A.定义
除非另外定义，这里使用的所有技术和科学术语具有与本研究所属领 域技术人员通常理解的相同的意义。遍及这里全部公开内容中所提及的所 有的专利、专利申请、公开的申请和出版物、GenBank序列、网站和其他 发表的材料，除非另外注释，在此全部通过引用并入。在本文术语具有多 种定义的情况中，优选那些在这个部分中的定义。其中参考提到URL或 其他这样的标识符或地址时，应理解这些标识符会变化并且因特网上的特 定的信息是不断变化的(come and go)，但是通过搜索因特网可找到等同 的信息。另外参考证明这些信息的可获得性和大众公开程度。
如这里所用，术语“大分子”用来表示主要由两个或多个单体的亚单元 组成的分子，或其由键连接的衍生物，或能形成三级结构的任何大分子。 大分子可为，例如多核苷酸、包括DNA、RNA和肽核酸(PNA)的核酸 分子、多肽、蛋白质、糖类或脂质或其衍生物或结合，如分别包含肽核酸 部分或糖蛋白的核酸分子。尽管这里根据蛋白质描述，但是这里提供的所 述方法、组合物、结合、试剂盒和制造物品可适于与这里定义和提供的其 他大分子的用途。
如这里使用的术语“大致上”或“大致”通常表示相对于参考至少约60％ 或60％，约70％或70％，或约或正好75％、80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或更高，所述参考如例如，核酸或蛋白质序列或实体的 原始组合物。这样，包含微颗粒的组合物“大致上”分离了所有其他的污染 物和/或成分(包括平衡离子、盐和来自混合(cocktail)溶液的溶剂)表示至 少约60％或60％，约70％或70％，或约或正好75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或更高量的污染物和/或试剂已从微颗粒形成 的混合溶液中被去除。术语“大致相同”或“大致同源”或类似的术语随那些 相关领域技术人员理解情景而变化且通常表示至少约60％或60％，约70％ 或70％，或约或正好75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％， 99％或更高的同一性。
在这里使用的术语“主要由......组成(consists essentially of)”和“主要 组成为(consisting essentially of)”是指大致上所有的与实体或其性质不相关 的其他组分/成分已经被去除或从所述实体中分离的实体。这样，“主要组 成为(consisting essentially of)”微颗粒的组合物表示所有其他的成分如污染 物和溶剂，已经大致上从包括所述微颗粒的溶液/悬液中去除。
这里使用的术语“微颗粒”与“微球”可互换并指包括大分子和传送感兴 趣的试剂，如药物或营养添加物到受治疗者的颗粒，其尺寸范围(平均长 度，宽度或直径)为约或正好0.001微米(μm)到约或正好500微米。所 述试剂可为大分子，如蛋白质、核酸、脂质或多糖，或形成微颗粒的大分 子可为活性试剂如药物或营养添加物的载体。所述微颗粒也可包括合成大 分子，所述大分子包括聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚 乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)和天然聚合物，如白蛋白、明胶、壳聚糖和 葡聚糖。这里描述的“微颗粒”可包括和可制备自一种特定的天然或合成大 分子，或来自不止一种类型的同样的天然或合成大分子(如不止一种类型 的蛋白质)，或来自不止一种不同类型的天然或合成大分子的结合(如蛋 白质和核酸或蛋白质和合成聚合物)。
这里使用的术语“微颗粒”也通常指一种并不是其生产自的全部溶液的 固体形态的颗粒，尽管这里也考虑包含大分子的溶液的冷冻和/或干燥的颗 粒。而是，这里使用的微颗粒通常是溶液组分的一部分的集合，其包括盐、 平衡离子、溶剂和其它成分，这些由包括但不限于沉淀、沉降、相分离和 胶体形成的方法形成。
这里使用的术语“沉淀”是指一种方法，借此溶液中感兴趣的一种或多 种溶质，如微颗粒的组分，不再存留在溶液中且形成与用来形成所述溶液 的一种或多种溶剂不同的相。微颗粒的沉淀和控制所述沉淀的微颗粒尺寸 可通过包括但不限于如下的多种方法完成：调整温度、离子强度、pH、介 电常数、平衡离子的浓度、有机溶剂浓度、添加聚电解质或聚合物、表面 活性剂、洗涤剂、或其组合。
这里使用的术语“相分离”是指单一同质性的相(如溶液)到两种或更 多的相的转化，如在溶剂或溶液中固体颗粒的混悬液。
这里使用的术语“沉降”是指如微颗粒等颗粒的运动，其是在液体混悬 液中或在应答如重力，离心力或电力等外界力时在溶液中形成。
术语“溶液”在这里与“混合溶液”使用上可以互换且是指两种或多种成 分在单一相、固体、液体或气体中的同质性的混合物，其中不同的成分只 有在分子水平才是可识别的。所述溶液可是一种液体，其中一种或多种如 盐的溶质是在如水或醇等溶剂中溶解或溶于如水和乙醇混合物的可混溶 的溶剂混合物中。所述溶液也可为一种液体溶液的冷冻形式。
这里使用的术语“可混溶的”是指一种或多种如液体，固体和气体的组 分混合在一起形成单一的同质性的相的能力。这样，如果两种液体可混合 在一起形成一种单一的同质性的液体，其不同的组分只在分子水平被识 别，那么它们是可混溶的。当组分是“部分可混溶的”，表示它们能混合在 一起形成一种在某个浓度范围但不是其它的浓度范围中单一的同质的相。 如这里使用的，当一种溶剂与另一种溶剂“部分可混溶”，表示当与另一溶 剂混溶时，在约或正好50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、 10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或更低体积/ 体积(v/v)的浓度其是可混溶的。
如这里使用的，“不可混溶的”表示当两种或多种的如液体，固体或气 体的组分被混合，它们形成不止一种相。如，当一种有机溶剂与一种含水 溶剂(如己烷和水)不混溶，所述有机溶剂作为不与含水溶剂层混合的分 离层是可见的。
如这里使用的，术语“多肽”表示至少两个氨基酸或氨基酸衍生物，其 包括大量修饰的氨基酸和氨基酸类似物，其是通过肽键相连，其肽键可能 是一个修饰的肽键。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”用在这里实质同义，尽 管本领域技术人员会认为肽通常包括少于约五十到约一百的氨基酸残基， 并且蛋白质通常取自天然来源和可能包括如，翻译后修饰。
多肽或蛋白质可翻译自包括至少编码序列的部分的多核苷酸，或没有 自然翻译的核苷酸序列一部分，未翻译因为如，其位于读码框而不是编码 框，或其为内含子序列，3’或5’非翻译序列，如启动子的调控序列或类似 的序列。多肽也可化学合成并可通过在翻译或化学合成后的化学或酶学方 法修饰。多肽可通过磷酸化(磷蛋白)，糖基化(糖蛋白，蛋白聚糖)或 类似的作用来进行翻译后修饰，其可在细胞中或体外反应中实行。
如这里使用的，术语“融合蛋白”是指取自不止一种蛋白或多肽的域的 轭合物。一个域可能是一个多肽标签，如His6标签。所述轭合物可通过化 学共轭，重组DNA技术或重组表达和化学共轭的组合来连接域而制备。
多种化学连接体(linker)对本领域技术人员是已知的，且包括但不限 于氨基酸和肽连接，其典型性地包括1到约60个氨基酸之间的，更通常 的是约10到30个氨基酸之间，异双功能的、可切割的交联体，其包括但 不限于N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸盐、硫代琥珀酰亚胺 基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸盐、4-琥珀酰亚胺基-氧代碳基-a-(2-吡啶 基二硫代)甲苯、硫代琥珀酰亚胺基-6-[a-甲基-a-(吡啶基二硫代)-甲苯 酰胺]己酸盐、N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)-丙酸盐、琥珀酰亚 胺基6[3(-(-2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸盐、硫代琥珀酰亚胺基6[3(-(-2- 吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸盐、3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰酰肼、Ellman 试剂、二氯三嗪酸(dichlorotriazinic acid)和S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸。
如这里使用的，术语“唾液酸酶融合蛋白”是指一种其中一个或多个域 为唾液酸酶或其部分的融合蛋白质，所述部分保留至少约60％或60％，约 70％或70％，或约或正好75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或更多的其催化活性。这里使用的唾液酸酶融合蛋白也可指一种融合 蛋白质，其包括与唾液酸酶大致同源的蛋白质或多肽和具有唾液酸酶的酶 活性。
如这里使用的，术语蛋白质的“催化域”是指一种蛋白质或多肽，其中 只有部分与唾液酸酶大致同源的序列是包括负责所述蛋白质催化活性域 的氨基酸残基序列(如SEQ ID NO：1中残基274-666被鉴别为粘性放线 菌唾液酸酶的催化域)，或其催化活性片段。所述催化域或其催化活性片 段保留至少约60％或60％、约70％或70％、或约或正好75％、80％、85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多所述蛋白质的催化活性。
如这里使用的，术语“流动特性”是指一种致使“流动”能力的性质，其 中“流动”是可允许一种物质被倒出和采取其倒入的容器的形状，而不受到 由于如聚集的障碍的性质。流体通常具有“流动”的性质，这通常致使它们 可变形的，即它们能改变它们的形状。如这里使用的，术语“流体”包括包 含胶体的液体，其包括乳浊液、气溶胶和气体。液体，气溶胶和具有固体 颗粒(如微颗粒)悬浮的气体，也被认为是这里定义的“流体”。
如这里使用的，乳浊液定义为两种不混溶的液体的胶体，第一种液体 和第二种液体，其中第一种液体散布在第二种液体中。
如这里使用的，表面活性剂(或“表面-活性的试剂”(“surface-active agent”))是化学或自然产生的实体，当溶于含水溶液时，其降低溶液的表 面张力或溶液中两个或多个相间接触面的张力。表面活性剂分子通常是两 性的和包括亲水的头部基团和疏水的尾部。所述表面活性剂分子可能作为 稳定剂和/或增强这里提供的微颗粒的流动特性。
如这里使用的，组合是指两个或多个用途项目间的结合。如，微颗粒 和吸入器的组合能用于治疗剂的肺部传送。
如这里使用的，组合物是指任何混合物。其可能是溶液、悬浊液、液 体、粉末、糊剂、含水的、不含水的或其任何组合。
如这里使用的，试剂盒是指一种组合，其中组分任选地与用途说明书 和/或用来使用这种组合的试剂和仪器一起包装。
如这里使用的，术语“酶”表示催化化学反应或生物过程的蛋白质。酶 通常促进和/或加速这种反应和过程。此外，酶通常对特定的反应或过程是 特异的，其转化特异的一组反应物到特异的产物。
如这里使用的，术语“胶体”是指如微颗粒的固体颗粒在液体中的分散 体，所述液体如在其中形成微颗粒的溶液。术语“胶体稳定性“是指胶体中 的微颗粒基本上不聚集。如，稳定的胶体是其中约30％、25％、20％、15％、 10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或更少的固体颗粒(如微颗粒)形 成聚集体的胶体。
术语“附聚物”是指一种或多种颗粒的结合体(association)，所述颗粒 如微球，其松散地通过范德华力或表面张力或静电力或其组合保持在一 起。在一些例子中，通过静电力保持的结合体可以定义为“絮凝物”。对这 里的用途，“附聚物”也包括“絮凝物”。附聚物通常容易被空气或液体中的 剪切力打开。术语“分散”或“分散性”是指颗粒的“流动”能力，即运动不被 如聚集体存在而阻碍的程度。
术语“聚集体”是指一种或多种颗粒的结合体，所述颗粒如微球、非晶 形的沉淀、晶体或玻璃状颗粒或其组合。聚集体通常不容易被断开，这阻 碍了它们分散或形成同质性的悬浊液或形成具有期望性质的气溶胶的能 力。
如这里使用的，术语“非变性的”是指提及蛋白质并且表示蛋白质的构 象，即它的二级结构，三级结构，四级结构或其组合时，其实质上没有从 自然存在状态的蛋白质改变。术语“非变性的”和“天然的”在这里可互换使 用并表示保留全部或至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的长度和/或自然构象的 蛋白质。这里互换使用的术语“非变性的”或“天然的”包括细胞中蛋白质的 自然的状态，如其长度和构象包括二级，三级和四级结构。如这里定义的， “非变性的”或“天然的”蛋白质包括这里提供的组合物中那些通常保留所有 或至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％的自然状态蛋白质的正常活性或功能的蛋白 质，所述活性或功能如作为一种营养物来提供氨基酸结构单元(building blocks)、抗氧化剂、酶、抗体、基因表达的调控子、支架等等。
如这里使用的，术语“活性”和“功能”与“生物活性”是可互换的并且是 指如蛋白质、维生素、矿物质或药物等化合物的体内活性，或化合物、组 合物或其他混合物体内给药产生的生理应答。这样，活性包括化合物，组 合物和混合物的治疗效果和药学活性。生物活性也可能在设计来试验或使 用这种活性的体外系统中观察到。
如这里使用的，“功能活性”也是与“活性”，“生物活性”或“功能”可互 换使用，并且是指显示与天然或非变性蛋白质相关的一种或多种活性的多 肽或其部分。功能活性包括但不限于生物活性、催化或酶学活性、抗原性 (结合抗多肽抗体的能力，或与多肽竞争结合抗多肽抗体的能力)、免疫 原性、形成多体的能力和特异结合到多肽受体或配体的能力。
如这里使用的，术语“变性的”是指蛋白质从其天然或非变性构象，即 其二级，三级或四级结构或其组合改变。改变构象通常通过包括消毒、辐 射、加热、化学制品、酶作用、暴露于酸或碱，和离子交换和其任何组合 的处理步骤进行。蛋白质的变性通常导致减少所有或一些，通常大于50％ 和至少约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％的包括天然或非变性状态的蛋白质活性和功能的原始性 质。
如这里使用的，术语“营养添加物”表示物质或组合物，其提供包括维 生素、矿物质、脂肪酸、氨基酸、碳水化合物、酶、蛋白质、生化物质和 它们的代谢物、草药和植物等营养物给如包括人的动物的宿主。通过营养 添加物提供到宿主的营养物可包括对生存，好的健康，治愈疾病或预防疾 病很重要的，在宿主饮食中缺少或不足的营养物，和认为增进健康，预防 疾病或治愈疾病但认为对生存或好的健康不是必需的营养物。
如这里使用的，“疏水的”是指物质是不带电的或不电荷极化的 (charge-polarized)，或不足够带电或不足够电荷极化来与水或其他极性溶 剂结合。疏水配体可能互相结合或与其他非极性分子或溶剂在水或极性溶 剂存在下通过疏水作用结合。疏水配体通常也是在非极性溶剂比在极性溶 剂中更可溶。非极性溶剂的例子包括以下：如己烷的烷烃、如二乙醚的烷 基醚、如苯的芳香烃类、和如二氯甲烷和四氯化碳的烷基卤化物、单、双 和三甘油酯、如油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸等脂肪酸、其共轭形式和 它们的酯。
如这里使用的，术语“治疗剂”表示当给药给包括人的宿主时，有效的 缓解或消除遗传的或获得的疾病的症状或现象的试剂或能治愈所述疾病 的试剂。
如这里使用的，“贮存期限”或“稳定性”是指微颗粒组合物制备后，所 述组合物保留至少约或70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％存在于组合物的初始蛋白质的活性，和如尺 寸、形状和气动粒径分布的微球的其它一般物理特性的时间。这样例如， 在这里定义的在约18℃到约25℃，26℃，27℃或28℃间范围的室温稳定 或具有贮存期限为30天的组合物在18℃到约25℃，26℃，27℃或28℃贮 存30天后会具有至少约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％的存在于组合物的初始蛋白质活性的量。这 里提供的所述微颗粒组合物的贮存期限通常地在55℃至少约10天，在42 ℃至少约2到3周和在25℃至少约8个月或更长，然而，这里包括这里提 供的方法生产的在任何温度下任何长度贮存期限的微颗粒组合物。
如这里使用的，“生物活性试剂”、“活性试剂”、“生物试剂”或“试剂” 是当被引入身体时任何引起如下的希望的生物应答的物质：在细胞，组织 或器官水平改变身体的功能和/或改变如体重和体形的美容外观。这种物质 可能是任何合成或自然的元素或化合物、蛋白质、细胞或包括药物的组织、 药物、治疗剂、营养添加物、草药、荷尔蒙或类似物或其任何组合。所述 术语也包括药学可接受的，这里特别提到的那些活性试剂的药理学活性衍 生物，其包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢产物、同分异构体、 片段、类似物等等。当术语“生物活性试剂”、“生物试剂”和“试剂”被使用， 或当特定的活性试剂被特别指定，其规定为包括活性试剂本身，和药学可 接受的药理学活性的盐、酯、酰胺、前药、活性代谢产物、同分异构体、 片段、和类似物。
如这里所使用的，“受治疗者”定义为包括哺乳动物，典型性地人的动 物。
如这里所使用的，“治疗有效量”是指当组合物以单一的剂型给药给受 治疗者，产生希望的治疗，预防或其他生物效果或应答的活性试剂的量。 在剂量中活性试剂特定的量会根据如活性试剂的性质、被治疗疾患的性 质、受治疗者的年龄和体型等条件而广泛地变化。
如这里所使用的，化合物的“药学可接受的衍生物”包括其盐、酯、烯 醇醚、烯醇酯、酸、碱、溶剂化物、水合物或前药。这些衍生物可以通过 本领域技术人员使用这种衍生的已知方法容易的生产。生产的所述化合物 可给药给动物或人而没有实质的毒性效果，并且要么是药学活性的要么是 前药。药学可接受的盐包括但不限于：如但不限于N，N’-二苯甲基乙二胺、 氯普鲁卡因、胆碱、氨、二乙醇胺和其他羟基烷基胺(hydroxyalkylamines)、 乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、普鲁卡因、N-苯甲基苯乙基胺、1-对-氯苯甲 基-2-吡咯烷-1′-基甲基苯并咪唑、二乙胺和其他烷基胺、哌嗪和三(羟 甲基)氨基甲烷的胺盐；如但不限于锂、钾、钠的碱金属盐类；如但不限 于钡、钙和镁的碱土金属盐类；如但不限于锌的过渡金属盐；如但不限于 磷酸氢钠和磷酸氢二钠的其他金属盐；且也包括但不限于：如但不限于盐 酸盐和硫酸盐的无机酸盐；如但不限于醋酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石 酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、丁酸盐、戊酸盐和富马酸盐的 有机酸盐。药学可接受的酯包括但不限于：包括但不限于羧酸、磷酸、次 膦酸、磺酸、亚磺酸和硼酸等酸性基团的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳 基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基和杂环基酯。
如这里所使用的，“治疗”表示其中病症、疾患或疾病的一个或多个症 状缓解或受益地改变的任何方式。治疗也包括这里所述的组合物的任何药 学用途，如用于治疗流感。
如这里所使用的，“有机溶剂”是指为有机化合物的溶剂，其为分子包 括碳和氢的大的化学化合物类别的任何成员。这些溶剂可包括，如来自下 列类别的化合物：脂肪族或芳香族醇、多元醇、醛、烷烃、烯烃、炔烃、 酰胺、胺、芳族化合物、偶氮化合物、羧酸、酯、二噁烷、醚类、卤代烷、 亚胺、酰亚胺、酮、腈类、酚类和硫醇。
如这里所使用的，“含水溶剂”是指水，或包含至少约50％或50％，至 少约60％或60％，至少约70％或70％，或约或正好75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或更高量的水的溶剂混合物。如这里使用的 术语“含水溶剂”也是指包括水作为溶剂的溶液，如缓冲液、盐溶液、含平 衡离子和其它在水中可溶的溶质的溶液。
如这里所使用的，术语“pI”或“等电点”是指蛋白质或多肽上没有净电 荷时的pH。
如这里所使用的，术语“平衡离子”是指能够启动来自如蛋白质，核酸， 脂质或低聚糖等大分子的微颗粒形成的带电荷或电荷极性化的分子。如就 DAS181融合蛋白(SEQ ID NO：17)来说，硫酸钠是平衡离子因为其能 启动在这里提供的方法中微颗粒的形成，然而苷氨酸，氯化钠或乙酸钠通 常对于DAS181不适合作为平衡离子。带电分子是否为平衡离子可基于以 下参数经验性地确定：包括但不限于蛋白质种类、pH、离子强度、使用的 有机溶剂的种类，和盐和如活性试剂的其它成分的存在。如这里提供和描 述的，平衡离子可为阴离子的或具有净负电荷或电荷极性化的基团，阳离 子的或具有净正电荷或电荷极性化的基团，或两性离子的和具有负和正电 荷或电荷极性化的基团。
如这里使用的，术语“冷却”是指温度降到希望的温度来获得微颗粒或 一旦获得微颗粒，进一步降低温度到希望的温度以便通过挥发溶剂(如， 冻干)来获得所述微颗粒的干制备物。如这里使用的术语“逐渐冷却”或“逐 渐地冷却”或“逐渐地被冷却”表示在溶液变冰冻前为了微颗粒形成，从环境 温度(约或正好18℃到约或正好30℃)降低温度到希望的温度是以一定 的速率或持续适合溶液中形成微颗粒的一定量的时间发生的。这样逐渐冷 却不同于如，快速冷冻，喷雾干燥或喷雾冻干，借此所述整个溶液转化为 不产生明显微颗粒的固体形式。
逐渐冷却的速率基于大分子的种类、溶剂、平衡离子和其他成分，还 有冷却的方法(如，热交换器，冰箱或冰库或冷冻干燥机)而经验性地确 定，且可在如微颗粒形成的一段时间，即约或正好1min、2min、3min、5min、 7min、10min、15min、20min、25min、30min、1h、2h、5h或10h到约或 正好1.5min、2min、3min、5min、7min、10min、15min、20min、25min、 30min、1h、2h、5h、10h或15h之间变化。
如这里使用的，术语“冷却”是指温度降低到希望的温度而获得微颗粒 或一旦获得期望尺寸的微颗粒，进一步降低温度到希望的温度以便通过挥 发溶剂(如，冻干)来获得所述微颗粒的干制备物。如这里使用的术语“逐 渐冷却”或“逐渐地冷却”或“逐渐地被冷却”表示在溶液变冰冻前为了微颗 粒形成，从形成溶液混合物的环境温度(约或正好-15℃到约或正好50℃， 通常为约或正好18℃到约或正好30℃)降低温度到希望的温度是以一定 的速率或持续适合溶液中形成期望尺寸的微颗粒的一定量的时间发生的。 这样逐渐冷却不同于如，快速冷冻，喷雾干燥或喷雾冻干，这样整个溶液 转化为不产生明显微颗粒的固体形式。
逐渐冷却的速率基于大分子的种类、溶剂、平衡离子和其他成分，还 有冷却的方法(如，热交换器，冰箱或冰库或冷冻干燥机)而经验性地确 定，且可在如微颗粒形成的一段时间，即约或正好0.1sec、0.2sec、0.5sec、 1sec、10sec、20sec、30sec、40sec、50sec、1min、2min、3min、5min、 7min、10min、15min、20min、25min、30min、1h、2h、5h或10h到 约或正好1.5min、2min、3min、5min、7min、10min、15min、20min、 25min、30min、1h、2h、5h、10h或15h之间变化。
希望尺寸的微颗粒也可通过如下方法形成，如，快速冷却所述混合物 (如，使用热交换器)和允许微颗粒混悬液保持一定长度的时间没有明显 的温度变化，然后快速冷冻所述混合物。
微颗粒形成的温度也是基于大分子种类、溶剂、平衡离子和其它成分 还有冷却的方法和均匀性而经验性地确定，并且可从约或正好15℃、10 ℃、8℃、5℃、3℃、2℃、1℃、-2℃、-5℃、-7.5℃、-10℃、-15℃、-20 ℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃或-45℃而变化。
如这里所使用的，术语“喷雾干燥”是指一种方法，其中包含如蛋白质 的大分子的溶液通过雾化到热的干燥介质中，通常经过约几毫秒到1-2秒 到几十秒的时间，转化到干燥的微粒子形式。这里使用的术语“喷雾冻干” 是指一种方法，其中包含如蛋白质的大分子的溶液通过雾化到如液氮等低 温介质中，来获得可通过冻干干燥的溶液冷冻微滴。这里使用时可互换的 术语“快速冷冻”或“迅速冷冻”或“快的冷冻”是指通过如下方法冷冻包括含 有如蛋白质的大分子的溶液的溶剂或溶液：将盛有所述溶剂或溶液的具有 好的热传递性质的容器(如，薄壁玻璃或金属试管)浸入到液氮中，或直 接将所述溶液倒入液氮中。“快速冷冻”和“迅速冷冻”通常发生在约几毫秒 到1-2秒到几十秒的时间内。
如这里使用的术语“冻干(lyophilize)”或“冻干(lyophilization)”与“冻 干(freeze-drying)”同义，且是指一种方法，其中冰冻包括乳浊液、胶体 或混悬液的溶液，并且所述溶剂直接挥发到蒸汽状态，只剩下固体成分。
B.制备大分子微颗粒组合物的方法
这里提供的是制备具有高含量的如蛋白质等大分子的微球的方法。这 里提供的微球是通过在平衡离子和有机溶剂存在时控制的沉淀来制备。所 述微球适合制备药学组合物，其能通过包括肺部，肠胃外用药和口服施用 途径的传送途径而传送给患者。也可以批量或连续方式实行所述方法，为 了提高效率和产量。
通过这里提供的方法获得的微球作为用于体内或体外治疗或诊断受 治疗者的疾病状态的预防、治疗或诊断试剂是有用的。这里提供的方法获 得的所述微球的尺寸可通过调整包括以下的参数来控制：有机溶剂的种类 和浓度、蛋白质或大分子浓度、离子强度、平衡离子种类和浓度、冷却的 速率和时间；从而提供了在从0.001微米到50微米或更大的大范围尺寸的 微球，其能通过包括肺部(如用于传递到喉咙、气管和支气管用于治疗流 感和其他呼吸道感染的1微米到5微米颗粒)、皮下、肌内、静脉内和其 他的途径(如使用几十微米尺寸的颗粒)的希望的途径传递治疗剂，提供 给受治疗人吸入药物的活性组分。
这里提供的方法的步骤包括：将包含大分子的溶液和平衡离子与有机 溶剂结合，且逐渐冷却产生的溶液到一定温度从而形成微颗粒。在一个实 施方式中，所述步骤可描述为以下：
1)在不产生大分子沉淀的浓度和在环境温度时加入平衡离子和 有机溶剂到包含如蛋白质、核酸、寡糖或脂质等大分子的溶 液中；
2)沉淀：冷却大分子/溶剂混合物来启动微球的形成；和
3)脱水：混悬液冷冻并通过升华作用去除有机溶剂和水(冻干， 如在约-20℃到约-80℃，或约-30℃到约-80℃，或约-40℃到约 -80℃，或约-45℃到约-80℃，或约-45℃到约-75℃的温度)。
可以任何顺序依序地，间歇地，或同时地实行所述方法的上述步骤。 在一个实施方式中，同时或以任何顺序依序地加入平衡离子和有机溶剂到 包括大分子的溶液中，接着冷冻。在其他的实施方式中，包含大分子的溶 液在加入平衡离子和有机溶剂前可预冷到适合微球形成的温度。如，预冷 的如蛋白质等大分子的含水溶液，可与硫酸铵和乙腈结合而形成微球。
所产生的微颗粒的悬浮液可通过如下方法被转化成干粉：进一步冷 却到低于凝固点的温度和随后去除挥发物(水、有机溶剂和可能的平衡离 子)，其通过如使用标准冰冻干燥器升华。
在一个实施方式中，通过使平衡离子和有机溶剂接触所述大分子和暴 露于低温而形成的微球通过包括沉降或过滤技术的方法从混悬液中分离 出。在从原始的沉淀混合物中分离后，可冲洗微球和/或将微球与其他改进 和/或修饰大分子和微球的特征的材料结合。
在另一个实施方式中，通过这里提供的方法制备的微球并不具有直接 的治疗效果，但是作为其他包括营养添加物的治疗剂或活性试剂的微载 体。可在沉淀时加入治疗剂或在冻干前加入治疗剂到形成的微球混悬液。 可选择地，可混合治疗剂进由微球组成的干粉。
没有遵从任何原理，在一方面，这里提供的方法可通过如下方法允许 微球的形成：(1)利用平衡离子中和大分子表面的电荷和(2)由于加入 的有机溶剂和逐渐冷却的结合效果引起的大分子的溶解性降低。
通过选择合适的在约或正好pH 2.0到约或正好pH 10.5或更高的范围 内pH，其取决于大分子、平衡离子和有机溶剂；在合适量的平衡离子存在 时；在所述大分子表面的实质数目的带电基团，在一些实施方式中所有带 电基团，可成为中和的。然后通过加入合适的有机溶剂，所述溶液极性的 降低可通过沉淀、相分离、胶体形成，或其他这类方法启动微球的形成。
可选择地，没有遵从任何原理，在一些实施方式中，观察到的微球的 沉淀现象也可利用平衡离子和有机溶剂的结构化(kosmotropic)(结构形 成)效果而解释，因为其与包含有大分子的含水溶液的水分子在低温下的 相互作用。不管在这里提供的方法中的潜在机制，相对少量的有机溶剂和 平衡离子加入到含水或其他包含大分子的亲水溶液，及溶液的冷却导致包 含大分子微球的组合物的产生。
在一个实施方式中，可通过将混合溶液通过热交换器来实行混合溶液 的逐渐冷却。热交换器的温度和混合物通过热交换器的流速可以调节，以 至所述混合物要么在微球形成之前预冷，要么冷冻到一定温度从而微球形 成。
在另一个实施方式中，这里提供的方法形成的微球通过如沉降或过滤 技术的方法从混悬液中浓缩或分离出来。在微球形成时，其生长(尺寸) 可通过调节离子强度、极性、pH或其他混悬液参数来控制。从所述混合溶 液的液体相中分离微球可通过离心、过滤(真空纤维、切向流动等)或其 他技术实行。所产生的微球或其浓缩的混悬液可被冻干或空气干燥(air dried)。
在一些实施方式中，从原始沉淀混合物中分离出的微球或干燥的微球 在作为治疗剂或载体给药前可重新构成，或可悬浮在包含修饰微球特征的 试剂的溶液中。所述修饰试剂可包括但不限于填充剂、赋形剂、非活性成 分、稳定性强化剂、味道和/或气味修饰剂或掩蔽试剂、维生素、治疗剂、 抗氧化剂、免疫调节剂、跨膜转运修饰剂、抗结块试剂、肠溶包衣剂、给 予抗酸如抗消化系统的酸的试剂、提供蛋白酶抗性的试剂、壳聚糖、聚合 物和流动性强化剂。
这里提供的方法生产的微球的形成和特征可通过如下变化的参数经 验性地确定，包括：所述大分子的性质和浓度、所述混合溶液的pH、所述 平衡离子的性质和浓度、所述有机溶剂的性质和浓度、离子强度和影响逐 渐冷却的冷却速率。这里提供的方法的所述步骤提供适于高通量的筛选的 方法，如在微量培养板格式中，来确定大分子、有机溶剂、平衡离子、pH、 离子强度和产生微球的冷却梯度(ramp)的合适组合。
大分子
根据这里提供的方法用来形成微球的大分子包括多种治疗剂、诊断 剂、营养试剂和其他活性试剂。治疗剂包括抗生素、疫苗、造血药、抗感 染药物、抗溃疡剂、抗过敏剂、解热药、镇痛药、抗炎药、抗痴呆药剂、 抗病毒药物、抗肿瘤剂、抗抑郁药、精神类药剂、强心剂、抗心律失常试 剂、血管扩张剂、抗高血压药、抗糖尿病药、抗凝血剂、和降低胆固醇药 剂。其他合适的大分子的例子包括蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、蛋白 质共轭物、病毒、病毒颗粒和其混合物。
所述大分子能够通过与所述平衡离子和有机溶剂相互作用的能力来 表征，如柠檬酸盐(平衡离子)和异丙醇(溶剂)，来形成完整的、分离 的包含高含量大分子的微球。微球中大分子含量可能从约或正好30％、 40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的微球重量/重量 (w/w)间变化。在一些实施方式中，微球的大分子含量实质上与在形成 微球之前的初始溶液中大分子的量相同。
通过这里提供的方法用来制备微球的大分子包括包含多肽和蛋白质 的肽，包括多糖的碳水化合物和核酸(DNA、RNA或PNA)。在一些实施 方式中，所述大分子是包括治疗蛋白质的蛋白质，如DAS181(具有SEQ ID NO：17中所列氨基酸残基序列的唾液酸酶融合蛋白质)、α1-抗胰蛋白酶、 PI8、水蛭蛋白酶抑制剂c、大肠杆菌素(Ecotin)、抑肽酶、重组人DNA 酶、胰岛素、干扰素、重组人DNA酶(重组人脱氧核糖核酸酶，如作为 吸入治疗药物治疗纤维囊泡症(Genentech)；也见Shak等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，87：9188-9192(1990))、人血清白蛋白、人生长激素、甲状 旁腺素和降钙素。在一些实施方式中，所述蛋白质是DAS181，所述平衡 离子是硫酸钠或柠檬酸钠，且所述有机溶剂是异丙醇。
这里提供的方法可避免如热的条件的使用，热可使蛋白质变性并减低 其活性。因而根据这里提供的方法提供的微球可用来制备疫苗或其他需要 蛋白质或肽以原始构象存在的治疗药物。
用于微球沉淀中的溶液中大分子的浓度可能在约或正好0.1mg/ml到 约或正好0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0、10.0、12.0、15.0、20.0、25.0、 30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100、或200mg/ml 之间。在一些实施方式中，所述浓度在约或正好1mg/ml到约或正好20 mg/ml之间。依据大分子的特征(pI、疏水性、溶解性、稳定性等)和其 他工艺参数，所述大分子的浓度可依据经验性地确定来达到形成希望尺寸 的微球。一般而言，在加入平衡离子和有机溶剂之前在溶剂(通常是含水 溶剂)中的具有较低溶解度的大分子可被在较低的浓度(0.1-5mg/ml)下 使用来形成根据这里方法的微球，而具有较高溶解度的大分子可被在1-20 mg/ml或更高的浓度下使用。如果观察到形成无定形的聚集体或聚集的微 球，所述大分子的浓度通常应该减低来减少或避免这种聚集。
平衡离子性质和浓度
平衡离子可为在该方法实行的pH下能中和在大分子上一个或多个带 相反电荷基团的任何化合物。根据大分子的特点(pK、pI、带电基团的性 质和数目、表面带电基团的分布、在不同的pH条件下的溶解性和结构稳 定性)，所述pH可根据微球形成而经验地确定。通常，如果在低于大分子 pK的pH实行沉淀，可使用阴离子平衡离子。通常，如果在高于大分子pK 的pH实行沉淀，可使用阳离子平衡离子。所述平衡离子可基于其启动微 球形成的合适程度而经验性地选择。在一些实施方式中，所述平衡离子可 具有60Da或更高，或约75Da或更高的分子量。
所述平衡离子可是阴离子，阳离子或两性离子。阴离子平衡离子可为 无机(磷酸盐、硫酸盐、硫氰酸盐、硫代硫酸盐、次氯酸盐、硝酸盐、溴、 碘等)或携带包括烯醇、羟基、巯基、羧基、羧甲基、磺丙基、磺基和磷 的电荷极化的基团的有机化合物。携带其他阴离子基团或因为其他的分子 特性具有负电荷的有机化合物也可被使用。可被用作阴离子平衡离子的化 合物也包括但不限于以下的：草酰乙酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、草酸盐、 丙酮酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酮戊二酸盐、丁烷三羧酸、 氢化粘康酸、环丁烷二羧酸、马来酸二甲酯、脱氧核糖核酸、聚谷氨酸、 叶酸、乳酸、抗坏血酸、胭脂红酸、山梨酸、丙二酸、EDTA、MOPS、TES、 MES、PIPES、吡啶、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、甘氨酸、甘氨 酰甘氨酸、甜菜碱、硫酸、硫代硫酸、磷酸、三磷酸腺苷、硝酸、衣康酸、 特戊酸、二甲基丙二酸和高氯酸。在一些实施方式中，衣康酸、特戊酸、 二甲基丙二酸和琥珀酸在这里提供的方法中用作平衡离子。
阳离子平衡离子可为携带称为胺、酰胺、亚胺、酰亚胺、胍类、咪唑、 二噁烷、苯胺等基团的无机(铵、磷、硫、铯、铷等)或有机化合物。携 带其他阳离子基团或因为其他分子特点具有正电极性的有机化合物也可 被使用。可用作阳离子平衡离子的化合物还包括但不限于以下：Tris、 Bis-Tris、Bis-Tris丙烷、二氨基丙烷、哌嗪、哌啶、戊胺、二氨基丁烷、 丙胺、三甲胺、三乙胺、精胺、亚精胺、腐胺、尸胺、乙醇胺、二乙醇胺、 三乙醇胺、咪唑、四甲基铵、三甲基铵、铵、铯、铷、咪唑、聚乙烯亚胺、 DEAE、TEAE、QAE。
也可使用以任何组合具有任何带电基团的两性平衡离子。可用作为两 性平衡离子的化合物包括但不限于以下：HEPES、BICINE、甘氨酸、甘氨 酰甘氨酸、6-氨基己酸、γ-氨基丁酸、天然和非天然氨基酸(如，组氨酸、 谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸)。
所述平衡离子可用作酸(如，硫酸)或碱(如，咪唑)或它们的盐(如， 硫酸钠或盐酸咪唑)。这里提供的方法中使用的平衡离子包括National Formulary，United States Pharmacopeia，Japanese Pharmacopeia，或European Pharmacopeia所列的那些，其临床安全性已经被证实(柠檬酸、苹果酸、 氨基酸、硫酸盐等)。在一些实施方式中，这里提供的方法中使用的平衡 离子包括其安全性已经确认或划入GRAS(通常认为安全的)的种类。所 述平衡离子(或其盐)在室温(约25℃)或在使用和贮存时打算的温度下 可为固体。两种或多种平衡离子的结合也可使用。挥发性和液体平衡离子 也可用于这里提供的方法中。
所述平衡离子的浓度通常保持在约0.1mM和约0.2、0.5、0.8、1.0、 2.0、3.0、5.0、7.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、 90.0和100.0mM之间。在一些实施方式中，所述平衡离子的浓度在约或 正好0.5mM和约或正好20mM之间。取决于大分子的特征(pI、疏水性、 溶解性、稳定性等)和其他工艺参数，所述平衡离子的浓度使用如这里提 供的高通量的格式可经验性地确定。通常，过大的微球、无定形的聚集体 或聚集的微球的形成显示平衡离子的浓度应该降低，不能形成微球(破碎 的玻璃样晶体或鳞片)或形成小于期望尺寸的微球显示平衡离子的浓度应 该增加。
有机溶剂的性质和浓度
加入到这里提供的方法中的混合物中的有机溶剂通常为可与水混溶 的，且选自于：醇(甲醇、乙醇、1-丙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇)、氯仿、 二甲基氯化物、多元糖醇(甘油、赤丁四醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨 醇、甘露醇)、芳香烃、醛、酮、酯、醚(二乙基醚)、烷烃(己烷、环己 烷、石油醚)、烯烃、共轭二烯、甲苯、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、多 元醇、聚酰亚胺、聚酯、聚醛和其混合物。在一些实施方式中，所述有机 溶剂可为挥发性的。在其它的实施方式中，当需要包含所述有机溶剂到微 球中时，非挥发性的有机溶剂可用来提供如新特点给所述微球(如，持续 释放或增加机械强度)。所述有机溶剂的浓度通常可保持在约或正好0.1％， 到约或正好0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或 50％体积/体积(v/v)之间。在一些实施方式中，所述有机溶剂的浓度在约 或正好1％到约或正好30％，v/v。也可使用与水部分可混溶的或完全不混 溶的有机化合物。
这里提供的方法中可使用的有机溶剂包括醇和其它在国际协调会议 (ICH)三方协调指导原则(杂质：残留溶剂指导原则)(International Conference on Harmonisation (ICH) Harmonised Tripartite Guideline (Impurities：Guideline for Residual Solvents))中列为3类和2类的溶剂， 其安全处理已经在药物和食品行业中建立。
取决于所述大分子的特点(疏水性、溶解性、稳定性等)和其他工艺 参数，所述有机溶剂的选择和浓度可利用如在微滴度板或类似芯片或其他 设备上高通量筛选优化。通常，在冷却启动之前的未控制的沉淀、过大尺 寸微球的形成、无定形的聚集体、聚集的微球或粘性的聚集体表示有机溶 剂的浓度应降低，而不能形成微球(破碎的玻璃样晶体或鳞片)或形成小 于希望尺寸的微球表示所述有机溶剂的浓度应增加。
pH
除了启动微球形成，所述平衡离子也可用作缓冲液。可选择地，在一 些实施方式中，缓冲的化合物可用来获得希望的pH。在一些实施方式中， 所述缓冲化合物为60Da或更大。取决于所述大分子的特征(pI、疏水性、 溶解性和在特定pH时稳定性等)和其他工艺参数，最适pH可经验性地调 整来达到希望尺寸的微球形成和保持大分子的活性。通常，不能形成微球 (破碎的玻璃样晶体或鳞片)指示所述蛋白质在使用的条件下可能溶解性 太大。形成无定形聚集体可指示沉淀未很好控制，且蛋白质可在使用的pH 处不稳定或不可溶。
当所述大分子为蛋白质，已观察到某些蛋白质/平衡离子结合在一定 pH值处可引起马上的和未控制的沉淀。这里提供的高通量筛选的方法可用 来经验性地确定合适的蛋白质、pH和平衡离子组合来形成希望尺寸的微 球。利用以下方法这可容易地补救：改变所述混合物的pH、使用不同的平 衡离子或降低混合物中所述蛋白质的浓度。通常，为了形成基于蛋白质的 微球，低于蛋白质pI的pH值提供了最优的微球形成。
离子强度
所述混合溶液的离子强度可通过平衡离子的浓度或通过如氯化物或 乙酸盐的其它的盐调节。在一些实施方式中，不需要另外的盐来产生微球。 在一些实施方式中，所述离子强度可调节来保持大分子的结构完整性和活 性。特定的盐的出现是有益的其他应用的例子包括肠胃外的和其他药物， 或食物的制剂，其中在微球重新构建时需要特定的张力或缓冲容量。
冷却梯度
在冷却前在所述大分子可溶时的温度，通常约-15℃到约30℃开始制 备包括大分子、平衡离子和有机溶剂的所述混合物。在一些实施方式中， 在冷却前的所述起始的温度是在环境温度(18-25℃)。在逐渐冷却到低于 所述大分子溶解并存在于溶液中的温度的温度时，利用如沉淀、相分离或 胶体形成等方法形成所述微球。实行冷却的速率可控制形成和如微球尺寸 等其他特点。通常，当所述大分子为蛋白质时，液氮中快速冷冻不产生微 球。
实行所述混合物冷却和冰冻(冷却梯度)的速率可确定所述微球的最 终尺寸。通常，更快的冷却梯度产生更小的微球，而更慢的冷却梯度产生 更大的微球。不遵循任何理论，冷却速率可确定以下的速率：(1)生产起 始的更小的微球的成核现象和(2)起始的微球联合(聚集体)和退火到 更大的微球的融合过程。较小颗粒融合到较大颗粒是一个依赖时间的过 程，其由如在冷冻前微球液体混悬液存在的持续时间来确定。因为某些如 蛋白质的大分子间的键的可恢复性质，在这里提供的微球组合物中，退火 到更大颗粒的较小微球可产生具有光滑表面的微球。取决于希望的微颗粒 的尺寸，冷却速率可为约0.01℃/min或0.01℃/min到约20℃/min或20℃ /min，约或正好0.05℃/min或约或正好0.1℃/min到约或正好10℃/min或 约或正好15℃/min，从约或正好0.2℃/min到约或正好5℃/min，从约或正 好0.5℃/min到约或正好2℃/min，或约或正好1℃/min。在一些实施方式 中，所述冷却梯度可为在0.1℃每分钟到约40℃每分钟之间。在其它的实 施方式中，冷却梯度可为在约0.5℃每分钟和15℃每分钟之间。
取决于具体需要，在一些实施方式中需要根据特定的设备调节生产过 程。在一些实施方式中，具有温度控制架的冷冻干燥机可用于冷却。如果 生产的微球比希望的大，可调节包括大分子浓度、有机溶剂、平衡离子、 离子强度和/或pH的其它工艺参数来达到所述微球尺寸希望的降低。
对更快的冷却梯度(更小的颗粒尺寸)，所述混合溶液可通过热交换 器，如以连续模式使用的热交换器。如果需要增加微球尺寸，增加所述混 合物成分(大分子、有机溶剂、平衡离子)之一的浓度可提供微球尺寸希 望的增加量。
通常，可均匀地和以稳定的速率实行冷却来避免形成聚集体和晶体。 取决于所述有机溶剂的浓度，所述大分子沉淀成微球可以几种方式发生。 在较高浓度的有机溶剂(约5％-40％，取决于使用的实际组分)，所述微球 在所述混合溶液还在液体状态时通常可形成。在较低浓度的有机溶剂 (2-25％，取决于使用的实际组分)冰晶可首先形成，此后排出的大分子 和有机溶剂的范围可达到临界的局部浓度并沉淀。在冷冻干燥机托盘近底 部的层的温度进一步降低可导致液体混悬液的完全凝固和有机溶剂进一 步排除到顶层中。顶层中过量的有机溶剂可导致未控制的所述大分子的沉 淀和微球的聚集。该效果通常可通过选择混合物中合适比例的组分-大分 子、平衡离子、有机溶剂、盐等来减轻。此外，在冷冻干燥机托盘中保持 薄层的混合物或在冷冻时混合混合物可避免聚集体和晶体的形成，且产生 均匀的微球。如，如果使用相对低浓度的异丙醇(如，2-6％)，且薄层的 混合物(10-20mm)加到托盘中，且所述托盘置于预冷(-30-75℃)的架 上，可获得均匀的微球。
这里提供的方法可导致大致全部或全部蛋白质或其它大分子从溶液 包括进微球中。
微颗粒形成条件的高通量筛选和颗粒形成的优化
取决于所述大分子的特点，可优化根据这里提供的方法用来制备微球 的所述混合溶液的组分。可利用如其中几十到几百到几千的混合物可以同 时筛选的微滴度板或芯片来以中等或高通量的格式快速实行优化。在一些 实施方式中，以不同的浓度可筛选很多pH值连同阳离子、阴离子或两性 平衡离子和有机溶剂。如，利用各自加入了不同浓度的感兴趣的大分子的 相同的几个微滴度板可实行所述筛选。可双份筛选每一套试验条件。在一 些实施方式中，对具有平底孔的微量培养板可打断微滴度板的边界来允许 冷冻干燥机架和所述孔底部间的良好的热传导。所述微量培养板可置于冷 冻干燥机架上并冷却来形成微球和随后凝固所述混悬液。在所述孔的内含 物冰冻时，可应用真空。在冻干结束时，其中一个重复平板可用水或选择 的缓冲液重组来观察是否某些条件使所述大分子不溶或降低其活性。产生 可容易地重新溶解或提供希望特点的微球的材料的条件可用光谱、色谱 法、酶法或其他测定法而进一步分析来确定保持了天然结构和活性。在重 复平板中的冻干材料可用来显微观察确定是否形成了微球。生产微球的条 件可进一步调节和微调来产生期望尺寸和特点的微球。
可提供实行高通量筛选的试剂盒，且其包括这里提供的方法中使用的 所有成分，包括一种或多种如蛋白质的大分子、缓冲液、预分配的已知组 分(有机溶剂，平衡离子)的混合物和/或盐。试剂盒在每一微滴度板中可 包括3、4、5、10、15、20、30、40、50、100或更多(典型性地96或更 多)具有预先确定pH、平衡离子、离子强度和有机溶剂的缓冲液。试剂盒 提供的微滴度板可调节，这样孔的底部可与冷冻干燥机的架直接接触。
C.大分子微颗粒组合物
在这里提供的方法获得的微颗粒组合物中包含的大分子结构和化学 实质地未被所述方法改变。如，当所述大分子是绿色荧光蛋白或红色荧光 蛋白时，它们的荧光和天然构象和蛋白质的天然活性在微颗粒中保持。可 存贮通过挥发除了与微球相关的溶剂和其他组分的大致所有的溶剂和/或 水分而获得的干燥微球，且其活性可通过重新构建而实质性的重新恢复。 这里提供的微颗粒相对低的水分含量，如在约或正好0.1％到约或正好 0.2％、0.3％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、 7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％、10.5％、11.0％、11.5％、 12.0％、12.5％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％间，可提供改 进的稳定性。这里提供的方法获得的微球在尺寸和形状上也是同质性的， 且可重复获得期望特点。其他传统用来制备干制剂的技术(如盐沉淀、醇 或丙酮沉淀、冷冻干燥)可导致完全或部分如蛋白质的所述大分子的变性。 另外，这里提供的方法制备的微球避免了对复杂或特定的喷雾干燥、喷雾 冻干、基于超临界流体反溶剂方法或研磨方法的需求(见，如，Laube BL. The expanding role of aerosols in systemic drug delivery，gene therapy，and vaccination(气溶胶在系统药物传送，基因治疗和免疫中的扩大的作用). Respir Care 2005；50(9)：1161-1176；Taylor G，Gumbleton M.Aerosols for Macromolecule Delivery：Design Challenges and Solutions(用于大分子传送 的气溶胶：设计挑战和溶液).American Journal of Drug Delivery 2004；2(3)： 143-155；Smyth HDC，Hickey AJ.Carriers in Drug Powder Delivery. Implications for Inhalation System Design(药物粉末传送中的载体。吸入系 统设计的启示).American Journal of Drug Delivery 2005；3(2)：117-132； Cryan SA.Carrier-based strategies for targeting protein and peptide drugs to the lungs(用于靶向蛋白质和肽药物到肺部的基于载体的策略).AAPS J 2005；7(1)：E20-E41；LiCalsi C，Maniaci MJ，Christensen T，Phillips E， Ward GH，Witham C.A powder formulation of measles vaccine for aerosol delivery(用于气溶胶传送的麻疹疫苗的粉剂).Vaccine 2001； 19(17-19)：2629-2636；Maa YF，Prestrelski SJ.Biopharmaceutical powders： particle formation and formulation consideraions(生物药物粉剂：颗粒形成 和配制的考虑).Curr Pharm Biotechnol 2000；1(3)：283-302；Maa YF， Nguyen PA，Hsu SW.Spray-drying of air-liquid interface sensitive recombinant human growth hormone(喷雾干燥气-液界面敏感的重组人生长激素).J Pharm Sci 1998；87(2)：152-159；Vanbever R，Mintzes JD，Wang J等. Formulation and physical characterization of large porous particles for inhalation(用于吸入的大且多孔颗粒的配制和物理表征).Pharm Res 1999；16(11)：1735-1742；Bot AI.Tarara TE，Smith DJ，Bot SR，Woods CM， Weers JG.Novel lipid-based hollow-porous microparticles as a platform for immunoglobulin delivery to the respiratory tract(新的基于脂质的中空多孔微 颗粒作为到呼吸道的免疫球蛋白传送的平台).Pharm Res 2000； 17(3)：275-283；Maa YF，Nguyen PA，Sweeney T，Shire SJ，Hsu CC.Protein inhalation powders：spray drying vs spray freeze drying(蛋白质吸入粉剂：喷 雾干燥相比喷雾冻干).Pharm Res 1999；16(2)：249-254；Sellers SP，Clark GS，Sievers RE，Carpenter J F.Dry powders of stable protein formulations from aqueous solutions prepared using supercritical CO(2)-assisted aerosolization (来自利用超临界的CO(2)帮助的烟雾化作用制备的含水溶液的稳定蛋白 质制剂的干粉剂).J Pharm Sci 2001；90(6)：785-797；Garcia-Contreras L， Morcol T，Bell SJ，Hickey AJ.Evaluation of novel particles as pulmonary delivery systems for insulin in rats(作为大鼠中胰岛素肺部传送系统的新颗 粒的评估).AAPS PharmSci 2003；5(2)：E9；Pfutzner A，Flacke F，Pohl R等. Pilot study with technosphere/PTH(1-34)-a new approach for effective pulmonary delivery of parathyroid hormone(1-34)(在技术圈/PTH(1-34)的领 航研究-甲状旁腺素有效肺部传送的新方法).Horm Metab Res 2003； 35(5)：319-323；Alcock R，Blair JA，O′Mahony DJ，Raoof A，Quirk AV. Modifying the release of leuprolide from spray dried OED microparticles(修饰 从喷雾干燥的OED微颗粒中醋酸亮丙瑞林的释放).J Control Release 2002；82(2-3)：429-440；Grenha A，Seijo B，Remunan-Lopez C. Microencapsulated chitosan nanoparticles for lung protein delivery(用于肺部 蛋白质传送的微胶囊化的壳聚糖纳米颗粒).Eur J Pharm Sci 2005； 25(4-5)：427-437；Edwards DA，Hanes J，Caponetti G等.Large porous particles for pulmonary drug delivery(用于肺部药物传送的大且多孔的颗 粒).Science 1997；276(5320)：1868-1871；McKenna BJ，Birkedal H，Bartl MH，Deming TJ，Stucky GD.Micrometer-sized spherical assemblies of polypeptides and small molecules by acid-base chemistry(通过酸碱化学反 应组装多肽和小分子的微米尺寸球体).Angew Chem Int Ed Engl 2004； 43(42)：5652-5655；Oh M，Mirkin CA.Chemically tailorable colloidal particles from infinite coordination polymers(从无限配位的聚合物得到的 化学可裁剪的胶体颗粒).Nature 2005；438(7068)：651-654；美国专利第 5,981,719号；美国专利第5,849,884号和美国专利第6,090,925号；美国专 利申请第20050234114号；美国专利第6,051,256号)。
这里提供的方法获得微颗粒可为任何形状和具有如下范围的尺寸(平 均宽度或直径)：从约或正好0.001微米到约或正好0.002、0.005、0.01、 0.02、0.03、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、15.0、20.0、25.0、 30.0、35.0、40.0、45.0或50.0微米或更大。对肺部给药于肺泡，所述尺 寸可从约0.1微米或更小到约0.5微米。对肺部给药于喉咙、气管和支气 管，所述尺寸可从约或正好0.5微米到约或正好1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或6.5微米，或在一些实施方式中从约或正 好1.0微米到约或正好2.0微米。在一些实施方式中，所述微颗粒在形状 上大致是球形的。
根据这里提供的方法可用于形成微颗粒的所述大分子可包括治疗和 诊断试剂、加工的食物、食品添加物和聚合物。在一些实施方式中，交联 剂、盐或其它化合物可包括入配制混合物中来调节微球的溶解性和/或增强 其机械强度。在一些实施方式中，在大多含水或有机溶剂中不可溶的微球 可用来生产如层析树脂和可分散的研磨剂的颗粒。在其它实施方式中，在 溶剂如药学传送载体中具有部分溶解性的微球可用于持续释放的活性试 剂或治疗制剂的生产。
在一些实施方式中，这里提供的微颗粒可与吸入装置结合用来传送治 疗剂量的大分子微球到受治疗者的呼吸道和肺部。如，当所述大分子是 DAS181蛋白(在SEQ ID NO：17中所列序列)时，约0.5微米到约8微 米，或约1微米到约5微米的微球可通过这里提供的方法，利用硫酸钠作 为平衡离子和异丙醇作为有机溶剂获得。对于DAS181微球，其可给药来 预防或治疗在呼吸道中起始的如流感的病毒感染，其需要在喉咙、气管或 支气管中沉积微球。配制为微球的DAS181融合蛋白可通过如下方法起作 用：在喉咙/气管/支气管中降解受体唾液酸，从而阻止在这些位点的病毒 结合和感染。为了DAS181微球最佳传送到呼吸道病毒感染起始的位点， 即喉咙、气管或支气管，所述微球必须不能(a)太大，以致它们在嘴的前 端被捕捉到(即，微球太大，约8微米或更大)；或(b)太小，这样它们 被深深地吸入肺部，且通过其中它们没有活性和/或可能为毒性的肺泡而系 统地吸收到血流中(即，0.5微米或更小)。对传送DAS181微球到喉咙、 气管和支气管，约1微米到约5.5-6微米的尺寸范围通常是合适的。
所述吸入器可用来治疗任何病症，其中蛋白质或其它大分子可通过吸 入治疗法给药。典型的吸入装置可包括干粉吸入器、计量吸入器和静电传 送装置。典型的传送装置的应用包括胰岛素和其它治疗蛋白质的深入肺部 的传送。
在一些实施方式中，这里提供的方法获得的微球可通过如下方式传 送：口服、鼻内地、静脉内地、肌内地、皮下地或其它适合治疗分子传送 的方法。对肺部传送的微球制剂通常可为约0.5微米到约5-6微米的尺寸 范围，而那些设计为其它种类传送，如皮下传送，肠胃外传送或肌内传送 的可在从约或正好10微米到约或正好30、40或50微米的范围内。
在一些实施方式中，这里提供的微球没有直接的治疗效果，但可用作 其它治疗剂的微载体。用于这些微球制备的大分子的例子包括但不限于多 糖、聚糖、蛋白质、肽、聚合物或其组合。治疗剂或其他活性试剂可在微 球形成时加入或加入到形成的微球的混悬液中。可选择地，治疗剂可与干 微球组合物通过药学和食品行业中实行的混合、翻滚(tumble)或其他技 术混合。
在一些实施方式中，交联剂、亲脂的物质、如那些在含水溶剂中具有 弱溶解性的盐，或其组合，或其他化合物可包括进配制混合溶液中来调节 所述微球的溶解性和/或增强其机械强度。所述微球的缓慢溶解可在如下方 法传送的治疗剂的持续释放中有用：口服、吸入、鼻内地、静脉内地、肌 内地、皮下地和其它适合治疗剂分子传送的传送方法。在一些实施方式中， 所述微球可以具有肠溶衣的片剂或胶囊的形式通过口服传送，从十二指肠 内吞，且所述大分子释放到血流或其它作用位点。
在一些实施方式中，所述微球可通过所述大分子的部分变性而使得不 可溶，所述大分子在传送时变得复性且生物可利用的。
在其它的实施方式中，所述微球形状是大致球形的，且可具有从约0.1 微米到30.0微米的范围的平均直径。在另一些实施方式中，所述微球的平 均直径可在从约0.5微米到5.0微米，或从约1.0微米到2.0微米的范围内。
在另一方面，这里提供的装置和方法用于传送所述微球到受治疗者， 如需要药物治疗的动物或人类病人。合适的传送途径可包括肠胃外的，如 肌内、静脉内和皮下地和非肠胃外的，如口服、含服、鞘内、鼻内、肺部、 透皮、跨粘膜和类似的传送途径。传送装置可包括无针的或有针的注射器 和吸入器。
所述传送装置可包括单一剂量的微球，其用于治疗可通过体内大分子 快速或持续释放可治疗的病症。在单一剂量中存在的微球数量取决于大分 子的种类和活性。所述单一剂量可选择来达到已优化来治疗特殊医学病症 的一段时间范围内的持续释放。如，当所述大分子是DAS181融合蛋白 (SEQ ID NO：17)时，包含DAS181的微球组合物的传送剂量可从约0.5 mg蛋白质每剂量到约100mg蛋白质每剂量，或约0.75mg、1mg、1.5mg、 2mg、3mg、5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、40mg、45mg、50mg、 55mg或60mg蛋白质每剂量。
所述微球的大分子组分可为根据这里提供的方法任何能形成微球的 分子。在一些实施方式中，所述大分子是蛋白质，包括酶和重组蛋白、肽、 碳水化合物、多糖、碳水化合物-或多糖-蛋白质共轭物、核酸、病毒、病 毒颗粒、小分子(如半抗原)和蛋白质的共轭物，或其混合物。有机或无 机自然或合成药学化合物或药物可通过如下方法包括进所述微球：将药物 结合到如蛋白质的大分子，然后形成来自大分子-药物复合物或共轭物的微 球。本领域技术人员会理解不能具有三级和四级结构的化合物可通过如下 方式并入微球：所述化合物并入或偶联到具有三级和四级结构的载体分 子。本领域技术人员进一步会理解所述大分子可为分子的一部分，如例如， 肽、双链核酸分子的单链区段或病毒颗粒、或其他具有三级和四级结构的 大分子。
术语“大分子”也可包括多种大分子和如以下的不同大分子的组合：药 学化合物和将需要治疗的组织、器官或肿瘤作为所述药学化合物目标的亲 和分子的组合。亲和分子可为，如配体或受体。配体的例子可包括病毒、 细菌、多糖或毒素，当给药于动物时其可作为抗原来产生免疫应答并导致 抗体的产生。
在一些实施方式中，所述大分子是治疗蛋白质，其包括但不限于：唾 液酸酶、唾液酸酶融合蛋白、包含融合到GAG-结合域的唾液酸酶催化域 的融合蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、胰岛素、干扰素、人生长激素、降 钙素、重组人脱氧核糖核酸酶或甲状旁腺素；且所述微球的蛋白质含量可 从约或正好50％到约或正好60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或更高。对于肺部给药，所述微球可具有从 约或正好0.5微米到约或正好5.0微米范围的平均尺寸，和在一些实施方 式中，为约或正好1微米到约或正好2微米间。
通过这里提供的方法用来形成微球的其他蛋白质包括但不限于包括 如下的治疗蛋白：DAS181(DAS181；SEQ ID NO：17)、a1-抗胰蛋白酶、 大肠杆菌素、水蛭蛋白酶抑制剂c、丝氨酸蛋白酶抑制剂、阿法链道酶(重 组人脱氧核糖核酸酶)、倍他洛尔TM、双氯芬酸TM、多柔比星、乙酰半胱 氨酸、利福平TM、醋酸亮丙瑞林、促黄体激素释放激素(LHRH)、 (D-Tryp6)-LHRH、醋酸那法瑞林、胰岛素、胰岛素钠、胰岛素锌、鱼精蛋 白、溶菌酶、α-乳清蛋白、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、β-乳球蛋白、 胰蛋白酶、降钙素、甲状旁腺素、碳酸酐酶、卵清蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、 人血清白蛋白(HSA)、磷酸化酶b、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、IgG、纤 维蛋白原、聚左旋赖氨酸、IgM、DNA、醋酸去氨加压素、生长激素释放 因子(GHRF)、生长激素抑制素、安替肽、因子VIII、G-CSF/GM-CSF、人 生长激素(hGH)、β干扰素、抗凝血酶III、α干扰素、α干扰素2b。
吸入装置可用来传送如以上所列的治疗蛋白质或其它基于大分子的 微球到受治疗者的呼吸道和肺部。所述蛋白质微球如可通过将所述蛋白质 的含水溶液与如柠檬酸或硫酸的羧酸，或其它平衡离子和如异丙醇的有机 溶剂接触，并冷却溶液来形成微球而制备。所述蛋白质可为治疗蛋白质， 如唾液酸酶、蛋白酶抑制剂、胰岛素、人生长激素、降钙素、重组人脱氧 核糖核酸酶或甲状旁腺素，且所述微球的蛋白质含量可为约或正好70％到 约或正好90％或更多，95％或更多或至少约99％或更多。对于肺部给药， 如DAS181微球的所述微球可被筛分(sized)为具有从约0.5微米到5.0 微米或在约1微米到约2微米间的范围的平均直径。
形成微球的培养条件可优化来包括至少约70％、75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的在 微球形成前在溶液中存在的大分子的总量，其是通过调节包括pH、温度、 大分子浓度或反应或培养的持续时间的参数。
在一些实施方式中，不产生期望的微球特点的分子或化合物可通过与 能形成具有期望特点的微球的载体分子并入或偶联而包括进具有如下期 望特点的微球中，如，尺寸、传送性能(profile)、机械强度。在一些实施 方式中，所述载体大分子为蛋白质，且所述分子或化合物结合进所述微球 和/或到所述微球的表面。在一些实施方式中，所述分子或化合物也可作为 平衡离子，并启动和/或便于微球的形成。
当制备包含蛋白质的微球，在微球形成过程中冷却所述混合物前可加 入如甘油、脂肪酸、如蔗糖的糖、如锌的离子、氯化钠或本领域技术人员 已知的任何其它蛋白质稳定剂的蛋白质稳定剂来最小化蛋白质变性。
在一些实施方式中，所述微球可进一步将如以下的合适的分子和/或包 衣剂包衣到表面：如那些抗如消化酸的酸或蛋白酶的。在其它的实施方式 中，所述微球可用如脂肪酸或脂质的化合物非共价包衣。包衣可通过如下 方法而应用到微球：通过浸入可溶的包衣物质然后以所述物质对微球喷 雾，或通过利用其它本领域技术人员已知的方法。在一些实施方式中，直 接加入所述脂肪酸或脂质到形成微球的混合溶液中。
可通过批次的或连续方式的众多常规方法实行通过降低温度形成微 球。微球形成可进一步由包括但不限于调节气压、重力(g-force)或表面 张力、包括放入晶种(seeding)的其他方法启动。微球形成可在暴露于这 些条件时马上形成或需要这里提供的延续的一段时间。
蛋白质
以下描述的是通过这里提供的方法用来形成微颗粒的示例性的蛋白 质。
唾液酸酶
唾液酸酶，也是指神经氨酸苷酶和N-酰基神经氨酰多糖水解酶，是外 切糖苷酶家族，其可催化来自唾液酸-糖共轭物(sialo-glycoconjugates)的 末端唾液酸残基的去除。唾液酸是具有9碳骨架的酮酸家族，其通常在寡 糖链最外层位置发现连接到糖蛋白和糖脂。这些分子涉及到多种的生物功 能和过程，如先天免疫的调控、细胞粘合和炎性细胞和靶细胞的相互作用， 其可能通过结合不同的凝集素(Varki等.(1992)Curr Opin Cell Biol 4： 257-266)来调节。唾液酸也为碳、氮、能量和细胞壁生物合成前体的优良 的来源。更进一步，真核细胞上的唾液酸可用作致病微生物的受体或共受 体，所述致病微生物包括但不限于流感病毒、副流感病毒、一些冠状病毒 和轮状病毒、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、粘 膜炎摩拉菌(Moraxella catarrhalis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)和 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。最著名的唾液酸家族成员是N- 乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，其为多数其他种类的生物合成的前体。在自然 中发现在Neu5Ac和碳水化合物支链的倒数第二个半乳糖残基间的两种主 要键合，Neu5Acα(2，3)-Gal和Neu5Acα(2，6)-Gal。Neu5Acα(2，3) -Gal和Neu5Acα(2，6)-Gal分子都可被流感病毒识别，且用作所述病毒 结合和启动感染的受体。然而人流感病毒似乎优选Neu5Acα(2，6)-Gal， 而禽类和马的流感病毒主要地识别Neu5Acα(2，3)-Gal(Ito等.(2000) Microbiol Immunol 44：423-730)。人呼吸道上皮细胞表达两种形式的唾液 酸，但是α(2，6)键合的唾液酸比α(2，3)键合的唾液酸更丰富。低丰度 的α(2，3)键合的唾液酸更可能作为禽类病毒物种屏障的基础，且指示降 低在气道上皮细胞上表达的唾液酸受体的水平可能降低流感病毒的感染 性。这样，从唾液酸-糖共轭物中去除末端唾液酸残基的唾液酸酶呈递本身 作为功能为降低受体唾液酸水平的潜在的流感病毒治疗剂。唾液酸酶也可 作为在包括但不限于如下的感染过程中利用唾液酸的任何其他病原的治 疗剂起作用：肺炎支原体、粘膜炎摩拉菌、幽门螺杆菌、流感嗜血杆菌、 肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、副流感病毒和一些冠状病毒和轮状病毒。
唾液酸酶可为高度的底物特异性。它们可靶向特定种类的复杂分子， 如糖蛋白或糖脂；特异的糖键(如2-3，2-6或2-8)，或可对连接糖本身(如， D-半乳糖，N-乙酰-D-半乳糖胺)的性质敏感。底物分子包括但不限于： 寡糖、多糖、糖蛋白、神经节苷脂和合成分子。如，唾液酸酶可切断在唾 液酸残基和底物分子剩余物间的α(2，3)-Gal，α(2，6)-Gal或α(2，8)-Gal 键。唾液酸酶也可切割任何或所有的在唾液酸残基和底物分子剩余物间的 键。很多唾液酸酶蛋白已经从微生物和高等真核生物中纯化，且其中几个 已经显示为催化作为病原微生物受体的末端唾液酸残基的去除。如，在大 的细菌唾液酸酶中是那些能降解流感受体唾液酸的Neu5Acα(2，6)-Gal 和Neu5Acα(2，3)-Gal，其包括来自产气荚膜梭菌、粘性放线菌、产脲节 杆菌(Arthrobacter ureafaciens)和生绿小单孢菌(Micromonospora viridifaciens)的唾液酸酶。其他可作为治疗剂的唾液酸酶包括如基因NEU2 和NEU4编码的那些人唾液酸酶。
唾液酸酶-GAG融合蛋白
唾液酸酶-GAG融合蛋白是由融合到糖胺聚糖(GAG)-结合序列的唾 液酸酶蛋白或其催化活性区域组成。如此，这些蛋白质有效地包含一个锚 定区域(GAG-结合序列)和治疗域(唾液酸酶蛋白或其催化活性区域)。 所述唾液酸酶-GAG融合蛋白设计来与上皮细胞结合，并去除周围的唾液 酸，且从而可用作在感染过程中利用唾液酸的病原的治疗剂。当给药所述 融合蛋白时，如作为治疗流感感染的吸入剂，融合蛋白结合到上皮细胞的 能力增加其保留时间。所述GAG-结合序列作为上皮细胞-锚定域，其连接 唾液酸酶到呼吸道上皮细胞并增加其保留时间和效力。
与肝素密切相关的硫酸类肝素是一种糖胺聚糖(GAG)，其广泛存在 于包括呼吸道上皮细胞表面的细胞膜上。很多蛋白质特异结合到肝素/硫酸 类肝素，且已经识别在这些蛋白质中的GAG-结合序列。如人血小板因子 4(PF4)(SEQ ID NO：3)、人白细胞介素8(IL8)(SEQ ID NO：4)、人 抗凝血酶III(AT III)(SEQ ID NO：5)、人载脂蛋白E(ApoE)(SEQ ID NO： 6)、人血管相关迁移细胞蛋白质(AAMP)(SEQ ID NO：7)或人双向调 节因子(SEQ ID NO：8)的GAG-结合序列已经显示展示了对肝素的高亲 和力(Lee等.(1991)PNAS 88：2768-2772；Goger等..(2002)Biochem.41： 1640-1646；Witt等.(1994)Curr Bio 4：394-400；Weisgraber等.(1986)J Bio Chem 261：2068-2076)。这些蛋白的GAG-结合序列不同于它们的受体结 合序列，所以它们不诱导与全长蛋白或受体结合域相关的生物活性。这些 能结合肝素/硫酸类肝素的序列或其它序列可用作在唾液酸酶-GAG融合蛋 白中的上皮细胞锚定域。
在唾液酸酶-GAG融合蛋白的上下文，所述唾液酸酶可包括全部唾液 酸酶蛋白，或其催化活性部分。如，唾液酸酶-GAG融合蛋白可包括来自 SEQ ID NO：1所列的粘性放线菌的901氨基酸唾液酸酶蛋白质。在另一 个例子中，所述唾液酸酶-GAG融合蛋白可包括来自SEQ ID NO：2所列 的粘性放线菌的唾液酸酶蛋白质的394氨基酸催化活性部分。GAG-结合 序列可通过重组方法连接到唾液酸酶上。在一些例子中，所述融合蛋白可 包括氨基酸连接体，如四甘氨酸残基。进一步地，连接可通过GAG-结合 序列N-或C-末端或唾液酸酶N-或C-末端。唾液酸酶-GAG融合蛋白示例 性的例子包括在SEQ ID NO：9-13和17中所列的那些多肽。再进一步的 例子中，所述唾液酸酶和GAG-结合序列组分可通过本领域的任何已知方 法，使用化学或肽连接体连接。
蛋白酶抑制剂8
蛋白酶抑制剂8(PI8)，也名为Serpin B8，是丝氨酸蛋白酶抑制剂 (serpin)。丝氨酸蛋白酶抑制剂是一个大的结构相关联的蛋白质超家族， 其在病毒、昆虫、植物和高等生物中表达，但不在细菌或酵母中表达。丝 氨酸蛋白酶抑制剂调控在包括如下很多生物过程中所涉及的蛋白酶活性： 凝血、纤溶、炎症、细胞迁移和肿瘤发生。它们包括暴露表面的反应性位 点环(RSL)，其通过模拟蛋白酶底物序列作为蛋白酶的“诱饵”。在靶蛋白 酶结合到丝氨酸蛋白酶抑制剂时，所述RSL被切割，此后所述蛋白酶共价 连接到丝氨酸蛋白酶抑制剂。在新形成的丝氨酸蛋白酶抑制剂-蛋白酶复合 物中的蛋白酶是失活的(Huntington等.(2000)Nature 407：923-926)。
PI8是鸡卵白蛋白为弓形(archtype)的丝氨酸蛋白酶抑制剂亚家族中 成员。像其它属于这个家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂，PI8缺少典型的可切 割的N-端信号序列，产生374氨基酸(SEQ ID NO：14)的主要位于细胞 内的蛋白质。其它这种人卵白蛋白样亚家族成员包括纤溶酶原激活剂抑制 因子2型(PAI-2)、单核细胞中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(MNEI)、鳞 状细胞癌抗原(SCCA)-1、leupin(SCCA-2)maspin(PI5)、蛋白酶抑制 剂6(PI6)、蛋白酶抑制剂(PI9)和bomapin(PI10)。在这个家族内，丝 氨酸蛋白酶抑制剂PI6、PI8和PI9显示最高的结构同源性(至68％氨基酸 同一性)(Sprecher等.(1995).J Biol Chem 270：29854-29861)。PI-8已显 示体外抑制胰蛋白酶、凝血酶、因子Xa、枯草菌溶素A、弗林蛋白酶和糜 蛋白酶。其由血小板释放，且显示牵涉进弗林蛋白酶活性的调控中和血小 板聚集反应中(LeBlond等.(2006)Thromb Haemost 95：243-252)。
除了在内源生物学过程调控中的作用，如凝固，丝氨酸蛋白酶抑制剂 也可作用来抑制外源微生物的生物活性。如，多种丝氨酸蛋白酶抑制剂已 经显示降低了在培养细胞、鸡胚胎和感染鼠肺部的流感病毒激活。所述丝 氨酸蛋白酶抑制剂结合到在流感病毒表面的血球凝集素(HA)分子，且抑 制其活性，这样降低了所述病毒的感染性。如胰蛋白酶抑制剂，如：抑肽 酶(Zhimov等，(2002)J Virol 76：8682-8689)、亮肽素(Zhimov等，(2002)J Virol 76：8682-8689；Tashiro等.(1987)J Gen Virol 68：2039-2043)、大豆 蛋白酶抑制剂(Barbey-Morel等.(1987)J Infect Dis 155：667-672)、e-氨 基己酸(Zhimov等，1982.Arch Virol 73：263-272)和n-p-甲苯磺酰基-L- 赖氨酸氯甲基酮(TLCK)(Barbey-Morel等.(1987)J Infect Dis 155： 667-672)都已经显示抑制流感病毒感染，且为用于治疗流感病毒感染的候 选治疗剂。这样，作为相关的胰蛋白酶抑制剂，PI8也可作为在治疗流感 病毒感染中的治疗剂。
表面活性试剂
这里提供的组合物可包括一种或多种表面活性试剂，其以足够的量加 入而形成稳定的乳浊液。因为一些试剂可具有自我乳化性质且其他试剂和 组份影响表面张力，表面活性试剂的合适的量为非变性蛋白，任选另外的 用于传送的活性试剂和其他在乳浊液中出现的组合物的函数。
这里使用的表面活性试剂是一种物质，其当溶于含水溶液时减少了溶 液的表面张力或水相和油相间分界面的界面张力，以形成稳定的水包油或 油包水乳液。表面活性剂分子是两亲性的，包含亲水头部基团和疏水尾部。 所述表面活性剂分子在乳浊液中形成多种大分子结构，如微团，反相微团， 脂质双层(脂质体)和立方水晶(cubosome)。形成的精确的大分子结构 取决于表面活性分子亲水和疏水区域相对尺寸。在一些实施方式中，表面 活性试剂选自十二烷基硫酸钠；失水山梨醇月桂酸酯、失水山梨醇棕榈酸 酯、失水山梨醇硬脂酸酯(在商标名Span20-40-60等下可获得)；聚山梨 醇酯，如聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山 梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯(在商品名吐温 20-40-60等下可获得)；苯扎氯铵、混合链的磷脂、阳离子脂质、寡脂质 (oligolipid)、磷脂、肉碱、鞘氨醇、鞘磷脂、神经酰胺、糖脂、脂蛋白、 载脂蛋白、两性蛋白质、两性肽、合成两性聚合物、以及它们的组合。这 里使用的其它示例的表面活性剂包括但不限于：
i)天然脂质，即胆固醇、鞘氨醇及衍生物、神经节苷脂、鞘氨醇衍 生物(黄豆)、植物鞘氨醇和衍生物(酵母)、胆碱(磷脂酰胆碱)、乙醇 胺(磷脂酰乙醇胺)、甘油(磷脂酰-DL-甘油)、肌醇(磷脂酰肌醇)、丝 氨酸(磷脂酰丝氨酸(钠盐))、心磷脂、磷脂酸、卵衍生的脂质、溶血(单 酰基)衍生物(溶血磷脂)、氢化磷脂、脂质组织提取物，
ii)合成脂质，即，不对称的脂肪酸、对称的不饱和脂肪酸-饱和系列、 对称的脂肪酸-不饱和系列、酰基辅酶A(乙酰基辅酶A、丁酰辅酶A、巴 豆酰(crotanoyl)辅酶A、己酰辅酶A、辛酰基辅酶A、癸酰辅酶A、月 桂酰辅酶A、肉豆蔻酰辅酶A、棕榈酰辅酶A、硬脂酰辅酶A、油酰辅酶 A、花生酰(arachidoyl)辅酶A、花生四烯酰(arachidonoyl)辅酶A、山 嵛酰辅酶A、二十三酰辅酶A、二十四酰辅酶A、二十四烯酰辅酶A、二 十六酰辅酶A，
iii)鞘脂类，即D-赤式(C-18)衍生物(鞘氨醇，如：D-赤式鞘 氨醇(合成)、鞘氨醇-1-磷酸酯、N，N二甲基鞘氨醇、N，N，N-三甲基鞘氨 醇、鞘氨酰磷酸胆碱、鞘磷脂及糖化鞘氨醇)、神经酰胺衍生物(神经酰 胺、D-赤式神经酰胺-1-磷酸酯、糖化神经酰胺)、二氢鞘氨醇(sphinganine) (二氢鞘氨醇)(二氢鞘氨醇-1-磷酸酯、二氢鞘氨醇(C20)、D-赤式二氢 鞘氨醇、N-酰基-二氢鞘氨醇C2、N-酰基-二氢鞘氨醇C8、N-酰基-二氢鞘 氨醇C16、N-酰基-二氢鞘氨醇C18、N-酰基-二氢鞘氨醇C24、N-酰基-二 氢鞘氨醇C24∶1)、糖化(C18)鞘氨醇和磷脂衍生物(糖化-鞘氨醇)(鞘 氨醇、βD-葡萄糖基、鞘氨醇、βD-半乳糖、鞘氨醇、βD-乳糖基)、糖化- 神经酰胺(D-葡萄糖基-β1-1’神经酰胺(C8)、D-半乳糖-β1-1’神经酰胺(C8)、 D-乳糖基-β1-1’神经酰胺(C8)、D-葡萄糖基-β1-1’神经酰胺(C12)、D-半 乳糖-β1-1’神经酰胺(C12)、D-乳糖基-β1-1’神经酰胺(C12))、糖化-磷脂 酰乙醇胺(1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N乳糖)、D-赤式(C17)衍 生物(D-赤式鞘氨醇、D-赤式鞘氨醇-1-磷酸酯)、D-赤式(C20)衍生物 (D-赤式鞘氨醇)、L-苏(C18)衍生物(L-苏鞘氨醇、沙芬戈(L-苏二氢 鞘氨醇))、鞘氨醇衍生物(卵、脑及奶衍生)(D-赤式-鞘氨醇、鞘磷脂、 神经酰胺、脑苷脂、脑硫脂类)、神经节苷脂(神经节苷脂结构、神经节 苷脂-羊脑、神经节苷脂-猪脑)、鞘氨醇衍生物(大豆)(葡萄糖神经酰胺)、 植物鞘氨醇衍生物(酵母)(植物鞘氨醇、D-核-植物鞘氨醇-1-磷酸酯、N- 酰基植物鞘氨醇C2、N-酰基植物鞘氨醇C8、N-酰基植物鞘氨醇C18，
iv)酰基辅酶A，即乙酰辅酶A(铵盐)、丁酰辅酶A(铵盐)、巴豆 酰(crotanoyl)辅酶A(铵盐)、己酰基辅酶A(铵盐)、辛酰基辅酶A(铵 盐)、癸酰辅酶A(铵盐)、月桂酰辅酶A(铵盐)、肉豆蔻酰辅酶A(铵盐)、 棕榈辅酶A(铵盐)、硬脂辅酶A(铵盐)、油酰辅酶A(铵盐)、花生酰 (arachidoyl)辅酶A(铵盐)、花生四烯酰辅酶A(铵盐)、山嵛酰辅酶A (铵盐)、二十三酰辅酶A(铵盐)、二十四酰辅酶A(铵盐)、二十四烯酰 (nervonoyl)辅酶A(铵盐)、二十六酰辅酶A(铵盐)、二十二碳六烯酰 (docosahexaenoyl)辅酶A(铵盐)，
v)氧化脂质，即1-棕榈酰-2-壬二酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-O-十六 烷基-壬二酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (PGPC)、1-棕榈酰-2-(9′-氧-壬酰)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰-2-(5′- 氧-戊酰)-sn-甘油-3-磷酸胆碱，
vi)醚脂，即：二醚脂(二烷基磷脂酰胆碱，二植烷酰醚脂)、烷基 磷酸胆碱(十二烷基磷酸胆碱(dodedylphosphocholine))、O-烷基二酰基 磷脂酰胆碱(diacylphosphatidylcholinium)(1，2-二酰基-sn-甘油-3-乙基磷 酸胆碱)、合成PAF&衍生物(1-烷基-2-酰基-甘油-3-磷酸胆碱&衍生物)，
vii)荧光脂，即：基于甘油的荧光脂(磷脂酰胆碱(NBD)、磷脂酸 (NBD)、磷脂酰乙醇胺(NBD)、磷脂酰甘油(NBD)、磷脂酰丝氨酸 (NBD))、基于鞘氨醇的荧光脂(神经酰胺(NBD)、鞘磷脂(NBD)、植 物鞘氨醇(NBD)、半乳糖脑苷(NBD))、头基标记脂质(基于甘油的)(磷 脂酰乙醇胺(NBD)、磷脂酰乙醇胺(丽丝胺罗丹明B)、二油酰磷脂酰乙 醇胺(丹酰、芘、荧光素)、磷脂酰丝氨酸(NBD)、磷脂酰丝氨酸(丹酰))、 25-NBD-胆固醇，
viii)其他脂，包括但不限于卵磷脂，Ultralec-P(ADM)、大豆粉，
ix)表面活性剂，包括但不限于聚乙二醇400；十二烷基硫酸钠；失 水山梨醇月桂酸酯，失水山梨醇棕榈酸酯，失水山梨醇硬脂酸酯(在商标 名Span20-40-60下可获得)；聚山梨醇酯，如聚氧乙烯(20)失水山梨 醇单月桂酸酯，聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯，聚氧乙烯(20) 失水山梨醇单硬脂酸酯(在商品名吐温20-40-60等下可获得)；苯扎氯铵。
在一些实施方式中，使用的磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂 酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、混合链的磷脂、溶血磷脂、 氢化磷脂、部分氢化磷脂、及其混合物。
在一些实施方式中，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯-80、卵磷脂和磷 脂酰胆碱。所述表面活性剂以足够的量存在来形成稳定的乳浊液。
表面活性剂的量可经验性地确定，且为所选定试剂和产生的组合物的 希望的形式的函数。所述的量包括按重量计少于0.1％一直到35％或以上。 在某些实施方式中，所述表面活性剂按重量计以约1％、2％、3％、4％、 5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％一直到以所述组合 物的总重量的重量计约30％的浓度存在。在某些实施方式中，所述表面活 性剂以约1重量％一直到所述组合物总重量约20重量％的浓度存在。在 某些实施方式中，所述表面活性剂以约1重量％一直到所述组合物总重量 约15重量％的浓度存在。在其它实施方式中，所述表面活性剂以约1％重 量一直到所述组合物总重量约10重量％的浓度存在。在其它实施方式中， 所述表面活性剂以约1重量％一直到所述组合物总重量约8重量％的浓度 存在。在其它实施方式中，所述表面活性剂以约1重量％一直到所述组合 物总重量约6重量％的浓度存在。在其它实施方式中，所述表面活性剂以 约1重量％一直到所述组合物总重量约4重量％的浓度存在。在其它实施 方式中，所述表面活性剂以所述组合物总重量约20重量％的浓度存在。在 其它实施方式中，所述表面活性剂以所述组合物总重量约15重量％的浓度 存在。在其它实施方式中，所述表面活性剂以所述组合物总重量约13重 量％的浓度存在。在其它实施方式中，所述表面活性剂在所述组合物总重 量约11重量％的浓度存在。在其它实施方式中，所述表面活性剂以所述组 合物总重量约8重量％的浓度存在。在其它实施方式中，所述表面活性剂 以所述组合物总重量约6重量％的浓度存在。在其它实施方式中，所述表 面活性剂以所述组合物总重量约4重量％的浓度存在。在其它实施方式中， 所述表面活性剂以所述组合物总重量约2重量％的浓度存在。在其它实施 方式中，所述表面活性剂以所述组合物总重量约1重量％的浓度存在。
这里提供的稳定的乳浊液可包含一种或多种可包裹另外的营养物或 活性试剂的选自如下的传送载体：微团，脂质体和立方水晶及其混合物， 或非变性的蛋白质的大分子聚合，如管，螺旋，球体等。然后包裹活性试 剂的所述传送载体在上皮吸收，非变性的蛋白质和/或另外的营养物/活性 试剂被传送到这里。
任选的另外的试剂
除了非变性的蛋白质，这里提供的组合物可任选包含一种或多种药物 或营养制品或其它此类被受治疗者摄食的试剂。一般来说，该试剂为宿主 中有功能的那些，功能为如，免疫调节、生化过程调节或酶活性调节。任 何可如这里描述配制的试剂可以这里提供的组合物的形式给药。如果所述 试剂是治疗剂，则所述组合物包含待传送的治疗有效量的试剂。在一个剂 量中活性试剂的特定的量会根据所述活性试剂的性质、受治疗病症的性 质、受治疗者的年龄和体型和其他参数而广泛地变化。
一般来说，除了非变性蛋白在组合物中活性试剂或营养物的量从按重 量计少于约0.01％到按所述组合物重量计约20％或更多而变化，且典型性 地配制成单一剂量给药。单一剂量可从每千克宿主体重约0.01μg到10mg 试剂变化，通常采用从0.1μg到1mg/kg的剂量。然而，这些浓度只是通 常的标准，且可基于给药的活性试剂，治疗的病症选择特定的量和剂量， 且采用的治疗用药法意味着具有如下特点的药物或活性试剂的量：该量足 够以合理的益处/风险比对参加医学治疗的受治疗者提供希望的局部或系 统效果和性能。
试剂可选自包括但不限于作用于如下的药物的无机和有机药物：周围 神经、肾上腺素能受体、胆碱能受体、神经系统、骨骼肌、心血管系统、 平滑肌、血液循环系统、突触的位点、神经效应器连接的位点、内分泌系 统、激素系统、免疫系统、生殖系统、骨骼系统、内分泌物系统、消化系 统和排泄系统、组胺系统等。使用这里提供的组合物可传送的活性试剂包 括但不限于：抗惊厥药物、止痛剂、抗震颤麻痹药、抗炎剂、钙拮抗剂、 麻醉剂、抗微生物剂、抗疟药物、抗寄生虫药、抗高血压药、抗组织胺剂、 解热药、α-肾上腺素能激动剂、α-阻断剂、杀虫剂、杀菌剂、支气管扩张 剂、β-肾上腺素能阻滞药物、避孕药、心血管类药物、钙通道抑制剂、镇 静剂、诊断剂、利尿剂、电解质、酶、催眠药、激素、降血糖药、促血糖 增高药、肌肉收缩剂、肌肉松弛剂、肿瘤药物、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、 眼药、心理兴奋剂、镇静药、类固醇、拟交感神经药、拟副交感神经药、 镇静剂、泌尿道药物、疫苗、阴道药物、维生素、矿物质、非甾体抗炎药、 血管紧张素转换酶、多核苷酸、多肽、多糖、和包括草药补充剂的营养补 品。
待传送的试剂水平按所述组合物重量计为从约0.01％直到约50％，从 约0.1％直到约40％，从约0.1％直到约30％，从约0.1％直到20％左右， 从约0.1％直到10％，从约0.1％直到约9％，从约0.1％直到约8％，从约 0.1％直到约7％，从约0.1％直到约6％，从约0.1％直到约5％，从约0.1 ％直到4％，从约0.1％直到约3％，从约0.1％直到约2％，从约0.1％直 到约1％。待传送的试剂可为水溶性的，微水溶性的或油溶性的。在某些 实施方式中，待传送的试剂选自：抗惊厥药物、止痛剂、抗震颤麻痹药、 抗炎剂、钙拮抗剂、麻醉剂、抗微生物药物、抗疟药物、抗寄生虫药、抗 高血压药、抗组织胺剂、解热药、α-肾上腺素能激动剂、α-阻断剂、杀虫 剂、杀菌剂、支气管扩张剂，β-肾上腺素能阻滞药物，避孕药，心血管类 药物，钙通道抑制剂、镇静剂、诊断剂、利尿剂、电解质、酶、催眠药、 激素、降血糖药、促血糖增高药、肌肉收缩剂、肌肉松弛剂、肿瘤药、糖 蛋白、核蛋白、脂蛋白、非变性乳清蛋白、眼药、心理兴奋剂、镇静药、 类固醇、拟交感神经药、拟副交感神经药、镇静剂、泌尿道药物、疫苗、 阴道药物、维生素、矿物质、非甾体抗炎药、血管紧张素转换酶、多核苷 酸、多肽、多糖和包括草药补充剂的营养补品。
在某些实施方式中，活性剂选自如下：
α-肾上腺素能激动剂，如阿屈非尼、肾上腺酮(adrenolone)、酰胺福 林(amidephrine)、阿拉可乐定、布酞嗪、可乐定、环喷他明、地托咪定、 二甲福林、双特戊酰肾上腺素、麻黄碱、肾上腺素、非诺唑啉、胍那苄、 胍法辛、羟基苯丙胺、异波帕胺、茚唑啉、握克丁、美芬丁胺、间羟胺、 盐酸甲氧明、甲己胺、美替唑啉、米多君、鼻眼净、去甲肾上腺素、去甲 苯福林、二甲己胺、鱆胺、羟甲唑啉、盐酸去氧肾上腺素、盐酸苯丙醇胺、 苯丙甲胺、福来君、丙己君、伪麻黄碱、利美尼定、昔奈弗林、眼圣眼药 水、噻美尼定、曲马唑啉、异庚胺、泰马唑啉、酪胺和赛洛唑啉；
β-肾上腺素能激动剂，如沙丁胺醇、班布特罗、比托特罗、卡布特罗、 克仑特罗、氯丙那林、地诺帕明、双羟乙麻黄碱、培沙明、麻黄碱、肾上 腺素、乙非君、乙基去甲肾上腺素、非诺特罗、福莫特罗、海索那林、异 波帕胺、乙基异丙肾上腺素、异丙肾上腺素、马布特罗、奥西那林、甲氧 那明、麻黄苯丙酮、吡布特罗、普瑞特罗、丙卡特罗、普罗托醇、茶丙喘 宁、利米特罗、利托君、索特瑞醇、特布他林和扎莫特罗；
α-肾上腺素能受体阻断剂，如氨磺洛尔、阿罗洛尔、达哌唑、多沙唑 嗪、甲磺酰双氢麦角碱、芬司匹利、吲哚拉明、拉贝洛尔、尼麦角林、哌 唑嗪、特拉唑嗪、妥拉唑林、曲马唑嗪和育亨宾；
β-肾上腺素能受体阻滞剂，如醋丁洛尔、心得舒、氨磺洛尔、阿罗洛 尔、阿替洛尔、苯呋洛尔、倍他洛尔、贝凡洛尔、比索洛尔、波引洛尔、 布库洛尔、布非洛尔(befetolol)、丁呋洛尔、布尼洛尔、布拉洛尔、盐酸 布替君、丁非洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、塞利洛尔、塞他洛 尔、氯拉洛尔、地来洛尔、依泮洛尔、艾司洛尔、茚诺洛尔、拉贝洛尔、 左布诺洛尔、甲吲哚心安、美替洛尔、美托洛尔、莫普洛尔、萘肟洛尔、 硝苯洛尔、尼普地罗、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普拉洛尔、丙萘 洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、硫氧洛尔、他林洛尔、特他洛尔、噻吗洛尔、 托利洛尔和希苯洛尔；
醇抑制剂，如柠檬酸氰氨化钙、双硫仑、纳迪德和硝法唑；
醛糖还原酶抑制剂，如依帕司他、泊那司他、索比尼尔和托瑞司他；
同化激素，如雄异噁唑、雄烯二醇、勃雄二醇、勃拉睾酮、氯司替勃、 乙雌烯醇；甲酰烯龙、4-羟基-19-去甲睾酮、美雄醇、美替诺龙、美曲勃 龙、诺龙、诺龙癸酸酯、诺龙对己基氧苯基丙酸酯、诺龙苯丙酸酯、二乙 诺酮、羟甲睾酮、苯噻啶、奎勃龙、司腾勃龙和群勃龙；
止痛剂(牙科)如三氯叔丁醇、丁香和丁香酚；
镇痛药(麻醉)，如阿芬太尼、烯丙罗定、阿法罗定、阿尼利定、苄 吗啡、贝齐米特、丁丙诺啡、布托啡诺、氯尼他秦、可待因、可待因甲基 溴、磷酸可待因、硫酸可待因、地索吗啡、吗拉迈得、地佐辛、地恩丙胺、 双氢可待因、醋酸双氢可待因酮烯醇、双氢吗啡、地美沙多、地美庚醇、 二甲噻丁、吗苯丁酯(dioxaphetyl butyrate)、地匹哌酮、依他佐辛、依索 庚嗪、乙甲噻丁、乙基吗啡、依托尼秦、芬太尼、氢可酮、重酒石酸二氢 可待因酮、氢吗啡酮、羟哌替啶、异美沙酮、凯托米酮、左吗喃、洛芬太 尼、度冷丁、美普他酚、美他佐辛、盐酸美沙酮、美托酮、吗啡、吗啡的 衍生物、苄吗啡十四酸酯、纳布啡、那碎因、二烟酰吗啡、左旋3-羟吗啡 烷、去甲美沙酮、去甲吗啡、二苯哌己酮、鸦片、羟考酮、氧吗啡酮、阿 片全碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、非那佐辛、苯哌利定(pheoperidine)、去 痛定、氰苯双哌酰胺、丙庚嗪、二甲哌替啶、异丙哌替啶、丙吡胺、达而 丰、舒芬太尼与替立定；
止痛药(非麻醉)，如对乙酰氨基酚、水杨酸对乙酰氨苯酯、乙酰苯 胺、乙酰水杨酰水杨酸、阿氯芬酸、阿明洛芬、阿洛普令、双(乙酰水杨 酸酯)铝、氨氯苯嗪、2-氨基-4-甲基吡啶、氨丙吡酮、氨基比林、水杨酸 铵、安替比林、水杨酸安替比林、安曲非宁、阿扎丙宗、阿司匹林、扑炎 痛、苯噁丙酸、苄哌吡酮、苄达明、对溴乙酰苯胺、5-溴水杨酸醋酸酯、 丁西丁、丁苯羟酸、丁丙二苯肼、布他西丁、乙酰水杨酸钙、卡马西平、 醇苯哌酯、卡必芬、苯噁嗪二酮、氯醛比林、氯乙苯噁嗪酮、胆碱水杨酸、 辛可芬、西拉马朵、氯美辛(Clormetacin)、克罗丙胺、克罗乙胺、右奥沙 屈、二苯米唑、二氟尼柳、二羟化铝乙酰水杨酸盐、地匹乙酯、安乃近、 依莫法宗、恩芬那酸、依匹唑、依特柳酯、乙水杨胺、乙氧二氨偶氮苯、 依托度酸、联苯乙酸、非诺洛芬、夫洛非宁、氟灭酸、氟苯乙砜、氟吡汀、 氟丙喹宗、氟比洛芬、磷柳酸、龙胆酸、格拉非宁、异丁芬酸、咪唑水杨 酸、吲哚美辛、吲哚洛芬、三苯唑酸、isoladol、异尼辛、酮洛芬、酮咯酸、 对乳酰乙氧苯胺、来苯胺、洛索洛芬、赖氨酸乙酰水杨酸盐、乙酰水杨酸 镁、甲氧异丁嗪、甲氧夫啉、咪洛芬、吗拉宗、吗啉水杨酸、萘普生、奈 福泮、尼芬那宗、5′硝基-2′丙氧基乙酰苯胺、帕沙米特、哌立索唑、非那 西丁、盐酸非那吡啶、非诺可、非诺吡酮、苯基乙酰水杨酸盐、水杨酸苯 酯、非尼拉朵、哌布宗、哌立酮、普罗利定、丙帕他莫、异丙安替比林、 普罗沙唑、奎宁水杨酸酯、雷米那酮、利马唑甲硫酸盐、乙酰水杨胺、水 杨苷、水杨酰胺、水杨酰胺邻乙酸、水杨酰硫酸酯、沙索林、沙维林、西 美曲特、水杨酸钠、磺甲比林、舒洛芬、他尼氟酯、替诺昔康、特罗芬那 酯、粉防己碱、替诺立定、托芬那酸、托普罗宁、曲马多、维米醇、联苯 丁酸和佐美酸；
雄激素，如雄酮、勃地酮、脱氢表雄酮、氟甲睾酮、美他诺龙、甲二 氢睾酮、美雄酮、17-甲睾酮、17α-甲基睾酮3-环戊烯醇醚、诺乙雄龙、甲 诺酮、氧雄龙、羟甲睾酮、康复龙、普拉睾酮、二氢睾酮(stanlofone)、 司坦唑醇、睾酮、睾酮17-三氯乙醛半缩醛、17β-环戊丙酸睾酮、庚酸睾酮、 烟酸睾酮、苯乙酸睾酮、丙酸睾酮和硫甲睾酮；
麻醉药，如醋胺丁香酚、醋酸阿法多龙、阿法沙龙、amucaine、阿莫 拉酮、盐酸阿米洛卡因、表麻滴瞳液、苯佐卡因、贝托卡因、苯柳胺酯、 布比卡因、布大卡因、丁二烯、布坦卡因、burethamine、丁硫妥钠、丁托 西卡因、卡铁卡因、2-盐酸氯普鲁卡因、己基苯酰爱康因、可卡因、环甲 卡因、盐酸二丁卡因、异喹卡因、二甲卡因、盐酸地哌冬、达克罗宁、去 水芽子碱、芽子碱、乙基氨基苯甲酸酯、乙基氯化物、依替卡因、乙苯噁 啶、β-优卡因、尤普罗辛、非那可明、福吗卡因、环己烯巴比妥、盐酸海 克卡因、羟孕酮酯钠、羟基普鲁卡因、羟丁卡因、异丁基对氨基苯甲酸酯、 氯胺酮、亮氨卡因甲磺酸酯、左沙屈尔、利多卡因、甲哌卡因、盐酸美普 卡因、盐酸美布卡因、美索比妥钠、甲基氯化物、咪唑安定、麦替卡因、 纳依卡因、奥他卡因、奥索卡因、乙氧连氮、对乙氧卡因、盐酸非那卡因、 苯环利定、苯酚、哌罗卡因、匹多卡因、聚乙二醇单十二醚、丙吗卡因、 丙胺卡因、普鲁卡因、丙泮尼地、丙泮卡因、丙美卡因、丙哌卡因、异丙 酚、盐酸丙氧卡因、假可卡因、吡咯卡因、盐酸奎宁尿素、利索卡因、水 杨酰醇、盐酸丁卡因、硫烯比妥、硫戊巴比妥(thimylal)、仲丁硫巴比妥 钠、硫喷妥钠、托利卡因、三甲卡因和佐拉敏；
减食欲剂，如阿米雷司、胺苯氯醛、安非他明、苄非他明 (benzaphetamine)、对氯苯丁胺、氯苄雷司、氯福雷司、邻氯苯叔丁胺、 环己异丙甲胺、硫酸右旋苯丙胺(destroamphetamine)、安非拉酮、二苯甲 哌啶乙醇、N-乙基苯丙胺、芬布酯、芬氟拉明、芬普雷司、呋甲苯丙胺、 左芬氟拉明(levophacetoperate)、马吲哚、美芬雷司、甲基麻黄酮、去氧 麻黄碱、去甲伪麻黄碱、苯甲曲秦、酒石酸苯甲曲秦、芬美曲秦、喷托雷 司、盐酸苯丙醇胺和匹西雷司；
驱虫药(绦虫)，如槟榔碱、鳞毛蕨素、绵马醇、双氯酚、酸藤子酚、苦 辛、萘、氯硝柳胺、石榴碱(Pellertierine)、石榴碱鞣酸米帕林；
驱虫药(线虫)，如土木香脑、硝硫氰胺、土荆艾油素、苄酚宁、双硫 氰苯、四氯化碳、香芹酚、环苯达唑、乙胺嗪、二苯甲酰乙烷、碘二噻宁、 地孟汀、甲紫、4-己雷琐辛、卡英酸、甲苯达唑、2-萘酚、奥克太尔、木 瓜蛋白酶、哌嗪、己二酸哌嗪、柠檬酸哌嗪、哌嗪依地酸钙、酒石酸哌嗪、 噻嘧啶、扑蛲灵、α-山道年、司替碘铵、四氯乙烯、四咪唑、噻苯达唑、 麝香草酚、百里基N-异戊基氨基甲酸酯、三氯酚哌嗪和脲锑胺；
驱虫药(盘尾属)，如伊维菌素和舒拉明钠；
驱虫药(裂体吸虫属)，如硝硫氰胺、氨苯酞胺、酒石酸锑钾、葡萄糖 酸锑钠、酒石酸锑钠、巯基乙酸锑钠、巯基乙酰胺锑、胺甲噻吨酮、海恩 酮、盐酸胺甲硫蒽酮、尼立达唑、奥沙尼喹、吡喹酮、二巯琥珀酸锑钠、 睇波芬和脲锑胺；
驱虫药(吸虫)，如安锑锂明和四氯乙烯；
抗痤疮药，如阿达帕林、苯甲孕酮、壬二酸、过氧化苯酰、西奥克托、 环丙孕酮、莫维A胺、间苯二酚、维甲酸、四羟醌和维A酸(Tretinonine)；
抗变应性药物，如氨来呫诺、阿司咪唑、氮卓斯汀、色甘酸钠、芬哌 丙烷、组胺、异丁司特、奈多罗米、奥沙米特、喷替吉肽、毒葛浸膏、槲 叶毒葛浸膏、有毒漆树提取物、瑞吡司特、曲尼司特、曲呫诺和漆酚；
抗阿米巴药，如胂噻醇、比拉米可、卡巴胂、吐根酚碱、氯倍他胺、 氯喹、氯苯沙明、金霉素、去氢依米丁、双溴丙脒、二氯尼特、Dephetarsone、 依米丁、烟曲霉素、格劳卡苷、甘铋胂、8-羟基-7-碘-5-硫酸喹啉、氯碘羟 喹、双碘喹啉、巴龙霉素、泛喹酮、甲苯比妥(phearsone sulfoxylate)、聚 苯胂酸、普罗帕脒、喹法米特、塞克硝唑、磺胺苯胂、替克洛占、四环素、 硫柳脲苯胂、硫代卡巴胂和替硝唑；
抗雄激素，如戊双氟酚、西奥克托、环丙孕酮、醋酸地马孕酮、福至 尔(flutimide)、尼鲁米特和奥生多龙；
抗心绞痛药，如醋丁洛尔、阿普洛尔、胺碘酮、氨氯地平、阿罗洛尔、 阿替洛尔、苄普地尔、贝凡洛尔、布库洛尔、布非洛尔、丁呋洛尔、布尼 洛尔、布拉洛尔、卡拉洛尔(Carozolol)、卡替洛尔、卡维地洛、塞利洛尔、 马来酸肉桂哌乙酯、地尔硫卓、依泮洛尔、非洛地平、戈洛帕米、伊莫拉 明、茚诺洛尔、二硝酸异山梨醇酯、伊拉地平、利马前列素、甲吲洛尔、 美托洛尔、吗多明、纳多洛尔、尼卡地平、硝苯地平、硝苯洛尔、尼伐地 平、尼普地洛、尼索地平、硝酸甘油、氧烯洛尔、奥昔非君、奥扎格雷、 喷布洛尔、四硝酸戊四醇酯、吲哚洛尔、丙萘洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、 特罗地林、噻吗洛尔、托利洛尔和维拉帕米；
抗心律不齐药，如醋丁洛尔、乙酰卡尼、阿糖腺苷、阿义马林、阿 普洛尔、胺碘酮、克冠吗啉、阿普林定、阿罗洛尔、阿替洛尔、贝凡洛尔、 甲苯磺酸溴苄胺、Bubumolol、布非洛尔、丁萘夫汀、布尼洛尔、布拉洛 尔、盐酸布替君、布托苯定、卡泊酸、卡拉洛尔、卡替洛尔、西苯唑啉、 氯拉洛尔、丙吡胺、恩卡尼、艾司洛尔、氟卡尼、戈洛帕米、二氢奎尼丁、 英地卡尼、茚诺洛尔、异丙托溴铵、利多卡因、劳拉义明、劳卡尼、甲氧 苯汀、美替洛尔、美西律、莫雷西嗪、萘肟洛尔、硝苯洛尔、氧烯洛尔、 喷布洛尔、吲哚洛尔、吡美诺、普拉洛尔、丙缓脉灵、盐酸普鲁卡酰胺、 丙萘洛尔、普罗帕酮、普萘洛尔、吡诺林、硫酸奎尼丁、奎尼丁、索他洛 尔、他林洛尔、噻吗洛尔、妥卡尼、维拉帕米、维喹地尔和希苯洛尔；
抗动脉硬化药物，如吡醇氨酯；
抗关节炎药/抗风湿药，如阿洛铜钠、金诺芬、金硫葡糖、金硫醋苯 胺、硫唑嘌呤、3-金硫-2-丙醇-1-磺酸钙、塞来考昔、氯喹、氯丁扎利、铜 克索林、双醋瑞因、氨基葡萄糖、硫代苹果酸金钠、硫代硫酸金钠、羟氯 喹、凯布宗、氯苯扎利、蜂毒素、甲氨蝶呤、金硫乙酸钙和青霉胺；
抗菌药(抗菌素)包括：氨基糖甙类药物如阿米卡星、安普霉素、阿贝 卡星、斑伯霉素、布替罗星、地贝卡星、二氢链霉素、阿司米星、庆大霉 素、天神霉素、卡那霉素、小诺米星、新霉素、十一烯酸新霉素、奈替米 星、巴龙霉素、核糖霉素、西索米星、大观霉素、链霉素、链霉素异烟肼 和妥布霉素；
酰胺醇类药物，如叠氮氯霉素、氯霉素、氯霉素棕榈酸酯、氯霉素 泛酸酯、氟苯尼考和甲砜霉素；
安莎霉素类，如利福米特、利福平、利福霉素和利福昔明；
β-内酰胺类，包括：碳青霉素烯类，如亚胺培南；
头孢菌素类，如头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢曲秦、头 孢西酮、头孢唑林、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地秦、头孢尼西、头孢哌 酮、头孢雷特、头孢噻肟、头孢替安、头孢咪唑、头孢匹胺(Cefpirimide)、 头孢泊肟、头孢沙定、头孢磺啶、头孢他啶、头孢特仑、头孢替唑、头孢 布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢呋辛、头孢唑喃、头孢乙腈钠、头孢氨 苄、头孢甘酸、头孢利素、头孢菌素、头孢噻吩、头孢匹林钠、头孢霉定 和pivcefalexin；
头霉素类如头孢拉宗、头孢美唑、头孢米诺、cefetan和头孢西丁；
单环β-内酰胺类如氨曲南，卡芦莫南和替吉莫南；
氧头孢烯类如氟氧头孢和拉氧头孢(moxolactam)；
青霉素类，如美西林、氮卓脒青霉素匹酯、阿莫西林、氨苄西林、阿 帕西林、阿扑西林、阿度西林、阿洛西林、巴氨西林、苄青霉酸、青霉素 钠、羧苄西林、羧苄青霉素苯酯钠、卡茚西林、氯甲西林、邻氯青霉素、 环西林、双氯西林、联苯青霉素钠、依匹西林、芬贝西林、氟氯西林 (Floxicillin)、海他西林、仑氨西林、美坦西林、甲氧西林钠、美洛西林、 萘夫西林钠、苯唑西林、培那西林、氢碘酸喷沙西林、苯乙苄胺青霉素G、 苄星青霉素G、二苯甲胺青霉素G、青霉素G钙、海巴明青霉素G、青霉 素G钾、普鲁卡因青霉素G、青霉素N、青霉素O、青霉素V、苄星青霉 素V、哈胺青霉素V、青哌环素、氨苯乙基青霉素钾、哌拉西林、匹氨西 林、丙匹西林、喹那西林、磺苄西林、酞氨西林、替莫西林和替卡西林；
林可酰胺类抗生素，如克林霉素和林可霉素；
大环内酯类，如阿奇霉素、卡波霉素、克拉霉素、红霉素、醋硬脂红 霉素、依托红霉素、红霉素葡庚糖酸酯、乳糖红霉素、红霉素丙酸酯、红 霉素硬脂酸酯、交沙霉素、吉他霉素、麦迪霉素、米卡霉素、竹桃霉素、 普利霉素、罗他霉素、罗沙米星、罗红霉素、螺旋霉素和醋竹桃霉素；
多肽，如安福霉素、杆菌肽、卷曲霉素、多粘菌素E、恩多霉素、恩 维霉素、夫沙芬净、短杆菌肽、短杆菌肽S、米卡霉素、多粘菌素、多粘 菌素B-甲磺酸、普那霉素、利托菌素、替考拉宁、硫链丝菌素、结核放线 菌素、短杆菌酪肽、短杆菌素、万古霉素、紫霉素、紫霉素泛酸酯、维吉 霉素和杆菌肽锌；
四环素类，如阿哌环素、金霉素、氯莫环素、地美环素、多西环素、 胍甲环素、赖甲环素、甲氯环素、美他环素、米诺环素、土霉素、青哌环 素、匹哌环素、罗利环素、山环素、琥氯霉素吡甲四环素和四环素；和
其它的抗生素，如环丝氨酸、莫匹罗星和抗结核菌素；
抗菌药物(合成的)，包括：2，4-二氨基嘧啶、如溴莫普林、四氧普林 和甲氧苄啶；
硝基呋喃类药物，如呋喃他酮、氯化呋噻咪唑、硝呋拉定、硝呋太尔、 硝呋复林、硝呋吡醇、硝呋拉嗪、硝呋妥因醇和呋喃妥因；
喹诺酮类及类似物，如氨氟沙星、西诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、 依诺沙星、氟罗沙星、氟甲喹、洛美沙星、米洛沙星、萘啶酸、诺氟沙星、 氧氟沙星、奥索利酸、培氟沙星、吡哌酸、吡咯米酸、罗索沙星、替马沙 星和托氟沙星；
磺胺类药物，如乙酰磺胺林、乙酰磺胺异噁唑、新百浪多息、苄磺胺、 氯胺-B、氯胺-T、二氯胺T、甲醛磺胺噻唑、N2甲酰磺胺异二甲嘧啶、 N2-β-D-N4-葡萄糖基磺胺、磺胺米隆、4′-(甲氨磺酰基)对氨基苯磺苯胺、 对硝磺胺噻唑、诺丙磺胺、酞磺醋胺、酞磺胺噻唑、柳氮磺嘧啶、琥珀磺 胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺醋酰、磺胺氯达嗪、磺胺柯定、磺胺乙胞嘧啶、 磺胺嘧啶、磺胺戊烯、磺胺地索辛、磺胺多辛、磺胺乙二唑、磺胺脒、磺 胺二甲哑唑脒、磺胺林、磺胺洛西酸、磺胺甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺 胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嗪、 磺胺美曲、磺胺米柯定、磺胺噁唑、磺胺、磺胺基甲烷磺酸三乙醇胺盐 (Sulfanilamidomethanesulfonic Acid Triethanolamine Salt)、4-磺胺水杨酸、 N-磺胺酰磺胺(Sulfanilylsulfanilamide)、磺胺酰脲、N-磺胺酰-3，4-丙谷胺、 磺胺硝苯、磺胺-5-甲嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺普罗林、磺胺吡嗪、磺胺吡 啶、磺胺异噻唑、磺胺均三嗪、磺胺噻唑、磺胺硫脲、磺胺托拉米、磺胺 索嘧啶和磺胺异噁唑；
砜类，如醋氨苯砜、氨苯砜乙酸、醋胺磺氨苯砜钠、氨苯砜、地百里 砜、二葡糖氨苯砜钠、苯丙砜、琥珀氨苯砜、对氨基苯磺酸、对磺胺酰苄 胺(p-Sulfanilylbenzylamine)、  p，p′-二磺酰二苯胺(Sulfonyldianiline)-N，N′ 二半乳糖苷、亚磺氨苯砜钠和噻唑砜；和
其它如氯福克酚、海克西定、乌洛托品、乌洛托品脱水亚甲基柠檬酸、 马尿酸乌洛托品、扁桃酸乌洛托品、次水杨酸乌洛托品、硝羟喹啉和希波 酚；
抗胆碱能类，如盐酸阿地芬宁、阿尔维林、Ambutonomium Bromide、 地美戊胺、阿米西群、磷酸安普洛托品、甲溴辛托品、阿朴阿托品、阿托 品、氧化阿托品、贝那替秦、苯醇酸胺乙酯、苄替米特、苯咯溴铵、甲磺 酸苄托品、甲硫贝弗宁、比哌立登、布托溴铵、N-丁基莨菪溴化铵、布卓 (Buzepide)、胺苯戊酯、盐酸咳美芬、氯苄沙明、氯苯沙明、西托溴铵、 溴奎环二苯酯、环戊君、碘化环宁、盐酸赛克立明、地普托品、右苄替米 特、硫酸地布托林、盐酸双环胺、二乙嗪、双苯美林、双己维林、甲硫酸 二苯甲哌、N-(1，2-二苯乙基)烟酰胺、双哌维林、地泊溴铵、依美溴铵、溴 甲桥苯齐林、普罗吩胺、乙苄托品、乙苄海明、依托多林、尤卡托品、苯 维溴铵、芬托溴铵、氟托溴铵、格隆溴铵、海特溴铵、甲硫己环铵 (Hexocyclium Methyl Sulfate)、后马托品、莨菪碱、异丙托溴铵、异丙酰 铵、阿托甲品、甲氯沙明、溴美喷酯、甲卡拉芬、溴甲胺太林、甲哌噻吨、 甲溴东莨菪碱、辛戊胺、氯化奥昔布宁、羟苄利明、奥芬溴铵、戊哌立特、 喷噻溴铵、芬卡米特、芬格鲁胺、溴哌喷酯、哌立度酯、哌苯乙醇、甲硫 泊尔定、普立地诺、吡芬溴铵、丙环定、溴丙胺太林、环苯哌酯、丙吡咯 吗嗪、东莨菪碱、氧化东莨菪碱、芪碘锭、曼陀罗、舒托泊铵、噻昔诺 (Thihexinol)、双苯乙硫酯、替莫碘胺、噻哌溴铵、替喹溴胺、曲地碘铵、 盐酸苯海索、二苯乙酸莨菪酯、齐酸甲氧托品、托吡卡胺、曲司氯铵、戊 沙溴铵和珍托溴铵；
抗惊厥药物，如乙酰苯丁脲、阿布妥因、阿洛双酮、氨鲁米特、4- 氨基-3-羟丁酸、苯乳胺、贝克拉胺、布拉氨酯、溴化钙、卡马西平、桂溴 胺、氯美噻唑、氯硝西泮、癸氧酰胺、地沙双酮、二甲双酮、去氧苯妥英、 依特比妥、依沙双酮、乙琥胺、乙苯妥英、氟苯乙砜、加巴喷丁(Garbapentin)、 5-羟色氨酸、拉莫三嗪、Lomactil、溴化镁、硫酸镁、美芬妥英、甲苯比妥、 美沙比妥、1-甲基苯乙妥因、甲琥胺、5-甲基-5-(3-菲基)海因、3-甲基-5- 苯基海因、那可比妥、尼美西泮、硝西泮、甲乙双酮、苯乙酰脲、非沙比 妥、苯丁酰脲、苯巴比妥、苯巴比妥钠、苯琥胺、苯甲比妥、苯妥英、苯 噻妥英钠、溴化钾、吉美前列素、扑米酮、卤加比、溴化钠、丙戊酸钠、 茄属、溴化锶、琥氯非尼、舒噻美、替群妥英、噻加宾、三甲双酮、丙戊 酸、丙戊酰胺、氨己烯酸和唑尼沙胺；
抗抑郁药，包括：双环类，如苯奈达林、卡罗沙酮、西酞普兰、二甲 沙生、吲达品、芬咖明、马来酸氟伏沙明、盐酸茚洛秦、奈福泮、诺米芬 辛、羟色氨酸、奥昔哌汀、帕罗西汀、舍曲林、胺苯硫卓酮、曲唑酮、文 拉法辛和氯苯吡卓；
肼类/肼，如苯酰甲苄肼、异丙氯肼、异丙烟肼、异卡波肼、尼亚拉胺、 奥他莫辛和苯乙肼；
吡咯酮类，如可替宁、罗利普令和咯利普兰；
四环类，如马普替林、美曲吲哚、米安色林和羟丙替林；
三环类，如阿地唑仑、阿米替林、氧阿米替林、阿莫沙平、布替林、 氯米帕明、地美替林、地昔帕明、二苯西平、Dimetracrine、二苯噻庚英、 多塞平、三氟丙嗪、丙米嗪、N-氧化丙米嗪、伊普吲哚、洛非帕明、美利 曲辛、美他帕明、去甲替林、肟替林、奥匹哌醇、苯噻啶、丙吡西平、普 罗替林、奎纽帕明、噻奈普汀和曲米帕明；和
其它的如阿屈非尼、贝那替秦、丁氨苯丙酮、布他西丁、地阿诺、醋 谷地阿诺、醋氨苯酸地阿诺、地奥沙屈、依托哌酮、非巴氨酯、非莫西汀、 芬戊二醇、氟西汀、氟伏沙明、血卟啉、Hypercinin、左芬氟拉明、美地 沙明、米那普令、吗氯贝胺、奥沙氟生、吡贝拉林、普罗林坦、吡琥胺酯、 氯化铷、舒必利、舒托必利、替尼沙秦、托扎啉酮、托芬那辛、托洛沙酮、 反苯环丙胺、L-色氨酸、维洛沙秦和齐美定；
抗糖尿病药，包括：双胍、如丁福明、二甲双胍和苯乙双胍；
激素，如高血糖素、胰岛素、胰岛素注射液、胰岛素锌混悬液、中效 胰岛素混悬液(lsophane Insulin Suspension)、精蛋白锌胰岛素混悬液和结 晶胰岛素锌；
磺酰脲衍生物，如醋酸己脲、1-丁基-3-间氨基苯磺酰脲、氨磺丁脲、 氯磺丙脲、格列波脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列派特、格列 本脲、格列噻唑、格列丁唑、格列己脲、格列嘧啶钠、格列平脲、苯磺丁 脲、妥拉磺脲、甲苯磺丁脲和甲磺环己脲；和
其它的如阿卡波糖、丙酮二酸钙和米格列醇；
止泻药物，如乙酰鞣酸、鞣酸白蛋白、氨磺苯丙酮、水杨酸铝-碱、西 阿尼醇、地芬诺辛、地芬诺酯、利达脒、洛哌丁胺、甲铋喹、延龄草属和 乌沙苷；
抗利尿药，如去氨加压素、苯赖加压素、赖氨加压素、鸟氨加压素 (Omipressin)、羟辛可芬、垂体后叶素、特利加压素和加压素；
抗雌激素药，如醋酸地马孕酮、乙胺氧三苯醇、他莫昔芬和托瑞米芬；
抗真菌药物(抗生素)，包括：多烯类化合物、如两性霉素B、克念菌 素、制皮菌素、非律平、制霉色基素、曲古霉素、哈霉素、鲁斯霉素、美 帕曲星、那他霉素、制霉菌素、培西洛星和真菌霉素；和其它的如氮丝氨 酸、灰黄霉素、寡霉素、十一烯酸新霉素、吡咯尼群、西卡宁、杀结核菌 素和绿毛菌素；
抗真菌药物(合成的)，包括：丙烯胺类，如萘替芬和特比萘芬；
咪唑类，如联苯苄唑、布康唑、氯登妥因、氯米达唑、氯康唑、克霉 唑、益康唑、恩康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、咪康唑、奥莫康唑、 奥昔康唑、硝酸盐、硫康唑和噻康唑；
三唑类，如氟康唑、伊曲康唑和特康唑；和其它的如吖啶琐辛、阿莫 罗芬、苯柳胺酯、溴柳氯苯胺、丁氯柳胺、丙酸钙、Chlophenesin、环吡 酮、氯羟喹、科帕腊芬内特、地马唑、卡匹帕明、依沙酰胺、氟胞嘧啶、 胺氯苯噻唑、海克替啶、氯氟卡班、硝呋太尔、碘化钾、丙酸、巯氧吡啶、 水杨苯胺、丙酸钠、舒苯汀、替诺尼唑、托西拉酯、托林达酯、托萘酯、 3′，4′，5′，5，7-五羟黄酮、苄硫噻二嗪乙酸、十一碳烯酸和丙酸锌；
抗青光眼药物，如乙酰唑胺、苯呋洛尔、倍他洛尔、布拉洛尔、卡替 洛尔、达哌唑、二氯磺胺、地匹福林、肾上腺素、左布诺洛尔、醋甲唑胺、 美替洛尔、毛果芸香碱、吲哚洛尔和噻吗洛尔；
抗促性腺激素，如达那唑、孕三烯酮和对羟苯丙酮；
抗痛风药物，如别嘌醇、卡洛芬、秋水仙碱、丙磺舒和磺吡酮；
抗组织胺类，包括：烷基胺衍生物、如阿伐斯汀、巴米品、溴苯那敏、 氯苯那敏、二甲茚定、异丙辛胺、非尼拉敏、吡咯他敏、噻苯哌胺、托普 帕敏和曲普利啶；
氨基烷基醚类，如氨醇醋茶碱、溴苯醇胺、卡比沙明、氯马斯汀、二 苯吡拉啉(Diphenlypyraline)、多西拉敏、Embrammine、甲氧拉敏、 Mephenphydramine、对甲苯海明、奥芬那君、苯托沙敏、哌海茶碱和司他 斯汀；
氨茶碱衍生物，如阿洛拉胺、对溴苄吡二胺、氯吡拉敏、氯噻吡二胺、 希司咯定、美沙喃林、美沙芬林、美沙吡林、芬苯扎胺、美吡拉敏、他拉 斯汀、西尼二胺、盐酸松齐拉敏、曲吡那敏和佐拉敏；
哌嗪类，如西替利嗪、氯环力嗪、桂利嗪、氯西尼嗪和羟嗪；
三环类，包括：吩噻嗪类、如二甲氨乙酰吩噻嗪、乙异丁嗪、芬乙嗪、 N-氯化羟甲异丙嗪、异丙美沙嗪、美喹他嗪、异丙嗪、帕拉塞嗪和甲磺异 丙嗪；和
其它的如阿扎他定、氯苯西泮、赛庚啶、地普托品、异西喷地、氯雷 他定和丙硫喷地；
和其它的抗组胺药物，如安他唑啉、阿司咪唑、氮卓斯汀、西托肟、 克立咪唑、氯苯托品、二苯唑啉、苯海拉明、丙酸氟替卡松、美海洛林 (Mebhydroline)、苯茚胺、特酚伪麻片和曲托喹啉；
抗高脂蛋白药，包括：芳氧基链烷酸衍生物，如苄氯贝特(Beclorbrate)、 苯扎贝特(Bazafibrate)、比尼贝特、环丙贝特、克利贝特、氯贝丁酯、氯 贝酸、依托贝特(Etonfibrate)、非诺贝特、吉非贝齐、尼可贝特、吡贝特、 氯烟贝特、双贝特和益多酯；
胆汁酸多价螯合剂类，如考来烯胺树脂、考来替泊和降胆葡胺；
HMG CoA还原酶，如氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀钠和辛伐他汀；
烟酸衍生物烟酰胺铝、阿昔莫司、戊四烟酯、尼可氯酯、尼可莫尔和 氧烟酸；
甲状腺激素及类似物，如依塞罗酯、甲状丙酸和甲状腺素；和其它的 如，阿昔呋喃、阿扎胆醇、苯氟雷司、β-亚苄基丁酰胺(Benzalbutyramid)、 卡尼汀、硫酸软骨素、氯雌酮甲醚、Detaxtran、葡聚糖硫酸钠、5，8，11，14，17- 二十碳五烯酸、香茹嘌呤、夫拉扎勃(Furazbol)、美格鲁托、甲亚油酰胺、 双甲雌三醇、鸟氨酸、γ-谷维素、泛硫乙胺、四乙酸季戊四醇酯、α-苯基 丁酰胺、吡扎地尔、普罗布考、α-谷甾醇、磺托酸、哌嗪盐、硫地醇、曲 帕拉醇和联苯丁酸；
抗高血压药，包括：芳基乙醇胺衍生物，如氨磺洛尔、丁呋洛尔、地 来洛尔、拉贝洛尔、丙萘洛尔、索他洛尔和硫氧洛尔；
芳基氧丙醇胺衍生物，如醋丁洛尔、阿普洛尔、阿罗洛尔、阿替洛尔、 倍他洛尔、贝凡洛尔、比索洛尔、波吲洛尔、布尼洛尔、布拉洛尔、丁非 洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔(Cartezolol)、卡维地洛、塞利洛尔、塞他洛 尔、依泮洛尔、茚诺洛尔、甲吲洛尔、美替洛尔、美托洛尔、莫普洛尔、 纳多洛尔、尼普地洛、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、他林 洛尔、Tetraolol、噻吗洛尔和托利洛尔；
苯噻二嗪衍生物，如阿尔噻嗪、苄氟噻嗪、苄噻嗪、苄氢氯噻嗪、布 噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮、环戊噻嗪、环噻嗪、二氮嗪、依匹噻嗪、乙噻嗪、 芬喹唑、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、甲氯噻嗪、美替克仑、美托拉宗、对氟噻 嗪、泊利噻嗪、四氯噻嗪和三氯噻嗪；
N-羧基烷基(肽/内酰胺)衍生物，如阿拉普利、卡托普利、西拉普利、 地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、赖诺普利、莫维普利、培 哚普利、喹那普利和雷米普利；
二氢吡啶衍生物，如氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝 苯地平、尼伐地平、尼索地平和尼群地平(Nitrendipirne)；
胍衍生物，如倍他尼定、异喹胍、胍那苄、胍那克林、胍那决尔、胍 那佐定、胍乙啶、胍法辛、胍氯酚、胍诺沙苄和胍生；
肼和酞嗪，如布屈嗪、卡屈嗪、双肼屈嗪、恩屈嗪、肼卡巴嗪、肼屈 嗪、苯异丙肼、匹尔屈嗪和托屈嗪；
咪唑衍生物，如可乐定、洛非西定、酚妥拉明、甲基磺酸酚妥拉明、 噻美尼定和托洛尼定；
季铵类化合物氮戊溴铵、氯化氯异吲哚铵、六甲铵、喷他双(硫酸甲酯) 铵(Pentacynium Bis(methyl sulfate)、五甲溴铵、酒石酸潘托铵、氯非那托 品(Phenactopinium Chloride)和Trimethidiunum methosulfate；
喹唑啉衍生物，如阿夫唑嗪、布那唑嗪、多沙唑嗪、哌唑嗪、特拉唑 嗪和曲马唑嗪；
利舍平衍生物，如比他舍平、地舍平、瑞西那明、利舍平和昔洛舍平；
氨苯磺胺衍生物，如安布赛特、氯帕胺、呋塞米、吲达帕胺、喹乙宗、 曲帕胺和希帕胺；和其它的、如阿义马林、γ-氨丁酸、丁苯碘胺、坎地沙 坦、氯噻酮、西氯他宁、环西多明、鞣酸绿藜安、依普罗沙坦、非诺多泮、 氟司喹南、吲哚拉明、厄贝沙坦、酮色林、氯沙坦、美布氨酯(Metbutamate)、 美卡拉明、甲基多巴、甲基4-吡啶基酮氨硫脲(Thiosemicarbarzone)、美 托拉宗、米诺地尔、莫唑胺、帕吉林、潘必啶、吡那地尔、哌罗克生、普 立哌隆、原黎芦碱、萝巴新、瑞西美托、利美尼定、沙拉新、硝普钠、替 尼酸、咪噻芬、酪氨酸酶、乌拉地尔和缬沙坦；
抗甲状腺机能亢进药物，如2-氨基-4-甲基噻唑、2-氨噻唑、卡比马唑、 3，5-二溴-L-酪氨酸、3，5-双碘酪氨酸、Hinderin、碘、碘硫尿嘧啶、甲巯咪 唑、甲硫氧嘧啶、丙硫氧嘧啶、高氯酸钠、硫苯唑林、硫巴比妥和2-硫脲 嘧啶；
抗低血压药，如甲硫酸氨甲氧苯嗪、增血压素、二甲福林、多巴胺、 双苯次甲丁胺、依替福林、吉培福林、间羟胺、米多君、去甲肾上腺素、 Pholedrinead和昔奈福林；
抗甲状腺机能亢进药物，如左甲状腺素钠、碘塞罗宁、甲状腺粉、甲 状腺浸膏、甲状腺素、替拉曲考和TSH；
抗炎(非甾体的)药物，包括：氨基芳基羧酸衍生物、如苯乙氨茴酸、 依托芬那酯、氟芬那酸、异尼辛、甲氯芬那酸、甲灭酸(Mefanamic Acid)、 尼氟酸、他尼氟酯、特罗芬那酯和托芬那酸；
芳基乙酸衍生物，如阿西美辛、阿氯芬酸、氨芬酸、丁苯羟酸、桂美 辛、氯吡酸、双氯酚酸钠、依托度酸、联苯乙酸、芬氯酸、苯克洛酸、芬 克洛酸、芬替酸、葡美辛、异丁芬酸、吲哚美新、三苯唑酸、伊索克酸、 氯那唑酸、甲嗪酸、奥沙美辛(Oxametacine)、丙谷美辛、舒林酸、噻拉 米特、托美丁和佐美酸；
芳基丁酸衍生物，如丁丙二苯肼、布替布芬、芬布芬和联苯丁酸；
芳基羧酸衍生物，如环氯茚酸、酮咯酸和替诺立定；
芳基丙酸衍生物，如阿明洛芬、苯噁洛芬、布氯酸、卡洛芬、非诺洛 芬、氟诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、异丁普生、吲哚洛芬、酮洛芬、洛索 洛芬、咪洛芬、萘普生、奥沙普秦、吡酮洛芬、吡洛芬、普拉洛芬、丙替 嗪酸、舒洛芬和噻洛芬酸；
吡唑，如二苯米唑和依匹唑；
吡唑酮，如阿扎丙宗、苄哌吡酮、非普拉宗、莫非布宗、吗拉宗、羟 布宗、保泰松、哌布宗、异丙安替比林、雷米那酮、琥布宗和 Thiazolinobutazone；
水杨酸衍生物，如醋氨沙洛、阿司匹林、贝诺酯、溴水杨醇、乙酰水 杨酸钙、二氟尼柳、依特柳酯、芬度柳、龙胆酸、水杨酸羟乙酯、水杨酸 咪唑、赖氨酸乙酰水杨酸、美沙拉秦、水杨吗啉、1-水杨酸萘酯(Narhthyl Salicylate)、奥沙拉秦、帕沙米特、乙酰水杨酸苯酯、水杨酸苯酯、醋水杨 胺、水杨胺O-乙酸、水杨酰硫酸酯、双水杨酯和柳氮磺吡啶；
噻嗪氨甲酰(Thiazinecarboxamide)，如屈噁昔康、伊索昔康、吡罗昔 康和替诺昔康；和其它的如ε-乙酰氨基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4- 羟丁酸、阿米西群、苄达酸、苄达明、布可隆、联苯吡胺、地他唑、依莫 法宗、愈创蓝油烃、萘丁美酮、尼美舒利、奥古蛋白、奥沙西罗、瑞尼托 林、哌立索唑、哌福肟、普罗喹宗、普罗沙唑和替尼达普；
抗疟药，如醋氨苯砜、酚喹、蒿甲醚(arteether)、蒿甲醚(artemether)、 青蒿素、青蒿琥酯、比比林、小檗碱、印度当药、氯胍、氯喹、氯丙胍、 金鸡纳霜、金鸡纳定、金鸡纳宁、恩波环氯胍、龙胆苦甙、卤泛群、羟氯 喹、盐酸甲氟喹、3-甲醋氨苯胂、帕马喹、甲氧胺喹、伯氨喹、乙胺嘧啶、 米帕林、奎宁、重硫酸奎宁、碳酸奎宁、二氢溴酸奎宁、二盐酸奎宁、碳 酸乙酯奎宁、甲酸奎宁、葡萄糖酸奎宁、氢碘酸奎宁、盐酸奎宁、水杨酸 奎宁、硫酸奎宁、鞣酸奎宁、盐酸奎宁脲、喹西特、氮萘和辉绿质砷酸钠；
抗偏头痛药，如阿吡必利、二氢麦角胺、依来曲普坦、麦角柯碱、麦 角异柯宁碱、麦角克列满汀碱、麦角、麦角胺、醋酸氟美烯酮、二甲替嗪、 麦角乙脲、美西麦角、那拉曲坦、奥昔托隆、苯噻啶、利扎曲普坦和舒马 普坦；
止恶心药，如乙酰亮氨酸单乙醇胺、阿立必利、苯喹胺、氨醇醋茶碱、 溴必利、布克力嗪、氯丙嗪、氯波必利、赛克力嗪、茶苯海明、地芬尼多 (Dipheniodol)、多潘立酮、格拉司琼、美克洛嗪、Methalltal、甲氧氯普 胺、美托哌丙嗪、大麻隆、昂丹司琼(Ondansteron)、奥昔喷地、匹哌马 嗪、哌海茶碱、丙氯拉嗪、东莨菪碱、四氢大麻酚、硫乙拉嗪、硫丙拉嗪 (Thioproperzaine)和曲美苄胺；
抗肿瘤药，包括：烷化试剂、如烷基磺酸酯、如白消安、英丙舒凡和 哌泊舒凡；
叠氮，如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派；
乙亚胺和甲基蜜胺，如六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、噻替派 和三羟甲基三聚氰胺(Trimethylolomelamine)；
氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷氮芥(Chclophosphamide)、雌莫 司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、 泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；
亚硝脲，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和 雷莫司汀；和其它的如喜树碱、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二 溴卫矛醇和哌泊溴烷；
抗生素，如阿克拉霉素、放线菌素F1、氨茴霉素、偶氮丝氨酸、争光 霉素、放线菌素C、卡柔比星、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉 素、6-重氮基-5-氧基-L-原亮氨酸、多柔比星、表柔比星、丝裂霉素类、麦 考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、普卡霉素、泊非霉素、嘌罗 霉素、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；
抗代谢药物，包括：叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤和 三甲曲沙；
嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟苷；和嘧啶类 似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、去氧氟尿 苷、依诺他滨、氟脲嘧啶脱氧核苷、氟尿嘧啶(Fluroouracil)和替加氟；
酶，如门冬酰胺酶；和其它的如醋葡醛内酯、安吖啶、Bestrabucil、 比生群、苔藓抑素、卡铂、顺铂、地磷酰胺、秋水仙胺、地吖醌、Elfornithine、 依利醋铵、依托格鲁、依托泊苷、硝酸镓、羟基脲、干扰素-α、干扰素-β、 干扰素-γ、白介素-2、香菇多糖、来曲唑、氯尼达明、米托胍腙、米托蒽 醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、鬼臼酸 (Podophyllinicc Acid)、2-Ethythydrazide、聚硝基立方烷、丙卡巴肼、PSK7、 雷佐生、西佐喃、锗螺胺、紫杉酚、替尼泊苷、细格孢氮杂酸、三亚胺醌、 2，2′，2″-三氯三乙胺、乌拉坦、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨；
抗瘤剂(激素的)，包括：雄激素，如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫 雄醇、美雄烷和睾内酪；
抗肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦和曲洛司坦；
抗雄激素物质，如氟他胺和尼鲁米特；和抗雌激素药，如他莫昔芬和 托瑞米芬；
抗肿瘤药助剂，包括叶酸补充液，如亚叶酸(Frolinic Acid)；
抗震颤麻痹药，如金刚烷胺、苄丝肼、氨醇醋茶碱、比哌立登、溴隐 亭、布地品、卡麦角林、卡比多巴、司来吉兰(a/k/a L-塞利吉林、L-deprenil、 L-司来吉兰和司来吉兰)、右苄替米特、二乙嗪、苯海拉明、屈昔多巴、普 罗吩胺、乙苄海明、左旋多巴、那高利特、培高利特、吡咯庚汀、普拉克 索、普立地诺、普罗地平、喹吡罗、瑞马西胺、罗匹尼罗、特麦角脲、惕 各假托品和盐酸苯海索；
抗嗜铬细胞瘤药物，如甲酪氨酸、酚苄明和酚妥拉明；
抗肺囊虫药物，如依洛尼塞(Effornithine)、喷他脒和磺胺甲噁唑；
抗前列腺肥大药物，如己酸孕诺酮、美帕曲星、奥生多龙和保列治7；
抗原虫药物(Leshmania)，如葡萄糖酸锑钠、乙睇胺、羟芪巴脒、醋 碘苯酸、N-泛影葡胺、喷他脒、二脒草替和脲锑胺；
抗原生动物药(毛滴虫属)，如乙酰胂胺、醋胺硝唑、茴香霉素、阿扎 硝唑、福米硝唑、呋喃唑酮、曲古霉素、月桂胍、美帕曲星、双唑泰栓、 硝呋太尔、硝呋醛肟、尼莫唑、塞克硝唑、苦味酸银、替诺尼唑和替硝唑；
抗原生动物药(锥虫)，如苄硝唑、依氟鸟氨酸、美拉胂醇、硝呋替莫、 氧芬胂、盐酸化物、喷他脒、普罗帕脒、嘌罗霉素、喹匹拉明、二脒草替、 舒拉明钠、锥虫红和锥虫胂胺；
抗紫癜药物，如樟脑、赛庚啶、二氯松、甘氨酸、卤米松、3-羟基樟 脑、薄荷脑、二甲基硫蒽、甲地嗪、苯酚、聚乙二醇单十二醚、利索卡因、 樟脑醑、噻苯哌胺、托普帕敏和阿利马嗪；
抗银屑病药物，如阿维A、水杨酸铵、地蒽酚、6-氮尿苷、佛手柑脑、 柯桠素、阿维A酯和焦棓酚；
抗精神病药物，包括：丁酰苯、如苯哌利多、溴哌利多、氟哌利多、 氟阿尼酮、氟哌啶醇、美哌隆、莫哌隆、匹泮哌隆、Sniperone、替米哌隆 和三氟哌多；
酚噻嗪系，如醋奋乃静、布他哌嗪、丙酰奋乃静、氯丙沙嗪、氯丙嗪、 氯螺旋嗪、氰美马嗪、地西拉嗪、氟奋乃静、咪克洛嗪、甲哌啶嗪、美索 达嗪、甲氧丙嗪、美托奋乃酯、奥沙氟嗪、培拉嗪、哌氰嗪、哌美他嗪、 奋乃静、哌西他嗪、哌泊噻嗪、丙氯拉嗪、丙嗪、磺达嗪、醋酸奋乃静、 硫利达嗪、三氟拉嗪和三氟丙嗪；
噻吨，如氯普噻吨、氯哌噻吨、氟哌噻吨和替沃噻吨；
其它三环类药物、如苯喹胺、卡匹帕明、氯卡帕明、氯胺丙压吖、氯 噻平、氯氮平、奥匹哌醇、丙硫喷地、丁苯那嗪和佐替平；  和
其它的，如阿立必利、氨磺必利、布拉氨酯、氟司必林、吗茚酮、五 氟利多、匹莫齐特、螺立林和舒必利；
解热药物，如扑热息痛、醋氨沙洛、乙酰苯胺、乌头原碱、乌头、 乌头碱、阿氯芬酸、双(乙酰水杨酸)铝、氨氯苯嗪、氨基比林、阿司匹 林、贝诺酯、苄达明、小檗碱、对溴乙酰苯胺、丁苯羟酸、丁丙二苯肼、 乙酰水杨酸钙、氯乙苯噁嗪酮、水杨酸胆碱、环氯茚酸、二羟基乙酰水杨 酸铝、地匹乙酯、安乃近、依匹唑、依特柳酯、水杨酸咪唑、吲哚美辛、 三苯唑酸、对乳酰乙氧苯胺、赖氨酸乙酰水杨酸、乙酰水杨酸镁、甲氯芬 那酸、吗拉宗、水杨吗啉、萘普生、尼芬那宗、51-硝基-2′-丙氧基乙酰苯 胺(propoxyacetanilide)、非那西丁、苯胺脲、非诺可、非诺吡酮、乙酰 水杨酸苯酯、水杨酸苯酯、哌布宗、丙帕他莫、异丙安替比林、雷米那酮、 醋水杨胺、柳胺乙酸、水杨酸钠、磺甲比林、粉防己碱和替诺立定；
抗立克次体药，如对氨苯甲酸、氯霉素、无味氯霉素、氯霉素泛酸酯 和四环素；
抗皮脂溢剂，如二氯羟喹、3-O-二乙酸月桂酰基吡哆醇、吡罗克酮、 巯氧吡啶、间苯二酚、硫化硒和噻克索酮；
防腐剂，包括：胍、如阿来西定、安巴腙、氯己定和哌氯定；
卤素和卤素化合物，如碘氧化铋、碘式没食子酸碘铋、三溴酚铋、冰 片基氯、碘酸钙、含氯石灰、氯氟苯脲、Flurosalan、碘酸、碘、一氯化碘、 三氯化碘、碘仿、四碘乌洛托品、奥昔氯生、聚维酮碘、次氯酸钠、碘酸 钠、氯氧三嗪、麝酚碘、三氯卡班、三氯生和曲氯新钾；
汞化合物，如水泻剂、汞林钠、汞溴红、氯化汞、氯化汞(加氨的)、 对苯酚磺酸钠汞、丁二酰亚胺汞、硫化汞、巴拿马红、羟汞硝酚钠、醋酸 亚汞、氯化亚汞、碘化亚汞、硝甲酚汞、四碘汞(II)钾、三碘汞钾液、硫 汞苯磺钠和硫柳汞；
硝基呋喃类药，如呋喃唑酮、2-(甲氧甲基)-5-硝基呋喃、尼屈昔腙、 硝呋醛肟、硝呋肼和硝基哌唑嗪；
酚类，如醋辛酚汞、硫氯酚、水杨酸镉、香芹酚、氯二甲酚、氯苄酚、 杂酚油(cresote)、甲酚、对甲酚、芬替克洛、六氯酚、1-萘基水杨酸盐、 2-萘基水杨酸、2，4，6-三溴-间甲酚和3′，4′，5′-三氯柳苯胺；
喹啉，如氨喹脲、苯甲酰喹、溴羟喹啉、二氯羟喹、氯喹那多、氯羟 喹、乙氢去甲奎宁、尤普罗辛、哈喹诺、白毛莨碱、8-羟基喹啉、8-羟基 喹啉硫酸酯和碘氯代羟基喹啉；和其它的，如醋酸铝溶液、次醋酸铝溶液、 硫酸铝、3-氨基-4-羟丁酸、硼酸、氯己定、氯阿唑丁、间醋酸甲酚酯、硫 酸铜、双溴丙脒、鱼石脂、间甲酚磺酸-甲醛缩聚物7、诺昔硫脲、奥硝唑、 β-丙内酯、α-萜品醇；
镇痉剂，如阿利苯多、氨布醋胺、氨丙嗪、阿朴阿托品、甲硫贝弗宁、 比坦维林、布他维林、布托溴铵、N-丁基莨菪溴化铵、卡罗维林、西托溴 铵、桂美君、氯波必利、毒芹碱氢溴化物、毒芹碱盐酸化物、碘化环宁、 双苯美林、地索普明、吗苯丁酯、地泊溴铵、六氢芬宁、依美溴铵、依沙 维林、非克立明、非那拉胺、非诺维林、芬哌丙烷、苯维溴铵、芬托溴铵、 黄酮哌酯、夫洛丙酮、葡糖酸、愈创他明、美拉肼、羟甲香豆素、利奥吡 咯、美贝维林、莫沙维林、萘维林、辛戊胺、奥他维林、戊哌立特、Phenamacide hydrochloride、间苯三酚、匹维溴铵、哌苯乙醇、盐酸哌泊索仑、普拉维 林、吡芬溴铵、丙哌利定、普鲁匹凡(Propivane)、丙吡咯吗嗪、普罗扎 平、消旋非明、罗西维林、解痉醚、芪碘锭、舒托泊铵、替莫碘胺、替喹 溴胺、苯酰胺桂胺、曲匹布通、3-甲色酮、车轴草属、曲美布汀、N，N-三 甲基-3，3-二苯-丙胺、齐酸甲氧托品、曲司氯铵和珍托溴铵；
抗血栓药，如阿那格雷、阿加曲班、西洛他唑、大黄酚苷、达曲班、 去纤苷、伊诺肝素、速碧林7、吲哚布芬、Lamoparan、奥扎格雷、吡考他 胺、普拉贝脲、瑞维肝素、替德肝素、噻氯匹定、三氟柳和华法林；
镇咳药，如阿洛拉胺、阿米西酮、苯丙哌林、苯佐那酯、比苯溴铵、 三溴甲烷、布他米酯、苯丁胺乙酯、乙二磺酸咳美芬、咳必清、止咳能、 氯丁替诺、氯哌斯汀、可待因、溴甲可待因、氧化可待因、磷酸可待因、 硫酸可待因、环沙酮、右美沙芬、双丁萘磺钠、双氢可待因、醋氢可待酮、 二甲啡烷、地美索酯、α，α-二苯-2-哌啶丙醇、羟丙哌嗪、羟蒂巴酚、依普 拉酮、地布酸乙酯、乙基吗啡、福米诺苯、Guiaiapate、氢可酮、异米尼尔、 左丙氧芬、吗氯酮、那碎因、去甲美沙酮、那可丁、奥昔拉定、奥索拉明、 福尔可定、匹考哌林、哔哌氮嗪酯、乙哌双酮、盐酸普诺地嗪、消旋甲啡 烷、盐酸他齐普酮、替培啶和齐培丙醇；
抗溃疡药，如乙酰谷酰胺铝络合物、ε-乙醚氨基己酸锌盐、Acetoxolone、 阿巴前列素、盐酸苄萘酸酯、次柠檬酸铋溶胶(干燥的)、甘珀酸、西曲酸 酯、西咪替丁、恩前列素、艾沙拉唑、法莫替丁、二甲酞酸、吉法酯、愈 创蓝油烃、伊索拉定、米索前列醇、尼扎替丁、奥美拉唑、奥诺前列素、 γ-谷维素、哌法宁、哌仑西平、普劳诺托、雷尼替丁、利奥前列素、罗沙 前列醇、罗曲酸、乙酸罗沙替丁、索法酮、螺佐呋酮、硫糖铝、替普瑞酮、 曲莫前列素、Thrithiozine、曲昔派特和佐利米定；
抗尿结石药，如醋羟胺酸、别嘌醇、枸橼酸钾和琥珀酰亚胺；
抗蛇毒素，如更生霉素7抗蛇毒素；
抗病毒药物，包括：嘌呤和嘧啶、如无环鸟苷、阿糖胞苷、双脱氧腺 苷、双脱氧胞苷、双去氧肌苷、依度尿苷、氟脲嘧啶脱氧核苷、更昔洛韦、 碘苷、异丙肌苷、MADU、喷昔洛韦、曲氟尿苷、阿糖腺苷(Vidrarbine) 和齐多夫定；和其它的，如乙酰亮氨酸单乙醇胺、金刚烷胺、粘病毒霉素、 己可可碱-烟酸复合剂、枯茗醛、结核安、磷卡萘钠、咪喹莫特、干扰素-α、 干扰素-β、干扰素-γ、乙氧丁酮醛、溶菌酶、甲吲噻踪、吗啉胍、鬼臼毒 素、利巴韦林、金刚乙胺、司他霉素、匍枝青霉菌素、曲金刚胺和珍那佐 酸；
抗焦虑药，包括：芳基哌嗪类化合物、如丁螺环酮、吉哌隆、伊沙匹 隆和坦度螺酮(Tondospirone)；
地西泮衍生物，如阿普唑仑、溴西泮、卡马西泮、氯氮卓、氯巴占、 氯卓酸钾、氯噻西泮(Chotiazepam)、氯噁唑仑、地西泮、氯氟卓乙酯、依 替唑仑、氟地西泮(Fluidazepam)、氟他唑仑、氟托西泮、哈拉西泮、凯他 唑仑、劳拉西泮、洛沙平、美达西泮、美他西泮、美沙唑仑、去甲西泮、 奥沙西泮、奥沙唑仑、匹那西泮、普拉西泮和托非索泮；
氨基甲酸酯，如环拉氨酯、依米氨酯、奥芬氨酯、甲丙氨酯、苯丙氨 和泰巴氨酯；和其它的如阿吡坦、苯佐他明、卡普托胺、氯美扎酮、依替 福辛、氟辛克生、氟苯乙砜、谷氨酸、羟嗪、来索吡琼、甲氯醛脲、美芬 诺酮、米氮平(Mirtazepine)、奥沙那胺、非那二醇、舒立克隆和扎托司琼；
地西泮拮抗药，如氟马西尼；
支气管扩张剂，包括：麻黄碱衍生物，如沙丁胺醇、班布特罗、比托 特罗、卡布特罗、克仑特罗、氯丙那林、双羟乙麻黄碱、麻黄碱、肾上腺 素(Epiniphrine)、依普罗醇、乙非君、乙基去甲肾上腺素、非诺特罗、海 索那林、乙基异丙肾上腺素、异丙肾上腺素、马布特罗、奥西那林、N-甲 麻黄碱、吡布特罗、丙卡特罗、普罗托醇、瑞普特罗、利米特罗、沙美特 罗、索特瑞醇、特布他林和妥洛特罗；
季铵化合物，如甲硫贝弗宁、Clutropium Bromide、异丙托溴铵和氧托 溴铵；
黄嘌呤衍生物，如，茶碱(acefylline)、哌醋茶碱、安布茶碱、氨茶碱、 巴米茶碱、胆茶碱、多索茶碱、二羟丙茶碱、恩丙茶碱、二乙氨乙茶碱、 乙羟茶碱、愈创茶碱、羟丙茶碱、可可碱、1-可可碱乙酸和胆茶碱 (theophylline)；和其它的如芬司匹利、美地巴嗪、孟鲁司特、 Methoxyphenanime、曲托喹酚和扎鲁司特；
钙通道阻断剂，如：芳基烷基胺、如苄普地尔、地尔硫卓、芬地林、 戈洛帕米(Gallopanil)、普尼拉明、特罗地林和维拉帕米；
二氢吡啶衍生物，如非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼 伐地平、尼莫地平、尼索地平和尼群地平；
哌嗪衍生物，如桂利嗪、氟桂利嗪和利多氟嗪；和其它的，如苄环烷、 依他苯酮和哌克昔林；
钙调节剂，如骨化二醇、降钙素、骨化三醇、氯甲双磷酸、双氢速甾 醇、依降钙素、依替膦酸、依普黄酮、帕米膦酸、甲状旁腺素和醋酸特立 帕肽；
强心剂，如Acefylline、乙酰洋地黄毒苷、2-氨基-4-甲基吡啶、氨力农、 苯呋地尔琥珀酸酯、布拉地新(Buclasdesine)、黄花夹竹桃次甙B、樟吡他 胺、铃兰毒苷、漆麻灵、地诺帕明、去乙酰毛花苷、ditalin、洋地黄、洋 地黄毒苷、地高辛、多巴酚丁胺、多巴胺、多培沙明、依诺昔酮、红皮素、 非那可明、吉他林、羟基洋地黄毒甙、胍基乙酸、辛胺醇、北美黄莲次碱、 异波帕胺、Lanotodises、甲氧酚酰胺、米力农、黄夹次甙B、夹竹桃、毒 毛花苷G、奥昔非君、普瑞特罗、海葱次苷、蟾力苏、海葱苷、海葱任宁、 毒毛花苷K、硫马唑、可可碱和扎莫特罗；
螯合剂，如去铁胺(Deferozmine)、二硫卡钠、依地酸钙二钠、依地酸 二钠、依地酸四钠(Edeate Sodium)、依地酸三钠、青霉胺、喷替酸钙钠、 酒石酸对羟福林、二巯丁二酸和曲恩汀；
促胰酶素拮抗剂，如丙谷胺；
胆石溶解剂，如鹅脱氧胆酸、甲基叔丁基醚、单辛精和熊去氧胆酸；
利胆药，如阿利苯多、胆维他、阿嗪米特、胆酸、环丁烯酸、利胆丁 酸、环丁酸醇、环香草酮、西那林、去氢胆酸、去氧胆酸、地美罗酸、α- 利胆醇、依昔罗酸、非布丙醇(Feguprol)、芬西布醇、非尼戊醇、夫洛梯 隆、羟甲香豆素、孟布酮、3-(邻甲氧苯)-2-苯丙烯酸、美托查酮、吗喹酮、 柳胺酚、牛胆汁浸膏、4.4′-氧二-2-丁醇、哌普唑林、普罗扎平、4-水杨酰 吗啉、辛卡利特、牛胆酸、噻莫西酸、托莰非、舒胆通和香草吗啉；
胆碱能药，如醋克利定、溴化乙酰胆碱、氯化乙酰胆碱、萘二磺乙 乳胆铵、苄吡溴铵、氯化氨甲酰甲胆碱、卡巴胆碱、卡普氯铵、地美溴铵、 右泛醇、二异丙基对硝苯磷酯、碘化二乙氧膦酰硫胆碱、氯化腾喜龙、依 舍立定、糠三甲铵、异氟磷、氯醋甲胆碱、毒蕈碱、新斯的明、奥普碘铵、 毒扁豆碱和溴吡斯的明；
乙酰胆碱酯酶抑制剂，如安贝氯铵、溴地斯的明和加兰他敏；
乙酰胆碱酯酶再活化剂，如氯化双复磷(Obidoximine Chloride)和氯 解磷定；
中枢神经系统兴奋药和试剂，如阿米庚酸、苯丙氨乙茶碱、苯丙胺苄 氰、贝美格、苄非他明、马钱子碱、咖啡因、对氯苯丁胺、氯苯环胺、氯 特胺、古柯、磷酸二甲氨乙酯、右奥沙屈、硫酸右旋苯异丙胺、安非拉酮、 N-乙基安非他命、香草二乙胺、双苯次甲丁胺、乙色胺、芬坎法明、芬乙 茶碱、非诺唑酮(Fenosolone)、三氟乙醚、加兰他敏、己环酸钠、后莫肯 芬、马吲哚、Megexamide、去氧麻黄碱、哌甲酯、尼可刹米、匹莫林、戊 四氮、苯甲曲秦(Phenidimetrazine)、芬麦特拉辛、芬特明、印防己毒素、 哌苯甲醇、普罗林坦和吡咯戊酮；
解充血药，如Amidephrine、咖啡氨醇、环喷他明、麻黄碱、肾上腺 素、非诺唑啉、茚唑啉、美替唑啉、萘甲唑林、盐酸异肾上腺素、奥托君、 羟甲唑啉、盐酸苯肾上腺素、盐酸苯丙醇胺、苯丙甲胺、丙己君、伪麻黄 碱、眼圣眼药水、泰马唑啉和赛洛唑啉；
牙科试剂，包括：二膦酸盐(抗牙周病和骨吸收)、如阿仑磷酸盐、氯 膦酸盐、1-羟基-亚乙基-1，1-二膦酸、氨羟二磷酸二钠和替鲁膦酸；运送预 防性的，如精氨酸和氟化钠；
脱敏试剂，如硝酸钾和枸橼酸盐、草酸盐；
脱色剂(Depigmentors)，如二氢奎宁、氢醌和莫诺苯宗；
利尿药，包括：有机汞的，如氯汞君、美拉鲁利、汞罗茶碱、硫汞林 钠、汞香豆酸、汞香豆林钠、氯化亚汞和汞撒利；
蝶啶，如呋氨蝶啶和氨苯蝶啶；
嘌呤，如Acefylline、7-吗啉甲茶碱、帕马溴、丙可可碱和可可碱；
类固醇，如坎利酮、夹竹桃苷和螺内酯；
氨苯磺胺衍生物，如Acetazolmide、安布赛特、阿佐塞米、布美他尼、 布他唑胺、氯米非那胺、氯非那胺、氯帕胺、氯索隆、二苯基甲烷-4.4′-二 氨苯磺胺、二磺法胺、依索唑胺(Ethbxzolamide)、呋塞米、吲达帕胺、 美夫西特、醋甲唑胺、吡咯他尼、喹乙宗、托拉塞米、曲帕胺和希帕胺；
尿嘧啶，如氨美啶和阿米美；
其它的如，阿马诺嗪、阿米洛利、熊果酚甙、氯拉扎尼、依他尼酸、 依托唑啉、肼卡巴嗪、异山梨醇、甘露醇、美托查酮、莫唑胺、哌克昔林、 替尼酸和尿素；
多巴胺受体激动药，如溴隐亭、多培沙明、非诺多泮、异波帕胺、麦 角乙脲、那高利特和培高利特；
杀体外寄生虫药，如阿米曲士、苯甲酸苄酯、甲萘威、克罗米通、DDT、 二黄原酸、异龙脑酯硫氰乙酸酯-技术级的(technical)、含硫石灰溶液、林 旦、马拉硫磷、油酸汞、二甲基硫蒽和硫黄-制药级的(pharmaceutical)；
酶，包括：消化酶，如α-淀粉酶(猪胰脏)、酯酶、胰脂肪酶、胃蛋白 酶和凝乳酶；
粘液溶解酶，如溶菌酶；
青霉素失活酶，如青霉素酶；和蛋白水解酶，如胶原酶、糜木瓜酶、 糜蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶；
酶诱导剂(肝脏的)，如氟双苯醇；
雌激素，包括：非类固醇类的雌激素类、如苯雌酚、溴底乙苯、氯烯 雌醚、己二烯雌酚、己烯雌酚、二丙酸己烯雌酚、甲己烯雌酚、磷雌酚、 己烷雌酚、美沙雌酸和美雌酚；和甾体雌激素类，如双醋羟雌酮、共轭的 雌激素、去氢马烯雌酮、马烯雌甾酮、雌二醇、苯甲雌二醇、雌二醇17β- 环戊丙酸酯、雌三醇、雌酮、乙炔雌二醇、美雌醇、莫克雌醇、双甲雌三 醇、雌三醇环戊醚和炔雌醚；
胃分泌抑制剂，如肠抑胃素和奥曲肽；
糖皮质激素，如21-乙酸孕烯醇酮、阿氯米松(Aalclometasone)、阿 尔孕酮、安西奈德(Amicinonide)、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯 泼尼松、氯倍他索、Blovetasone、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质甾酮、可的 松、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羟米松、地塞米松、二氟拉松、二 氟可龙、二氟泼尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟二氯松、二氟美松 (Flumehtasone)、氟尼缩松、氟轻松丙酮、醋酸氟轻松、氟考丁酯、氟可 龙、氟米龙、醋酸甲氟龙、醋酸氟甲叉龙、氟泼尼龙、氟羟可舒松、福莫 可他、哈西奈德、卤米松、醋酸卤泼尼松、氢可他酯、氢化可的松、醋酸 氢化可的松、磷酸氢化可的松(ydrocortisone Phosphate)、氢化可的松21- 琥珀酸钠、叔丁醋酸氢化可的松、马泼尼酮、甲羟松、甲泼尼松、甲基去 氢氢化可的松、莫米松糠酸酯、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、泼尼松 龙21-二乙氨基乙酯、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松龙琥珀酸钠、泼尼松龙21- 间磺苯甲酸钠、泼尼松龙21-硬脂酰乙醇酸酯、泼尼松龙叔丁乙酯、泼尼 松龙21-三乙酸甲酯、泼尼松、强的松龙戊酸酯、泼尼立定、泼尼立定21- 二乙氨基乙酸酯、替可的松、曲安西龙、羟氢化泼尼松缩丙酮、苯曲安奈 德和丙酮缩去炎松己酸酯；
性腺刺激素，如布舍瑞林、氯米芬、环芬尼、表美雌醇、FSH、HCG 和LH-RH；
促性腺激素，如LH和PMSG；
生长激素抑制剂，如奥曲肽和生长抑素；
生长激素释放因子，如Semorelin；
生长刺激剂，如生长激素；
溶血剂，如苯肼和盐酸苯肼；
肝素拮抗剂，如海美溴铵和鱼精蛋白；
肝保护剂，如S-腺苷甲硫氨酸、甜菜碱、西阿尼醇、Citolone、马洛 替酯、奥拉米特、磷酰胆碱、原卟啉IX、水飞蓟素-组(group)、二硫辛酸 和硫普罗宁；
免疫调节剂，如氨普立糖、布西拉明、二硫卡钠、异丙肌苷、干扰素 -y、白介素-2、香菇多糖、目罗他新、普拉通宁(Platonin)、丙考达唑、 四米唑、胸腺生成素、胸腺喷丁和乌苯美司；
免疫抑制剂，如硫唑嘌呤、环孢菌素和咪唑立宾；
离子交换树脂，如天青A羧丙烯酸树脂(Carbacrylic Resins)、考来烯 胺树脂、考来替泊、降胆葡胺、雷索德克(Resodec)和聚苯乙烯磺酸钠；
泌乳刺激素，如催乳素；
LH-RH激动剂，如布舍瑞林、戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、那法瑞林和 曲普瑞林；
抗脂肪药，如N-乙酰蛋氨酸、氯化胆碱、去氢胆酸胆碱、枸橼酸二氢 胆碱、肌醇、卵磷脂和蛋氨酸；
红斑狼疮抑制剂，如氨三乙酸铋钠、碱式水杨酸铋、氯喹和羟氯喹；
盐皮质素类，如醛甾酮、去氧皮质酮、醋酸脱氧皮质酮和氟氢可的松；
缩瞳药，如卡巴胆碱、毒扁豆碱、毛果芸香碱和毛果芸香属；
单胺氧化酶抑制剂，如司来吉兰、异丙氯肼、异丙烟肼、异卡波肼、 吗氯贝胺、2-肼辛烷、帕吉林、苯乙肼、苯氧异丙肼、特戊酰苯肼、普罗 地平、托洛沙酮和反苯环丙胺；
粘液溶解剂，如乙酰半胱氨酸、溴己新、羧甲司坦、多米奥醇、来托 司坦、溶菌酶、盐酸美司坦、美司钠、索布瑞醇、司替罗宁、硫普罗宁和 泰洛沙泊；
肌松药(骨骼肌的)，如氟喹酮、双烯丙毒马钱碱、苯磺阿曲库铵、巴 氯芬、苯佐他明、氯化苄醌铵、C-葫芦箭毒碱、卡立普多、氯美扎酮、氯 苯甘油氨酯、氯丙沙嗪、Chlozoxazone、箭毒、环拉氨酯、环苯扎林、丹 曲林、十烃溴铵、地西泮、乙哌立松、法扎溴铵、氟美吗酮、戈拉碘铵、 溴化氨酰胆碱、己芴溴铵、羟乙桂胺、Lauexium Methyl Sulfate、来普达林、 美金刚、美芬新、美芬诺酮、美他沙酮、美索巴莫、粉肌松、尼美西泮、 奥芬那君、潘库溴铵、苯丙氨酯、非尼拉朵、哌库溴铵、普罗索仑、硫酸 奎宁、司替氨酯、溴化琥珀胆碱、氯琥珀胆碱、碘化琥珀胆碱、溴琥乙氧 铵、四氢西泮、硫秋水仙苷、替扎尼定、托哌酮、氯筒箭毒碱、维库溴铵 和氯苯唑胺(Zoxolamine)；
麻醉药拮抗药，如阿米苯唑、环佐辛、左洛啡烷、辅酶I、纳美芬 (Nalmfene)、烯丙吗啡、烯丙吗啡二烟酸酯、纳洛酮和纳曲酮；
神经保护作用试剂，如地佐环平；
益智药，如乙酰谷酰胺、乙酰肉毒碱、茴拉西坦、二苯美仑、依昔苯 酮、非哌西特、艾地苯醌、盐酸茚洛秦(Indeloxazune Hydrochloride)、尼 唑苯酮、奥拉西坦、吡拉西坦、丙戊茶碱、吡硫醇和他克林；
眼科药物，如15-酮前列腺素；
卵巢激素，如松弛素；
子宫收缩药，如卡前列素、卡古缩宫素、去氨催产素、麦角新碱、吉 美前列素、甲基麦角新碱、缩宫素、垂体后叶素(后的)、前列腺素E2、前 列腺素F2a和司巴丁；
胃蛋白酶抑制剂、如淀粉硫酸钠；
蠕动兴奋药，如西沙必利；
孕激素类，如烯丙雌醇、阿那孕酮、醋酸氯地孕酮、去氢氯地孕酮、 地美孕酮、去氧孕烯、地美炔酮、地屈孕酮、炔孕酮、炔诺醇、醋酸氟羟 孕酮、孕二烯酮、己酸孕诺酮、卤孕酮、17-羟基-16-亚甲基-妊娠素、17α- 羟孕酮、17α-羟基孕二烯酮己酸酯、利奈孕酮、美屈孕酮、甲羟孕酮、醋 酸甲地孕酮、美仑孕酮、炔诺酮、异炔诺酮、诺孕酮、诺孕酯、炔诺孕酮、 诺孕烯酮、诺乙烯酮、喷他孕酮、黄体酮、普美孕酮、奎孕酮和群孕酮；
催乳素抑制剂、如甲麦角林；
前列腺素和前列腺素类似物，如阿巴前列素、卡前列素、恩前列素、 吉美前列素(Bemeprost)、利马前列素、米索前列醇、奥诺前列素、依前 列醇、前列腺素E1、前列酮素E2、前列腺素F2a、利奥前列素、罗沙前列 醇、硫前列酮和曲莫前列素；
蛋白酶抑制剂，如抑肽酶、卡莫司他、加贝酯和萘莫司他；
呼吸兴奋药、如阿米三嗪、贝美格、二氧化碳、克罗丙胺、克罗乙胺、 二甲弗林、地莫拉明、多沙普仑、香草二乙胺、福米诺苯、洛贝林、甲哌 呫诺、甲氧酚酰胺、尼可刹米、印防己毒素、哌美克隆、吡哆茶碱、丁二 酸钠和他克林；
致硬化试剂，如乙醇胺、乙胺、2-己基癸酸、聚乙二醇单十二醚、重 硫酸奎宁、盐酸奎宁脲、蓖麻油酸钠、十四烷基硫酸钠和三苄糖苷；
镇静药和安眠药，包括：非环状的酰脲、如乙酰阿达林、丙戊酰脲、 溴米那(Bomisovalum)、卡普脲、卡溴脲和依克替脲；
醇，如氯醛己醇、乙氯维诺、甲戊炔醇、4-甲基-5-噻唑乙醇、叔-戊醇 和2，2，2-三氯乙醇；
酰胺，如布酰胺、二乙溴乙酰胺、异溴米特、异戊酰二乙胺、尼普拉 嗪、三甲氧苯醋酰胺、曲美托嗪、唑吡坦和佐匹克隆；
巴比妥酸衍生物，如阿洛巴比妥、异戊巴比妥、阿普比妥、巴比妥、 溴烯比妥、5，5-乙基仲丁巴比妥钠、布他比妥、丁溴比妥、正丁巴比妥、 卡布比妥、环己巴比妥、环戊巴比妥、烯丙异丙甲巴比妥、5-乙基-5-(1- 哌啶基)巴比妥酸、5-糠基-5-异丙基巴比妥酸、环庚比妥、己巴比妥钠、海 索比妥、甲苯比妥、美西妥拉、那可比妥、尼阿比妥、戊巴比妥钠、苯烯 比妥、苯巴比妥、苯巴比妥钠、苯甲比妥酸、丙巴比妥、丙溴比妥、丙羟 巴比、双环辛巴比妥、司可巴比妥钠、他布比妥、替曲比妥、另戊稀巴比 妥钠和乙烯比妥；
地西泮衍生物，如溴替唑仑、度氟西泮、艾司唑仑、氟硝西泮、氟西 泮、卤沙唑仑、氯普唑仑、氯甲西泮、硝西泮、夸西泮、替马西泮和三唑 仑；
溴化物，如溴化铵、溴化钙、乳糖醛酸溴化钙、溴化锂、溴化镁、溴 化钾和溴化钠；
氨基甲酸酯，如戊基叔氨基甲酸酯、炔己蚁胺、Hexaprpymate、氨甲 酸甲戊炔酯、二乙烯丙醋胺和三氯氨基甲酸乙酯(Tricholorourethan)；
三氯乙醛衍生物、如卡波氯醛、氯醛甜菜碱、水合氯醛甲酰胺、水合 氯醛、氯醛比林、氯醛比林、培曲氯醛和三氯福司；
哌啶二酮，如格鲁米特、甲乙哌酮、乙哌双酮、吡乙二酮、他谷酰胺 和沙利度胺；
喹唑啉酮衍生物，如依他喹酮、甲氯喹酮和甲喹酮；和
其它的，如乙缩醛、苯乙酮、醛醇、缬草酸铵、安非尼酮、d-冰片基 α-溴代戊酸乙酯、d-异戊酸龙脑酯、三溴甲烷、2-乙基丁酸钙、Carfinate、 α-氯醛糖(Chlorolose)、氯美噻唑、鬼督邮、多西拉敏、依托羟嗪、依托 咪酯、酚二唑、高氟奋乃静、氢溴酸、甲氯沙明、薄荷基戊酸酯、阿片、 副醛、哌拉平、丙酰马嗪、利马扎封、羟丁酸钠、曲砜那和双乙磺丙烷；
溶血栓药，如APSAC、纤溶酶、原尿激酶、链激酶、组织纤维蛋白溶 酶原激活剂和链激酶；
促甲状腺激素，如TRH和TSH；
促尿酸排除剂，如苯溴马隆、二乙氨磺苯酸、乳清酸、羟辛可芬、丙 磺舒、磺吡酮、替尼酸和氯苯唑胺；
血管扩张剂(大脑的)，如苄环烷、桂利嗪、胞磷胆碱、环扁桃酯、环 烟酯、二氯乙酸二异丙胺、长春西汀(Eburnamorine)、非诺地尔、氟桂利 嗪、异丁司特、艾芬地尔、萘呋胺酯、烟卡酯、麦角溴烟酯、尼莫地平、 罂粟碱、喷替茶碱、替诺非君、长春胺、长春西丁和维喹地尔；
血管扩张剂(冠状的)，如胺氧三苯、地巴唑、苯呋地尔半琥珀酸酯、 苯碘达隆、Chloacizine、卡波罗孟、氯苯呋醇、氯硝甘油、地拉卓、双嘧 达莫、氢普拉明、乙氧黄酮、赤藻糖醇、丁四硝赤藻糖醇酯、依他苯酮、 芬地林、夫洛地尔、更利芬、己烷雌酚二(β-二乙氨乙基醚)、海索苯定、 硝乙醇胺对甲苯磺酸酯(itramin Tosylate)、凯林、利多氟嗪、甘露六硝酯、 美地巴嗪、尼可地尔、硝酸甘油、硝酸戊四醇酯、戊硝醇、哌克昔林、匹 美茶碱、普尼拉明、硝二羟甲丁醇、吡哆茶碱、曲匹地尔、3-甲色酮、曲 美他嗪、磷酸三硝乙醇胺和维司那定；
血管扩张剂(外周的)，如烟酰胺铝、巴美生、苄环烷、倍他司汀、缓 激汰、溴长春胺、Bufoniode、丁咯地尔、布他拉胺、西替地尔、环烟酯、 桂哌齐特、桂利嗪、环扁桃酯、二异丙胺二氯乙酸酯、依来多辛、Fenoxidil、 氟桂利嗪、癸烟酯(Heronicate)、艾芬地尔、烟酸肌醇酯、异克舒令、赖 氨酰舒缓激肽、血管舒缓素、莫西赛利、萘呋胺酯、烟卡酯、尼麦角林、 尼可呋糖、烟醇、布酚宁、喷替茶碱、己酮可可碱、吡贝地尔、前列腺素 E1、舒洛地尔和黄嘌呤脑脉康；
血管保护剂，如苯扎隆、生物类黄酮、色烯卡、红细胞糖苷脂 (Clobeoside)、地奥司明、氢醌磺酸钙、七叶树皂角素、Rolescutol、无色 矢车菊素、甲七叶茶碱、槲皮素、芦丁和曲克芦丁；
维生素、维生素来源和维生素提取物，如维生素A、B、C、D、E和 K和其衍生物、维生素d2、甘草属和甲钴胺；
创伤药，如乙酰半胱氨酸、尿囊素、积雪苷、卡地姆碘、甲壳质、聚 糖酐和奥沙西罗；
抗凝血剂，如肝素；
杂的(Miscellaneous)如红细胞生成素(补血的)、非格司亭、非那雄胺 (良性前列腺肥大)和干扰素β1-α(多发性硬化症)。
某些实施方式中，待传送的试剂为一种或多种蛋白质、激素、维生素 或矿物质。在一些实施方式中，待传送的试剂选自胰岛素、IGF-1、睾酮、 长春西丁、海沙瑞林、GHRP-6或钙。在某些实施方式中，所述组合物包 含两种或多种试剂。
上面活性试剂的列表基于在The Merck Index、12th Edition、Merck & Co.Rahway、N.J.(1996)中THER-1到THER-28页所列的那些种类和药物 种类。该参考在此全部并入作为参考。
D.所述组合物的用途
所述微球的治疗和诊断应用包括药物传送、疫苗、基因治疗、和体内 组织或肿瘤成像。给药途径包括口服或肠胃外的给药；粘膜给药；眼科给 药；静脉的、皮下的、动脉内的或肌肉内的注射；吸入给药、和局部给药。
所述疾病或病症可包括但不限于神经的病症、呼吸的病症、免疫系统 病症、肌肉的病症、生殖病症、胃肠的病症、肺部病症、消化病症、代谢 病症、心血管病症、肾脏病症、增殖病症、癌性疾病和炎症。
这里提供的微颗粒可用来治疗传染性疾病，如虫媒病毒的感染、肉毒 杆菌中毒、布氏菌病、念珠菌病、弯曲菌病、水痘、衣原体、霍乱、冠状 病毒感染、葡萄球菌感染、柯萨奇病毒感染、克罗伊茨费尔特-雅各布病、 隐孢子虫病、环孢子虫感染、巨细胞病毒感染、EB病毒感染、登革热、 白喉、耳部感染、脑炎、流感病毒感染、副流感病毒感染贾第虫病、性病 尿道炎、流感嗜血杆菌感染、汉坦病毒属感染、病毒性肝炎、单纯疱疹病 毒感染、HIV/AIDS、缠绕杆菌属感染、人乳头状瘤病毒(HPV)感染、传染 性单核细胞增多、军团杆菌病、麻风病、钩端螺旋体病、李斯特菌病、莱 姆病、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、疟疾、麻疹、马尔堡出血热、脑膜炎、 猴痘、腮腺炎、分枝杆菌感染、支原体感染、诺沃克病毒感染、百日咳、 蛲虫感染、肺炎球菌疾病、肺炎链球菌感染、肺炎支原体感染、卡他莫拉 菌感染、铜绿假单胞杆菌感染、轮状病毒感染、鹦鹉热、狂犬病、呼吸道 合胞体病毒感染(RSV)、癣菌病、落矶山斑疹热、风疹、沙门菌感染、SARS、 疥疮、性传播疾病、志贺氏菌病、带状疱疹、孢子丝菌病、链状球菌的感 染、梅毒、破伤风、旋毛虫病、结核病、土拉菌病、伤寒、病毒性脑膜炎、 细菌性脑膜炎、西尼罗病毒、黄热病、耶尔森菌病、和其它传染性的呼吸 的、肺部的、皮肤的、胃肠的和尿道的疾病。
其它的疾病和病症包括：关节炎、哮喘、过敏性病症、阿尔茨海默病、 癌症、心血管疾病、多发性硬化症(MS)、帕金森病、囊性纤维化病(CF)、 糖尿病、非病毒肝炎、血友病、出血障碍、血质不调、遗传病症、激素失 调(hormonal disorders)、肾脏疾病、肝脏疾病、神经障碍、新陈代谢疾病、 皮肤病症、甲状腺疾病、骨质疏松、肥胖症、中风、贫血、炎症性的疾病 和自身免疫疾病。
E.组合，试剂盒，制造物品
这里提供了组合和包含该组合的试剂盒，其包含微颗粒或用于形成微 颗粒的成分，如蛋白质或其它大分子、平衡离子、溶剂、缓冲液或盐和任 选包括给药的说明。所述组合包括如这里提供的组合物和用于稀释组合物 到期望浓度的反应物或溶液以给药于包括人类的受治疗者。所述组合也可 包括如这里提供的组合物和如这里提供的包括药物的另外的营养和/或治 疗剂。
另外地这里提供了包括上面描述的组合和任选的给药说明的试剂盒， 所述的给药是通过口服，皮下的，经皮肤的，静脉的，肌肉的，眼或其他 途径，取决于蛋白质和任选传送的另外的试剂。
这里提供的组合物可包装成包含包装材料，这里提供的组合物和指示 所述组合物的标签的制造物品，如，配制DAS181制剂用于口服，肺部或 其它传送。
这里提供的制造物品可包括包装材料。用于包装的药学产品的包装材 料对本领域技术人员是熟知的。见，如美国专利第5,323,907，5,052,558 和5,033,252号。药学包装材料的例子包括但不限于泡罩包装、瓶子、试 管、吸入器、泵、袋子、管型瓶、容器、瓶子，和其它适于选定配方和预 期的给药及治疗方式的包装材料。
包括以下的实施例只做解释用途，并非有意用来限定本发明的范围。
实施例1
唾液酸酶融合蛋白DAS181微球的制备
A.DAS181的纯化
DAS181是包含肝素(糖胺聚糖或GAG)结合域的融合蛋白，其来自 人双向调节因子N末端融合到粘性放线菌催化域C端(SEQ ID NO：17 所列的氨基酸序列)。所述DAS181蛋白如在Malakhov等，Antimicrob. Agents Chemother.，1470-1479，2006中所述地纯化，其在此全部通过引用并 入。简言之，编码DAS181的DNA片段在IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半 乳糖苷)诱导型的启动子控制下克隆进质粒载体pTrc99a(Pharmacia；SEQ ID NO：16)。所产生的构建体在大肠杆菌(E.coli)BL21菌株中表达。
在50mM的磷酸盐缓冲液，pH 8.0；0.3M NaCl和10％的甘油中超声 波裂解包含表达构建体的大肠杆菌细胞。澄清的裂解液通过SP-琼脂糖柱。 蛋白质利用包含0.8M NaCl的裂解缓冲液从柱上洗脱。从SP-琼脂糖上洗 脱的组分调节到1.9M硫酸铵((NH4)2SO4)中，通过离心澄清，然后上样 到丁基-琼脂糖柱上。用两倍体积的1.3M(NH4)2SO4冲洗所述柱，且所述 DAS181融合蛋白用0.65M(NH4)2SO4洗脱。
对于最后一步，在用磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡的聚丙烯酰胺葡聚 糖S-200(Sephacryl S-200)上实行尺寸排阻层析。蛋白质纯度通过如下方 法评估确定为大于98％：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，反相高压 液体层析和利用产生的抗大肠杆菌细胞蛋白的抗体酶联免疫吸附测定。纯 化的DAS181，分子量为44,800Da，以2mM，pH5.0的乙酸钠缓冲液透 析。
B.DAS181活性
利用荧光底物4-甲基伞形酮-N-乙酰-α-D-神经氨酸(4-MU-NANA； Sigma)测量DAS181唾液酸酶活性。一个单位的唾液酸酶定义为在37℃ 下(50mM CH3COOH-NaOH缓冲液，pH5.5)，包含0.2ml体积的20nmol 的4-MU-NANA(Potier等，Anal.Biochem.，94：287-296，1979)的反应中， 10min后从4-MU-NANA中释放10nmol的MU的酶量。DAS181的比活 性经确定为1,300U/mg蛋白质(每单位活性0.77μg DAS181蛋白质)。
C.利用纯化的DAS181制备微球
如上述部分A描述纯化和制备的DAS181(10mg/ml)可用来形成如 下显示的200μl混合物。如下所述混合物包含要么甘氨酸要么柠檬酸盐作 为平衡离子，和异丙醇作为有机溶剂：
1)DAS181+5mM甘氨酸，pH 5.0；
2)DAS181+5mM甘氨酸，pH 5.0+10％异丙醇；
3)DAS181+5mM柠檬酸钠，pH 5.0；
4)DAS181+5mM柠檬酸钠，pH 5.0+10％异丙醇；
从以下温度逐渐冷却包含具有以上1)-4)描述的成分的混合物的塑 料微离心管：
(a)通过放置混合物于冰箱中，从环境温度(约25℃)到4℃，接 着：
(b)通过放置来自(a)产生的混合物于冷库中，冷却到-20℃，接着：
(c)通过放置来自(b)产生的混合物于冷库中，冷却到-80℃。
在最佳的条件下，在约4℃到约-20℃间(通常在约-2℃到约-15℃范围 内)可期望形成微球。操作冷却到-80℃来通过冻干去除来自混合物的微球 以外的成分(如，溶剂等)。混合物4)制备成三等份，两等份在塑料管， 一等份在玻璃管。一等份(在塑料管)如上述冷却，而其它两等份(一等 份在塑料管，一等份在玻璃管)通过浸入试管到液氮中用来快速冷却/冰冻。
在冷冻后，将所有的试管置于冷冻干燥机内，且挥发物(水和异丙醇) 通过升华去除，剩下干燥沉淀。
结果：试验自如上述描述处理的混合物回收的干燥沉淀中微球的存在。 在上述的样品中，只有包含柠檬酸盐平衡离子和异丙醇且经受逐渐冷却的 混合物4)观察到具有良好分散特点、约2微米(μm)尺寸的微球。平衡 离子甘氨酸证明不是最适合DAS181蛋白质(混合物2)，显示玻璃样晶体 和附聚物的混合物，只有很少微球。当没有有机溶剂存在，获得了玻璃样 冻干的DAS181蛋白团块，且没有观察到微球(混合物1)和3))。快速 冷冻玻璃管中混合物4)产生玻璃样晶体，没产生微球，然而塑料管中混 合物4)的快速冷冻(因为通过塑料比通过玻璃稍慢的热传播，冷却速率 稍慢)产生附聚的微球。
该实施例表明具有小尺寸分布和好的分散性(附聚物最少)的微球通 过使用这里提供的方法如下方式生产：合适的蛋白质，平衡离子，有机溶 剂的结合和逐渐冷却。
实施例2
DAS181微球的尺寸作为有机溶剂浓度的函数
利用DAS181蛋白质(10mg/ml)，柠檬酸盐平衡离子(柠檬酸钠，5 mM)和异丙醇有机溶剂(10％，20％或30％)的组合，纯化和利用DAS181 制备如上述实施例1(见混合物4))中微球。所产生的混合溶液如实施例 1所述从环境温度(约25℃)冷却到4℃，接着冷却到-20℃，接着冷冻到 -80℃。在冷冻到-80℃后，所述试管置于冷冻干燥机中，挥发物(水和异 丙醇)通过升华去除，剩下包含微球的干粉。
结果：在所有三个浓度：10％，20％或30％的有机溶剂异丙醇下观察 到微球形成。然而，所述微球尺寸是不同的，其取决于所述有机溶剂的浓 度。通过比较颗粒与在血细胞计数器上的网格确定，利用10％异丙醇，所 述微球的尺寸估计为2微米；利用20％异丙醇为4微米；利用30％异丙醇 为5-6微米。这些结果表明利用合适浓度的有机溶剂，微颗粒的尺寸可设 计为希望的。
实施例3
DAS181微球的尺寸作为蛋白质浓度的函数
利用DAS181蛋白质(5mg/ml或10mg/ml)，柠檬酸盐平衡离子(柠 檬酸钠，5mM)和异丙醇(5％或20％)的组合，纯化和利用DAS181制 备如上述实施例1(见混合物4))中微球。产生的混合溶液如实施例1所 述从环境温度(约25℃)冷却到4℃，接着冷却到-20℃，接着冷冻到-80 ℃。在冷冻到-80℃后，将所述试管置于冷冻干燥机中，挥发物(水和异丙 醇)通过升华去除，剩下包含微球的干粉。
结果：在两个蛋白质浓度(5mg/ml和10mg/ml)和有机溶剂的两个 浓度(5％或20％)下观察到微球形成。然而，所述微球尺寸是不同的。包 含5mg/ml或10mg/ml蛋白质和5％异丙醇的混合物产生估计为约1.5微 米尺寸的微球。包含5mg/ml蛋白质和20％异丙醇的所述混合物产生估计 为约3微米尺寸的微球，而含10mg/ml蛋白质和20％异丙醇的所述混合物 产生估计为约4微米尺寸的微球。这些结果表明利用合适浓度的蛋白质或 合适浓度的有机溶剂和蛋白质的组合，微颗粒的尺寸可设计为希望的。
实施例4
DAS181微球的尺寸作为平衡离子浓度的函数
利用DAS181蛋白质(10mg/ml)，柠檬酸盐平衡离子(柠檬酸钠，2 mM，3mM或6mM)和异丙醇(20％)的组合，纯化和利用DAS181制 备如上述实施例1(见混合物4))中微球。所述混合溶液在玻璃管状瓶中 混合，且以1℃每分钟的冷冻梯度在Millrock Lab Series冷冻干燥机中从+20 ℃冷却到-40℃。挥发物(水和异丙醇)在100mTorr通过升华去除，且初 次干燥在-30℃12小时和第二次干燥在30℃3小时，剩下包含微球的干 粉。
结果：在所有三个试验的柠檬酸盐平衡离子浓度下观察到微球形成。 微球的尺寸从2mM柠檬酸盐下l微米增加到3mM柠檬酸盐下3微米， 到6mM柠檬酸盐下5微米。加入1mM的柠檬酸钠或1mM的氯化钠到 含2mM柠檬酸盐的混合物中并不影响由柠檬酸盐平衡离子启动的微球形 成。这些结果表明利用合适浓度的平衡离子，微颗粒的尺寸可设计为希望 的。
实施例5
在表面活性剂存在时形成的DAS181微球
加入表面活性剂到大分子(如蛋白质)微球中经常可改进微球的特点 使其适合给药于受治疗者，如流动性，分散性和用于特殊给药途径的配置， 如鼻内或口腔吸入。试验表面活性剂是否可并入这里提供的生产微球的方 法，可如上述实施例1进行DAS181微球的生产，除了另外加入表面活性 剂到溶液中之外。
加入表面活性剂(3.5％w/w卵磷脂，0.7％w/w Span-85(去水山梨 糖醇三油酸酯)或3.5％w/w油酸)到包含5mg/ml DAS181，5mM柠檬 酸钠和20％异丙醇的混合溶液中。通过冷却所述溶液到4℃，接着冷却到 -20℃形成所述微球，接着冷冻到-80℃用于如在上面实施例1中描述的冻 干。在冰冻后，将所述试管置于冷冻干燥机内，且通过升华去除挥发物(水 和异丙醇)，剩下包含微球的干粉。
结果：自如上面描述的每种混合物的处理产生的微球使用盖玻片环形 移动摩擦来涂到载玻片上。在所有的例子中观察到有效的微球形成。当包 含表面活性剂的样品与包含所有其余成分而没有添加表面活性剂的样品 相比较时，注意到在表面活性剂存在时形成的所述微球提高了分散性(更 少的附聚或聚集)。
实施例6
通过选择合适种类和浓度的有机溶剂和平衡离子制备牛血清白蛋白 (BSA)微球
如这里描述的，可在高通量模式中依经验性地优化这里提供的方法来 获得具有期望特点，包括尺寸、流动性和分散性的微球。此实验的目的是 为了表明通过改变有机溶剂和平衡离子的种类和浓度，还有混合物的pH， 可以调节感兴趣蛋白质微球的尺寸和质量，在此例中为牛血清白蛋白 (BSA)。
在指定的pH和浓度下(见表1)包含5mg/ml的BSA和不同有机溶 剂和平衡离子的混合溶液置于微滴度板(终体积每孔0.1ml)中。在Millrock Lab Series冷冻干燥机中以1℃每分钟的冷冻梯度从+20℃冷却所述混合溶 液到-40℃。挥发物在100mTorr下通过升华去除，且初次干燥在-30℃ 12 小时和第二次干燥在30℃3小时。
结果：所述结果在下面的表1中显示。对于BSA蛋白，产生具有最少 结晶或聚集的最均匀的微球组合(分别是平衡离子和有机溶剂的)包括：
(1)柠檬酸盐+异丙醇
(2)柠檬酸盐+丙酮
(3)衣康酸+1-丙醇
(4)甘氨酸+二噁烷
(5)甘氨酸+1-丙醇
(6)铷+1-丙醇
(7)高氯酸盐+1-丙醇
表1：在不同条件下形成的BSA微球的高通量筛选
  平衡离子   pH   有机溶剂   产品描述   5mM三甲基醋酸   4.0   5％环己醇   偶尔具有晶体的0.5-1微米微球   5mM三甲基醋酸   4.0   5％1-丙醇   具有一些聚集体的0.5-1微米微球   5mM三甲基醋酸   4.0   5％丁基醇   聚集的微球   5mM三甲基醋酸   4.0   5％对二噁烷   聚集的微球   5mM氯化铷   9.0   5％环己醇   0.5-1微米微球。   聚集体和偶尔的晶体   5mM氯化铷   9.0   5％1-丙醇   0.5-1微米微球   5mM氯化铷   9.0   5％丁基醇   很少的微球(0.5-1微米)。   多数聚集体和晶体   5mM氯化铷   9.0   5％对二噁烷   具有一些聚集体的1-2微米微球   5mM溴化钠   4.0   5％环己醇   具有一些聚集体的1-2微米微球   5mM溴化钠   4.0   5％1-丙醇   很少的微球(0.5-2微米)。   多数聚集体和晶体
  5mM溴化钠   4.0   5％丁基醇   很少的微球(0.5-1微米)。   多数聚集体和晶体   5mM溴化钠   4.0   5％对二噁烷   具有一些聚集体的1-2微米微球   5mM高氯酸钠   4.0   5％环己醇   具有一些晶体和聚集体的0.5-2微米的微球   5mM高氯酸钠   4.0   5％1-丙醇   0.5-1微米微球   5mM高氯酸钠   4.0   5％丁基醇   很少的1-2微米微球。   多数晶体和聚集体   5mM高氯酸钠   4.0   5％对二噁烷   聚集的微球   5mM磷酸钙   4.0   5％环己醇   很少的1-2微米微球。   多数聚集体   5mM磷酸钙   4.0   5％1-丙醇   具有一些聚集体的1-2微米微球   5mM磷酸钙   4.0   5％丁基醇   很少的1-2微米微球。   多数晶体和聚集体   5mM磷酸钙   4.0   5％对二噁烷   聚集的微球   5mM三乙胺   9.0   5％环己醇   具有一些晶体和聚集体的0.5-1微米的微球   5mM三乙胺   9.0   5％1-丙醇   具有一些聚集体的1-2微米微球   5mM三乙胺   9.0   5％丁基醇   很少的1-2微米微球。   多数晶体和聚集体   5mM三乙胺   9.0   5％对二噁烷   聚集的微球   5mM甘氨酸   9.0   5％环己醇   具有一些晶体和聚集体的0.5-1微米的微球   5mM甘氨酸   9.0   5％1-丙醇   偶尔具有聚集体的0.5-2微米微球   5mM甘氨酸   9.0   5％丁基醇   很少的1-2微米微球。   多数晶体和聚集体   5mM甘氨酸   9.0   5％对二噁烷   1-2微米微球   5mM柠檬酸钠   4.0   15％异丙醇   1-2微米微球   5mM柠檬酸钠   4.0   15％丙酮   0.5-1微米微球   5mM衣康酸   4.0   15％1-丙醇   1-2微米微球
这些结果显示对每种蛋白质，可以很容易的筛选在高通量的设计中对 于形成最好的微球(希望的尺寸、一致性、分散性、最少聚集体和晶体形 成等)的多种配方。选自起始筛选的反应物和条件的组合(平衡离子、有 机溶剂、pH、浓度)可进一步按需要微调。
实施例7
利用多种蛋白质制备微球
这里提供的方法可利用多种蛋白质来制备微球。除了上面举例的 DAS181和BSA，所述方法可用来制备胰蛋白酶、血红蛋白、DNA酶I、 溶菌酶、卵白蛋白、RNA酶A、六组氨酸标签的人蛋白酶抑制剂8(PI8， 具有如SEQ ID NO：15所述的氨基酸序列)、红色荧光蛋白(RFP)和绿色 荧光蛋白(GFP)微球。
DNA酶I、胰蛋白酶和血红蛋白购自Worthington。溶菌酶、卵白蛋 白和RNA酶A购自Sigma。6×His标签的PI8，GFP和RFP的纯化：6×His 标签的PI8，GFP和RFP基本上如在上面实施例1中对于DAS181描述的 表达和纯化，其中具有如下改动：
6×His标签的GFP和6×His标签的RFP的纯化：编码具有N端His6 标签的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的构建体在大肠杆菌中表达为6×His 标签的蛋白质。允许红色荧光蛋白的表达在具有1mM IPTG的LB培养基 中进行过夜。在具有1mM IPTG的TB培养基中诱导绿色荧光蛋白3个小 时。通过离心澄清来自4升诱导培养物的细胞裂解物，且通过在Fast-Flow 螯合树脂(GE Healthcare)上的金属螯合亲和层析纯化所述蛋白质，所述 树脂带镍，且装载到C-10柱(GE Healthcare)上。
所述蛋白质进一步通过在以磷酸盐缓冲盐水平衡的0.5cm×70cm聚 丙烯酰胺葡聚糖200柱上的凝胶过滤层析纯化。所述蛋白质在2mM的乙 酸钠缓冲液，pH 5.0下透析，且在Centriprep(Amicon)上浓缩。
6×His标签的PI8的纯化：编码具有N末端的His6标签的PI8的构建 体在大肠杆菌中表达为6×His标签的PI8。如上文对6×His RFP和6×His GFP描述的实行纯化，除了在不同层析纯化步骤中使用的所有缓冲液包含 1mM TCEP(三(2-羧基乙基)盐酸膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride))。
微球的制备：如在上面实施例6中描述在微滴度板上制备包含5mg/ml 的蛋白质和下列各种平衡离子、有机溶剂和pH的混合溶液。
表2：用来生产不同蛋白质微球的组合
  蛋白质   平衡离子   pH   有机溶剂  微球尺寸(微米)   胰蛋白酶   5mM精氨酸   8.0   5％异丙醇  0.5-1   溶菌酶   5mM柠檬酸盐   8.0   5％异丙醇  4-5   PIN 168(PI8)   5mM柠檬酸盐   5.0   7％异丙醇  2-5   DNA酶I   5mM柠檬酸盐   4.0   5％异丙醇  0.4-1   RNA酶A   5mM柠檬酸盐   4.0   5％异丙醇  0.4-1   血红蛋白   5mM甘氨酸   5.0   10％异丙醇  0.4-0.7   卵白蛋白   5mM三甲基醋酸   4.0   10％异丙醇  0.5-1   红色荧光蛋白   5mM三甲基醋酸   7.0   10％1-丙醇  1-4(偶尔的聚集体)   绿色荧光蛋白   5mM三甲基醋酸   7.0   10％1-丙醇  0.5-1.5
在Millrock Lab Series冷冻干燥机中以1℃每分钟的冷冻梯度从+20℃ 冷却所述微滴度板到-40℃。挥发物(水和异丙醇)在100mTorr下通过升 华去除，且初次干燥在-30℃ 12小时和第二次干燥在30℃ 3小时，剩下 包含微球的干粉。
将所述干粉分散在载玻片上，且通过要么32×要么100×物镜实行显微 照相。所有的上面表2中列的组合生产了良好质量(一致的尺寸分布、分 散性，只有很少聚集体和/或晶体)的微球。所述微球的尺寸从约0.4-1微 米(RNA酶A，DNA酶I)到约2-5微米(6×His PI8，溶菌酶)间变化， 其取决于所述蛋白质。该实施例证明这里提供的方法可用来生产来自广泛 种类蛋白质的微球。
实施例8
用于吸入的DAS181微球的气动粒径分布：这里提供的方法与喷雾干 燥的比较
如这里描述的，这里提供的方法可用来生产任何期望尺寸范围的微球， 包括用于通过吸入传送的约0.5微米到约6-8微米的范围。
A.微球的制备
为了测试配制用于吸入传送的DAS181干粉(微球)的气动粒径分布， 用如下两种方法制备DAS181微球：
(a)包含14mg/ml DAS181、5mM柠檬酸钠，pH5.0的DAS181 含水溶液在55℃的空气流中喷雾干燥来生产微球。
(b)可选择地，根据这里提供的方法生产DAS181微球。加入 5％的异丙醇到包含14mg/ml DAS181、5mM柠檬酸钠，pH 5.0的DAS181含水溶液作为有机溶剂。在Millrock Lab Series冷冻干燥机中在1℃每分钟的冷冻梯度下从+20℃冷 却产生的溶液到-40℃。挥发物(水和异丙醇)在100mTorr 下通过升华去除，且初次干燥在-30℃ 12小时和第二次干燥 在30℃ 3小时，剩下包含微球的干粉。
B.微球的气动粒径分布
通过Anderson级联冲击(Cascade Impaction)试验如在实施例8A中 描述制备的微球。在呼吸道的药物沉积作用可通过在级联冲击器的载物台 /收集碟上的颗粒(微球)的空气动力学行为预测。
利用通过如下方法制备的DAS181微球实行所述级联冲击实验：在上 面部分A描述的两种可选择的方法中一种，即要么通过喷雾干燥，要么通 过这里提供的方法。装载所述微球(10mg)到明胶胶囊中。所述明胶胶 囊置于CycloHaler(PharmaChemie)干粉吸入器中，且经受级联冲击。使 用8载物台的、不能活动的(non-viable)Andersen级联冲击器(Thermo Electron，Boston)，其经改装以每分钟90升气流使用，且装有USP喉部， 诱导锥体和没有预分离器。代表吸入后不同区域/阶段(气管、主支气管和 次级支气管、终端支气管、肺泡等)的沉积作用的冲击器的收集碟用硅喷 雾涂层来防止微球跳动。来自载物台和收集碟的微球回收到包含0.1％吐温 的磷酸盐缓冲盐水中，且通过测量280nm处吸光度定量回收自每一个载 物台和收集碟的沉积的DAS181的量。
结果：通过所述两种方法生产的微球几何尺寸通过光学显微镜评估， 且发现对于两种方法基本上是相同的(1.5-3.0微米的范围)。然而如下面 表3中显示的，所述两种制品的气动粒径分布在这两种方法间显著地不同。 对于根据如这里提供的方法生产的微球(即，上面部分A中所列的方法 (b))，少于25％保持陷在口中(冲击器装置的喉部/锥体)，而大于70％ 的微球传送到气管和肺部(大于40％的在终端支气管和肺泡中)。相比较， 少于50％的通过喷雾干燥(上面部分A中所列的方法(a))形成的DAS181 微球传送到气管和肺部(少于20％的在终端支气管和肺泡中)。所述结果 表明这里提供的方法可生产用于传送到肺部深处的微球，且相比通过喷雾 干燥方法生产的微球，通过这里的方法生产的微球具有出众的瓦解和流动 性质(提供更高的传送剂量)。
表3：DAS181微球的级联冲击分析结果

实施例9
大规模的微球生产
本实施例表明这里提供的方法可放大规模用于生产大量的DAS181。 这里描述的批次方法适合生产如从数微克到约一千克的范围量的高质量 干粉微球，且由混合箱和/或冷冻干燥机架空间的容量限制。这里描述的选 择性的“连续的”方法可用来生产如从几百克到一百千克或更多(100克到 100千克和以上)范围的量。连续方法的另外的优点是更好控制所述混合 物的冷冻。
通过批次方法或连续方法的大规模生产可以按照例如下面描述的一 个或多个步骤的任何组合或特定的可选择的方法进行：
●蛋白质沉淀到微球：该步骤可以批次方式，通过如下方法实 行：放置包含期望浓度的蛋白质、有机溶剂和平衡离子的混 合溶液到冷冻干燥托盘中，且放置所述托盘到冷冻干燥机架 上。可选择地，托盘可在冷冻的平台或其它种类的设备(如， 冰库)中变冷并冰冻，且贮存一段时间后来冰冻和冻干。可 选择地，所述微球可通过在辅以搅拌的容器中沉淀而形成， 其中所述容器放置于冷表面，或冷却管浸入到液体中，或当 利用蠕动泵将所述混合物在热交换器中再循环时。可选择 地，所述微球可通过以连续方式沉淀，通过使用蠕动泵将所 述混合溶液经过热交换器而形成。
●大量液体(bulk liquid)的去除：所述微球的混悬液可利用 标准离心、连续流动离心(如，CARR ViaFuge Pilot)或过 滤(如，在玻璃纤维，烧结玻璃，聚合体过滤器，中空纤维 套筒(如由GE Healthcare制造的那些)或正切流动过滤盒 (如由Millipore或Sartorius制造的那些TFF盒))来浓缩。 大量液体的去除(50％或更高)可产生更快的干燥循环和更 高的效率和生产量。
●干燥微球：通过任何方式形成的回收的微球可通过常规冷冻 干燥来干燥。可选择地，所述微球可在环境温度和大气压下 干燥，不使用冷冻干燥机。
结果：DAS181蛋白通过这里描述的连续方式成功地处理成干粉(微 球)。包含10mg/ml DAS181、20％异丙醇、2mM硫酸钠的混合物利用蠕 动泵通过连通NESLAB循环式低温恒温器的35SERIES热交换器(Exergy， Garden City，NY)，以使在通道中所述混合物从约25℃冷却到约-12℃。将 离开热交换器的产生的微球混悬液泵到预冷的冷冻干燥托盘(-40℃)中， 冰冻和冻干或选择地，直接泵到液氮中然后冻干。通过显微镜和级联冲击 分析产生的微球显示为具有最小聚集和良好分散性的一致的微球，且在尺 寸和气动粒径分布上与批次方式生产的微球相似。当配制的DAS181混合 溶液(不通过热交换器，这样不诱导微球沉淀)没有冷冻而直接倒入液氮 中时，没有观察到微球，相反，在冷冻干燥后观察到玻璃样晶体。
实施例10
用于传送到上部和中部呼吸道的DAS181微球的批次方法过程和配制
此实施例描述配制和生产DAS181微球的过程。所述DAS181混合溶 液内含物和它们相对的量在下面表4中表示。
表4：DAS181微球的批次生产配方

(1)批量大小：配制的混合物的终体积为5.38L。大批DAS181干粉的理论产量74g。
(2)所述DAS181蛋白质(API)母液组分。
A.原料药物质的生产
术语药物物质，活性药物成分和API在本实施例中可互换地使用，且 是指DAS181蛋白质。大批的DAS181蛋白质的生产如下进行。首先，将 大批量(bulk amount)的DAS181大致按实施例1中描述的在大肠杆菌 (BL21菌株)中表达。表达所述DAS181蛋白质的大肠杆菌细胞通过如 下方法冲洗：利用Toyopearl缓冲液1，UFP-500-E55中空纤维套筒(GE Healthcare)和Watson-Marlow蠕动泵在发酵收获冲洗步骤中渗滤。
然后重组DAS181蛋白质从所述细胞中大批纯化。在下面的表5和表 6中提供在DAS181大批纯化中使用的组分和缓冲液的具体规格。所收获 和冲洗的细胞由将细胞两次通过Niro-Soave Panda细胞破碎仪的匀浆步骤 裂解。这样获得的匀浆物通过使用Toyopearl缓冲液1，Hydrosart 0.2微米 TFF盒和Watson Marlow泵的微过滤来澄清。然后所述澄清的匀浆物通过 允许裂解物不加入新鲜缓冲液的再循环来浓缩。接着，在Toyopearl SP-550C树脂上捕获来自澄清的匀浆物的DAS181蛋白，所述树脂在 DAS181蛋白质从树脂洗脱前在一系列缓冲液(见表5)中冲洗。所述洗 脱物的氯化钠浓度在pH 8.050mM磷酸盐最终缓冲液中调节到1.0M。然 后包含DAS181的洗脱液利用Toyopearl缓冲液4通过Toyopearl己基-650C 树脂而进一步纯化。然后包含DAS181蛋白质的所述树脂洗脱物在渗滤步 骤(见表5步骤8)中经缓冲液交换到5mM乙酸钠中。然后所浓缩的蛋 白质通过Sartorius Q SingleSep滤器以便以流通方式去除DNA。加入异丙 醇到Q SingleSep滤液中至20％v/v的最终浓度。在所述缓冲液中的 DAS181蛋白质通过用Amberchrom缓冲液(见表5步骤11)平衡的 Amberchrome CG300M树脂。然后纯化的大批的DAS181蛋白质经缓冲液 交换到配制缓冲液中且通过渗滤(见表5的步骤12)浓缩。
表5：大批DAS181药物物质的纯化




*体积以升计，除了4×表示所述保留体积的倍数
CV＝柱体积
NR＝未记录
NS＝非特定
表6：在DAS181纯化过程中使用的缓冲液

N
B.批次生产过程
在下面描述的大批量批次方法中结合上面表4中所列的成分来形成 DAS181微球。
步骤I：原料药物质的解冻
在塑料瓶中冰冻的0.2μm过滤的原料药物质在环境温度(25±3℃)下 解冻过夜。
步骤II：赋形剂的称量和溶液的制备
称量35.51克无水硫酸钠粉末，且用冲洗用水适量补到500mL，然后 搅拌来获得澄清溶液。称量18.38克二水氯化钙粉末，且用冲洗用水适量 补到250mL，然后搅拌来获得澄清溶液。
步骤III：DAS181混合溶液的制备
缓慢加入1.79L冲洗用水到3.3L浓缩的药物物质(19.55g/L)并搅 拌，接着加入0.0215L硫酸钠溶液，0.0028L氯化钙溶液和0.269L异丙 醇。搅拌所述溶液来确保组分的完全混合。
步骤IV：通过0.2μm过滤器过滤配制的混合溶液
通过0.2μm过滤器过滤步骤III配制的混合溶液到消毒的培养基袋子 来控制微粒子和污染菌(bioburden)。
步骤V：填进冷冻干燥托盘
配制的过滤溶液分配到高温高压灭菌的Lyoguard冷冻干燥托盘上。为 了确保所述溶液均衡冷却和高质量微球的形成，6个托盘的每一个填有0.9 L或更少的混合溶液。
步骤VI：冰冻和冻干
将所述托盘置于预冷到-45±5℃冷冻干燥机(Hull 120FSX200)架上， 且允许所述溶液冷冻和冰冻。当所述溶液正冷冻时微球的形成发生。允许 冷冻进行1-2小时来确保完全固化。所述产物温度通过阅读连接到所述6 个托盘中2个的温差电偶来核实。
冷冻干燥循环步骤如下
a)设置真空到160微米，且允许抽空到100-200微米；
b)架温度在3小时内梯度上升到+10℃；
c)保持架温度在+10℃36小时(初次干燥)；
d)检查温差电偶轨迹(trace)来核实初次干燥阶段是完全的，且 产物温度已经在+10℃±5℃稳定了15-30小时。
e)架温度在1小时内梯度上升到+30℃，且保持3-5小时(第二次 干燥)。
步骤VII：转移大批的DAS181微球到容器并混合
使用清洁擦清洁在每个Lyoguard冷冻干燥托盘底部薄膜上的部分，且 用手术刀做成3×3cm的开口。转移所述干燥微球到塑料瓶中。盖上所述 瓶并上下翻滚40次，每次颠倒改变方向。翻滚是为确保瓶内含物的一致 性。取出用于分析试验的样品，且重新盖上所述瓶并密封到塑料袋子中贮 存。
在上面描述的DAS181微球大批的生产过程中，表明硫酸盐为用作平 衡离子的安全物质，且可重复生产具有窄尺寸分布的微球。进一步，有机 溶剂异丙醇是好的溶剂选择，因为(1)其是种类3溶剂，(2)其可生产 在宽范围(2-30％，v/v)浓度的微球，和(3)其具有相对高的冰点，所以 其蒸汽在冻干中可有效的截留。
在最终制剂中所述蛋白质浓度可变化(10-14mg/ml)，平衡离子的浓 度(1-5mM)和异丙醇(2-30％v/v)也可变化，而不会对微球的物理性质 或在微球中DAS181蛋白质的活性有实质的影响。在较高浓度的异丙醇 (15-30％)下，所述微球在混合物还是完全液体时形成。在较低浓度 (2-15％)下，冰晶首先开始形成，接着沉淀形成微球。
C.微球中DAS181的产量
根据如下的公式计算干燥微球中DAS181的理论产量：
理论产量＝DAS181蛋白质，g÷在干粉(微球)中蛋白质百分率
通过分析几个生产的DAS181微球批次依经验性地确定所述蛋白质的 分数值(0.866)。对于表2中所列量的理论产量为64.56g÷0.866＝74.55g。 实际的DAS181干粉产量发现为64克。
结果：通过Andersen级联冲击测试如上面部分B中描述制备的用于口 腔吸入给药的微球的适合性。所述结果在下面的表7中总结。在呼吸道中 药物的沉积作用可通过在级联冲击器载物台/收集碟上的颗粒(微球)的沉 积作用预测。对于给药来预防或治疗在呼吸道中起始的病毒感染，如流感 的药物，如DAS181微球；需要在喉咙，气管和支气管(上部和中部呼吸 道)中沉积药物。传送到上部和中部呼吸道的DAS181融合蛋白从粘膜切 去受体唾液酸，这样防止在这些位点的病毒结合和感染。对于所述DAS181 微球到呼吸病毒感染起始的位点，即在喉咙，气管或支气管的最佳传送， 所述微球必须不(a)太大以至其在嘴的前端被捕获(即，微球太大，约8 微米或更大)；或(b)太小以至其沉积在肺深部且系统地吸收进血流(即， 0.5微米或更小)。对于所述DAS181微球传送到喉咙，气管和支气管，约 1微米到约5.5-6微米尺寸范围通常是合适的。
如上面描述生产的DAS181微球由Andersen级联冲击表征，且发现适 合传送到上部和中部呼吸道且以足够低百分率(＜5％)沉积在肺泡。
表7：在60升每分钟下DAS181干粉的气动粒径分布
  Andersen级联   冲击器的组成   相应的尺寸定   点，微米   在呼吸道期望   的沉积   沉积的   DAS181蛋白   质(以mg计)   回收的总   DAS181蛋白   质的百分比   吸入器   (Cyclohaler)   1.57±0.11   20.13％   喉部/锥体   ＞10   口腔   0.93±0.19   11.92％   -1(载物台+收   8.6-10   口腔   0.50±0.10   6.41％
  集碟)   -0(载物台+收   集碟)   6.5-8.6   口咽的   0.40±0.03   5.13％   1(载物台+收   集碟)   4.4-6.5   咽   0.58±0.03   7.44％   2(载物台+收   集碟)   3.3-4.4   气管/支气管   0.83±0.07   10.64％   3(载物台+收   集碟)   2.0-3.3   次级支气管   1.80±0.09   23.08％   4(载物台+收   集碟)   1.1-2.0   终端支气管   0.82±0.08   10.51％   5(载物台+收   集碟)   0.54-1.1   肺泡   0.23±0.03   2.95％   6(载物台+收   集碟)   0.25-0.54   肺泡   0.14±0.03   1.79％   ∑ACI(发射)   6.24±0.10   80.00％
将10±1.0mg的DAS181干粉(8.5mg±10％DAS181蛋白质)填入HPMC胶囊 ∑ACI(发射)百分数为从USP喉部、诱导锥体和载物台-1到6回收的所有材料的总和。
DAS181微球通过激光散射进一步表征，其表明，与级联冲击结果一 致，通过在此实施例中描述的方法生产的大多数微球在尺寸为1微米和5 微米间的尺寸范围内。扫描电子显微镜观察(FEI Quanta 200扫描电子显 微镜，Everhart Thornley(ET)检测器)根据此实施例中描述的方法制备 的DAS181微球，显示所述微球作为上百和上千的约0.5-3微米尺寸的单 独颗粒的附聚物而存在。然而所述附聚物容易被致动中产生的穿过干粉吸 入器的气体湍流分散(如通过Andersen级联冲击或激光散射表明)。光学 显微镜观察分散在液体表面活性剂(如，Triton X-100或Tween 20)或并 不溶解微球的非极性溶剂(如，醇、丙酮或乙腈)的微球证实聚集体容易 分散为单独均匀的微球。
实施例11
使用非钠盐的硫酸盐制备DAS181微球
研究显示在一些例子中，如在一些哮喘病人中，在对肺部给药的制剂 中钠的存在会带有诱导气道高反应性(airways hyperresponsiveness)的风 险(Agrawal等，Lung，183：375-387(2005))。因而此实施例试验了选择性 的盐，如其他金属的盐，如钾、镁和钙。
如在上面实施例1中描述地生产DAS181微球。包含12mg/ml DAS181 和5％(v/v)异丙醇的混合溶液包含在2mM浓度，pH 4.5-5.0下指示的硫 酸盐作为平衡离子。通过从+25℃冷却溶液到-45℃形成所述微球。在冰冻 后，挥发物(水和异丙醇)通过升华去除，剩下包含微球的干粉。
所述干粉的气动粒径分布通过Andersen级联冲击评估，且每载物台的 DAS181的量通过在226nm(A226)UV测量来测定。所述结果在下面表8 中表示。所述结果表明非钠盐的硫酸盐可用作平衡离子来获得一定尺寸范 围的DAS181微球，以使大多数以与当硫酸钠用作平衡离子时传送的量相 当的量传送到喉咙、气管和支气管。
表8：有或无钠配制的DAS181微球的气动粒径分布

所述干粉也在+37℃或+53℃下培养如表9中指示的持续时间，且使用 如在实施例1中描述且这里通过引用并入的4-MU-NANA测定来试验唾液 酸酶活性。相比贮存于-80℃非冻干的DAS181微球的相对活性在表9中表 示。所述结果表示，使用多样的金属硫酸盐作为平衡离子制备的所述微球 的稳定性与硫酸钠的是相当的，在37℃保留了几乎所有或所有的活性超过 2个月且在53℃下保留几乎所有(硫酸钠和硫酸钾)或超过85％(硫酸镁 和硫酸锌)的活性超过10天。此实验表明多样的不含钠的平衡离子可产 生具有期望特点的微球。
表9：DAS181微球配方的唾液酸酶活性：加速的稳定性研究

实施例12
DAS181微球的稳定性
在微球中的DAS181蛋白质的稳定性通过使用如上面实施例1描述且 这里通过引用并入的4-MU-NANA活性测定随时间测量唾液酸酶活性来评 估。在包含10mg/ml DAS181，2mM硫酸钠，5％v/v异丙醇的混合溶液 中进行干燥DAS181微球的生产。加入0.01％w/v糖(山梨醇、甘露醇、 海藻糖或蔗糖)到一些溶液中。通过从+25℃冷却溶液到-45℃形成微球。 在冰冻后，挥发物(水和异丙醇)通过升华去除，剩下包含微球的干粉。
A.没有糖的DAS181微球的稳定性
在室温下(25℃)没有糖配制的DAS181干粉微球贮存在临近Drierite 干燥剂(Hammond Drierite，Xenia，OH)的容器中。所述干粉保持其原来 的效能(如通过使用根据实施例1且这里通过引用并入的4-MU-NANA的 唾液酸酶活性测量；结果在表10中表示)和气动粒径分布(如通过Andersen 级联冲击测量；表11)至少8个月。
表10：DAS181干粉的比活性
 试验  时间0   三个月   八个月  相对于时间0的唾  液酸酶活性  100％   102.0％   99.9％
表11：DAS181干粉的气动粒径分布
  ACI组   成   相应的尺寸定点，   微米   在呼吸道期望   的沉积   时间0   三个月   八个月   喉部+锥   体   ＞10   口腔   19.57±2.43   26.00±0.30   18.57±4.14   载物台-1   8.6-10   口腔   17.87±0.51   12.87±1.56   15.13±2.41   载物台-0   6.5-8.6   口咽的   10.27±0.93   7.07±0.32   9.80±1.80   载物台1   4.4-6.5   咽   8.57±0.49   8.80±0.26   7.73±0.57   载物台2   3.3-4.4   气管/支气管   10.67±0.23   10.70±0.35   9.30±0.82   载物台3   2.0-3.3   次级支气管   21.10±0.75   21.80±0.52   21.90±0.87   载物台4   1.1-2.0   终端支气管   10.10±0.75   10.63±0.80   14.50±3.22   载物台5   0.54-1.1   肺泡   1.47±0.23   1.73±0.06   2.37±0.06   载物台6   0.25-0.54   肺泡   0.33±0.06   0.40±0.10   0.73±0.06
表11：通过Andersen级联冲击来评估气动粒径分布，且表示为回收的总DAS181 蛋白质的百分比(％)。将10mg DAS181干粉填入胶囊，且使用Cyc1oha1er干粉吸入 器作为传送装置来驱动。空气流动速率为60升每分钟。分三等份实行测定，显示了平 均和标准偏差。
B.配制有糖的DAS181微球的稳定性
在包含糖的干粉微球制剂和在-80℃贮存未冻干的微球制剂中的 DAS181唾液酸酶活性使用如在实施例1中描述且这里通过引用并入的荧 光底物4-MU-NANA测量。在+42℃贮存如下面表12指示的不包含糖或包 含各种糖的干粉制剂4周(强制降解(degradation))。所述结果在表12中 表示。相对贮存于-80℃的未冻干的制剂，不包含糖的所述制剂保持其几乎 80％的活性。各种糖的加入增加稳定性以至保持了约88-98％的活性，这取 决于所述的糖。
表12
  糖   在42℃四周后剩余的唾液酸酶活性百分比   不含糖   79.82   山梨醇   91.23   甘露醇   89.47   海藻糖   97.37   蔗糖   88.60
因为修改对本领域技术人员是明显的，所以本发明仅预期被所附的权 利要求的范围限制。
相关申请
要求美国临时申请第60/762,002号的优先权权益，2006年1月24号 提交，名称为“Technology for Preparation of Macromolecular Microsphere” (大分子微球的制备技术)。这里被允许，该申请在此通过引用全部并入。
该申请还涉及序列号为11/657,812的美国申请(律师备审案件目录号 21865-004001/6504，2007年1月24号申请)。该申请也与第US20050004020 A1和US20050112751 A1号美国公布有关。这里被允许，这些申请中每一 个在此通过引用全部并入。
序列表
<110>耐百生物制药有限公司
     迈克尔 P.马拉科夫
     房芳
<120>大分子微球的制备技术
<130>21865-004WO1/6504PC
<140>US 60/762,002
<141>2006-01-24
<160>17
<170>用于Windows 4.0版本的FastSEQ
<210>1
<211>901
<212>PRT
<213>粘性放线菌
<400>1
Met Thr Ser His Ser Pro Phe Ser Arg Arg Arg Leu Pro Ala Leu Leu
 1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Pro Leu Ala Ala Thr Gly Leu Ile Ala Ala Ala Pro Pro
            20                  25                  30
Ala His Ala Val Pro Thr Ser Asp Gly Leu Ala Asp Val Thr Ile Thr
        35                  40                  45
Gln Val Asn Ala Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Ser Val Gly Asp Val Met
    50                  55                  60
Thr Phe Asn Ile Thr Leu Thr Asn Thr Ser Gly Glu Ala His Ser Tyr
65                  70                  75                  80
Ala Pro Ala Ser Thr Asn Leu Ser Gly Asn Val Ser Lys Cys Arg Trp
                85                  90                  95
Arg Asn Val Pro Ala Gly Thr Thr Lys Thr Asp Cys Thr Gly Leu Ala
            100                 105                 110
Thr His Thr Val Thr Ala Glu Asp Leu Lys Ala Gly Gly Phe Thr Pro
        115                 120                 125
Gln Ile Ala Tyr Glu Val Lys Ala Val Glu Tyr Ala Gly Lys Ala Leu
    130                 135                 140
Ser Thr Pro Glu Thr Ile Lys Gly Ala Thr Ser Pro Val Lys Ala Asn
145                 150                 155                 160
Ser Leu Arg Val Glu Ser Ile Thr Pro Ser Ser Ser Gln Glu Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Leu Gly Asp Thr Val Ser Tyr Thr Val Arg Val Arg Ser Val Ser
            180                 185                 190
Asp Lys Thr Ile Asn Val Ala Ala Thr Glu Ser Ser Phe Asp Asp Leu
        195                 200                 205
Gly Arg Gln Cys His Trp Gly Gly Leu Lys Pro Gly Lys Gly Ala Val
    210                 215                 220
Tyr Asn Cys Lys Pro Leu Thr His Thr Ile Thr Gln Ala Asp Val Asp
225                 230                 235                 240
Ala Gly Arg Trp Thr Pro Ser Ile Thr Leu Thr Ala Thr Gly Thr Asp
                245                 250                 255
Gly Ala Thr Leu Gln Thr Leu Thr Ala Thr Gly Asn Pro Ile Asn Val
            260                 265                 270
Val Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser
        275                 280                 285
Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn
    290                 295                 300
Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn
305                 310                 315                 320
Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn
                325                 330                 335
Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser
            340                 345                 350
Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly
        355                 360                 365
Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val
    370                 375                 380
Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp
385                 390                 395                 400
Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly
                405                 410                 415
Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp
            420                 425                 430
Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr
        435                 440                 445
Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro
    450                 455                 460
His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly
465                 470                 475                 480
Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp
                485                 490                 495
Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val
            500                 505                 510
Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly
        515                 520                 525
Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp
    530                 535                 540
Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Lou Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala
545                 550                 555                 560
Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala
                565                 570                 575
Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg
            580                 585                 590
Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr
        595                 600                 605
Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala
    610                 615                 620
Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn
625                 630                 635                 640
Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp
                645                 650                 655
Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu Pro Ser Pro Ala Pro
            660                 665                 670
Ser Pro Thr Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Thr Glu Lys Pro Ala Pro
        675                 680                 685
Ser Ala Ala Pro Ser Ala Glu Pro Thr Gln Ala Pro Ala Pro Ser Ser
    690                 695                 700
Ala Pro Glu Pro Ser Ala Ala Pro Glu Pro Ser Ser Ala Pro Ala Pro
705                 710                 715                 720
Glu Pro Thr Thr Ala Pro Ser Thr Glu Pro Thr Pro Ala Pro Ala Pro
                725                 730                 735
Ser Ser Ala Pro Glu Gln Thr Asp Gly Pro Thr Ala Ala Pro Ala Pro
            740                 745                 750
Glu Thr Ser Ser Ala Pro Ala Ala Glu Pro Thr Gln Ala Pro Thr Val
        755                 760                 765
Ala Pro Ser Val Glu Pro Thr Gln Ala Pro Gly Ala Gln Pro Ser Ser
    770                 775                 780
Ala Pro Lys Pro Gly Ala Thr Gly Arg Ala Pro Ser Val Val Asn Pro
785                 790                 795                 800
Lys Ala Thr Gly Ala Ala Thr Glu Pro Gly Thr Pro Ser Ser Ser Ala
                805                 810                 815
Ser Pro Ala Pro Ser Arg Asn Ala Ala Pro Thr Pro Lys Pro Gly Met
            820                 825                 830
Glu Pro Asp Glu Ile Asp Arg Pro Ser Asp Gly Thr Met Ala Gln Pro
        835                 840                 845
Thr Gly Gly Ala Ser Ala Pro Ser Ala Ala Pro Thr Gln Ala Ala Lys
    850                 855                 860
Ala Gly Ser Arg Leu Ser Arg Thr Gly Thr Asn Ala Leu Leu Ile Leu
865                 870                 875                 880
Gly Leu Ala Gly Val Ala Val Val Gly Gly Tyr Leu Leu Leu Arg Ala
                885                 890                 895
Arg Arg Ser Lys Asn
            900
<210>2
<211>394
<212>PRT
<213>粘性放线菌
<400>2
Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser Thr
 1               5                  10                  15
Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn Thr
            20                  25                  30
Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn Gly
        35                  40                  45
Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn Gly
    50                  55                  60
Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser Thr
65                  70                  75                  80
Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly Thr
                85                  90                  95
Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val Asp
            100                 105                 110
His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp Gln
        115                 120                 125
Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly Ile
    130                 135                 140
Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp Thr
145                 150                 155                 160
His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr Ala
                165                 170                 175
Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro His
            180                 185                 190
Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly Ala
        195                 200                 205
Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp Gln
    210                 215                 220
Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val Glu
225                 230                 235                 240
Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly Ser
                245                 250                 255
Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp Ser
            260                 265                 270
Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala Gln
        275                 280                 285
Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala Lys
    290                 295                 300
Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg Asp
305                 310                 315                 320
Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr Thr
                325                 330                 335
Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala Val
            340                 345                 350
Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn Gly
        355                 360                 365
Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp Leu
    370                 375                 380
Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu
385                 390
<210>3
<211>24
<212>PRT
<213>人类
<400>3
Asn Gly Arg Arg Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys
 1               5                  10                  15
Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser
            20
<210>4
<211>27
<212>PRT
<213>人类
<400>4
Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val
 1               5                  10                  15
Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser
            20                  25
<210>5
<211>34
<212>PRT
<213>人类
<400>5
Gln Ile His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn Cys Arg Leu Tyr Arg Lys
 1               5                  10                  15
Ala Asn Lys Ser Ser Lys Leu Val Ser Ala Asn Arg Leu Phe Gly Asp
            20                  25                  30
Lys Ser
<210>6
<211>34
<212>PRT
<213>人类
<400>6
Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg
 1               5                  10                  15
Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala Val Tyr Gln
            20                  25                  30
Ala Gly
<210>7
<211>12
<212>PRT
<213>人类
<400>7
Arg Arg Leu Arg Arg Met Glu Ser Glu Ser Glu Ser
 1               5                  10
<210>8
<211>21
<212>PRT
<213>人类
<400>8
Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg
 1               5                  10                  15
Lys Lys Lys Asn Pro
            20
<210>9
<211>400
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>9
Met Gly Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala
 1               5                   10                 15
Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro
            20                  25                  30
Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly
        35                  40                  45
Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg
    50                  55                  60
Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln
65                  70                  75                  80
Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val
                85                  90                  95
Val Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr
            100                 105                 110
Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg
        115                 120                 125
Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr
    130                 135                 140
Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp
145                 150                 155                 160
Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln lle Gln His Gly
                165                 170                 175
Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly
            180                 185                 190
Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr
        195                 200                 205
Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val
    210                 215                 220
Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp
225                 230                 235                 240
Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr
                245                 250                 255
Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn
            260                 265                 270
Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg
        275                 280                 285
Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser
    290                 295                 300
Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp
305                 310                 315                 320
Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile
                325                 330                 335
Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His
            340                 345                 350
Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn
        355                 360                 365
Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Lys Arg Lys Lys Lys
    370                 375                 380
Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg Lys Lys Lys Asn Pro
385                 390                 395             400
<210>10
<211>422
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>10
Met Val Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg
  1              5                  10                  15
Asn Arg Lys Lys Lys Asn Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp His Pro
            20                  25                  30
Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser Thr Glu Leu Pro Ala
        35                  40                  45
Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn Thr Ala Thr Asp Asn
    50                  55                  60
Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn Gly Asp Leu Leu Ile
65                  70                  75                  80
Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn Gly Gly Ser Asp Ala
                85                  90                  95
Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys
            100                 105                 110
Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly Thr Glu Thr Gly Lys
        115                 120                 125
Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val Asp His Gln Thr Gly
    130                 135                 140
Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp Gln Gly Trp Gly Gly
145                 150                 155                 160
Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly Ile Ile Gln Ala Glu
                165                 170                 175
Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp Thr His Arg Thr Ile
            180                 185                 190
Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr Ala Arg Phe Ala Ala
        195                 200                 205
Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro His Ala Gly Arg Leu
    210                 215                 220
Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly Ala Val Gln Ala Val
225                 230                 235                 240
Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp Gln Ala Gly Thr Pro
                245                 250                 255
Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val Glu Leu Ser Asp Gly
            260                 265                 270
Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly Ser Gly Phe Arg Lys
        275                 280                 285
Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp Ser Glu Pro Val Ser
    290                 295                 300
Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala Gln Ile Ile Arg Ala
305                 310                 315                 320
Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala Lys Val Leu Leu Leu
                325                 330                 335
Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg Asp Arg Gly Thr Ile
            340                 345                 350
Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr Thr Ser Lys Val Phe
        355                 360                 365
His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala Val Gln Ser Asp Gly
    370                 375                 380
Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn Gly Ala Asp Tyr Gly
385                 390                 395                 400
Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp Leu Gly Glu Gln Cys
                405                 410                 415
Gly Gln Lys Pro Ala Glu
            420
<210>11
<211>415
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>11
Met Gly Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala
 1               5                  10                  15
Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro
            20                  25                  30
Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly
        35                  40                  45
Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg
    50                  55                  60
Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln
65                  70                  75                  80
Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val
                85                  90                  95
Val Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr
            100                 105                 110
Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg
        115                 120                 125
Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr
    130                 135                 140
Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp
145                 150                 155                 160
Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly
                165                 170                 175
Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly
            180                 185                 190
Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr
        195                 200                 205
Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val
    210                 215                 220
Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp
225                 230                 235                 240
Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr
                245                 250                 255
Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn
            260                 265                 270
Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg
        275                 280                 285
Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser
    290                 295                 300
Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp
305                 310                 315                 320
Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile
                325                 330                 335
Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His
            340                 345                 350
Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn
        355                 360                 365
Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu Pro Ser Pro Ala
    370                 375                 380
Pro Ser Pro Thr Ala Ala Pro Ser Ala Ala Lys Arg Lys Lys Lys Gly
385                 390                 395                 400
Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg Lys Lys Lys Asn Pro
                405                 410                 415
<210>12
<211>404
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>12
Met Gly His His His His His His Leu Glu Gly Asp His Pro Gln Ala
 1              5                  10                  15
Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met
            20                  25                  30
Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg
        35                  40                  45
Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr
    50                  55                  60
Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn
65                  70                  75                  80
Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp
                85                  90                  95
Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val
            100                 105                 110
Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val Asp His Gln Thr Gly Thr Ile
        115                 120                 125
Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg
    130                 135                 140
Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser
145                 150                 155                 160
Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala
                165                 170                 175
Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly
            180                 185                 190
Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln
        195                 200                 205
Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val
    210                 215                 220
Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly
225                 230                 235                 240
Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu
                245                 250                 255
Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala
            260                 265                 270
His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys
        275                 280                 285
Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro
    290                 295                 300
Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His
305                 310                 315                 320
Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met
                325                 330                 335
Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu
            340                 345                 350
Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile
        355                 360                 365
Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile
    370                 375                 380
Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln
385                 390                 395                 400
Lys Pro Ala Glu
<210>13
<211>416
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>13
Met Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn
 1               5                  10                  15
Arg Lys Lys Lys Asn Pro Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro
            20                  25                  30
Ala Pro Asp Ala Ser Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln
        35                  40                  45
His Leu Ala Ala Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala lle
    50                  55                  60
Thr Thr Ala Pro Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro
65                  70                  75                  80
Lys Asp Asn Gly Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile
                85                  90                  95
Val Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr
            100                 105                 110
Tyr Ile His Gln Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp
        115                 120                 125
Pro Ser Tyr Val Val Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His
    130                 135                 140
Val Lys Ser Tyr Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp
145                 150                 155                 160
Pro Glu Asn Arg Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp
                165                 170                 175
Ash Gly Trp Thr Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys
            180                 185                 190
Asp Lys Pro Trp Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln
       195                 200                 205
Ile Gln His Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile
    210                 215                 220
Arg Thr Ala Gly Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp
225                 230                 235                 240
His Gly Lys Thr Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp
                245                 250                 255
Glu Asn Lys Val Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser
            260                 265                 270
Arg Ala Ser Asp Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp
        275                 280                 285
Gly Gly Gln Thr Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp
    290                 295                 300
Ser Val Asp Asn Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro
305                 310                 315                 320
Asp Asp Pro Arg Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro
                325                 330                 335
Arg Pro Trp Ser Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp
            340                 345                 350
Gly Ala Ser Trp Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly
        355                 360                 365
Tyr Thr Thr Ile Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser
    370                 375                 380
Glu Asp Ala His Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn
385                 390                 395                 400
Phe Thr Met Asn Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu
                405                 410                 415
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>Xaa可为任何天然产生的氨基酸
<400>14
Met Xaa Xaa Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly
 1               5                  10
<210>15
<211>374
<212>PRT
<213>人类
<220>
<223>蛋白酶抑制剂8(PI8)(Serpin B8)
<400>15
Met Asp Asp Leu Cys Glu Ala Asn Gly Thr Phe Ala Ile Ser Leu Phe
 1               5                  10                  15
Lys Ile Leu Gly Glu Glu Asp Asn Ser Arg Asn Val Phe Phe Ser Pro
            20                  25                  30
Met Ser Ile Ser Ser Ala Leu Ala Met Val Phe Met Gly Ala Lys Gly
        35                  40                  45
Ser Thr Ala Ala Gln Met Ser Gln Ala Leu Cys Leu Tyr Lys Asp Gly
    50                  55                  60
Asp Ile His Arg Gly Phe Gln Ser Leu Leu Ser Glu Val Asn Arg Thr
65                  70                  75                  80
Gly Thr Gln Tyr Leu Leu Arg Thr Ala Asn Arg Leu Phe Gly Glu Lys
                85                  90                  95
Thr Cys Asp Phe Leu Pro Asp Phe Lys Glu Tyr Cys Gln Lys Phe Tyr
            100                 105                 110
Gln Ala Glu Leu Glu Glu Leu Ser Phe Ala Glu Asp Thr Glu Glu Cys
        115                 120                 125
Arg Lys His Ile Asn Asp Trp Val Ala Glu Lys Thr Glu Gly Lys Ile
    130                 135                 140
Ser Glu Val Leu Asp Ala Gly Thr Val Asp Pro Leu Thr Lys Leu Val
145                 150                 155                 160
Leu Val Asn Ala Ile Tyr Phe Lys Gly Lys Trp Asn Glu Gln Phe Asp
                165                 170                 175
Arg Lys Tyr Thr Arg Gly Met Leu Phe Lys Thr Asn Glu Glu Lys Lys
            180                 185                 190
Thr Val Gln Met Met Phe Lys Glu Ala Lys Phe Lys Met Gly Tyr Ala
        195                 200                 205
Asp Glu Val His Thr Gln Val Leu Glu Leu Pro Tyr Val Glu Glu Glu
    210                 215                 220
Leu Ser Met Val Ile Leu Leu Pro Asp Asp Asn Thr Asp Leu Ala Val
225                 230                 235                 240
Val Glu Lys Ala Leu Thr Tyr Glu Lys Phe Lys Ala Trp Thr Asn Ser
                245                 250                 255
Glu Lys Leu Thr Lys Ser Lys Val Gln Val Phe Lcu Pro Arg Leu Lys
            260                 265                 270
Leu Glu Glu Ser Tyr Asp Leu Glu Pro Phe Leu Arg Arg Leu Gly Met
        275                 280                 285
Ile Asp Ala Phe Asp Glu Ala Lys Ala Asp Phe Ser Gly Met Ser Thr
    290                 295                 300
Glu Lys Asn Val Pro Leu Ser Lys Val Ala His Lys Cys Phe Val Glu
305                 310                 315                 320
Val Asn Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ala Ala Ala Thr Ala Val Val Arg
                325                 330                 335
Asn Ser Arg Cys Ser Arg Met Glu Pro Arg Phe Cys Ala Asp His Pro
            340                 345                 350
Phe Leu Phe Phe Ile Arg Arg His Lys Thr Asn Cys Ile Leu Phe Cys
        355                 360                 365
Gly Arg Phe Ser Ser Pro
    370
<210>16
<211>4176
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒载体PTrc99A
<400>16
gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 60
ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 120
gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180
tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga 240
taacaatttc acacaggaaa cagaccatgg aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta 300
gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc 360
tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca 420
gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg 480
atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga 540
aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc 600
ctgagtagga caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg 660
tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg 720
acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact ctttttgttt atttttctaa atacattcaa 780
atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 840
agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 900
ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 960
gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 1020
gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 1080
tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 1140
acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 1200
aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 1260
cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 1320
gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 1380
cgatgcctac agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 1440
tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 1500
tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 1560
ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 1620
tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 1680
gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1740
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1800
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1860
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1920
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1980
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 2040
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 2100
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 2160
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 2220
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 2280
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 2340
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 2400
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 2460
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 2520
acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 2580
gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 2640
cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 2700
tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc 2760
gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 2820
gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg 2880
gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agcagatcaa 2940
ttcgcgcgcg aaggcgaagc ggcatgcatt tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc 3000
tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa 3060
ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc 3120
gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg 3180
gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg 3240
ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg 3300
attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc 3360
ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg 3420
atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat 3480
gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat tattttctcc 3540
catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc 3600
gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat 3660
aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc 3720
atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg 3780
ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg 3840
cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat 3900
atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac 3960
cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca 4020
ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 4080
gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg 4140
caacgcaatt aatgtgagtt agcgcgaatt gatctg                           4176
<210>17
<211>415
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>DAS181
<400>17
Met Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser
 1               5                  10                  15
Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn
            20                  25                  30
Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn
        35                  40                  45
Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn
    50                  55                  60
Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser
65                  70                  75                  80
Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly
                85                  90                  95
Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val
            100                 105                 110
Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp
        115                 120                 125
Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly
    130                 135                 140
Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp
145                 150                 155                 160
Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr
                165                 170                 175
Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro
            180                 185                 190
His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly
        195                 200                 205
Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp
    210                 215                 220
Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val
225                 230                 235                 240
Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly
                245                 250                 255
Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp
            260                 265                 270
Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala
        275                 280                 285
Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala
    290                 295                 300
Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg
305                 310                 315                 320
Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr
                325                 330                 335
Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala
            340                 345                 350
Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn
        355                 360                 365
Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp
    370                 375                 380
Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Lys Arg Lys Lys Lys Gly
385                 390                 395                 400
Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg Lys Lys Lys Asn Pro
                405                 410                 415