本发明涉及基因治疗技术在伤口愈合和相关症状中的应用。更具 体地讲，本发明涉及编码早期生长应答-1(Egr-1)转录因子的多聚核 苷酸在治疗伤口、伤口愈合和相关症状中的一个新的应用，如用于治 疗由局部缺血引起的皮肤溃疡和与糖尿病、外周动脉闭塞病、深静脉 血栓症、慢性静脉功能不全和褥疮相关的神经病，与如白内障、皮肤 移植、烧伤、鳞癣相关的术后瘢痕，加速组织改型和再生；硬组织修 复，如骨骼；软组织修复，如腱、韧带、肌肉，血管生成的加速，穿 皮的经腔冠状血管成形术之后的上皮再生成，左心室心脏肥大的抑 制，血管内壁钙化的调节和神经再生的调节。

进一步的应用可能包括纤维化症状的抑制，如肺部和肝脏纤维 化，以及脱发的抑制。

本发明也涉及Egr-1的转录及其调节。

皮肤愈合包括广范围的细胞、分子、生理和生化事件。在愈合的 过程中，细胞迁移到伤口部位，它们在该处增生并合成细胞外基质成 分，以便重新构建十分类似于未受损伤的原始组织的组织。该活性由 伤口边缘细胞分泌的介体调节，如血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮 生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)β和其它细胞因子。这些介体对 于细胞的有利作用已经在体外和体内被证实(由Moulin综述，Eur.J. Cell Biol.68；1-7,1995)，包括对糖尿病大鼠模型施用PDGF的 益处(Brown等，J.Surg.Res.56；562-570,1994)。

在过去的五年里，许多生长因子已经显示出在体外可以加速细胞 增殖并在动物模型中可以加速伤口愈合。在伤口修复的领域中，TGFβ 已经受到最大重视，因为它能促进细胞增殖、分化和基质产生。在动 物模型中，局部或系统地施用TGFβ加速了皮肤伤口的修复(Ashcroft 等，自然医学，3；1209-1215,1997；Sporn和Roberts细胞生物 学杂志119；1017-1021,1997；Beck等J.Clin.Invest.92； 2841-2849,1993)。同样地，PDGF已经被报道在局部缺血的组织和 糖尿病动物内可以增强上皮再生成和血管的再形成(Uhl等 Langenbecks Archiv fur Chirurgie-Supplement-Kongressband 114； 705-708,1997及Dirks和Bloemers的综述，分子生物学报道22； 1-24,1996)。

转录因子Egr-1是超过30个基因的的潜在调节子，并在生长、发 育和分化中担任重要角色(Liu等的综述Crit.Rev.Oncogenesis 7； 101-125,1996；Khachigian和Collins Circ.Res.81；457-461, 1997)。Egr-1是由血管内皮的损伤诱导的(如Khachigian等 科学； 271,1427-1431,1996)，并且转录活化的目标是多个基因，包括表 皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子-A(PDGF-A)、碱性纤维母细 胞生长因子(bFGF)、诱导PDGF A、PDGF B、TGFβ、bFGF、尿纤维蛋 白酶原活化因子(u-PA)、组织因子和胰岛素样生长因子-2(IGF-2)。

调节血管内皮生长因子(VEGF)诱导的转录复合物是直接依赖于 AP2而不是Egr-1(Gille等，EMBO J 16；750-759,1997)。然而， PDGF B直接增量调节VEGF的表达(Finkenzeller Oncogene 15； 669-676,1997)。VEGF mRNA转录的增强是通过许多因子，包括PDGF B、bFGF、角质细胞生长因子(KGF)、EGF、肿瘤坏死因子(TNF)α和TGF β1。VEGF已经可以促进瓣膜损伤的动脉内的上皮再生。在兔子中获 得的数据显示出明显的VEGF驱动的金属支架钝化抑制了支架内新血 管内膜的形成，血栓阻塞的发生减少，假肢上皮再生的加速和血管收 缩神经活性的提高(van Belle,E.等，Bichem.Biophys.Res. Comm.,235；311-316,1997；van Belle,E，等，J.Am.Coll. Cardiol.,29；1371-1379,1997；Asahara,T.，等，循环，94； 3291-3302,1997)。在人类中进行VEGF促进上皮再生的初步研究的 NIH批准在1996年获得通过。另外，在颈动脉干道损伤的大鼠模型 中，HGF也已经显示出可以在瓣膜血管形成术之后促进上皮再生 (Nakamura等，摘要1681，美国心脏相关会议；Dallas,1998)。在 动物模型中，VEGF驱动的金属支架的钝化已经显示出可以抑制新血管 内膜的形成、加速上皮再生和提高血管收缩神经的活性(Asahara等， 循环；94,3291-3302)。

VEGF表达已经在愈合伤口和牛皮癣皮肤中被报道，在两种疾病中 TGFα及其配体EGF受体(EGFr)被增量调节。EGF的表达诱导了Egr- 1(Iwami等，Am.J.Physiol.270；H2100-2107,1996；Fang等， Calcified Tissue International 57；450-455,1995；J. Neuroscience Res.36；58-65,1993)。目前有轶事样的证据，即 Egr-1可能激活细胞间粘连分子(ICAM-1)在佛波酯激活的B-淋巴细 胞内的表达(Maltzman等，分子细胞生物学16；2283-2294,1996)， 并且可能由于一个Egr-1结合位点在TNFα启动子上的存在，而激活 TNFα的表达(Kramer等，Biochim.Biophys.Acta 1219；413-421, 1994)。最后，Egr-1剔除小鼠为不育及促黄体生成激素(LH)缺陷型 (Lee等，科学273；1219-1221,1996)，暗示着LH启动子可能也是 Egr-1活化的一个目标。

骨负重、机械拉伸和类似于造骨细胞的MC3T3E1细胞的液体流动 诱导了Egr-1(Dolce等Archs.Oral Biol.41；1101-1118,1996； Ogata细胞生理学杂志170；27-34,1997)，同时伴随着生长因子的 活化。Egr-1的表达在发育小鼠的软骨和骨中占主要地位(McMahon 等，发育108；281-287)，并且已经涉及造骨细胞的生长和分化的调 节(Chaudhary等，分子细胞生物化学156；69-77,1996)。Egr-1和 与其紧密相关的锌指转录因子Wilm’s肿瘤1(WT1)已经涉及破骨细 胞生成(Kukita等，内分泌学138；4384-4389,1997)，而且前列 腺环素E2(PGE2)和EGF均由Egr1诱导(Fang等钙化组织国际57, 450-455,1995；Fang等前列腺素、白三烯和必需的脂肪酸54； 109-114,1996)。血管钙化是一种类似于骨形成的活化调节的过程， 其包括已知在骨代谢调节中很重要的细胞和因子(Dermer等综述， Trends Cardiovasc.Med.4；45-49,1994)。造骨细胞生成和/或 破骨细胞生成的调节剂可以调节血管壁钙化的程度。

肥大刺激如血动力负荷和血管收缩素Ⅱ可以被用于驱动主要在 一种肌细胞特异性启动子的控制之下的显性失活的Egr-1的产生，并 且在治疗心力衰竭中具有应用。

Egr-1是施万细胞表达p75神经生长因子(NGF)受体所必需的 (Nikam等分子细胞神经科学6；337-348,1995)。NGF诱导Egr-1 的表达，同时伴随着生长因子的活化(Kendall等，脑研究，分子脑 研究.25；73-79,1994；Kujubu等，神经科学研究杂志36；58-65, 1993)，

目前已经发现在受伤的部位施用一种编码转录因子Egr-1的多核 苷酸，并随后表达它，促进了愈合的加速。

因此，依据本发明的第一个方面，提供了一种包括编码一种Egr-1 转录因子多肽或其生物活性片段的序列的核酸分子在生产一种治疗 哺乳动物(包括人类)伤口的药物中的应用。

为了避免任何怀疑，提及一种多聚核苷酸和任何提及一种多聚核 酸分子是意义相同的。

依据本发明的第二个方面，提供了一种治疗哺乳动物(包括人类) 伤口的方法，该方法包括对该哺乳动物施用一种核酸分子，该分子包 括一段编码一种Egr-1转录因子多肽或其生物活性片段的序列。

依据第三个方面，本发明提供了一种用于治疗伤口的核酸分子， 其包括一段编码一种Egr-1转录因子多肽或其一段生物活性片段的序 列。

在第四个方面，本发明提供了一种药剂组合物，其包括一种含有 一段编码Egr-1或其一段生物活性片段的序列的核酸分子及其一种 或多种在药理学上可接受的载体。

本发明因此涉及编码Egr-1转录因子的多聚核苷酸在治疗伤口中 的治疗用途。本发明也涉及一种Egr-1转录因子本身在治疗伤口中的 治疗用途，如以下更详细的描述。

本发明涉及来自任何来源或物种的Egr-1多肽和编码Egr-1的核 酸序列的应用。该蛋白序列在物种之间的是高度保守的，例如大鼠和 小鼠之间有98％同源性。鼠Egr-1 DNA序列是已知的(细胞，53 37- 43(1988))。其推测的氨基酸序列显示出一段长的开放读框，终止密 码子(TAA)在1858位上。所推测的氨基酸序列预测是具有533个氨基 酸的多肽，分子量为56,596。来自其它物种的相应序列可以通过本领 域已知的方法获得，如通过使用基于或来源于鼠Egr-1序列的低聚核 苷酸序列作为探针，筛选基因组或cDNA文库。已知人类Egr-1位于5 号染色体上，更准确地是在5q23-31(细胞53,37-43)。人类Egr-1 cDNA的序列如核酸研究18第4283页，1990中所描述。小鼠和人类 的序列在核酸和蛋白水平上的相似性分别为87％和94％。

提及下文所描述的Egr-1多肽和多聚核苷酸对于任何来源的序列 是普遍适用的，包括如细胞，53 37-43(1998)中所发表的鼠Egr-1 DNA 和相应的氨基酸序列，以及如核酸研究18第4283页，1990中所发 表的人类序列，以及来自其它物种的序列。如以下将要描述的，术语 Egr-1也包括Egr-1的变体、片段和类似物。最优选的，是使用人类 的序列。

提供以下的说明性解释以帮助对本说明书中所使用的特定术语的 理解。所提供的解释仅是作为一种方便，而不是本发明的限制。

“治疗伤口”包括对与创伤、伤口愈合及其相关症状相关的症状 的治疗和促进、增强或加速组织愈合的治疗，以及包括治疗在糖尿病 和外周动脉阻塞疾病中的肢体溃疡、手术后疤痕、烧伤、牛皮癣，加 速组织的重建和骨修复以及促进血管生成、经皮腔内冠状动脉成形术 后的上皮再生成，抑制左心室心脏肥大，调节血管壁钙化，以及促进 神经再生。其进一步包括抑制纤维化的症状，如肺部和肝脏纤维化， 以及阻止脱发。

本说明书中所说的Egr-1的“生物活性片段”是一段具有Egr-1 活性的片段，该活性包括本发明的伤口愈合性质。

“遗传因子”通常是指一段含有编码一种多肽的区域的多聚核苷 酸，或是一段调节复制、转录或翻译或其它对于该多肽在宿主细胞内 体外因子表达很重要的过程的多聚核苷酸区域，或是一种包括一段编 码一种多肽的区域和一段与其操作性连接以调节表达的区域的多聚 核苷酸。遗传因子可以包括在一种作为染色体外因子复制的载体内； 也就是，作为一种在物理上独立于宿主细胞基因组的分子。它们可以 包括在质粒内。遗传元件也可以包括在一种宿主细胞基因组内；但不 是处于它们的天然状态，而是，在如分离、克隆的操作之后以一种纯 化的DNA的形式转入到宿主细胞内或存在于一种载体上。

“宿主细胞”是一种已经被转化或转染的细胞，或者是可以被一 段外源的多聚核苷酸序列转化或转染的细胞。

“同一性”，如本领域所公知的，是通过比较序列而确定的，两 种或更多种多肽序列之间或者是两种或更多种多聚核苷酸序列之间 的关系。在本领域中，同一性也表示多肽或多聚核苷酸序列之间的序 列相关性，这种情况可以，通过比较这些序列的信息串进行确定。同 一性可以容易地被计算(计算的分子生物学，Lesk,A.M.，编辑，牛 津大学出版社，New York,1988；生物计算：信息学和基因组计划， Smith,D.W.，编辑，学术出版社，New York,1993；序列数据的计 算机分析，第一部分，Griffin,A.M.，和Griffin,H.G.编辑.， Humana Press,New Jersey,1994；分子生物学中的序列分析，von Heinje,G.，学术出版社，1987；以及序列分析引物，Gribskov,M. 和Devereux,J.编辑，M Stockton Press,New York,1991)。虽 然存在许多用来测定两种多聚核苷酸或两种多肽序列之间的同一性 的方法，但该术语是本领域技术人员熟知的(分子生物学中的序列分 析，von Heinje,G.，学术出版社，1987；序列分析引物，Gribskov, M.和Devereux,J.编辑，M Stockton Press,New York,1991；以 及Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073 (1988))。普遍应用以确定序列之间的同一性的方法包括，但不局限 于Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073 (1988)中所公布的方法。设计确定同一性的优选方法来给出所检测序 列之间的最大比较。确定同一性的方法在计算机程序中被编成法典。 确定两种序列之间同一性的优选计算机程序方法包括，但不局限于， GCG程序包(Devereux,J.，等，核酸研究12(1):387(1984))、 BLASTP、BLASTN、和FASTA (Atschul,S.F.等，分子生物学杂志 215:403(1990))。

“分离的”表示从其天然状态“通过人手工”改变；即，如果其 是以天然状态发生时，其已经被改变或从其原始环境被除去，或二者 都有。例如，一种天然存在的多聚核苷酸或一种以其天然状态天然存 在于一种生物有机体内的多肽不是“分离的”，但是从其天然状态的 共生物质中被分离出来的同样的多聚核苷酸或多肽是“分离的”，如 该术语在本说明书中被应用。作为分离的一部分或分离之后，这种多 聚核苷酸可以与其它多聚核苷酸连接，如DNA，以进行突变，以形成 融合蛋白，以及在某一宿主内进行扩增或表达。分离的多聚核苷酸， 单独的或与其它多聚核苷酸序列连接(如以载体的形式)，可以在培养 物中或在整个有机体内被引入到宿主细胞内。在培养物或在整个有机 体内被引入到宿主细胞内之后，这种DNA仍然是被分离的，如本说明 书中所应用的术语，因为它们将不是其天然存在的形式或其环境不是 天然存在的组合物，并且，在其中仍然是在本说明书中所用到的术语 的含义范围内的分离的多聚核苷酸或多肽。

“多聚核苷酸”一般是指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核 苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰过的RNA或DNA或cDNA。 因此，例如，本说明书中所用到的多聚核苷酸尤其是指，单或双链 DNA、单或双链区域或单、双和三链区域混合物的DNA、单和双链RNA、 以及单和双链区域的混合物的RNA、含有DNA和RNA的杂交分子(其可 以是单链，或更典型地，双链、或三链、或单和双链区域的混合物)。 另外，本说明书中所用到的多聚核苷酸指包括RNA或DNA或RNA及DNA 的三链区域。在这些区域中的链可以来自相同的分子或不同的分子。 这些区域可以包括一种或更多分子的全部，但更典型地是仅包括部分 这些分子中的某一个区域。三链区域中的一个分子常常是低聚核苷 酸。如本说明书中所用到的，术语多聚核苷酸包括如以上所描述的含 有一个或多个修饰过的碱基的DNA或RNA。因此，为了稳定或其它原 因，其主链被修饰的DNA或RNA是“多聚核苷酸”，该术语特意应用 在本说明书中。而且，包括以不普遍的碱基(如次黄苷)、或修饰过的 碱基(如三苯甲基化的(tritylated)碱基)为两个实例的DNA或RNA 亦属于本发明的术语多聚核苷酸。应该理解的是已经在DNA和RNA上 进行了许多不同的修饰，以实现许多本领域人员所了解的有用的目 的。本说明书中所用到的术语多聚核苷酸包括多聚核苷酸的化学、酶 促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞的DNA和RNA特性的化学形式， 尤其包括简单和复杂的细胞。多聚核苷酸包括短的多聚核苷酸，常常 被称作低聚核苷酸。

“多肽”，如本说明书中所提到的，包括如以下所描述的所有多 肽。多肽的基本结构是熟知的，并且已经在无数教科书和其它本领域 的出版物中被描述。在本文中，该术语在此处是指包括两个或更多通 过肽键以线性链状相互连接的氨基酸的肽或蛋白。如此处所用到的， 该术语指短链(其在本领域中也常常作例如肽、低聚肽段和低聚体)及 较长的链(其在本领域通常被称作蛋白质，其有多种类型)。应该理解 的是多肽常常包括除了通常作为20种天然存在的氨基酸提及的20种 氨基酸之外的氨基酸，这许多的氨基酸，包括末端氨基酸，可以在特 定的多肽内被修饰，或者通过天然的过程，如加工和其它翻译后的修 饰，但也可以通过本领域熟知的化学修饰技术。即使是在多肽内天然 发生的常见修饰也是太多，以至无法在本文中列尽，但是它们在基础 课本已被详细描述并在专题论文中的描述更详细，以及在大量的研究 文献中被描述，它们对于本领域熟练的人员是熟知的。

在可以存在于用于本发明的多肽内已知的修饰中有，列出少量说 明性的，乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价结合、 血红素部分的共价结合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂质或 脂质衍生物的共价结合、phosphotidylinositol*的共价结合、交联， 环化、二硫键形成、去甲基作用、共价交联的形成、胱氨酸的形成、 焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化作用、糖基化作用、GPI锚定的形 成、羟基化、碘化作用、甲基化作用、豆蔻酰化、氧化、蛋白分解加 工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋作用、硒化作用、硫酸化、转移RNA 介导的氨基酸加入到蛋白中，如精氨酰化，和遍在蛋白化。这些修饰 对于熟练人员是熟知的，并且已经在科学文献中被详细描述。几种尤 其普遍的修饰，例如糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧 化、羟基化和ADP-核糖基化，在大多数基础课本中被描述，例如，如 蛋白-结构和分子特性，第二版，T.E.Creighton,W.H.Freeman 和Company,New York(1993)。有许多有关该主题的详细的综述， 例如，举例来说，由Wold,F.提供，翻译后的蛋白修饰：观点和展望， 第1-12页，在蛋白翻译后的共价修饰中，B.C.Johnson编辑，学 术出版社，New York(1983)；Seifter等，酶学方法182:626-646 (1990)和Rattan等，蛋白合成：翻译后修饰和成熟，Ann.N.Y.Acad. Sci.663:48-62(1992)。应该理解的是，如所熟知的和以上所指出 的，这些多肽并不总是完全线性化的。例如，多肽通常可以是由于翻 译后的事件，包括自然加工事件和由人操作带来的不是自然发生的事 件的结果。环状的、分支的和分支环状的多肽可以通过非翻译自然过 程合成，并通过完全合成的方法进行合成。修饰可以发生在多肽的任 何位置，包括主肽链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。事实上，通过 共价修饰对多肽内氨基或羧基基团的封阻，或二者均被封阻，在天然 存在和合成的多肽内是普遍的，并且同样地，这些修饰可以存在于本 发明的多肽内。例如，在大肠杆菌或其它细胞内产生的氨基末端残 基，在蛋白水解加工之前，几乎常常将是N-甲酰甲硫氨酸。在该肽的 翻译后修饰的过程中，在NH2-末端的一个甲硫氨酸残基可能被删除。 因此，本发明涉及本发明中的蛋白的含有甲硫氨酸及不含甲硫氨酸氨 基末端变体的使用。发生在一段多肽内的修饰受其制备方法的影响。 例如，对于通过在一个宿主内表达一个克隆基因制备的多肽，修饰的 本性和程度，在很大程度上由宿主细胞的翻译后修饰能力和存在于多 肽氨基酸序列内的修饰信号来确定。例如，如众所周知的，糖基化常 常不在细菌宿主内发生，如，大肠杆菌。因此，当需要糖基化时，一 段多肽需要在糖基化宿主内表达，通常是真核细胞。昆虫细胞常常进 行与哺乳动物细胞相同的翻译后糖基化作用以及，由于这一原因，特 别是昆虫细胞表达体系已经被开发成有效地表达具有糖基化天然模 式的哺乳动物蛋白。类似的考虑应用于其它修饰中，应该理解的是相 同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于一段给定的多肽内的几 个位点上。同样，一段给定的多肽可以包括多种类型的修饰。通常， 如本文中所用到的，术语多肽包含所有这些修饰，尤其是存在于通过 在一种宿主细胞内表达一段多聚核苷酸来重组性合成的多肽内的修 饰。

术语多聚核苷酸或多肽的“变体”，如本文中所用到的，是分别 与一段参考多聚核苷酸或多肽不同的多聚核苷酸或多肽。在这一意义 上的变体在本说明书中在下文和别处被更详细地描述。(1)在核苷序 列上与另一段参考多聚核苷酸不同的多聚核苷酸。通常，区别是局限 性的，以便参考的核苷酸序列和变体在整体上是十分类似的，并且在 许多区域上是相同的。如以下所提到的，在变体的核苷酸序列上的改 变可以是沉默的。即是，它们可能不改变由多聚核苷酸编码的氨基 酸。当改变是局限于这种类型的沉默改变时，一种变体多聚核苷酸将 编码具有与参考相同氨基酸序列的多肽。同样如以下所提到的，在变 体多聚核苷酸的核苷酸序列上的变化可能改变由参考多聚核苷酸编 码的多肽的氨基酸序列。这种核苷酸的改变可能导致由参考序列编码 的多肽内的氨基酸的替代、添加、删除、融合和截短，如以下所讨论 的。(2)一段在氨基酸序列上不同于另一段参考序列的多肽。通常， 区别是局限性的，以至参考和变体的序列在整体上是十分类似的，并 在许多区域相同。一种变体和参考多肽可能通过一个或多个替代、添 加、删除、融合和截短而在氨基酸序列上不同，其能以任何组合存在。

“治疗/疗法”包括任何能够有利于人类或非人类的动物的方法。 治疗可能是针对一种存在的症状或可能是预防性的(预防性治疗)。

“包括/具有”包含任何包括一种特定的特征/特性的事物，以及 任何具有该特征/特性的事物，但其也具有一个或多个附加的特征/特 性。因此对于一段包括/具有一段给定序列的核酸/蛋白序列，该序列 本身包括在内，也同样是较长的序列。

“同系物”被用来包括一种特定的生物活性分子的任何变体，其 具有该分子的一种或多种生物活性。

本发明涉及核酸分子的治疗作用，该分子包括一段编码一种 Egr-1多肽的序列。本发明也涉及上述多聚核苷酸序列的编码某一 Egr-1生物活性片段的片段，或该多聚核苷酸序列的变体，其由于遗 传密码的简并性，编码Egr-1的功能(也就是生物活性)片段的治疗作 用，也涉及由单个或多个碱基替代、添加和/或删除修饰的、功能等 同的等位基因变体和相关序列，其编码具有Egr-1活性的多肽。

这些可以通过本领域技术人员已知的常规克隆操作获得。

编码Egr-1转录因子的多聚核苷酸能够以DNA、cDNA或RNA的形 式存在，如通过克隆获得或通过化学合成技术产生的mRNA。该DNA 可以是单或双链。单链DNA可以是编码或有义链，或者其可以是非编 码或反义链。为了治疗的作用，该多聚核苷酸是以可以在被治疗的患 者的创伤部位表达的功能性Egr-1转录因子的形式存在。该多聚核苷 酸也可以被用于体外生产Egr-1多肽以在本发明的进一步治疗方面进 行施用，如以下详细描述。

本发明的编码Egr-1转录因子多肽的多聚核苷酸可以包括，但不 局限于，Egr-1多肽或其生物活性片段的编码序列。因此，该多聚核 苷酸可以同附加的、非编码序列一起提供，该序列包括，例如但不局 限于，非编码的5’和3’序列，如转录、非翻译的序列，其在转录(例 如，包括终止信号)、核糖体结合、mRNA稳定因子中起作用，以及编 码附加的氨基酸的附加编码序列，如提供附加功能的序列。本发明的 多聚核苷酸也包括，但不局限于，包括Egr-1的一种结构基因和其天 然相关的遗传因子的多聚核苷酸。

与前述的一致，本说明书中所用到的术语“编码一种多肽的多聚 核苷酸”包括含有一段编码Egr-1转录因子多肽的序列的多聚核苷 酸。该术语包括含有一个单独的编码该多肽的连续区域或不连续区域 (如，被整合的噬菌体或插入序列或编辑打断)以及附加区域的多聚核 苷酸，其也可能含有编码和/或非编码序列。

本发明进一步涉及本说明书中以上所描述的多聚核苷酸的变体， 其编码该多肽的片段、类似物和衍生物。该多聚核苷酸的变体可以是 一种天然存在的变体，如天然存在的等位基因变体，或其可能是一种 未知是天然存在的变体。该多聚核苷酸的这些非天然存在的变体可以 通过突变技术构建，包括应用于多聚核苷酸、细胞或有机体中的技 术。

在这一方面的变体中，是不同于上述的通过核苷酸替代、删除或 添加得到的多聚核苷酸的变体。这些替代、删除或添加可以涉及一个 或多个核苷酸。这些变体可能在编码或非编码区域或同时在这两个区 域改变。在编码区域的改变可能产生保守或非保守的氨基酸替代、删 除或添加。

本发明中进一步优选的实施例是其全长与编码一种具有Cell53 37-43(1988)中列出的氨基酸序列(小鼠序列)的多聚核苷酸具有至 少70％同一性的多聚核苷酸，更优选的是其全长与核酸研究18 4283, 1990中的编码人cDNA序列和与其(人序列)互补的多聚核苷酸具有至 少70％同一性的多聚核苷酸，以及与这些多聚核苷酸互补的多聚核苷 酸。可选地，最高度优选的是其所含有的一段区域的全长与一种编码 本发明中的多肽的多聚核苷酸具有至少80％同一性的多聚核苷酸。在 这一点上，其全长与相同的多聚核苷酸具有至少90％同一性的多聚核 苷酸是尤其优选的，在这些尤其优选的多聚核苷酸中，至少具有95％ 同一性的是特别优选的。此外，在具有至少95％的多聚核苷酸中至少 具有97％的是高度优选的，在这些中间至少具有98％和至少具有99％ 是尤其高度优选的，至少具有99％的是更优选的。

此外，在这一点上优选的实施例是，其编码的多肽在本质上保留 与Cell 63 37-43(1988)中列出的鼠DNA序列所编码的鼠Egr-1多 肽(更优选的是由核酸研究18 4283,1990中列出的人序列所编码的 多肽)具有相同的生物功能或活性的多聚核苷酸。

本发明进一步涉及与本说明书中以上所描述的序列杂交的多聚核 苷酸。在这一点上，本发明尤其涉及在严格条件下与本说明书中以上 所描述的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸。如本说明书中所用到的，术 语“严格条件”是指如果在两段序列在之间存在至少95％及优选的是 至少97％的同一性，则将发生杂交。优选的，以这种方式与本发明中 的序列杂交的序列所编码的多肽具有Egr-1的生物活性。

这些多聚核苷酸所编码的多肽可能是成熟的蛋白加上附加的氨基 或羧基末端氨基酸。这些附加的序列可能起作用，尤其是如可能加长 或缩短蛋白的半衰期，或可能简化蛋白的加工以利于分析或生产。在 体内条件下通常是，附加的氨基酸可能通过细胞内的酶从成熟蛋白上 切除。

本发明中用于基因治疗方面的多聚核苷酸可能单独提供，或者作 为某一载体的部分，如一种表达载体，其例子在本领域中是熟知的。

一种编码Egr-1的多聚核苷酸可以用本发明中的方法通过基因治 疗发挥治疗作用，其中该多聚核苷酸以其可以在原位指导Egr-1(或其 一段生物活性片段)产生的形式被施用到创伤位置或其它需要愈合的 组织。据信，Egr-1通过活化涉及伤口愈合的基因来促进伤口愈合， 如VEGF、PDGF、EGF、TGFβ、碱性成纤维细胞生长因子、UPA和组织 因子的基因。

优选的是在基因治疗中，施用该多聚核苷酸以至其在被治疗的患 者体内表达，如以重组DNA分子的形式，该DNA分子包括如在一种表 达载体内的一段编码Egr-1的多聚核苷酸和与其操作性连接的一段控 制表达的核酸序列，这种载体因此将含有适当的转录控制信号，包括 可以表达编码序列的启动子区域，上述启动子可以在被治疗的患者体 内发挥功能。因此对于人类基因治疗来说，启动子这一术语不仅包括 对于指导RNA聚合酶到转录起始位点是必需的序列，而且包括，如果 适当的话，还包括其它操作或控制序列包括增强子，优选的是来自一 种人类基因的人类启动子序列，或者是来自在人体内典型表达的基 因，如来自人类巨细胞病毒(CMV)的启动子。在已知的真核启动子中， 在这一点上合适的启动子有CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动 子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTRs启动子(如罗斯肉瘤 病毒(“RSV”)的启动子)、和金属硫蛋白启动子(如小鼠金属硫蛋白 -1启动子)。

如以下更详细的讨论，可以使用天然Egr-1启动子。本发明人已 经发现已发表的人类Egr-1启动子的序列是不正确的，并且已经提供 了一个新的序列，其与上述已发表的序列存在多处不同。

可以提供克隆到可复制的质粒载体上的一段多聚核苷酸序列和转 录操纵序列，该载体以商业上提供的载体为依据，如pBR322，或者可 以通过熟知的、已发表的方法的常规应用从现有载体中构建。

该载体也可以包括转录控制信号，位于Egr-1编码序列的3’端， 也包括多腺苷酸化信号，在被治疗的患者体内是可识别的，例如，举 例来说，来自病毒的相应序列如，用于人类治疗的SV40病毒。其它 转录操纵序列在本领域中是熟知的并可以被使用。

表达载体也可以包括选择性标记，如抗生素抗性，其使载体可以 繁殖。

能够在原位合成Egr-1的表达载体可以通过物理方法直接引入到 创伤位置。这些例子包括局部施用在合适的媒介物内“裸露的”核酸 载体，如溶解在治疗上可接受的赋形剂(如磷酸缓冲盐(PBS))内，或 通过物理的方法施用载体，如颗粒轰击，也就是所知的“基因枪”技 术，依照本领域已知的方法，如在US-5371015中所描述的，其中的 惰性颗粒，如用载体包裹的金颗粒凭借在高压下从一个发射装置中发 射，以足够的速度被加速，使得它们可以在受伤位置(如皮肤细胞)穿 透表面。(用本发明中的核酸分子包裹的颗粒在本发明的范围内，同 样地，含有这些颗粒的设备也包括在本发明的范围内。)

其它直接将DNA施用到接受者体内的物理方法包括超声、电刺 激、电穿孔和微量接种。

尤其优选的是微量接种的传递模式，其是在原位将遗传物质传递 到患者体内的一种系统。该方法在美国专利编号5,697,901中描述。

用于本发明治疗的编码Egr-1的核酸序列也可以通过传递载体的 方法施用。它们包括病毒传递载体，如本领域已知的腺病毒或逆转录 酶病毒传递载体。

其它非病毒传递载体包括脂质传递载体，包括本领域已知的脂质 体传递运载体。

一种编码Egr-1的核酸序列也可以通过转化宿主细胞的方式施用 到受伤位置。这些细胞包括从患者体内收集到的细胞，该核酸序列被 引入到其中是通过本领域已知的基因运载的方法，接着通过在培养基 中生长该细胞并移植到该患者体内。

如以上所描述的表达构建物可以通过多种途径应用于本发明中的 治疗上。因此，它们可以直接施用到患者的受伤部位，或者它们可以 被用于制备重组的Egr-1转录因子，然后其本身可以如以下所更详细 讨论地施用到受伤部位。本发明也涉及宿主细胞，用含有Egr-1多聚 核苷酸或本发明中的多聚核苷酸或上文中所定义的遗传因子的构建 物对所述细胞进行遗传工程改造，本发明也涉及这些载体和细胞在本 发明的治疗方法上的应用。这些构建物本身可以被用于本发明的治疗 方法中，或者它们可以被用于构建一种在本发明的治疗方法上使用的 Egr-1多肽，如以下更详细的描述。

该载体可以是，如，一种质粒载体，一种单链或双链噬菌体载体、 一种单链或双链RNA或DNA病毒载体，依赖于该载体是否直接使用到 受伤部位(也就是，用于在原位合成Egr-1)，或者可以被用于合成重 组的Egr-1。本说明书中所公布的起始质粒是商业上提供的、公开提 供的、或者可以通过熟知的、已公开的方法操作从现有的质粒构建。 可用于本发明的许多质粒和其它克隆和表达载体是熟知的，并且对于 本领域熟练的人员是很容易得到的。

通常，用于表达一种在本发明中使用的Egr-1多肽的载体包括顺 式操作调控区域，它与待表达的多聚核苷酸操作性连接，对在宿主内 的表达有利。合适的反式作用因子由宿主提供、由一种互补的载体提 供或者由将其引入到宿主内的载体本身提供。

在这一点上的特定实施例中，这些载体提供了特定的表达。为了 产生重组的Egr-1，这种特定的表达可以是可诱导的表达、或者是仅 在特定类型的细胞内表达、或者既可诱导又具细胞特异性。在可诱导 的载体中尤其优选的是易于操纵的环境因子(如温度或营养添加剂) 诱导表达的载体。适用于本发明的这一方面的多种载体，包括用于原 核和真核宿主的组成型和可诱导的表达载体，它们是熟知的并且是本 领域的熟练人员常规使用的。

很多种表达载体可以被用于表达在本发明中使用的Egr-1。这些 载体包括，尤其是，染色体、游离体和病毒衍生的载体，如来自细菌 质粒、来自噬菌体、来自转座子、来自酵母游离体、来自插入因子、 来自酵母染色体因子、来自病毒(如杆状病毒、乳头多瘤空泡病毒如 SV40、痘苗病毒、腺病毒、家禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒) 的载体，以及来自组合的载体，如来自质粒和噬菌作遗传因子的载 体，如粘粒和噬菌粒，所有这些载体可以依据本发明的该方面用于表 达。通常，任何适于在一种宿主内维持、繁殖或表达多聚核苷酸以便 在宿主中表达一种多肽的载体在这一点上均可以被用于表达。

适当的DNA序列可以通过多种熟知和常规技术中的任何一种插入 到载体内，如，例如，在Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第二 版；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York(1989)中所列出的技术。

表达载体内的核酸序列与合适的表达操纵序列(包括，例如，指导 mRNA转录的启动子)操作性连接。这些启动子的代表包括，但不局限 于，噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trp和tac启动子，用于重 组表达，及SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTRs启动子用于 原位表达。

通常，表达构建物将包含转录起始和终止的位点，以及，在转录 区域，将包含用于翻译的核糖体结合位点。由构建物表达的成熟转录 产物的编码部分将在开始包括翻译起始AUG，并在被翻译的多肽末端 包括一个在合适位点的终止密码子。

另外，该构建物可能包括调控及诱发表达的操纵区域。通常，依 据许多常用的操作，这些区域将通过控制转录进行操作，尤其如转录 因子，抑制结合位点和终止。

用于繁殖和表达的载体通常将包括选择性标记和扩增区域，如， 例如，在Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第二版；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989) 中所列出的。

用于重组表达Egr-1的合适宿主的代表性的例子包括细菌细胞， 如链球菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌、链霉菌属和枯草芽孢杆菌细胞； 真菌细胞，如酵母细胞和曲霉菌细胞；昆虫细胞如果蝇属S2和 Spodoptera Sf9细胞；动物细胞如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、 BHK、293和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。

以下载体，其为商业上可供的，通过举例的方式提供。在载体中， 用于细菌中优选的是pQE70、pQE60和pQE-9,Qiagen有售；pBS载 体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、 pNH46A,Stratagene有售；以及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、 pDR540、pRIT5,Pharmacia有售，以及pBR322(ATCC 37017)。优 选的真核载体中有pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1以及pSG, Stratagene有售；以及pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL,Pharmacia有 售。列举这些可以被用于重组表达及用于原位表达载体，只是作为在 多种商业上提供的载体的说明的，并且是本领域熟练的人员可以利用 以依据本发明的该方面进行应用的熟知载体。应该了解的是其它适 于，如，在某一宿主内引入、维持、繁殖或表达多聚核苷酸或多肽以 用于本发明中的治疗的质粒或载体可以在本发明的这一方面被利 用。

用于本发明中这一方面的载体的例子包括表达载体，其中的 Egr-1cDNA序列被插入到某一质粒内，藉此基因表达由人立即早期巨 细胞病毒增强子-启动子驱动(Foecking和Hofstefter，细胞，45, 101-105,1986)。这些表达质粒可以包括SV40 RNA加工信号，如多 聚腺苷酸化和终止信号。商业上提供的使用CMV启动子的表达构建物 有pCDM8、pcDNA1及其衍生物、pcDNA3及其衍生物(Invitrogen)。 其它可供的且可以使用的表达载体有pSVK3和pSVL，其含有来自 SV40(pSVK3)的SV40启动子和mRNA剪接位点以及多聚腺苷酸化信 号，以及SV40 VP1加工信号(PSVL；来自Pharmacia的载体)。

启动子区域可以从任何理想的基因中选取，使用的载体含有一个 缺乏启动子区域的报告转录单元，如氯霉素乙酰基转移酶(“CAT”) 转录单元、限制性酶切位点的下游或用于引入一个候选的启动子片段 的位点；即，一段可以含有一个启动子的片段。众所周知，在cat基 因上游的限制性酶切位点处将一段含有启动子的片段引入载体会引 起CAT活性的产生，其可以通过标准的CAT分析检测。适于此目的的 载体是熟知及容易得到的，如pKK232-8和pCM7。用于表达在本发明 的治疗中使用的多聚核苷酸的启动子不仅包括熟知和容易获得的启 动子，而且包括容易通过前述的技术(使用一种报告基因，用于原位 表达)获得的启动子，这种启动子在被治疗的患者体内将如所希望地 被识别。

在已知的原核启动子中，适合表达本发明治疗方法中的多聚核苷 酸和多肽的启动子有大肠杆菌1acl和1acZ启动子、T3和T7启动子、 gpt启动子、λPR启动子、PL启动子和trp启动子。

重组的表达载体将包括，例如，复制的起点、一个启动子(优选的 是来自高度表达的基因，以指导下游结构序列的转录)、和一个选择 性标记以使得在载体进入之后可以分离含有载体的细胞。

用于本发明的治疗中的多聚核苷酸，编码本发明中的多肽的异源 结构序列，通常可以采用常规的技术被插入到载体内，以与启动子操 作性连接来用于表达。该多聚核苷酸将被定位使得转录起始位点大约 位于核糖体结合位点的5’端。该核糖体结合位点将位于起始将被表达 的多肽翻译的AUG的5’端。

通常，没有其它的开放读框是从起始密码子(常常是AUG)开始 的，它位于核糖体结合位点和起始密码子的中间。而且，通常，在多 肽的末尾将有一个翻译终止密码子，并且在构建物中将有一个多聚腺 苷酸信号以用于真核宿主。适当地位于转录区域的3’末端的转录终止 信号也可以包括在多聚核苷酸构建物内。

为了将所翻译的蛋白分泌到内质网的内腔、壁膜间隙或到细胞外 的环境中，可以在重组性合成时将适当的分泌信号结合到所表达的多 肽内。这些信号可以是该多肽的内源，信号，或者它们可以是异源信 号。

该多肽可以以修饰的方式表达，如融合蛋白，也可以不仅包括分 泌信号还包括附加的异源功能区域。因此，例如，一段附加氨基酸的 区域，尤其是带电荷的氨基酸，可以被加到该多肽的N-或C-末端， 以在纯化或在后来的操作和贮存中提高在宿主细胞内的稳定性和持 久性。而且，也可以在多肽中加上一段区域以利于纯化。这些区域可 以在多肽的最后制备之前被除去。尤其是在多肽中加入肽部分引起分 泌和排除，以提高稳定性或便于纯化，是本领域熟悉的常规技术。一 种优选的融合蛋白包括一段来自免疫球蛋白的异源区域，其对于溶解 和纯化多肽是有利的。然后典型地是通过离心收集细胞，通过物理或 化学的方法破碎，保留所得到的粗提物以进行进一步的纯化。

用于蛋白表达的微生物细胞可以通过任何简便的方法破碎，包括 冻融循环、超声、机械破碎、或使用细胞溶解剂，这些方法是本领域 的熟练人员所熟知的。

哺乳动物表达载体可以包括一个复制起点、一个合适的启动子和 增强子、也包括任何必要的核糖体结合位点、多聚腺苷酸区域、剪接 供体和受体位点、转录终止序列、以及表达所必需的5’端侧翼非转录 序列。

为了制备用于本发明的Egr-1多肽，可以使用遗传工程构建的宿 主细胞。将一段多聚核苷酸引入到宿主细胞可以通过磷酸钙转染、 DEAE-葡聚糖调节的转染、转位、微量注射、阳离子脂质介导的转染、 电穿孔、转导、刮削负荷(scrape loading)、轰击引入、感染或其它 方法。这些方法在许多标准的实验室手册中有描述，如Davis等，分 子生物学基本方法，(1986)和Sambrook等，分子克隆：实验室手册， 第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。

成熟的蛋白可以在适当的启动子的操纵下，在宿主细胞内表达， 宿主细胞包括哺乳动物细胞(如CHO细胞)、酵母、细菌、或其它细胞。 也可以采用无细胞翻译系统来生产这些蛋白，使用来自本发明的DNA 构建物的RNA。与原核和真核宿主一起使用的适当的克隆和表达载体 报露于Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。

该多肽可以通过熟知的方法从重组的细胞培养物中回收和纯化， 这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换层 析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层 析和凝集素层析。最优选的，采用高效液相层析进行纯化。当多肽在 分离和纯化过程中被变性时，可以采用熟知的重折叠蛋白的技术以再 生活性构象。

为了治疗，编码Egr-1的多聚核苷酸，如以重组载体的形式，可 以通过本领域已知的技术纯化，如通过Sambrook等，分子克隆：实 验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中所描述的柱层析的方法。

如以上所显示的，Egr-1可以在受伤位点作为Egr-1编码核酸进 行施用，该核酸本身在受伤位点以基因治疗的形式被转录并翻译成 Egr-1，或者该转录因子本身可以直接被施用。

因此，依据本发明的第五个方面，提供了Egr-1转录因子多肽或 其生物活性片段在生产一种用于治疗哺乳动物(包括人类)伤口的药 物上的应用。

依据本发明的第六个方面，提供了一种治疗哺乳动物(包括人类) 伤口的方法，该方法包括对该哺乳动物施用治疗上有效剂量的Egr-1 转录因子多肽或其生物活性片段。

在第七个方面，本发明提供了一种Egr-1转录因子或其生物活性 片段的施用，将其应用于治疗伤口及伤口愈合。

在第八个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括Egr-1转 录因子或其生物活性片段，及其一种或多种药用载体。

如本说明书中所用到的，术语“Egr-1转录因子多肽”包括天然 或重组产生的Egr-1转录因子，其天然的、合成的和生物活性多肽类 似物或变体或衍生物，或其生物活性片段，以及上述片段的变体、衍 生物和类似物。

包括Egr-1转录因子的生物活性片段的Egr-1转录因子蛋白产物 可以通过本领域已知的常规技术产生和/或分离。

用于本发明中的治疗的Egr-1及其上述的片段和衍生物可以通过 工艺上已知的方法从天然来源中抽提。这些方法包括通过序列特异性 的DNA亲和层析进行纯化，采用Briggs等，科学234,47-52,1986 中所描述的方法，使用一种识别Egr-1的DNA结合低聚核苷酸。该多 肽的制备也可以通过如以上所描述的本领域已知的重组DNA技术的方 法，即，通过在宿主细胞内表达所描述的构建物。可选地，本发明中 的多肽可以通过常规的肽合成仪合成产生。

本发明也涉及Egr-1的片段、类似物和衍生物的使用。术语“片 段”、“衍生物”和“类似物”表示一种基本上保留与这种多肽一样 的生物功能或活性的多肽。因此，一种类似物包括一种前蛋白，其可 以通过切除前蛋白部分被激活以形成活化的成熟多肽。

该多肽的片段、衍生物或类似物可以为(ⅰ)其中的一个或多个氨基 酸残基被一个保守的或非保守的氨基酸残基(优选的是一个保守的氨 基酸残基)替代、并且这些替代的氨基酸残基可能是或可能不是被遗 传密码编码的残基的多肽，或者(ⅱ)其中的一个或多个氨基酸残基含 有一个取代基的多肽，或者(ⅲ)其中的成熟多肽与另一种化合物融 合、如一种提高该多肽的半衰期的化合物(如聚乙二醇)的多肽，或者 (ⅳ)其中附加的氨基酸被融合到成熟的多肽内、如一段前导或分泌序 列或一段用于成熟多肽的纯化的序列或一段前蛋白序列的多肽。从本 说明书中的指导来看，这些片段、衍生物和类似物被认为是在本领域 熟练的人员的知识范围之内。

优选的变体是通过保守氨基酸的替代而与天然发生的Egr-1不同 的变体。这些替代是在一段多肽序列内用具有类似性质的另一种氨基 酸替代一种给定的氨基酸。典型地作为保守替代的是替代，在脂肪族 氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中，一种换成另一种；羟基残基Ser和 Thr的互换，酸性残基Asp和Glu的互换，酰胺残基Asn和Gln之间 的替换，碱性残基Lys和Arg之间的互换，以及芳香残基Phe、Tyr 之间的替代。

在这一点上进一步尤其优选的是变体、类似物、衍生物和片段， 以及该片段的变体、类似物和衍生物，具有该多肽的氨基酸序列，其 中几个，一些，5到10个，1到5个，1到3个，2个，1个或没有氨 基酸残基被替代、删除或添加，以任何方式组合。这其中尤其优选的 是沉默替代、添加和删除，其不改变本发明中的多肽的性质和活性。 在这一点上也尤其优选的是保守的替换。

尤其优选的片段是生物活性片段，即保留亲本多肽的伤口愈合特 性的片段。

在本发明中有用的多肽和多聚核苷酸优选的是以分离的形式提 供，并且优选的是被纯化以具同质性。

用于本发明的Egr-1多肽包括Egr-1多肽以及与如细胞53 37- 43(1988)中所列出的鼠多肽序列和与由人序列编码的多肽具有至少 70％同一性，优选的至少80％同一性以及更优选的至少90％以上的同一 性，以及更加优选的是至少95％相似性(更优选的是至少99％同一性) 的多肽，并且也包括这些多肽的部分，多肽的这些部分通常含有至少 30个氨基酸，更优选的是至少50个氨基酸。

在本发明的治疗中有用的多肽的片段或部分可以被用于通过肽合 成构建相应的全长多肽；因此，这些片段可以作为中间物采用以构建 全长的多肽。在本发明中有用的多聚核苷酸的片段或部分可以被用于 合成在本发明中有用的全长多聚核苷酸。

本发明也涉及本说明书中以上所定义的Egr-1多肽的片段和变体 的片段及其衍生物的应用。

在这一点上，一段片段是一段所具有的氨基酸序列与Egr-1多肽 及其变体或衍生物的部分(而不是全部)氨基酸序列完全相同的多 肽。

这些片段可以是“独立式的”，也就是，不是其它氨基酸或多肽 的部分或与其融合，或者它们可以包括在一段较大的多肽内，它们形 成其中的一个部分或区域。当包括在一段较大的多肽内时，目前所讨 论的片段最优选的是形成一个单独的连续区域。然而，几个片段可能 包含在一个单个的较大多肽内。例如，特定优选的实施例涉及本发明 中一种多肽的一个片段，该片段包含在涉及用于在某一宿主内表达的 前体多肽内，该多肽具有与该片段的氨基末端融合的异源前体和原体 多肽以及一段与该片段的羧基末端融合的附加区域。因此，片段在本 说明书中所特指的意义一方面是指，来源于本发明的一种多肽的一段 融合多肽的部分或多个部分，或者是融合蛋白。

在本发明的这一方面也优选的是其结构和功能特性属于在本发明 的治疗中有用的多肽的片段。在这一点上，本发明中优选的实施例是 含有本发明中的多肽的以下片段：α-螺旋和形成α-螺旋的区域、β- 片层和形成β-片层的区域、转角和形成转角的区域、卷曲和形成卷曲 的区域、亲水区域、疏水区域、α两性区域、β两性区域、柔性区域、 表面形成区域、底物结合区域、和本发明多肽的高抗原性指数区域， 及这些片段的组合。

优选的区域是调节本发明中多肽的活性的区域。在这一点上最优 选的是具有本发明中的多肽的化学、生物或其它活性的片段，包括具 有类似的活性或提高的活性，或具有降低了的所不希望的活性的片 段。进一步优选的多肽片段是包括或含有在某一哺乳动物(尤其是在 人类)体内的抗原或免疫原决定簇的片段。

应该理解的是本发明也涉及，尤其是，编码上述片段的多聚核苷 酸、与编码该片段的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸，尤其是在严格条 件下杂交的多聚核苷酸，以及，如PCR引物，用于扩增编码该片段的 多聚核苷酸。在这一点上，优选的多聚核苷酸是与如以上所描述的优 选的片段相应的多聚核苷酸。

本发明这一方面的进一步实施例包括其在生物学、预防学、临床 医学或治疗学上有用的变体、类似物或衍生物、或片段，包括变体、 类似物和衍生物的片段及含有相同片段的组合物。生物活性变体、类 似物和片段包括在本发明的范围之内。

本发明也涉及含有以上所描述的多聚核苷酸或多肽的组合物。因 此，本发明中的多聚核苷酸或多肽可以与治疗上可接受的载体或多种 载体结合使用。

这些载体可以包括，但不局限于，盐溶液、缓冲盐溶液、葡萄糖、 水、甘油、乙醇和它们的组合。

多肽和多聚核苷酸在本发明中可以单独或与其它的化合物(如治 疗化合物)结合使用。

这些药用组合物能够以任何有效、方便的方式有效地施用到靶伤 口位点，包括，如，尤其是通过局部、静脉内、肌肉内、鼻内或真皮 内的途径施用。通常，这些组分可以在原位应用于受伤或相关症状。

在治疗中或作为一种预防药物，该活性药剂可以以一种可注射的 组合物施用给患者，如作为一种无菌的水分散体，优选的是等渗的。

可选地，该组合物可以被配制用于局部使用，如以软膏、乳膏、 外用药水、眼药膏、滴眼药、滴耳剂、嗽口水、浸渍的敷料和缝合及 气溶胶的形式，也可以含有适当的传统添加剂，包括，如，防腐剂， 辅助药物渗入的溶剂，以及在软膏和乳膏中的软化剂。这种局部的制 剂也可以含有适当的传统载体，如乳膏或软膏基质，及乙醇或油醇用 于洗涤。这些载体可以组成制剂质量的大约1％至大约98％；更通常的 是它们将构成制剂质量的80％。

为了施用到哺乳动物，尤其是人类，期望的是活性药剂的日剂量 水平从大约0.01毫克/千克到10毫克/千克，代表性地是大约1毫克 /千克。内科医生在任何情况下将确定最适于某患者的确切剂量，这 将依据特定患者的年龄、体重和应答而不同。以上剂量是可模仿的平 均情况。当然，存在个别病例中需要较高或较低的剂量范围，这在本 发明的范围之内。

作为第九个方面，提供了一种含有Egr-1转录因子或含有编码 Egr-1的序列的核酸分子及其一种或多种治疗上可接受的载体的药剂 组合物。

使用转录因子在加速伤口愈合上的治疗优越性在于多个促进加速 愈合的靶基因的活化。Egr-1在响应受伤中天然活化，并且增强该天 然应答也是有利的。该治疗是以DNA为基础的，其提供了一种可靠且 可再现的传递系统。

当一种Egr-1多聚核苷酸被用于本发明的治疗方法中时，该多聚 核苷酸可以作为一种表达构建物的部分使用，如以一种表达载体的形 式。在这种方法中，该构建物被引入到受伤位点，Egr-1在该处原位 产生。这些所使用的构建物可以是标准的载体和/或基因传递系统， 如脂质体、受体调节的传递系统和病毒载体。

本发明适于伤口愈合的所有方面，包括在糖尿病和末梢动脉闭塞 病中的四肢溃疡、手术后疤痕、烧伤和牛皮癣。

如以上所描述的，本发明中的Egr-1多肽或核酸可以通过任何简 便的方法原位施用到组织损伤的位点，如通过局部施用。一种传递核 酸产物的方法是使用基因枪技术，其中Egr-1分离的核酸分子，如， 以cDNA的形式或在一个表达载体内，被固定在金颗粒上并直接射入 受伤位点。因此，作为本发明的一个优选的方面，提供了一种含有编 码Egr-1的序列的核酸分子在基因枪内的使用，以用于治疗伤口。而 且，提供了一种适于基因枪治疗的组合物，其包括一种编码Egr-1转 录因子的序列和金颗粒。

然而传递本发明中的核酸或多肽优选的是通过如美国5,697,901 中所描述的微量接种的方法。

如以上所提到的，包括一段编码Egr-1或其生物活性片段的序列 的多聚核苷酸，可以在至少一部分天然Egr-1启动子(优选的是人 Egr-1启动子)的控制之下。

鼠Egr-1启动子已经被分离并测序(Morris，核酸研究， 16:8835-3346)。潜在的调控序列包括在-26到-22位上的一段AAATA 因子(一种“TATA”样的类似物)；在-337到-333位上的一段CCAAT 盒子；在-110到-91、-342到-324、-358到-339、-374到-355及- 412到-393位上的五个血清应答因子(SRE)；在-610到-603及-867 到-860位上的两个Ap1位点；在-285到-280、-649到-644、-700 到-695及-719到-714位上的四个Sp1位点；以及在-138到-131和 -631到-624位上的两个cAMP应答因子。Egr-1已经表现出与鼠Egr-1 启动子结合及减量调节其自身表达的转录。该启动子的序列在附图的 图9中列出。

关于人类Egr-1启动子的调控了解较少。已经提供了一种可能的 人类Egr-1序列。将mRNA起始位点视为+1，已经鉴定出上游序列的 695个核苷酸。这段上游序列包括一个在-26到-22位的AAATA因子(一 种“TATA”样的类似物)，以及多个潜在的调控因子，包括-505到-499 位和-647到-642位的两个Sp1位点；在-134到-127位和-630到-623 位的两个环化AMP应答因子；在-108到-89、-344到-326、-359到 -340、-376到-357和-410到-394位的五个血清应答因子；在-597 到-589的一个Egr-1结合位点(EBS)以及在-609到-602位的一个十 四烷酰佛波乙酯(TPA)应答因子(Ap1结合位点)。已知TPA结合位点 是有功能的，因为TPA刺激质粒表达氯霉素乙酰基转移酶基因。SRES3 和4已经表现出调节Egr-1启动子对切变应力的应答，并且可以将切 变应力应答传给SV40启动子。从人启动子因子中删除EBS导致该启 动子切变应力应答的增强，由此支持了Egr-1在减量调节人启动子活 性中的作用。

本发明人也发现已发表的有关人Egr-1启动子的序列是不正确 的，并且提供了一种与上述已发表的序列具有多处区别的新的序列。 这些序列的区别是无法提前预知的，并且至少其中有一部分被认为是 功能上重要的。而且，本发明者们已经提供了一段完整的序列，然而 所报道的人Egr-1启动子序列包括多个缺口。

因此，包括编码Egr-1或其一段生物活性片段的序列的核酸分子 可以与一段核酸序列操作性连接，该序列：

a)具有一段含有图7中所提供的GW SEQ序列的链；或者

b)相对GW SEQ而言，具有包括一个或多个删除、插入和/或替 代的链，但是其不含有图7中作为ON SEQ显示的序列，以及其也不 含有图9中所显示的序列；或者

根据本发明的第十个方面，提供了一段核酸分子：

a)具有一段含有图7中所提供的GW SEQ序列的链；或者

b)相对GW SEQ而言，具有包括一个或多个删除、插入和/或替 代的链，但是其不含有图7中作为ON SEQ显示的序列，以及其也不 含有图9中所显示的序列；或者

c)具有与以上a)或b)中所描述的链杂交的链。

在以上a)、b)或c)范围内的分子在此将被更详细的描述：

a)一种具有图7中所提供的GW SEQ序列的核酸分子

可以发现图7中所显示的GW SEQ基因具有多个盒子区域。这些被 认为是功能上重要的。不受理论的束缚，图7中所显示的多个盒子区 域的可能的功能如以下所描述：

Sp1(两个区域)

Sp1表示一段结合转录因子Sp1及其同系物的序列。

cAMP RE(两个区域)

cAMP RE表示一段结合转录因子ATF及其同系物的序列。该过程 由cAMP诱导，因此该序列称成为cAMP应答因子。

TPA RE

TPA RE表示一段结合转录因子AP1及其同系物的序列。该过程是 由，如，佛波酯TPA诱导，因此该序列被称为一种TPA应答因子。

EBS

EBS表示一段结合转录因子Egr-1及其同系物的序列。

SRE(SRE5、SRE4、SRE3、SRE2、SRE1)

SRE表示一段提供了血清应答的序列(即血清应答因子)。以及相 关的Ets(E26转化特异性)结合位点血清应答因子结合转录因子，如 SRF、ELK-1和/或F-ACT1，以及它们的同系物。

TATA

TATA盒子被认为是转录复合物的组合组装所需要的，其包括多个 转录起始所需要的转录因子。其不需要包括准确的“TATA”序列，因 为其是一个共有序列，并且可以发生一定程度的变化。

GW SEQ具有多个与已发表的人Egr-1序列(此处指定为“ON SEQ”) 相关的序列差别。此处该区别在关于图7中所显示的序列GW SEQ和 ON SEQ的对齐中进行讨论。

从图7中可以看出，GW SEQ中有五个核苷酸相对于ON SEQ中相 应位置上所提供的特定核苷酸有变化。这些可以被看作是与ON SEQ 相关的替换。其中两个存在于盒子内的区域。两个替换是用一个T替 换一个G以及用一个C替换一个G。它们分别存在于第一个cAMP RE 盒子和SRE3盒子。

相对ON SEQ而言，GW SEQ也具有多个附加的核苷酸(即不是特定 鉴定存在于ON SEQ内的核苷酸)。这些可以被认作是相对ON SEQ的 插入。其中的四个存在于SRE5盒子内。(其中有三个是A的插入和一 个C的插入。)

相对ON SEQ而言，GW SEQ具有一个删除。是G的删除。它不存 在于盒子区域内。其位于第二个Sp1盒子和SRE5盒子之间。

在以上a)的范围内的分子当然可能具有相对GW SEQ的附加的上 游和/或下游序列。例如，可能提供一个或多个涉及其转录/翻译或调 控的区域。也可能提供一个编码区域(优选的是编码Egr-1或其一段 生物活性片段)。附加区域在以后有更详细的讨论。

b)一段核酸分子，相对GW SEQ而言，其具有一段包括一个或多个 删除、插入和/或替换的链，但其不包括图7中作为ON SEQ显示的序 列以及不包括图9中所显示的序列

可以使得GW SEQ的分子的核苷酸序列发生改变，以提供其它仍然 有用的分子。

这些变化在本发明的范围之内。它们包括等位基因和非等位基因 的变体。

在以上b)的范围之内的变体优选的是通常包含一个或多个调控 区域，这些区域具有的功能与GW SEQ中显示的一个或多个盒子区域 的功能相应(即使该功能是相对GW SEQ中所显示的一个或多个盒子区 域的增量调节或减量调节)。最优选的，这些分子将具有一个或多个 与GW SEQ中所显示的一个或多个盒子区域具有相同序列的区域。

在以上b)范围内的理想的变体，是其与上述GW SEQ的全长或其 部分在全部或部分上述GW SEQ基本上相同的序列。

如果某一变体具有一个或多个相应于图7中所显示的GW SEQ的一 个或多个盒子区域的区域，则优选的是与上述盒子区域没有区别或仅 有少量这种区别(如，其通常优选的是与某一给定的盒子区域最多具 有1、2或3个区别)。在盒子区域之外可能存在更多序列的变化。因 此，至于不在图7中的盒子内的区域，变体与GW SEQ中的相应部分 可能具有相对低程度的序列同一性。事实上，一些变体可能不具有一 个或多个相应于GW SEQ中上述盒子区域之外的一个或多个区域的区 域。

本发明的第十个方面中的优选的核酸分子将包括一个或多个调控 区域，这些区域在体内条件下可以改变Egr-1在哺乳动物(最优选的 是在人类)体内的转录水平。因此，这些核酸分子可以被施用到哺乳 动物以允许其表达在转录水平被调控的方式来提供Egr-1(因此这些 核酸分子通常将包括一段编码一种具有Egr-1活性的物质的区域)。

可以存在一个或多个血清应答因子(SRE)。理想的是它们中间的一 个或多个将是切变应力应答因子(SSRE)。这些区域能对转录产生切变 应力应答。

多个SSRE可能协同作用以促进切变应力应答。理想的是它们与一 个或多个Ets位点相关或包括一个或多个Ets位点。然而，在一些情 况下，有可能仅需要SSRE(优选的是与一个Ets位点一起)来提供一定 程度的切变应力应答。

一种优选的SSRE在图7中作为“GW SEQ”的SRE5显示。本发明 者们已经证明其是具有功能的，然而在ON SEQ中所显示的SRE5序列 是没有功能的。SRE5本身，以及可以提供切变应力应答的SRE5变体 在本发明的范围之内。这些变体优选的是包括存在GW SEQ5中、与ON SEQ SRE5之间的至少一个核苷酸的区别。

其它优选的SSRE是图7中的GW SEQ所显示的SRE3和SRE4，以 及它们的可以提供切变应力应答的变体。

最优选的，所有三个SRE3、SRE4和SRE5(或其可以提供切变应力 应答的变体)均存在。

无论是否存在特定的SRE，本发明第十个方面中的一种核酸分子 理想的是将包括一个TATA盒子(其不必需包含共有序列“TATA”)。 该分子通常也包括一个CCAAT盒子(其不必需包含共有序列 “CCAAT”)。

通常也将存在至少一个，优选的是两个Sp1结合区域。Sp1结合 区域可以是图7所显示的GW SEQ的Sp1结合序列的任一个或两个。

可能存在一段cAMP应答区域。这些区域优选的是包括图7中所显 示的具有关于GW SEQ的指定为cAMP RE的序列。最优选的是图7中 所显示的GW SEQ的第一个cAMP RE。它们可以使得转录受cAMP调控。

可能存在一个Egr-1结合位点(EBS)。其被认为一旦Egr-1的水 平超过了一个特定的界限，则起到减量调节Egr-1转录的重要作用。 因此，Egr-1可以在切变应力刺激之后限制其自身的表达。如果一个 EBS对于以这种方式限制Egr-1的水平是理想的，则其通常被包括在 内。该EBS可能具有图中作为EBS列出的7GW SEQ序列。可以对一种 给定的EBS进行核酸的改变以提供它的变体。例如，所提供的变体可 以提供与图7GW SEQ中所显示的EBS相比，对Egr-1的亲和力降低。 一种这样的变体是如图8中所显示的EBS。在一些情况下，可能不存 在一种功能的EB，因此通过Egr-1的调控可能完全消除(如可以制造 一种EBS的完全删除)。也可以对一种EBS进行核苷酸改变以提供对 Egr-1的亲和力提高。如果需要提高Egr-1表达的自我调控，这将是 有用的。

c)一种所具有的链与以上a)或b)中所描述的链杂交的核酸分子

可以与以上所讨论的一种或多种核酸分子杂交的核酸分子也包括 在本发明的第十个方面内。这些核酸分子在本说明书中作为“杂交” 核酸分子提到。理想的是，本发明中的杂交分子全长具有至少10个 核苷酸，优选的是全长具有至少25个、至少50个、至少100个、或 至少200个核苷酸。

本发明中的杂交核酸分子的全长可能与以上a)或b)的范围之内 的核酸分子的互补核酸分子具有高度的序列同一性(如至少50％、至少 75％、至少90％、至少95％、或至少98％的同一性)，虽然这不是必需 的。一段给定的单链核酸分子和另一段单链核酸分子之间的序列同一 性程度越高，其越有可能在合适的条件下与另一种单链核酸分子的互 补单链核酸分子杂交。

优选的杂交分子在中等或高度严格的条件下杂交。杂交条件的详 细讨论在Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)的 第1101-1110和1145-1161页。一种可以使用的杂交条件的例子包括 使用一种预洗溶液5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)，并在 55℃下使用5×SSV尝试杂交过夜。然而，存在许多其它的可能条件。 例如，其中一些列于WO98/45435中的表1(见尤其是在该表中的A-F 下所列出的条件，次优选的是在G到L或M到R所列出的条件)，

另外一种途径是确定在给定的条件下具有一定长度的特定完美双 链(即没有错配)的Tm，然后在这些条件下与该双链中的一条单链尝试 杂交，但是在充分低于Tm的温度下进行，以使得一定范围内的稳定 杂交以可接受的速度形成，同时仍然需要适当程度的杂交特异性。这 种双链的Tm值能够以经验为主地进行确定，通过提供双链及逐步升 高温度直至达到Tm值。该Tm值的确定也可以，如通过使用：Tm=81.5 +16.6(log10[Na+])+0.41(G+C部分)-(600/N)，其中N是 链的长度(该公式对于Na+浓度为1M或较低、及多聚核苷酸长度为14 到70是适当准确的，但当没有满足这些参数时，该公式较不准确)。 对于全长大于200个核苷酸的核酸分子，在给定的条件下，杂交可以， 如，在低于理想杂交(即没有错配)Tm15至20℃下进行。然而，由于 长度降低，Tm值降低，直至有时在Tm-25℃下进行杂交是不方便的。 因此与较短核酸分子的杂交常常在仅低于Tm5到10℃下进行。中等 或高度严格条件通常将引起小部分的错配。作为单凭经验而做的方 法，对于每1％的错配，Tm值降低1-1.5℃。优选的，选择杂交条件使 得错配小于25％，更优选的是使得错配小于10％或小于5％。在杂交之 后可以接着进行提高严格性的清洗。因此，开始的清洗可以在低严格 下，但接着就要进行较高严格的清洗，直到达到杂交在其下进行的严 格条件。

杂交条件的上述讨论所提供的只是通常指导，但不具有局限性。 因为熟练人员将能够适当变化参数以提供合适的杂交条件，并且能够 考虑一些变化，如多聚核苷酸长度，碱基组成，双链的性质(即 DNA/DNA、RNA/RNA或DNA/RNA)，离子存在的类型，等等。

最优选的，本发明第十个方面的杂交核酸分子与具有图7中所显 示的GW SEQ序列的DNA分子杂交，或者与图7中所显示的一个或多 个盒子区域杂交。

例如，杂交核酸分子可以作为探针或引物使用。

探针可以被用于纯化和/或鉴定核酸。它们可以用于诊断。例如， 探针可以被用于确定某一患者是否在其基因组中具有可能影响Egr-1 的转录或该转录的调控的缺陷。这些缺陷可能使患者具有患多种病症 的倾向，这可以使用本发明中的治疗方法进行治疗。例如，伤口愈合 可以通过一个或多个SRE上的突变被损害。这些突变可以通过使用探 针进行鉴定，这些探针与GW SEQ中所显示的一个或多个SRE杂交的 特异性程度高于与突变SRE杂交的特异性(或反之亦然)。

理想的是，本发明第十个方面的杂交分子与具有图7中所显示的 GW SEQ序列或其一个或多个盒子区域的DNA分子之间的杂交，其严格 性高于和具有图7中所显示的ON SEQ序列或其一个或多个盒子区域 的DNA分子之间的杂交。例如，可以设计杂交分子对图7中所显示的 GW SEQ的SRE3、SRE5和cAMP区域中的一个或多个具有高度的特异 性(所有这些区域在序列上与ON SEQ中的相应区域存在区别)。

在本发明的第十个方面范围之内的杂交核酸分子包括引物。引物 在扩增核酸分子或其部分中是有用的，如通过PCR技术。

除了作为探针或引物有用之外，本发明第十个方面中的核酸分子 可以用作反义分子来改变表达。该技术被用于反义治疗。反义分子可 以被用于，如通过阻止或降低转录水平来阻断或降低Egr-1的表达。 可选地，它们可以被用于通过结合调控Egr-1转录的调节子通常结合 的区域，来阻止或降低该调节子对于Egr-1转录的调控。

重要的是需要注意用于本发明中的核酸分子不仅包括具有经典的 DNA或RNA结构的分子，而且包括具有修饰(非磷酸二酯)的变体主 链，如吗啉衍生物和肽核酸(PNAs)，其含有一个以N-(2-氨基乙基) 甘氨酸为基础的拟肽主链(见NielSen,P.E.，生物物理和生物分子 结构年鉴，24 167-83(1995))。具有修饰的主链的核酸变体相对于 未修饰的核酸稳定性提高，并且当需要长时间的杂交时(如在反义治 疗时)，其是尤其有用的。

从以上的讨论中，应该理解的是很大数量的核酸是在本发明的第 十个方面的范围之内的。除非本文另外指明，否则本发明第十个方面 中的核酸分子可以因此具有一个或多个以下的特征：

1)它们可能是以DNA或RNA的形式存在(包括天然存在的DNA或 RNA结构的变体，其具有非天然存在的碱基及/或非天然存在的主 链)。

2)它们可能是单链或双链(一段给定的链及其互补的链均包括在 内，不论它们是否相联)。

3)它们可能是以重组的形式提供，即共价结合到一段异源的5’和 /或3’侧翼序列以提供一种嵌合分子(如载体)，其不是天然存在的。

4)它们可能没有与通常情况下天然存在的5’和/或3’侧翼序列一 起提供。

5)它们可能是以基本上单纯的形式(如以分离的形式)提供。这可 以通过，如使用探针来分离具有一种理想靶基因序列的克隆分子，或 者通过使用化学合成的技术合成。因此，该核酸分子可能以基本上没 有污染蛋白和/或其它核酸分子的形式。

6)它们可能以有内含子(如，作为一段全长的基因)或没有内含子 形式提供。

本发明第十个方面的各种用途将在此处进行进一步的详细的讨 论。

本发明第十个方面的核酸分子可能包含任何理想的编码序列。 如，一个或多个血清应答因子可以与一段编码序列操作性连接，该编 码序列通常是不与这些因子连接的。例如如果需要对一种给定的、由 通常不表现血清应答的编码序列编码的治疗制剂提供血清应答，则其 在伤口愈合中是有用的。

然而本发明第十个方面的核酸分子优选的是包括Egr-1或其生物 活性片段的编码序列。

所希望的是，本发明第十个方面的核酸分子包括一个启动子区 域，并且可以被用于通过允许Egr-1 mRNA的转录来提供Egr-1。然 后其可以通过存在于宿主内的核糖体进行翻译。因此，核酸分子可以 被施用到某一患者(优选的是人类或其它哺乳动物)，使得在该患者体 内可以合成附加的Egr-1，或者(次优选的)它们可以被用于制备 Egr-1本身，然后可以将该Egr-1施用给该患者。

本发明第十个方面中用于施用到某一患者的核酸分子优选的是能 够以某种方式转录，以使得该转录可以被一种或多种在该患者体内调 节Egr-1转录的因子调控。

例如，可以提供一种或多种SSRE(如以上所讨论的)以提供具有切 变应力应答的Egr-1的转录。当本发明第十个方面的核酸分子被施用 到某一患者(而不是使用Egr-1本身)时，这是尤其有利的。当本发明 第十个方面的核酸分子被用于体内治疗伤口时，切变应力应答是有利 的。这是由于在受伤位点的切变应力应答可以导致因子结合到SSRE 上，这可以刺激Egr-1转录增强。所得到的Egr-1水平的提高可以加 速伤口的愈合。

在某些情况下，可能需要降低切变应力应答水平。例如，可能需 要通过这种方法降低伤口的治疗速度(可能是为了减少疤痕)。另外， 可能需要降低与切变应力应答相关的心血管问题的危险。

本发明的第十方面还可用于这里。它首次提供了与人Egr-1转录 调控相关的五个人SREs的完整序列。可以对这些序列中的一种或多 种进行突变，以便相对用图7所示GW SEQ的一个或多个SREs可获得 的切变应力应答水平而言，降低该应答的水平。

在另一些情况下，可能需要通过在五个SRE中的一个或多个上提 供突变来提高切变应力应答的水平，目的是提高与使用图7GW SEQ 中所显示的SRE可得到的应答相关的切变应力应答的水平。这些突变 可能如在加速伤口的愈合中是有用的。

本发明第十个方面的核酸分子可能以载体的形式存在，虽然这不 是必要的。它们可能通过物理的方法施用到某一患者体内。这些方法 包括局部施用在一种适当的媒介物内的“裸露的”核酸载体-如在治 疗上可接受的赋形剂的溶液中，如磷酸缓冲盐溶液(PBS)。这些方法 包括颗粒轰击(这也即是已知的“基因枪”技术，在US-5371015中被 描述)。在本说明书中，惰性颗粒，如用核酸包裹的金颗粒通过在高 压下从一种发射装置中放出，以足够的速度被加速，使得它们可以穿 过受伤部位表面(如皮肤)(用本发明中的核酸分子包裹的颗粒在本发 明的范围之内，以及含有这些颗粒的装置)。其它将DNA直接施用到 某一受体体内的物理方法包括超声、电穿孔、电穿孔和微量接种。尤 其优选的是微量接种的传递模式。其描述在US-5697901中。

本发明第十个方面的核酸分子也可以通过特定的传递载体被施 用。

可以使用任何适于基因治疗的载体。基因治疗方法的讨论如，由 Verna等，在自然389:239-242中所披露的。病毒及非病毒系统均 可以使用。

以病毒为基础的系统包括以逆转录酶病毒、慢病毒、腺病毒、腺 病毒相关的病毒、疱疹病毒和牛痘病毒为基础的系统。

非病毒基系统包括直接施用以核酸和脂质体为基础的系统。

本发明第十个方面的核酸序列甚至可以通过转化宿主细胞的方式 被施用。这些细胞包括从患者体内收集到的细胞。本发明中的核酸分 子可以在体外被引入到这种细胞内，然后可以将该转化的细胞返回到 该患者体内。该核酸分子不需要被作为载体引入，因为可以引入非载 体核酸分子。一些这样的分子可以通过同源重组，整合到已经存在于 宿主细胞内的核酸中。

本发明也包括可以用于提供多肽(如Egr-1)的表达系统。然后可 以将这些多肽用于治疗。

优选的表达载体是真核载体。然而也可以使用原核载体。合适的 载体通常将包括一段与一个或多个调控序列操作性连接的编码序 列。优选地，该编码序列编码Egr-1。

许多不同的表达系统是已知的并且在，如Sambrook等(分子克 隆，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))中被 讨论。

从以上的讨论中应该理解的是本发明第十个方面的核酸(其可能 以载体的形式存在)可以在多种治疗应用中被使用，以及可以使用这 种核酸来产生多肽。因此本发明包括含有上述核酸或多肽的治疗上可 接受的组合物，该组合物与一种或多种治疗上可接受的载体选择性地 组合。

这些载体可能包括，但不局限于盐溶液、缓冲盐溶液、葡萄糖、 水、甘油、乙醇及它们的组合。

多肽和核酸在本发明中可以单独或与其它物质(如治疗物质)结合 使用。例如，在特定环境下(如，需要使疤痕最小、阻止再狭窄 (resteriosis)、调节血管壁钙化和/或抑制细胞增殖(如在癌症中)) 可以施用Egr-1抑制剂(如NAB1和/或NAB2)。当需要使用两种或多 种活性制剂时，其作为组合制剂进行同时、分别或连续使用。

本发明中的药剂组合物可以以任何有效的方式施用，包括，如， 尤其是通过局部、静脉内、肌肉内、鼻内或皮下途径使用。通常优选 的是该组合物可以局部使用，如在受伤位点或其相关症状的位点上或 其附近使用。然而可以采用系统性施用。

一种活性制剂可以作为一种注射性组合物(如作为一种无菌的水 性分散体)施用到某一患者体内。其优选的是与某一受体的体液基本 上等渗。

可选地，该组合物可以被配制用于局部使用，如以软膏、乳膏、 外用药水、眼药膏、滴眼药、滴耳剂、嗽口水、浸渍敷料和缝合及气 溶胶的形式使用。其可以含有添加剂，包括，如防腐剂、辅助药物渗 透的溶剂、以及在软膏和乳膏中的软化剂。这种局部制剂也可以含有 兼容性的载体，如乳膏或软膏基质，以及用于外用药水的乙醇或油 醇。这些载体可以构成制剂质量的大约1％到大约98％。更通常的它们 将构成制剂质量的80％。

最优选的，含有本发明中的核酸的药剂组合物适于通过“基因枪” 技术施用。因此，该核酸可以与能够作为发射体使用的颗粒(如金颗 粒)结合。

为了施用到哺乳动物，尤其是人类，希望的是一种活性制剂的日 剂量水平将为从0.01毫克/千克到10毫克/千克，典型的是大约1毫 克/千克。在实践上，一个内科医生将确定最适于某一患者的确切剂 量，这一剂量可以依据特定患者的年龄、体重和状况而有很大不同 变。如果产生副作用，可以依据良好的临床实践降低剂量。

除了治疗作用之外，本发明也可以被用于诊断。如以上所讨论的， 本发明提供了可以被用于诊断不同病症的探针。它们可以作为诊断试 剂盒的部分被提供，该试剂盒可能包括其它组分-如一种或多种清洗 液体、检测杂交的装置、使用的指导，等。该探针可以用一种可检测 的标记进行标记(如，荧光标记或放射标记)。

本发明可以被用于筛选。例如，本发明第十个方面的核酸分子(如 一种含有图7所示GW SEQ或其部分的分子)可以被用于筛选与其结合 的物质。可以对这些物质进行分析来看它们是否会影响Egr-1的转 录。因此它们可能在以上所讨论的设计治疗药物中是有用的。可选 地，本发明第十个方面的核酸分子可以被用于筛选能够阻断另一种物 质与该核酸分子结合的物质。如果另一种物质是Egr-1转录的调控 子，阻断上述结合的物质也能够用于设计以上所讨论的一种或多种治 疗的药物。

本发明可以被用于研究，如在研究凭借什么来制造一个或多个与 给定的核酸分子相关的改变时，本发明第十个方面的核酸分子可以作 为一个起点。这可以被用作确定该分子的哪个部分在Egr-1的转录中 是重要的，或者在调控这种转录中是重要的。如可以制造与图7中所 显示的GW SEQ的一个或多个盒子区域相关的插入/删除/替换，并且 可以调整这些插入/删除/替换的影响。可以制造变化来设法鉴定可以 使Egr-1转录水平提高或降低的核酸分子。

本发明每个方面的优选的特征相互作为其它方面的必要的变用。 本说明书中所提到的现有技术文件在法律准许的最大范围内，结合在 本说明书中。

下面将参考附图仅以举例形式对本发明进行描述，其中：

图1a和b表示VEGF的Egr-1表达；

图1c和d表示TGF-B1的Egr-l表达；

图1e和f表示PDGF A的Egr-1表达。

图2a表示Egr-1对大鼠切除伤口收敛的影响；

图2b表示Egr-1 DNA转染对愈合的大鼠切除伤口的组织学影响；

图2c表示Egr-1对大鼠切除伤口中胶原蛋白沉积的影响；

图2d表示使用vWF免疫染色得到的Egr-1对大鼠切除伤口中的 血管生成形式的影响；

图3a表示使用Mirus TranslT(Cambridge Bioseciences)，将 pGL3荧光素酶对照质粒转染到血管生成共培养系统中的脂质∶DNA比 例(v/w)的最优化。

图3b表示Egr-1对血管生成的影响；

图4a表示使用western印迹分析得到的样品对骨负荷*影响；

图4b表示在负荷之后对人TE85骨细胞内的Egr-1蛋白进行的 western印迹分析；

图4c表示在负荷之后对TE85骨细胞产生的PDGF BB进行的ELISA 分析；

图4d表示在将CMV-TGF-B1转染到ROS细胞内之后对VEGF和 TGF-B1的检测；

图4e表示在将CMV-TGF-B1转染MC3tE1细胞之后对VEGF和 TGF-B1的检测；

图5表示在异位骨形成的鼠模型中，Egr-1对其中碱性磷酸酶水 平的影响；

图6a表示对用CMV Egr-1转染的人平滑肌细胞的抗Egr-1抗体 染色；

图6b表示对用CMV Egr-1DNA转染的猪的平滑肌细胞的抗Egr- 1抗体染色；

图6c表示通过Fugene将pGL3荧光素酶对照质粒对人SMC的最 优转染；

图6d表示通过Fugene将pGL3荧光素酶对照质粒对猪SMC的最 优转染；

图6e表示通过将CMV-Egr-1转染到人SMC对VEGF产生/分泌的 活化；

图6f表示通过将CMV-Egr-1转染到人SMC对HGF产生/分泌的活 化；

图6g表示通过将CMV-Egr-1转染到人SMC对PDGF产生/分泌的 活化；

图6h表示在受伤之前和之后Egr-1蛋白在血管壁内的免疫染色；

图7表示分别表示为GW SEQ和ON SEQ的两段核酸序列的比较。 ON SEQ是已发表的早期生长应答-1启动子(Sakamoto等，癌基因6； 867-871,1991),GW SEQ是本发明的一种序列，其含有多种如所显 示的碱基插入/删除及替换(黑体下划线)。

图8表示图7中所显示的序列的一种变体，该变体在Egr-1结合 位点(EBS)中具有一个修饰的EBS区域突变，如黑体下划线所示。

图9表示小鼠Egr-1基因中已发表的5’上游序列(Morris，核酸 研究16:8835-8846)。该核苷酸从加帽位点=+1处开始编号。假定的 TATA和CCAAT因子包括在盒子内。下划线为潜在的调控因子，并在图 中标明。点下划线表示用于引物延伸研究的29-聚体；

图10表示通过pFA-MEK1瞬时转染活化SRE5。

实施例

实施例1和2描述了基因枪传递与金颗粒复合的β-半乳糖苷酶和 Egr-1表达质粒DNA，传递到啮齿类的皮肤。

a)管道装置的制备

造管制备装置设置在一个无菌的气体层流橱柜内，用70％的I.M.S 擦洗并在橱柜内风干。将从氮气罐至管道制备装置之间的气体线性管 道高压灭菌，并加上一个Gelman同轴的0.2微米滤膜。将灭过菌的 管道和制备装置中的气体入口通过一个luer锁定连接器连接起来， 并使气体以0.2升/分钟流过以使管道完全干燥。

将颗粒发送管道与制备装置连接，并使气体如以上流过以使管道 内部完全干燥。在管道内任何残留的湿气都将导致金颗粒与管壁的不 良或不均匀接触，这可能会对任何实验的结果产生不利影响。

b)DNA-金微载体颗粒的制备：

1.0微米的金颗粒购自Bio-Rad UK。称量一份分装的金颗粒(53 毫克)装入一个微量离心管中，加入100微升0.05M亚精胺并轻轻震 荡该管。

加入100微升含有100-120微克表达Egr-1或β-半乳糖苷酶的质 粒DNA的DNA溶液，然后边震荡边加入100微升1MCaCl2。将该混合 物在室温下静置10分钟，然后离心沉淀。去掉上清液并用无水乙醇 将金颗粒洗三次。

最后将金颗粒重悬在含有0.1毫克/毫升聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的 无水乙醇中。

估计DNA包裹到金微颗粒上的效率，然后释放到水分散相中：所 有样品(起始物质、DNA/金颗粒复合物形成之后的沉淀后上清液、以 及洗脱的物质)均在“GeneQuant＂”(Pharmacia)内进行DNA分析。残 留的沉淀后DNA给出了未结合物质的估计，并认为结合：起始物质的 比例是包裹效率。

c)将DNA/微载体上清液装入金传送管道内：

然后使用注射器将在乙醇/PVP中的金颗粒上清液装入传送管道 内，并允许上清液在管道内静置3-5分钟。在这段时间内，金颗粒沉 淀在管道的内表面，使得乙醇可以通过注射器被除去。当乙醇被除去 时，旋转管道使金颗粒均匀分散在管道的内表面上。旋转2-3分钟之 后，将氮气以0.1升/分钟的速度通过管道以除去残留的乙醇并使金 颗粒黏附。10分钟之后，移去管道，使用(Bio-Rad UK)提供的切割 器将其切成适当的长度，并将切割后的管道装入基因枪内。

使用商业上可供的检测Egr-1的抗体制剂(Santa Cruz)，采用常 规的免疫组化确定Egr-1的表达和活性，并在1-7天内监测Egr-1靶 基因产物(Santa Cruz或R&D系统)和表达。阴性对照是无效的DNA。

实施例1

Egr-1DNA传递到未受伤的啮齿类皮肤

1．1方法

通过基因枪调节的颗粒传送，将一种包括Egr-1cDNA、由人巨细 胞病毒启动子(hCMV；Houston等，Arterioscler.Thromb.Vasc. Biol.,19；281-289,1999)驱动的表达质粒传递到未受伤小鼠的背 部。金/DNA复合物的制备如以上所描述，使用基因枪的压力为 350psi，金颗粒的大小为1.6微米，每只动物发送0.5-1.0微克DNA。 在发送DNA的0、1、2和6天之后宰杀动物，将其皮肤包埋在OCT内 并在干冰/己烷中速冻。将切片制为0.7微米并通过免疫染色、使用 抗VEGF、PDGF A、TGFβ和Egr-1的抗体检测Egr-1靶生长因子。

1．2结果

显示出Egr-1活化VEGF(图1a和1b)、TGFβ(图1c和1d)、PDGF A(图1e和1f)的免疫组化数据。结果表明VEGF蛋白在第1和第2天 明显被增量调节，在第6天下降，TGFβ在第6天增量调节但不在第1 和第2天，以及PDGFA在Egr-1DNA传递2小时以后迅速增量调节(标 为0天)。

1．3结论

这些数据证明Egr-1在体内可以活化靶生长因子的表达，其中一 些在本说明书中被描述。这些数据说明Egr-1活化生长因子发生在在 时间上分开的时间段内。

在使用未受伤的啮齿类皮肤已经确证了Egr-1靶基因的活化(实 施例1)之后，则进行切除的大鼠伤口的Egr-1和β-半乳糖苷酶基因 枪传递以鉴定Egr-1对伤口愈合速度的影响。

实施例2

使用Egr-1转录因子以在啮齿类中促进伤口修复

2．1方法

2．1．1质粒构建：

在本研究中使用的表达质粒是CMV启动的β-半乳糖苷酶和CMV启 动的Egr-1(Houston等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol,19； 281-289,1999)。质粒在大肠杆菌XL-2Blue MR中扩增，DNA使用 Qiagen maxi试剂盒制备。

2．1．2颗粒调节的基因转移：

将18只体重为250克的雄性Sprague Dawley大鼠在氧气/氮氧 化物为2∶1的混合气体中，使用异氟烷麻醉。在大鼠背部的两个转 染位点(距头部8厘米，脊柱两侧各1.5厘米)的准备首先是剪去皮 毛，然后用剃刀削净。在各受伤位点进行两次转染，间隔8毫米，通 过将Egr-1或β-半乳糖苷酶的质粒/金复合物以350 psi加速到皮肤 内。每次转染总的DNA量不少于1.7微克(平均每个伤口3.4微克)

2．1．3切除伤口的愈合模式：

转染后24小时麻醉动物，在转染的准确位点用生检刀制造两个全 层切除伤口(直径8毫米)。受伤之后迅速用照相机/录象设备记录各 伤口，并使动物从麻醉中苏醒。在受伤的2、4和6天之后宰杀6只 动物并同样用相同的照相机/录象设备记录各伤口。记录之后，切开 伤口并收集以进行常规的组织学和免疫组织化学。

2．1．4愈合分析：

ⅰ)宏观鉴定

使用图象分析确定受伤区域，愈合表现为初始受伤区域的百分率提 高。采用一种成对的Mann-Whitney检测来估计处理过的和对照组群之 间区别的统计显著性。

ⅱ)微观鉴定

组织学分析：

在解剖之后在每个时间点，将各伤口水平切开。一半放入4％多聚 甲醛中24小时并加工，以便进行蜡固定组织学分析。使用薄片切片 机从每个伤口切出5微米的薄片并用van Geison染色薄片。使用这 一组织染色，鉴定伤口愈合的关键标记，包括上皮再形成和胶原蛋白 含量，并在处理过的和对照薄片之间进行比较。

免疫细胞化学

进行免疫细胞化学和图象分析以将使用常规组织学所看到的区别 量化。一旦在OCT中冷冻，则使用低温恒温器将各伤口的第二部分切 成7微米的薄片。将来自各伤口的两个薄片在冰冻的丙酮中固定，并 进行主要是对胶原蛋白I和冯.威利布兰德因子(von Willebrand factor,vWF)的荧光免疫染色。免疫染色之后迅速将各薄片放在荧光 显微镜下并用×25倍的放大记录受伤面积。整合图象并设定界限以 使背景最小化。采用图象分析测定染色的面积和强度并绘出曲线图。 使用一种Man-Whitney非参数检测来估计处理过的和对照组之间区 别的统计学显著性。

2．2结果

2．2．1Egr-1对大鼠切除伤口愈合的影响

(ⅰ)伤口收敛

在受伤6天以后，与对照(β-半乳糖苷酶)相比，相应于Egr-1转 染的直径为8毫米的全层大鼠真皮切除伤口在边缘收敛较快。统计学 上显著增强(p＜0.05)的收敛发生在受伤6天以后，其中Egr-1处理的 伤口收敛后的面积小于对照7％(图2a)。

(ⅱ)组织学分析：

在受伤4和6天以后，用van Gieson染色的伤口切片在伤口的 组织学上表现出明显的区别。在受伤2天以后，在Egr-1和β-半乳糖 苷酶转染的伤口之间存在很小的区别。两种处理均在受伤位点显示单 核细胞，意味着早期炎性应答，伴随着早期痂的形成，但没有上皮再 生成。在受伤的4天以后，上皮再生成仍然没有开始，然而用Egr-1 转染的伤口与β-半乳糖苷酶相比在受伤位点具有更多的胶原蛋白。在 受伤的6天以后，与β-半乳糖苷酶相比，用Egr-1处理的伤口具有更 成熟的肉芽组织，在受伤位点表现出明显更多的胶原蛋白，其程度达 到在其中可以看到清晰的厚胶原蛋白纤维。与β-半乳糖苷酶中的0％ 相比，用Egr-1处理的上皮再生成完成了伤口的50％。在组织学上， 用Egr-1处理的伤口与β-半乳糖苷酶相比，表现出愈合的加速(图 2b)。

(ⅲ)使用免疫组织化学和图象分析对Egr-1在胶原蛋白沉积中 的影响进行量化：

对用Egr-1或β-半乳糖苷酶处理的伤口的7微米低温切片进行胶 原蛋白I免疫染色，并使用图象分析对染色进行量化。与Egr-1相比， 用β-半乳糖苷酶处理的伤口在受伤2天以后具有明显较多的胶原蛋 白。在受伤的4和6天以后，Egr-1转染的伤口比对照(β-半乳糖苷 酶)具有更多的胶原蛋白沉积，这证明了使用常规的蜡固定组织学方 法所看到的发现。Egr-1转染提高了受伤4和6天以后胶原蛋白沉积 的量(图2c)。

(ⅳ)使用免疫组织化学和图象分析对Egr-1在血管生成中的影响 进行量化：

采用冯.威利布兰德因子对伤口低温切片进行免疫染色和图象分 析测定受伤位点处阳性染色的面积，来对血管生成进行量化。在受伤 的2天以后，与对照(β-半乳糖苷酶)相比，Egr-1转染的伤口具有明 显(p＜0.01)较多的新血管。在受伤的4和6天以后，Egr-1和β-半乳 糖苷酶转染的伤口具有类似水平的血管生成。表达Egr-1的DNA的转 染比对照早2天促进血管生成(图2d)。

2．3结论

Egr-1转染大鼠切除伤口通过提高收敛、上皮再生成和胶原蛋白 沉积的速度来加速愈合。Egr-1转染也在受伤2天以后促进了血管生 成。

实施例3

使用Egr-1转录因子促进血管生成

3．1方法

将在hCMV启动子控制之下的Egr-1(Houston等，Arterioseler. Thromb.Vase.Biol.,19；281-289,1999)转染到被设计用于在体 外测定血管生成的人细胞共培养系统内。血管生成试剂盒(TCS Biologicals)如商家指导所描述的进行使用，分别采用VEGF蛋白(2 纳克/毫升)和苏拉明(20μM)作为血管生成的阳性和阴性对照。

采用pGL3对照荧光素酶(Promega)对共培养系统进行转染的最优 化，同时将1.0微克和0.5微克CMV-βgal作为正规化质粒用作转染 对照。采用两种比例的脂质：DNA(v/w)；2∶1和4∶1(图3a)。在一个 24孔的微量滴定板中，CMV Egr-1DNA以每孔0.5、1.0、1.5和2.5 微克，各三孔，使用Mirus Transit试剂(Cambridge Biosciences) 和DNA比例为2∶1进行转染。向三组重复的孔中加入VEGF蛋白阳性 对照和苏拉明阴性对照。在共培养11天以后，通过对细胞进行内皮 细胞标记PECAM-1的染色和使用BCIP/NBT底物显象对血管生成进行 确定。

记录使用四种剂量的Egr-1表达质粒以及VEGF(阳性对照)和苏拉 明(阴性对照)的细管形成的典型图象，并通过采用Ouantimet 600影 像分析和相关软件的图象分析对其进行加工。

3．2结果

在共培养11天以后，作为细管形成来描述的血管生成在光学显微 镜下是可检测得到的。同全孔的图解一样，使用图象分析提供血管生 成的得分，结果是以每单位面积的血管与处理比较进行描述的(图 3b)。

降低的细管形成(用苏拉明(suramin)处理的细胞)和提高的细管 形成(用VEGF蛋白处理的细胞)被显示。Egr-1以相反的剂量依赖方 式表现出促进增强的细管生成。

3．3结论

在共培养系统中，Egr-1转录因子表达是血管由来的。这与实施 例1中的数据相互支持，当通过基因枪传递到小鼠皮肤内时Egr-1表 现出增量调节的生长因子表达(如VEGF)，也与实施例5中的数据相互 支持，在例5中Egr-1转染表现出提高VEGF在人血管平滑肌细胞中 产生的数量。作为一种前血管生成刺激的Egr-1的反向剂量应答与实 施例6中所获得的结果一致，要指出的是Egr-1可能减量调节其自身 的产生(Cao,X.等，J.Biol.Chem.,268,16949-16957,1993； Schwachtgen,J.-L.等，J.,Clin.Invest.,101,254-2549, 1998)。

实施例4

体外使用Egr-1转录因子促进骨发生

4．1骨负荷和生长因子的鉴定

4．1．1方法：

所使用的细胞为TE85，一种人骨肉瘤衍生的造骨细胞样细胞系。 胰酶化亚铺满的细胞层并重悬在含有10％胎牛血清(FCS)和1％盘尼西 林-链霉素(PS)抗生素的DMEM中。将细胞悬液接种到负载底物上(18× 18毫米正方形的组织培养-处理的塑料)。将细胞置过夜使之附着。一 旦附着到负载底物上，则将细胞转移到装有含2％FCS和1％PS的DMEM 的烧瓶内，在负荷刺激之前再培养24小时。

现图4a中所描述的每个时间点有四套条件：

[1]负荷(以每秒3232微应变*进行200个循环的2000微应变 *)。

[2]对照(无负荷)。

[3]阳性对照(100纳克/毫升PMA处理1小时)。

[4]溶质对照。

对于细胞负荷，将细胞从标准的组织培养条件下无菌地转移到负 荷仓内。细胞在仓内负荷的持续时间为4分钟。负荷之后，将细胞转 回到它们先前的培养条件下。对照处理的细胞以几乎一样的方式处 理，除了不对仓内施加负荷。

通过两种不同的方法分析结果。第一，在负荷实验之后，通过 Western印迹分析细胞团以鉴定Egr-1转录因子的存在(图4b)。第 二，通过ELISA分析组织培养基来鉴定所分泌的生长因子的存在(图 4c)。

4．1．2结论：

这些结果显示在骨负荷的条件下，转录因子Egr-1在人骨肉瘤衍 生的造骨细胞样细胞中生成。

对人TE85细胞施加骨负荷刺激了生长因子的产生和分泌，其中的 一个例子是PDGF B。

4．2将CMV TGF-BI转染到MC3T3E1和ROS细胞，接着对细胞培 养上清液进行人TGF-α1和小鼠VEGF的ELISA分析。

4．2．1材料：

(ⅰ)转染

小鼠造骨细胞(MC3T3E1)和大鼠骨肉瘤细胞(ROS17/2.8)被用于 接种到6孔培养皿内。

MC3T3E1细胞在MEM-α、最低要求标准的培养基eagleα改进 (Sigma)、10％胎牛血清(Life Teehnologies)、1％L-谷氨酰胺(Life Technologies)、1％盘尼西林-链霉素(Life Teehnologies)中培养。

ROS细胞在F12 HAM、含谷氨酰胺、10％胎牛血清(Life Teehnologies)、1％盘尼西林-链霉素(Life Teehnologies)的F-12 HAM(Life Technologies)中生长。

细胞使用Fugene(Boehringer Mannheim)、用以上所描述的 (Benn,S.I.等，J.Clin.Invest.,98；2894-2902,1996)CMV TGF-β1表达质粒进行转染。转染到细胞内如所描述的进行：

1)准备一个6孔培养皿，每孔2×105个细胞，放置过夜，直至 达到5-70％铺满。

2)第二天，在6只eppendorf管中各加入94微升无血清培养基 (SFM)和6微升Fugene，在室温下放置5分钟。

3)这6只分开的管中，其中两只不加DNA，然而在剩下4只管中 加入4微克CMV-TGF-β1 DNA。

4)将步骤2)中的Fugene/SFM混合物逐滴加入步骤3)中的管内， 将管轻弹几次，然后在室温下孵育15分钟。

5)将Fugene/SFM/DNA转染混合物逐滴加入它们各自的孔内，同 时旋转6孔培养皿，将培养皿在37℃孵育48小时。

6)分装细胞培养上清液并贮存于-20℃。

对MC3-T3E1细胞和ROS细胞进行以上操作。

通过ELISA(R&D系统)，使用一种基于链霉亲和素-HRP的颜色检 测系统，检测到了TGF-β1和VEGF在细胞培养上清液中的存在。

4．2．2结果：

在转染CMV TGF-β1之后，TGF-β1和VEGF的产生和检测在ROS 细胞(图3)和MC3T3E1细胞(图4)中被表示。这些数据表明一种Egr-1 靶基因，在本实施例中是TGF-β1已经活化了VEGF的产生。

4．3结论

Egr-1的表达和Egr-1靶基因的活化可能协同增强活化VEGF。

实施例5

在体内使用Egr-1转录因子促进骨生成

5．1大鼠异位的骨形成

在啮齿类中皮下移植可能的骨诱导化合物，代表了在目前使用中 最广泛研究的生物分析系统(Wozney,J.M.，细胞分子生物学，131- 167,1993)。一种载体基质的使用增强了骨诱导应答的可再现性和敏 感性。在该分析系统中(Reddi,A.H.等，Proc.Nati.Acad.Sci. USA,69；1601-1605,1972；Sampath,T.K.,ibid,78；7599- 7603,1981)，该载体基质是来自大鼠长骨的骨干部分，其已被研磨成 特定大小的颗粒，接着除去矿物质和通过胍抽提去除生物活性。所剩 下的载体主要由不具有骨诱导能力的骨胶原蛋白组成。然后通过用酒 精沉淀、对水透析或冻干法将待分析的化合物或物质沉淀在该基质 上。然后将该基质组合物植入大鼠的皮下组织持续许多天(在本实验 中是12天)。然后对植入物进行组织学和生物化学的分析，分析它们 诱导骨形成的能力(Sampath，T.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80:6591-6595,1983；Sampath,T.K.等，ibid,84；7109-7113, 1987；Wang,E.ibid,85；9484-9488；Wang,E.等，ibid,87； 2220-2224；Sampath,T.K.等，J.Cell Biol.,98；2192-2197, 1984)。

5．1．1实验方法；

随机分配所准备的20只雄性Sprague Dawley大鼠(42-49天龄， 体重170-220克)，在氟烷麻醉下将两种移植物穿过背、胸*植入皮下。 这些移植物包括四种处理中的一种；

*阴性对照-仅载体(去除矿物质的胍抽提的骨基质DGBM)

*CMV Egr 1 DNA；500微克在载体DGBM上

*CMV Egr 1 DNA；500微克加上重组的骨发生蛋白(BMP)4；5微 克在载体DGBM上，(BMP4因其趋化影响而被使用)

*重组BMP4蛋白5微克在载体DGBM上

插入的当天记为第0天，在操作的12天以后使用一种计划1中提 出的方法宰杀所有的大鼠，去除植入物，清洗软组织并等分成两份。 将一半放于10％福尔马林中以进行组织学检测，将另一半冷冻并贮存 在-20摄氏度。该样品在以后用于分析钙含量和碱性磷酸酶活性。

5．1．2去矿物质的大鼠骨骼的制备；

除去成年Sprague Dawley大鼠的腿节、胫节和肱部的骨干，剥 去软组织并用标准盐溶液冲洗骨髓腔。然后将骨在100毫升氯仿∶甲 醇(2∶1)中搅动10分钟脱脂。该步骤在干燥箱内风干之前重复一次。 然后将骨干在液氮中冷冻并在一台CRC micromill上磨成粉末。将所 得到的粉末筛滤以留下大小严格为75-425微米的颗粒，然后在0.5 M*HCl中连续搅拌3小时以去矿物质。接着将该混合物以19,0000rpm (Kontron CentriksTl24，转头A8.24)、在15摄氏度下离心30分钟。 将沉淀重悬在100毫升水中，搅拌1小时并离心。重复该步骤。然后 将沉淀重悬在100毫升乙醇中，搅拌1小时并离心。乙醇蒸发消失， 将样品重悬在4M盐酸胍/50mM Tris,pH7.4中并搅拌过夜。然后进 行进一步的离心，沉淀重悬在50毫升水中，搅拌1小时并离心。该 步骤再重复两次。然后将样品在干燥箱内干燥过夜。DNA通过机械混 合和冻干法加入到骨上。

5．2组织学检测

在初始的福尔马林固定之后，将样品包埋在甲基丙烯酸甲酯中， 切成1微米的薄片并用冯科萨斯(Von Kossa)和甲苯胺蓝染色。然后 让不了解检测物质的病理学家顾问对来自各植入的三个非毗邻的切 片进行评估并平均得分。

采用一种用于软骨和骨的标准评分系统；

+/-试验性鉴定骨或软骨

1．＞10％各切片新软骨或骨

2．＞25％各切片新软骨或骨

3．＞50％各切片新软骨或骨

4．＞75％各切片新软骨或骨

5．＞80％各切片新软骨或骨

5．3生化检测

将组织在2毫升冰浴的0.25M蔗糖-3mM NaHCO3中匀浆。将匀浆 物在12,000g、12摄氏度离心15分钟，收集上清液用于酶切分析。 使用比色分析，用对硝基苯磷酸盐(PNP)作为底物，测定碱性磷酸酶 的活性。在检测样品与PNP在37摄氏度孵育之后，在一台标准的微 滴定培养皿读出器上，确定405nm处的光密度。

5．4结果

结果如图5所示。将每只大鼠中的两个植入位点的数据彼此独立 地进行分析。提供了中值和四分位差(IQR)，这是由于数据的数值小 及倾斜分布。在以上的变数中已经进行了Kruskal Wallis试验，发 现碱性磷酸酶的水平彼此明显不同。

仅在一个组(CMV Egr-1 DNA/BMP)中，五个植入位点中的一个植 入是骨形成阳性的。采用12天这个单一的时间点进行分析的初始实 验，其被选择以给出早期的预测结果。在这一时间点上，碱性磷酸酶 的活性水平在CMV Egr-1 DNA和CMV Egr-1 DNA/BMP4组群中相对于 对照明显提高。这种碱性磷酸酶活性的临时升高(作为骨形成的先兆) 典型地是通过物质如BMP看出的，BMP在10-15天时刺激骨形成上升 到顶峰，以后则下降。这代表的是在内生软骨瘤的骨化早期所看到的 上升。到目前为止，在所检测的样品中没有表现出钙含量的明显区 别，虽然已经在CMV-Egr-1/BMP4组的许多组织学样品中观察到早期 钙化。这可以解释为是在生检的时标内钙化仅仅是刚开始。

5.5结论

Egr-1提高了异位骨形成的啮齿类模型中碱性磷酸酶的水平，并 且可能促进局部的骨形成。

实施例6

在体外经皮腔内冠状动脉成形术之后，使用Egr-1转录因子以促 进上皮再生成

6．1方法

解冻人或猪的血管平滑肌细胞(SMC；Clonetics)，保存在培养基 中并依据商家的指导对其进行传代直至不迟于第4代。用一种含有从 CMV启动子表达的Egr-1 cDNA的表达质粒转染SMC(Houston等， Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,19；218-289,1999)。在用 荧光素酶报告载体pGL3对照(Promega)或Mirus Transit (Cambridge Biosciences)对SMC进行优化之后，使用Fugene (Boehringer Mannheim)将Egr-1表达DNA转染到SMC中，两种转染 程序均使用β-半乳糖苷酶作为正规化质粒用于转染对照。

6．2结果

CMV Egr-1 DNA被转染到人SMC中，并通过使用一种多克隆抗体 (Santa Cruz)的免疫组织化学和过氧化物酶检测对Egr-1蛋白进行检 测(Sigma and Vector Laboratories)。CMV Egr-1 DNA转染的人 SMC(右手画面)或假转染(左手画面)如图6a中所示，CMV Egr-1 DNA 转染的猪SMC(右手画面)或假转染(左手画面)如图6b中所示。Egr-1 蛋白的表达因棕褐色变而可检测得到。使用Fugene 6(进行进一步的 体外定性，图6c)和Mirus Transit(进行后来的体内研究，图6d) 使DNA转染达到最优化。在这些数据中，常规使用4微克CMV Egr-1 DNA用于生长因子活化，采用的脂质∶DNA的比例为3∶1。在体内基因 传递实验中也采用脂质∶DNA的比例为3∶1。

6．3结论

在CMV Egr-1 DNA转染之后，Egr-1蛋白在SMC中表达。Egr-1 的转染提高了SMC来源的PDGF、HGF和VEGF的产生/分泌。

实施例7

EGR-1启动子序列

跨越-674至+12位核苷酸的人Egr-1启动子片段的合成是通过 PCR，其反应物包括0.5微克人胎盘基因组DNA作为模板，0.4mM dATP、dCTP、dGTP和dTTP,25皮摩尔正向引物(5’-GGC CAC GCG TCG TCG GTT CGC TCT CAC GGT CCC-3’,Mlu 1限制性酶切位点下划线)， 25皮摩尔反向引物5’-GCA GCT CGA GGC TGG ATC TCT CGC GAC TCC-3’(Xho1位点下划线)以及Vent DNA聚合酶(NEB)。将PCR片段 用Mlu1和Xho1酶切，琼脂糖凝胶纯化并将其克隆到载体pGL3基础 (Promega)的多克隆位点上的Mlu1和Xho1位点之间。

现在已经得到了全序列，使所发表的序列中的“缺口”被填满。 这如图7所示，其中由本发明者们得到的完整序列(GW SEQ)与以前所 发表的序列(0N SEQ)进行比较。该启动子序列是有功能的，并且已经 在内皮细胞上的切变应力研究中被研究。

在已发表的人Egr-1启动子序列和我们所描述的序列(图8)之间 的一个重要的区别，位于两个以前未被认识的SRE上。虽然所发表的 SRE5和SRE1序列不结合血清应答因子(SRF)，也没有功能(Nurrish SJ,Treisman R,Mol Cell Biol 1995,15(8):4076-85)，但我们 发现它们与SRE共有序列(图7)一致。

我们已经集中于SRE5。新的SRE5及其相关的Ets转录因子结合 位点作为一种双链低聚核苷酸被合成，并插入到SV40最小启动子载 体(pSV40)上游的NheⅠ位点。

SRE5具有序列； AG GCTGCGACCCGGAAATGCCATATAAGGAGCAGGAAGGATCCCCCCGCCGGCG ACGCTGGGCCTTTAC GGTATATTCCTCGTCCTTCCTAGGGGGGCGGCCGA

2个Ets位点是黑体，SRE下被划线。突出的AG是被用于克隆到 pGLE启动子的部分填满的Nhe位点。

将所得到的报告质粒pSVSRE5与pFA-dbd质粒(编码Gal4 DNA结 合区域(dbd)的构建物)或pFA-MEK1(编码Gal4 DNA结合区域(dbd) 和MAP激酶激酶*MEK1的激酶区域的一种融合蛋白的构建物)一起暂 时转染到HeLa细胞中。Gal4-MEK1融合蛋白是组成性地活化的，并 使Elk1和SRF磷酸化，与SRE5结合。

图10中所显示的结果表明所分离的SRE5序列在MEK1存在下被 活化3倍，而SV40启动子仅表现出极微的活化。

结果显示出新的SRE5是有功能的。