别AKAP9基因中的两个变体。这些变体引起编码的蛋白质中的R3233C和R3832C取代。这两个变体与自闭症一致并且在两个无关扩展ASD系谱中发现(图6、图11)。
R3233C变体另外在我们的病例/对照研究中发现。从五个主要自闭症GWAS研究鉴别的基因
和从替代性方法产生的自闭症候选基因的新近元研究，诸如大规模CNV研究，将AKAPS列为
连接由生物信息学鉴别的许多路径的中心整合基因家族[49]。给出其在定位突触后支架中
的PKA、腺苷酸环化酶同种型以及NMDAR中的作用，AKAP9代表如同其更好表征的配对物
AKAP5一样，可以在突触传递和可塑性、谷氨酸能受体功能调控和再循环以及树突棘形态中发挥功能的蛋白质[70]。

[0193] 含有潜在的ASD风险等位基因的两个基因(MOK、TRPM1)由我们的先前研究中所观测的风险CNV部分或完全包涵[27]。这表明相同的基因可能受具有相同或相似的表型结果
的不同遗传机制影响。含有这些基因的CNV两者都是拷贝数损失。此处所描述的MOK序列变
体是无义变化，而TRPM1变体是错义变化。这些结果与归因于这两个基因座处的单倍不足的MOK和TRPM1作用一致。

[0194] 尽管自闭症的可遗传性相当高，但我们的数据显示众多遗传变体甚至在单一家族中仍可能赋予ASD风险。这个发现与全基因组测序研究的结果一致，这项研究使用隐性模型与模型非依赖性分析以鉴别具有两个受影响的个体的ASD家族中的若干潜在ASD风险变体
[71]。与迄今鉴别的大量潜在ASD风险基因一致，这个单一多重ASD[71]家族中鉴别的基因
中无一与我们的研究中鉴别的基因重叠。我们的研究通过鉴别30个2-6代高风险ASD家族中
的单体型共享区域中的序列变体而增添这种复杂性。我们的数据进一步展示在很大的多代
家族中，额外的风险变体从系谱中结婚的个体进入家族的可能性很高。

[0195] 这项研究首先使用经验方法以鉴别共享的基因组区段，继之以序列变体检测以鉴别一大组自闭症家族中潜在的ASD风险变体。鉴别584个在我们的高风险家族中可能易感自
闭症的非保守性错义、无义、框移以及剪接位点变体。鉴别36个基因中的39个DNA序列变体，其潜在地代表ASD风险基因。观测到这些变体中的十一个在一组1541个无关自闭症儿童和
5785个对照中具有大于1.5的优势比。RAB11FIP5、ABP1以及JMJD7-PLA2G4B基因中的三个变体各自在单个病例中而不在任何对照中观测到。这些变体在公共序列数据库中也不可见，
表明其可能是罕见的致病ASD变体。只有在高风险ASD家族中观测到二十八个额外的罕见变
体。总的来说，这39个变体将36个基因鉴别为ASD风险基因。在这些家族中先前检测的序列变体和拷贝数变体的分离揭示复杂的模式，其中仅RAB11FIP5变体分离至一个两代系谱中
所有受影响的个体。发现一些受影响的个体具有多个潜在的风险等位基因，包括序列变体
和CNV，表明这些家族中自闭症的高发病率可以由多个基因座处的变体最好地解释。

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detection of a de novo 2.8Mb deletion in2q24.2-->q24.3in a girl with autistic
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Akarsu NA.ALX1的破坏导致极端小眼畸形和严重面裂：扩展常染色体隐性ALX相关的额鼻
发育不良的谱系(Disruption of ALX1causes extreme microphthalmia and severe
facial clefting:expanding the spectrum of autosomal-recessive ALX-related
frontonasal dysplasia)《. 美国人类遗传学杂志(Am J Hum Genet)》.2010,86(5):789-
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E,Diallo O；S2D Group,Shekarabi M,Marineau C,Shevell M,Maranda B,Mitchell G,
Nadeau A,D'Anjou G,Vanasse M,Srour M,Lafrenière RG,Drapeau P,Lacaille JC,Kim
E等:与非综合症性智力残疾中的谷氨酸能系统相关的基因中的过量新生有害突变(Excess
of de novo deleterious mutations in genes associated with glutamatergic
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[0283] 表4：序列比对和变体检测方法.

[0284]

[0285] 表5：选择用于基于单体型共享进行测序的染色体区域.在给出多个数字的情况下，多个家族共享重叠的单体型。*指示第九个受影响的个体稍后未显示共享相同单体型的家族。

[0286]

[0287]

[0288] 表7：仅在高风险ASD家族中观测到的序列变体.*指示得到无义密码子的突变。使用标准单字母氨基酸命名。

[0289]

[0290] 表8.具有在ASD儿童中发现的变体的基因的生物功能/路径

[0291]

[0292] 表9

[0293] 30个Utah ASD家族的概述

[0294]

[0295] *注意，一些个体在家族之间重叠，因此基因分型的个体的总数小于这个表格中的总数。

[0296]

[0297]

[0298] 表11

[0299]

[0300]

[0301]

[0302]

[0303]

[0304]

[0305]

[0306]

[0307]

[0308]

[0309]

[0310]

[0311]

[0312]

[0313]

[0314]

[0315] *********

[0316] 虽然所描述的发明内容已经参考其特定实施方案加以描述，但本领域的技术人员应了解，在不脱离本发明的真正精神和范围的情况下可以作出各种改变并且可以替代等效
物。另外，可以作出许多修改以使特定的情形、物质、物质组合物、工艺、工艺步骤适于所描述的发明内容的客观精神和范围。所有这样的修改欲处于随附权利要求书的范围内。

[0317] 本文所参考的专利、专利申请、专利申请公布、期刊文章以及方案出于所有目的以其全文引用的方式并入。

标题	发布/更新时间	阅读量
螺-噁唑酮	2020-05-19	42
乙炔基衍生物	2020-05-23	457
7,8-二羟黄酮和7,8-取代的黄酮衍生物、组合物及其相关方法	2020-05-26	368
7,8-二羟黄酮和7,8-取代的黄酮衍生物、组合物及其相关方法	2020-05-26	331
含镁催产素制剂和应用方法	2020-05-15	432
一种自闭症谱系障碍诊断试剂盒	2020-05-11	178
19-去甲C3,3-二取代的C21-N-吡唑基类固醇及其使用方法	2020-05-17	789
用于诊断自闭症谱系障碍的组合物和方法	2020-05-13	330
螺-噁唑酮	2020-05-19	932
一种用于自闭症谱系障碍的监察耳机	2020-05-14	834

自闭症谱系障碍的诊断和预测

自闭症谱系障碍的诊断和预测

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