本发明一般涉及治疗糖尿病患者的方法。更具体地说，本发明 涉及单体胰岛素类似物的肺传递以通过肺而系统吸收，从而显著降 低或消除通过注射给予单体胰岛素类似物的需要。

自从在二十世纪二十年代引入胰岛素以来，对改善糖尿病的治 疗已取得了不断进步。已经在胰岛素纯度和可用性方面取得重要进 展，也已经研制了具有不同作用时间的各种制剂。需要非注射型胰 岛素以增加患者对强胰岛素治疗的顺从性以及降低其并发症风险。

糖尿病是影响约6％世界人口的疾病。此外，大多数国家的人口 老化，而糖尿病在老年人口中特别常见。通常就是这个人群经历难 以或不愿意自我注射给予胰岛素。在美国约有5％的人患有糖尿病， 而这些糖尿病患者的约三分之一通过皮下注射每天自我给予一剂或 多剂胰岛素。这种类型的强治疗是降低血糖水平所必需的。高水平 的血糖是由于低水平或缺乏内源性胰岛素引起的，它改变正常的人 体化学，并可能导致许多器官的微血管系统衰竭。未治疗的糖尿病 患者常常经受切断术和遭受失明以及肾衰竭。据估计仅在美国糖尿 病副作用的医学治疗和由于糖尿病的不当治疗引起的生产力丧失的 年费用约400亿美元。

涉及1，441例Ⅰ型糖尿病患者的九年糖尿病控制和并发症实验 (DCCT)证实，血糖水平维持在高精度范围内可降低糖尿病并发症的 频率和严重程度。常规的胰岛素治疗涉及每天仅注射两次。在所述 DCCT研究中的强胰岛素治疗涉及每天注射胰岛素三次或三次以上。 在该研究中，糖尿病副作用的发生率显著降低。例如在用强疗法的 患者中，视网膜病变降低50-76％，肾脏病变降低35-56％以及神经病 变降低60％。

遗憾的是，由于与维持葡萄糖水平的精确控制需要的多次注射 有关的不舒服，许多糖尿病患者不愿意接受强治疗。该类型治疗可 能在心理和生理上均是痛苦的。口服后，胰岛素迅速在胃肠道降解 而不能吸收入血流。因此，许多研究者已经研究了给予胰岛素的替 代途径，例如口服、直肠、经皮和鼻途径。然而迄今这些给药途径 仍未产生有效的胰岛素吸收。

多年来，已知某些蛋白可以由肺吸收。实际上，胰岛素以吸入 气溶胶给到肺在1925年由Gaensslen首次报道。尽管事实是许多人 类和动物研究已表明某些胰岛素制剂可以通过肺吸收，但是肺传递 作为有效治疗糖尿病的手段仍未获得广泛接受。部分原因是相对于 传递量而言吸收的胰岛素量小。另外，在肺传递不同胰岛素制剂甚 至多剂相同制剂在不同时间传递后，研究人员已经观察到吸收的胰 岛素量变异幅度大。

因此，需要提供通过肺途径传递胰岛素的有效可靠的方法。这 种需要对于用速效人单体胰岛素类似物进行攻击性治疗(aggressive treatment)方案的患者特别明显。如果需要快速降低血糖浓度，例如 餐后或不用胰岛素疗法较长时间后，速效人单体胰岛素类似物的有 效肺传递将具有该效应。

显然，不是所有蛋白均可以在肺中有效吸收。有很多因素影响 蛋白是否可以通过肺有效传递。经肺吸收在较大程度上取决于待传 递的特定治疗蛋白的物理特性。所以，尽管已经观察了正规人胰岛 素的肺传递，但是正规人胰岛素和速效单体胰岛素类似物之间的物 理差异，使得不清楚这些类似物是否可以经肺途径有效传递。

蛋白的有效肺传递取决于将所述蛋白传递到深部肺泡上皮的能 力。沉积在上呼吸道上皮的蛋白很大程度上不被吸收。这是因为上 面覆盖的粘液约30-40μm厚并是吸收障壁。另外，沉积在该上皮的 蛋白由粘液纤毛沿所述呼吸道向上运输而被清除，然后经胃肠道清 除。该机制也大致上造成某些蛋白颗粒的吸收低。蛋白不被吸收而 经这些途径消除的程度取决于其可溶性、大小和其它缺少了解的特 性。

难以预测的是，治疗蛋白即使成功传递至深部肺泡上皮，是否 可以由肺快速运送到血液。已经计算了经肺传递的某些蛋白的吸收 值，其范围从甲状旁腺素(片段1-34)的15分钟至糖基化α1-抗胰蛋白 酶的48小时。因为在肺中存在范围广泛的肽酶，较长的吸收时间增 加所述蛋白吸收前显著降解或经粘液纤毛转运清除的可能性。

胰岛素是分子量约5，800道尔顿的肽激素。在存在锌的情况下， 人胰岛素自缔合为稳定的六聚体型。据信所述稳定六聚体的离解是 胰岛素由皮下注射部位吸收入血流的限速步骤。但是速效胰岛素类 似物不易形成稳定的六聚体。因为这些类似物不易自缔合成稳定的 高级复合物，所以称为单体胰岛素类似物。这种自缔合的缺乏是由 于人胰岛素的氨基酸序列中的修饰引起的，所述修饰通过破坏二聚 体形成而减少缔合。遗憾的是，对胰岛素的修饰使得这些类似物成 单体，还导致单体非特异性凝集。这种非特异性凝集可使所述类似 物不溶和不稳定。

因此，由于单体胰岛素类似物的固有不稳定性、形成不溶性胰 岛素类似物沉淀的可能性、胰岛素和单体胰岛素类似物之间的物理 差异以及在经肺传递的正规人胰岛素吸收方面的高度变异性，令人 惊奇的是，气溶胶化单体胰岛素类似物制剂可以重复而有效地经肺 传递。最为有益而意外的发现是，与用正规人胰岛素获得的数据相 比，吸入体积的改变不会导致在所述单体胰岛素类似物的药代动力 学或药效学上产生可检测的差异，特别是LysB28ProB29-人胰岛素。此 外，令人吃惊的是，LysB28ProB29-人胰岛素传递后由肺的吸收至少与 皮下给予后一样迅速。

本发明涉及给予单体胰岛素类似物的方法，包括通过肺途径对 需要其的患者给予有效量的所述单体胰岛素类似物。本发明还涉及 治疗糖尿病的方法，包括通过肺途径对需要其的患者给予有效量的 单体胰岛素类似物。本发明的另一方面涉及治疗高血糖症的方法， 包括通过肺途径对需要其的患者给予有效量的单体胰岛素类似物。 最好是，所述单体胰岛素类似物通过吸入传递到所述患者的下呼吸 道。

可以采用适合吸入给予的各种装置中的任何一种，将所述单体 胰岛素类似物在载体中作为溶液或悬浮液、或作为干粉传递。最好 是，所述单体胰岛素类似物以有效到达肺的下呼吸道的颗粒大小传 递。优选的单体胰岛素类似物的颗粒大小小于10微米。甚至更优选 的单体胰岛素类似物的颗粒大小为1-5微米。

图1图示LysB28ProB29-人胰岛素的气溶胶传递后，在小猎犬中的 平均葡萄糖反应与时间的关系曲线。

本文使用的术语“胰岛素”是指哺乳动物胰岛素，例如牛、猪 或人胰岛素，所述胰岛素的序列和结构是本领域已知的。人胰岛素 的氨基酸序列和空间结构是众所周知的。人胰岛素由通过二硫键交 联的21个氨基酸的A链和30个氨基酸的B链组成。正常交联的人 胰岛素含有3个二硫桥：一个在A链7位和B链7位之间、第二个 在A链20位和B链19位之间、第三个在A链6位和11位之间。

术语“胰岛素类似物”是指具有A链和B链、其氨基酸序列分 别与人胰岛素的A链和B链大致相同的蛋白，但是所述序列因具有 不破坏所述胰岛素类似物的胰岛素活性的一个或多个氨基酸缺失、 一个或多个氨基酸取代和/或一个或多个氨基酸插入，而不同于人胰 岛素的A链和B链。

一种类型的胰岛素类似物“单体胰岛素类似物”是本领域众所 周知的。这些是人胰岛素的速效类似物，包括例如这样的单体胰岛 素类似物，其中： a)用Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代B28位的氨酰基残基，而B29 位的氨酰基残基是Lys或Pro；b)B28、B29和B30位的氨酰基残基 缺失；或c)B27位的氨酰基残基缺失。优选的单体胰岛素类似物是 AspB28。甚至更优选的单体胰岛素类似物是LysB28ProB29。

单体胰岛素类似物公开于Chance等，美国专利第5，514，646号； Chance等，美国专利申请系列第08/255，297号；Brems等，Protein Engineering，5：527-533(1992)；Brange等，EPO公布号第214，826 号(于1987年3月18日公布)；和Brange等，Current Opinion in Structural Biology，1：934-940(1991)。为了描述单体胰岛素类似物，这 些说明书特别通过引用结合到本文中。

胰岛素类似物也可以具有以酸型氨基酸取代酰胺化氨基酸的取 代。例如，Asn可以用Asp或Glu取代。同样，Gln可以用Asp或Glu 取代。具体来说，Asn(A18)、Asn(A21)或Asp(B3)或这些残基的任意 组合可以由Asp或Glu取代。此外，Gln(A15)或Gln(B14)或这二者 可以由或Asp或Glu取代。

术语“防腐剂”是指加入药用制剂中以抗微生物剂发挥作用的 化合物。胃肠外制剂必须符合对工业上可行的多用途产品的防腐效 果准则。作为胃肠外制剂中有效并可接受、本领域已知的防腐剂有 苯扎氯铵、苯索氯铵、氯己定、苯酚、间甲苯酚、苄醇、羟苯甲酸 甲酯、氯丁醇、邻甲苯酚、对甲苯酚、氯甲苯酚、硝酸苯汞、乙基 汞硫代水杨酸钠、苯甲酸和其各种混合物。参见例如Wallh_usser，K. -H.，Develop.Biol.Standard，24：9-28(Basel，S.Krager，1974)。已知某 些酚类防腐剂(例如苯酚和间甲苯酚)结合胰岛素样分子，由此诱导提 高物理或化学或物理化学稳定性的构象变化[Birnbaum等，Pharmac. Rrs.14：25-36(1997)；Rahuel-Clermont等，Biochemistry 36：5837- 5845(1997)]。间甲苯酚和苯酚是在用于本发明的所述单体胰岛素类 似物制剂中的优选防腐剂。

术语“缓冲剂”或“药学上可接受的缓冲剂”是指已知用于胰 岛素制剂是安全的、并具有控制所述制剂的pH于所述制剂需要的pH 的作用的化合物。用于控制pH于中度酸性pH至中度碱性pH的药 学上可接受的缓冲剂包括，例如，诸如磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、 TRIS、精氨酸或组氨酸的化合物。

术语“等渗剂”是指生理上可耐受并赋予制剂合适张力以防止 水净流过所述细胞膜的化合物。为此普遍使用已知浓度的诸如甘油 的化合物。其它可接受的等渗剂包括盐类(例如NaCl)、葡萄糖、甘 露醇和乳糖。优选浓度为12-25mg/mL的甘油作为等渗剂。 单体胰岛素类似物的给予

单体胰岛素类似物以剂量有效方式吸入给予，以提高循环的胰 岛素蛋白水平和/或降低循环的葡萄糖水平。这种给予对治疗诸如糖 尿病或高血糖症的疾病可能是有效的。达到有效剂量的单体胰岛素 类似物需要给予的吸入剂量为高于约0.5μg/kg-约50μg/kg单体胰岛 素类似物蛋白，优选约3μg/kg-约20μg/kg，最优选约7μg/kg-约 14μg/kg。治疗有效量可由有经验的从业医师确定，所述从业医师将 考虑的因素包括胰岛素蛋白水平、血糖水平、所述患者的身体状况、 所述患者的肺状况等。

按照本发明，单体胰岛素类似物经吸入传递以达到快速吸收这 些类似物。吸入给予可以产生与皮下给予胰岛素相当的药代动力学。 吸入单体胰岛素类似物导致循环的胰岛素水平快速升高，接着血糖 水平快速下降。当比较相似的颗粒大小和相似的肺沉积水平时，不 同吸入装置通常提供相似的药代动力学。

按照本发明，单体胰岛素类似物可以用本领域已知的、用于吸 入给予治疗剂的各种吸入装置中的任何一种传递。这些装置包括计 量剂量吸入器、雾化器、干粉生成器、喷雾器等。单体胰岛素类似 物优选经干粉吸入器或喷雾器传递。用于给予单体胰岛素类似物的 吸入装置具有几种需要的特性。例如，经吸入装置传递的优势是可 靠、可重复和准确。所述吸入装置应该传递小颗粒以利于良好呼吸， 例如小于约10μm，优选约1-5μm。适合实施本发明的市售吸入装 置的某些具体实例有TurbohalerTM(Astra)、Rotahaler_(Glaxo)、Diskus_ (Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、Inhale Therapeutics销售的装置、 AERxTM(Aradigm)、Ultravent_雾化器(Mallinckrodt)、AcornⅡ_雾化器 (Marquest Medical Products)、Ventolin_计量剂量吸入器(Glaxo)、 Spinhaler_粉剂吸入器(Fisons)等。

本领域技术人员会认识到，单体胰岛素类似物蛋白的制剂、所 传递制剂的量和单剂量的给药时间取决于所用吸入装置的类型。对 于某些气溶胶传递系统，例如雾化器，给药频率和所述系统活化时 间长短主要取决于气溶胶中的单体胰岛素类似物蛋白的浓度。例如， 较短的给药时间可用于雾化器溶液中较高浓度的单体胰岛素类似物 蛋白。诸如计量剂量吸入器的装置可以产生较高的气溶胶浓度，并 可操作用于较短时间传递需要量的单体胰岛素类似物蛋白。诸如干 粉吸入器的装置传递活性药物直到给定的治疗剂装料由所述装置喷 出。在该类型吸入器中，一定量的所述粉剂中的单体胰岛素类似物 蛋白的量决定了单次给药所传递的剂量。

在由所述吸入装置传递的制剂中，所述单体胰岛素类似物蛋白 的颗粒大小对于使所述蛋白进入肺以及优选进入下呼吸道或肺泡的 能力是重要的。优选配制所述单体胰岛素类似物使得至少约10％所 传递的单体胰岛素类似物蛋白沉积在肺中，优选约10％-约20％或更 高。已知对于口呼吸的人，用颗粒大小约2μm-约3μm获得最大 效率的肺沉积。当颗粒大小大于约5μm时，肺沉积明显减少。小于 约1μm的颗粒大小导致肺沉积减少，并使得难以传递具有治疗上有 效的足够质量的颗粒。因此，吸入传递的单体胰岛素类似物蛋白颗 粒的颗粒大小优选小于约10μm，更优选范围约1μm-约5μm，最 优选范围约2μm-约3μm。选择单体胰岛素类似物蛋白制剂以在选 定的吸入装置中产生所需要的颗粒大小。 用干粉吸入器给予单体胰岛素类似物

为了有利于以干粉给予，单体胰岛素类似物蛋白以颗粒大小小 于约10μm、优选约1μm-约5μm、最优选约2μm-约3μm的颗 粒型制备。优选的颗粒大小为有效传递到所述患者肺泡的大小。最 好是，所述干粉主要由所产生的颗粒组成，从而使得大多数颗粒的 大小在所需要的范围内。最好是至少约50％的所述干粉是直径小于 约10μm的颗粒。这类制剂可以通过含单体胰岛素类似物蛋白和其 它需要成分的溶液的喷雾干燥、制粉或临界点凝结获得。也适合产 生可用于本发明的颗粒的其它方法是本领域已知的。

所述颗粒通常与容器中的干粉制剂分开，然后通过载气流运送 入患者肺中。通常，在目前的干粉吸入器中，仅由患者的吸入提供 破碎所述固体的力。一种合适的干粉吸入器是Astra(S_dertalje，瑞典) 生产的TurbohalerTM。在另一种类型吸入器中，由患者吸入产生的气 流驱动使所述单体胰岛素类似物颗粒解凝集的叶轮马达。Dura SpirosTM吸入器就是这样一种装置。

用于由干粉吸入器给予的单体胰岛素类似物制剂通常包括含单 体胰岛素类似物蛋白的细碎干粉剂，但是所述粉剂也可以含有增量 剂、载体、赋形剂、另一添加剂等。添加剂可以包含于单体胰岛素 类似物蛋白的干粉制剂中，例如以便根据需要稀释干粉以由所述特 定粉剂吸入器传递、以有助于所述制剂的加工、以便为所述制剂提 供有利的粉剂特性、以有利于由所述吸入装置分散所述粉剂、以稳 定所述制剂(例如，抗氧化剂或缓冲剂)、以赋予所述制剂味道等。 有益的是，所述添加剂不会负面影响患者的气道。所述单体胰岛素 类似物蛋白可以在分子水平与添加剂混合，或所述固体制剂可以包 括与所述添加剂颗粒混合的单体胰岛素类似物蛋白颗粒或所述单体 胰岛素类似物蛋白包衣于所述添加剂颗粒上的颗粒。典型的添加剂 包括单糖、双糖和多糖；糖醇类和其它多元醇类，诸如例如，乳糖、 葡萄糖、棉籽糖、松三糖、乳糖醇、麦芽糖醇、海藻糖、蔗糖、甘 露醇、淀粉或它们的组合物；表面活性剂，例如山梨醇、二磷脂酰 胆碱或卵磷脂等。通常添加剂(例如增量剂)以上述目的的有效量存 在，常常为所述制剂重量的约50％-约90％。本领域已知的用于诸 如胰岛素类似物蛋白的蛋白制剂的其它添加剂也可以包含于所述制 剂中。

LysB28ProB29-人胰岛素的Humalog_干粉制剂经吸入给予是治疗 糖尿病的优选方法。 以喷雾剂给予单体胰岛素类似物

含单体胰岛素类似物蛋白的喷雾剂可以通过迫使单体胰岛素类 似物蛋白悬浮液或溶液加压下通过喷嘴而产生。可以选择所述喷嘴 的大小和构型、所用的压力和所述液体的进料速率以获得所需要的 输出量和颗粒大小。例如通过与毛细管或喷嘴进料装置(nozzle feed) 连接的电场可以产生电子喷雾。有利的是，经喷雾器传递的单体胰 岛素类似物蛋白颗粒的颗粒大小小于约10μm，优选范围约1μm-约 5μm、最优选约2μm-约3μm。

适合用喷雾器使用的单体胰岛素类似物蛋白制剂通常包括浓度 为每ml溶液含约1mg-约20mg单体胰岛素类似物蛋白的单体胰 岛素类似物蛋白水溶液。所述制剂可以含有的药剂例如赋形剂、缓 冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂并优选含有锌。所述制剂也可 以含有稳定所述单体胰岛素类似物蛋白的赋形剂或药剂，例如缓冲 剂、还原剂、填充蛋白或糖类。用于配制单体胰岛素类似物蛋白的 填充蛋白包括白蛋白、鱼精蛋白等。通常用于配制单体胰岛素类似 物蛋白的糖类包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。所述 单体胰岛素类似物蛋白制剂也可以含有表面活性剂，它可以减少或 防止在形成气溶胶时所述溶液雾化引起的所述单体胰岛素类似物蛋 白的表面诱导的凝集。可以使用各种常规表面活性剂，例如聚氧乙 烯脂肪酸酯和醇类以及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。用量范围一般为 所述制剂重量的0.001-4％。用于本发明目的的特别优选的表面活性 剂是聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、多乙氧基醚80、多乙氧基醚20等。 用于诸如胰岛素类似物蛋白的蛋白制剂的本领域已知的其它的药剂 也可以包含于所述制剂中。 用雾化器给予单体胰岛素类似物

单体胰岛素类似物蛋白可以经雾化器给予，例如喷射式雾化器 或超声雾化器。通常在喷射式雾化器中，压缩空气源用来产生通过 喷嘴的高速空气射流。随着所述气体膨胀到所述喷嘴以外，产生低 压区，它通过连接至液体贮存器的毛细管抽吸单体胰岛素类似物蛋 白液。来自所述毛细管的液体流当其离开所述毛细管时被剪切为不 稳定丝和微滴，产生所述气溶胶。可以应用各种构型、流速和折流 板类型以由给定的喷射式雾化器获得所需要的性能特性。在超声雾 化器中，用高频电能来产生振动的机械能，通常应用压电变换器。 该能量或者直接传递或经过偶合流体传递至单体胰岛素类似物蛋白 制剂，从而产生含所述单体胰岛素类似物蛋白的气溶胶。有利的是， 由雾化器传递的单体胰岛素类似物蛋白颗粒的颗粒大小小于约10 μm，优选范围约1μm-约5μm、最优选约2μm-约3μm。

适合用雾化器(或者为喷气式雾化器或者为超声雾化器)使用的单 体胰岛素类似物蛋白制剂通常包括浓度为每ml溶液含约1mg-约20 mg单体胰岛素类似物蛋白的单体胰岛素类似物蛋白水溶液。所述制 剂可以含有的药剂例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活 性剂并优选含有锌。所述制剂也可以含有稳定所述单体胰岛素类似 物蛋白的赋形剂或药剂，例如缓冲剂、还原剂、填充蛋白或糖类。 可用于配制单体胰岛素类似物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、鱼精蛋 白等。通常用于配制单体胰岛素类似物蛋白的糖类包括蔗糖、甘露 醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。所述单体胰岛素类似物蛋白制剂也 可以含有表面活性剂，它可以减少或防止在形成气溶胶时所述溶液 雾化引起的所述单体胰岛素类似物蛋白的表面诱导的凝集。可以使 用各种常规表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇类以及聚氧乙 烯山梨醇脂肪酸酯。用量范围一般为所述制剂重量的0.001-4％。用 于本发明目的的特别优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨醇酐单油酸 酯、多乙氧基醚80、多乙氧基醚20等。用于诸如胰岛素类似物蛋白 的蛋白制剂的本领域已知的其它药剂也可以包含于所述制剂中。 用计量剂量吸入器给予单体胰岛素类似物

在计量剂量吸入器(MDI)中，抛射剂、单体胰岛素类似物蛋白和 任何赋形剂或其它添加剂以包含液化压缩气的混合物盛于罐(canister) 中。所述计量阀的开启释放作为气溶胶的混合物，所述混合物优选 含有的颗粒大小小于约10μm，优选约1μm-约5μm、最优选约2μm -约3μm。通过采用本领域技术人员已知的各种方法生产的单体胰岛 素类似物制剂，可以获得所需要的气溶胶颗粒大小，所述方法包括 喷射研磨、喷雾干燥、临界点凝聚等。优选的计量剂量吸入器包括3M 或Glaxo生产并用氟代烃(hydrofluorocarbon)抛射剂的吸入器。

用于用计量剂量吸入器装置使用的单体胰岛素类似物蛋白制剂 一般包括含单体胰岛素类似物蛋白的细碎粉剂，所述粉剂为非水介 质中的悬浮物，例如借助于表面活性剂悬浮于抛射剂中。所述抛射 剂可以是用于该目的的任何常规物质，例如含氯氟烃 (chlorofluorocarbon)、氯代氟代烃(hydrochlorofluorocarbon)、氟代烃、 或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四 氟乙烷、HFA-134a(氟代链烷-134a)、HFA-227(氟代链烷-227)等。所 述抛射剂最好是氟代烃。可以选择所述表面活性剂以稳定作为所述 抛射剂中的悬浮物的单体胰岛素类似物蛋白，以保护所述活性剂对 抗化学降解等。合适的表面活性剂包括失水山梨醇三油酸酯、大豆 卵磷脂、油酸等。在某些情况下，优选用诸如乙醇的溶剂的溶液气 溶胶类。用于诸如胰岛素类似物蛋白的蛋白制剂的本领域已知的其 它药剂，也可以包含于所述制剂中。

本领域技术人员将认识到，可以通过经非本文所述装置肺部给 予单体胰岛素类似物实施本发明的方法。 单体胰岛素类似物蛋白的药用制剂

本发明还涉及含单体胰岛素类似物蛋白并适合经吸入给予的药 用组合物或制剂。按照本发明，单体胰岛素类似物蛋白可以用于生 产适合吸入给予的制剂或药物。本发明还涉及生产含单体胰岛素类 似物蛋白、适合吸入给予的剂型制剂的方法。例如，用常规技术， 可以以几种方式生产干粉制剂。大小范围适合在下呼吸道中最大沉 积的颗粒可以通过微粉化、碾磨、喷雾干燥等制得。而液体制剂的 制造可以将所述单体胰岛素类似物蛋白溶于合适pH的合适溶剂(诸 如水)中，所述溶剂包括缓冲剂或其它赋形剂。

一种用于将通过所述肺途径给予的特定单体胰岛素类似物蛋白 的特定药用组合物为Humalog_。Humalog_制剂描述于DeFelippis， 美国专利第5，461，031号；Bakaysa等，美国专利第5，474，978号；和 Baker等，美国专利第5，504，188号。为了描述各种单体胰岛素类似 物制剂，这些说明书特别通过引用结合到本文。其它制剂包括单独 的无菌水溶液和含低浓度表面活性剂、和/或防腐剂、和/或稳定剂、 和/或缓冲剂的水溶液。其它合适的具锌单体胰岛素类似物制剂是本 领域技术人员已知的。

参考以下实施例可以更好地理解本发明。这些实施例是本发明 的典型的具体实施方案，而不是为了限制本发明的范围。 实施例1：

在小猎犬中肺部给予单剂气溶胶剂量后LysB28ProB29-人胰岛素的 血清药代动力学

LysB28ProB29-人胰岛素(LysB28ProB29-hI)的气溶胶由LysB28ProB29-hI 的无菌水溶液产生，由超声雾化器经气管内插管通过肺途径给予麻 醉的狗。用有效的放射免疫分析方法测定免疫反应性LysB28ProB29-hI 的血清浓度。

6只小猎犬(3只雌性和3只雄性)用于本研究。所述动物或者每 笼饲养2只或者单独饲养于具有悬起的网状底板的不锈钢笼中。开 始，所有猎犬每天喂饲约450g Purina鉴定的犬粮(Certified Canine Diet) 5007。给药前动物禁食约8小时。由麻醉状态恢复后，随意供给食 物和水直到给药后48小时。初始的日饲养制度开始于给药后48小 时。在研究开始，所述动物重量为12.5-17.6kg。

给药后在不同时间点收集血标本，以测定所述LysB28ProB29-hI的 血浆浓度和测定所吸入物质的生物利用度。选择犬是因为它们是具 有与人相似的呼吸道颗粒沉积的大动物。

如所有狗的血清中升高的免疫反应性LysB28ProB29-hI浓度所示， 肺部给予LysB28ProB29-hI导致系统暴露。           表1：肺传递后随时间而变的LysB28ProB29-hI                   血清浓度(ng/mL)示于表1： a所用的缩写：h，小时；M，雄性；F，雌性；N，计算用的动物数；SD，标准差；SEM， 所述均值的标准误；BLQ，低于定量极限(＜0.25ng/mL)。为了计算，BLQ定为0值。 bN.S=无样品。给药前(0h)未从狗27258收集血清。 肺部给予产生免疫反应性胰岛素迅速升高，大多数狗在暴露于所述 气溶胶后约5-20分钟达到峰浓度(Tmax)。

  表2：经肺传递的LysB28ProB29-hI的药代动力学参数 所用的缩写：kg，公斤；μg，微克；ng，纳克；mL，毫升；h，小时； Cmax，最大血清浓度；Tmax，达到最大血清浓度的时间； ${\mathrm{AUC}}_0^t$ ，从 给药时间到回到基线的曲线下面积；t’“回到基线”；β，终末速率 常数；t1/2，半衰期；M，雄性；F，雌性；SD，标准差；％CV，变 异系数百分率；N，计算用的动物数。

所述数据表明，肺部给予气溶胶化LysB28ProB29-hI在小猎犬血清 中产生可检测浓度的免疫反应性LysB28proB29-hI。LysB28ProB29-hI快速 吸收，在30分钟以内达到平均最大浓度。免疫反应性LysB28proB29-hI 血清浓度下降的平均半衰期约40分钟。在LysB28proB29-hI的传递和 沉积上未发现明显的性别差异。血糖值显示，吸入LysB28proB29-hI后， 下降至其禁食狗的对照值的约55％(图1)。用γ摄像机检测锝99测定， 产生这些效应需要的平均肺剂量约7μg/kg，所述锝99用作所述气溶 胶微滴的放射性标记。与皮下注射后所观察到的相比，吸入 LysB28proB29-hI的葡萄糖值下降所用的时间略少。

                  实施例2：

肺部给予后AspB28-人胰岛素在小猎犬中的吸收

AspB28-人胰岛素以气溶胶用头罩系统传递到清醒的小猎犬。收 集血标本以测定暴露后的血清葡萄糖水平和血清AspB28-人胰岛素水 平。选择犬用于本研究是因为它们是具有与人相似的呼吸道颗粒沉 积的大动物。

6只雌性小猎犬用于本研究。所述动物或者每笼饲养2只或者单 独饲养于具有悬起的网状底板的不锈钢笼中。所有动物每天喂饲约 450g Hill’s Science Diet。给药前动物禁食约12小时。在研究开始， 所述动物重量为10.8-14.1kg。

将所有狗暴露于AspB28-人胰岛素的气溶胶，同时用限制悬带固 定保持。将一条0.03英寸胶乳片置于所述动物颈部周围以形成非限 制性密封标志。将定制的11-L头罩置于所述狗头部并固定在所述限 制装置上。通过所述头罩的总流速约11-15L/分钟。用输入速率约 7.5L/分钟的雾化器产生气溶胶。所述发生器装有6mL含2.4mg AspB28-人胰岛素/mL的无菌水溶液和100-500μCi99mTC。。所述发生 器的输出物直接流入头罩。在每次以1L/分钟的流速暴露15分钟期 间，收集一个重量分析标本。目标肺剂量为10mg/kg。实际沉积的 肺剂量通过暴露后立即用γ照像机成像测定。

于0时(暴露前)、暴露后0.08、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3 和4小时收集血标本以测定血清葡萄糖水平和血清AspB28-人胰岛素 水平。每只狗暴露于AspB28-人胰岛素的平均暴露浓度范围为17.9-30.5 μg/L。所有动物的平均(±标准差)浓度为22.4±4.3μg/L。计算沉 积在6只狗的肺中的平均AspB28-人胰岛素剂量为10±5μg/kg(均值 ±标准差)。平均吸入剂量为287±107μg/kg(均值±标准差)。单个 动物的数据示于以下的表3。 表3： 　动物　　　　目标　　　　吸入的　　　　估测的 　编号　　　　沉积　　　　剂量　　　　　沉积 　　　　　　　的肺　　　　(μg/kg)　　　　肺剂量 　　　　　　　剂量(μg/kg)　　　　　　　　(μg/kg) 　27682　　　10　　　　　230　　　　　8.48 　27684　　　10　　　　　210　　　　　8.15 　27685　　　10　　　　　230　　　　　8.47 　27686　　　10　　　　　320　　　　　4.94 　27687　　　10　　　　　240　　　　 11.88 　27689　　　10　　　　　490　　　　 19.60　

如所有狗的血清中升高的免疫反应性AspB28-人胰岛素浓度所 示，肺部给予AspB28-人胰岛素引起系统暴露。用Coat-A-Count胰岛 素RIA试剂盒(Diagnostic Products，Los Angeles，California)测定肺传 递后随时间变化的AspB28-人胰岛素血清浓度。

表4：肺传递后随时间变化的AspB28-人胰岛素血清浓度(ng/mL)

肺部给予AspB28-人胰岛素后还检测血清葡萄糖的变化(表5)。用 Hitachi Chemistry System(Boehringer Mannheim Corp.，Indpls，IN)测定 血清葡萄糖。肺部给予后于暴露后1小时，观察到血清葡萄糖水平 相对于对照的最大下降百分率。给予约10μg/kg沉积的肺剂量后观 察到约40％和70％的下降。 表5：

肺部给予AspB28-人胰岛素获得测试项目高于给药前水平的可检 测水平。皮下和肺部给予后的药代动力学参数的比较示于表6。 表6： 　　传递途径　　　　　　AUC　　　　　　Cmax　　　　　　Tmax(h) 　　　　　　　　　　　(ng·h/mL)　　　　(ng/mL)　　　　 (均值±SEM)　 　　　　　　　　　　 (均值±SEM)　　 (均值±SEM)　 　　皮下　　　　　　10.30±0.47　　　　5.57±0.35　　　　0.42±0.05 　　肺　　　　　　　5.21±0.47　　　　 3.04±0.42　　　　0.21±0.07　　

肺部给予的AUC产生自-0.25-2小时(此时血糖水平大约回到基 线)；皮下给予的AUC产生自0-4小时(此时血糖水平大约回到基 线)。然后通过减去内源性犬胰岛素的基线水平，从而调整这些AUC 值。减去所述内源性胰岛素基值后，估算所述肺途径相对于皮下注 射的生物利用度约26％。为了比较，估算人胰岛素的所述肺途径相 对于皮下注射给予的生物利用度约38％。