与胰腺导管腺癌相关的新型抗原和抗体
阅读：231发布：2023-03-05
专利汇可以提供与胰腺导管腺癌相关的新型抗原和抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了新型人类蛋白 抗原 以及相关的 抗体 ，已鉴定其特异性表达与人类胰腺 导管 腺癌(PDA)相关。特别的，已在转化的胰源细胞系中鉴定了α－烯醇化酶的新型磷 酸化 同种型，且PDA患者的血清中特异性存在结合这些同种型的抗体。这些蛋白和抗体可用于诊断和 治疗 PDA以及其他具有共同分子特征的癌症。，下面是与胰腺导管腺癌相关的新型抗原和抗体专利的具体信息内容。
1.一种人类α-烯醇化酶的同种型，其特征在于，其在至少3个 位点发生磷酸化。
2.根据权利要求1所述的同种型，其中，所述3个位点选自苏氨 酸55、酪氨酸57、酪氨酸200、酪氨酸236、苏氨酸237、酪 氨酸257和丝氨酸419。
3.一种抗体，其特异性结合权利要求1或2所述的α-烯醇化酶 的同种型。
4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆 抗体或抗体片段。
5.根据权利要求3或4所述的抗体，其特征在于，所述抗体融合 或结合于可检测的标记分子。
6.根据权利要求1或2所述的抗α-烯醇化酶的同种型、或者结 合权利要求1或2所述的抗α-烯醇化酶的同种型的抗体在诊 断胰腺导管腺癌中的应用。
7.用于诊断胰腺导管腺癌(PDA)的方法，包括检测权利要求1 或2所述的抗α-烯醇化酶的同种型、和/或检测结合权利要求 1或2所述的抗α-烯醇化酶的同种型的抗体。
8.用于诊断胰腺导管腺癌(PDA)的试剂盒，包含权利要求1 或2所述的抗α-烯醇化酶的同种型、和/或结合权利要求1或 2所述的抗α-烯醇化酶的同种型的抗体。
9.抗α-烯醇化酶的抗体在制备用于治疗胰腺导管腺癌的药物组 合物中的应用。
10.一种用于治疗胰腺导管腺癌的药物组合物，包含抗α-烯醇化 酶的抗体。
技术领域
本发明涉及用于诊断和治疗人类癌症，特别是胰源癌症的新手 段(means)。
背景技术
胰腺导管腺癌(PDA)是最常见的胰腺癌，而且，在美国和欧 洲，胰腺导管腺癌是癌症死亡的第四诱因。确诊后大多数患者在12 个月内死亡，存活5年的仅有2％。胰腺切除术仍然是PDA治疗和 化疗的基础，但其提供了边缘存活效益(marginal survival benefit) (Laheru D和Jaffee M，2005；Kleef J et al.，2006)。
尽管手术和药物治疗(包括采用单克隆抗体、疫苗和化疗)已 有所改进，但目前用于早期PDA诊断的标志物仍然极少且可信度 较差。最常用于胰腺癌诊断的血清标志物是唾液酸化的Lewis血型 抗原CA19-9，但其用途主要为了监测对治疗的反应而非PDA诊断。 实际上，在患良性胰腺疾病(例如慢性胰腺炎或胆道阻塞)的患者 血清中，该抗原也以较高浓度存在而提供假阳性，而且其不能应用 于所有的患者，因为其在5-10％的人群中根本不表达(Okusaka T et al.，2006)。
正是由于这些原因，人们正在评估用于PDA诊断的可替代性 生物标志物(或生物标记，biomarker)，目的在于减少介入性操作 如活组织检查和组织病理学评估(Bouvet M，2004；Brand R，2001； Goggins M，2005；Leung T et al.，2005)，以及用于评估候选药物 (Cohen S和Meropol N，2002；Jimeno A和Hidalgo M，2006)。
最近已采用多种技术利用大规模的蛋白表达分析(基于RNA 或蛋白水平)来鉴定候选的PDA生物标志物。特别地，通过比较 由双向凝胶电泳(或二维凝胶电泳，2-DE)所分辨的、由癌症患者 的血清抗体所识别的、以及利用质谱法所鉴定的蛋白，已经应用蛋 白质组学技术来检测PDA患者的血清中诱发体液应答的抗原(Gorg A et al.，2004；Graham D et al.，2005)。文献中以不同的名称描述了用 于蛋白质分离、选择和表征的方法的多种变型，如SERPA(Klade C et al.，2001)、PROTEOMEX(Lichtenfels R et al.，2003)、或SPEAR (Unwin R et al.，2003)。
这些方法学共同的作用前提是，通过表征对抗癌症特异性表达 的抗原的B细胞库(所谓的人类癌症免疫组)，应该能够确定在癌 症免疫监视(immunosurveillance)和免疫编辑(immunoediting)中 涉及的特异性靶标，并理解导致细胞增殖和转移失控的机制(Drake C et al.，2006；Dunn G et al.，2004)。
已表明免疫疗法是一种用于治疗胰腺癌的有用途径(Laheru D 和Jaffee M，2005)。事实上，已经根据其RNA水平的表达升高(WO 04/55519)，或者血清样品和/或胰腺样品的大规模蛋白质组学分析 (Bhattacharyya S et al.，2004；Cao D et al.，2005；Cecconi D et al.， 2003；Chen R et al.，2005；Gronborg M et al.，2006；Honda K et al.， 2005；Koomen J et al.，2005；Rodriguez J et al.，2005；Shen J et al.， 2004，Rosty C和Goggins M，2005；Sinha P et al.，1999；Yu Y et al.， 2005)而产生了一系列候选的PDA特异性蛋白。血清中用于PDA 诊断的候选蛋白为纤维蛋白原γ(Bloomston M et al.，2006)、 DEAD-Box蛋白48(Xia Q et al.，2005)、MIC-1(Koopmann et J al.， 2004)、PTH相关蛋白(Bouvet M et al.，2001)和钙网织蛋白(Hong S et al.，2004)。
然而，仍然需要用于PDA早期检测以及将其与其他胰腺病症 或癌症区分开的可靠的生物标志物。
尽管手术和药物治疗(包括采用单克隆抗体、疫苗和化疗)已 有所改进，但目前用于早期PDA诊断的标志物仍然极少且可信度 较差。最常用于胰腺癌诊断的血清标志物是唾液酸化的Lewis血型 抗原CA19-9，但其用途主要为了监测对治疗的反应而非PDA诊断。 实际上，在患良性胰腺疾病(例如慢性胰腺炎或胆道阻塞)的患者 血清中，该抗原也以较高浓度存在而提供假阳性，而且其不能应用 于所有的患者，因为其在5-10％的人群中根本不表达(Okusaka T et al.，2006)。
正是由于这些原因，人们正在评估用于PDA诊断的可替代性 生物标志物(或生物标记，biomarker)，目的在于减少介入性操作 如活组织检查和组织病理学评估(Bouvet M，2004；Brand R，2001； Goggins M，2005；Leung T et al.，2005)，以及用于评估候选药物 (Cohen S和Meropol N，2002；Jimeno A和Hidalgo M，2006)。
最近已采用多种技术利用大规模的蛋白表达分析(基于RNA 或蛋白水平)来鉴定候选的PDA生物标志物。特别地，通过比较 由双向凝胶电泳(或二维凝胶电泳，2-DE)所分辨的、由癌症患者 的血清抗体所识别的、以及利用质谱法所鉴定的蛋白，已经应用蛋 白质组学技术来检测PDA患者的血清中诱发体液应答的抗原(Gorg A et al.，2004；Graham D et al.，2005)。文献中以不同的名称描述了用 于蛋白质分离、选择和表征的方法的多种变型，如SERPA(Klade C et al.，2001)、PROTEOMEX(Lichtenfels R et al.，2003)、或SPEAR (Unwin R et al.，2003)。
这些方法学共同的作用前提是，通过表征对抗癌症特异性表达 的抗原的B细胞库(所谓的人类癌症免疫组)，应该能够确定在癌 症免疫监视(immunosurveillance)和免疫编辑(immunoediting)中 涉及的特异性靶标，并理解导致细胞增殖和转移失控的机制(Drake C et al.，2006；Dunn G et al.，2004)。
已表明免疫疗法是一种用于治疗胰腺癌的有用途径(Laheru D 和Jaffee M，2005)。事实上，已经根据其RNA水平的表达升高(WO 04/55519)，或者血清样品和/或胰腺样品的大规模蛋白质组学分析 (Bhattacharyya S et al.，2004；Cao D et al.，2005；Cecconi D et al.， 2003；Chen R et al.，2005；Gronborg M et al.，2006；Honda K et al.， 2005；Koomen J et al.，2005；Rodriguez J et al.，2005；Shen J et al.， 2004，Rosty C和Goggins M，2005；Sinha P et al.，1999；Yu Y et al.， 2005)而产生了一系列候选的PDA特异性蛋白。血清中用于PDA 诊断的候选蛋白为纤维蛋白原γ(Bloomston M et al.，2006)、 DEAD-Box蛋白48(Xia Q et al.，2005)、MIC-1(Koopmann et J al.， 2004)、PTH相关蛋白(Bouvet M et al.，2001)和钙网织蛋白(Hong S et al.，2004)。
然而，仍然需要用于PDA早期检测以及将其与其他胰腺病症 或癌症区分开的可靠的生物标志物。
发明内容
本发明基于以下观察结果，即，与健康个体或患其他病症个体 的血清相比，PDA患者的血清包含抗特异蛋白的抗体，而该特异蛋 白在源于胰腺癌的细胞系中表达。在获自正常胰腺组织和PDA胰 腺组织的提取物中，利用特异于这些蛋白的纯化抗体可确定这些蛋 白的存在。
本发明的一个主要目的是新型的、至少在3个位点被磷酸化的 人类α-烯醇化酶(ENOA)的PDA相关同种型(亚型，isoform)， 并且这些位点已在α-烯醇化酶的新同种型中的一种中得到确定。
本发明的另一个目的是结合这些ENOA磷酸化同种型并将它 们与其他ENOA同种型区分开的抗体。所述抗体可以为任何恰当的 形式，例如单克隆抗体(特别是人类单克隆抗体)和抗体片段。
本发明中已限定为PDA相关的蛋白及结合它们的抗体(以及 用于检测它们的任何其他特定方式)均可用于PDA诊断的方法中， 以及用来鉴定用于治疗PDA的药剂。具体地，在获自患者的生物 学样品(如血清或活检组织)中基于抗体检测PDA相关的ENOA 磷酸化同种型可用于PDA诊断、评估疾病进展(progression)或评 估用于治疗PDA的药物疗效的方法中。
本发明的其他目的是用于PDA诊断、评估疾病进展、或评估 用于治疗PDA的药物疗效的试剂盒，该试剂盒包括至少一种本发 明所述的PDA相关蛋白和/或结合它们的抗体。
下文的说明中还将提供本发明的其他目的，包括那些与胰腺癌 诊断和治疗中的特异性抗α-烯醇化酶抗体的限定和应用相关的目 的。
附图说明
图1：SERPA法的示意图，SERPA法用于利用CF-PAC-1细胞 (肿瘤细胞)和来自PDA(肿瘤)患者或对照(健康)供体的血清 来表征PDA相关蛋白抗原和抗体。
图2：(A)2-DE凝胶，利用来自CF-PAC-1细胞系的蛋白提取物 而制备，作为用于检测PDA相关蛋白表达的测定。细胞提取物中 的蛋白根据其分子量和pI而在凝胶中分离并利用银染色而显现。指 出了采用PDA血清而非对照血清的蛋白质印迹(Western blot)中 存在的斑点的位置(表I中列出了对应于每一个编号的特定蛋白的 名称)。(B)柱状图，表示患有慢性胰腺炎(CP)或不同分期(II、 III、IV)PDA的患者(每一组中患者总数以n表示)血清中包含识 别所指出的PDA相关蛋白的抗体的百分比。表I中指出了对应于缩 写的蛋白质全名。
图3：人α-烯醇化酶(ENOA；SWISSPROT Acc.No.P06733； SEQ ID NO：1)与人γ烯醇化酶(ENOG SWISSPROT Acc.No. P09104；SEQ ID NO：2)蛋白序列的比对(两种蛋白质中相同的氨基 酸用“：”表示，而那些仅保守的氨基酸则用“.”表示)。在2-DE凝胶 斑点中已通过质谱法鉴定且用来将ENOA同种型分配到这些斑点 的肽序列用下划线表示。
图4：人α-烯醇化酶(ENOA)蛋白序列中的磷酸化位点(加 粗、有下划线)的位置，其通过不同的算法来预测和/或通过实验来 鉴定(蛋白序列下面的小写字母；参见图注)。在ENOA中已鉴定 为在ENOA同种型3中发生磷酸化的肽用实线框出。ENOA同种型 3中鉴定为未磷酸化的肽用虚线框出。
图5：(A)通过不同方式检测6种α-烯醇化酶同种型(ENOA1、 2、3、4、5、6)。ENOA 1/2、和3的位置用白色箭头表示。(B) 检测正常胰腺组织或PDA患者胰腺组织的蛋白提取物中的6种α- 烯醇化酶同种型(1、2、3、4、5、6)，其已转移至膜上，随后用 抗-ENOA作为第一抗体通过蛋白质印迹法进行检测。ENOA 1/2同 种型的位置用白色箭头表示。作为凝胶上样以及转移至膜上的蛋白 量的对照，用多克隆兔抗人肌动蛋白抗体(稀释度1∶10000；Sigma Chemical Co.)对膜进行检测。
图6：利用PDA患者血清作为第一抗体，通过2-DE凝胶和蛋 白质印迹法检测CF-PAC-1细胞提取物中的6种α-烯醇化酶同种型 (斑点1、2、3、4、5、6)，该血清已用或未用重组人α-烯醇化酶 进行预吸附(+rENOA或-rENOA)。可替代地，利用PDA患者血 清池(pool)作为第一抗体进行蛋白质印迹法前，用磷酸酶 (+λPPASE)对该膜进行预处理。
本发明的一个主要目的是新型的、至少在3个位点被磷酸化的 人类α-烯醇化酶(ENOA)的PDA相关同种型(亚型，isoform)， 并且这些位点已在α-烯醇化酶的新同种型中的一种中得到确定。
本发明的另一个目的是结合这些ENOA磷酸化同种型并将它 们与其他ENOA同种型区分开的抗体。所述抗体可以为任何恰当的 形式，例如单克隆抗体(特别是人类单克隆抗体)和抗体片段。
本发明中已限定为PDA相关的蛋白及结合它们的抗体(以及 用于检测它们的任何其他特定方式)均可用于PDA诊断的方法中， 以及用来鉴定用于治疗PDA的药剂。具体地，在获自患者的生物 学样品(如血清或活检组织)中基于抗体检测PDA相关的ENOA 磷酸化同种型可用于PDA诊断、评估疾病进展(progression)或评 估用于治疗PDA的药物疗效的方法中。
本发明的其他目的是用于PDA诊断、评估疾病进展、或评估 用于治疗PDA的药物疗效的试剂盒，该试剂盒包括至少一种本发 明所述的PDA相关蛋白和/或结合它们的抗体。
下文的说明中还将提供本发明的其他目的，包括那些与胰腺癌 诊断和治疗中的特异性抗α-烯醇化酶抗体的限定和应用相关的目 的。
附图说明
图1：SERPA法的示意图，SERPA法用于利用CF-PAC-1细胞 (肿瘤细胞)和来自PDA(肿瘤)患者或对照(健康)供体的血清 来表征PDA相关蛋白抗原和抗体。
图2：(A)2-DE凝胶，利用来自CF-PAC-1细胞系的蛋白提取物 而制备，作为用于检测PDA相关蛋白表达的测定。细胞提取物中 的蛋白根据其分子量和pI而在凝胶中分离并利用银染色而显现。指 出了采用PDA血清而非对照血清的蛋白质印迹(Western blot)中 存在的斑点的位置(表I中列出了对应于每一个编号的特定蛋白的 名称)。(B)柱状图，表示患有慢性胰腺炎(CP)或不同分期(II、 III、IV)PDA的患者(每一组中患者总数以n表示)血清中包含识 别所指出的PDA相关蛋白的抗体的百分比。表I中指出了对应于缩 写的蛋白质全名。
图3：人α-烯醇化酶(ENOA；SWISSPROT Acc.No.P06733； SEQ ID NO：1)与人γ烯醇化酶(ENOG SWISSPROT Acc.No. P09104；SEQ ID NO：2)蛋白序列的比对(两种蛋白质中相同的氨基 酸用“：”表示，而那些仅保守的氨基酸则用“.”表示)。在2-DE凝胶 斑点中已通过质谱法鉴定且用来将ENOA同种型分配到这些斑点 的肽序列用下划线表示。
图4：人α-烯醇化酶(ENOA)蛋白序列中的磷酸化位点(加 粗、有下划线)的位置，其通过不同的算法来预测和/或通过实验来 鉴定(蛋白序列下面的小写字母；参见图注)。在ENOA中已鉴定 为在ENOA同种型3中发生磷酸化的肽用实线框出。ENOA同种型 3中鉴定为未磷酸化的肽用虚线框出。
图5：(A)通过不同方式检测6种α-烯醇化酶同种型(ENOA1、 2、3、4、5、6)。ENOA 1/2、和3的位置用白色箭头表示。(B) 检测正常胰腺组织或PDA患者胰腺组织的蛋白提取物中的6种α- 烯醇化酶同种型(1、2、3、4、5、6)，其已转移至膜上，随后用 抗-ENOA作为第一抗体通过蛋白质印迹法进行检测。ENOA 1/2同 种型的位置用白色箭头表示。作为凝胶上样以及转移至膜上的蛋白 量的对照，用多克隆兔抗人肌动蛋白抗体(稀释度1∶10000；Sigma Chemical Co.)对膜进行检测。
图6：利用PDA患者血清作为第一抗体，通过2-DE凝胶和蛋 白质印迹法检测CF-PAC-1细胞提取物中的6种α-烯醇化酶同种型 (斑点1、2、3、4、5、6)，该血清已用或未用重组人α-烯醇化酶 进行预吸附(+rENOA或-rENOA)。可替代地，利用PDA患者血 清池(pool)作为第一抗体进行蛋白质印迹法前，用磷酸酶 (+λPPASE)对该膜进行预处理。
具体实施方式
生物化学和蛋白质组学技术的联合应用可鉴定并评估与疾病 有关的生物学样品中存在的特有蛋白(individual proteins)。本发明 中，这种类型的分析最初旨在用于癌症(PDA)，并利用两种来源 的疾病相关分子：源自人胰腺导管腺癌(PDA)的细胞系(CF-PAC-1) 和获自一大组PDA患者的血清，其可能包含与PDA肿瘤形成和/ 或进展相关的抗体。
通过这些血清的蛋白质印迹分析在CF-PAC-1提取物中检测到 的免疫活性蛋白谱与利用不同对照群体(健康个体、非PDA肿瘤 患者、慢性胰腺炎患者)的血清所获得的蛋白谱进行比较，以确定 CF-PAC-1蛋白质组中候选的PDA相关抗体和相关抗原(图1)。
已经发现，具有已清楚了解的生物学活性的有限数量的蛋白 (包括代谢酶和细胞骨架蛋白)的抗体选择性地存在于PDA患者 的血清中，表明这些蛋白是PDA相关的，且可在PDA患者而非健 康个体或非PDA癌症患者中诱发体内抗体应答。
本发明中已确定为PDA相关的蛋白和抗体(以及用于检测它 们的任何其他特定方式)，均可用于PDA诊断的方法中，并可用来 鉴定用于治疗PDA的药剂。
已经采用用于蛋白分离和分析的2-DE和质谱技术确定了一组 PDA相关的人类蛋白(包括α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、视黄醛 脱氢酶-1、葡萄糖-6-磷酸盐-1-脱氢酶、延伸因子Tu和异柠檬酸盐 脱氢酶、I型角蛋白细胞骨架10、Cofilin 1；图2B和表I)为用于 PDA血清中特异性存在的抗体的抗原。此外，针对这些抗原的纯化 抗体确认了它们的差异表达，并从而确认了用于检测它们的任何基 于蛋白质的方式(包括血清、完全或部分纯化的抗体、多克隆抗体 制备物、和肽)用于PDA早期诊断并用于评估患者体内这种癌症 的进展的有效性。
因而这些蛋白均可单独或组合使用，用作PDA早期诊断以及 用于评估患者体内这种癌症进展的生物标志物。在这些生物标志物 中，ENOA 1/2(α-烯醇化酶同种型1和同种型2)和COF1(Cofilin 1)，如利用2-DE和蛋白质印迹法鉴定的，看来是最可靠的PDA相 关蛋白抗原。
如在实施例中所示出的，结合这些PDA相关抗原的抗体可用 于上文列出的范围。因此，包括检测生物学样品(如血清、活检组 织(biopsies)、或细胞/组织蛋白提取物)中这些抗原和/或抗体的方 法可实现PDA早期诊断以及对患者体内PDA进展的评估。
除了在下文所述的一种情形中，对PDA相关抗原的表征不能 推广至对PDA相关蛋白的任何翻译后修饰的定义。数据表明，任 何特异性结合给定抗原的全部同种型所共有的表位(如表I使用的 纯化抗体，右列)或包含PDA相关的翻译后修饰的一种或多种同 种型所仅有的表位(如PDA患者血清中存在的以及在PDA进展过 程中检测到的抗体；参见图2B)的抗体或肽，均可用于确定PDA 诊断和进展。
考虑到人们对提供用于治疗PDA的新型治疗化合物的兴趣， 包括检测生物学样品中PDA相关抗原和抗体(以及它们的结合特 性)的方法还可用来评估用于治疗PDA的候选药物。该方式适用 于一些分析中，其中可比较PDA相关蛋白和/或抗体的存在，如在 ENOA同种型(ENOA 1/2)的实例中所示出的。
在暴露于候选化合物之后而发生的这些特性的改变，可利用实 施例和文献中所描述的生物化学和蛋白质组学技术而确认，其可表 明导致PDA肿瘤形成和转移的生物学途径。例如，通过检测患者 或动物模型的血清中抗PDA相关抗原的第一抗体的消失、以及利 用抗原特异性抗体在细胞提取物中通过蛋白质印迹法检测斑点数 目的减少而确认化合物的PDA特异性活性是可能的。
候选化合物可针对任何可能的PDA治疗性靶标，包括那些在 本发明中确定为PDA相关蛋白的靶标(如COF1或ENOA 1/2)。 例如，这些化合物的形式可为结合它们的抗体(大体上或仅特定的 同种型)，或为通过调节修饰它们的酶的活性而改变其表达或翻译 后修饰的小分子。而且，已经发现结合人α-烯醇化酶的抗体(如鼠 单克隆抗体)抑制胰腺源转化细胞系(呈现(presenting)6种α烯 醇化酶同种型(即包括ENOA 1/2，如利用PDA患者血清在蛋白质 印迹法中检测到的))的体外生长和增殖。在非胰腺源转化细胞系 (呈现这6种α烯醇化酶同种型)中也观察到了这种对体外生长和 增殖的抑制效应，但对于仅呈现3种非磷酸化同种型的非胰腺源转 化细胞系则未观察到该效应(实施例3；图5B；表IV)，表明利用 抗-ENOA抗体治疗PDA的可能性。
随后可利用细胞系或动物模型在任何用于胰腺细胞的增殖分 析中评估这些可能的治疗特性，并已加以检测来证实不同化合物如 肽、肽类似物和影响信号转导的小分子的效应(Baker C et al.，2002； Bauer T et al.，2005；Bruns C et al.，2000；Lee L et al.，2002；Levitzki A 和Mishani E，2006；Qin Y et al.，1995；Yezhelyev M et al.，2004； Rubio-Viqueira B et al.，2006)。此外，已经证实了联用针对不同分子 靶标的化合物从而更加有效地治疗胰腺癌的可能性。例如，联合给 予化疗药物和特异于细胞膜受体的激酶抑制剂可抑制实验性人胰 腺癌的生长并显著延长动物模型的存活期(Yokoi N et al.，2005)。 可替代地，已有文献描述，如果将两种或更多种针对病毒或人类靶 标的抗体结合于药物组合物中，则不仅由于加合作用(additive effect)而且由于协同效应而可使所得的组合物表现出改善的治疗和 /或诊断有效性(Logtenberg T，2007)。
包含抗PDA相关蛋白(如ENOA 1/2)的抗体的药物组合物可 给予人类用于治疗和诊断目的。因此，用于PDA治疗或诊断的方 法可包括给予包含抗PDA相关蛋白(如ENOA 1/2)的抗体的药物 组合物。
所述组合物可包括常用的药物赋形剂，且可以单剂量或多剂量 和/或利用适合的装置通过不同的途径：肌内、静脉内、皮下、局部、 经粘膜、以不可生物降解/可生物降解的基质材料、或利用颗粒药物 递送系统而给予。特别的，该组合物应该可有效给予至胰腺或任何 其他存在PDA相关蛋白的组织。
药物组合物应该为患者提供治疗或预防有效量的化合物，允许 该化合物可在足够长的时间内发挥其活性。期望的效果是通过控制 PDA生长和增殖，并通过减少至少部分PDA临床表现而改善PDA 患者的病况。例如，根据给药途径以及个体状况不同，该组合物应 该以约0.005至约50mg/kg体重的有效量给予。
当组合物具有诊断性用途时，则该化合物应该利用通常在临床 和研究实验室中所建立的用于检测生物样品中的病毒的技术加以 检测(例如，ELISA或其他血清学分析)，或者当体内给予患者时， 则至少在给予后1、2、5、10、24或更多个小时进行检测。PDA相 关蛋白和/或抗体的检测可利用本发明的PDA相关蛋白和/或抗体在 已建立的用于诊断PDA的已知方法和步骤之后实施或者与其联合 实施。
PDA治疗和/或诊断的临床开发(clinical development)和应用， 应该基于抗体药代动力学和药效动力学的特征(Lobo E et al.， 2004)、临床前和临床安全数据(data preclinical and clinical safety) (Tabrizi M和Riskos L，2007)，并遵守关于人类治疗和体内诊断性 应用的单克隆抗体的生产和质量控制的国际规定(Harris R et al. 2004)。
用于患者PDA诊断的试剂盒可包括一种或多种上文限定的 PDA相关蛋白和/或抗体以及任何其他实现它们的检测的化合物， 如本发明中所限定的。这些试剂盒可包括未标记/标记的抗原、抗体 或在与这些抗原相互作用后被改性(modified)的底物(例如，已 鉴定为具有酶活性的那些)。
在对PDA的体液应答的靶标中，人们特别感兴趣的是发现新 型的α-烯醇化酶的磷酸化同种型可由PDA血清识别。人α-烯醇化 酶(ENOA)的该新型同种型在至少三个位置发生磷酸化，而且已 经鉴定了全部七个磷酸化位点(图4)。这个发现的重要性通过利用 获自PDA患者的血清或在获自PDA患者的胰腺组织中特异性检测 到两种高度磷酸化的ENOA同种型(ENOA1/2)而得到证实(图 2B、图5和图6；表I和表II)。PDA患者呈现有(present)可特异 性结合本发明所述高度磷酸化ENOA同种型的抗体。
实施例表明，即使ENOA序列中的若干个位置可以发生磷酸 化，但在细胞系和PDA组织中，苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸残基的 精确组合实际上发生磷酸化，且可通过PDA患者产生的人类抗体 而检测。特别的，苏氨酸55、酪氨酸57、酪氨酸200、酪氨酸236、 苏氨酸237、酪氨酸257和丝氨酸419的磷酸化存在于ENOA同种 型3中，如ENOA1/2，其表现出可经磷酸酶处理而改变的蛋白磷酸 化谱。蛋白磷酸化的类似改变可应用于诊断PDA以及利用获自患 者的生物学样品而评估疾病进展。
在完整ENOA 1/2同种型的替换中，产生呈现(present)相同 的ENOA 1/2磷酸化残基(如图4中所鉴定的那些(参见加框的序 列))的ENOA源性单肽、包括其的蛋白质序列或文库及它们的组 合也是有用的。用于产生并利用这些磷酸化蛋白和肽的方法在文献 中有所披露(Conrads T et al.，2002；US5763164；WO 97/30097)。
α-烯醇化酶同种型(特别是ENOA 1/2)中翻译后修饰的数目和 效应可进一步通过已知技术(Kalume D et al.，2003；Machida K et al.， 2003；Mann M et al.，2002；Rush J et al.，2005；Molina H et al.，2007； Schmelzle K和White F，2006；Wu J et al.，2005)在PDA相关的和对 照样品中加以证实。其他已知的ENOA磷酸化和/或修饰(表III) 可存在于ENOA 1/2中，且与这些同种型的抗原性和生物学活性以 及其利用同种型特异性抗体进行检测相关。与疾病特定分期/分型相 关的翻译后修饰可通过几种方法进行检测，包括直接蛋白分析或抗 体区分具有特定修饰的同种型，如其他蛋白所示(Edberg D et al.， 2005；Mandell J，2003)。
抗体，尤其是单克隆抗体，通过其与利用2-DE和蛋白质印迹 法在非PDA/PDA蛋白提取物中差异表达的蛋白同种型的结合而得 以确定，可应用于治疗在2-DE和蛋白质印迹法中具有类似谱的癌 症。因此，结合α-烯醇化酶(大体上；或特别地，特定的磷酸化同 种型)的抗体可应用于制备用于PDA治疗的药物组合物以及用于 PDA患者或表现出类似的α烯醇化酶表达谱(即，表达本发明所述 的在至少3个位置发生磷酸化的新型人α-烯醇化酶同种型)的癌症 患者的治疗性处理方法中。
抗体可用于癌症(如PDA)的检测或治疗，所述癌症特征在于 患者血清中存在磷酸化α-烯醇化酶同种型。这些抗体可通过利用用 于鉴定、表征和产生诊断性或治疗性抗体的任何已知技术而产生 (Jain M et al.，2007；Laffly E和Sodoyer R，2005)。该抗体可以以用 于功能性抗体的任何蛋白形式而产生，如完整抗体(或完全抗体， full antibody)(如单克隆抗体，特别是人或人源化单克隆抗体)、抗 体片段、抗原结合蛋白以及其他基于基因工程抗体的融合蛋白和 肽，它们在文献中以不同命名得到描述，如Scfv(单链片段可变区)、 Fab(可变区重/轻链异源二聚体)、双价抗体(或双体，diabody)、 分离的重链或轻链、肽体(或多聚肽体，peptabody)或双特异性抗 体。
本发明的抗体可通过结合(conjugate)(利用化学接头(或化 学连接体，chemical linker)或聚合体)或融合于治疗性、稳定性、 标记性、或诊断性试剂而加以改善。这些试剂的实例是可被结合的 可检测性标记分子(例如放射性同位素、荧光化合物、毒素、金属 原子、化学发光化合物、生物发光化合物、生物素、酶底物或酶)。 ENOA特异性活性还可以通过与另一种治疗性蛋白如可在诊断性或 治疗性应用中改变代谢和/或稳定性的蛋白或聚合物融合而得到增 强。
文献中提供了用于选择和设计蛋白成分、配体和恰当接头的方 式以及用于构建、纯化、检测和应用融合蛋白的方法和策略(Nilsson et al.，1997；“Applications Of Chimeric Genes And Hybrid Proteins” Methods Enzymol.Vol.326-328，Academic Press，2000；WO 01/77137)，且通常可在临床和科研实验室中采用。例如，融合蛋白 可包含由商品化抗体识别的序列(包括标签，如多组氨酸、FLAG、 c-Myc或HA标签)，其可促进该融合蛋白的体内和/或体外鉴定或 者其纯化。其他蛋白序列可通过直接荧光分析(如绿色荧光蛋白)， 或通过特异性底物或酶(例如应用蛋白水解位点)而容易地鉴定。
识别PDA特异性蛋白序列(如ENOA 1/2)的抗体，或源自这 种抗体的任何其他蛋白序列，均可利用这种用于转化恰当宿主细胞 的载体而表达为重组蛋白，所述宿主细胞可以是原核或真核宿主细 胞且应该可实现所需重组蛋白的分泌。用于产生这种蛋白的方法包 括培养宿主细胞，其在适于蛋白表达的条件下用包含其编码序列的 表达载体而转化，并从宿主细胞培养物中回收蛋白。
在原核或真核宿主细胞内表达的载体在关于如何克隆和产生 重组蛋白的书籍和综述中有所描述，包括由Oxford Univ.Press出版 的系列丛书《A Practical Approach》中的题目(“DNA Cloning 2： Expression Systems”，1995；“DNA Cloning 4：Mammalian Systems”， 1996；“Protein Expression”，1999；“Protein Purification Techniques”， 2001)。其他蛋白序列可结合所需抗体形式(Scfv、FAb、抗体片段、 完全人抗体等)、或结合一个或多个内部氨基酸的插入、取代或去 除而加入。这些技术也可以用于进一步的结构和功能表征以及蛋白 质(一般而言)、特别是抗体的治疗特性的优化(Kim S et al.，2005)。
接下来，本发明将借助下列实施例进行阐述，其不应理解为以 任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：在CP-PAC-1细胞系的蛋白质组中检测PDA相关的体液 抗原
材料&方法
人血清
在得到患者和健康供体的知情同意和临床研究机构伦理委员 会批准后，从静脉血分离血清样品。使用前，将样品储存于-80℃。
从70位PDA患者(31位男性，39位女性；年龄范围32-86 岁；年龄平均值±标准差：67±11)获得血清，并按照通用的分类(Faria S et al.，2004)和UICC(国际抗癌联合会)分类分组为如下不同的 临床分期：II期17人(未转移，中度分化)、III期17人(未转移， 低分化)，以及IV期36人(远端转移，未分化)。
将这些血清的反应性与无癌症或自身免疫疾病史的用做对照 的40个健康个体(14位男性，26位女性；年龄范围57-77岁；年 龄平均值±标准差：70±7)的血清反应性进行比较。此外，将这些 血清的反应性与30位非PDA癌症患者(9位肝细胞癌患者，12位 乳腺癌患者、8位结肠癌患者和1位卵巢癌患者；11位男性，19位 女性；年龄范围44-79岁；年龄平均值±标准差：66±10)和15位 慢性胰腺炎患者(9位男性，6位女性；年龄范围49-76岁；年龄平 均值±标准差：59±8)的血清反应性进行比较。
提供血清的不同组的患者的年龄和性别分布，经非配对双尾学 生氏t检验(unpaired 2-tailed Student’s t-test)评估，未表现出统计 学显著性差异。仅在慢性胰腺炎的组中，这两组的年龄(而非性别) 分布显著不同，因为该疾病通常发生于比PDA较年轻的年龄(平 均约44岁)。
细胞系和细胞提取物的制备
收集源于胰腺导管腺癌(Schoumacher R et al.，1990)的 CF-PAC-1细胞系(ECACC Ref.no.91112501)的细胞(107)，并用 Hank’s平衡盐溶液(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)洗涤。 将该细胞团(或细胞沉淀，pellet)冷冻-干燥过夜并储存于-80℃。 将该细胞团重悬浮于200μl再水合缓冲液[5M尿素、2M硫脲、4％ w/v CHAPS(Sigma Chemical Co.)、2％v/v IPG缓冲液3-10NL(GE Healthcare Bio-Sciences，Uppsala，Sweden)、80mM DTT(Sigma Chemical Co.)]和痕量溴酚蓝(Sigma Chemical Co.)中。通过Bradford 分析测定蛋白质浓度(Bio-Rad实验室)。
双向凝胶电泳(2-DE)
将100μg来自CF-PAC-1细胞系的蛋白提取物通过凝胶中再水 合(in gel rehydration)上样于7cm IPG胶条(strip)上(pH 3-10NL)， 用于分析和制备型凝胶。在IPGphor IEF unit system(GE Healthcare Bio-Sciences)上实施等电聚焦(IEF)，电压梯度达5000V，共 16000Vh。SDS-PAGE运行前，将IPG胶条用Tris/HCl缓冲液(50mM； pH 8.8)、尿素(6M)、甘油(30％v/v)、SDS(2％w/v)和DTT(2％ w/v)的溶液平衡15分钟，随后在含碘乙酰胺(2.5％w/v)和溴酚 蓝(而非DTT)的相同缓冲液中再平衡5分钟。为了进行双向电泳， 利用Novex X-Cell IITM Mini-cell system(Invitrogen)，使7cm的胶 条(strip)以恒定200V在小4-12％Bis-Tris 预制凝胶(Invitrogen，格罗宁根(Groningen)，荷兰)上进行电泳 (run)，并利用Novex X-Cell IITM Blot Module(Invitrogen)转移至 Hybond ECL硝基纤维素膜(GE Healthcare Bio-Sciences)上或者经 银染用于质谱分析(Shevchenko A et al.，1996)。
利用GE Healthcare Bio-Sciences提供的pH梯度图，从蛋白斑 点在2-DE凝胶上的位置估计蛋白斑点的pI值。通过与已知分子量 的SeeBlue Plus2预染标准(Invitrogen)的迁移比较，计算蛋白质 的分子量。用“ImageScanner”(GE Healthcare Bio-Sciences)获取2-DE 凝胶图像并用“ImageMaster Labscan Ver 3.00”软件(GE Healthcare Bio-Sciences)记录为TIFF格式。
蛋白质印迹分析
用封闭缓冲液(由含5％脱脂奶粉的TBS组成)将膜在4℃孵 育15小时，然后用血清(工作稀释度1∶200，用含0.05％Tween 20 和5％脱脂奶粉的TBS稀释)孵育4小时。洗涤后，将膜用结合辣 根过氧化物酶(HRP)的兔抗人免疫球蛋白G(IgG)抗体(Santa Cruz Biotechnology)以1∶1000的稀释度在室温下孵育90分钟。
可替代地，对于利用纯化的第一抗体的蛋白质印迹分析，从 2-DE凝胶印迹而来的硝基纤维素膜(nitrocellulose membranes)用 1∶1000稀释的抗体于25℃孵育1小时进行检测，所述第一抗体为 小鼠源的[例如单克隆抗体抗烯醇化酶19/128(Moscato S et al.，2000 中表征的克隆19/12的亚克隆)、抗-磷酸丙糖异构酶1(Abnova Corporation)、抗-角蛋白10(Chemicon International)、抗-延伸因子 tu(Abnova Corporation)]或兔源的[例如多克隆抗体抗-乙醛脱氢酶 1(Chemicon International)、抗-葡萄糖-6-磷酸盐1-脱氢酶(Bethyl laboratories)、抗-异柠檬酸盐脱氢酶(Biogenecis Ltd)和抗-cofilin 1 (Cell Signaling)]。随后，按照生产商的说明书，将膜用结合HRP 的特异性第二羊抗体，抗小鼠IgG或抗兔IgG(Santa Cruz Biotechnoly)孵育1小时。
胰腺组织的蛋白质印迹分析利用共30-50mg新鲜冰冻组织实 施，该组织在400μl裂解缓冲液(包含50mM TRIS/HCl pH 7.4、 150mM NaCl、1％NP40、1％Triton X-100、1mM DTT、10μl/ml抑 制性混合物、1mM PMSF(均购自Sigma Chemical Co.)和10μl/ml 核酸酶混合物(GE Healthcare Bio-Sciences))中于冰上进行匀质化 处理(T18basic UltraTurrax)。用超声仪(ultrasound sonicator) (Hielscher UP200S，3×40秒，振幅40％，周期(cycle)0.5)进行 超声降解(sonication)后，将该混合物离心(4℃，13000rpm/min， 30分钟)。上清中包含20μg蛋白提取物并用Bradford分析(Bio-Rad Laboratories)进行测定，在小4-12％Bis-Tris(双 [三(羟甲基)]氨基甲烷)预制凝胶(pre-cast gel)(Invitrogen)上进 行电泳，并如上所述转移至硝基纤维素膜上。
免疫检测利用ECL(增强化学发光，GE Healthcare Bio-Sciences)实施，随后在hyperfilm(GE Healthcare Bio-Sciences) 上进行放射自显影。用“ImageScanner”(GE Healthcare Bio-Sciences) 获取已显影的膜的图像，并用“ImageMaster Labscan Ver 3.00”软件 (GE Healthcare Bio-Sciences)记录为TIFF格式并用Image Master 2D Elite version 3.1软件(GE Healthcare Bio-Sciences)进行分析。
利用质谱(MS)鉴定蛋白
为了进行MS分析，将感兴趣的斑点从制备型2-DE凝胶上切 割下来，并利用基质辅助的激光解吸电离/飞行时间(MALDI-TOF) 进行分析，必要时，利用电喷雾电离(ESI)进行分析。
用25mM碳酸氢铵和50％乙腈的溶液将蛋白脱色过夜，随后 用胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)进行凝胶中消化，如前所 述(Hellman U et al.，1995)。为了进行MALDI-TOF MS，将每一种 肽混合物0.5μl置于目标盘(target disk)中并使其风干。随后，将 0.5μl基质溶液(1％w/v α-氰基-4-羟基肉桂酸/30％乙腈，0.1％TFA) 应用于干燥样品，并使其再次干燥。利用Bruker Reflex III MALDI-TOF质谱仪获得质谱。蛋白消化物的MS谱的判读 (interpretation)利用MS-Fit软件(http://prospector.ucsf.edu； Chamrad D et al.，2004)通过“肽质量指纹(peptide mass fingerprinting)”(PMF)而进行。
为了实施MS/MS实验，将胰蛋白酶肽混合物脱盐并在ZipTipC18 仪(Millipore)中浓缩。用60％甲醇加1％甲酸洗脱后，将4.5μl 胰蛋白酶肽混合物吸入涂有金的硅硼毛细管(gold-coated borosilicate capillary)(Proxeon Biosystems)并在安装有纳ESI源(纳 电喷雾离子源，nano ESI source)的LCQ Thermo(ThermoFinnigan) 离子阱质谱仪中分析。将毛细管电压设为46V，喷雾电压设为1.8 kV。收集来自全扫描质谱的最稳定信号，并通过低能碰撞诱导解离 (CID)进行碎裂，标准化碰撞能量范围为22-24％。
某些蛋白还利用装配有ESI离子源的LCQ DECA XP Plus离子 阱质谱仪(ThermoFinnigan)通过LC-MS/MS来鉴定。利用Surveyor (自动采样器和泵)仪(ThermoFinnigan)，以10μl注射体积、200 μl/min流速，在C18柱Luna，150×2.0mm(Phenomenex)上进行 层析分离，其后为MS分析仪。
为了进行所有MS/MS数据分析，采用Bioworks 3.0 (ThermoFinnigan)软件，并利用FASTA软件 (http://www.ebi.ac.uk/fasta33/；Johnson R et al.，2005)将所得序列与 EBI数据库中存在的人蛋白序列进行比较。
统计分析
所有的统计均利用GraphPad Prism软件进行计算。数据以均值 ±SEM(均值的标准误差)示出。利用非配对双尾t检验估计PDA 和正常胰腺组织中不同蛋白表达的显著性。双侧P值＜0.05可认为 具有统计学显著性。
结果
CF-PAC-1细胞系的蛋白质组，常用作用于PDA相关蛋白表达 和细胞增殖的模型(Bouvet M et al.，2001；Szepeshazi K et al.，2005)， 其用来利用PDA患者的血清作为第一抗体的来源而鉴定与PDA相 关的蛋白和抗体的存在。
来自该细胞系的蛋白提取物利用2-DE进行分析，通过银染色 确定代表性的双向图谱。该途径可将该提取物中所包含的蛋白分离 为根据其在2-DE凝胶中的密度和位置而分类的“斑点”，且由此可 大致确定蛋白质的量、分子量和pI。
将2-DE凝胶转移至膜上，以通过蛋白质印迹法利用一组来自 PDA患者或非PDA患者(包括健康个体、患其他癌症的患者以及 患慢性胰腺炎的患者)的血清进行分析。不同的斑点图谱之间(以 及2-DE凝胶的银染图像与相对应的蛋白质印迹图像之间)的比较， 可实现PDA相关斑点的鉴定，该PDA相关斑点可例如通过蛋白片 段的质谱分析进一步表征，而该蛋白片段利用以受控方式消化蛋白 的酶从这些斑点中提取(图1)。
利用这种途径，筛选出10个斑点并将其进一步表征为可利用 来自PDA患者的血清抗体而唯一识别(图2A)。该分析限于人IgG 抗体，因为已采用的第二抗体特异于这种同型(isotype)。将该10 个斑点从制备型凝胶切割下来，并通过MALDI-TOF MS进行分析 以鉴定其对应于哪种人类蛋白。利用该途径，将9种不同蛋白鉴定 为PDA相关抗原。两对斑点对应于相同蛋白的同种型，一个斑点 包含属于两种不同蛋白质但不能利用2-DE完全分离的序列。在利 用对照血清而实施的蛋白质印迹法中，所有这些斑点均不存在或几 乎检测不到。结合这些斑点中的一种或多种蛋白的第一抗体可在显 著比例的获自PDA患者的血清中鉴别出(表I)。
在这些PDA相关抗原性蛋白中，可根据生物学活性的类型(其 在文献中已指出)区分为两类蛋白。第一组蛋白包括代谢酶：α-烯 醇化酶(存在于两个斑点中，每一个斑点对应于一个特定的同种 型)、磷酸丙糖异构酶(存在于两个斑点中，每一个斑点对应于一 个特定的同种型)、视黄醛脱氢酶-1、葡萄糖-6-磷酸盐-1-脱氢酶、 延伸因子Tu、和异柠檬酸盐脱氢酶。第二组蛋白中的大多数被表征 为细胞骨架蛋白：I型角蛋白细胞骨架10和Cofilin 1。
除了利用CF-PAC-1细胞和人血清得到的结果，将从健康和 PDA个体中获得的胰腺提取物利用抗这些蛋白的纯化抗体(而非人 血清)作为第一抗体在蛋白质印迹法中进行比较。该分析可实现蛋 白总量(而非限制于一种同种型)的定量，但其表明在获自PDA 患者的活检组织的胰腺组织中这些蛋白均有不同程度的过表达(表 I)。
这些蛋白(以及PDA血清中针对其的特异性抗体的存在)的 诊断价值通过区分对应于PDA血清中每一种蛋白的斑点是否存在 而进一步评估，PDA血清获自根据疾病分期而分组的患者，并采用 患慢性胰腺炎患者的血清作为对照。
蛋白质印迹分析表明，针对不同蛋白的自身抗体的存在及其量 在不同PDA分期的患者中并非均一分布(图2B)。在对照血清中， 针对大多数蛋白的自身抗体均不存在，而在II期PDA患者中，除 了ENOA 1/2是明显例外，对大多数蛋白而言，PDA血清包含其的 频率略微升高(低于25％)。自身抗体生成谱中，这些频率在大多 数晚期得到了证实，其中，鉴于III期和IV期PDA中其频率持续 增加，因此针对α-烯醇化酶同种型的自身抗体同样是人们最感兴趣 的。
结论
一种基于血清学的方法，其结合人胰腺肿瘤细胞系(CF-PAC-1) 的2-DE表达谱和蛋白质印迹分析(利用PDA患者血清中的人IgG 作为第一抗体)，可鉴定有限数量的人蛋白及其同种型，而PDA患 者针对这些蛋白和同种型产生特异性体液应答。除了仅有的一个例 外(AL1A1)，这些蛋白的表达在PDA活组织检查中均上调。此外， 针对这些PDA相关蛋白的抗体的产生，至少对某些抗原而言，看 来在疾病晚期显著增加。
这些结果证实了血清学方法在鉴定早期PDA诊断的可能标志 物(在本情形中，大多数位于细胞内)方面的适用性。免疫系统对 细胞内蛋白发生反应的机制尚不清楚，但可能依赖于肿瘤形成的独 特环境，其能够改变肿瘤细胞中细胞内酶的定位。
Cofilin1(COF1)，作为一种在侵入伪足(invadopodium)的形 成中所涉及的肌动蛋白解聚酶，在肌动蛋白重塑、迁移和癌症中发 挥作用(Yamaguchi H et al.，2005)，且可能是肿瘤细胞应答趋向性 或生长因子刺激的方向性(directionality)所必需的(Mouneimne G et al.，2004)。之前曾观察到COF1的过表达与PDA动物模型相关 (Cecconi D et al.，2003；Sinha P et al.，1999)。
α-烯醇化酶是一种高度保守的代谢酶，具有多种特性且可在不 同环境中检测到(Pancholi V，2001；Piast M et al.，2005；Terrier B et al.，2007)。其在细胞表面上作为纤溶酶原受体而表达 (Lopez-Alemany R et al.，2003)并可由B细胞识别，可能用作一种 B细胞激活剂(Babu J et al.，2002)。在胰腺腺癌中已经检测到两种 同种型，但未描述其在翻译后修饰方面的分子特征(Shen J et al.， 2004)。
针对α-烯醇化酶的自身抗体已经在多个不同的生物学和疾病 模型中得到鉴定，如癌症相关的视网膜病(Adamus G et al.，1998； Adamus G et al.，1996)、非小细胞肺癌(non-small lung cancer)和其 他非胰腺的癌症(WO 07/072219；US20070172487：He P et al.， 2007)、胆汁性肝硬化(Akisawa N et al.，1997)、脑病(Fujii A et al.， 2005)和自身免疫病(Ballot E et al.，2003；Bogdanos D et al.，2004； Gitlits V et al.，2001)，其中α-烯醇化酶作为一种同种型或多种同种 型而存在(但还没有ENOA磷酸化同种型特异性表达的证据)。人 们已经利用噬菌体展示(Arza B et al.，1997；Kemp E et al.，2002)或 肽(Adamus G et al.，1998；Sato N et al.，2000；Walter M et al.，1995； Fujii A et al.，2005)研究了α-烯醇化酶及α-烯醇化酶特异性抗体或 自身抗体的特征。
本发明的结果证实，鉴于PDA患者血清中抗该蛋白的两种特 定同种型(ENOA 1/2)的自身抗体的出现频率和特异性生成，特定 的α-烯醇化酶同种型及用于检测它们的抗体可作为一种用于PDA 诊断特别有用的工具(表I和图2B)。所述抗体可特异于全部或多 数同种型共有的表位(如实验中采用的纯化抗体)或将PDA相关 同种型与其他同种型区分的表位(如那些在PDA血清中存在的抗 体)。此外，PDA从II期至IV期进展的特征在于抗ENOA 1/2自身 抗体生成的极显著增加，表明与肿瘤大小和生长能力直接关联。
对这些同种型的更加详细的分析不仅对于确定自身抗体对 PDA诊断的预测价值非常重要，而且对于更加深入理解将其与PDA 及与抗该癌症的可能治疗方法联系的分子机制非常重要。
实施例2：分析CF-PAC-1细胞中由自身抗体检测的α-烯醇化酶同 种型
材料&方法
MS分析
将斑点从制备型2-DE凝胶上切割下来并通过基质辅助的激光 解吸电离/飞行时间(MALDI-TOF)进行分析。蛋白用含0.025mol/L 碳酸氢铵和50％乙腈的溶液脱色过夜，随后用胰蛋白酶(Promega， Madison，WI)进行凝胶中消化，如前所述(Hellman U et al.，1995)。 为了进行MALDI-TOF MS，将每一种肽混合物0.5μl置于目标盘中， 并使其风干。随后，将0.5μl基质溶液(1％w/v α-氰基-4-羟基肉桂 酸/30％乙腈，0.1％TFA)应用于干燥样品，并再次使其干燥。利用 Bruker Reflex III MALDI-TOF谱仪(Bremen，Germany)获得谱图。 蛋白消化物的MS谱的判读利用MS-Fit软件通过“肽质量指纹” (PMF)来进行。
磷酸化分析
人α-烯醇化酶蛋白序列的分析利用下列可在因特网上使用的 软件而实施：NetPhos[http://www.cbs.dtu.dk/services/；(Blom N et al.， 1999)]、NetPhosK[http://www.cbs.dtu.dk/services/；(Blom N et al.， 2004)]、dbPTM[http://dbPTM.mbc.nctu.edu.tw/；(Lee T et al.，2006)]、 PPSP[http://bioinformatics.lcd-ustc.org/PPSP/；(Xue Y et al.，2006)]和 GPS[http://bioinformatics.lcd-ustc.org/gps web/predict.php；(Xue Y et al.，2005)]。
如前所述(Yamagata A et al.，2002)，采用λPPase(New England Biolabs Inc.)实施磷酸酶处理，并做了如下改良。将团状(pelleted) CF-PAC-1细胞(30×106)重悬浮于1ml裂解缓冲液(1％w/v NP40、 1％w/v SDS、50mM Tris pH 7.6和150mM NaCl蛋白酶抑制剂混合 物)中达15小时。用去离子水将裂解物(120μl，相当于2mg蛋 白)调至终体积1240μl，然后加入20μl的20mM MnCl2溶液和20 μl的λPPase缓冲液。添加完成后，轻轻地将溶液混匀。将该混合 物分为几等份，其中每一等份中加入600单位的λPPase。混匀后， 将这些等份于30℃孵育15小时。蛋白经丙酮和氯仿沉淀并用于 2-DE分析(参见实施例1)。
基于染料检测磷蛋白是在2-DE凝胶中利用ProQ磷蛋白荧光染 料(Molecular Probes(分子探针))并通过用于检测总蛋白的Sypro Ruby染色(Bio-Rad)而实施的，如生产商说明书和文献中所述(Wu J et al.，2005)。简言之，在2-DE之后，通过首先在50％甲醇/10％ 醋酸中固定凝胶30分钟而实施Pro-Q染色。随后用双蒸水洗涤凝 胶，并对其进行Pro-Q Diamond磷蛋白染色4小时。在用Sypro Ruby 荧光染料染色(过夜)前，通过用含20％乙腈的50mM醋酸钠， pH 4.0连续洗涤而进行脱色。
来自活检组织的胰腺组织中ENOA同种型表达的分析
将从健康个体或PDA患者(II期)活检组织获得的胰腺组织 在400μl裂解缓冲液(包含5mol/L尿素、2mol/L硫脲、4％w/v CHAPS、2％v/v IPG缓冲液非线性pH 3-10、0.08mol/L二硫苏糖 醇(DTT)、10μl/mL核酸酶混合物和痕量溴酚蓝)中在冰上进行 匀质化(T18 basic UltraTurrax，IKA)。用超声仪(ultrasound sonicator) (Hielscher UP200S，3×40s，振幅40％，周期0.5，Hielscher Ultrasonics GmbH)进行超声降解(sonication)后，将该混合物离 心(4℃，13000rpm，30分钟)，其中蛋白溶液包含于上清中。
蛋白浓度用Bradford分析进行测定。如实施例1中所述，将30 μg蛋白提取物在小4-12％Bis-Tris预制凝胶上电 泳，转移至硝基纤维素膜、用抗α-烯醇化酶单克隆抗体19/128 (Moscato S et al.，2000)于4℃温育过夜，并在蛋白质印迹中显现。
生成重组组氨酸标记的ENOA(rENOA)。
从已用编码融合于组氨酸标签的人ENOA(仅缺少最开始9个 氨基酸)序列的质粒进行转染的大肠杆菌细胞中纯化重组蛋白。简 言之，通过离心从1升培养物中收集细菌细胞，并将细胞团重悬浮 于20ml添加了溶菌酶(100μg/ml)和0.7％十二烷基肌氨酸钠的非 变性结合缓冲液(NBB，20mM磷酸钠和500mM氯化钠，pH 7.8) 中。将该悬浮液于4℃缓慢摇动15分钟。于冰上通过10次40秒 的高强度脉冲对细胞裂解物进行超声裂解。将该裂解物以10000 rpm于4℃离心5分钟，以沉淀(pellet)不溶性成分，将其重悬浮 于10ml富含蛋白酶抑制剂的胍盐裂解缓冲液(6M盐酸胍、20mM 磷酸钠、500mM氯化钠，pH 7.8)中，在室温下10分钟。将该裂 解物加至已平衡的柱(Ni-NTA琼脂糖柱，Invitrogen)中通过轻柔 摇晃在4℃经30分钟而结合于树脂。树脂用NBB洗涤两次，随后 用非变性洗涤缓冲液(NWB；NBB，pH 6.0)洗涤两次。洗脱利用 10ml咪唑洗脱缓冲液(350mM pH 6)来实施，生成重组组氨酸标 记的ENOA(rENOA)。将洗脱出的成分在无菌水中透析(dialyse)， 然后将其冻干并重悬浮于无菌无致热源的杜尔贝科磷酸盐缓冲溶 液(DPBS，Sigma)中。将各等份储存于-20℃。在鲎变形细胞溶解 测定(Limulus Amebocyte Lysate assay(Pyrogent；Bio Whittaker)) 中，内毒素水平低于0.03EU/ml。
利用患者血清和蛋白质印迹法分析CF-PAC-1中ENOA同种型的表 达
如前所述，将CF-PAC-12-DE凝胶电转移至Hybond ECL硝基 纤维素膜(GE Healthcare)上。用含5％脱脂奶粉的TBS封闭1小 时后，在不同条件下用ENOA 1/2+患者的三份血清池(用TBS1： 100稀释)孵育印迹。
在一系列实验中，孵育该膜之前，首先于4℃将血清池(pool of sera)在震荡器上与20μg/ml的重组α-烯醇化酶(rENOA)一起孵 育15小时。在另外一系列实验中，首先将膜用2ml含600单位λ PPase的PBS、40μl 20mM的MnCl2溶液和40μlλPPase缓冲液于 30℃孵育15小时。再将膜封闭1小时、用TTBS洗涤3次(15分 钟)并用混合血清(稀释度1∶100)孵育。
如实施例1中所述，血清中抗体与ENOA同种型的结合利用标 记的抗人抗体在蛋白质印迹法中显现。作为所固定的ENOA量的对 照，膜用鼠单克隆抗体抗烯醇化酶19/128进行再次检测(参见实施 例1)。
结果
在证实PDA患者血清中的抗体特异性检测到两种人α-烯醇化 酶的同种型后，我们利用不同方法表征这些同种型(以及CF-PAC-1 细胞中存在的该蛋白的任何其他同种型)的特征。
比较利用抗α-烯醇化酶的纯化抗体或不同PDA患者的血清所 获得的蛋白质印迹、2-DE凝胶的银染色以及质谱分析，表明2-DE 凝胶中还存在另外4个斑点(对应于与PDA不相关的其他α-烯醇 化酶同种型)，具有相似分子量但实验性pI值低于ENOA 1/2(表 II)。这些证据是利用CF-PAC-1或MiaPaCa-2细胞提取物在2-DE 凝胶分析中获得的。
从这些斑点获得的肽与ENOA片段相同(且明显不同于高度相 似的人γ-烯醇化酶；图3)，证实了蛋白质印迹证据，即这些斑点应 该对应于ENOA同种型，其中仅ENOA 1/2是PDA相关的。翻译 后修饰是通常将一种同种型与其他同种型相区别的特征。初步分析 似乎排除了糖基化(鉴于分子量的改变有限)，而暗示了磷酸化修 饰(鉴于pI下降)。
人α-烯醇化酶的序列包含几个酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基， 它们是可被不同激酶磷酸化的可能靶标。这种假设通过在2-DE分 离之前将蛋白提取物暴露于广泛有效的磷酸酶来观察采用磷酸化 依赖性抗体所检测的斑点强度是否发生变化而加以检测，如关于其 他蛋白的文献中所示出的(Kumar Y et al.，2004)。实际上，对应于 多数酸性同种型(其为PDA相关的ENOA 1/2和ENOA同种型3； 表II)的ENOA斑点的强度在磷酸酶预处理的CF-PAC-1细胞提取 物中明显下降。此外，ENOA同种型3(比ENOA 1/2丰度更高) 的质谱分析表明，该同种型中残基55、57、200、236、237、257、 和419发生了磷酸化(图4)。
之前关于α-烯醇化酶体内或体外磷酸化的报道(Cooper J et al.， 1984；Eigenbrodt E et al.，1983；Marcus K et al.，2000；Rush J et al.， 2005；Stasyk T et al.，2005；Molina H et al.，2007)大体上均未指出至 少三个特定残基可同时发生磷酸化，尤其是，ENOA同种型中的残 基55、57、200、236、237、257、和419发现可发生磷酸化。此外， ENOA同种型3中磷酸化残基的组合很难利用对ENOA蛋白序列基 于软件的分析而加以预测，因为其中存在大量的候选磷酸化位点 (图4)。不能排除ENOA同种型3可能具有在质谱分析阶段未检 测到的其他磷酸化位点，但ENOA 1/2应该含有翻译后修饰的残基 (根据pI值及采用磷酸酶得到的结果，极可能也发生了磷酸化)， 这些翻译后修饰的残基将其与ENOA同种型3相区分。
很明显，多于一种的从ENOA3同种型获得的肽未表现出这种 修饰，其中对所述肽的磷酸化状态进行了测定并且其含有候选的磷 酸化位点。例如，文献中特异性鉴定为在已建立的白血病T细胞系 中发生磷酸化的酪氨酸44(Rush J et al.，2005)在ENOA同种型3 中则未发现磷酸化。类似地，如在ENOA同种型3中(图4)，已 鉴定残基57与残基63共同磷酸化(Molina H et al.，2007)，而不是 与残基55共同磷酸化。
通过将蛋白质印迹法中获得的图像与利用染料染色2-DE凝胶 中总蛋白(银染或Sypro Ruby)或特异于磷蛋白(Pro-Q Diamond) 的染料染色得到的图像进行比较而进一步分析利用PDA血清和 ENOA特异性抗体检测到的ENOA同种型中的磷酸化。该分析证实 在CF-PAC-1细胞中仅ENOA 1/2和3发生了磷酸化(图5A；表II)。
还通过蛋白质印迹法检测了获自经手术治疗的PDA患者(II 期；n＝7)的组织和正常胰腺组织(n＝1)中的ENOA表达，所采 用的抗烯醇化酶抗体结合在PDA患者血清中检测到的全部六种同 种型共有的特定表位。在7例PDA活检组织中，有6例中检测到 了全部六种ENOA同种型。相比之下，在正常胰腺中仅四种同种型 (ENOA 3、4、5和6)可清晰检测到(图5B)。因此，可以推断出 不仅PDA患者产生抗ENOA 1/2的抗体，而且这些同种型在PDA 胰腺组织中显著过表达。
采用CF-PAC-1细胞提取物在2-DE和蛋白质印迹中进一步研 究PDA患者血清抗磷酸化ENOA的反应性，以了解该反应性是否 特异性针对它们的磷酸化表位。因为PDA患者血清对全部6种同 种型均发生反应，因此其可能包含对磷酸化或非磷酸化表位均发生 反应的抗体。
在第一系列实验中，血清用不含磷酸化残基的重组人ENOA提 前孵育，以观察暴露于ENOA抗原是否改变血清识别参照胰腺细胞 系中ENOA同种型的能力。实际上，2-DE蛋白质印迹分析表明， 非磷酸化ENOA仅显著降低了对同种型3、4、5和6的反应性，而 未影响对ENOA 1/2同种型的反应性。这种迹象在另一系列实验中 进一步得到了证实，其中膜用磷酸酶(λPPase)提前孵育，以确定 患者血清中是否包含对磷酸化的ENOA 1/2同种型发生特异性反应 的抗体。如果不存在λPPase，该血清则识别全部ENOA同种型，其 中λPPase处理显著降低了血清对ENOA 1/2的反应性(图6)。
在经过处理或未经处理的膜中，抗ENOA mAb同样检测到了 全部同种型(数据未示出)，这些数据证明，PDA患者血清中的抗 体与磷酸化的ENOA 1/2同种型发生了特异性反应。
结论
利用不同的蛋白质组学方法，已经鉴定了多种ENOA同种型以 及针对这些同种型的抗体(Adamus G et al.，1998；Adamus G et al.， 1996；Akisawa N et al.，1997；Ballot E et al.，2003；Bryborn M et al.， 2005；Lubec G et al.，2003；O’Dwyer D et al.，2002)。然而，这些报道 未明确证实磷酸化状态和位置与PDA进展中抗特定同种型的自身 抗体的产生之间的相关性。
其他文章报道了例如采用患者血清在2-DE凝胶的蛋白质印迹 中所检测到的与特殊细胞处理(Baty J et al.，2005；Bottalico L et al.， 1993；Kanamoto T et al.，2002)或疾病(Byrjalsen I et al.，1999； Clauser K et al.，1995；Nakanishi T et al.，2006；Tanaka Y et al.，2006； US20070172487)相关的α-烯醇化酶斑点的强度和/或数量的变化， 表明其可能是由于诸如磷酸化的翻译后修饰。
其他报道中，还指出了在通过2-DE凝胶分析的PDA样品中， 人α-烯醇化酶是几种过表达的蛋白之一，并在mRNA和免疫细胞 化学水平得到了确认，但未提到那些可表征与PDA相关的α-烯醇 化酶的同种型的特异性磷酸化(WO04/55548；Shen J et al.，2004； Nakanishi T et al.，2006；Mikuriya K et al.，2007)。
在α-烯醇化酶中检测到的大量翻译后修饰(表III)中，较早的 文献表明在体内和体外均已检测到磷酸化(Cooper J et al.，1984； Coussens P et al.，1985；Eigenbrodt E et al.，1983；Golden A et al.， 1986)。最近，已经利用2D凝胶、商品化小鼠抗磷酸酪氨酸的抗体 (clone 4G10，cod.05-321；Biomol)和质谱在人血小板中(Marcus K et al.，2000)检测到了α-烯醇化酶的两种磷酸化同种型。利用2D- 凝胶、放射性标记和质谱在TGFβ1处理的细胞(MCF-7细胞系) (Stasyk T et al.，2005)中或者在MIAPaCa细胞(一种胰腺癌细胞 系)中检测到了α-烯醇化酶的一种磷酸化变异体(variant)，其中烯 醇化酶磷酸化随着用黄酮类处理而降低(Lee L et al.，2002)。此外， 双磷酸化位点位于酪氨酸残基(44和286；Rush J et al.，2005)或酪 氨酸与丝氨酸残基(57和63；Molina H et al.，2007)。
然而，这些文献均未将PDA与已在至少三个位点发生磷酸化 的α-烯醇化酶同种型的额外磷酸化、以及与结合其的抗体关联起 来。
实施例3：结合α-烯醇化酶的抗体对表达α-烯醇化酶磷酸化同种型 的转化细胞系的生长和增殖的影响
材料&方法
用于细胞系增殖的分析
采用完全细胞培养基(含10％胎牛血清的RPMI-1640)通过在 96孔微孔板(microplate)中接种2-10×103细胞/孔而实施指定细胞 系的体外细胞增殖分析，含有或不含抗α-烯醇化酶的单克隆抗体 72/1(Moscato S et al.，2000)或小鼠IgG 1同型对照单克隆抗体 (R&D Systems)用做阴性对照。
44或68小时后，每个孔中加入20μl甲基四唑(methyl tetrazolium)溶液(MTT；5mg/ml)，于37℃再培养4小时。弃去 培养基，用DMSO溶解细胞。培养板通过分光光度计在540纳米下 读数。
结果
如通过2-DE和蛋白质印迹法测定的，抗α-烯醇化酶的抗体对 呈现不同α-烯醇化酶表达谱的细胞系生长的影响是通过测定MTT 的掺入(incorporation)而检测的，MTT是一种可掺入存活细胞内 的化合物，与活性细胞生长、代谢和增殖有关。
利用基于MTT的比色测定，在表达全部六种同种型的转化细 胞系中均得到了细胞增殖的显著抑制，与其是胰腺来源还是非胰腺 来源无关。利用IgG 1同型(isotype-matched)对照单克隆抗体或 不表达所述三种磷酸化ENOA同种型的细胞系，该影响则极低(表 IV)。
因此，抗α-烯醇化酶的抗体能够抑制(至少部分地)具有特定 α-烯醇化酶磷酸化谱的细胞系生长和增殖，α-烯醇化酶可在PDA相 关生物学样品中检出(如血清或来自活检的组织)。
结论
即便人们通常认为α-烯醇化酶是一种细胞质蛋白 (cytoplasmatic protein)，其仍然可被表达为一种细胞表面上的生物 学活性蛋白(Arza B et al.，1997；Bergman A et al.，1997；Moscato S et al.，2000；Lopez-Alemany R et al.，2003)以及一种可溶性因子(Babu J et al.，2002；Demir A et al.，2005)。
体外数据表明，只要转化细胞系表达α-烯醇化酶的磷酸化同种 型，该转化细胞系的生长就会由于抗体结合于在胞外空间中表达的 α-烯醇化酶同种型(作为一种细胞表面受体和/或作为一种可溶性蛋 白)中所存在的表位而减慢。
因此，特异性结合呈现α-烯醇化酶磷酸化同种型的细胞的单克 隆抗体，可抑制转化细胞系的增殖。控制细胞增殖的这种机制看来 不仅存在于PDA中，还存在于其他表现出该分子特征的癌症形式 中，且可被恰当的单克隆抗体作为靶标，用于癌症相关的治疗性应 用，例如制备用于PDA治疗的药剂以及用于诊断和治疗PDA患者 的方法。
表I.被PDA患者血清识别为抗原的蛋白
ND：不确定
a通过银染和蛋白质印迹法在2-DE凝胶中检测为PDA特异性(见图1B中相 应斑点编号的位置)
b用特异于每一种蛋白的抗体实施蛋白质印迹法。反应性线(reactive line)的 强度表示为任意单位的标准化线强度(normalized line intensity)(三次实验的 均值±SEM)
c采用配对双尾t检验估计所选蛋白标准化线强度的统计学显著性
d这些蛋白共定位(colocalize)于同一个斑点中
表II.鉴定由PDA患者血清识别的ENOA同种型
LC-MS/MS分析
a人类非翻译后修饰的α-烯醇化酶的值为47kD
b人类非翻译后修饰的α-烯醇化酶的值为7.0
c所有非重复肽(non-duplicate peptide)的离子分值(ions scores)总和
表III：阐述α-烯醇化酶中除磷酸化外的翻译后修饰的精选文献
修饰 参考文献 乙酰化 Iwabata H et al.，2005 瓜氨酸化 Kinloch A et al.，2005 D-Asp Takata T et al.，2006 4-羟基壬烯 酸修饰 Kapphahn R et al.，2006 硝化 Casoni F et al.，2005；Kanski J et al.，2005；Shin S et al.，2004 氧化 Butterfield et al.，2006；Castegna A et al.，2002；Ishii T and Uchida K，2004；Perluigi M et al.，2005 酪氨酰化 Avram D et al.，2004
表IV：体外增殖分析的结果
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Met Ser Ile Leu Lys Ile His Ala Arg Glu Ile Phe Asp Ser Arg Gly
1 5 10 15
Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Leu Phe Thr Ser Lys Gly Leu Phe Arg
20 25 30
Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ile Tyr Glu Ala Leu Glu
35 40 45
Leu Arg Asp Asn Asp Lys Thr Arg Tyr Met Gly Lys Gly Val Ser Lys
50 55 60
Ala Val Glu His Ile Asn Lys Thr Ile Ala Pro Ala Leu Val Ser Lys
65 70 75 80
Lys Leu Asn Val Thr Glu Gln Glu Lys Ile Asp Lys Leu Met Ile Glu
85 90 95
Met Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Lys Phe Gly Ala Asn Ala Ile Leu
100 105 110
Gly Val Ser Leu Ala Val Cys Lys Ala Gly Ala Val Glu Lys Gly Val
115 120 125
Pro Leu Tyr Arg His Ile Ala Asp Leu Ala Gly Asn Ser Glu Val Ile
130 135 140
Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val Ile Asn Gly Gly Ser His Ala Gly
145 150 155 160
Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu Pro Val Gly Ala Ala
165 170 175
Asn Phe Arg Glu Ala Met Arg Ile Gly Ala Glu Val Tyr His Asn Leu
180 185 190
Lys Asn Val Ile Lys Glu Lys Tyr Gly Lys Asp Ala Thr Asn Val Gly
195 200 205
Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Glu Asn Lys Glu Gly Leu
210 215 220
Glu Leu Leu Lys Thr Ala Ile Gly Lys Ala Gly Tyr Thr Asp Lys Val
225 230 235 240
Val Ile Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe Phe Arg Ser Gly Lys
245 250 255
Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Ser Pro Asp Asp Pro Ser Arg Tyr Ile Ser
260 265 270
Pro Asp Gln Leu Ala Asp Leu Tyr Lys Ser Phe Ile Lys Asp Tyr Pro
275 280 285
Val Val Ser Ile Glu Asp Pro Phe Asp Gln Asp Asp Trp Gly Ala Trp
290 295 300
Gln Lys Phe Thr Ala Ser Ala Gly Ile Gln Val Val Gly Asp Asp Leu
305 310 315 320
Thr Val Thr Asn Pro Lys Arg Ile Ala Lys Ala Val Asn Glu Lys Ser
325 330 335
Cys Asn Cys Leu Leu Leu Lys Val Asn Gln Ile Gly Ser Val Thr Glu
340 345 350
Ser Leu Gln Ala Cys Lys Leu Ala Gln Ala Asn Gly Trp Gly Val Met
355 360 365
Val Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr PheIle Ala Asp Leu
370 375 380
Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg
385 390 395 400
Ser Glu Arg Leu Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Leu Arg Ile Glu Glu Glu
405 410 415
Leu Gly Ser Lys Ala Lys Phe Ala Gly Arg Asn Phe Arg Asn Pro Leu
420 425 430
Ala Lys
<210>2
<211>434
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Met Ser Ile Glu Lys Ile Trp Ala Arg Glu Ile Leu Asp Ser Arg Gly
1 5 10 15
Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Leu Tyr Thr Ala Lys Gly Leu Phe Arg
20 25 30
Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ile Tyr Glu Ala Leu Glu
35 40 45
Leu Arg Asp Gly Asp Lys Gln Arg Tyr Leu Gly Lys Gly Val Leu Lys
50 55 60
Ala Val Asp His Ile Asn Ser Thr Ile Ala Pro Ala Leu Ile Ser Ser
65 70 75 80
Gly Leu Ser Val Val Glu Gln Glu Lys Leu Asp Asn Leu Met Leu Glu
85 90 95
Leu Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Lys Phe Gly Ala Asn Ala Ile Leu
100 105 110
Gly Val Ser Leu Ala Val Cys Lys Ala Gly Ala Ala Glu Arg Glu Leu
115 120 125
Pro Leu Tyr Arg His Ile Ala Gln Leu Ala Gly Asn Ser Asp Leu Ile
130 135 140
Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val Ile Asn Gly Gly Ser His Ala Gly
145 150 155 160
Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu Pro Val Gly Ala Glu
165 170 175
Ser Phe Arg Asp Ala Met Arg Leu Gly Ala Glu Val Tyr His Thr Leu
180 185 190
Lys Gly Val Ile Lys Asp Lys Tyr Gly Lys Asp Ala Thr Asn Val Gly
195 200 205
Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Glu Asn Ser Glu Ala Leu
210 215 220
Glu Leu Val Lys Glu Ala Ile Asp Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Ile
225 230 235 240
Val Ile Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Arg Asp Gly Lys
245 250 255
Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Ser Pro Thr Asp Pro Ser Arg Tyr Ile Thr
260 265 270
Gly Asp Gln Leu Gly Ala Leu Tyr Gln Asp Phe Val Arg Asp Tyr Pro
275 280 285
Val Val Ser Ile Glu Asp Pro Phe Asp Gln Asp Asp Trp Ala Ala Trp
290 295 300
Ser Lys Phe Thr Ala Asn Val Gly Ile Gln Ile Val Gly Asp Asp Leu
305 310 315 320
Thr Val Thr Asn Pro Lys Arg Ile Glu Arg Ala Val Glu Glu Lys Ala
325 330 335
Cys Asn Cys Leu Leu Leu Lys Val Asn Gln Ile Gly Ser Val Thr Glu
340 345 350
Ala Ile Gln Ala Cys Lys Leu Ala Gln Glu Asn Gly Trp Gly Val Met
355 360 365
Val Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Phe Ile Ala Asp Leu
370 375 380
Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg
385 390 395 400
Ser Glu Arg Leu Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Met Arg Ile Glu Glu Glu
405 410 415
Leu Gly Asp Glu Ala Arg Phe Ala Gly His Asn Phe Arg Asn Pro Ser
420 425 430
Val Leu
通过这些血清的蛋白质印迹分析在CF-PAC-1提取物中检测到 的免疫活性蛋白谱与利用不同对照群体(健康个体、非PDA肿瘤 患者、慢性胰腺炎患者)的血清所获得的蛋白谱进行比较，以确定 CF-PAC-1蛋白质组中候选的PDA相关抗体和相关抗原(图1)。
已经发现，具有已清楚了解的生物学活性的有限数量的蛋白 (包括代谢酶和细胞骨架蛋白)的抗体选择性地存在于PDA患者 的血清中，表明这些蛋白是PDA相关的，且可在PDA患者而非健 康个体或非PDA癌症患者中诱发体内抗体应答。
本发明中已确定为PDA相关的蛋白和抗体(以及用于检测它 们的任何其他特定方式)，均可用于PDA诊断的方法中，并可用来 鉴定用于治疗PDA的药剂。
已经采用用于蛋白分离和分析的2-DE和质谱技术确定了一组 PDA相关的人类蛋白(包括α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、视黄醛 脱氢酶-1、葡萄糖-6-磷酸盐-1-脱氢酶、延伸因子Tu和异柠檬酸盐 脱氢酶、I型角蛋白细胞骨架10、Cofilin 1；图2B和表I)为用于 PDA血清中特异性存在的抗体的抗原。此外，针对这些抗原的纯化 抗体确认了它们的差异表达，并从而确认了用于检测它们的任何基 于蛋白质的方式(包括血清、完全或部分纯化的抗体、多克隆抗体 制备物、和肽)用于PDA早期诊断并用于评估患者体内这种癌症 的进展的有效性。
因而这些蛋白均可单独或组合使用，用作PDA早期诊断以及 用于评估患者体内这种癌症进展的生物标志物。在这些生物标志物 中，ENOA 1/2(α-烯醇化酶同种型1和同种型2)和COF1(Cofilin 1)，如利用2-DE和蛋白质印迹法鉴定的，看来是最可靠的PDA相 关蛋白抗原。
如在实施例中所示出的，结合这些PDA相关抗原的抗体可用 于上文列出的范围。因此，包括检测生物学样品(如血清、活检组 织(biopsies)、或细胞/组织蛋白提取物)中这些抗原和/或抗体的方 法可实现PDA早期诊断以及对患者体内PDA进展的评估。
除了在下文所述的一种情形中，对PDA相关抗原的表征不能 推广至对PDA相关蛋白的任何翻译后修饰的定义。数据表明，任 何特异性结合给定抗原的全部同种型所共有的表位(如表I使用的 纯化抗体，右列)或包含PDA相关的翻译后修饰的一种或多种同 种型所仅有的表位(如PDA患者血清中存在的以及在PDA进展过 程中检测到的抗体；参见图2B)的抗体或肽，均可用于确定PDA 诊断和进展。
考虑到人们对提供用于治疗PDA的新型治疗化合物的兴趣， 包括检测生物学样品中PDA相关抗原和抗体(以及它们的结合特 性)的方法还可用来评估用于治疗PDA的候选药物。该方式适用 于一些分析中，其中可比较PDA相关蛋白和/或抗体的存在，如在 ENOA同种型(ENOA 1/2)的实例中所示出的。
在暴露于候选化合物之后而发生的这些特性的改变，可利用实 施例和文献中所描述的生物化学和蛋白质组学技术而确认，其可表 明导致PDA肿瘤形成和转移的生物学途径。例如，通过检测患者 或动物模型的血清中抗PDA相关抗原的第一抗体的消失、以及利 用抗原特异性抗体在细胞提取物中通过蛋白质印迹法检测斑点数 目的减少而确认化合物的PDA特异性活性是可能的。
候选化合物可针对任何可能的PDA治疗性靶标，包括那些在 本发明中确定为PDA相关蛋白的靶标(如COF1或ENOA 1/2)。 例如，这些化合物的形式可为结合它们的抗体(大体上或仅特定的 同种型)，或为通过调节修饰它们的酶的活性而改变其表达或翻译 后修饰的小分子。而且，已经发现结合人α-烯醇化酶的抗体(如鼠 单克隆抗体)抑制胰腺源转化细胞系(呈现(presenting)6种α烯 醇化酶同种型(即包括ENOA 1/2，如利用PDA患者血清在蛋白质 印迹法中检测到的))的体外生长和增殖。在非胰腺源转化细胞系 (呈现这6种α烯醇化酶同种型)中也观察到了这种对体外生长和 增殖的抑制效应，但对于仅呈现3种非磷酸化同种型的非胰腺源转 化细胞系则未观察到该效应(实施例3；图5B；表IV)，表明利用 抗-ENOA抗体治疗PDA的可能性。
随后可利用细胞系或动物模型在任何用于胰腺细胞的增殖分 析中评估这些可能的治疗特性，并已加以检测来证实不同化合物如 肽、肽类似物和影响信号转导的小分子的效应(Baker C et al.，2002； Bauer T et al.，2005；Bruns C et al.，2000；Lee L et al.，2002；Levitzki A 和Mishani E，2006；Qin Y et al.，1995；Yezhelyev M et al.，2004； Rubio-Viqueira B et al.，2006)。此外，已经证实了联用针对不同分子 靶标的化合物从而更加有效地治疗胰腺癌的可能性。例如，联合给 予化疗药物和特异于细胞膜受体的激酶抑制剂可抑制实验性人胰 腺癌的生长并显著延长动物模型的存活期(Yokoi N et al.，2005)。 可替代地，已有文献描述，如果将两种或更多种针对病毒或人类靶 标的抗体结合于药物组合物中，则不仅由于加合作用(additive effect)而且由于协同效应而可使所得的组合物表现出改善的治疗和 /或诊断有效性(Logtenberg T，2007)。
包含抗PDA相关蛋白(如ENOA 1/2)的抗体的药物组合物可 给予人类用于治疗和诊断目的。因此，用于PDA治疗或诊断的方 法可包括给予包含抗PDA相关蛋白(如ENOA 1/2)的抗体的药物 组合物。
所述组合物可包括常用的药物赋形剂，且可以单剂量或多剂量 和/或利用适合的装置通过不同的途径：肌内、静脉内、皮下、局部、 经粘膜、以不可生物降解/可生物降解的基质材料、或利用颗粒药物 递送系统而给予。特别的，该组合物应该可有效给予至胰腺或任何 其他存在PDA相关蛋白的组织。
药物组合物应该为患者提供治疗或预防有效量的化合物，允许 该化合物可在足够长的时间内发挥其活性。期望的效果是通过控制 PDA生长和增殖，并通过减少至少部分PDA临床表现而改善PDA 患者的病况。例如，根据给药途径以及个体状况不同，该组合物应 该以约0.005至约50mg/kg体重的有效量给予。
当组合物具有诊断性用途时，则该化合物应该利用通常在临床 和研究实验室中所建立的用于检测生物样品中的病毒的技术加以 检测(例如，ELISA或其他血清学分析)，或者当体内给予患者时， 则至少在给予后1、2、5、10、24或更多个小时进行检测。PDA相 关蛋白和/或抗体的检测可利用本发明的PDA相关蛋白和/或抗体在 已建立的用于诊断PDA的已知方法和步骤之后实施或者与其联合 实施。
PDA治疗和/或诊断的临床开发(clinical development)和应用， 应该基于抗体药代动力学和药效动力学的特征(Lobo E et al.， 2004)、临床前和临床安全数据(data preclinical and clinical safety) (Tabrizi M和Riskos L，2007)，并遵守关于人类治疗和体内诊断性 应用的单克隆抗体的生产和质量控制的国际规定(Harris R et al. 2004)。
用于患者PDA诊断的试剂盒可包括一种或多种上文限定的 PDA相关蛋白和/或抗体以及任何其他实现它们的检测的化合物， 如本发明中所限定的。这些试剂盒可包括未标记/标记的抗原、抗体 或在与这些抗原相互作用后被改性(modified)的底物(例如，已 鉴定为具有酶活性的那些)。
在对PDA的体液应答的靶标中，人们特别感兴趣的是发现新 型的α-烯醇化酶的磷酸化同种型可由PDA血清识别。人α-烯醇化 酶(ENOA)的该新型同种型在至少三个位置发生磷酸化，而且已 经鉴定了全部七个磷酸化位点(图4)。这个发现的重要性通过利用 获自PDA患者的血清或在获自PDA患者的胰腺组织中特异性检测 到两种高度磷酸化的ENOA同种型(ENOA1/2)而得到证实(图 2B、图5和图6；表I和表II)。PDA患者呈现有(present)可特异 性结合本发明所述高度磷酸化ENOA同种型的抗体。
实施例表明，即使ENOA序列中的若干个位置可以发生磷酸 化，但在细胞系和PDA组织中，苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸残基的 精确组合实际上发生磷酸化，且可通过PDA患者产生的人类抗体 而检测。特别的，苏氨酸55、酪氨酸57、酪氨酸200、酪氨酸236、 苏氨酸237、酪氨酸257和丝氨酸419的磷酸化存在于ENOA同种 型3中，如ENOA1/2，其表现出可经磷酸酶处理而改变的蛋白磷酸 化谱。蛋白磷酸化的类似改变可应用于诊断PDA以及利用获自患 者的生物学样品而评估疾病进展。
在完整ENOA 1/2同种型的替换中，产生呈现(present)相同 的ENOA 1/2磷酸化残基(如图4中所鉴定的那些(参见加框的序 列))的ENOA源性单肽、包括其的蛋白质序列或文库及它们的组 合也是有用的。用于产生并利用这些磷酸化蛋白和肽的方法在文献 中有所披露(Conrads T et al.，2002；US5763164；WO 97/30097)。
α-烯醇化酶同种型(特别是ENOA 1/2)中翻译后修饰的数目和 效应可进一步通过已知技术(Kalume D et al.，2003；Machida K et al.， 2003；Mann M et al.，2002；Rush J et al.，2005；Molina H et al.，2007； Schmelzle K和White F，2006；Wu J et al.，2005)在PDA相关的和对 照样品中加以证实。其他已知的ENOA磷酸化和/或修饰(表III) 可存在于ENOA 1/2中，且与这些同种型的抗原性和生物学活性以 及其利用同种型特异性抗体进行检测相关。与疾病特定分期/分型相 关的翻译后修饰可通过几种方法进行检测，包括直接蛋白分析或抗 体区分具有特定修饰的同种型，如其他蛋白所示(Edberg D et al.， 2005；Mandell J，2003)。
抗体，尤其是单克隆抗体，通过其与利用2-DE和蛋白质印迹 法在非PDA/PDA蛋白提取物中差异表达的蛋白同种型的结合而得 以确定，可应用于治疗在2-DE和蛋白质印迹法中具有类似谱的癌 症。因此，结合α-烯醇化酶(大体上；或特别地，特定的磷酸化同 种型)的抗体可应用于制备用于PDA治疗的药物组合物以及用于 PDA患者或表现出类似的α烯醇化酶表达谱(即，表达本发明所述 的在至少3个位置发生磷酸化的新型人α-烯醇化酶同种型)的癌症 患者的治疗性处理方法中。
抗体可用于癌症(如PDA)的检测或治疗，所述癌症特征在于 患者血清中存在磷酸化α-烯醇化酶同种型。这些抗体可通过利用用 于鉴定、表征和产生诊断性或治疗性抗体的任何已知技术而产生 (Jain M et al.，2007；Laffly E和Sodoyer R，2005)。该抗体可以以用 于功能性抗体的任何蛋白形式而产生，如完整抗体(或完全抗体， full antibody)(如单克隆抗体，特别是人或人源化单克隆抗体)、抗 体片段、抗原结合蛋白以及其他基于基因工程抗体的融合蛋白和 肽，它们在文献中以不同命名得到描述，如Scfv(单链片段可变区)、 Fab(可变区重/轻链异源二聚体)、双价抗体(或双体，diabody)、 分离的重链或轻链、肽体(或多聚肽体，peptabody)或双特异性抗 体。
本发明的抗体可通过结合(conjugate)(利用化学接头(或化 学连接体，chemical linker)或聚合体)或融合于治疗性、稳定性、 标记性、或诊断性试剂而加以改善。这些试剂的实例是可被结合的 可检测性标记分子(例如放射性同位素、荧光化合物、毒素、金属 原子、化学发光化合物、生物发光化合物、生物素、酶底物或酶)。 ENOA特异性活性还可以通过与另一种治疗性蛋白如可在诊断性或 治疗性应用中改变代谢和/或稳定性的蛋白或聚合物融合而得到增 强。
文献中提供了用于选择和设计蛋白成分、配体和恰当接头的方 式以及用于构建、纯化、检测和应用融合蛋白的方法和策略(Nilsson et al.，1997；“Applications Of Chimeric Genes And Hybrid Proteins” Methods Enzymol.Vol.326-328，Academic Press，2000；WO 01/77137)，且通常可在临床和科研实验室中采用。例如，融合蛋白 可包含由商品化抗体识别的序列(包括标签，如多组氨酸、FLAG、 c-Myc或HA标签)，其可促进该融合蛋白的体内和/或体外鉴定或 者其纯化。其他蛋白序列可通过直接荧光分析(如绿色荧光蛋白)， 或通过特异性底物或酶(例如应用蛋白水解位点)而容易地鉴定。
识别PDA特异性蛋白序列(如ENOA 1/2)的抗体，或源自这 种抗体的任何其他蛋白序列，均可利用这种用于转化恰当宿主细胞 的载体而表达为重组蛋白，所述宿主细胞可以是原核或真核宿主细 胞且应该可实现所需重组蛋白的分泌。用于产生这种蛋白的方法包 括培养宿主细胞，其在适于蛋白表达的条件下用包含其编码序列的 表达载体而转化，并从宿主细胞培养物中回收蛋白。
在原核或真核宿主细胞内表达的载体在关于如何克隆和产生 重组蛋白的书籍和综述中有所描述，包括由Oxford Univ.Press出版 的系列丛书《A Practical Approach》中的题目(“DNA Cloning 2： Expression Systems”，1995；“DNA Cloning 4：Mammalian Systems”， 1996；“Protein Expression”，1999；“Protein Purification Techniques”， 2001)。其他蛋白序列可结合所需抗体形式(Scfv、FAb、抗体片段、 完全人抗体等)、或结合一个或多个内部氨基酸的插入、取代或去 除而加入。这些技术也可以用于进一步的结构和功能表征以及蛋白 质(一般而言)、特别是抗体的治疗特性的优化(Kim S et al.，2005)。
接下来，本发明将借助下列实施例进行阐述，其不应理解为以 任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：在CP-PAC-1细胞系的蛋白质组中检测PDA相关的体液 抗原
材料&方法
人血清
在得到患者和健康供体的知情同意和临床研究机构伦理委员 会批准后，从静脉血分离血清样品。使用前，将样品储存于-80℃。
从70位PDA患者(31位男性，39位女性；年龄范围32-86 岁；年龄平均值±标准差：67±11)获得血清，并按照通用的分类(Faria S et al.，2004)和UICC(国际抗癌联合会)分类分组为如下不同的 临床分期：II期17人(未转移，中度分化)、III期17人(未转移， 低分化)，以及IV期36人(远端转移，未分化)。
将这些血清的反应性与无癌症或自身免疫疾病史的用做对照 的40个健康个体(14位男性，26位女性；年龄范围57-77岁；年 龄平均值±标准差：70±7)的血清反应性进行比较。此外，将这些 血清的反应性与30位非PDA癌症患者(9位肝细胞癌患者，12位 乳腺癌患者、8位结肠癌患者和1位卵巢癌患者；11位男性，19位 女性；年龄范围44-79岁；年龄平均值±标准差：66±10)和15位 慢性胰腺炎患者(9位男性，6位女性；年龄范围49-76岁；年龄平 均值±标准差：59±8)的血清反应性进行比较。
提供血清的不同组的患者的年龄和性别分布，经非配对双尾学 生氏t检验(unpaired 2-tailed Student’s t-test)评估，未表现出统计 学显著性差异。仅在慢性胰腺炎的组中，这两组的年龄(而非性别) 分布显著不同，因为该疾病通常发生于比PDA较年轻的年龄(平 均约44岁)。
细胞系和细胞提取物的制备
收集源于胰腺导管腺癌(Schoumacher R et al.，1990)的 CF-PAC-1细胞系(ECACC Ref.no.91112501)的细胞(107)，并用 Hank’s平衡盐溶液(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)洗涤。 将该细胞团(或细胞沉淀，pellet)冷冻-干燥过夜并储存于-80℃。 将该细胞团重悬浮于200μl再水合缓冲液[5M尿素、2M硫脲、4％ w/v CHAPS(Sigma Chemical Co.)、2％v/v IPG缓冲液3-10NL(GE Healthcare Bio-Sciences，Uppsala，Sweden)、80mM DTT(Sigma Chemical Co.)]和痕量溴酚蓝(Sigma Chemical Co.)中。通过Bradford 分析测定蛋白质浓度(Bio-Rad实验室)。
双向凝胶电泳(2-DE)
将100μg来自CF-PAC-1细胞系的蛋白提取物通过凝胶中再水 合(in gel rehydration)上样于7cm IPG胶条(strip)上(pH 3-10NL)， 用于分析和制备型凝胶。在IPGphor IEF unit system(GE Healthcare Bio-Sciences)上实施等电聚焦(IEF)，电压梯度达5000V，共 16000Vh。SDS-PAGE运行前，将IPG胶条用Tris/HCl缓冲液(50mM； pH 8.8)、尿素(6M)、甘油(30％v/v)、SDS(2％w/v)和DTT(2％ w/v)的溶液平衡15分钟，随后在含碘乙酰胺(2.5％w/v)和溴酚 蓝(而非DTT)的相同缓冲液中再平衡5分钟。为了进行双向电泳， 利用Novex X-Cell IITM Mini-cell system(Invitrogen)，使7cm的胶 条(strip)以恒定200V在小4-12％Bis-Tris 预制凝胶(Invitrogen，格罗宁根(Groningen)，荷兰)上进行电泳 (run)，并利用Novex X-Cell IITM Blot Module(Invitrogen)转移至 Hybond ECL硝基纤维素膜(GE Healthcare Bio-Sciences)上或者经 银染用于质谱分析(Shevchenko A et al.，1996)。
利用GE Healthcare Bio-Sciences提供的pH梯度图，从蛋白斑 点在2-DE凝胶上的位置估计蛋白斑点的pI值。通过与已知分子量 的SeeBlue Plus2预染标准(Invitrogen)的迁移比较，计算蛋白质 的分子量。用“ImageScanner”(GE Healthcare Bio-Sciences)获取2-DE 凝胶图像并用“ImageMaster Labscan Ver 3.00”软件(GE Healthcare Bio-Sciences)记录为TIFF格式。
蛋白质印迹分析
用封闭缓冲液(由含5％脱脂奶粉的TBS组成)将膜在4℃孵 育15小时，然后用血清(工作稀释度1∶200，用含0.05％Tween 20 和5％脱脂奶粉的TBS稀释)孵育4小时。洗涤后，将膜用结合辣 根过氧化物酶(HRP)的兔抗人免疫球蛋白G(IgG)抗体(Santa Cruz Biotechnology)以1∶1000的稀释度在室温下孵育90分钟。
可替代地，对于利用纯化的第一抗体的蛋白质印迹分析，从 2-DE凝胶印迹而来的硝基纤维素膜(nitrocellulose membranes)用 1∶1000稀释的抗体于25℃孵育1小时进行检测，所述第一抗体为 小鼠源的[例如单克隆抗体抗烯醇化酶19/128(Moscato S et al.，2000 中表征的克隆19/12的亚克隆)、抗-磷酸丙糖异构酶1(Abnova Corporation)、抗-角蛋白10(Chemicon International)、抗-延伸因子 tu(Abnova Corporation)]或兔源的[例如多克隆抗体抗-乙醛脱氢酶 1(Chemicon International)、抗-葡萄糖-6-磷酸盐1-脱氢酶(Bethyl laboratories)、抗-异柠檬酸盐脱氢酶(Biogenecis Ltd)和抗-cofilin 1 (Cell Signaling)]。随后，按照生产商的说明书，将膜用结合HRP 的特异性第二羊抗体，抗小鼠IgG或抗兔IgG(Santa Cruz Biotechnoly)孵育1小时。
胰腺组织的蛋白质印迹分析利用共30-50mg新鲜冰冻组织实 施，该组织在400μl裂解缓冲液(包含50mM TRIS/HCl pH 7.4、 150mM NaCl、1％NP40、1％Triton X-100、1mM DTT、10μl/ml抑 制性混合物、1mM PMSF(均购自Sigma Chemical Co.)和10μl/ml 核酸酶混合物(GE Healthcare Bio-Sciences))中于冰上进行匀质化 处理(T18basic UltraTurrax)。用超声仪(ultrasound sonicator) (Hielscher UP200S，3×40秒，振幅40％，周期(cycle)0.5)进行 超声降解(sonication)后，将该混合物离心(4℃，13000rpm/min， 30分钟)。上清中包含20μg蛋白提取物并用Bradford分析(Bio-Rad Laboratories)进行测定，在小4-12％Bis-Tris(双 [三(羟甲基)]氨基甲烷)预制凝胶(pre-cast gel)(Invitrogen)上进 行电泳，并如上所述转移至硝基纤维素膜上。
免疫检测利用ECL(增强化学发光，GE Healthcare Bio-Sciences)实施，随后在hyperfilm(GE Healthcare Bio-Sciences) 上进行放射自显影。用“ImageScanner”(GE Healthcare Bio-Sciences) 获取已显影的膜的图像，并用“ImageMaster Labscan Ver 3.00”软件 (GE Healthcare Bio-Sciences)记录为TIFF格式并用Image Master 2D Elite version 3.1软件(GE Healthcare Bio-Sciences)进行分析。
利用质谱(MS)鉴定蛋白
为了进行MS分析，将感兴趣的斑点从制备型2-DE凝胶上切 割下来，并利用基质辅助的激光解吸电离/飞行时间(MALDI-TOF) 进行分析，必要时，利用电喷雾电离(ESI)进行分析。
用25mM碳酸氢铵和50％乙腈的溶液将蛋白脱色过夜，随后 用胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)进行凝胶中消化，如前所 述(Hellman U et al.，1995)。为了进行MALDI-TOF MS，将每一种 肽混合物0.5μl置于目标盘(target disk)中并使其风干。随后，将 0.5μl基质溶液(1％w/v α-氰基-4-羟基肉桂酸/30％乙腈，0.1％TFA) 应用于干燥样品，并使其再次干燥。利用Bruker Reflex III MALDI-TOF质谱仪获得质谱。蛋白消化物的MS谱的判读 (interpretation)利用MS-Fit软件(http://prospector.ucsf.edu； Chamrad D et al.，2004)通过“肽质量指纹(peptide mass fingerprinting)”(PMF)而进行。
为了实施MS/MS实验，将胰蛋白酶肽混合物脱盐并在ZipTipC18 仪(Millipore)中浓缩。用60％甲醇加1％甲酸洗脱后，将4.5μl 胰蛋白酶肽混合物吸入涂有金的硅硼毛细管(gold-coated borosilicate capillary)(Proxeon Biosystems)并在安装有纳ESI源(纳 电喷雾离子源，nano ESI source)的LCQ Thermo(ThermoFinnigan) 离子阱质谱仪中分析。将毛细管电压设为46V，喷雾电压设为1.8 kV。收集来自全扫描质谱的最稳定信号，并通过低能碰撞诱导解离 (CID)进行碎裂，标准化碰撞能量范围为22-24％。
某些蛋白还利用装配有ESI离子源的LCQ DECA XP Plus离子 阱质谱仪(ThermoFinnigan)通过LC-MS/MS来鉴定。利用Surveyor (自动采样器和泵)仪(ThermoFinnigan)，以10μl注射体积、200 μl/min流速，在C18柱Luna，150×2.0mm(Phenomenex)上进行 层析分离，其后为MS分析仪。
为了进行所有MS/MS数据分析，采用Bioworks 3.0 (ThermoFinnigan)软件，并利用FASTA软件 (http://www.ebi.ac.uk/fasta33/；Johnson R et al.，2005)将所得序列与 EBI数据库中存在的人蛋白序列进行比较。
统计分析
所有的统计均利用GraphPad Prism软件进行计算。数据以均值 ±SEM(均值的标准误差)示出。利用非配对双尾t检验估计PDA 和正常胰腺组织中不同蛋白表达的显著性。双侧P值＜0.05可认为 具有统计学显著性。
结果
CF-PAC-1细胞系的蛋白质组，常用作用于PDA相关蛋白表达 和细胞增殖的模型(Bouvet M et al.，2001；Szepeshazi K et al.，2005)， 其用来利用PDA患者的血清作为第一抗体的来源而鉴定与PDA相 关的蛋白和抗体的存在。
来自该细胞系的蛋白提取物利用2-DE进行分析，通过银染色 确定代表性的双向图谱。该途径可将该提取物中所包含的蛋白分离 为根据其在2-DE凝胶中的密度和位置而分类的“斑点”，且由此可 大致确定蛋白质的量、分子量和pI。
将2-DE凝胶转移至膜上，以通过蛋白质印迹法利用一组来自 PDA患者或非PDA患者(包括健康个体、患其他癌症的患者以及 患慢性胰腺炎的患者)的血清进行分析。不同的斑点图谱之间(以 及2-DE凝胶的银染图像与相对应的蛋白质印迹图像之间)的比较， 可实现PDA相关斑点的鉴定，该PDA相关斑点可例如通过蛋白片 段的质谱分析进一步表征，而该蛋白片段利用以受控方式消化蛋白 的酶从这些斑点中提取(图1)。
利用这种途径，筛选出10个斑点并将其进一步表征为可利用 来自PDA患者的血清抗体而唯一识别(图2A)。该分析限于人IgG 抗体，因为已采用的第二抗体特异于这种同型(isotype)。将该10 个斑点从制备型凝胶切割下来，并通过MALDI-TOF MS进行分析 以鉴定其对应于哪种人类蛋白。利用该途径，将9种不同蛋白鉴定 为PDA相关抗原。两对斑点对应于相同蛋白的同种型，一个斑点 包含属于两种不同蛋白质但不能利用2-DE完全分离的序列。在利 用对照血清而实施的蛋白质印迹法中，所有这些斑点均不存在或几 乎检测不到。结合这些斑点中的一种或多种蛋白的第一抗体可在显 著比例的获自PDA患者的血清中鉴别出(表I)。
在这些PDA相关抗原性蛋白中，可根据生物学活性的类型(其 在文献中已指出)区分为两类蛋白。第一组蛋白包括代谢酶：α-烯 醇化酶(存在于两个斑点中，每一个斑点对应于一个特定的同种 型)、磷酸丙糖异构酶(存在于两个斑点中，每一个斑点对应于一 个特定的同种型)、视黄醛脱氢酶-1、葡萄糖-6-磷酸盐-1-脱氢酶、 延伸因子Tu、和异柠檬酸盐脱氢酶。第二组蛋白中的大多数被表征 为细胞骨架蛋白：I型角蛋白细胞骨架10和Cofilin 1。
除了利用CF-PAC-1细胞和人血清得到的结果，将从健康和 PDA个体中获得的胰腺提取物利用抗这些蛋白的纯化抗体(而非人 血清)作为第一抗体在蛋白质印迹法中进行比较。该分析可实现蛋 白总量(而非限制于一种同种型)的定量，但其表明在获自PDA 患者的活检组织的胰腺组织中这些蛋白均有不同程度的过表达(表 I)。
这些蛋白(以及PDA血清中针对其的特异性抗体的存在)的 诊断价值通过区分对应于PDA血清中每一种蛋白的斑点是否存在 而进一步评估，PDA血清获自根据疾病分期而分组的患者，并采用 患慢性胰腺炎患者的血清作为对照。
蛋白质印迹分析表明，针对不同蛋白的自身抗体的存在及其量 在不同PDA分期的患者中并非均一分布(图2B)。在对照血清中， 针对大多数蛋白的自身抗体均不存在，而在II期PDA患者中，除 了ENOA 1/2是明显例外，对大多数蛋白而言，PDA血清包含其的 频率略微升高(低于25％)。自身抗体生成谱中，这些频率在大多 数晚期得到了证实，其中，鉴于III期和IV期PDA中其频率持续 增加，因此针对α-烯醇化酶同种型的自身抗体同样是人们最感兴趣 的。
结论
一种基于血清学的方法，其结合人胰腺肿瘤细胞系(CF-PAC-1) 的2-DE表达谱和蛋白质印迹分析(利用PDA患者血清中的人IgG 作为第一抗体)，可鉴定有限数量的人蛋白及其同种型，而PDA患 者针对这些蛋白和同种型产生特异性体液应答。除了仅有的一个例 外(AL1A1)，这些蛋白的表达在PDA活组织检查中均上调。此外， 针对这些PDA相关蛋白的抗体的产生，至少对某些抗原而言，看 来在疾病晚期显著增加。
这些结果证实了血清学方法在鉴定早期PDA诊断的可能标志 物(在本情形中，大多数位于细胞内)方面的适用性。免疫系统对 细胞内蛋白发生反应的机制尚不清楚，但可能依赖于肿瘤形成的独 特环境，其能够改变肿瘤细胞中细胞内酶的定位。
Cofilin1(COF1)，作为一种在侵入伪足(invadopodium)的形 成中所涉及的肌动蛋白解聚酶，在肌动蛋白重塑、迁移和癌症中发 挥作用(Yamaguchi H et al.，2005)，且可能是肿瘤细胞应答趋向性 或生长因子刺激的方向性(directionality)所必需的(Mouneimne G et al.，2004)。之前曾观察到COF1的过表达与PDA动物模型相关 (Cecconi D et al.，2003；Sinha P et al.，1999)。
α-烯醇化酶是一种高度保守的代谢酶，具有多种特性且可在不 同环境中检测到(Pancholi V，2001；Piast M et al.，2005；Terrier B et al.，2007)。其在细胞表面上作为纤溶酶原受体而表达 (Lopez-Alemany R et al.，2003)并可由B细胞识别，可能用作一种 B细胞激活剂(Babu J et al.，2002)。在胰腺腺癌中已经检测到两种 同种型，但未描述其在翻译后修饰方面的分子特征(Shen J et al.， 2004)。
针对α-烯醇化酶的自身抗体已经在多个不同的生物学和疾病 模型中得到鉴定，如癌症相关的视网膜病(Adamus G et al.，1998； Adamus G et al.，1996)、非小细胞肺癌(non-small lung cancer)和其 他非胰腺的癌症(WO 07/072219；US20070172487：He P et al.， 2007)、胆汁性肝硬化(Akisawa N et al.，1997)、脑病(Fujii A et al.， 2005)和自身免疫病(Ballot E et al.，2003；Bogdanos D et al.，2004； Gitlits V et al.，2001)，其中α-烯醇化酶作为一种同种型或多种同种 型而存在(但还没有ENOA磷酸化同种型特异性表达的证据)。人 们已经利用噬菌体展示(Arza B et al.，1997；Kemp E et al.，2002)或 肽(Adamus G et al.，1998；Sato N et al.，2000；Walter M et al.，1995； Fujii A et al.，2005)研究了α-烯醇化酶及α-烯醇化酶特异性抗体或 自身抗体的特征。
本发明的结果证实，鉴于PDA患者血清中抗该蛋白的两种特 定同种型(ENOA 1/2)的自身抗体的出现频率和特异性生成，特定 的α-烯醇化酶同种型及用于检测它们的抗体可作为一种用于PDA 诊断特别有用的工具(表I和图2B)。所述抗体可特异于全部或多 数同种型共有的表位(如实验中采用的纯化抗体)或将PDA相关 同种型与其他同种型区分的表位(如那些在PDA血清中存在的抗 体)。此外，PDA从II期至IV期进展的特征在于抗ENOA 1/2自身 抗体生成的极显著增加，表明与肿瘤大小和生长能力直接关联。
对这些同种型的更加详细的分析不仅对于确定自身抗体对 PDA诊断的预测价值非常重要，而且对于更加深入理解将其与PDA 及与抗该癌症的可能治疗方法联系的分子机制非常重要。
实施例2：分析CF-PAC-1细胞中由自身抗体检测的α-烯醇化酶同 种型
材料&方法
MS分析
将斑点从制备型2-DE凝胶上切割下来并通过基质辅助的激光 解吸电离/飞行时间(MALDI-TOF)进行分析。蛋白用含0.025mol/L 碳酸氢铵和50％乙腈的溶液脱色过夜，随后用胰蛋白酶(Promega， Madison，WI)进行凝胶中消化，如前所述(Hellman U et al.，1995)。 为了进行MALDI-TOF MS，将每一种肽混合物0.5μl置于目标盘中， 并使其风干。随后，将0.5μl基质溶液(1％w/v α-氰基-4-羟基肉桂 酸/30％乙腈，0.1％TFA)应用于干燥样品，并再次使其干燥。利用 Bruker Reflex III MALDI-TOF谱仪(Bremen，Germany)获得谱图。 蛋白消化物的MS谱的判读利用MS-Fit软件通过“肽质量指纹” (PMF)来进行。
磷酸化分析
人α-烯醇化酶蛋白序列的分析利用下列可在因特网上使用的 软件而实施：NetPhos[http://www.cbs.dtu.dk/services/；(Blom N et al.， 1999)]、NetPhosK[http://www.cbs.dtu.dk/services/；(Blom N et al.， 2004)]、dbPTM[http://dbPTM.mbc.nctu.edu.tw/；(Lee T et al.，2006)]、 PPSP[http://bioinformatics.lcd-ustc.org/PPSP/；(Xue Y et al.，2006)]和 GPS[http://bioinformatics.lcd-ustc.org/gps web/predict.php；(Xue Y et al.，2005)]。
如前所述(Yamagata A et al.，2002)，采用λPPase(New England Biolabs Inc.)实施磷酸酶处理，并做了如下改良。将团状(pelleted) CF-PAC-1细胞(30×106)重悬浮于1ml裂解缓冲液(1％w/v NP40、 1％w/v SDS、50mM Tris pH 7.6和150mM NaCl蛋白酶抑制剂混合 物)中达15小时。用去离子水将裂解物(120μl，相当于2mg蛋 白)调至终体积1240μl，然后加入20μl的20mM MnCl2溶液和20 μl的λPPase缓冲液。添加完成后，轻轻地将溶液混匀。将该混合 物分为几等份，其中每一等份中加入600单位的λPPase。混匀后， 将这些等份于30℃孵育15小时。蛋白经丙酮和氯仿沉淀并用于 2-DE分析(参见实施例1)。
基于染料检测磷蛋白是在2-DE凝胶中利用ProQ磷蛋白荧光染 料(Molecular Probes(分子探针))并通过用于检测总蛋白的Sypro Ruby染色(Bio-Rad)而实施的，如生产商说明书和文献中所述(Wu J et al.，2005)。简言之，在2-DE之后，通过首先在50％甲醇/10％ 醋酸中固定凝胶30分钟而实施Pro-Q染色。随后用双蒸水洗涤凝 胶，并对其进行Pro-Q Diamond磷蛋白染色4小时。在用Sypro Ruby 荧光染料染色(过夜)前，通过用含20％乙腈的50mM醋酸钠， pH 4.0连续洗涤而进行脱色。
来自活检组织的胰腺组织中ENOA同种型表达的分析
将从健康个体或PDA患者(II期)活检组织获得的胰腺组织 在400μl裂解缓冲液(包含5mol/L尿素、2mol/L硫脲、4％w/v CHAPS、2％v/v IPG缓冲液非线性pH 3-10、0.08mol/L二硫苏糖 醇(DTT)、10μl/mL核酸酶混合物和痕量溴酚蓝)中在冰上进行 匀质化(T18 basic UltraTurrax，IKA)。用超声仪(ultrasound sonicator) (Hielscher UP200S，3×40s，振幅40％，周期0.5，Hielscher Ultrasonics GmbH)进行超声降解(sonication)后，将该混合物离 心(4℃，13000rpm，30分钟)，其中蛋白溶液包含于上清中。
蛋白浓度用Bradford分析进行测定。如实施例1中所述，将30 μg蛋白提取物在小4-12％Bis-Tris预制凝胶上电 泳，转移至硝基纤维素膜、用抗α-烯醇化酶单克隆抗体19/128 (Moscato S et al.，2000)于4℃温育过夜，并在蛋白质印迹中显现。
生成重组组氨酸标记的ENOA(rENOA)。
从已用编码融合于组氨酸标签的人ENOA(仅缺少最开始9个 氨基酸)序列的质粒进行转染的大肠杆菌细胞中纯化重组蛋白。简 言之，通过离心从1升培养物中收集细菌细胞，并将细胞团重悬浮 于20ml添加了溶菌酶(100μg/ml)和0.7％十二烷基肌氨酸钠的非 变性结合缓冲液(NBB，20mM磷酸钠和500mM氯化钠，pH 7.8) 中。将该悬浮液于4℃缓慢摇动15分钟。于冰上通过10次40秒 的高强度脉冲对细胞裂解物进行超声裂解。将该裂解物以10000 rpm于4℃离心5分钟，以沉淀(pellet)不溶性成分，将其重悬浮 于10ml富含蛋白酶抑制剂的胍盐裂解缓冲液(6M盐酸胍、20mM 磷酸钠、500mM氯化钠，pH 7.8)中，在室温下10分钟。将该裂 解物加至已平衡的柱(Ni-NTA琼脂糖柱，Invitrogen)中通过轻柔 摇晃在4℃经30分钟而结合于树脂。树脂用NBB洗涤两次，随后 用非变性洗涤缓冲液(NWB；NBB，pH 6.0)洗涤两次。洗脱利用 10ml咪唑洗脱缓冲液(350mM pH 6)来实施，生成重组组氨酸标 记的ENOA(rENOA)。将洗脱出的成分在无菌水中透析(dialyse)， 然后将其冻干并重悬浮于无菌无致热源的杜尔贝科磷酸盐缓冲溶 液(DPBS，Sigma)中。将各等份储存于-20℃。在鲎变形细胞溶解 测定(Limulus Amebocyte Lysate assay(Pyrogent；Bio Whittaker)) 中，内毒素水平低于0.03EU/ml。
利用患者血清和蛋白质印迹法分析CF-PAC-1中ENOA同种型的表 达
如前所述，将CF-PAC-12-DE凝胶电转移至Hybond ECL硝基 纤维素膜(GE Healthcare)上。用含5％脱脂奶粉的TBS封闭1小 时后，在不同条件下用ENOA 1/2+患者的三份血清池(用TBS1： 100稀释)孵育印迹。
在一系列实验中，孵育该膜之前，首先于4℃将血清池(pool of sera)在震荡器上与20μg/ml的重组α-烯醇化酶(rENOA)一起孵 育15小时。在另外一系列实验中，首先将膜用2ml含600单位λ PPase的PBS、40μl 20mM的MnCl2溶液和40μlλPPase缓冲液于 30℃孵育15小时。再将膜封闭1小时、用TTBS洗涤3次(15分 钟)并用混合血清(稀释度1∶100)孵育。
如实施例1中所述，血清中抗体与ENOA同种型的结合利用标 记的抗人抗体在蛋白质印迹法中显现。作为所固定的ENOA量的对 照，膜用鼠单克隆抗体抗烯醇化酶19/128进行再次检测(参见实施 例1)。
结果
在证实PDA患者血清中的抗体特异性检测到两种人α-烯醇化 酶的同种型后，我们利用不同方法表征这些同种型(以及CF-PAC-1 细胞中存在的该蛋白的任何其他同种型)的特征。
比较利用抗α-烯醇化酶的纯化抗体或不同PDA患者的血清所 获得的蛋白质印迹、2-DE凝胶的银染色以及质谱分析，表明2-DE 凝胶中还存在另外4个斑点(对应于与PDA不相关的其他α-烯醇 化酶同种型)，具有相似分子量但实验性pI值低于ENOA 1/2(表 II)。这些证据是利用CF-PAC-1或MiaPaCa-2细胞提取物在2-DE 凝胶分析中获得的。
从这些斑点获得的肽与ENOA片段相同(且明显不同于高度相 似的人γ-烯醇化酶；图3)，证实了蛋白质印迹证据，即这些斑点应 该对应于ENOA同种型，其中仅ENOA 1/2是PDA相关的。翻译 后修饰是通常将一种同种型与其他同种型相区别的特征。初步分析 似乎排除了糖基化(鉴于分子量的改变有限)，而暗示了磷酸化修 饰(鉴于pI下降)。
人α-烯醇化酶的序列包含几个酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基， 它们是可被不同激酶磷酸化的可能靶标。这种假设通过在2-DE分 离之前将蛋白提取物暴露于广泛有效的磷酸酶来观察采用磷酸化 依赖性抗体所检测的斑点强度是否发生变化而加以检测，如关于其 他蛋白的文献中所示出的(Kumar Y et al.，2004)。实际上，对应于 多数酸性同种型(其为PDA相关的ENOA 1/2和ENOA同种型3； 表II)的ENOA斑点的强度在磷酸酶预处理的CF-PAC-1细胞提取 物中明显下降。此外，ENOA同种型3(比ENOA 1/2丰度更高) 的质谱分析表明，该同种型中残基55、57、200、236、237、257、 和419发生了磷酸化(图4)。
之前关于α-烯醇化酶体内或体外磷酸化的报道(Cooper J et al.， 1984；Eigenbrodt E et al.，1983；Marcus K et al.，2000；Rush J et al.， 2005；Stasyk T et al.，2005；Molina H et al.，2007)大体上均未指出至 少三个特定残基可同时发生磷酸化，尤其是，ENOA同种型中的残 基55、57、200、236、237、257、和419发现可发生磷酸化。此外， ENOA同种型3中磷酸化残基的组合很难利用对ENOA蛋白序列基 于软件的分析而加以预测，因为其中存在大量的候选磷酸化位点 (图4)。不能排除ENOA同种型3可能具有在质谱分析阶段未检 测到的其他磷酸化位点，但ENOA 1/2应该含有翻译后修饰的残基 (根据pI值及采用磷酸酶得到的结果，极可能也发生了磷酸化)， 这些翻译后修饰的残基将其与ENOA同种型3相区分。
很明显，多于一种的从ENOA3同种型获得的肽未表现出这种 修饰，其中对所述肽的磷酸化状态进行了测定并且其含有候选的磷 酸化位点。例如，文献中特异性鉴定为在已建立的白血病T细胞系 中发生磷酸化的酪氨酸44(Rush J et al.，2005)在ENOA同种型3 中则未发现磷酸化。类似地，如在ENOA同种型3中(图4)，已 鉴定残基57与残基63共同磷酸化(Molina H et al.，2007)，而不是 与残基55共同磷酸化。
通过将蛋白质印迹法中获得的图像与利用染料染色2-DE凝胶 中总蛋白(银染或Sypro Ruby)或特异于磷蛋白(Pro-Q Diamond) 的染料染色得到的图像进行比较而进一步分析利用PDA血清和 ENOA特异性抗体检测到的ENOA同种型中的磷酸化。该分析证实 在CF-PAC-1细胞中仅ENOA 1/2和3发生了磷酸化(图5A；表II)。
还通过蛋白质印迹法检测了获自经手术治疗的PDA患者(II 期；n＝7)的组织和正常胰腺组织(n＝1)中的ENOA表达，所采 用的抗烯醇化酶抗体结合在PDA患者血清中检测到的全部六种同 种型共有的特定表位。在7例PDA活检组织中，有6例中检测到 了全部六种ENOA同种型。相比之下，在正常胰腺中仅四种同种型 (ENOA 3、4、5和6)可清晰检测到(图5B)。因此，可以推断出 不仅PDA患者产生抗ENOA 1/2的抗体，而且这些同种型在PDA 胰腺组织中显著过表达。
采用CF-PAC-1细胞提取物在2-DE和蛋白质印迹中进一步研 究PDA患者血清抗磷酸化ENOA的反应性，以了解该反应性是否 特异性针对它们的磷酸化表位。因为PDA患者血清对全部6种同 种型均发生反应，因此其可能包含对磷酸化或非磷酸化表位均发生 反应的抗体。
在第一系列实验中，血清用不含磷酸化残基的重组人ENOA提 前孵育，以观察暴露于ENOA抗原是否改变血清识别参照胰腺细胞 系中ENOA同种型的能力。实际上，2-DE蛋白质印迹分析表明， 非磷酸化ENOA仅显著降低了对同种型3、4、5和6的反应性，而 未影响对ENOA 1/2同种型的反应性。这种迹象在另一系列实验中 进一步得到了证实，其中膜用磷酸酶(λPPase)提前孵育，以确定 患者血清中是否包含对磷酸化的ENOA 1/2同种型发生特异性反应 的抗体。如果不存在λPPase，该血清则识别全部ENOA同种型，其 中λPPase处理显著降低了血清对ENOA 1/2的反应性(图6)。
在经过处理或未经处理的膜中，抗ENOA mAb同样检测到了 全部同种型(数据未示出)，这些数据证明，PDA患者血清中的抗 体与磷酸化的ENOA 1/2同种型发生了特异性反应。
结论
利用不同的蛋白质组学方法，已经鉴定了多种ENOA同种型以 及针对这些同种型的抗体(Adamus G et al.，1998；Adamus G et al.， 1996；Akisawa N et al.，1997；Ballot E et al.，2003；Bryborn M et al.， 2005；Lubec G et al.，2003；O’Dwyer D et al.，2002)。然而，这些报道 未明确证实磷酸化状态和位置与PDA进展中抗特定同种型的自身 抗体的产生之间的相关性。
其他文章报道了例如采用患者血清在2-DE凝胶的蛋白质印迹 中所检测到的与特殊细胞处理(Baty J et al.，2005；Bottalico L et al.， 1993；Kanamoto T et al.，2002)或疾病(Byrjalsen I et al.，1999； Clauser K et al.，1995；Nakanishi T et al.，2006；Tanaka Y et al.，2006； US20070172487)相关的α-烯醇化酶斑点的强度和/或数量的变化， 表明其可能是由于诸如磷酸化的翻译后修饰。
其他报道中，还指出了在通过2-DE凝胶分析的PDA样品中， 人α-烯醇化酶是几种过表达的蛋白之一，并在mRNA和免疫细胞 化学水平得到了确认，但未提到那些可表征与PDA相关的α-烯醇 化酶的同种型的特异性磷酸化(WO04/55548；Shen J et al.，2004； Nakanishi T et al.，2006；Mikuriya K et al.，2007)。
在α-烯醇化酶中检测到的大量翻译后修饰(表III)中，较早的 文献表明在体内和体外均已检测到磷酸化(Cooper J et al.，1984； Coussens P et al.，1985；Eigenbrodt E et al.，1983；Golden A et al.， 1986)。最近，已经利用2D凝胶、商品化小鼠抗磷酸酪氨酸的抗体 (clone 4G10，cod.05-321；Biomol)和质谱在人血小板中(Marcus K et al.，2000)检测到了α-烯醇化酶的两种磷酸化同种型。利用2D- 凝胶、放射性标记和质谱在TGFβ1处理的细胞(MCF-7细胞系) (Stasyk T et al.，2005)中或者在MIAPaCa细胞(一种胰腺癌细胞 系)中检测到了α-烯醇化酶的一种磷酸化变异体(variant)，其中烯 醇化酶磷酸化随着用黄酮类处理而降低(Lee L et al.，2002)。此外， 双磷酸化位点位于酪氨酸残基(44和286；Rush J et al.，2005)或酪 氨酸与丝氨酸残基(57和63；Molina H et al.，2007)。
然而，这些文献均未将PDA与已在至少三个位点发生磷酸化 的α-烯醇化酶同种型的额外磷酸化、以及与结合其的抗体关联起 来。
实施例3：结合α-烯醇化酶的抗体对表达α-烯醇化酶磷酸化同种型 的转化细胞系的生长和增殖的影响
材料&方法
用于细胞系增殖的分析
采用完全细胞培养基(含10％胎牛血清的RPMI-1640)通过在 96孔微孔板(microplate)中接种2-10×103细胞/孔而实施指定细胞 系的体外细胞增殖分析，含有或不含抗α-烯醇化酶的单克隆抗体 72/1(Moscato S et al.，2000)或小鼠IgG 1同型对照单克隆抗体 (R&D Systems)用做阴性对照。
44或68小时后，每个孔中加入20μl甲基四唑(methyl tetrazolium)溶液(MTT；5mg/ml)，于37℃再培养4小时。弃去 培养基，用DMSO溶解细胞。培养板通过分光光度计在540纳米下 读数。
结果
如通过2-DE和蛋白质印迹法测定的，抗α-烯醇化酶的抗体对 呈现不同α-烯醇化酶表达谱的细胞系生长的影响是通过测定MTT 的掺入(incorporation)而检测的，MTT是一种可掺入存活细胞内 的化合物，与活性细胞生长、代谢和增殖有关。
利用基于MTT的比色测定，在表达全部六种同种型的转化细 胞系中均得到了细胞增殖的显著抑制，与其是胰腺来源还是非胰腺 来源无关。利用IgG 1同型(isotype-matched)对照单克隆抗体或 不表达所述三种磷酸化ENOA同种型的细胞系，该影响则极低(表 IV)。
因此，抗α-烯醇化酶的抗体能够抑制(至少部分地)具有特定 α-烯醇化酶磷酸化谱的细胞系生长和增殖，α-烯醇化酶可在PDA相 关生物学样品中检出(如血清或来自活检的组织)。
结论
即便人们通常认为α-烯醇化酶是一种细胞质蛋白 (cytoplasmatic protein)，其仍然可被表达为一种细胞表面上的生物 学活性蛋白(Arza B et al.，1997；Bergman A et al.，1997；Moscato S et al.，2000；Lopez-Alemany R et al.，2003)以及一种可溶性因子(Babu J et al.，2002；Demir A et al.，2005)。
体外数据表明，只要转化细胞系表达α-烯醇化酶的磷酸化同种 型，该转化细胞系的生长就会由于抗体结合于在胞外空间中表达的 α-烯醇化酶同种型(作为一种细胞表面受体和/或作为一种可溶性蛋 白)中所存在的表位而减慢。
因此，特异性结合呈现α-烯醇化酶磷酸化同种型的细胞的单克 隆抗体，可抑制转化细胞系的增殖。控制细胞增殖的这种机制看来 不仅存在于PDA中，还存在于其他表现出该分子特征的癌症形式 中，且可被恰当的单克隆抗体作为靶标，用于癌症相关的治疗性应 用，例如制备用于PDA治疗的药剂以及用于诊断和治疗PDA患者 的方法。
表I.被PDA患者血清识别为抗原的蛋白
ND：不确定
a通过银染和蛋白质印迹法在2-DE凝胶中检测为PDA特异性(见图1B中相 应斑点编号的位置)
b用特异于每一种蛋白的抗体实施蛋白质印迹法。反应性线(reactive line)的 强度表示为任意单位的标准化线强度(normalized line intensity)(三次实验的 均值±SEM)
c采用配对双尾t检验估计所选蛋白标准化线强度的统计学显著性
d这些蛋白共定位(colocalize)于同一个斑点中
表II.鉴定由PDA患者血清识别的ENOA同种型
LC-MS/MS分析
a人类非翻译后修饰的α-烯醇化酶的值为47kD
b人类非翻译后修饰的α-烯醇化酶的值为7.0
c所有非重复肽(non-duplicate peptide)的离子分值(ions scores)总和
表III：阐述α-烯醇化酶中除磷酸化外的翻译后修饰的精选文献
修饰 参考文献 乙酰化 Iwabata H et al.，2005 瓜氨酸化 Kinloch A et al.，2005 D-Asp Takata T et al.，2006 4-羟基壬烯 酸修饰 Kapphahn R et al.，2006 硝化 Casoni F et al.，2005；Kanski J et al.，2005；Shin S et al.，2004 氧化 Butterfield et al.，2006；Castegna A et al.，2002；Ishii T and Uchida K，2004；Perluigi M et al.，2005 酪氨酰化 Avram D et al.，2004
表IV：体外增殖分析的结果
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P25334STA-序列表.TXT
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比奥林诊断有限责任公司(Bioline Diagnostici S.R.L)
<120>与胰腺导管腺癌相关的新型抗原和抗体
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