无需全身性免疫遏制的同种异体移植物耐受
阅读：400发布：2021-04-03
专利汇可以提供无需全身性免疫遏制的同种异体移植物耐受专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了一种细胞，所述细胞经遗传修饰以包含至少一种用于在移植到同种异体宿主中时在移植部位提供局部免疫遏制的机制；和用于制备和使用所述细胞的方法。所述细胞包含一组转基因，每种转基因编码为 细胞质 、膜结合或局部作用的基因产物，并且其功能是以下中的一种或多种：减轻 抗原 呈递细胞活化和功能；减轻攻击移 植物 的白细胞活性或溶细胞功能；减轻同种异体移植物细胞的巨噬细胞溶细胞功能和吞噬作用；诱导攻击移植物的白细胞中的细胞凋亡；减轻局部炎性蛋白；以及保护免受白细胞介导的细胞凋亡。所述转基因包括以下基因中的两种或更多种：PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或Fasl、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及Serpin B9或Spi6。，下面是无需全身性免疫遏制的同种异体移植物耐受专利的具体信息内容。
1.一种细胞，所述细胞经遗传修饰以包含至少一种用于在移植到同种异体宿主中时在移植部位提供局部免疫遏制的机制，所述遗传修饰的细胞包含：
-一组转基因，每种转基因编码为细胞质、膜结合或局部作用的基因产物，并且其功能是以下中的一种或多种：
a)减轻抗原呈递细胞活化和功能；
b)减轻攻击移植物的白细胞活性或溶细胞功能；
c)减轻同种异体移植物细胞的巨噬细胞溶细胞功能和吞噬作用；
d)诱导攻击移植物的白细胞中的细胞凋亡；
e)减轻局部炎性蛋白；以及
f)保护免受白细胞介导的细胞凋亡，
其中所述组转基因包括以下基因中的两种或更多种：PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及SerpinB9或Spi6，或编码充当PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8、或Serpin B9或Spi6的激动剂的生物制剂的基因。
2.如权利要求1所述的细胞，其中所述组转基因包括以下基因中的三种、四种、五种、六种、七种或全部八种：PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及SerpinB9或Spi6，或编码充当PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8、或Serpin B9或Spi6的激动剂的生物制剂的基因。
3.如权利要求1所述的细胞，其中所述组转基因基因包括PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及SerpinB9或Spi6，或编码充当PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及SerpinB9或Spi6的激动剂的生物制剂的基因。
4.如权利要求1至3中任一项所述的细胞，其还包含以下转基因中的一种或多种：TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1以及IFNγR1 d39，或编码充当TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1或IFNγR1 d39的激动剂的生物制剂的基因。
5.如权利要求4所述的细胞，其中所述TGF-β或生物制剂在移植物环境中局部作用。
6.如权利要求1至5中任一项所述的细胞，其中所述细胞是干细胞、适用于基因组编辑的细胞和/或治疗性细胞类型的来源。
7.如权利要求6所述的细胞，其中所述细胞是胚胎干细胞、多能干细胞、诱导型多能干细胞(iPSC)、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞或祖细胞、种系干细胞、肺干细胞或祖细胞、乳腺干细胞、嗅成体干细胞、毛囊干细胞、肠干细胞或祖细胞、多潜能干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞、神经干细胞或祖细胞、成体干细胞、体干细胞、组织特异性干细胞、全能干细胞、成纤维细胞、单核细胞前体、B细胞、外分泌细胞、胰腺祖细胞、内分泌祖细胞、成肝细胞、成肌细胞、前脂肪细胞、肝细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、K562人红白血病细胞系、骨细胞、滑膜细胞、肌腱细胞、韧带细胞、半月板细胞、脂肪细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、红细胞-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、胆管细胞、白色或棕色脂肪细胞、激素分泌细胞、表皮角质形成细胞、上皮细胞、肾细胞、生殖细胞、骨骼关节滑膜细胞、骨膜细胞、软骨膜细胞、软骨细胞、内皮细胞、心包细胞、脑膜细胞、角质形成细胞前体细胞、角质形成细胞干细胞、周细胞、神经胶质细胞、室管膜细胞、从羊膜或胎盘膜分离的细胞、浆膜细胞、体细胞，或源自皮肤、心脏、脑或脊髓、肝、肺、肾、胰腺、膀胱、骨髓、脾、肠或胃的细胞。
8.如权利要求1至7中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含至少一种用于控制细胞增殖的机制，所述遗传修饰的细胞包含：
a)对一个或多个细胞分裂基因座/基因座(CDL)的遗传修饰，所述CDL是其一种或多种转录产物由分裂细胞表达的一个或多个内源性或外源性基因座，所述遗传修饰是以下中的一种或多种：
i)消除连接(ALINK)系统，所述ALINK系统包含与编码所述CDL的DNA序列转录连接的编码阴性选择性标记物的DNA序列；以及
ii)CDL调控的外源性活化因子(EARC)系统，所述EARC系统包含与所述CDL可操作连接的基于诱导型活化因子的基因表达系统。
9.如权利要求8所述的细胞，其中所述CDL的遗传修饰包括用以下中的一种或多种进行所述CDL的靶向置换：
a)包含所述ALINK系统的DNA载体；
b)包含所述EARC系统的DNA载体；以及
c)包含所述ALINK系统和所述EARC系统的DNA载体；
其中所述ALINK系统和/或EARC系统各自可操作地连接至所述CDL。
10.如权利要求8或9所述的细胞，其中包含所述ALINK系统的CDL的遗传修饰是纯合的、杂合的、半合子的或复合杂合的，和/或其中包含所述EARC系统的CDL的遗传修饰仅通过所述基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂导致所述CDL的活化。
11.如权利要求8至10中任一项所述的细胞，其中所述CDL是表5中列举的基因座中的一种或多种。
12.如权利要求11所述的细胞，其中所述CDL编码在以下中的一者或多者中起作用的基因产物：细胞周期、DNA复制、RNA转录、蛋白质翻译和代谢。
13.如权利要求12所述的细胞，其中所述CDL是Cdk1/CDK1、Top2A/TOP2A、Cenpa/CENPA、Birc5/BIRC5以及Eef2/EEF2中的一种或多种，优选地其中所述CDL是Cdk1或CDK1。
14.如权利要求8至13中任一项所述的细胞，其中所述ALINK系统包括单纯疱疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韦系统、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统、羧基酯酶/伊立替康系统或iCasp9/AP1903系统，优选地其中所述ALINK系统是单纯疱疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韦系统。
15.如权利要求8至13中任一项所述的细胞，其中所述EARC系统是dox-桥系统、香豆酸盐开关诱导型系统、蜕皮激素诱导型系统、无线电波诱导型系统或配体可逆的二聚化系统，优选地其中所述ERAC系统是dox-桥系统。
16.如权利要求1至15中任一项所述的细胞，其中PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及SerpinB9或Spi6中的一种或多种以等于或大于活化的白细胞中相应内源性基因的表达水平的水平表达。
17.如权利要求16所述的细胞，其中PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及Serpin B9或Spi6中的全部八种以等于或大于活化的白细胞中相应内源性基因的表达水平的水平表达。
18.如权利要求1至17中任一项所述的细胞，其中所述PD-L1转基因编码与SEQ ID NO:
11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
19.如权利要求1至18中任一项所述的细胞，其中所述HLA-G或H2-M3转基因编码与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
20.如权利要求1至19中任一项所述的细胞，其中所述Cd47转基因编码与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
21.如权利要求1至20中任一项所述的细胞，其中所述CD200转基因编码与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
22.如权利要求1至21中任一项所述的细胞，其中所述FASLG或FasL转基因编码与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
23.如权利要求1至22中任一项所述的细胞，其中所述Ccl21或Ccl21b转基因编码与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
24.如权利要求1至23中任一项所述的细胞，其中所述Mfge8转基因编码与SEQ ID NO:
13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
25.如权利要求1至24中任一项所述的细胞，其中所述Serpin B9或Spi6转基因编码与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
26.如权利要求4至25中任一项所述的细胞，其中所述IFNγR1 d39转基因编码与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
27.如权利要求1至26中任一项所述的细胞，其中所述两种或更多种转基因可操作地连接至组成型启动子。
28.如权利要求27所述的细胞，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1α启动子、PGK启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子以及劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。
29.如权利要求1至28中任一项所述的细胞，其中所述细胞还包含编码治疗剂的转基因。
30.如权利要求29所述的细胞，其中所述治疗剂是蛋白质或抗体。
31.如权利要求30所述的细胞，其中所述抗体是抑制性抗体或激动剂抗体。
32.如权利要求29至31中任一项所述的细胞，其中所述治疗剂是表2中列出的剂或已知在癌症、酶或激素缺乏症、代谢病症或变性疾病中突变的基因的野生型型式。
33.如权利要求29至32中任一项所述的细胞，其中所述治疗剂使用选自由以下组成的组的诱导型表达系统来表达：四环素响应元件、光诱导型系统、放射遗传系统、香豆酸盐开关诱导型系统、蜕皮激素诱导型系统、去稳定结构域系统或配体可逆的二聚化系统。
34.如权利要求29至32中任一项所述的细胞，其中所述治疗剂使用选自由以下组成的组的组成型启动子来表达：CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1α启动子、PGK启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子以及劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。
35.一种遗传修饰的细胞群，其包含如权利要求1至34中任一项所述的细胞。
36.一种用于在同种异体宿主中的移植部位提供局部免疫遏制的方法，所述方法包括在同种异体宿主中的移植部位移植如权利要求1至34中任一项所述的细胞或如权利要求35所述的遗传修饰的细胞群。
37.一种用于在同种异体宿主中的移植部位提供局部免疫遏制的方法，所述方法包括：
(i)提供细胞；以及
(ii)在所述细胞中表达一组转基因，每种转基因编码为细胞质、膜结合或局部作用的基因产物，其功能是以下中的一种或多种：
a)减轻抗原呈递细胞活化和功能；
b)减轻攻击移植物的白细胞活性或溶细胞功能；
c)减轻同种异体移植物细胞的巨噬细胞溶细胞功能和吞噬作用；
d)诱导攻击移植物的白细胞中的细胞凋亡；
e)减轻局部炎性蛋白；以及
f)保护免受白细胞介导的细胞凋亡，
其中所述组转基因包括以下基因中的两种或更多种：PD-L1、HLAG或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及SerpinB9或Spi6，或编码充当PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8、或Serpin B9或Spi6的激动剂的生物制剂的基因。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述组转基因包括以下基因中的三种、四种、五种、六种、七种或全部八种：PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及SerpinB9或Spi6，或编码充当PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8、或Serpin B9或Spi6的激动剂的生物制剂的基因。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述组转基因基因包括PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及SerpinB9或Spi6，或编码充当PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及SerpinB9或Spi6的激动剂的生物制剂的基因。
40.如权利要求37至39中任一项所述的方法，其还包括表达以下转基因中的一种或多种：TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1以及IFNγR1 d39，或编码充当TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1或IFNγR1 d39的激动剂的生物制剂的基因。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述TGF-β或生物制剂在移植物环境中局部作用。
42.如权利要求37至41中任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞、适用于基因组编辑的细胞和/或治疗性细胞类型的来源。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述细胞是胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、诱导型多能干细胞(iPSC)、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞或祖细胞、种系干细胞、肺干细胞或祖细胞、乳腺干细胞、嗅成体干细胞、毛囊干细胞、肠干细胞或祖细胞、多潜能干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞、神经干细胞或祖细胞、成体干细胞、体干细胞、组织特异性干细胞、全能干细胞、成纤维细胞、单核细胞前体、B细胞、外分泌细胞、胰腺祖细胞、内分泌祖细胞、成肝细胞、成肌细胞、前脂肪细胞、肝细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、K562人红白血病细胞系、骨细胞、滑膜细胞、肌腱细胞、韧带细胞、半月板细胞、脂肪细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、红细胞-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、胆管细胞、白色或棕色脂肪细胞、激素分泌细胞、表皮角质形成细胞、上皮细胞、肾细胞、生殖细胞、骨骼关节滑膜细胞、骨膜细胞、软骨膜细胞、软骨细胞、内皮细胞、心包细胞、脑膜细胞、角质形成细胞前体细胞、角质形成细胞干细胞、周细胞、神经胶质细胞、室管膜细胞、从羊膜或胎盘膜分离的细胞、浆膜细胞、体细胞，或源自皮肤、心脏、脑或脊髓、肝、肺、肾、胰腺、膀胱、骨髓、脾、肠或胃的细胞。
44.一种控制同种异体宿主中的移植部位处的如权利要求1-7中任一项所述的细胞的增殖的方法，所述方法包括：
a)在细胞中遗传修饰细胞分裂基因座/基因座(CDL)，所述CDL是其一种或多种转录产物由分裂细胞表达的一个或多个内源性或外源性基因座，所述CDL的遗传修饰包括以下中的一种或多种：
i)消除连接(ALINK)系统，所述ALINK系统包含与编码所述CDL的DNA序列转录连接的编码阴性选择性标记物的DNA序列；以及
ii)CDL调控的诱导型外源性活化因子(EARC)系统，所述EARC系统包含与所述CDL可操作连接的基于诱导型活化因子的基因表达系统；
b)将所述细胞或所述细胞群移植在同种异体宿主中的移植部位处；以及
c)i)通过在不存在所述阴性选择性标记物的诱导剂的情况下维持包含所述ALINK系统的所述遗传修饰的细胞来允许包含所述ALINK系统的所述遗传修饰的细胞的增殖，和/或通过将包含所述ALINK系统的所述遗传修饰的细胞暴露于所述阴性选择性标记物的诱导剂来消除和/或抑制包含所述ALINK系统的所述细胞的增殖；和/或
ii)通过将包含所述EARC系统的所述遗传修饰的细胞暴露于所述基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂来允许包含所述EARC系统的所述遗传修饰的细胞的增殖，或通过在不存在所述基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂的情况下维持包含所述EARC系统的所述遗传修饰的细胞来预防或抑制包含所述EARC系统的所述细胞的增殖。
45.如权利要求36至44中任一项所述的方法，其中所述同种异体宿主是哺乳动物。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述同种异体宿主是小鼠。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述同种异体宿主是人。
48.如权利要求36至47中任一项所述的方法，其中所述宿主患有可用细胞疗法治疗的变性疾病或疾患。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述疾病或疾患是失明、关节炎、局部缺血、糖尿病、多发性硬化症、脊髓损伤、中风、癌症、肺病、血液疾病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、ALS、酶或激素缺乏症、代谢病症、自身免疫性疾病、年龄相关性黄斑变性、视网膜营养不良、感染性疾病、血友病、心肌梗塞、变性疾病或年龄相关性疾病。
50.如权利要求37至49中任一项所述的方法，其中PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及Serpin B9或Spi6中的一种或多种以等于或大于活化的白细胞中相应内源性基因的表达水平的水平表达。
51.如权利要求50所述的方法，其中PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及Serpin B9或Spi6中的全部八种以等于或大于活化的白细胞中相应内源性基因的表达水平的水平表达。
52.如权利要求37至51中任一项所述的方法，其中所述PD-L1转基因编码与SEQ ID NO:
11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
53.如权利要求37至52中任一项所述的方法，其中所述HLA-G或H2-M3转基因编码与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
54.如权利要求37至53中任一项所述的方法，其中所述Cd47转基因编码与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
55.如权利要求37至54中任一项所述的方法，其中所述CD200转基因编码与SEQ ID NO:
5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
56.如权利要求37至55中任一项所述的方法，其中所述FASLG或FasL转基因编码与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
57.如权利要求37至56中任一项所述的方法，其中所述Ccl21或Ccl21b转基因编码与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
58.如权利要求37至57中任一项所述的方法，其中所述Mfge8转基因编码与SEQ ID NO:
13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
59.如权利要求37至58中任一项所述的方法，其中所述Serpin B9或Spi6转基因编码与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
60.如权利要求40至59中任一项所述的方法，其中所述IFNγR1d39转基因编码与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
61.如权利要求37至60中任一项所述的方法，其中所述一种或多种转基因可操作地连接至组成型启动子。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1α启动子、PGK启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子以及劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。
63.如权利要求37至62中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含编码治疗剂的转基因。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述治疗剂是蛋白质或抗体。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述抗体是抑制性抗体或激动剂抗体。
66.如权利要求63至65中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是表2中列出的剂或在所述受试者中突变的基因的野生型型式。
67.如权利要求63至66中任一项所述的方法，其中所述治疗剂使用选自由以下组成的组的诱导型表达系统来表达：四环素响应元件、光诱导型系统、放射遗传系统、香豆酸盐开关诱导型系统、蜕皮激素诱导型系统、去稳定结构域系统或配体可逆的二聚化系统。
68.如权利要求63至66中任一项所述的方法，其中所述治疗剂使用选自由以下组成的组的组成型启动子来表达：CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1α启动子、PGK启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子以及劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。
69.一种组合物，其包含如权利要求1至34中任一项所述的细胞。
70.如权利要求69所述的组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。
71.一种药盒，其包含如权利要求1至34中任一项所述的细胞或如权利要求69或70所述的组合物。
72.一种治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至34中任一项所述的细胞或如权利要求69或70所述的组合物。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述疾病或疾患是失明、关节炎、局部缺血、糖尿病、多发性硬化症、脊髓损伤、中风、癌症、肺病、血液疾病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、ALS、酶或激素缺乏症、代谢病症、自身免疫性疾病、年龄相关性黄斑变性、视网膜营养不良、感染性疾病、血友病、心肌梗塞、变性疾病、年龄相关性疾病或表2中列出的疾病或疾患。
74.如权利要求72或73所述的方法，其中在施用至所述受试者之前，使所述细胞分化成谱系限制性细胞类型。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述疾病或疾患是心肌梗塞，并且使所述细胞分化成心肌细胞。
76.如权利要求74所述的方法，其中所述疾病或疾患是失明，并且使所述细胞分化成感光细胞。
77.如权利要求74所述的方法，其中所述疾病或疾患是脊髓损伤、帕金森氏病、亨廷顿氏病或阿尔茨海默氏病，并且使所述细胞分化成神经元。
78.如权利要求74所述的方法，其中所述疾病或疾患是多发性硬化症，并且使所述细胞分化成神经胶质细胞。
79.如权利要求72至78中任一项所述的方法，其中将所述细胞局部施用至需要细胞或所述治疗剂的组织或身体部位。
80.如权利要求72至79中任一项所述的方法，其中静脉内、皮下、肌内、经皮、皮内、胃肠外、动脉内、血管内或通过灌注施用所述细胞。
81.如权利要求80所述的方法，其中通过皮下注射施用所述细胞以产生遮掩的皮下组织。
82.如权利要求72至79中任一项所述的方法，其中作为组织施用所述细胞。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述组织与凝胶、生物相容性基质或细胞支架一起施用。
84.如权利要求72至79中任一项所述的方法，其中以25,000至5,000,000,000个细胞的量施用所述细胞。
85.如权利要求80至83中任一项所述的方法，其中以800,000,000至3,000,000,000个细胞的量施用所述细胞。
86.如权利要求72至85中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用另外的治疗剂。
87.如权利要求86所述的方法，其中在施用所述细胞之前施用所述另外的治疗剂。
88.如权利要求86所述的方法，其中在施用所述细胞之后施用所述另外的治疗剂。
89.如权利要求86所述的方法，其中与施用所述细胞同时施用所述另外的治疗剂。
90.如权利要求86至89中任一项所述的方法，其中所述另外的治疗剂是免疫遏制剂、疾病改善性抗风湿药物(DMARD)、生物响应调节剂(一种类型的DMARD)、皮质类固醇或非类固醇抗炎药物(NSAID)、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、甲氨蝶呤、羟氯喹、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、环磷酰胺、硫唑嘌呤、托法替尼、阿达木单抗、阿巴西普、阿纳金拉、阿那白滞素、塞妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗或托珠单抗、6-巯基嘌呤、
6-硫鸟嘌呤、阿巴西普、阿达木单抗、阿仑单抗、氨基水杨酸盐、抗生素、抗组胺剂、抗TNFα、硫唑嘌呤、贝利木单抗、β干扰素、钙调磷酸酶抑制剂、赛妥珠单抗、皮质类固醇、可玛林、环孢菌素A、环孢霉素、富马酸二甲酯、依那西普、芬戈莫德、富马酸酯、克帕松、戈利木单抗、羟基脲、IFNγ、IL-11、来氟米特、白三烯受体拮抗剂、长效β2激动剂、米托蒽醌、吗替麦考酚酯、那他珠单抗、奥瑞珠单抗、吡美莫司、益生菌、类视黄醇、水杨酸、短效β2激动剂、柳氮磺胺吡啶、他克莫司、特立氟胺、茶碱、托珠单抗、优特克单抗或维多珠单抗、贝伐单抗、兰尼单抗或阿柏西普)、光动力疗法、光凝固、卡比多巴-左旋多巴、多巴胺激动剂、MAO-B抑制剂、邻苯二酚-O-甲基转移酶抑制剂、抗胆碱能药、金刚烷胺、深部脑刺激、抗凝剂、抗血小板剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂、血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、β阻滞剂、组合的α和β阻滞剂、钙通道阻滞剂、降胆固醇药物、烟酸、胆固醇吸收抑制剂、洋地黄制剂、利尿剂、血管扩张剂、双重抗血小板疗法、心脏手术、抗病毒化合物、核苷类似物逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂、抗细菌化合物、抗真菌化合物、抗寄生虫化合物、胰岛素、磺酰脲、双胍、美格列奈、噻唑烷二酮、DPP-4抑制剂、SGLT2抑制剂、α-葡糖苷酶抑制剂、胆汁酸螯合剂、阿司匹林、饮食方案、凝血因子、去氨加压素、凝块保存药物、纤维蛋白密封剂、物理疗法、辅酶、骨髓移植物、器官移植物、血液透析、血液滤过、交换输血、腹膜透析、中链三酰甘油、麦格司他、酶补充疗法、检查点抑制剂、化学治疗药物、生物药物、放射疗法、冷冻疗法、热疗、手术切除肿瘤组织或抗癌疫苗。
91.如权利要求72至90中任一项所述的方法，其中所述方法还包括控制所述细胞的增殖。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述细胞包含ALINK系统，并且所述控制增殖的方法包括：
i)通过在不存在所述阴性选择性标记物的诱导剂的情况下维持包含所述ALINK系统的所述细胞来允许包含所述ALINK系统的所述细胞的增殖；或
ii)通过将包含所述ALINK系统的所述细胞暴露于所述阴性选择性标记物的诱导剂来消除或抑制包含所述ALINK系统的所述细胞的增殖。
93.如权利要求91所述的方法，其中所述细胞包含EARC系统，并且所述控制细胞增殖的方法包括：
i)通过将包含所述EARC系统的所述细胞暴露于所述基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂来允许包含所述EARC系统的所述细胞的增殖；或
ii)通过在不存在所述基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂的情况下维持包含所述EARC系统的所述细胞来预防或抑制包含所述EARC系统的所述细胞的增殖。
94.如权利要求72至93中任一项所述的方法，其中在完成所述疗法后除去所述细胞。
95.如权利要求1至34中任一项所述的细胞或如权利要求69或70所述的组合物，其用于治疗有需要的受试者的疾病或疾患。
96.如权利要求95所述的细胞，其中所述疾病或疾患是失明、关节炎、局部缺血、糖尿病、多发性硬化症、脊髓损伤、中风、癌症、肺病、血液疾病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、ALS、酶或激素缺乏症、代谢病症、自身免疫性疾病、年龄相关性黄斑变性、视网膜营养不良、感染性疾病、血友病、心肌梗塞、变性疾病、年龄相关性疾病或表2中列出的疾病或疾患。
97.如权利要求1至34中任一项所述的细胞或如权利要求69或70所述的组合物，其用于在同种异体宿主中的移植部位提供局部免疫遏制。
98.如权利要求1所述的细胞，其还包含以下转基因中的一种或多种：TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1以及IFNγR1 d39，或编码充当TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1或IFNγR1 d39的激动剂的生物制剂的基因。
99.如权利要求98所述的细胞，其中所述TGF-β或生物制剂在移植物环境中局部作用。
100.如权利要求1所述的细胞，其中所述细胞是干细胞、适用于基因组编辑的细胞和/或治疗性细胞类型的来源。
101.如权利要求100所述的细胞，其中所述细胞是胚胎干细胞、多能干细胞、诱导型多能干细胞(iPSC)、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞或祖细胞、种系干细胞、肺干细胞或祖细胞、乳腺干细胞、嗅成体干细胞、毛囊干细胞、肠干细胞或祖细胞、多潜能干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞、神经干细胞或祖细胞、成体干细胞、体干细胞、组织特异性干细胞、全能干细胞、成纤维细胞、单核细胞前体、B细胞、外分泌细胞、胰腺祖细胞、内分泌祖细胞、成肝细胞、成肌细胞、前脂肪细胞、肝细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、K562人红白血病细胞系、骨细胞、滑膜细胞、肌腱细胞、韧带细胞、半月板细胞、脂肪细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、红细胞-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、胆管细胞、白色或棕色脂肪细胞、激素分泌细胞、表皮角质形成细胞、上皮细胞、肾细胞、生殖细胞、骨骼关节滑膜细胞、骨膜细胞、软骨膜细胞、软骨细胞、内皮细胞、心包细胞、脑膜细胞、角质形成细胞前体细胞、角质形成细胞干细胞、周细胞、神经胶质细胞、室管膜细胞、从羊膜或胎盘膜分离的细胞、浆膜细胞、体细胞，或源自皮肤、心脏、脑或脊髓、肝、肺、肾、胰腺、膀胱、骨髓、脾、肠或胃的细胞。
102.如权利要求1所述的细胞，其中所述细胞还包含至少一种用于控制细胞增殖的机制，所述遗传修饰的细胞包含：
a)对一个或多个细胞分裂基因座/基因座(CDL)的遗传修饰，所述CDL是其一种或多种转录产物由分裂细胞表达的一个或多个内源性或外源性基因座，所述遗传修饰是以下中的一种或多种：
i)消除连接(ALINK)系统，所述ALINK系统包含与编码所述CDL的DNA序列转录连接的编码阴性选择性标记物的DNA序列；以及
ii)CDL调控的外源性活化因子(EARC)系统，所述EARC系统包含与所述CDL可操作连接的基于诱导型活化因子的基因表达系统。
103.如权利要求102所述的细胞，其中所述CDL的遗传修饰包括用以下中的一种或多种进行所述CDL的靶向置换：
a)包含所述ALINK系统的DNA载体；
b)包含所述EARC系统的DNA载体；以及
c)包含所述ALINK系统和所述EARC系统的DNA载体；
其中所述ALINK系统和/或EARC系统各自可操作地连接至所述CDL。
104.如权利要求102所述的细胞，其中包含所述ALINK系统的所述CDL的遗传修饰是纯合的、杂合的、半合子的或复合杂合的，和/或其中包含所述EARC系统的所述CDL的遗传修饰仅通过所述基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂导致所述CDL的活化。
105.如权利要求102所述的细胞，其中所述CDL是表5中列举的基因座中的一种或多种。
106.如权利要求105所述的细胞，其中所述CDL编码在以下中的一者或多者中起作用的基因产物：细胞周期、DNA复制、RNA转录、蛋白质翻译和代谢。
107.如权利要求106所述的细胞，其中所述CDL是Cdk1/CDK1、Top2A/TOP2A、Cenpa/CENPA、Birc5/BIRC5以及Eef2/EEF2中的一种或多种，优选地其中所述CDL是Cdk1或CDK1。
108.如权利要求102所述的细胞，其中所述ALINK系统包括单纯疱疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韦系统、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统、羧基酯酶/伊立替康系统或iCasp9/AP1903系统，优选地其中所述ALINK系统是单纯疱疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韦系统。
109.如权利要求102所述的细胞，其中所述EARC系统是dox-桥系统、香豆酸盐开关诱导型系统、蜕皮激素诱导型系统、无线电波诱导型系统或配体可逆的二聚化系统，优选地其中所述EARC系统是dox-桥系统。
110.如权利要求1所述的细胞，其中PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及Serpin B9或Spi6中的一种或多种以等于或大于活化的白细胞中相应内源性基因的表达水平的水平表达。
111.如权利要求110所述的细胞，其中PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及Serpin B9或Spi6中的全部八种以等于或大于活化的白细胞中相应内源性基因的表达水平的水平表达。
112.如权利要求1所述的细胞，其中所述PD-L1转基因编码与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
113.如权利要求1所述的细胞，其中所述HLA-G或H2-M3转基因编码与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
114.如权利要求1所述的细胞，其中所述Cd47转基因编码与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:
4的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
115.如权利要求1所述的细胞，其中所述CD200转基因编码与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
116.如权利要求1所述的细胞，其中所述FASLG或FasL转基因编码与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
117.如权利要求1所述的细胞，其中所述Ccl21或Ccl21b转基因编码与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
118.如权利要求1所述的细胞，其中所述Mfge8转基因编码与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
119.如权利要求1所述的细胞，其中所述Serpin B9或Spi6转基因编码与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
120.如权利要求4所述的细胞，其中所述IFNγR1 d39转基因编码与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
121.如权利要求1所述的细胞，其中所述两种或更多种转基因可操作地连接至组成型启动子。
122.如权利要求121所述的细胞，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1α启动子、PGK启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子以及劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。
123.如权利要求1所述的细胞，其中所述细胞还包含编码治疗剂的转基因。
124.如权利要求123所述的细胞，其中所述治疗剂是蛋白质或抗体。
125.如权利要求124所述的细胞，其中所述抗体是抑制性抗体或激动剂抗体。
126.如权利要求123所述的细胞，其中所述治疗剂是表2中列出的剂或已知在癌症、酶或激素缺乏症、代谢病症或变性疾病中突变的基因的野生型型式。
127.如权利要求123所述的细胞，其中所述治疗剂使用选自由以下组成的组的诱导型表达系统来表达：四环素响应元件、光诱导型系统、放射遗传系统、香豆酸盐开关诱导型系统、蜕皮激素诱导型系统、去稳定结构域系统或配体可逆的二聚化系统。
128.如权利要求123所述的细胞，其中所述治疗剂使用选自由以下组成的组的组成型启动子来表达：CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1α启动子、PGK启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子以及劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。
129.一种遗传修饰的细胞群，其包含如权利要求1所述的细胞。
130.一种用于在同种异体宿主中的移植部位提供局部免疫遏制的方法，所述方法包括在同种异体宿主中的移植部位移植如权利要求1所述的细胞或如权利要求129所述的遗传修饰的细胞群。
131.如权利要求37所述的方法，其还包括表达以下转基因中的一种或多种：TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1以及IFNγR1 d39，或编码充当TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1或IFNγR1 d39的激动剂的生物制剂的基因。
132.如权利要求131所述的方法，其中所述TGF-β或生物制剂在移植物环境中局部作用。
133.如权利要求37所述的方法，其中所述细胞是干细胞、适用于基因组编辑的细胞和/或治疗性细胞类型的来源。
134.如权利要求133所述的方法，其中所述细胞是胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、诱导型多能干细胞(iPSC)、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞或祖细胞、种系干细胞、肺干细胞或祖细胞、乳腺干细胞、嗅成体干细胞、毛囊干细胞、肠干细胞或祖细胞、多潜能干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞、神经干细胞或祖细胞、成体干细胞、体干细胞、组织特异性干细胞、全能干细胞、成纤维细胞、单核细胞前体、B细胞、外分泌细胞、胰腺祖细胞、内分泌祖细胞、成肝细胞、成肌细胞、前脂肪细胞、肝细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、K562人红白血病细胞系、骨细胞、滑膜细胞、肌腱细胞、韧带细胞、半月板细胞、脂肪细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、红细胞-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、胆管细胞、白色或棕色脂肪细胞、激素分泌细胞、表皮角质形成细胞、上皮细胞、肾细胞、生殖细胞、骨骼关节滑膜细胞、骨膜细胞、软骨膜细胞、软骨细胞、内皮细胞、心包细胞、脑膜细胞、角质形成细胞前体细胞、角质形成细胞干细胞、周细胞、神经胶质细胞、室管膜细胞、从羊膜或胎盘膜分离的细胞、浆膜细胞、体细胞，或源自皮肤、心脏、脑或脊髓、肝、肺、肾、胰腺、膀胱、骨髓、脾、肠或胃的细胞。
135.一种控制同种异体宿主中的移植部位处的如权利要求1所述的细胞的增殖的方法，所述方法包括：
a)在细胞中遗传修饰细胞分裂基因座/基因座(CDL)，所述CDL是其一种或多种转录产物由分裂细胞表达的一个或多个内源性或外源性基因座，所述CDL的遗传修饰包括以下中的一种或多种：
i)消除连接(ALINK)系统，所述ALINK系统包含与编码所述CDL的DNA序列转录连接的编码阴性选择性标记物的DNA序列；以及
ii)CDL调控的诱导型外源性活化因子(EARC)系统，所述EARC系统包含与所述CDL可操作连接的基于诱导型活化因子的基因表达系统；
b)将所述细胞或所述细胞群移植在同种异体宿主中的移植部位处；以及
c)i)通过在不存在所述阴性选择性标记物的诱导剂的情况下维持包含所述ALINK系统的所述遗传修饰的细胞来允许包含所述ALINK系统的所述遗传修饰的细胞的增殖，和/或通过将包含所述ALINK系统的所述遗传修饰的细胞暴露于所述阴性选择性标记物的诱导剂来消除和/或抑制包含所述ALINK系统的所述细胞的增殖；和/或
ii)通过将包含所述EARC系统的所述遗传修饰的细胞暴露于所述基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂来允许包含所述EARC系统的所述遗传修饰的细胞的增殖，或通过在不存在所述基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂的情况下维持包含所述EARC系统的所述遗传修饰的细胞来预防或抑制包含所述EARC系统的所述细胞的增殖。
136.如权利要求37所述的方法，其中所述同种异体宿主是哺乳动物。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述同种异体宿主是小鼠。
138.如权利要求136所述的方法，其中所述同种异体宿主是人。
139.如权利要求37所述的方法，其中所述宿主患有可用细胞疗法治疗的变性疾病或疾患。
140.如权利要求139所述的方法，其中所述疾病或疾患是失明、关节炎、局部缺血、糖尿病、多发性硬化症、脊髓损伤、中风、癌症、肺病、血液疾病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、ALS、酶或激素缺乏症、代谢病症、自身免疫性疾病、年龄相关性黄斑变性、视网膜营养不良、感染性疾病、血友病、心肌梗塞、变性疾病或年龄相关性疾病。
141.如权利要求37所述的方法，其中PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及Serpin B9或Spi6中的一种或多种以等于或大于活化的白细胞中相应内源性基因的表达水平的水平表达。
142.如权利要求141所述的方法，其中PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及Serpin B9或Spi6中的全部八种以等于或大于活化的白细胞中相应内源性基因的表达水平的水平表达。
143.如权利要求37所述的方法，其中所述PD-L1转基因编码与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
144.如权利要求37所述的方法，其中所述HLA-G或H2-M3转基因编码与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
145.如权利要求37所述的方法，其中所述Cd47转基因编码与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
146.如权利要求37所述的方法，其中所述CD200转基因编码与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
147.如权利要求37所述的方法，其中所述FASLG或FasL转基因编码与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
148.如权利要求37所述的方法，其中所述Ccl21或Ccl21b转基因编码与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
149.如权利要求37所述的方法，其中所述Mfge8转基因编码与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
150.如权利要求37所述的方法，其中所述Serpin B9或Spi6转基因编码与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
151.如权利要求37所述的方法，其中所述IFNγR1 d39转基因编码与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％同一性的蛋白质。
152.如权利要求37所述的方法，其中所述一种或多种转基因可操作地连接至组成型启动子。
153.如权利要求152所述的方法，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1α启动子、PGK启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子以及劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。
154.如权利要求37所述的方法，其中所述细胞还包含编码治疗剂的转基因。
155.如权利要求154所述的方法，其中所述治疗剂是蛋白质或抗体。
156.如权利要求155所述的方法，其中所述抗体是抑制性抗体或激动剂抗体。
157.如权利要求154所述的方法，其中所述治疗剂是表2中列出的剂或在所述受试者中突变的基因的野生型型式。
158.如权利要求154所述的方法，其中所述治疗剂使用选自由以下组成的组的诱导型表达系统来表达：四环素响应元件、光诱导型系统、放射遗传系统、香豆酸盐开关诱导型系统、蜕皮激素诱导型系统、去稳定结构域系统或配体可逆的二聚化系统。
159.如权利要求154所述的方法，其中所述治疗剂使用选自由以下组成的组的组成型启动子来表达：CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1α启动子、PGK启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子以及劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。
160.一种组合物，其包含如权利要求1所述的细胞。
161.如权利要求160所述的组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。
162.一种药盒，其包含如权利要求1所述的细胞或如权利要求160所述的组合物。
163.一种治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1所述的细胞或如权利要求160所述的组合物。
164.如权利要求163所述的方法，其中所述疾病或疾患是失明、关节炎、局部缺血、糖尿病、多发性硬化症、脊髓损伤、中风、癌症、肺病、血液疾病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、ALS、酶或激素缺乏症、代谢病症、自身免疫性疾病、年龄相关性黄斑变性、视网膜营养不良、感染性疾病、血友病、心肌梗塞、变性疾病、年龄相关性疾病或表2中列出的疾病或疾患。
165.如权利要求163所述的方法，其中在施用至所述受试者之前，使所述细胞分化成谱系限制性细胞类型。
166.如权利要求165所述的方法，其中所述疾病或疾患是心肌梗塞，并且使所述细胞分化成心肌细胞。
167.如权利要求165所述的方法，其中所述疾病或疾患是失明，并且使所述细胞分化成感光细胞。
168.如权利要求165所述的方法，其中所述疾病或疾患是脊髓损伤、帕金森氏病、亨廷顿氏病或阿尔茨海默氏病，并且使所述细胞分化成神经元。
169.如权利要求165所述的方法，其中所述疾病或疾患是多发性硬化症，并且使所述细胞分化成神经胶质细胞。
170.如权利要求163所述的方法，其中将所述细胞局部施用至需要细胞或所述治疗剂的组织或身体部位。
171.如权利要求163所述的方法，其中静脉内、皮下、肌内、经皮、皮内、胃肠外、动脉内、血管内或通过灌注施用所述细胞。
172.如权利要求171所述的方法，其中通过皮下注射施用所述细胞以产生遮掩的皮下组织。
173.如权利要求163所述的方法，其中作为组织施用所述细胞。
174.如权利要求173所述的方法，其中所述组织与凝胶、生物相容性基质或细胞支架一起施用。
175.如权利要求163所述的方法，其中以25,000至5,000,000,000个细胞的量施用所述细胞。
176.如权利要求171所述的方法，其中以800,000,000至3,000,000,000个细胞的量施用所述细胞。
177.如权利要求163所述的方法，其中所述方法还包括施用另外的治疗剂。
178.如权利要求177所述的方法，其中在施用所述细胞之前施用所述另外的治疗剂。
179.如权利要求177所述的方法，其中在施用所述细胞之后施用所述另外的治疗剂。
180.如权利要求177所述的方法，其中与施用所述细胞同时施用所述另外的治疗剂。
181.如权利要求177所述的方法，其中所述另外的治疗剂是免疫遏制剂、疾病改善性抗风湿药物(DMARD)、生物响应调节剂(一种类型的DMARD)、皮质类固醇或非类固醇抗炎药物(NSAID)、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、甲氨蝶呤、羟氯喹、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、环磷酰胺、硫唑嘌呤、托法替尼、阿达木单抗、阿巴西普、阿纳金拉、阿那白滞素、塞妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗或托珠单抗、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿巴西普、阿达木单抗、阿仑单抗、氨基水杨酸盐、抗生素、抗组胺剂、抗TNFα、硫唑嘌呤、贝利木单抗、β干扰素、钙调磷酸酶抑制剂、赛妥珠单抗、皮质类固醇、可玛林、环孢菌素A、环孢霉素、富马酸二甲酯、依那西普、芬戈莫德、富马酸酯、克帕松、戈利木单抗、羟基脲、IFNγ、IL-11、来氟米特、白三烯受体拮抗剂、长效β2激动剂、米托蒽醌、吗替麦考酚酯、那他珠单抗、奥瑞珠单抗、吡美莫司、益生菌、类视黄醇、水杨酸、短效β2激动剂、柳氮磺胺吡啶、他克莫司、特立氟胺、茶碱、托珠单抗、优特克单抗或维多珠单抗、贝伐单抗、兰尼单抗或阿柏西普)、光动力疗法、光凝固、卡比多巴-左旋多巴、多巴胺激动剂、MAO-B抑制剂、邻苯二酚-O-甲基转移酶抑制剂、抗胆碱能药、金刚烷胺、深部脑刺激、抗凝剂、抗血小板剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂、血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、β阻滞剂、组合的α和β阻滞剂、钙通道阻滞剂、降胆固醇药物、烟酸、胆固醇吸收抑制剂、洋地黄制剂、利尿剂、血管扩张剂、双重抗血小板疗法、心脏手术、抗病毒化合物、核苷类似物逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂、抗细菌化合物、抗真菌化合物、抗寄生虫化合物、胰岛素、磺酰脲、双胍、美格列奈、噻唑烷二酮、DPP-4抑制剂、SGLT2抑制剂、α-葡糖苷酶抑制剂、胆汁酸螯合剂、阿司匹林、饮食方案、凝血因子、去氨加压素、凝块保存药物、纤维蛋白密封剂、物理疗法、辅酶、骨髓移植物、器官移植物、血液透析、血液滤过、交换输血、腹膜透析、中链三酰甘油、麦格司他、酶补充疗法、检查点抑制剂、化学治疗药物、生物药物、放射疗法、冷冻疗法、热疗、手术切除肿瘤组织或抗癌疫苗。
182.如权利要求163所述的方法，其中所述方法还包括控制所述细胞的增殖。
183.如权利要求182所述的方法，其中所述细胞包含ALINK系统，并且所述控制增殖的方法包括：
i)通过在不存在所述阴性选择性标记物的诱导剂的情况下维持包含所述ALINK系统的所述细胞来允许包含所述ALINK系统的所述细胞的增殖；或
ii)通过将包含所述ALINK系统的所述细胞暴露于所述阴性选择性标记物的诱导剂来消除或抑制包含所述ALINK系统的所述细胞的增殖。
184.如权利要求182所述的方法，其中所述细胞包含EARC系统，并且所述控制细胞增殖的方法包括：
i)通过将包含所述EARC系统的所述细胞暴露于所述基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂来允许包含所述EARC系统的所述细胞的增殖；或
ii)通过在不存在所述基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂的情况下维持包含所述EARC系统的所述细胞来预防或抑制包含所述EARC系统的所述细胞的增殖。
185.如权利要求163所述的方法，其中在完成所述治疗后除去所述细胞。
186.如权利要求1所述的细胞或如权利要求160所述的组合物，其用于治疗有需要的受试者的疾病或疾患。
187.如权利要求186所述的细胞，其中所述疾病或疾患是失明、关节炎、局部缺血、糖尿病、多发性硬化症、脊髓损伤、中风、癌症、肺病、血液疾病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、ALS、酶或激素缺乏症、代谢病症、自身免疫性疾病、年龄相关性黄斑变性、视网膜营养不良、感染性疾病、血友病、心肌梗塞、变性疾病、年龄相关性疾病或表2中列出的疾病或疾患。
188.如权利要求1所述的细胞或如权利要求160所述的组合物，其用于在同种异体宿主中的移植部位提供局部免疫遏制。
189.如权利要求1至34中任一项所述的细胞，其中PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及Serpin B9或Spi6中的一种或多种以在所述细胞的基因组中所有基因的基因表达的前5％内的水平表达。
190.如权利要求1至34中任一项所述的细胞，其中PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及Serpin B9或Spi6中的全部八种都以在所述细胞的基因组中所有基因的基因表达的前5％内的水平表达。
191.如权利要求1至3中任一项所述的细胞，其中PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及Serpin B9或Spi6中的一种或多种以在所述细胞的基因组中所有基因的基因表达的前5％内的水平表达。
192.如权利要求1至3中任一项所述的细胞，其中PD-L1、HLA-G或H2-M3、Cd47、Cd200、FASLG或FasL、Ccl21或Ccl21b、Mfge8以及Serpin B9或Spi6中的全部八种都以在所述细胞的基因组中所有基因的基因表达的前5％内的水平表达。
无需全身性免疫遏制的同种异体移植物耐受
发明领域
[0001] 本公开总体上涉及移植领域。本公开进一步涉及用于在移植细胞的环境中产生局部免疫遏制的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 人胚胎干(ES)细胞和诱导型多能干(iPS)细胞的出现对再生医学和转化医学具有范式转变作用。这些细胞可在多能状态下无限自我更新，同时保留分化为人体中的任何细胞类型的能力。此类性质使研究人员更好地了解人类发育和发育障碍的病因。它们还为现代医学提供了针对用常规医学难以治疗或无法治疗的疾病的强大新工具，所述疾病举几个来说包括脊髓损伤、糖尿病、失明、多发性硬化症和癌症。随着对如何控制干细胞分化和分化的细胞产物的生物学的了解不断增强，细胞疗法的适用疾病的功效和范围只会增加。
[0004] 这些应用带来重要且严峻的挑战。连同细胞安全性，最重要的关注之一是来自不同遗传背景的细胞的免疫排斥。免疫排斥仍然是关键的障碍，因为免疫系统已经进化出一套复杂的机制来识别和消除表达特定蛋白质片段的“非自身”细胞–尤其是来自主要组织相容性复合物(小鼠中的MHC，人中的HLA)的那些–在供体与接受者之间不同(Yang等人,Nat Rev Genet.18:309-26(2017))。这种响应几乎肯定是保护免受机会性感染和恶性肿瘤的进化压力的副产物，所述机会性感染和恶性肿瘤通常由“外来”蛋白质和表位的存在来定义。视情况而定，移植的细胞或组织的排斥可在数分钟/数小时(超急性)、数天/数月(急性)和数月/年(慢性)的时间尺度内发生(LaRosa等人,J Immunol.178:7503-9(2007))。这种排斥由来自先天性(Murphy等人,Immunol Rev.241:39-48(2011))和适应性免疫(Issa等人,
Expert Rev Clin Immunol.6:155-69(2010))的细胞类型的复杂且协调的效应引起。
Expert Rev Clin Immunol.6:155-69(2010))的细胞类型的复杂且协调的效应引起。
[0005] 排斥的最重要途径之一是适应性免疫系统的引发和CD8+细胞毒性T细胞的活化。这在抗原呈递细胞加工供体特异性肽且然后活化对次级淋巴器官中的相同肽具有特异性的接受者T细胞后发生(Lechler等人,J Exp Med.155:31-41(1982)；Guermonprez等人,Annu Rev Immunol.20:621-67(2002)；Stockwin等人,Immunol Cell Biol.78:91-102
(2000))。这些T细胞然后迁移至并杀死移植的细胞或组织，伴随释放如穿孔素和颗粒酶的溶细胞因子。NK细胞还可基于外来MHC表达或无MHC表达诱导供体细胞的细胞凋亡
(Kitchens等人,Transplantation.81:811-7(2006)；Benichou等人,Curr Opin Organ Transplant.16:47-53(2011))，并且其他细胞类型如巨噬细胞可通过在植入部位释放促炎性细胞因子而支持排斥(Mannon,Curr Opin Organ Transplant.17:20-5(2012))。许多其他细胞类型和亚型也在同种异体移植物排斥中起作用。由于这些是用于消除常见病毒和细菌病原体的相同免疫途径，因此它们–连同同种异体移植物排斥–在整个脊椎动物物种中都是高度保守的。
(2000))。这些T细胞然后迁移至并杀死移植的细胞或组织，伴随释放如穿孔素和颗粒酶的溶细胞因子。NK细胞还可基于外来MHC表达或无MHC表达诱导供体细胞的细胞凋亡
(Kitchens等人,Transplantation.81:811-7(2006)；Benichou等人,Curr Opin Organ Transplant.16:47-53(2011))，并且其他细胞类型如巨噬细胞可通过在植入部位释放促炎性细胞因子而支持排斥(Mannon,Curr Opin Organ Transplant.17:20-5(2012))。许多其他细胞类型和亚型也在同种异体移植物排斥中起作用。由于这些是用于消除常见病毒和细菌病原体的相同免疫途径，因此它们–连同同种异体移植物排斥–在整个脊椎动物物种中都是高度保守的。
[0006] 用于预防同种异体移植物排斥的当前解决方案涉及以下两种选择：寻找具有匹配的组织相容性单倍型的供体(最可能来自遗传相关家族)，并且常见得多的是使用广泛定向的免疫遏制剂药物(Wiseman,Clin J Am Soc Nephrol.11:332-43(2016)；Malaise等人,Transplant Proc.37:2840-2(2005))。常见药物包括来自以下家族的那些：钙调磷酸酶抑制剂(Flechner等人,Clin Transplant.22:1-15(2008)；Casey等人,Curr Opin Nephrol Hypertens.20:610-5(2011))、抗增殖剂(Hardinger等人,World J Transplant.3:68-77(2013))、mTOR抑制剂(Macdonald,ExpertRev Clin Immunol.3:423-36(2007)；Neuhaus等人,Liver Transpl.7:473-84(2001))和类固醇(Steiner等人,Semin Immunopathol.33:157-67(2011))–其全部遏制T细胞增殖或功能(特别是前三种)。这些药物需要终生每天服用，并且即使错过单个剂量也可能增加排斥的风险。然而，它们并不总是起作用，并且当它们起作用时，慢性排斥率仍然随时间推移持续攀升(Demetris等人,Ann Transplant.2:27-
44(1997)；Libby等人,Immunity.14:387-97(2001))。最重要的是，它们具有全身性作用，并且最终使患者免疫受损，伴随癌症和威胁生命的感染率增加(Gallagher等人,JAm
SocNephrol.21:852-8(2010))。与ES细胞有关，这些药物在允许跨越MHC屏障存活方面仅显示出微小的改善(Swijnenburg等人,Proc Natl Acad Sci U S A.105:12991-6(2008)；
Toriumi等人,NeurolRes.31:220-7(2009))。尽管更新的和更具靶向性的免疫遏制剂试剂变得在皮肤和心脏中可用且进行了测试(Larsen等人,Nature.381:434-8(1996))，以及ES细胞同种异体移植物环境(Pearl等人,Cell Stem Cell.8:309-17(2011)，它们仍发挥全身性作用，并且因此可能使宿主的免疫受到损害。
44(1997)；Libby等人,Immunity.14:387-97(2001))。最重要的是，它们具有全身性作用，并且最终使患者免疫受损，伴随癌症和威胁生命的感染率增加(Gallagher等人,JAm
SocNephrol.21:852-8(2010))。与ES细胞有关，这些药物在允许跨越MHC屏障存活方面仅显示出微小的改善(Swijnenburg等人,Proc Natl Acad Sci U S A.105:12991-6(2008)；
Toriumi等人,NeurolRes.31:220-7(2009))。尽管更新的和更具靶向性的免疫遏制剂试剂变得在皮肤和心脏中可用且进行了测试(Larsen等人,Nature.381:434-8(1996))，以及ES细胞同种异体移植物环境(Pearl等人,Cell Stem Cell.8:309-17(2011)，它们仍发挥全身性作用，并且因此可能使宿主的免疫受到损害。
[0007] iPS细胞的发现的一种提出的益处是可从每个患者并且针对每个患者产生它们。理论上，这些细胞应被保护免受相应患者的免疫排斥(Pearl等人,Sci Transl Med.4:
164ps25(2012))。但是，诱导iPS细胞状态涉及可产生异常和恶性肿瘤的表观遗传变化和体外培养压力，因此需要对每个细胞系进行严格测试和/或遗传修饰，以实现安全性以及功能(Hussein等人,Nature.471:58-62(2011)；Laurent等人,Cell Stem Cell.8:106-18
(2011)；Lister等人,Nature.471:68-73(2011))。最终，对于每一个体患者产生并测试iPS细胞系所需的成本和时间使这种方法在实践上和经济上都不切实际。即使大大降低了成本，也无法帮助需要立即治疗诸如烧伤、心脏病发作、中风和脊髓损伤(等)的疾患的那些患者。此外，鉴于最近的发现，即使当将iPS细胞来源的细胞类型移植到它们所来源的同一宿主中，所述iPS细胞来源的细胞类型是否真正被保护免受免疫排斥仍存在争议(Zhao等人,Nature.474:212-5(2011))。
164ps25(2012))。但是，诱导iPS细胞状态涉及可产生异常和恶性肿瘤的表观遗传变化和体外培养压力，因此需要对每个细胞系进行严格测试和/或遗传修饰，以实现安全性以及功能(Hussein等人,Nature.471:58-62(2011)；Laurent等人,Cell Stem Cell.8:106-18
(2011)；Lister等人,Nature.471:68-73(2011))。最终，对于每一个体患者产生并测试iPS细胞系所需的成本和时间使这种方法在实践上和经济上都不切实际。即使大大降低了成本，也无法帮助需要立即治疗诸如烧伤、心脏病发作、中风和脊髓损伤(等)的疾患的那些患者。此外，鉴于最近的发现，即使当将iPS细胞来源的细胞类型移植到它们所来源的同一宿主中，所述iPS细胞来源的细胞类型是否真正被保护免受免疫排斥仍存在争议(Zhao等人,Nature.474:212-5(2011))。
[0008] 在这方面，一种提出的解决方案是使用天然遏制性或调控性免疫细胞，如Treg或其他，所述免疫细胞在治疗性细胞或组织的移植之前、期间或之后扩增和/或转移(Cobbold等人,Cold Spring Harb Perspect Med.3(6)(2013)；Wood等人,Nature reviews Immunology.12:417-30(2012))。这些策略已经基于对遏制性免疫途径的认识，特别是对CD4+细胞调控性T细胞的亚群进行编程的主调控因子FoxP3的发现(Hori等人,299:1057-61(2003)；Fontenot等人，Nat Immunol.4:330-6(2003))以及它们在促进对同种异体移植物的耐受性中的至关重要性的证据(Kendal等人,JExpMed.208:2043-53(2011))而提出。这种想法与最初的耐受性诱导策略中的一些形成对照，所述策略几乎完全专注于用单克隆抗体消减效应T细胞，与骨髓移植物和供体嵌合状态的产生结合(Cobbold等人,Nature.323:
164-6(1986)；Qin等人,JExp Med.169:779-94(1989))。稍后意识到遏制性T细胞表型的重要性，连同不会杀死细胞、但以使它们对同种异体移植物无响应的方式阻断关键T细胞受体(Cobbold等人,J Immunol.172:6003-10(2004))、但同时能够遏制具有其他特异性的初始T细胞(Cobbold等人,Immunol Rev.129:165-201(1992)；Qin等人,Eur J Immunol.20:2737-
45(1990))的策略。现已被识别为Treg的这些细胞可通过多种机制促进耐受性，所述机制包括(但不限于)遏制性因子如TGFβ(Nakamura等人,The Journal of experimental
medicine.194:629-44(2001)；Nakamura等人,J Immunol.172:834-42(2004))、CTLA4(Tang等人,J Immunol.181:1806-13(2008)；Walker等人,Trends Immunol.36:63-70(2015))、IL10(O'Garra等人,J Clin Invest.114:1372-8(2004)；Chaudhry等人,Immunity.34:566-
78(2011))和IL35(Collison等人,Nature.450:566-9(2007))的表达，以及IL-2的优先消耗(Shevach等人,Immunity.30:636-45(2009)；Setoguchi等人,JExp Med.201:723-35
(2005))，操纵或杀死抗原呈递细胞(Mahnke等人,Cell Immunol.250:1-13(2007)；Shevach等人,ImmunolRev.212:60-73(2006))以及局部ATP(Regateiro等人,Eur J Immunol.41:
2955-65(2011)；Regateiro等人,Clin Exp Immunol.171:1-7(2013))或必需氨基酸
(Cobbold等人,Proc Natl Acad Sci U S A.106:12055-60(2009))的消减。
164-6(1986)；Qin等人,JExp Med.169:779-94(1989))。稍后意识到遏制性T细胞表型的重要性，连同不会杀死细胞、但以使它们对同种异体移植物无响应的方式阻断关键T细胞受体(Cobbold等人,J Immunol.172:6003-10(2004))、但同时能够遏制具有其他特异性的初始T细胞(Cobbold等人,Immunol Rev.129:165-201(1992)；Qin等人,Eur J Immunol.20:2737-
45(1990))的策略。现已被识别为Treg的这些细胞可通过多种机制促进耐受性，所述机制包括(但不限于)遏制性因子如TGFβ(Nakamura等人,The Journal of experimental
medicine.194:629-44(2001)；Nakamura等人,J Immunol.172:834-42(2004))、CTLA4(Tang等人,J Immunol.181:1806-13(2008)；Walker等人,Trends Immunol.36:63-70(2015))、IL10(O'Garra等人,J Clin Invest.114:1372-8(2004)；Chaudhry等人,Immunity.34:566-
78(2011))和IL35(Collison等人,Nature.450:566-9(2007))的表达，以及IL-2的优先消耗(Shevach等人,Immunity.30:636-45(2009)；Setoguchi等人,JExp Med.201:723-35
(2005))，操纵或杀死抗原呈递细胞(Mahnke等人,Cell Immunol.250:1-13(2007)；Shevach等人,ImmunolRev.212:60-73(2006))以及局部ATP(Regateiro等人,Eur J Immunol.41:
2955-65(2011)；Regateiro等人,Clin Exp Immunol.171:1-7(2013))或必需氨基酸
(Cobbold等人,Proc Natl Acad Sci U S A.106:12055-60(2009))的消减。
[0009] Treg的潜在治疗用途的两种方法涉及使用供体抗原的体外扩增连同移植，或利用调控性T细胞与效应T细胞之间的差异的选择性体内扩增。尽管这些策略是令人感兴趣的，但迄今为止，仅通过使用体外或体内扩增的Treg尚不能证明长期接受同种异体移植物。Treg生物学仍然存在许多并发症和未知的方面，包括用于体外或体内扩增的最佳方法，以及治疗相关的剂量和时机。还已经显示，取决于炎性背景，可“击败”抗原特异性Treg遏制(Korn等人,Nat Med.13:423-31(2007))，并且Treg可被NK细胞杀死(Roy等人,J
Immunol.180:1729-36(2008))。
Immunol.180:1729-36(2008))。
[0010] 除Treg外，还探索了其他遏制性细胞类型来诱导同种异体移植物耐受性，如抗原呈递细胞，像树突细胞(DC)(Walker等人,Trends Immunol.36:63-70(2015))。DC是先天性免疫与适应性免疫之间的联系，并且它们可取决于如它们的成熟状态和局部炎症提示的情况诱导效应子和遏制性免疫响应。在同种异体移植物排斥过程中，DC将同种异体移植物抗原呈递到其表面上的MHC(小鼠)或HLA(人)分子连同如CD80、CD86和CD40(等)的共刺激分子的结合沟内，同种异体移植物特异性T细胞克隆识别出所述分子变得活化(Walker等人,Trends Immunol.36:63-70(2015))。可通过暴露于遏制性提示从未成熟状态诱导致致耐受性DC，所述提示使MHC和共刺激分子的表达水平保持较低，并且进而在DC-T细胞相互作用后将初始T细胞促进为无变应性或甚至T调控性亚型。
[0011] 治疗上，这种生物学的一种应用是扩增在体外同时暴露于特定目标同种异体移植物抗原和免疫遏制因子(其中许多已进行了测试，包括TGF-β、IL10、cAMP、前列腺素E2、组胺、神经肽、维生素D2、B2激动剂、HLA-G、氨基葡萄糖)以及诸如皮质类固醇、环孢霉素、他克莫司、雷帕霉素、阿司匹林、吗替麦考酚酯、萨菲菌素(sanglifehrin)和脱氧精胍菌素的药物的DC(Hackstein等人,Nat Rev Immunol.4:24-34(2004))。或者，DC已被遗传工程化以直接表达免疫调节因子，如TGF-β、IL-10、VEGF、FasL、CTLA4-Ig、IDO、NFKb诱饵受体、可溶性TNFR、CCR7以及siRNA诱导的IL-沉默12(Morelli等人,Immunol Rev.196:125-46(2003))。然后将这些培养或工程化的DC与同种异体移植物一起转移至接受者中，以测试它们是否能够延长同种异体移植物的存活，假设它们遏制同种异体移植物特异性T细胞或增加同种异体移植物集中的T调控细胞的数量。
[0012] 在这类的一种原型方法中，用SOCS1转导骨髓来源的DC(从而防止共刺激分子和MHCII的上调)，其延长小鼠心脏同种异体移植物(Fu等人,CellMolImmunol.6:87-95(2009))。在另一展示中，表达FasL的DC也能够延长小鼠心脏同种异体移植物(Min等人,J Immunol.164:161-7(2000))。一般来说，按照这些方法存在使用致耐受性DC的许多单一方法和组合方法(Bjorck等人,J Heart Lung Transplant.24:1118-20(2005)；Sun等人,PLoS One.7:e52096(2012)；Li等人,J Immunol.178:5480-7(2007)；Xu等人,Transplant
Proc.38:1561-3(2006)；Lan等人,J Immunol.177:5868-77(2006)；Lutz等人,Eur J
Immunol.30:1813-22(2000)；Fischer等人,Transpl Immunol.25:20-6(2011))，并且结果取决于对DC的修饰的类型、培养条件、时机和所测试的同种异体移植物的类型而高度可变(Zhou等人,JImmunol Res.2016:5730674(2016)；Xia等人,JEvidBasedMed.7:135-46
(2014))。几乎所有这些研究都一直在小鼠中进行，但是最近的人体测试已经开始包括在健康志愿者中针对安全性的测试(Dhodapkar等人,JExpMed.193:233-8(2001)；Dhodapkar等人,Blood.100:174-7(2002))以及在10位糖尿病患者中的I期临床试验(Giannoukakis等人,Diabetes Care.34:2026-32(2011))。
Proc.38:1561-3(2006)；Lan等人,J Immunol.177:5868-77(2006)；Lutz等人,Eur J
Immunol.30:1813-22(2000)；Fischer等人,Transpl Immunol.25:20-6(2011))，并且结果取决于对DC的修饰的类型、培养条件、时机和所测试的同种异体移植物的类型而高度可变(Zhou等人,JImmunol Res.2016:5730674(2016)；Xia等人,JEvidBasedMed.7:135-46
(2014))。几乎所有这些研究都一直在小鼠中进行，但是最近的人体测试已经开始包括在健康志愿者中针对安全性的测试(Dhodapkar等人,JExpMed.193:233-8(2001)；Dhodapkar等人,Blood.100:174-7(2002))以及在10位糖尿病患者中的I期临床试验(Giannoukakis等人,Diabetes Care.34:2026-32(2011))。
[0013] 对于过继性Treg和致耐受性DC疗法仍然存在许多未知，并且最重要的一项是它们的功效的持续时间。尽管体内研究表明，使用这两种方法(有或无另外的免疫遏制药物)，延长的同种异体移植物存活是可能的，但它不是长期的，并且在几乎每种情况下，同种异体移植物最终都会死亡。这与Treg和DC两者均具有有限的时间跨度的事实相符合。此外，尤其是在DC中，致耐受性表型有可能“转化”并反而促进炎性途径(Delamarre等人,Semin Immunol.23:2-11(2011)；Schreibelt等人,Cancer Immunol Immunother.59:1573-82
(2010)；Satpathy等人,Nat Immunol.14:937-48(2013))。这可能是由于DC的高度适应性本质以及它们感知并响应于各种炎性提示的能力。还显示出这些细胞可在体内过继转移后极快速死亡。还存在已进行了描述的遏制性Treg和致耐受性DC的许多亚群，并且目前尚不清楚哪种是理想的亚型，或者它是否将完全取决于同种异体移植物移植的背景。
(2010)；Satpathy等人,Nat Immunol.14:937-48(2013))。这可能是由于DC的高度适应性本质以及它们感知并响应于各种炎性提示的能力。还显示出这些细胞可在体内过继转移后极快速死亡。还存在已进行了描述的遏制性Treg和致耐受性DC的许多亚群，并且目前尚不清楚哪种是理想的亚型，或者它是否将完全取决于同种异体移植物移植的背景。
[0014] 另外，这些种类的方法存在巨大的实践和经济障碍，因为它们要求临床医生除治疗方法外还需要操作并处理复杂的免疫细胞类型。鉴于它们的有限寿命，仍不清楚是否需要连续和/或重复递送这些细胞以赋予同种异体移植物长期耐受性。这将使用于培养、扩增或转导具有关键免疫调节因子的细胞的已经昂贵且适时的方法复杂，并最终阻碍对极度时间敏感性的治疗的使用。
[0015] 用于诱导耐受性的另一种方法是使用造血细胞移植(HCT)，其中HLA不匹配器官的接受者使用来自同一供体的造血细胞接受HCT(Gozzo等人,Surg Forum.21:281-4(1970)；Ildstad等人,Nature.307:168-70(1984)；Sayegh等人,Ann Intern Med.114:954-5
(1991)；Huang等人,J Clin Invest.105:173-81(2000)；Kawai等人,N Engl J Med.358:
353-61(2008)；Sachs等人,Semin Immunol.23:165-73(2011))。这产生嵌合现象，所述嵌合现象可允许接受者中新发育的T细胞和B细胞耐受接受者和供体抗原(Tomita等人,J
Immunol.153:1087-98(1994)；Tomita等人,Transplantation.61:469-77(1996)；Tomita等人,Transplantation.61:477-85(1996)；Khan等人,Transplantation.62:380-7(1996)；
Manilay等人,Transplantation.66:96-102(1998))。这是由于造血细胞在胸腺中的阳性和阴性选择中所起的作用所致，在胸腺中它们消除对同种异体移植物中也可能存在的含造血细胞的抗原具有亲和力的细胞，从而最终导致它们的排斥。(Griesemer等人,
Transplantation.90:465-74(2010))。但是，这种方法固有且危险的风险是移植物抗宿主疾病(GVHD)的可能性，其中移植的造血细胞将接受者组织识别为外来并进行全身性攻击(Sun等人,PLoS One.7:e52096(2012))。从一开始，已开发出若干HCT变体来阻抑排斥，包括使用非清髓性策略。这些策略使用改变的化疗方案，通常涉及较低的剂量，以使得接受HCT的接受者不会接受其造血区室的完全消除。这些策略中的最新策略例如使用基于促进耐受性的促进细胞(FC)的HCT来促进HLA不匹配的肾脏接受者中的耐受性，同时很大程度上避免GHVD(Leventhal等人,Sci TranslMed.4:124ra28(2012))。
(1991)；Huang等人,J Clin Invest.105:173-81(2000)；Kawai等人,N Engl J Med.358:
353-61(2008)；Sachs等人,Semin Immunol.23:165-73(2011))。这产生嵌合现象，所述嵌合现象可允许接受者中新发育的T细胞和B细胞耐受接受者和供体抗原(Tomita等人,J
Immunol.153:1087-98(1994)；Tomita等人,Transplantation.61:469-77(1996)；Tomita等人,Transplantation.61:477-85(1996)；Khan等人,Transplantation.62:380-7(1996)；
Manilay等人,Transplantation.66:96-102(1998))。这是由于造血细胞在胸腺中的阳性和阴性选择中所起的作用所致，在胸腺中它们消除对同种异体移植物中也可能存在的含造血细胞的抗原具有亲和力的细胞，从而最终导致它们的排斥。(Griesemer等人,
Transplantation.90:465-74(2010))。但是，这种方法固有且危险的风险是移植物抗宿主疾病(GVHD)的可能性，其中移植的造血细胞将接受者组织识别为外来并进行全身性攻击(Sun等人,PLoS One.7:e52096(2012))。从一开始，已开发出若干HCT变体来阻抑排斥，包括使用非清髓性策略。这些策略使用改变的化疗方案，通常涉及较低的剂量，以使得接受HCT的接受者不会接受其造血区室的完全消除。这些策略中的最新策略例如使用基于促进耐受性的促进细胞(FC)的HCT来促进HLA不匹配的肾脏接受者中的耐受性，同时很大程度上避免GHVD(Leventhal等人,Sci TranslMed.4:124ra28(2012))。
[0016] 除了GHVD的风险和二次HCT程序的风险外，这些诱导嵌合现象的方法的普遍局限性是需要HLA匹配的供体可用于收集骨髓。尽管这在啮齿动物研究中容易地实现，但在人中却是相当苛刻的要求。理想地应尽快从供体取得供体器官，这将留出从其收集骨髓的非常短的窗口(如果可能的话)。这也是需要极度患者和操作特异性的方法的昂贵且逻辑要求高的程序。并且，与调控性细胞方法一样，尚不清楚如何将其实际应用于患者可从中受益或需要立即治疗急性损伤或疾病的疗法的那些情况。
[0017] 已针对减少体内同种异体移植排斥(allorejection)进行测试的另一种方法是除去组织相容性分子(Torikai等人Blood.122:1341-9(2013))，所述组织相容性分子是同种异体移植排斥中“非自身”识别的主要抗原来源。这与HLA匹配的供体和接受者在移植后大大提高器官存活率的经验数据相符合(Opelz等人,Rev Immunogenet.1:334-42(1999))。尽管使用这种方法已经取得了一些积极的结果，但除去I类MHC使细胞极易受到NK细胞的影响(Pegram等人,Immunol Cell Biol.89:216-24(2011)；Raulet等人,Nat Rev Immunol.6:520-31(2006)；Huntington,Immunol Cell Biol.92:208-9(2014))。它还使CD8+T细胞之中非MHC依赖性杀伤途径完整(Haspot等人,Am J Transplant.14:49-58(2014))，并且未解决MHC/HLA基因家族以外的抗原差异(次要抗原)(Roopenian等人,Immunol Rev.190:86-94(2002))。
[0018] 这种方法的采用涉及从多能干细胞中缺失所有经典HLA I类分子，与引入编码HLA-E(一种抑制NK细胞的最小多态性HLA)的基因结合(Gornalusse等人,Nat Biotechnol.(2017))。尽管这种方法在部分免疫受损的人源化小鼠中显示出对NK和CD8 T细胞攻击的短期抗性，但并未证明这些细胞可在具有完全免疫能力的宿主中长期存活。在另一种方法中，将ES细胞工程化以表达PD-L1和CTLA4-Ig，其改善了同种异体宿主中的存活(Rong等人,Cell Stem Cell.14:121-30(2014))，但伴随严重局限性，即CTLA4-Ig可导致全身性免疫遏制。尚未证明，对ES或iPS细胞的一组修饰允许它们逃避同种异体移植排斥而无系统免疫遏制的可能性且无需免疫遏制药物。
发明内容
[0020] 在一方面，提供了一种细胞，所述细胞经遗传修饰以包含至少一种用于在移植到同种异体宿主中时在移植部位提供局部免疫遏制的机制。所述遗传修饰的细胞包含：一组转基因，每种转基因编码为细胞质、膜结合或局部作用的基因产物；并且具有以下功能中的一种或多种：a)减轻抗原呈递细胞活化和功能；b)减轻攻击移植物的白细胞活性或溶细胞功能；c)减轻同种异体移植物细胞的巨噬细胞溶细胞功能和吞噬作用；d)诱导攻击移植物的白细胞的细胞凋亡；e)减轻局部炎性蛋白；以及f)保护免受白细胞介导的细胞凋亡。
[0021] 在所述细胞的一个实施方案中，所述组转基因包括以下基因中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)：PD-L1、HLA-G(或HLA-G的小鼠型式，H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(或FASLG的小鼠型式，FasL)、Ccl21(或Ccl21的小鼠型式，Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(或Serpin B9的小鼠型式，Spi6)。
[0022] 在所述细胞的一个实施方案中，所述组转基因包括以下基因中的两种或更多种：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)。
[0023] 在所述细胞的一个实施方案中，所述组转基因基因包括PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)，或编码充当PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)的激动剂的生物制剂的基因。
[0024] 在所述细胞的一个实施方案中，所述细胞还包含以下转基因中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或全部十一种)：TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1以及IFNγR1 d39，或编码充当TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1或IFNγR1 d39的激动剂的生物制剂的基因。
[0025] 在所述细胞的一个实施方案中，所述TGF-β或生物制剂在移植物环境中局部作用。在所述细胞的一个实施方案中，所述TGF-β或生物制剂在移植物环境中以最小的全身性作用局部作用。
[0026] 在所述细胞的各种实施方案中，所述细胞是干细胞、适用于基因组编辑的细胞和/或治疗性细胞类型的来源(例如，可分化成治疗性细胞类型的细胞或所需靶组织的细胞)。在各种实施方案中，所述细胞是胚胎干细胞、多能干细胞、诱导型多能干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞或祖细胞、种系干细胞、肺干细胞或祖细胞、乳腺干细胞、嗅成体干细胞、毛囊干细胞、肠干细胞或祖细胞、多潜能干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞、神经干细胞或祖细胞、成体干细胞、体干细胞、组织特异性干细胞、全能干细胞、成纤维细胞、单核细胞前体、B细胞、外分泌细胞、胰腺祖细胞、内分泌祖细胞、成肝细胞、成肌细胞、前脂肪细胞、肝细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、K562人红白血病细胞系、骨细胞、滑膜细胞、肌腱细胞、韧带细胞、半月板细胞、脂肪细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、红细胞-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、胆管细胞、白色或棕色脂肪细胞、激素分泌细胞、表皮角质形成细胞、上皮细胞、肾细胞、生殖细胞、骨骼关节滑膜细胞、骨膜细胞、软骨膜细胞、软骨细胞、内皮细胞、心包细胞、脑膜细胞、角质形成细胞前体细胞、角质形成细胞干细胞、周细胞、神经胶质细胞、室管膜细胞、从羊膜或胎盘膜分离的细胞、浆膜细胞、体细胞，或源自皮肤、心脏、脑或脊髓、肝、肺、肾、胰腺、膀胱、骨髓、脾、肠或胃的细胞。
[0027] 在所述细胞的一个实施方案中，所述细胞被进一步遗传修饰以包含至少一种(例如，一种、两种、三种或更多种)机制，用于控制细胞增殖(例如，以降低经修饰的细胞的致瘤潜能或降低已经变得致瘤性的经修饰的细胞的增殖)。所述遗传修饰的细胞包含：对一个或多个(例如，一个、两个、三个或更多个)细胞分裂基因座/基因座(CDL)的遗传修饰，所述CDL是其转录产物由分裂细胞(例如，所有分裂细胞含有免疫遏制性转基因中的一种或多种)表达的一个或多个基因座，所述遗传修饰是以下中的一种或多种：a)消除连接(ALINK)系统，所述ALINK系统包含与编码所述CDL的DNA序列转录连接的编码阴性选择性标记物的DNA序列；以及b)CDL调控的外源性活化因子(EARC)系统，所述EARC系统包含与所述CDL可操作连接的基于诱导型活化因子的基因表达系统。
[0028] 在所述细胞的一个实施方案中，所述CDL的遗传修饰包括用以下中的一种或多种进行所述CDL的靶向置换：a)包含所述ALINK系统的DNA载体；b)包含所述EARC系统的DNA载体；c)包含所述ALINK系统和所述EARC系统的DNA载体；其中所述ALINK和/或EARC系统各自可操作地连接至所述CDL。
[0029] 在所述细胞的各种实施方案中，所述CDL的ALINK遗传修饰是纯合的、杂合的、半合子的或复合杂合的，和/或所述EARC遗传修饰确保功能性CDL修饰只能通过EARC修饰的等位基因产生。
[0030] 在所述细胞的各种实施方案中，所述CDL是表5中列举的基因座中的一个或多个(例如，一个、两个、三个或更多个)。在各种实施方案中，所述CDL编码在以下中的一者或多者中起作用的基因产物：细胞周期、DNA复制、RNA转录、蛋白质翻译和代谢。在各种实施方案中，所述CDL是Cdk1/CDK1、Top2A/TOP2A、Cenpa/CENPA、Birc5/BIRC5以及Eef2/EEF2中的一种或多种，优选地所述CDL是Cdk1或CDK1。在一些实施方案中，所述CDL是Top2A。在一些实施方案中，所述CDL是Eef2。在各种实施方案中，所述CDL是Cdk1/CDK1、Top2A/TOP2A、Cenpa/CENPA、Birc5/BIRC5以及Eef2/EEF2中的两种或更多种，优选地所述CDL是Cdk1和Top2A或Cdk1和Eef2。
[0031] 在所述细胞的各种实施方案中，所述ALINK系统包括单纯疱疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韦系统、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统、羧基酯酶/伊立替康系统或iCasp9/AP1903系统，优选地所述ALINK系统是单纯疱疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韦系统。
[0032] 在所述细胞的各种实施方案中，所述EARC系统是强力霉素诱导型“dox-桥”系统、香豆酸盐开关诱导型系统、蜕皮激素诱导型系统、无线电波诱导型系统或配体可逆的二聚化系统，优选地所述EARC系统是dox-桥系统。
[0033] 在一方面，提供了一种用于在同种异体宿主中的移植部位提供局部免疫遏制的方法。所述方法包括提供细胞；并且在所述细胞中表达一组转基因，每种转基因编码为细胞质、膜结合或局部作用的基因产物；并且具有以下功能中的一种或多种：a)减轻抗原呈递细胞活化和功能；b)减轻攻击移植物的白细胞活性或溶细胞功能；c)减轻同种异体移植物细胞的巨噬细胞溶细胞功能和吞噬作用；d)诱导攻击移植物的白细胞的细胞凋亡；e)减轻局部炎性蛋白；以及f)保护免受白细胞介导的细胞凋亡。
[0034] 在所述方法的一个实施方案中，所述组转基因包括以下基因中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)，或编码充当PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8或SerpinB9(Spi6)的激动剂的生物制剂的基因。
[0035] 在所述方法的一个实施方案中，所述组转基因包括以下基因中的两种或更多种：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及SerpinB9(Spi6)。
[0036] 在所述方法的一个实施方案中，所述组转基因基因包括PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及SerpinB9(Spi6)，或编码充当PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及SerpinB9(Spi6)的激动剂的生物制剂的基因。
[0037] 在所述方法的一个实施方案中，所述方法还包括表达以下转基因中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或全部十一种)：TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1以及IFNγR1 d39，或编码充当TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1或IFNγR1 d39的激动剂的生物制剂的基因。在一个实施方案中，所述TGF-β或生物制剂在移植物环境中局部作用。在所述细胞的一个实施方案中，所述TGF-β或生物制剂在移植物环境中以最小的全身性作用局部作用。
[0038] 在所述方法的各种实施方案中，所述细胞是干细胞、适用于基因组编辑的细胞和/或治疗性细胞类型的来源(例如，可分化成治疗性细胞类型的细胞或所需靶组织的细胞)。在各种实施方案中，所述细胞是胚胎干细胞、多能干细胞、诱导型多能干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞或祖细胞、种系干细胞、肺干细胞或祖细胞、乳腺干细胞、嗅成体干细胞、毛囊干细胞、肠干细胞或祖细胞、多潜能干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞、神经干细胞或祖细胞、成体干细胞、体干细胞、组织特异性干细胞、全能干细胞、成纤维细胞、单核细胞前体、B细胞、外分泌细胞、胰腺祖细胞、内分泌祖细胞、成肝细胞、成肌细胞、前脂肪细胞、肝细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、K562人红白血病细胞系、骨细胞、滑膜细胞、肌腱细胞、韧带细胞、半月板细胞、脂肪细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、红细胞-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、胆管细胞、白色或棕色脂肪细胞、激素分泌细胞、表皮角质形成细胞、上皮细胞、肾细胞、生殖细胞、骨骼关节滑膜细胞、骨膜细胞、软骨膜细胞、软骨细胞、内皮细胞、心包细胞、脑膜细胞、角质形成细胞前体细胞、角质形成细胞干细胞、周细胞、神经胶质细胞、室管膜细胞、从羊膜或胎盘膜分离的细胞、浆膜细胞、体细胞，或源自皮肤、心脏、脑或脊髓、肝、肺、肾、胰腺、膀胱、骨髓、脾、肠或胃的细胞。
[0039] 在所述方法的各种实施方案中，将所述细胞提供(例如注射)到移植部位或移植部位附近。在所述方法的各种实施方案中，将所述细胞提供(例如注射或植入)到移植物中(例如在移植之前、期间或之后注射或植入到组织或器官移植物中)。在一些实施方案中，其中表达转基因的细胞是所述移植物的细胞(例如，被移植的组织或器官的细胞进行修饰以表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种))。
[0040] 在一方面，提供了一种控制同种异体宿主中的移植部位处的细胞增殖的方法(例如，降低所述移植部位处的细胞的致瘤潜能或降低在所述移植部位处已经变得致瘤性的细胞的增殖)。所述方法包括：a)在所述细胞中遗传修饰一个或多个(例如，一个、两个、三个或更多个)细胞分裂基因座/基因座(CDL)，所述CDL是其转录产物由分裂细胞(例如，所有分裂细胞含有免疫遏制性转基因中的一种或多种)表达的一个或多个基因座，所述CDL的遗传修饰包含以下中的一种或多种：i)消除连接(ALINK)系统，所述ALINK系统包含与编码所述CDL的DNA序列转录连接的编码阴性选择性标记物的DNA序列；以及i)CDL调控的诱导型外源性活化因子(EARC)系统，所述EARC系统包含与所述CDL可操作连接的基于诱导型活化因子的基因表达系统；b)对所述细胞进行遗传修饰以包含至少一种用于在移植部位提供局部免疫遏制的机制；c)将所述细胞或所述细胞群体移植在同种异体宿主中的移植部位处；以及d)通过在不存在所述阴性选择性标记物的诱导剂的情况下维持包含所述ALINK系统的遗传修饰的细胞来允许包含所述ALINK系统的遗传修饰的细胞的增殖，和/或通过将包含所述ALINK系统的遗传修饰的细胞暴露于所述阴性选择性标记物的诱导剂来消除和/或抑制包含所述ALINK系统的细胞的增殖；和/或通过将包含所述EARC系统的遗传修饰的细胞暴露于所述基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂来允许包含所述EARC系统的遗传修饰的细胞的增殖，或通过在不存在所述基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂的情况下维持包含所述EARC系统的遗传修饰的细胞来预防或抑制包含所述EARC系统的细胞的增殖。
[0041] 在所述方法的一个实施方案中，所述CDL的遗传修饰包括用以下中的一种或多种进行所述CDL的靶向置换：a)包含所述ALINK系统的DNA载体；b)包含所述EARC系统的DNA载体；c)包含所述ALINK系统和所述EARC系统的DNA载体；其中所述ALINK和/或EARC系统各自可操作地连接至所述CDL。
[0042] 在所述方法的各种实施方案中，所述CDL的ALINK遗传修饰是纯合的、杂合的、半合子的或复合杂合的，和/或所述EARC遗传修饰确保功能性CDL修饰只能通过ERAC修饰的等位基因产生。
[0043] 在所述方法的各种实施方案中，所述CDL是表5中列举的基因座中的一个或多个(例如，一个、两个、三个或更多个)。在各种实施方案中，所述CDL编码其功能涉及以下中的一者或多者的基因产物：细胞周期、DNA复制、RNA转录、蛋白质翻译和代谢。在各种实施方案中，所述CDL是Cdk1/CDK1、Top2A/TOP2A、Cenpa/CENPA、Birc5/BIRC5以及Eef2/EEF2中的一种或多种，优选地所述CDL是Cdk1或CDK1。在一些实施方案中，所述CDL是Top2A。在一些实施方案中，所述CDL是Eef2。在各种实施方案中，所述CDL是Cdk1/CDK1、Top2A/TOP2A、Cenpa/CENPA、Birc5/BIRC5以及Eef2/EEF2中的两种或更多种，优选地所述CDL是Cdk1和Top2A或Cdk1和Eef2。
[0044] 在所述方法的各种实施方案中，所述ALINK系统包括单纯疱疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韦系统、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统、羧基酯酶/伊立替康系统或iCasp9/AP1903系统，优选地所述ALINK系统是单纯疱疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韦系统。
[0045] 在所述方法的各种实施方案中，所述EARC系统是强力霉素诱导型“dox-桥”系统、香豆酸盐开关诱导型系统、蜕皮激素诱导型系统、无线电波诱导型系统或配体可逆的二聚化系统，优选地所述EARC系统是dox-桥系统。
[0046] 在所述方法的一个实施方案中，所述遗传修饰的细胞包含：一组转基因，每种转基因编码为细胞质、膜结合或局部作用的基因产物；并且具有以下功能中的一种或多种：a)减轻抗原呈递细胞活化和功能；b)减轻攻击移植物的白细胞活性或溶细胞功能；c)减轻同种异体移植物细胞的巨噬细胞溶细胞功能和吞噬作用；d)诱导攻击移植物的白细胞的细胞凋亡；e)减轻局部炎性蛋白；以及f)保护免受白细胞介导的细胞凋亡。
[0047] 在所述方法的一个实施方案中，所述组转基因包括以下基因中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)，或编码充当PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8或Serpin B9(Spi6)的激动剂的生物制剂的基因。
[0048] 在所述方法的一个实施方案中，所述组转基因包括以下基因中的两种或更多种：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)。
[0049] 在所述方法的一个实施方案中，所述组转基因基因包括PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)，或编码充当PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)的激动剂的生物制剂的基因。
[0050] 在所述方法的一个实施方案中，所述细胞还包含以下转基因中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或全部十一种)：TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1以及IFNγR1 d39，或编码充当TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1或IFNγR1 d39的激动剂的生物制剂的基因。
[0051] 在所述方法的一个实施方案中，所述TGF-β或生物制剂在移植物环境中局部作用。在一个实施方案中，所述TGF-β或生物制剂在移植物环境中以最小的全身性作用局部作用。
[0052] 在所述方法的各种实施方案中，所述细胞是干细胞、适用于基因组编辑的细胞和/或治疗性细胞类型的来源(例如，可分化成治疗性细胞类型的细胞或所需靶组织的细胞)。在各种实施方案中，所述细胞是胚胎干细胞、多能干细胞、诱导型多能干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞或祖细胞、种系干细胞、肺干细胞或祖细胞、乳腺干细胞、嗅成体干细胞、毛囊干细胞、肠干细胞或祖细胞、多潜能干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞、神经干细胞或祖细胞、成体干细胞、体干细胞、组织特异性干细胞、全能干细胞、成纤维细胞、单核细胞前体、B细胞、外分泌细胞、胰腺祖细胞、内分泌祖细胞、成肝细胞、成肌细胞、前脂肪细胞、肝细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、K562人红白血病细胞系、骨细胞、滑膜细胞、肌腱细胞、韧带细胞、半月板细胞、脂肪细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、红细胞-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、胆管细胞、白色或棕色脂肪细胞、激素分泌细胞、表皮角质形成细胞、上皮细胞、肾细胞、生殖细胞、骨骼关节滑膜细胞、骨膜细胞、软骨膜细胞、软骨细胞、内皮细胞、心包细胞、脑膜细胞、角质形成细胞前体细胞、角质形成细胞干细胞、周细胞、神经胶质细胞、室管膜细胞、从羊膜或胎盘膜分离的细胞、浆膜细胞、体细胞，或源自皮肤、心脏、脑或脊髓、肝、肺、肾、胰腺、膀胱、骨髓、脾、肠或胃的细胞。
[0053] 在所述方法的各种实施方案中，将所述细胞提供(例如注射)到移植部位或移植部位附近。在所述方法的各种实施方案中，将所述细胞提供(例如注射或植入)到移植物中(例如在移植之前、期间或之后注射或植入到组织或器官移植物中)。在一些实施方案中，其中表达转基因的细胞是所述移植物的细胞(例如，被移植的组织或器官的细胞进行修饰以表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种))。
[0055] 在所述方法的各种实施方案中，所述宿主患有可用细胞疗法治疗的变性疾病或疾患。在各种实施方案中，所述疾病或疾患是失明、关节炎(例如，骨关节炎或类风湿性关节炎)、局部缺血、糖尿病(例如，1型或2型糖尿病)、多发性硬化症、脊髓损伤、中风、癌症、肺病、血液疾病、神经系统疾病(如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和ALS)、酶或激素缺乏症、代谢病症(例如，溶酶体贮积症、半乳糖血症、枫糖尿病、苯丙酮尿症、糖原贮积病、线粒体病症、弗里德里希共济失调、过氧化物酶体病症、金属代谢病症或有机酸血症、自身免疫性疾病(例如，银屑病、全身性红斑狼疮、格雷夫斯病、炎性肠病、艾迪生病、斯耶格伦综合征)、桥本甲状腺炎、血管炎、自身免疫性肝炎、斑秃、自身免疫性胰腺炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、皮肌炎)、年龄相关性黄斑变性、视网膜营养不良、感染性疾病、血友病、变性疾病(例如，夏科-马利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)、慢性阻塞性肺病、慢性创伤性脑病、克罗伊茨费尔特-雅格布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、囊性纤维化、细胞色素C氧化酶缺乏症、埃勒斯-当洛斯综合征(Ehlers-Danlos syndrome)、特发性震颤、进行性骨化性纤维发育不良症、婴儿神经轴索营养不良、圆锥形角膜、球形角膜、肌营养不良、神经元蜡样脂褐质沉积症、既往疾病、进行性核上性麻痹、桑德霍夫病、脊髓性肌萎缩症、视网膜色素变性)或年龄相关性疾病(例如，动脉粥样硬化、心血管疾病(例如，心绞痛、心肌梗塞)、白内障、骨质疏松症或高血压)。
[0056] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)以等于或大于活化的白细胞中相应内源性基因的表达水平的水平表达(例如，T细胞，例如遮掩转基因的表达水平等于活化的白细胞中内源性基因的表达水平，或者比活化的白细胞中内源性基因的表达水平高1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍)。在一些实施方案中，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及SerpinB9(Spi6)中的全部八种以等于或大于活化的白细胞中相应内源性基因的表达水平的水平表达。
[0057] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)以大于野生型干细胞中相应内源性基因的表达水平的水平表达(例如，来自相同物种的野生型ES细胞，例如，与来自相同物种的未修饰的野生型ES细胞中内源性基因的表达相比，遮掩转基因的表达水平在遮掩的细胞中高至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、500、1,000倍或更高)。在一些实施方案中，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的全部8种都以大于野生型干细胞(例如，与遮掩的细胞来自相同物种的胚胎干细胞)中内源性基因的表达水平(例如，高2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100倍或更高)的水平表达。在一些实施方案中，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)以在ES细胞基因组中所有基因的基因表达的前5％内的水平表达。在一些实施方案中，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或所有八种)以在ES细胞基因组中所有基因的基因表达的前1％内的水平表达。在一些实施方案中，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)全部都以在ES细胞基因组中所有基因的基因表达的前5％内的水平表达。
[0058] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述PD-L1转基因编码与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或更高同一性)的蛋白质。
[0059] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述HLA-G(H2-M3)转基因编码与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或更高同一性)的蛋白质。
[0060] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述Cd47转基因编码与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或更高同一性)的蛋白质。
[0061] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述CD200转基因编码与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或更高同一性)的蛋白质。
[0062] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述FASLG(FasL)转基因编码与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或更高同一性)的蛋白质。
[0063] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述Ccl21(Ccl21b)转基因编码与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或更高同一性)的蛋白质。
[0064] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述Mfge8转基因编码与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或更高同一性)的蛋白质。
[0065] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述Serpin B9(Spi6)转基因编码与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或更高同一性)的蛋白质。
[0066] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述IFNγR1 d39转基因编码与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少85％同一性(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性或更高同一性)的蛋白质。
[0067] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述一种或多种转基因可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方案中，所述组成型启动子选自由以下组成的组：CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1α启动子、PGK启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子以及劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。
[0068] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞还包含(例如，所述细胞被进一步修饰以包含)编码治疗剂的转基因。在一些实施方案中，所述治疗剂是蛋白质或抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抑制性抗体或激动剂抗体。在一些实施方案中，所述治疗剂是表2中列出的剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是在受试者中突变的基因的野生型型式(例如，与所述受试者的疾病或疾患相关的突变的基因的野生型型式，例如与癌症、酶或激素缺乏症、代谢病症或变性疾病相关的遗传突变)。在一些实施方案中，使用选自由以下组成的组的诱导型表达系统来表达所述治疗剂：四环素响应元件、光诱导型系统、放射遗传系统、香豆酸盐开关诱导型系统、蜕皮激素诱导型系统、去稳定结构域系统或配体可逆的二聚化系统。在一些实施方案中，使用选自由以下组成的组的组成型启动子来表达所述治疗剂：CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1α启动子、PGK启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子以及劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。
[0069] 在另一方面，提供了一种根据上述细胞中的任一种的遗传修饰的细胞群。
[0070] 在一方面，提供了一种用于在同种异体宿主中的移植部位提供局部免疫遏制的方法。所述方法包括在同种异体宿主中的移植部位移植如上所述的遗传修饰的细胞或如上所述的遗传修饰的细胞群。
[0071] 在另一方面，本发明的特征是一种含有本发明的细胞的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
[0072] 在另一方面，特征是一种药盒，所述药盒包含本发明的细胞或本发明的药物组合物。
[0073] 在另一方面，特征是一种通过向有需要的受试者施用本发明的细胞或本发明的组合物来治疗所述受试者的疾病或疾患的方法。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是失明、关节炎(例如，骨关节炎或类风湿性关节炎)、局部缺血、糖尿病(例如，1型或2型糖尿病)、多发性硬化症、脊髓损伤、中风、癌症、肺病、血液疾病、神经系统疾病(如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和ALS)、酶或激素缺乏症、代谢病症(例如，溶酶体贮积症、半乳糖血症、枫糖尿病、苯丙酮尿症、糖原贮积病、线粒体病症、弗里德里希共济失调、过氧化物酶体病症、金属代谢病症或有机酸血症、自身免疫性疾病(例如，银屑病、全身性红斑狼疮、格雷夫斯病、炎性肠病、艾迪生病、斯耶格伦综合征)、桥本甲状腺炎、血管炎、自身免疫性肝炎、斑秃、自身免疫性胰腺炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、皮肌炎)、年龄相关性黄斑变性、视网膜营养不良、感染性疾病、血友病、变性疾病(例如，夏科-马利-杜斯氏病、慢性阻塞性肺病、慢性创伤性脑病、克罗伊茨费尔特—雅格布病、囊性纤维化、细胞色素C氧化酶缺乏症、埃勒斯-当洛斯综合征、特发性震颤、进行性骨化性纤维发育不良症、婴儿神经轴索营养不良、圆锥形角膜、球形角膜、肌营养不良、神经元蜡样脂褐质沉积症、既往疾病、进行性核上性麻痹、桑德霍夫病、脊髓性肌萎缩症、视网膜色素变性)或年龄相关性疾病(例如，动脉粥样硬化、心血管疾病(例如，心绞痛、心肌梗塞)、白内障、骨质疏松症或高血压)或表2中列出的疾病或疾患，和/或所述细胞还包含编码表2中列出的相应治疗剂或在受试者中突变的基因的野生型型式(例如，与所述受试者的疾病或疾患相关的突变的基因的野生型型式，例如与癌症、酶或激素缺乏症、代谢病症或变性疾病相关的遗传突变)的转基因。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是年龄相关性黄斑变性(例如，湿性AMD)或视网膜营养不良，并且所述治疗剂是VEGF抑制剂(例如，VEGF受体的可溶性形式(例如，可溶性VEGFR-1或NRP-1)、血小板因子-4、催乳素、SPARC、VEGF抑制性抗体(例如，贝伐单抗或兰尼单抗)或Holash等人,Proc NatlAcad Sci U.S.A.99:11383-11398,2002中描述的可溶性诱饵受体，例如，VEGF-Trap亲本、VEGF-TrapΔB1、VEGF-TrapΔB2、VEGF-TrapR1R2，例如阿柏西普)。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是骨关节炎或类风湿性关节炎，并且所述治疗剂是抗炎生物制剂(例如TNFα抑制剂(例如，阿达木单抗、依那西普、英夫利昔单抗、戈利木单抗或赛妥珠单抗)、白介素-6(IL6)受体抑制剂(例如，托珠单抗)、IL1受体抑制剂(例如，阿那白滞素)或用于治疗类风湿关节炎的另一种剂(例如，阿巴西普、利妥昔单抗))。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是糖尿病(例如，1型糖尿病或2型糖尿病)，并且所述治疗剂是胰岛素。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是血友病，并且所述治疗剂是因子VIII。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是代谢缺陷症，并且所述治疗剂是具有在受试者中突变的基因的野生型型式的核酸序列的转基因或编码在受试者中缺乏的酶的转基因。
[0074] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，在施用至受试者之前，使所述细胞分化成谱系限制性细胞类型。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是心肌梗塞，并且使所述细胞分化成心肌细胞。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是失明，并且使所述细胞分化成感光细胞。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是脊髓损伤、帕金森氏病、亨廷顿氏病或阿尔茨海默氏病，并且使所述细胞分化成神经元。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是多发性硬化症，并且使所述细胞分化成神经胶质细胞。
[0075] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，将所述细胞局部施用(例如注射或植入)至需要细胞或治疗剂的组织或身体部位。
[0076] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞通过静脉内、皮下、肌内、经皮、皮内、胃肠外、动脉内、血管内或通过灌注施用。
[0077] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞通过皮下注射施用以产生遮掩的皮下组织。
[0079] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞以25,000至5,000,000,000个细胞(例如，2.5x 104、5x 104、7.5x 104、1x 105、2x105、3x 105、4x 105、6x 105、6x 105、7x 105、8x 105、9x 105、1x106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x106、1x
107、2x 107、3x 107、4x 107、5x 107、6x 107、7x 107、8x107、9x 107、1x 108、2x 108、3x 108、
4x 108、5x 108、6x 108、7x108、8x 108、9x 108、1x 109、2x 109、3x 109、4x 109或5x 109个细胞)的量施用。
107、2x 107、3x 107、4x 107、5x 107、6x 107、7x 107、8x107、9x 107、1x 108、2x 108、3x 108、
4x 108、5x 108、6x 108、7x108、8x 108、9x 108、1x 109、2x 109、3x 109、4x 109或5x 109个细胞)的量施用。
[0080] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞以800,000,000至100,000,000,000个细胞(例如，8x 108、9x 108、1x 109、2x 109、或3x 109、4x 109、5x 109、6x 109、7x
109、8x 109、9x 109、1x 1010、2x 1010、3x 1010、4x 1010、5x 1010、6x 1010、7x 1010、8x 1010、
9x1010或1x 1011个细胞)的量施用。
109、8x 109、9x 109、1x 1010、2x 1010、3x 1010、4x 1010、5x 1010、6x 1010、7x 1010、8x 1010、
9x1010或1x 1011个细胞)的量施用。
[0081] 在前述方法中任一项的一些实施方案中，所述方法还包括施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂在施用所述细胞之前施用。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂在施用所述细胞之后施用。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂与施用所述细胞同时施用。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是免疫遏制剂、疾病改善性抗风湿药物(DMARD)、生物响应调节剂(一种类型的DMARD)、皮质类固醇或非类固醇抗炎药物(NSAID)、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、甲氨蝶呤、羟氯喹、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、环磷酰胺、硫唑嘌呤、托法替尼、阿达木单抗、阿巴西普、阿纳金拉、阿那白滞素(kineret)、塞妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗或托珠单抗、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿巴西普、阿达木单抗、阿仑单抗、氨基水杨酸盐、抗生素、抗组胺剂、抗TNFα、硫唑嘌呤、贝利木单抗、β干扰素、钙调磷酸酶抑制剂、赛妥珠单抗、皮质类固醇、可玛林(cromolyn)、环孢菌素A、环孢霉素、富马酸二甲酯、依那西普、芬戈莫德、富马酸酯、克帕松、戈利木单抗、羟基脲、IFNγ、IL-11、来氟米特、白三烯受体拮抗剂、长效β2激动剂、米托蒽醌、吗替麦考酚酯、那他珠单抗、奥瑞珠单抗、吡美莫司、益生菌、类视黄醇、水杨酸、短效β2激动剂、柳氮磺胺吡啶、他克莫司、特立氟胺、茶碱、托珠单抗、优特克单抗或维多珠单抗、贝伐单抗、兰尼单抗或阿柏西普)、光动力疗法、光凝固、卡比多巴-左旋多巴、多巴胺激动剂、MAO-B抑制剂、邻苯二酚-O-甲基转移酶抑制剂、抗胆碱能药、金刚烷胺、深部脑刺激、抗凝剂、抗血小板剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂、血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、β阻滞剂、组合的α和β阻滞剂、钙通道阻滞剂、降胆固醇药物、烟酸、胆固醇吸收抑制剂、洋地黄制剂、利尿剂、血管扩张剂、双重抗血小板疗法、心脏手术、抗病毒化合物、核苷类似物逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂、抗细菌化合物、抗真菌化合物、抗寄生虫化合物、胰岛素、磺酰脲、双胍、美格列奈、噻唑烷二酮、DPP-4抑制剂、SGLT2抑制剂、α-葡糖苷酶抑制剂、胆汁酸螯合剂、阿司匹林、饮食方案、凝血因子、去氨加压素、凝块保存药物、纤维蛋白密封剂、物理疗法、辅酶、骨髓移植物、器官移植物、血液透析、血液滤过、交换输血、腹膜透析、中链三酰甘油、麦格司他、酶补充疗法、检查点抑制剂、化学治疗药物、生物药物、放射疗法、冷冻疗法、热疗、手术切除肿瘤组织或抗癌疫苗。
[0082] 在前述方法中任一项的一些实施方案中，所述方法还包括控制细胞的增殖。在一些实施方案中，所述细胞包含ALINK系统，并且所述控制增殖的方法包括：i)通过在不存在阴性选择性标记物的诱导剂的情况下维持包含ALINK系统的细胞来允许包含所述ALINK系统的细胞的增殖；或ii)通过将包含ALINK系统的细胞暴露于阴性选择性标记物的诱导剂来消除或抑制包含所述ALINK系统的细胞的增殖。在一些实施方案中，所述细胞包含EARC系统，并且所述控制细胞增殖的方法包括：i)通过将包含EARC系统的细胞暴露于基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂来允许包含所述EARC系统的细胞的增殖；或ii)通过在不存在基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂的情况下维持包含EARC系统的细胞来预防或抑制包含所述EARC系统的细胞的增殖。
[0083] 在前述方法中任一项的一些实施方案中，所述细胞在治疗完成后除去。所述细胞的除去可通过手术(例如，除去移植的组织或器官，或除去遮掩的皮下组织)或通过使用ALINK和/或EARC系统进行。在一些实施方案中，一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或更多个)ALINK和/或EAReC系统用于消除所有遮掩的细胞。
[0084] 在另一方面，本发明提供了本发明的细胞或本发明的组合物，其用于治疗有需要的受试者的疾病或疾患。在一些实施方案中，疾病或疾患是失明、关节炎(例如，骨关节炎或类风湿性关节炎)、局部缺血、糖尿病(例如，1型或2型糖尿病)、多发性硬化症、脊髓损伤、中风、癌症、肺病、血液疾病、神经系统疾病(如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和ALS)、酶或激素缺乏症、代谢病症(例如，溶酶体贮积症、半乳糖血症、枫糖尿病、苯丙酮尿症、糖原贮积病、线粒体病症、弗里德里希共济失调、过氧化物酶体病症、金属代谢病症或有机酸血症、自身免疫性疾病(例如，银屑病、全身性红斑狼疮、格雷夫斯病、炎性肠病、艾迪生病、斯耶格伦综合征)、桥本甲状腺炎、血管炎、自身免疫性肝炎、斑秃、自身免疫性胰腺炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、皮肌炎)、年龄相关性黄斑变性、视网膜营养不良、感染性疾病、血友病、变性疾病(例如，夏科-马利-杜斯氏病、慢性阻塞性肺病、慢性创伤性脑病、克罗伊茨费尔特-雅格布病、囊性纤维化、细胞色素C氧化酶缺乏症、埃勒斯-当洛斯综合征、特发性震颤、进行性骨化性纤维发育不良症、婴儿神经轴索营养不良、圆锥形角膜、球形角膜、肌营养不良、神经元蜡样脂褐质沉积症、既往疾病、进行性核上性麻痹、桑德霍夫病、脊髓性肌萎缩症、视网膜色素变性)或年龄相关性疾病(例如，动脉粥样硬化、心血管疾病(例如，心绞痛、心肌梗塞)、白内障、骨质疏松症或高血压)，或表2中列出的疾病或疾患。
[0085] 在另一方面，本发明提供了本发明的细胞或本发明的组合物，其用于在同种异体宿主中的移植部位提供局部免疫遏制。
[0086] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞包含下组转基因中的两种：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)(例如，PD-L1和HLA-G(H2-M3)；PD-L1和Cd47；PD-L1和Cd200；PD-L1和FASLG(FasL)；PD-L1和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1和Mfge8；PD-L1和SerpinB9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)和Cd47；HLA-G(H2-M3)和Cd200；HLA-G(H2-M3)和FASLG(FasL)；HLA-G(H2-M3)和Ccl21(Ccl21b)；HLA-G(H2-M3)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)和SerpinB9(Spi6)；Cd47和Cd200；Cd47和FASLG(FasL)；Cd47和Ccl21(Ccl21b)；Cd47和Mfge8；Cd47和Serpin B9(Spi6)；Cd200和FASLG(FasL)；Cd200和Ccl21(Ccl21b)；Cd200和Mfge8；Cd200和Serpin B9(Spi6)；FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；FASLG(FasL)和Mfge8；FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；或Mfge8和Serpin B9(Spi6))。
[0087] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞包含下组转基因中的三种：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)(例如，PD-L1、HLA-G(H2-M3)和Cd47；PD-L1；HLA-G(H2-M3)和Cd200；PD-L1、HLA-G(H2-M3)和FASLG(FasL)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47和Cd200；PD-L1、Cd47和FASLG(FasL)；PD-L1、Cd47和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、Cd47和Mfge8；PD-L1、Cd47和Serpin B9；PD-L1、Cd200和FASLG(FasL)；PD-L1、Cd200和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、Cd200和Mfge8；PD-L1；Cd200和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、FASLG(FasL)和Mfge8；PD-L1、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47和Cd200；HLA-G(H2-M3)、Cd47和FASLG(FasL)；HLA-G(H2-M3)、Cd47和Ccl21(Ccl21b)；HLA-G(H2-M3)、Cd47和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd47和Serpin B9；HLA-G(H2-M3)、Cd200和FASLG(FasL)；HLA-G(H2-M3)、Cd200和Ccl21(Ccl21b)；HLA-G(H2-M3)、Cd200和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd200和Serpin B9；HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Cd200和FASLG(FasL)；Cd47、Cd200和Ccl21(Ccl21b)；
Cd47、Cd200和Mfge8；Cd47、Cd200和Serpin B9(Spi6)；Cd47、FASLG(FasL)和Ccl21
(Ccl21b)；Cd47、FASLG(FasL)和Mfge8；Cd47、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；Cd47、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；Cd200、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；Cd200、FASLG(FasL)和Mfge8；Cd200、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；Cd200、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6))。
Cd47、Cd200和Mfge8；Cd47、Cd200和Serpin B9(Spi6)；Cd47、FASLG(FasL)和Ccl21
(Ccl21b)；Cd47、FASLG(FasL)和Mfge8；Cd47、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；Cd47、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；Cd200、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；Cd200、FASLG(FasL)和Mfge8；Cd200、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；Cd200、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6))。
[0088] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞包含下组转基因中的四种：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)(例如，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47和Cd200；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47和FASLG(FasL)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200和FASLG(FasL)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Cd200和FASLG(FasL)；PD-L1、Cd47、Cd200和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、Cd47、Cd200和Mfge8；PD-L1、Cd47、Cd200和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、Cd47、FASLG(FasL)和Mfge8；PD-L1、Cd47、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、Cd47、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd200、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、Cd200、FASLG(FasL)和Mfge8；PD-L1、Cd200、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd200、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200和FASLG(FasL)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200和Ccl21(Ccl21b)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd200、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；
Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Mfge8；Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Cd200、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；或FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6))。
Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Mfge8；Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Cd200、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；或FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6))。
[0089] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞包含下组转基因中的五种：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)(例如，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200和FASLG(FasL)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)和Mfge8、PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；
PD-L1、HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Mfge8、PD-L1、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Cd200、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd200、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；
HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；或Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21
(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6))。在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞包含下组转基因中的六种：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)(例如，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；或Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6))。
PD-L1、HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Mfge8、PD-L1、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Cd200、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd200、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；
HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；或Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21
(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6))。在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞包含下组转基因中的六种：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)(例如，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Ccl21(Ccl21b)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；或Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6))。
[0090] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞包含下组转基因中的七种：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)(例如，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Mfge8；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)；PD-L1、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和SerpinB9(Spi6)；或HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6))。
[0091] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞包含下组转基因中的全部八者：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)。
[0092] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞包含下组转基因中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种或全部七种)：HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)。
[0093] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞包含下组转基因中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种或全部七种)：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)。
[0094] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞包含下组转基因中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种或全部六种)：HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)。
[0095] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞未进行修饰来表达PD-L1。
[0096] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞未进行修饰来表达FasL。
[0097] 在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞未进行修饰来表达TGF-β。在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞未进行修饰来表达CTLA4或CLTA4-Ig。在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞未进行修饰来表达IDO。在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞未进行修饰来表达IL-35。在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞未进行修饰来表达IL-10。在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞未进行修饰来表达VEGF。在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞未进行修饰来表达NFkb诱饵受体。在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞未进行修饰来表达可溶性TNFR。在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞未进行修饰来表达CCR7。在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞未进行修饰来表达SOCS1。在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞未进行修饰来表达HLA-E。在前述方面中任一项的一些实施方案中，所述细胞未进行修饰来表达针对IL-12的siRNA。
[0098] 定义
[0099] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
[0100] 如本文所用，术语“约”是指高于或低于所描述值的不超过10％的值。例如，术语“约5nM”指示4.5nM至5.5nM的范围。
[0101] 如本文所用，术语“活化的白细胞”是指由对感知的损害的响应引起的白细胞(例如，粒细胞，如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞；单核细胞或淋巴细胞，如B或T细胞)的状态。当白细胞变得活化时，它们可增殖、分泌细胞因子、分化、呈递抗原、变得更加极化、变得更具吞噬性和/或变得更具细胞毒性。刺激免疫细胞活化的因子包括促炎性细胞因子、病原体和非自身抗原呈递。活化的白细胞可从淋巴器官分离。还可使用抗CD3/CD28珠或本领域技术人员所采用的其他方法在体外活化白细胞，如T细胞(参见，例如Frauwith和Thompson,J.Clin Invest 109:295-299(2002)；以及Trickett和Kwan,J Immunol Methods 275:251-255(2003))。
[0102] 如本文所用，“同种异体的”是指取自或源自相同物种的不同受试者的细胞、组织、DNA或因子。
[0103] 如本文所用，术语“干细胞”是指可分化成一个或多个特化细胞并且具有自我更新能力的细胞。干细胞包括多能干细胞(PSC)，如胚胎干细胞(ESC)和诱导型多能干细胞(iPSC)；以及多潜能干细胞，如脐带血干细胞、间充质基质细胞和成体干细胞，它们在各种组织中发现。术语“干细胞”还包括适用于基因组编辑的细胞、可充当治疗性细胞类型的来源的细胞(例如，可定向分化为用于细胞疗法的谱系限制性或终末分化的细胞的细胞，或所需靶组织的细胞)以及具有“人工”细胞获得的干细胞特性(例如，多能性或多潜能性或自我更新)的细胞。
[0104] 如本文所用，术语“胚胎干细胞”和“ES细胞”是指可在适合条件下在体外培养物中维持的源自囊胚的内细胞团的胚胎来源的全能或多能干细胞。ES细胞能够分化成三个脊椎动物胚层(例如内胚层、外胚层或中胚层)中的任一个的细胞。ES细胞的特征还在于它们在适合的体外培养条件下无限繁殖的能力。参见例如，Thomson等人,Science282:1145(1998)。
[0105] 如本文所用，术语“诱导型多能干细胞”、“iPS细胞”和“iPSC”是指可直接源自分化的体细胞的多能干细胞。可通过将特定组的重编程因子引入非多能细胞中来产生人iPS细胞，所述非多能细胞可包括例如Oct3/4、Sox家族转录因子(例如，Sox1、Sox2、Sox3、Soxl5)、Myc家族转录因子(例如，c-Myc、1-Myc、n-Myc)、Kruppel样家族(KLF)转录因子(例如，KLF1、KLF2、KLF4、KLF5)和/或相关的转录因子，如NANOG、LIN28和/或Glis1。还可例如通过使用miRNA、模拟转录因子的作用的小分子或谱系特异性分子(lineage specifier)来产生人iPS细胞。人iPS细胞的特征在于它们能够分化成三个脊椎动物胚层(例如内胚层、外胚层或中胚层)的任何细胞。人iPS细胞的特征还在于它们在适合的体外培养条件下无限繁殖的能力。参见例如，Takahashi和Yamanaka,Cell 126:663(2006)。
[0106] 如本文所用，术语“减轻抗原呈递细胞的活化和功能”是指编码基因产物的转基因，所述基因产物的功能是抑制抗原呈递细胞活化或抗原呈递细胞促进攻击移植物的白细胞的活化的能力(Fiorentino等人,J Immunol.146:3444-51(1991)；Salio等人,Eur J Immunol.29:3245-53(1999))。在一个实施方案中，抗原呈递细胞活化和功能的减轻是指APC活化和功能相对于对照降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％(例如，如使用抗原呈递细胞活化的测定所确定，如增殖减少、促炎性细胞因子(例如，白介素-1(IL-1，例如IL-1β)、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF，例如TNFα)、干扰素γ(IFNγ)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
(GMCSF)，其可使用培养基或患者样品(如血液样品)的ELISA或蛋白质印迹分析来测量)减少，或细胞表面标志物(例如，CD11c、CD11b、HLA分子(例如，MHC-II)、CD40、B7、IL-2、CD80或CD86，其可使用流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交和允许测量细胞表面标志物的其他测定进行评估)的水平降低)。抗原呈递细胞包括树突细胞、B细胞和巨噬细胞。肥大细胞和嗜中性粒细胞也可被诱导来呈递抗原。用于确定抗原呈递细胞活化和功能的减轻的方法是本领域已知的。减轻抗原呈递细胞活化和功能的基因产物的实例包括但不限于：Ccl21
(Ccl21b)和PD-L1。此类转基因在本文中可被称为“遮掩”或“遮掩的”基因。
(GMCSF)，其可使用培养基或患者样品(如血液样品)的ELISA或蛋白质印迹分析来测量)减少，或细胞表面标志物(例如，CD11c、CD11b、HLA分子(例如，MHC-II)、CD40、B7、IL-2、CD80或CD86，其可使用流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交和允许测量细胞表面标志物的其他测定进行评估)的水平降低)。抗原呈递细胞包括树突细胞、B细胞和巨噬细胞。肥大细胞和嗜中性粒细胞也可被诱导来呈递抗原。用于确定抗原呈递细胞活化和功能的减轻的方法是本领域已知的。减轻抗原呈递细胞活化和功能的基因产物的实例包括但不限于：Ccl21
(Ccl21b)和PD-L1。此类转基因在本文中可被称为“遮掩”或“遮掩的”基因。
[0107] 如本文所用，术语“减轻攻击移植物的白细胞活性或溶细胞功能”是指编码基因产物的转基因，所述基因产物的功能是抑制或防止同种异体移植细胞附近的攻击移植物的白细胞活性或溶细胞功能(MacDonald等人,JImmunol.126:1671-5(1981)；Bongrand等人,EurJ Immunol.13:424-9(1983)；MacDonald等人,Eur J Immunol.9:466-70(1979))。在一个实施方案中，攻击移植物的白细胞活性或溶细胞功能的减轻是指白细胞活性或溶细胞功能相对于对照降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％(例如，如使用白细胞活化的测定所确定，如增殖减少、促炎性细胞因子(例如，白介素-1(IL-1，例如IL-1β)、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF，例如TNFα)、干扰素γ(IFNγ)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)，其可使用培养基或患者样品(如血液样品)的ELISA或蛋白质印迹分析来测量)减少，或极化降低(例如，巨噬细胞或单核细胞中IL-12、TNF、IL-1β、IL-6、IL-23、MARCO、MHC-II、CD86、iNOS、CXCL9和CXCL10的水平降低，或T细胞中Th1特异性标志物(例如，T-bet、IL-12R、STAT4)、趋化因子受体(例如，CCR5、CXCR6或CXCR3)或Th2特异性标志物：(例如，CCR3、CXCR4、STAT6、GATA3或IL-4Rα)的水平降低，其可使用针对细胞标志物或细胞内蛋白质的流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、qPCR或蛋白质印迹分析以及针对分泌的蛋白质的ELISA或蛋白质分析来进行评估)；
或者如使用溶细胞功能的测定所确定(例如，通过将白细胞与已预先涂有针对由靶细胞系表达的表面抗原的抗体的靶细胞系一起孵育并测量具有荧光活力染色的存活靶细胞的数量或通过测量来自白细胞的溶细胞颗粒(例如，穿孔素、颗粒酶或从免疫细胞释放的其他溶细胞蛋白质)的分泌)。用于确定攻击移植物的白细胞活性或溶细胞功能的减轻的方法是本领域已知的。减轻攻击移植物的白细胞活性或溶细胞功能的基因产物的实例包括但不限于：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd39、Cd73和Lag3。此类转基因在本文中可被称为“遮掩”或“遮掩的”基因。
或者如使用溶细胞功能的测定所确定(例如，通过将白细胞与已预先涂有针对由靶细胞系表达的表面抗原的抗体的靶细胞系一起孵育并测量具有荧光活力染色的存活靶细胞的数量或通过测量来自白细胞的溶细胞颗粒(例如，穿孔素、颗粒酶或从免疫细胞释放的其他溶细胞蛋白质)的分泌)。用于确定攻击移植物的白细胞活性或溶细胞功能的减轻的方法是本领域已知的。减轻攻击移植物的白细胞活性或溶细胞功能的基因产物的实例包括但不限于：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd39、Cd73和Lag3。此类转基因在本文中可被称为“遮掩”或“遮掩的”基因。
[0108] 如本文所用，术语“减轻同种异体移植物细胞的巨噬细胞溶细胞功能和吞噬作用”是指编码基因产物的转基因，所述基因产物的功能是抑制或防止同种异体移植物细胞的巨噬细胞溶细胞功能和/或吞噬作用(Fish等人,Toxicology.19:127-38.(1981)；Sung等人,J Biol Chem.260:546-54(1985)；Amash等人,J Immunol.196:3331-40(2016))。在一个实施方案中，同种异体移植细胞的巨噬细胞溶细胞功能和吞噬作用的减轻是指同种异体移植物细胞的巨噬细胞溶细胞功能和/或吞噬作用相对于对照降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％(例如，如使用巨噬细胞溶细胞功能的测定所确定(例如，通过将巨噬细胞与已预先涂有针对由靶细胞系表达的表面抗原的抗体的靶细胞系一起孵育并测量具有荧光活力染色的存活靶细胞的数量或通过测量从巨噬细胞事发的溶细胞颗粒(例如，穿孔素、颗粒酶或从免疫细胞释放的其他溶细胞蛋白质)的分泌；或者如使用巨噬细胞吞噬作用的测定所确定(例如，将巨噬细胞与荧光珠或已预先涂有针对由靶细胞系表达的表面抗原的抗体的靶细胞系一起培养并测量免疫细胞内部的荧光或量化被吞没的珠或细胞的数量))。用于确定同种异体移植物细胞的巨噬细胞溶细胞功能和吞噬作用的减轻的方法是本领域已知的。减轻巨噬细胞溶细胞功能的基因产物的实例包括但不限于：Cd47、Cd200、Mfge8和Il1r2。此类转基因在本文中可被称为“遮掩”或“遮掩的”基因。
[0109] 如本文所用，术语“诱导攻击移植物的白细胞的细胞凋亡”是指编码基因产物的转基因，所述基因产物的功能是杀死同种异体移植物细胞附近的攻击移植物的白细胞(Huang等人,Proc Natl Acad Sci U S A.96:14871-6(1999)；Suzuki等人,Proc Natl Acad Sci U S A.97:1707-12(2000)；Simon等人,Proc Natl Acad Sci U S A.98:5158-63(2001))。在一个实施方案中，攻击移植物的白细胞的细胞凋亡的诱导是指攻击移植物的白细胞的细胞凋亡相对于对照增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或
100％(例如，如使用细胞凋亡的测定如TUNEL染色、半胱天冬酶染色或膜联蛋白-V染色或使用荧光活力染色所确定)。用于确定攻击移植物的白细胞的细胞凋亡的诱导的方法是本领域已知的。可诱导攻击移植物的白细胞的细胞凋亡的基因产物的实例包括但不限于：FASLG(FasL)和Tnfsf10。此类转基因在本文中可被称为“遮掩”或“遮掩的”基因。
100％(例如，如使用细胞凋亡的测定如TUNEL染色、半胱天冬酶染色或膜联蛋白-V染色或使用荧光活力染色所确定)。用于确定攻击移植物的白细胞的细胞凋亡的诱导的方法是本领域已知的。可诱导攻击移植物的白细胞的细胞凋亡的基因产物的实例包括但不限于：FASLG(FasL)和Tnfsf10。此类转基因在本文中可被称为“遮掩”或“遮掩的”基因。
[0110] 如本文所用，术语“减轻局部炎性蛋白”是指编码基因产物的转基因，所述基因产物的功能是抑制局部蛋白质的活性，其中所述蛋白质的功能是促进攻击移植物的白细胞累积和/或它们的溶细胞功能(Felix等人,Nat Rev Immunol.17:112-29(2017))。在一个实施方案中，局部炎性蛋白的减轻是指局部炎性蛋白相对于对照减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％(例如，如使用促进白细胞活化或迁移至炎症部位的炎性蛋白(例如，趋化因子如CCL2、CCL3、CCL5、CXCL1、CXCL2和CXCL8或促炎细胞因子如IL-1β、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、TNFα、IFNγ或GMCSF，其可使用ELISA、蛋白质印迹分析或本领域已知的用于测量分泌的蛋白质的其他技术来测量)的测定来确定)。用于确定局部炎性蛋白的减轻的方法是本领域已知的。减轻局部炎性蛋白的基因产物的实例包括但不限于：PD-L1、Il1r2和Ackr2。此类转基因在本文中可被称为“遮掩”或“遮掩的”基因。
[0111] 如本文所用，术语“保护免受白细胞介导的细胞凋亡”是指编码基因产物的转基因，所述基因产物的功能是抑制可诱导同种异体移植物细胞的细胞凋亡或细胞溶解的任何细胞组分(Abdullah等人,J Immunol.178:3390-9(2007))。在一个实施方案中，保护免受白细胞介导的细胞凋亡是指白细胞介导的细胞凋亡相对于对照减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％(例如，如使用白细胞介导的凋亡的测定所确定(例如，通过将白细胞与已预先涂有针对由靶细胞系表达的表面抗原的抗体的靶细胞系一起孵育并测量具有荧光活力染色的存活靶细胞的数量或通过测量从白细胞释放的溶细胞颗粒(例如，穿孔素、颗粒酶或从免疫细胞释放的其他溶细胞蛋白质)的分泌)。用于确定保护免受白细胞介导的细胞凋亡的方法是本领域已知的。保护免受白细胞介导的细胞凋亡的基因产物的实例包括但不限于：Serpin B9(Spi6)和Dad1。此类转基因在本文中可被称为“遮掩”或“遮掩的”基因。
[0112] 如本文所用，术语“生物制剂”是指可表达为转基因的设计的多肽和相应的编码DNA。多肽可激动或抑制内源性基因的功能或抑制或活化生物过程。用于确定多肽是否具有激动剂或拮抗剂活性或功能的方法在本领域中通常是已知的。在一个实施方案中，激动剂功能是相对于对照的功能，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的功能。在一个实施方案中，拮抗剂功能是相对于对照的功能，至少约10％、
20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的功能。
20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的功能。
[0113] 如本文所用，术语“可操作地连接”是指第一分子连接至第二分子，其中所述分子如此布置以使得第一分子影响第二分子的功能或表达。两个分子可以或可以不为单一邻接分子的一部分并且可以或可以不相邻。例如，如果启动子调节细胞中的目标可转录多核苷酸分子的转录，则所述启动子可操作地连接至可转录多核苷酸分子。另外，如果转录调控元件的两个部分连接在一起以使得一个部分的转录活化功能性不受另一部分的存在不利地影响，则所述两个部分彼此可操作地连接。两个转录调控元件可通过接头核酸(例如，插入非编码核酸)彼此可操作地连接，或者可在不存在插入核苷酸的情况下彼此可操作地连接。
[0114] 如本文所用，术语“启动子”是指DNA上由RNA聚合酶结合的识别位点。聚合酶驱动转基因的转录。
[0115] 相对于参考多核苷酸或多肽序列的“序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并且在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参考多核苷酸或多肽序列中的核酸或氨基酸相同的核酸或氨基酸的百分比。出于测定核酸或氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以在本领域技术人员能力范围内的多种方式实现，所述方式例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2或Megalign软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，可使用序列比较计算机程序BLAST来产生序列同一性百分比值。作为说明，给定核酸或氨基酸序列A对于、与或针对给定核酸或氨基酸序列B的序列同一性百分比(其可替代地措词为给定核酸或氨基酸序列A具有或包含对于、与或针对给定核酸或氨基酸序列B的某一序列同一性百分比)如下计算：
[0116] 100×(分数X/Y)
[0117] 其中X为通过序列比对程序(例如，BLAST)在所述程序的A和B的比对中评分为相同匹配的核苷酸或氨基酸的数目，并且其中Y为B中的核酸的总数。应当理解，当核酸或氨基酸序列A的长度不等于核酸或氨基酸序列B的长度时，A与B的序列同一性百分比将不等于B与A的序列同一性百分比。
[0118] 如本文所用，术语“药物组合物”是指待施用至受试者，如哺乳动物(例如人)以预防、治疗或控制影响或可能影响所述受试者的特定疾病或疾患的含有治疗剂的混合物，所述治疗剂任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体组合。
[0119] 如本文所用，术语“药学上可接受的”是指适合于与受试者如哺乳动物(例如人)的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应和/或其他问题并发症、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0120] 如本文所用，术语“野生型”是指给定生物体中特定基因的具有最高频率的基因型。
[0121] 如本文所用，术语“细胞分裂基因座(cell division locus)”、“细胞分裂基因座(cell division loci)”和“CDL”是指其转录产物由分裂细胞表达的基因组基因座(或基因座)。当CDL包含单个基因座时，细胞(或其衍生物)中CDL表达的不存在意味着肿瘤起始和/或形成被禁止，因为所述细胞将在不存在CDL表达的情况下被消除或者因为所述细胞的增殖将在不存在CDL表达的情况下被阻断或损害。当CDL包含多个基因座时，细胞(或其衍生物)中基因座的全部或子集的表达的不存在意味着肿瘤起始和/或形成被禁止，因为所述细胞将在不存在CDL表达的情况下被消除或者因为所述细胞的增殖将在不存在CDL表达的情况下被阻断或损害。CDL可或可不在非分裂和/或非增殖细胞中表达。CDL可以是宿主细胞内源的，或者它可以是转基因。如果CDL是转基因，则它可与宿主细胞来自相同或不同的物种，或者它可具有合成起源。在一个实施方案中，CDL是在细胞分裂过程中转录的单个基因座。例如，在一个实施方案中，单个基因座CDL是CDK1。在一个实施方案中，CDL包含在细胞分裂期间转录的两个或更多个基因座。例如，在一个实施方案中，多基因座CDL包含两种MYC基因(c-Myc和N-myc)(Scognamiglio等人，2016)。在一个实施方案中，多基因座CDL包含可具有重叠功能的AURORA B和C激酶(Fernandez-Miranda等人，2011)。细胞分裂和细胞增殖是可在本文中互换使用的术语。
[0122] 如本文所用，术语“细胞分裂的正常速率”、“正常细胞分裂速率”、“细胞增殖的正常速率”和“正常细胞增殖速率”是指为非癌性健康细胞所典型的细胞分裂和/或增殖的速率。细胞分裂和/或增殖的正常速率可以是细胞类型特异性的。例如，众所周知，表皮、肠、肺、血液、骨髓、胸腺、睾丸、子宫和乳腺中细胞的数量通过高细胞分裂率和高细胞死亡率得以维持。相比之下，胰腺、肾、角膜、前列腺、骨骼、心脏和脑中细胞的数量通过低的细胞分裂速率和低的细胞死亡速率得以维持(Pellettieri和SánchezAlvarado,2007)。
[0123] 如本文所用，术语“增殖的诱导型负效应物”和“iNEP”是指通过以下方式促进利用CDL表达来控制细胞分裂和/或增殖的遗传修饰：i)诱导性地终止或阻断CDL表达，从而禁止细胞分裂和增殖；ii)诱导性地消除至少一部分表达CDL的细胞(即杀死至少一部分增殖细胞)；或iii)相对于细胞的正常细胞分裂速率诱导性地减缓细胞分裂的速率，以使得细胞分裂速率将不足以快至促成肿瘤形成。
[0124] 如本文所用，术语“消除连接”和“ALINK”是指iNEP的实例，其包括在CDL与编码阴性选择性标记物的序列之间的转录连接。ALINK修饰允许使用者通过将ALINK修饰的细胞暴露于阴性选择性标记物的诱导剂来杀死至少一部分增殖细胞而诱导性地杀死包含ALINK的增殖宿主细胞或抑制宿主细胞的增殖。例如，可用阴性选择性标记物的诱导剂(例如前药)处理经修饰以在CDL处包含ALINK的细胞，以便消除增殖细胞或通过杀死至少一部分增殖细胞来抑制细胞增殖。
[0125] 如本文所用，术语“CDL调控的外源性活化因子”和“EARC”是指iNEP的实例，其包括经由活化因子促进非编码或编码DNA转录或相应翻译的外源性改变的机制或系统。EARC修饰允许使用者通过从EARC修饰的细胞中除去允许EARC修饰的CDL的转录和/或翻译的诱导剂而诱导性地终止或抑制包含EARC的细胞的分裂。例如，基于诱导型活化因子的基因表达系统可以可操作地连接至CDL并用于外源性控制CDL的表达或CDL翻译，以使得药物诱导型活化因子和相应的诱导剂药物的存在是CDL转录和/或翻译所必需的。在没有诱导剂药物的情况下，细胞分裂和/或增殖将终止或受到抑制(例如减缓至正常细胞分裂速率)。例如，可对CDL Cdk1/CDK1进行修饰以包含dox-桥，以使得Cdk1/CDK1的表达以及细胞分裂和增殖仅在诱导剂(例如强力霉素)存在下才可能。
[0126] 如本文所用，术语“增殖拮抗剂系统”是指其存在抑制(完全或部分)细胞的增殖的天然或工程化的化合物。
[0127] 如本文所用的术语“dox-桥”是指通过内源性或外源性启动子表达rtTA(Gossen等人，1995)来使启动子的活性与靶转录区域分离并在TRE控制下实现靶区域的转录的机制。如本文所用，“rtTA”是指四环素诱导型系统的反向四环素反式活化因子元件(Gossen等人，
1995)，并且“TRE”是指由最小启动子上游的TetO操纵子序列组成的启动子。在强力霉素存在下rtTA与TRE启动子的结合后，TRE启动子下游的基因座的转录增加。rtTA序列可插入与CDL相同的转录单元中，或者插入基因组的不同位置中，只要靶区域的转录表达的允许或不允许状态受强力霉素控制即可。dox-桥是EARC的一个实例。
1995)，并且“TRE”是指由最小启动子上游的TetO操纵子序列组成的启动子。在强力霉素存在下rtTA与TRE启动子的结合后，TRE启动子下游的基因座的转录增加。rtTA序列可插入与CDL相同的转录单元中，或者插入基因组的不同位置中，只要靶区域的转录表达的允许或不允许状态受强力霉素控制即可。dox-桥是EARC的一个实例。
[0128] 如本文所用，术语“失效安全(fail-safe)细胞”是指在一个或多个CDL(例如，至少两个、三个、四个或五个CDL)中含有一个或多个纯合的、杂合的、半合子的或复合杂合的ALINK或EARC的细胞。失效安全细胞可含有ALINK或EARC或者ALINK和EARC修饰两者(例如，不同CDL或单个CDL中的ALINK和EARC修饰)。
[0129] 如本文所用，术语“失效安全”是指不太可能表现出不受控制的(例如，致瘤性)增殖的细胞的性质。当细胞增殖处于负调控因子或诱导物的控制下并且由于遗传突变所致的细胞丧失控制增殖的系统的活性的可能性较低时，可认为所述细胞为“失效安全”。失效安全容量将取决于ALINK的数量和ALINK靶向的CDL的数量(例如，具有两个不同CDL的纯合修饰的细胞具有比具有单个CDL的杂合修饰的细胞更高的失效安全容量(例如，不太可能丧失所有通过遗传突变控制增殖的系统))。表3中进一步描述了失效安全性质。附图说明
[0131] 在参考附图的以下详述中，本公开的这些和其他特征将变得更加显而易见，其中：
[0132] 图1A-1D描绘示出使用免疫组织化学C57BL/6小鼠胚胎干细胞系C2中遮掩蛋白质(Cd200(图1A)、FasL(图1B)、H2-M3(图1C)和Cd47(图1D))的表达的代表性图像。
[0133] 图2A-2E是示出在混合淋巴细胞反应中使用脾细胞(图2A)、wt B16黑素瘤细胞(图2B)、遮掩的B16黑素瘤细胞(图2C)、wt ES细胞(图2D)和遮掩的ES细胞(图2E)的T细胞活化的流式细胞术图。
[0134] 图3A-3B是示出与它们的WT对应物(图3A)相比，同种异体模型中遮掩的(图3B)B16F10癌细胞被保护免受排斥的示意图和图像。C57BL/6(n＝5)中未遮掩的细胞和FVB/N(n＝4)中未遮掩的细胞(图3A)；C57BL/6(n＝5)中遮掩的细胞和FVB/N(n＝6)中遮掩的细胞(图3B)的代表性图像。
[0135] 图4是示出遮掩的胚胎干细胞在等基因B6小鼠接受者(上图)和FVB同种异体接受者(下图)中形成肿瘤的示意图。
[0136] 图5A-5C是描绘由皮下注射遮掩的C57BL/6ES细胞形成的携带畸胎瘤的同种异体小鼠的一系列照片。红色箭头指示畸胎瘤。图5A示出C3H小鼠中的畸胎瘤，图5B示出FVB/N小鼠中的畸胎瘤，图5C示出CD1小鼠中的畸胎瘤。
[0137] 图6是示出具有遮掩的组织的动物未受到免疫损害的示意图和系列图像。
[0138] 图7是示出显示具有遮掩的组织的动物未受到免疫损害的另外的结果的FVB/N小鼠的一系列图像。
[0139] 图8A-8H示出在源自C57BL/6小鼠的含有克隆安全失效的胚胎干细胞中的转基因表达。图8A示出FasL表达，图8B示出Ccl21b表达，图8C示出Cd200表达，图8D示出Cd47表达，图8E示出Mfge8表达，图8F示出Spi6表达，图8G示出H2-M3表达，并且图8H示出PD-L1表达。
[0140] 图9是描绘ES细胞克隆中遮掩转基因表达的一系列图。每种遮掩的转基因均以不同的颜色描绘。同心圆代表按log10标度的表达水平。粗黑圈代表归一化至阳性对照(从鼠淋巴器官分离的活化的白细胞)的1x表达，其中下一个外环分别表示与阳性对照相比的10x和100x表达。最内环是与阳性对照相比的0.1x表达。克隆NT2和15(用红色方块表示)具有最高的遮掩基因表达。这些克隆在同种异体宿主中存活。
[0141] 图10是描绘在ES细胞的整个基因组的全基因组基因表达水平分布中遮掩转基因的表达的图。NT2细胞系和NT2来源的畸胎瘤中的所有8种遮掩转基因的表达水平均在ES细胞基因组中所有基因的前5％中，其中5种遮掩转基因的表达水平在ES细胞基因组中所有基因的前1％中。NT2系和NT2来源的畸胎瘤中转基因的表达水平成功实现同种异体移植物耐受性。
[0142] 图11A-11B是示出FVB/N小鼠中C57BL/6来源的畸胎瘤的照片。转基因株系NT2在10个注射位点中产生9个畸胎瘤。在注射后3个月拍摄图像。图11B是由图11A中的箭头指示的畸胎瘤的放大图像。
[0143] 图12A-12B是示出在用更昔洛韦处理的同基因(图12A)和同种异体(图12B)小鼠中畸胎瘤肿瘤大小的图。
[0144] 图13A-13B是示出被注入同基因(图13A)和同种异体(图13B)宿主中的遮掩的胚胎干细胞可分化成所有三种细胞谱系的一系列显微照片。
[0145] 图14A-14D是示出在由皮下注射遮掩的ES细胞到小鼠中形成的畸胎瘤中所有三个胚层的形成的显微照片。图14A、图14B和图14C示出三个胚层(ec＝外胚层，图14A中所示；en＝内胚层，图14C中所示；me＝中胚层，图14B中所示。图14D示出由红色箭头指示的血管，从而确认组织被良好地血管化。
[0146] 图15是示出表达同种异体耐受性必不可少的靶基因的载体的构建的示意图。
[0147] 图16A-16H是示出由ES细胞中的遮掩转基因编码的蛋白质的表达荧光显微照片。图16A示出PD-L1的表达，图16B示出CD200的表达，图16C示出CD47的表达，图16D示出FasL的表达，图16E示出H2-M3的表达，图16F示出Ccl21的表达，图16G示出Mfge8的表达，并且图16H示出Spi6的表达。
[0148] 图17A-17B是示出遮掩的ES细胞具有典型的ES细胞形态(图17A)并表达ES细胞标志物碱性磷酸酶(图17B)的显微照片。
[0149] 图18A-18B是示出遮掩的ES细胞中多能ES细胞的标志物(Oct4(图18A)和SSEA1(图18B))的表达的荧光显微照片。图18A-18B中的插图示出ES细胞标志物(Oct4和SSEA)和标记细胞核的DAPI的荧光显微照片的单通道图像，以证明ES细胞标志物的染色与遮掩的细胞共定位。
[0150] 图19是描绘在ES细胞中通过遮掩转基因(上图)和用于表达遮掩转基因的表达盒(下图)进行抑制的免疫过程的示意图。
[0151] 图20是描绘干扰素γ(IFNγ)对ES细胞中MHC水平的影响的一系列图。IFNγ增加野生型ES细胞和过表达野生型IFNγ受体IFNγR1的ES细胞中的MHC水平，但不增加过表达IFNγ受体的显性阴性形式(IFNγR1 d39)的ES细胞中的MHC水平，从而表明IFNγR1 d39完全抑制IFNγ介导的ES细胞中MHC的上调。
具体实施方式
[0152] 细胞和方法的描述
[0153] 特征是诸如遗传修饰的细胞的工具，以及用于例如在将所述细胞移植在同种异体宿主中时使用所述细胞在移植部位提供局部免疫遏制的方法。所述遗传修饰的细胞包含：一种或一组转基因，每种转基因编码为细胞质、膜结合或局部作用并且其功能是减轻宿主免疫系统的功能(例如，攻击移植物的白细胞和NK细胞活化)或充当针对攻击白细胞的防御机制的基因产物。
[0154] 已经发现各种细胞质、膜结合或局部作用免疫因子调控局部免疫区室和局部免疫群体。免疫因子如PD-L1(Brown等人,J Immunol.170:1257-66(2003:Curiel等人,Nat Med.9:562-7(2003)；Dong等人,NatMed.8:793-800(2002))、CD47((Willingham等人,Proc Natl Acad Sci U S A.109:6662-7(2012)；Liu等人,PLoSOne.10:e0137345(2015)；
Demeure等人,J Immunol.164:2193-9(2000))、CD200(Jenmalm等人,J Immunol.176:191-9(2006)；Cherwinski等人,J Immunol.174:1348-56(2005)；Kretz-Rommel等人,J
Immunol.178:5595-605(2007))、FasL(O'Connell等人,J Exp Med.184:1075-82(1996)；Ju等人,Nature.373:444-8(1995)；Mazar等人,JBiol Chem.284:22022-8(2009))以及Spi6(Medema Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.98:11515-20(2001)；Zhang等人,Immunity.24:451-61(2006)；Soriano等人,Lung Cancer.77:38-45(2012))在已经描述的众多中，包括它们在免疫调节中的作用。发现同种异体细胞中的这些免疫调控因子中的一种或多种的表达可用于在向其施用细胞的宿主中提供局部免疫遏制和/或减少同种异体排斥。
Demeure等人,J Immunol.164:2193-9(2000))、CD200(Jenmalm等人,J Immunol.176:191-9(2006)；Cherwinski等人,J Immunol.174:1348-56(2005)；Kretz-Rommel等人,J
Immunol.178:5595-605(2007))、FasL(O'Connell等人,J Exp Med.184:1075-82(1996)；Ju等人,Nature.373:444-8(1995)；Mazar等人,JBiol Chem.284:22022-8(2009))以及Spi6(Medema Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.98:11515-20(2001)；Zhang等人,Immunity.24:451-61(2006)；Soriano等人,Lung Cancer.77:38-45(2012))在已经描述的众多中，包括它们在免疫调节中的作用。发现同种异体细胞中的这些免疫调控因子中的一种或多种的表达可用于在向其施用细胞的宿主中提供局部免疫遏制和/或减少同种异体排斥。
[0155] 通过使用引入到细胞或细胞群体中的特定免疫调节因子来修饰同种异体细胞。修饰的细胞通过同时调节许多不同的局部免疫途径来逃避免疫排斥。无论遗传背景如何，此类遗传工程化的细胞都可“现成”地移植到许多受体中，并且不被受体免疫系统排斥。这种免疫调节方法克服对移植接受者进行全身性免疫遏制(其对接受者可能是危险的)的要求。因此，尽管可向接受本文所述的修饰的细胞的患者施用免疫遏制剂，但是所述疗法不必包括施用免疫遏制剂。这种免疫调节方法还克服昂贵且不切实际的方法，获得患者特异性iPS细胞、操纵调控性细胞或通过造血细胞移植(HCT)诱导嵌合现象。
[0156] 可对细胞进行遗传修饰以表达一组转基因，所述转基因编码为细胞质、膜结合或局部作用并且其功能是减轻免疫功能(例如，攻击移植物的白细胞和NK细胞活化)或充当针对免疫响应(例如，攻击白细胞)的防御基质的基因产物。所述组转基因可选自在上述免疫调节途径中具有作用的基因。此类基因包括但不限于表1中提供的那些。
[0157] 表1：可用于局部免疫遏制的由同种异体细胞表达的基因
[0158]
[0159]
[0160] C-C基序趋化因子配体21(Ccl21)由局部淋巴结表达，在局部淋巴结中它用于吸引活化的抗原呈递细胞(APC)。这种关键功能提供通过在移植的细胞上过表达这种基因来“逆转”APC迁移的机会。实际上，一些黑素瘤表达Ccl21并募集CCR7+细胞，所述细胞进而可将其肿瘤基质的部分重组为“自身”。这导致指导Cd4+Treg的募集和维持的基质重建(Zindl等人,Science.328:697-8(2010))。实际上，Ccl21在肿瘤上的表达可保护同系同种异体移植物环境中共植入的Ccl21缺陷型肿瘤细胞免于排斥(Shields等人,Science.328:749-52(2010))。Ccl21b是人Ccl21的小鼠直系同源物。
[0161] 小鼠和人Ccl21的氨基酸序列是：
[0162] 小鼠Ccl21
[0163] MAQMMTLSLLSLVLALCIPWTQGSDGGGQDCCLKYSQKKIPYSIVRGYRKQEPSLGCPIPAILFLPRKHSKPELCANPEEGWVQNLMRRLDQPPAPGKQSPGCRKNRGTSKSGKKGKGSKGCKRTEQTQPSRG(SEQ ID NO:1)
[0164] 人Ccl21
[0165] MAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIP
[0166] AILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP(SEQ ID NO:2)
[0167] 脐带血中Cd47的表达可促进低响应性T细胞的发育(Avice等人,JImmunol.167:2459-68(2001))。由于它们缺乏“自身”呈递，红细胞还上调Cd47以避免树突细胞活化(van denBerg等人,Immunity.43:622-4(2015))。最近，表明人Cd47的表达增加猪至人造血细胞移植的小鼠模型中的植入(Tena等人,AmJTransplant.14:2713-22(2014))。
[0168] 小鼠和人Cd47的氨基酸序列是：
[0169] 小鼠Cd47
[0170] MWPLAAALLLGSCCCGSAQLLFSNVNSIEFTSCNETVVIPCIVRNVEAQSTEEMFVKWKLNKSYIFIYDGNKNSTTTDQNFTSAKISVSDLINGIASLKMDKRDAMVGNYTCEVTELSRE
[0171] GKTVIELKNRTVSWFSPNEKILIVIFPILAILLFWGKFGILTLKYKSSHTNKRIILLLVAGLVLTVIVVVGAILLIPGEKPVKNASGLGLIVISTGILILLQYNVFMTAFGMTSFTIAILITQVLGYVLALVGLCLCIMACEPVHGPLLISGLGIIALAELLGLVYMKFVASNQRTIQPPRNR(SEQ ID NO:3)
[0172] 人Cd47
[0173] MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVASNQKTIQPPRKAVEEPLNAFKESKGMMNDE(SEQ ID NO:4)
[0174] Cd200也是重要的免疫调控分子；表达增加可降低同种异体移植物排斥、自身免疫和过敏性疾病的严重性(Gorczynski等人,JImmunol.172:7744-9(2004))。已经表明，在体外，Cd200的APC表达遏制由活化的Cd8+T细胞产生干扰素γ(IFN-γ)和溶细胞颗粒(Misstear等人,J Virol.86:6246-57(2012))。最令人感兴趣的是，Cd200的过表达通过促进Foxp3+Treg细胞而增加小鼠中皮肤和心脏同种异体移植物的存活率(Gorczynski等人,Transplantation.98:1271-8(2014))。
[0175] 小鼠和人Cd200的氨基酸序列是：
[0176] 小鼠Cd200
[0177] MGSLVFRRPFCHLSTYSLIWGMAAVALSTAQVEVVTQDERKALHTTASLRCSLKTSQEPLIVTWQKKKAVSPENMVTYSKTHGVVIQPAYKDRINVTELGLWNSSITFWNTTLEDEGCYMCLFNTFGSQKVSGTACLTLYVQPIVHLHYNYFEDHLNITCSATARPAPAISWKGTGTGIENSTESHFHSNGTTSVTSILRVKDPKTQVGKEVICQVLYLGNVIDYKQSLDKGFWFSVPLLLSIVSLVILLVLISILLYWKRHRNQERGESSQGMQRMK(SEQ ID NO:5)
[0178] 人Cd200
[0179] MERLVIRMPFSHLSTYSLVWVMAAVVLCTAQVQVVTQDEREQLYTPASLKCSLQNAQEALIVTWQKKKAVSPENMVTFSENHGVVIQPAYKDKINITQLGLQNSTITFWNITLEDEGCYMCLFNTFGFGKISGTACLTVYVQPIVSLHYKFSEDHLNITCSATARPAPMVFWKVPRSGIENSTVTLSHPNGTTSVTSILHIKDPKNQVGKEVICQVLHLGTVTDFKQTVNKGYWFSVPLLLSIVSLVILLVLISILLYWKRHRNQDRGELSQGVQKMT(SEQ ID NO:6)
[0180] Spi6是由活化的Cd8+T细胞释放的细胞毒性效应分子颗粒酶B的内源性抑制剂(Sun等人,JBiol Chem.272:15434-41(1997))。一些数据表明，间充质干细胞(MSC)通过上调这种分子而逃避免疫排斥(El Haddad等人,Blood.117:1176-83(2011))。最近还证明，树突细胞将抗原呈递至细胞毒性T细胞而自身不会通过接触介导的细胞毒性被杀死的能力由Spi6介导(Lovo等人,JImmunol.188:1057-63(2012))。Spi6也称为Serpin B9。
[0181] 小鼠Spi6和人对应物Serpin B9的氨基酸序列是：
[0182] 小鼠Spi6
[0183] MNTLSEGNGTFAIHLLKMLCQSNPSKNVCYSPASISSALAMVLLGAKGQTAVQISQALGL
[0184] NKEEGIHQGFQLLLRKLNKPDRKYSLRVANRLFADKTCEVLQTFKESSLHFYDSEMEQLSFAEEAEVSRQHINTWVSKQTEGKIPELLSGGSVDSETRLVLINALYFKGKWHQPFNKEYTMDMPFKINKDEKRPVQMMCREDTYNLAYVKEVQAQVLVMPYEGMELSLVVLLPDEGVDLSKVENNLTFEKLTAWMEADFMKSTDVEVFLPKFKLQEDYDMESLFQRLGVVDVFQEDKADLSGMSPERNLCVSKFVHQSVVEINEEGTEAAAASAIIEFCCASSVPTFCADHPFLFFIRHNKANSILFCGRFSSP(SEQ ID NO:7)
[0185] 人Serpin B9
[0186] METLSNASGTFAIRLLKILCQDNPSHNVFCSPVSISSALAMVLLGAKGNTATQMAQALSL
[0187] NTEEDIHRAFQSLLTEVNKAGTQYLLRTANRLFGEKTCQFLSTFKESCLQFYHAELKELS
[0188] FIRAAEESRKHINTWVSKKTEGKIEELLPGSSIDAETRLVLVNAIYFKGKWNEPFDETYTREMPFKINQEEQRPVQMMYQEATFKLAHVGEVRAQLLELPYARKELSLLVLLPDDGVELS
[0189] TVEKSLTFEKLTAWTKPDCMKSTEVEVLLPKFKLQEDYDMESVLRHLGIVDAFQQGKADLSAMSAERDLCLSKFVHKSFVEVNEEGTEAAAASSCFVVAECCMESGPRFCADHPFLFFIRHNRANSILFCGRFSSP(SEQ ID NO:8)
[0190] 活化的、细胞毒性的Cd8+可通过FasL的表达杀死靶细胞，所述FasL与FAS受体结合并活化半胱天冬酶介导的靶向细胞的细胞凋亡。然而，许多肿瘤通过上调其表面上的FasL而发展“反击”(Chen等人,J Immunol.171:1183-91(2003))。FasL在人和小鼠实体瘤的脉管系统中的选择性表达一直与稀少的Cd8+T细胞浸润和大量的FoxP3+Treg细胞相关(Motz等人Nat Med.20:607-15(2014))。最近，表明B淋巴细胞还使用FasL的表达来在免疫响应的效应阶段杀死T辅助细胞(Lundy等人,FrontImmunol.6:122(2015))。FasL是人FASLG的小鼠直系同源物。
[0191] 小鼠FasL和人对应物FASLG的氨基酸序列是：
[0192] 小鼠FasL
[0193] MQQPMNYPCPQIFWVDSSATSSWTPPGSVFPCPSSGPRGPDQRRPPPPPPPVSPLPPPSQPLPLPPLTPLKKKDHNTNLWLPVVFFMVLVALVGMGLGMYQLFHLQKELAELREFTNQSLKVSSFEKQIANPSTPSEKKELRSVAHLTGNPHSRSIPLEWEDTYGTALISGVKYKKGSLVINEAGLYFVYSKVYFRGQSCNNQPLNHKVYMRNSKYPGDLVLMEEKRLNYCTTGQIWAHSSYLGAVFNLTSADHLYVNISQLSLINFEESKTFFGLYKL(SEQ ID NO:9)
[0194] 人FASLG
[0195] MQQPFNYPYPQIYWVDSSASSPWAPPGTVLPCPTSVPRRPGQRRPPPPPPPPPLPPPPPPPPLPPLPLPPLKKRGNHSTGLCLLVMFFMVLVALVGLGLGMFQLFHLQKELAELRESTSQMHTASSLEKQIGHPSPPPEKKELRKVAHLTGKSNSRSMPLEWEDTYGIVLLSGVKYKKGGLVINETGLYFVYSKVYFRGQSCNNLPLSHKVYMRNSKYPQDLVMMEGKMMSYCTTGQMWARSSYLGAVFNLTSADHLYVNVSELSLVNFEESQTFFGLYKL(SEQ ID NO:10)[0196] PD-L1是结合至程序性细胞死亡1(PD-1)的关键免疫调节分子。PD-1在T细胞上表达，并且与PD-L1的结合导致T细胞无变应性(MacDonald等人,JImmunol.126:1671-5(1981))。
[0197] 小鼠和人PD-L1的氨基酸序列是：
[0198] 小鼠PD-L1
[0199] MRIFAGIIFTACCHLLRAFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKE
[0200] DEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYCCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTHWVLLGSILLFLIVVSTVLLFLRKQVRMLDVEKCGVEDTSSKNRNDTQFEET(SEQ ID NO:11)
[0201] 人PDL1(CD274)
[0202] MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET(SEQ ID NO:12)
[0203] 如同由同种异体移植物诱导的那些，炎性环境吸引巨噬细胞和炎性单核细胞以及许多其他先天免疫细胞。乳脂肪球表皮生长因子–8(Mfge-8)在许多鼠类肿瘤中表达(Neutzner等人,Cancer Res.67:6777-85(2007))，并且已显示通过使进入的单核细胞极化为遏制性M2样巨噬细胞而有助于局部免疫遏制(Soki等人,J Biol Chem.289:24560-72
(2014))。
(2014))。
[0204] 小鼠和人MFGE-8的氨基酸序列是：
[0205] 小鼠MFGE8
[0206] MQVSRVLAALCGMLLCASGLFAASGDFCDSSLCLNGGTCLTGQDNDIYCLCPEGFTGLVCNETERGPCSPNPCYNDAKCLVTLDTQRGDIFTEYICQCPVGYSGIHCETETNYYNLDGEYMFTTAVPNTAVPTPAPTPDLSNNLASRCSTQLGMEGGAIADSQISASSVYMGFMGLQRWGPELARLYRTGIVNAWTASNYDSKPWIQVNLLRKMRVSGVMTQGASRAGRAEYLKTFKVAYSLDGRKFEFIQDESGGDKEFLGNLDNNSLKVNMFNPTLEAQYIKLYPVSCHRGCTLRFELLGCELHGCSEPLGLKNNTIPDSQMSASSSYKTWNLRAFGWYPHLGRLDNQGKINAWTAQSNSAKEWLQVDLGTQRQVTGIITQGARDFGHIQYVASYKVAHSDDGVQWTVYEEQGSSKVFQGNLDNNSHKKNIFEKPFMARYVRVLPVSWHNRITLRLELLGC(SEQ ID NO:13)
[0207] 人MFGE8
[0208] MPRPRLLAALCGALLCAPSLLVALDICSKNPCHNGGLCEEISQEVRGDVFPSYTCTCLKGYAGNHCETKCVEPLGMENGNIANSQIAASSVRVTFLGLQHWVPELARLNRAGMVNAWTPSSNDDNPWIQVNLLRRMWVTGVVTQGASRLASHEYLKAFKVAYSLNGHEFDFIHDVNKKHKEFVGNWNKNAVHVNLFETPVEAQYVRLYPTSCHTACTLRFELLGCELNGCANPLGLKNNSIPDKQITASSSYKTWGLHLFSWNPSYARLDKQGNFNAWVAGSYGNDQWLQVDLGSSKEVTGIITQGARNFGSVQFVASYKVAYSNDSANWTEYQDPRTGSSKIFPGNWDNHSHKKNLFETPILARYVRILPVAWHNRIALRLELLGC(SEQ ID NO:14)
[0209] NK细胞的强效杀伤潜力在移植排斥中也至关重要。NK细胞可杀死缺乏MHC I类分子的靶细胞，以及炎性环境中的其他细胞。H2-M3，人HLA-G的鼠类同源物最近已显示对NK细胞具有调控作用，从而使它们可忽略缺乏“自身分子”的细胞(Andrews等人,Nat Immunol.13:1171-7(2012))。这被认为通过在NK细胞和T细胞上结合HLA-G，免疫遏制性受体来实现(Carosella等人,Adv Immunol.127:33-144(2015))。H2-M3是人HLA-G的小鼠直系同源物。
[0210] 小鼠H2-M3和人对应物HLA-G的氨基酸序列是：
[0211] 小鼠H2-M3
[0212] SIEEIPRMEPRAPWMEKERPEYWKELKLKVKNIAQSARANLRTLLRYYNQSEGGSHILQWMVSCEVGPDMRLLGAHYQAAYDGSDYITLNEDLSSWTAVDMVSQITKSRLESAGTAEYFRAYVEGECLELLHRFLRNGKEILQRADPPKAHVAHHPRPKGDVTLRCWALGFYPADITLTWQKDEEDLTQDMELVETRPSGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCYVHHEGLTEPLALKWGRSSQSSVVIMV(SEQ ID NO:15)
[0213] 人HLA-G
[0214] MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWAGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWKQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD(SEQ ID NO:16)
[0215] 包括PD-L1、H2-M3、Cd47、Cd200、FasL、Ccl21b、Mfge8以及Spi6A中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)的一组转基因可在细胞中表达。细胞可以是例如干细胞或适用于基因组编辑的细胞，如可用于治疗和/或分化成治疗性细胞类型的细胞。干细胞可以是例如胚胎干(ES)细胞或诱导型多能干(iPS)细胞。所述组转基因可包括这些基因中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或全部8种，或者可包括这些基因中的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种。可对所述细胞进行进一步遗传修饰以表达TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1和/或IFNγR1 d39中的一种或多种。可使用本领域技术人员已知的方法修饰TGF-β转基因以便以膜结合形式表达基因产物(即，以使得所述基因产物在同种异体移植物的细胞表面上表达)。例如，用于将TGF-β定位至膜的方法是将TGF-β与编码LRRC32蛋白或导致TGF-β定位至细胞膜的任何其他多肽的另外的转基因共表达。这种蛋白质将TGF-β锚定至膜。(Tran DQ等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A.106:13445-50(2009))。
[0216] IFNγR1 d39的氨基酸序列是：
[0217] MGPQAAAGRMILLVVLMLSAKVGSGALTSTEDPEPPSVPVPTNVLIKSYNLNPVVCWEYQNMSQTPIFTVQVKVYSGSWTDSCTNISDHCCNIYGQIMYPDVSAWARVKAKVGQKESDYARSKEFLMCLKGKVGPPGLEIRRKKEEQLSVLVFHPEVVVNGESQGTMFGDGSTCYTFDYTVYVEHNRSGEILHTKHTVEKEECNETLCELNISVSTLDSRYCISVDGISSFWQVRTEKSKDVCIPPFHDDRKDSIWILVVAPLTVFTVVILVFAYWYTKKNSFKRKSIMLPKSLLSVVKSATLETKPESKYSLVTPHQPAVLESETVICEEPLSTVTAPDSPEAAEQEELSKETKALEAGGSTSAMTPDSPPTPTQRRSFSLLSSNQSGPCSLTAYHSRNGSDSGLVGSGSSISDLESLPNNNSETKMAEHDPPPVRKA(SEQ ID NO:17)
[0218] 这些基因可以是人基因或鼠基因。在一个实施方案中，所述基因与待在其中移植细胞的同种异体移植物接受者的接受者具有相同物种。在一个实施方案中，所述基因具有其中所述基因的功能是保守的或其中设计的生物制剂具有内源性对应物的激动剂功能的任何物种。用于在细胞中引入和表达这些转基因的方法在本文进行了描述并且也是本领域技术人员已知的。表达这些转基因的细胞由于它们在无全身性免疫遏制和无需免疫遏制性药物的情况下逃避同种异体排斥的能力而可被称为“遮掩的”。
[0219] 本文中预期当在同种异体接受者的移植部位移植时，源自上述遮掩的细胞的细胞群体也可用于产生局部免疫遏制。
[0220] 在产生本公开的遮掩的细胞之前或之后，可首先将所述细胞修饰为失效安全细胞。失效安全细胞使用细胞分裂基因座(CDL)来控制动物细胞中的细胞增殖。如本文提供的，CDL是其转录产物在细胞分裂期间表达的基因座。如本文所述，可对CDL进行遗传修饰以包含阴性选择性标记物和/或基于诱导型活化因子的基因表达系统，其允许使用者通过添加或除去适当的诱导剂而容许、消除和/或抑制遗传修饰的细胞的增殖。用于制备和使用失效安全细胞的方法例如描述于WO 2016/141480中，其全部教义以引用的方式并入本文。可首先使细胞为失效安全，且然后再进行遮掩。或者，可首先遮掩细胞，且然后再使其失效安全。
[0221] 细胞可以是脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，如人细胞或小鼠细胞。细胞还可以是脊椎动物干细胞，例如哺乳动物干细胞，如人干细胞或小鼠干细胞。优选地，细胞或干细胞适合于遗传修饰。优选地，使用者认为细胞或干细胞具有治疗价值，意味着所述细胞或干细胞可用于治疗需要治疗疾病、病症、缺陷或损伤的受试者的疾病、病症、缺陷或损伤。
[0222] 在一些实施方案中，细胞是干细胞或祖细胞(例如，iPSC、胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞、脂肪干或祖细胞、种系干细胞、肺干细胞或祖细胞、乳腺干细胞、嗅成体干细胞、毛囊干细胞、多潜能干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞或神经干细胞或祖细胞)。在一些实施方案中，干细胞是成体干细胞(例如，体干细胞或组织特异性干细胞)。在一些实施方案中，干细胞或祖细胞能够分化(例如，干细胞是全能的、多能的或多潜能的)。在一些实施方案中，细胞分离自胚胎或新生儿组织。在一些实施方案中，细胞是成纤维细胞、单核细胞前体、B细胞、外分泌细胞、胰腺祖细胞、内分泌祖细胞、成肝细胞、成肌细胞、前脂肪细胞、祖细胞、肝细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、K562人红白血病细胞系、骨细胞、滑膜细胞、肌腱细胞、韧带细胞、半月板细胞、脂肪细胞、树突细胞或自然杀伤细胞。在一些实施方案中，将细胞操纵(例如，转化或分化)成肌细胞、红细胞-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、iPS细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞、内分泌祖细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、肝细胞、胆管细胞或褐色脂肪细胞。在一些实施方案中，细胞是肌细胞(例如，骨骼肌、平滑肌或心肌细胞)、红细胞-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、iPS细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞(例如，红细胞、白细胞或血小板)、内分泌祖细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、肝细胞、胆管细胞或白色或褐色脂肪细胞。在一些实施方案中，细胞是分泌激素的细胞(例如，分泌胰岛素、催产素、内啡肽、加压素、血清素、生长抑素、胃泌素、促胰液素、胰高血糖素、甲状腺激素、蛙皮素、缩胆囊素、睾丸素、雌激素或孕激素、肾素、胃饥饿素、胰淀素或胰多肽的细胞)、表皮角质形成细胞、上皮细胞(例如，外分泌腺分泌上皮细胞、甲状腺上皮细胞、角质化上皮细胞、胆囊上皮细胞或角膜、舌、口腔、食道、肛管、尿道远端或阴道的表面上皮细胞)、肾细胞、生殖细胞、骨骼关节滑膜细胞、骨膜细胞、骨细胞(例如，破骨细胞或成骨细胞)、软骨膜细胞(例如，成软骨细胞或软骨细胞)、软骨细胞(cartilage cell)(例如，软骨细胞(chondrocyte))、成纤维细胞、内皮细胞、心包细胞、脑膜细胞、角质形成细胞前体细胞、角质形成细胞干细胞、周细胞、神经胶质细胞、室管膜细胞、从羊膜或胎盘膜分离的细胞或浆膜细胞(例如，内衬体腔的浆膜细胞)。在一些实施方案中，细胞是体细胞。在一些实施方案中，细胞源自皮肤或其他器官，例如心脏、脑或脊髓、肝、肺、肾、胰腺、膀胱、骨髓、脾、肠或胃。细胞可来自人或其他哺乳动物(例如，啮齿动物、非人灵长类动物、牛或猪细胞)。本文考虑遮掩的细胞可用于基于细胞的疗法中，其中可能希望逃避在局部化移植部位的同种异体排斥。
[0223] 在一些实施方案中，本文所述的遮掩的细胞在宿主中存活而不刺激宿主免疫响应持续一周或更长时间(例如，一周、两周、一个月、两个月、三个月、6个月、一年、两年、三年、四年、五年或更长时间，例如持续细胞和/或其子代的寿命)。只要遮掩转基因在宿主中存活，细胞就维持它们的表达(例如，如果遮掩转基因不再表达，则遮掩的细胞可被宿主的免疫系统除去)。在一些实施方案中，遮掩的细胞进一步表达转基因，所述转基因编码允许在体内检测遮掩的细胞的蛋白质(例如，荧光蛋白，如GFP或其他可检测的标记物)。
[0224] 本文中考虑，遮掩的细胞和失效安全细胞的组合可用于基于细胞的疗法中，其中可能希望逃避在局部化移植部位的同种异体排斥，同时还能够消除表现出不希望的生长速率的细胞，无论此类细胞是在将细胞移植到宿主之前还是之后产生的。组合的遮掩和失效安全技术允许局部化免疫保护，同时解决接受者由于细胞正在提供局部免疫遏制而将发展恶性肿瘤的风险。
[0225] 产生遮掩的细胞的方法
[0226] 本文所述的组合物和方法可用于通过遮掩转基因的表达来减轻同种异体细胞的排斥。已经建立了多种方法用于将蛋白质递送至哺乳动物细胞并用于在哺乳动物细胞中稳定表达编码蛋白质的基因，所述方法可用于产生本文所述的遮掩的细胞。
[0227] 编码遮掩蛋白质或治疗剂的多核苷酸
[0228] 可用于在哺乳动物细胞中实现遮掩蛋白质或治疗剂的治疗有效表达的一种平台是经由稳定表达编码遮掩蛋白质或治疗剂的基因(例如，通过整合到哺乳动物细胞的细胞核或线粒体基因组中，或通过哺乳动物细胞的细胞核中的游离多联体形成)。所述基因是编码相应蛋白质的一级氨基酸序列的多核苷酸。为了将外源性基因引入哺乳动物细胞中，可将基因并入载体中。可通过多种方法将载体引入细胞中，所述方法包括转化、转染、转导、直接摄取、射弹轰击以及通过将载体囊封在脂质体中。转染或转化细胞的合适方法的实例包括磷酸钙沉淀、电穿孔、显微注射、感染、脂质转染和直接摄取。此类方法在例如Green等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第四版(Cold Spring Harbor University Press,New York 2014)；以及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,New York2015)中更详细地描述，所述文献各自的公开内容以引用的方式并入本文。
[0229] 还可通过将含有编码遮掩蛋白质或治疗剂的基因的部分的载体靶向细胞膜磷脂来将遮掩蛋白质或治疗剂引入哺乳动物细胞中。例如，通过将载体分子连接至VSV-G蛋白(一种对所有细胞膜磷脂具有亲和力的病毒蛋白)，可使载体靶向细胞膜的细胞外表面上的磷脂。可使用本领域技术人员众所周知的方法来产生这种构建体。
[0230] 哺乳动物RNA聚合酶对编码遮掩蛋白质或治疗剂的多核苷酸的识别和结合对于基因表达是重要的。如此，可在多核苷酸内包括对转录因子表现出高亲和力的序列元件，所述转录因子募集RNA聚合酶并促进转录复合物在转录起始位点的组装。此类序列元件包括例如哺乳动物启动子，其序列可被特异性转录起始因子和最终RNA聚合酶识别并结合。
[0231] 适用于本文所述的组合物和方法的多核苷酸还包括编码哺乳动物启动子下游的遮掩蛋白质或治疗剂的那些多核苷酸。可用于在哺乳动物细胞中表达遮掩蛋白质或治疗剂的启动子包括组成型启动子。组成型启动子包括CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、EF1α启动子和PGK启动子。或者，源自病毒基因组的启动子也可用于在哺乳动物细胞中稳定表达这些剂。可用于促进这些剂的哺乳动物表达的功能性病毒启动子的实例包括腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子以及劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。
[0232] 一旦将以下本文描述的编码遮掩蛋白质或治疗剂的多核苷酸并入哺乳动物细胞的核DNA中，就可通过本领域已知的方法诱导这种多核苷酸的转录。例如，可通过使哺乳动物细胞暴露于外部化学试剂(如调节转录因子和/或RNA聚合酶与哺乳动物启动子的结合且由此调控基因表达的剂)来诱导表达。化学试剂可用于例如通过除去结合了启动子的阻遏蛋白来促进RNA聚合酶和/或转录因子与哺乳动物启动子的结合。或者，化学试剂可用于增强哺乳动物启动子对RNA聚合酶和/或转录因子的亲和力，以使得在化学试剂的存在下提高位于启动子下游的基因的转录速率。通过上述机制增强多核苷酸转录的化学试剂的实例包括四环素和强力霉素。这些试剂是可商购的(Life Technologies,Carlsbad,CA)，并且可根据建立的方案施用至哺乳动物细胞以促进基因表达。
[0233] 可包含在用于本文所述的组合物和方法中的核酸载体中的其他DNA序列元件包括增强子序列。增强子代表另一类调控元件，所述调控元件在含有目标基因的多核苷酸中诱导构象变化，以使得DNA采用三维取向，所述三维取向有利于转录起始位点处的转录因子和RNA聚合酶的结合。因此，用于本文所述的组合物和方法中的多核苷酸包括编码遮掩蛋白质或治疗剂并且另外包括哺乳动物增强子序列的那些。现在从哺乳动物基因已知许多增强子序列，并且实例包括来自编码哺乳动物球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素的基因的增强子。用于本文所述的组合物和方法中的增强子还包括源自能够感染真核细胞的病毒遗传物质的增强子。实例包括复制起点(bp 100-270)的后侧上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的后侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。在Yaniv等人,Nature 297:17(1982)中公开了诱导真核基因转录的活化的另外增强子序列。可将增强子剪接到含有编码遮掩蛋白质或治疗剂的多核苷酸的载体中，例如，在此基因的5'或3'位置。在优选的取向上，增强子位于启动子的5'侧，其进而相对于编码遮掩蛋白质或治疗剂的多核苷酸位于5'。
[0234] 本文所述的核酸载体可包括土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。WPRE通过促进转录物的核输出和/或通过提高新生转录物的聚腺苷酸化效率在转录水平下发挥作用，从而增加细胞中mRNA的总量。将WPRE添加至载体可导致体外和体内来自若干不同启动子的转基因表达的水平的显著改善。
[0235] 在一些实施方案中，用于本文所述的组合物和方法中的核酸载体包含报告基因序列，其可适用于验证例如特定细胞和组织中的基因表达。可在转基因中提供的报告基因序列包括编码β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶以及本领域中熟知的其他酶的DNA序列。当与驱动其表达的调控元件缔合时，报告基因序列提供可通过常规手段检测的信号，所述手段包括酶促、放射照相、比色、荧光或其他光谱测定、荧光活化细胞分选测定和免疫测定，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和免疫组织化学。例如，在标记物序列是LacZ基因的情况下，通过针对β-半乳糖苷酶活性的测定来检测携带信号的载体的存在。当转基因是绿色荧光蛋白或荧光素酶时，可在发光计中通过颜色或发光来目测测量携带信号的载体。
[0236] 用于将转基因引入细胞中的技术
[0237] 转染
[0238] 可用于将转基因，如本文所述的遮掩转基因或治疗性转基因引入靶细胞(例如哺乳动物细胞)中的技术是本领域众所周知的。例如，电穿孔可用于通过将静电势施加至目标细胞来使哺乳动物细胞(例如人靶细胞)透化。以这种方式经受外部电场的哺乳动物细胞(如人细胞)随后容易摄取外源核酸。哺乳动物细胞的电穿孔在例如Chu等人,NucleicAcids Research 15:1311(1987)中详细描述，其公开内容以引用的方式并入本文。类似的技术NucleofectionTM利用施加的电场来刺激外源多核苷酸摄取到真核细胞的细胞核中。TM
Nucleofection 和可用于进行这种技术的方案在例如Distler等人,Experimental
Dermatology14:315(2005)以及US 2010/0317114中详细描述，其各自的公开内容以引用的方式并入本文。
Nucleofection 和可用于进行这种技术的方案在例如Distler等人,Experimental
Dermatology14:315(2005)以及US 2010/0317114中详细描述，其各自的公开内容以引用的方式并入本文。
[0239] 可用于转染靶细胞的另外技术包括挤压穿孔方法。这种技术诱导细胞的快速机械变形，以刺激外源DNA穿过响应于所施加的压力而形成的膜孔摄取。这种技术的优点在于，不需要用于将核酸递送到细胞，如人靶细胞中的载体。挤压穿孔在例如Sharei等人,Journal of Visualized Experiments 81:e50980(2013)中进行了详细描述，其公开内容以引用的方式并入本文。
[0240] 脂质转染代表了另一种可用于转染靶细胞的技术。这种方法涉及将核酸负载到脂质体中，所述脂质体通常向脂质体外部呈递阳离子官能团，如季胺或质子化胺。由于细胞膜的阴离子性质，这促进了脂质体与细胞之间的静电相互作用，其最终导致外源核酸的摄取，例如，通过脂质体与细胞膜的直接融合或复合物的内吞作用。脂质转染例如在美国专利号7,442,386中详细描述，其公开内容以引用的方式并入本文。利用与细胞膜的离子相互作用来激发外来核酸的摄取的类似技术包括使细胞与阳离子聚合物-核酸复合物接触。与多核苷酸缔合以赋予有利于与细胞膜相互作用的正电荷的示例性阳离子分子包括活化的树枝状聚合物(例如在Dennig,Topics in Current Chemistry228:227(2003)中进行了描述，其公开内容以引用的方式并入本文)、聚乙烯亚胺和二乙基氨基乙基(DEAE)-右旋糖酐，其作为转染剂的用途在例如Gulick等人,Current Protocols in Molecular Biology40:I:
9.2:9.2.1(1997)中进行了详细描述，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文。磁珠是可用于以温和且有效的方式转染靶细胞的另一种工具，因为这种方法利用施加的磁场以指导核酸的摄取。这种技术例如在US 2010/0227406中进行了详细描述，其公开内容以引用的方式并入本文。
9.2:9.2.1(1997)中进行了详细描述，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文。磁珠是可用于以温和且有效的方式转染靶细胞的另一种工具，因为这种方法利用施加的磁场以指导核酸的摄取。这种技术例如在US 2010/0227406中进行了详细描述，其公开内容以引用的方式并入本文。
[0241] 用于诱导靶细胞摄取外源核酸的另一种有用的工具是激光转染(也称为光学转染)，其是一种涉及将细胞暴露于特定波长的电磁辐射以使细胞温和透化并允许多核苷酸穿透细胞膜的技术。这种技术的生物活性类似于电穿孔，并且在一些情况下优于电穿孔。
[0242] 刺穿转染(Impalefection)是可用于将遗传物质输送至靶细胞的另一种技术。它依赖于使用纳米材料，如碳纳米纤维、碳纳米管和纳米线。垂直于基底的表面合成针状纳米结构。含有意图用于细胞内递送的基因的DNA被附接至纳米结构表面。具有这些针的阵列的芯片然后被按压抵靠细胞或组织。被纳米结构刺穿的细胞可表达所递送的基因。这种技术的实例在Shalek等人,PNAS 107:1870(2010)中进行了描述，其公开内容以引用的方式并入本文。
[0243] 磁转染也可用于将核酸递送至靶细胞。磁转染原理是使核酸与阳离子磁性纳米粒子缔合。磁性纳米粒子由完全生物可降解的氧化铁制成，并涂有根据应用而变化的特定阳离子专有分子。它们与基因载体(DNA、siRNA、病毒载体等)的缔合通过盐诱导的胶体聚集和静电相互作用来实现。磁性粒子然后在由磁体产生的外部磁场的影响下集中在靶细胞上。这种技术在Scherer等人,Gene Therapy 9:102(2002)中进行了详细描述，其公开内容以引用的方式并入本文。
[0244] 用于诱导靶细胞摄取外源核酸的另一种有用的工具是声致穿孔(sonoporation)，其是一种涉及使用声音(通常为超声频率)来改变细胞质膜的通透性、使细胞透化并允许多核苷酸穿透细胞膜的技术。这种技术在例如Rhodes等人,Methods in Cell Biology 82:309(2007)中进行了详细描述，其公开内容以引用的方式并入本文。
[0245] 微泡代表根据本文所述的方法可用于修饰靶细胞的基因组的另一种潜在媒介物。例如，通过糖蛋白VSV-G与例如基因组修饰蛋白(如核酸酶)的共同过表达诱导的微泡可用于有效地将蛋白质递送到细胞中，其随后催化内源多核苷酸序列的位点特异性裂解以使细胞的基因组准备用于共价并入目标多核苷酸，如基因或调控序列。此类囊泡(也称为
Gesicles)用于真核细胞的遗传修饰的用途在例如，在Quinn等人,Genetic Modification ofTarget Cells byDirectDelivery of Active Protein[摘要]。于:Methylation
changes in early embryonic genes in cancer[摘要]中,于:美国基因与细胞治疗学会第18届年会论文集(Proceedings of the 18th Annual Meeting of the American
Society of Gene and Cell Therapy)；2015年5月13日,文摘号122中进行了详细描述。
Gesicles)用于真核细胞的遗传修饰的用途在例如，在Quinn等人,Genetic Modification ofTarget Cells byDirectDelivery of Active Protein[摘要]。于:Methylation
changes in early embryonic genes in cancer[摘要]中,于:美国基因与细胞治疗学会第18届年会论文集(Proceedings of the 18th Annual Meeting of the American
Society of Gene and Cell Therapy)；2015年5月13日,文摘号122中进行了详细描述。
[0246] 病毒感染
[0247] 除了实现高转录和翻译速率，外源基因在哺乳动物细胞中的稳定表达还可通过将含有所述基因的多核苷酸整合到哺乳动物细胞的核基因组中来实现。已经开发了用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送和整合到哺乳动物细胞的核DNA中的多种载体。表达载体的实例公开于例如WO 1994/011026中并且以引用的方式并入本文。用于本文所述的组合物和方法的表达载体含有遮掩转基因或治疗性转基因，以及例如用于表达这些剂和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞的基因组中的另外序列元件。可用于表达遮掩转基因或治疗性转基因的某些载体包括含有指导基因转录的调控序列(如启动子和增强子区)的质粒。用于表达遮掩转基因或治疗性转基因的其他有用的载体含有多核苷酸序列，所述多核苷酸序列增强这些基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括例如5'和3'非翻译区和聚腺苷酸化信号位点，以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。适用于本文所述的组合物和方法的表达载体还可含有编码用于选择含有这种载体的细胞的标记物的多核苷酸。合适的标记物的实例包括编码对抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔丝菌素)的抗性的基因。
[0248] 用于核酸递送的病毒载体
[0249] 病毒基因组提供了丰富的载体来源，所述载体可用于将目标基因有效递送至靶细胞(例如，哺乳动物细胞，如人细胞)的基因组中。病毒基因组是用于基因递送的特别有用的载体，因为包含在此类基因组内的多核苷酸通常通过普遍性或特异性转导并入哺乳动物细胞的核基因组中。这些过程作为天然病毒复制周期的一部分发生，并且不需要添加蛋白质或试剂来诱导基因整合。病毒载体的实例包括逆转录病毒(例如，逆转录病毒科病毒载体)、腺病毒(例如，Ad5、Ad26、Ad34、Ad35和Ad48)、细小病毒(例如，腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒(如小核糖核酸病毒和甲病毒)和双链DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒)以及痘病毒(例如，痘苗、修饰的痘苗安卡拉(MVA)、禽痘和金丝雀痘)。例如，其他病毒包括诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳头瘤病毒、嗜肝DNA病毒、人乳头瘤病毒、人泡沫病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病-肉瘤病毒、禽C型病毒、哺乳动物C型病毒、B型病毒、D型病毒、致癌逆转录病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、α逆转录病毒、γ逆转录病毒、泡沫病毒(spumavirus)(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,Virology,第三版(Lippincott-Raven,Philadelphia,1996))。其他实例包括鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒、禽白血病病毒、人T细胞白血病病毒、狒狒内源性病毒、长臂猿白血病病毒、Mason Pfizer猴病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猿猴肉瘤病毒、劳斯肉瘤病毒和慢病毒。载体的其他实例描述于例如美国专利号5,801,030中，其公开内容以引用的方式并入本文，因为它涉及用于基因治疗的病毒载体。
[0250] 用于核酸递送的AAV载体
[0251] 在一些实施方案中，将本文所述的遮掩转基因或治疗性转基因并入rAAV载体和/或病毒粒子中，以便有助于将它们引入细胞中。可用于本文所述的组合物和方法的rAAV载体是重组核酸构建体，所述构建体包含(1)启动子，(2)待表达的异源序列(例如本文所述的遮掩转基因或治疗性转基因)和(3)促进异源基因的整合和表达的病毒序列。病毒序列可包括顺式用于将DNA复制和包装(例如功能性ITR)到病毒粒子中所需的AAV的那些序列。此类rAAV载体还可含有标记物或报告基因。有用的rAAV载体具有全部或部分缺失的AAVWT基因中的一种或多种，但保留功能性侧接ITR序列。AAV ITR可具有适合于特定应用的任何血清型。使用rAAV载体的方法描述于例如Tal等人,J.Biomed.Sci.7:279(2000)以及Monahan和Samulski,Gene Delivery 7:24(2000)中，其各自的公开内容以引用的方式并入本文，因为它们涉及用于基因递送的AAV载体。
[0252] 可将本文所述的转基因和载体(例如，与遮掩转基因或治疗性转基因可操作地连接的启动子)并入rAAV病毒体中，以便有助于将多核苷酸或载体引入细胞中。AAV的衣壳蛋白构成病毒粒子的外部非核酸部分并且由AAVcap基因编码。cap基因编码三种病毒外壳蛋白VP1、VP2和VP3，其是病毒粒子组装所必需的。rAAV病毒粒子的构建已描述于例如US 5,173,414；US 5,139,941；US 5,863,541；US5,869,305；US 6,057,152；和US 6,376,237；以及Rabinowitz等人,J.Virol.76:791(2002)和Bowles等人,J.Virol.77:423(2003)中，其各自的公开内容以引用的方式并入本文，因为它们涉及用于基因递送的AAV载体。
[0253] 可与本文所述的组合物和方法结合使用的rAAV病毒粒子包括源自多种AAV血清型的那些，包括AAV 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、rh10、rh39、rh43和rh74。不同血清型的AAV载体和AAV蛋白的构建和用途描述于例如Chao等人,Mol.Ther.2:619(2000)；Davidson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:3428(2000)；Xiao等人,J.Virol.72:2224(1998)；Halbert等人,J.Virol.74:1524(2000)；Halbert等人,J.Virol.75:6615(2001)；以及Auricchio等人,Hum.Molec.Genet.10:3075(2001)中，其各自的公开内容以引用的方式并入本文，因为它们涉及用于基因递送的AAV载体。
[0254] 与本文所述的组合物和方法结合使用的还有假型化rAAV载体。假型化载体包括用源自不同于给定血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8等)的血清型的衣壳基因假型化的给定血清型(例如，AAV9)的AAV载体。涉及假型化rAAV病毒粒子的构建和使用的技术是本领域已知的，并且描述于例如在Duan等人,J.Virol.75:7662(2001)；Halbert等人,J.Virol.74:1524(2000)；Zolotukhin等人,Methods,28:158(2002)；以及Auricchio等人,Hum.Molec.Genet.10:3075(2001)中。
[0255] 在病毒粒子衣壳内具有突变的AAV病毒粒子可比非突变的衣壳病毒粒子更有效地用于感染特定的细胞类型。例如，合适的AAV突变体可具有配体插入突变，以有助于AAV靶向特定细胞类型。包括插入突变体、丙氨酸筛选突变体和表位标签突变体的AAV衣壳突变体的构建和表征在Wu等人,J.Virol.74:8635(2000)中进行了描述。可在本文所述的方法中使用的其他rAAV病毒粒子包括通过病毒的分子育种以及通过外显子改组而产生的那些衣壳杂合体。参见例如，Soong等人,Nat.Genet.,25:436(2000)以及Kolman和Stemmer,Nat.Biotechnol.19:423(2001)。
[0256] 基因组编辑
[0257] 除上述之外，已经开发了可用于将目标基因并入靶细胞如哺乳动物细胞中的多种工具。可用于将编码靶基因的多核苷酸并入靶细胞中的一种这样的方法涉及转座子的使用。转座子是编码转座酶并且含有侧接5'和3'切除位点的目标多核苷酸序列或基因的多核苷酸。一旦转座子已被递送到细胞中，转座酶基因的表达就开始并且产生从转座子裂解目标基因的活性酶。这种活性由转座酶对转座子切除位点的位点特异性识别介导。在一些情况下，这些切除位点可以是末端重复序列或反向末端重复序列。一旦从转座子切除，目标基因就可通过转座酶催化裂解存在于细胞的核基因组内的类似切除位点而整合到哺乳动物细胞的基因组中。这允许目标基因在互补切除位点处插入到裂解的核DNA中，并且随后共价连接使目标基因连接至哺乳动物细胞基因组的DNA的磷酸二酯键完成并入过程。在某些情况下，转座子可以是逆转录转座子，以使得编码靶基因的基因首先转录成RNA产物且然后逆转录成DNA，之后并入哺乳动物细胞基因组中。示例性转座子系统是piggybac转座子(例如在WO 2010/085699中详细描述)和睡美人转座子(例如在US 2005/0112764中详细描述)，其各自的公开内容以引用的方式并入本文，因为它们涉及用于基因递送至目标细胞的转座子。
[0258] 用于将靶基因整合到靶细胞的基因组中的另一种工具是成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统，其是一种最初演变为细菌和古细菌中针对病毒感染的适应性防御机制的系统。CRISPR/Cas系统包括质粒DNA内的回文重复序列和相关的Cas9核酸酶。这种DNA和蛋白质的集合通过首先将外来DNA并入CRISPR基因座中来指导靶序列的位点特异性DNA裂解。含有这些外来序列和CRISPR基因座的重复序列-间隔区元件的多核苷酸进而在宿主细胞中转录以产生引导RNA，所述引导RNA随后可与靶序列退火并将Cas9核酸酶定位于此位点。以这种方式，高度位点特异性cas9介导的DNA裂解可在外来多核苷酸中产生，因为使cas9在靶DNA分子附近内的相互作用受RNA:DNA杂交控制。结果，可设计CRISPR/Cas系统来裂解任何目标靶DNA分子。已经利用这种技术以编辑真核基因组(Hwang等人,Nature Biotechnology 31:227(2013))并且可用作位点特异性编辑靶细胞基因组的有效手段，以便在并入编码靶基因的基因之前裂解DNA。使用CRISPR/Cas来调节基因表达已例如在美国专利号8,697,359中进行了描述，其公开内容以引用的方式并入本文，因为它涉及使用CRISPR/Cas系统进行基因组编辑。在将目标基因并入靶细胞之前，用于位点特异性裂解基因组DNA的替代方法包括使用锌指核酸酶(ZFN)和转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)。与CRISPR/Cas系统不同，这些酶不含用于定位至特异性靶序列的引导多核苷酸。相反，靶特异性由这些酶内的DNA结合结构域控制。ZFN和TALEN在基因组编辑应用中的用途描述于例如Urnov等人,Nature Reviews Genetics 11:636(2010)；以及Joung等人,Nature Reviews Molecular Cell Biology 14:49(2013)中，其各自的公开内容以引用的方式并入本文，因为它们涉及用于基因组编辑的组合物和方法。
[0259] 可用于将编码靶基因的多核苷酸并入靶细胞的基因组中的另外基因组编辑技术包括使用可合理设计以便位点特异性地裂解基因组DNA的ARCUSTM大范围核酸酶。鉴于已经为此类酶建立了确定的结构-活性关系，使用这些酶将编码靶基因的基因并入哺乳动物细胞的基因组中是有利的。可在某些氨基酸位置修饰单链大范围核酸酶，以产生在所需位置选择性地裂解DNA的核酸酶，从而使靶基因能够位点特异性并入靶细胞的核DNA中。这些单链核酸酶已经在例如美国专利号8,021,867和US 8,445,251中进行了广泛描述，其各自的公开内容以引用的方式并入本文，因为它们涉及用于基因组编辑的组合物和方法。
[0260] 遮掩转基因的表达
[0261] 本文所述的遮掩转基因(例如，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8和Serpin B9(Spi6)中的一种或任何组合)以足以产生遮掩作用的量(例如，当注射到受试者，例如哺乳动物受试者，如小鼠、大鼠或人中时足以预防排斥的量)表达。如果皮下注射遮掩的细胞产生不被受试者的免疫系统清除的畸胎瘤，则可认为转基因表达产生遮掩作用。遮掩转基因也以足以促进由所述转基因编码的蛋白质的产生的水平表达。可使用本领域技术人员已知的常规方法(例如，免疫组织化学、蛋白质印迹分析或允许可视化蛋白质的其他方法)来检测蛋白质产生。优选地，遮掩转基因的表达使得由遮掩转基因编码的所有8种蛋白质(PD-L1、H2-M3、Cd47、Cd200、FasL、Ccl21b、Mfge8和Spi6)可在遮掩的细胞中检测(例如，通过免疫组织化学使用针对由遮掩转基因编码的蛋白质的抗体进行检测)。
[0262] 在一些实施方案中，遮掩转基因在遮掩的细胞中以与活化的白细胞如T细胞中的内源性基因表达的水平类似的水平表达(例如，来自相同物种的活化的白细胞，如从淋巴器官分离的活化的白细胞，例如，在遮掩的小鼠细胞中的表达类似于在从鼠淋巴器官分离的活化的白细胞中的表达)。一种或多种遮掩转基因(例如，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或8种))的表达大于或等于来自相同物种的活化的白细胞(例如T细胞)中内源性基因的表达(例如，遮掩转基因的表达水平等于活化的白细胞中内源性基因的表达水平，或者比活化的白细胞中内源性基因的表达水平高1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍)。在一些实施方案中，所有8种遮掩转基因以大于或等于来自相同物种的活化的白细胞中内源性基因的表达水平的水平表达。可从淋巴器官分离活化的白细胞，或者可使用抗CD3/CD28珠或本领域技术人员所采用的其他方法在体外活化白细胞，如T细胞(参见，例如
Frauwith和Thompson,J.Clin Invest 109:295-299(2002)；以及Trickett和Kwan,J
Immunol Methods 275:251-255(2003))。还可将遮掩的细胞中的转基因表达与活化的T细胞的谱分析研究中报告的基因表达水平进行比较(参见例如，Palacios等人,PLOSone 2:
e1222(2007))。在一些实施方案中，将遮掩转基因表达与细胞的野生型型式(例如，干细胞，例如与遮掩的细胞来自相同物种的胚胎干细胞)中的内源性基因的表达进行比较。与在与遮掩的细胞相同细胞类型的未修饰的野生型细胞(例如，干细胞，如来自相同物种的胚胎干细胞)中的内源性基因的表达相比，一种或多种遮掩转基因(例如，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的1种、2种、3种、
4种、5种、6种、7种或8种)的表达在遮掩的细胞中高至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、
50、100、500、1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，全部8种遮掩转基因都以大于细胞的野生型型式(例如，干细胞，例如与遮掩的细胞来自相同物种的胚胎干细胞)中内源性基因的表达水平(例如，高2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100倍或更高)的水平表达。可通过与分离的ES细胞直接比较或与Project Grandiose数据集(www.stemformatics.org/
project_grandiose)中的干细胞表达(例如，ES细胞表达)进行比较来评价基因表达。可使用本领域中已知的技术(例如，定量聚合酶链反应(qPCR))来测量基因表达。
Frauwith和Thompson,J.Clin Invest 109:295-299(2002)；以及Trickett和Kwan,J
Immunol Methods 275:251-255(2003))。还可将遮掩的细胞中的转基因表达与活化的T细胞的谱分析研究中报告的基因表达水平进行比较(参见例如，Palacios等人,PLOSone 2:
e1222(2007))。在一些实施方案中，将遮掩转基因表达与细胞的野生型型式(例如，干细胞，例如与遮掩的细胞来自相同物种的胚胎干细胞)中的内源性基因的表达进行比较。与在与遮掩的细胞相同细胞类型的未修饰的野生型细胞(例如，干细胞，如来自相同物种的胚胎干细胞)中的内源性基因的表达相比，一种或多种遮掩转基因(例如，PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的1种、2种、3种、
4种、5种、6种、7种或8种)的表达在遮掩的细胞中高至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、
50、100、500、1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，全部8种遮掩转基因都以大于细胞的野生型型式(例如，干细胞，例如与遮掩的细胞来自相同物种的胚胎干细胞)中内源性基因的表达水平(例如，高2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100倍或更高)的水平表达。可通过与分离的ES细胞直接比较或与Project Grandiose数据集(www.stemformatics.org/
project_grandiose)中的干细胞表达(例如，ES细胞表达)进行比较来评价基因表达。可使用本领域中已知的技术(例如，定量聚合酶链反应(qPCR))来测量基因表达。
[0263] 在移植部位提供局部免疫遏制的方法
[0264] 还特征是在移植部位提供局部免疫遏制的方法。
[0265] 所述方法包括提供细胞；并且在所述细胞中表达一组转基因，每种转基因编码为细胞质、膜结合或局部作用并且其功能是减轻攻击移植物的白细胞和NK细胞活化的功能或充当针对攻击白细胞的防御机制的基因产物。
[0266] 所述组转基因包括以下基因中的一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及SerpinB9(Spi6)。在一个实施方案中，所述组转基因包括Pd-L1、H2-M3、Cd47、Cd200、FasL、Ccl21b、Mfge8以及Spi6。
[0267] 任选地，所述方法还包括在细胞中表达以下转基因中的一种或多种：TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1以及IFNγR1 d39。在一个实施方案中，TGF-β或生物制剂是局部作用的。
[0268] 用于将各种遗传修饰如转基因引入动物细胞中的技术在本文描述并且通常是本领域中已知的。
[0269] 在所述方法的一个实施方案中，所述细胞是干细胞、适用于基因组编辑的细胞和/或治疗性细胞类型的来源(例如，可分化成用于细胞治疗的谱系限制性细胞或所需靶组织的细胞)。在一个实施方案中，细胞是胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、成体干细胞、组织特异性干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞或祖细胞、种系干细胞、肺干细胞或祖细胞、乳腺干细胞、嗅成体干细胞、毛囊干细胞、多潜能干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞或神经干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，细胞源自靶组织，例如皮肤、心脏、脑或脊髓、肝、肺、肾、胰腺、膀胱、骨髓、脾、肠或胃。在一些实施方案中，细胞是成纤维细胞、上皮细胞或内皮细胞。细胞可以是脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，如人或小鼠细胞。在一些实施方案中，进行修饰以表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及SerpinB9(Spi6)中的一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)的细胞是待移植的组织或器官中的细胞。在一些实施方案中，使用本领域技术人员已知的方法在体外使遮掩的细胞(例如，遮掩的干细胞)分化成用于移植的组织或器官。
[0270] 在一些实施方案中，将一百万至一千亿个遮掩的细胞(例如，1x106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x106、1x 107、2x 107、3x 107、4x 107、5x 107、
7 7 7 7 8 8 8 8 8 8 8
6x 10 、7x 10 、8x10 、9x 10、1x 10 、2x 10 、3x 10 、4x 10 、5x 10 、6x 10 、7x10 、8x
108、9x 108、1x 109、2x 109、3x 109、4x 109、5x 109、6x109、7x 109、8x 109、9x 109、1x 1010、
2x 1010、3x 1010、4x 1010、5x 1010、6x 1010、7x 1010、8x 1010、9x 1010或1x 1011个遮掩的细胞)施用至受试者中的移植部位或其附近，或施用到待移植的器官或组织中。
7 7 7 7 8 8 8 8 8 8 8
6x 10 、7x 10 、8x10 、9x 10、1x 10 、2x 10 、3x 10 、4x 10 、5x 10 、6x 10 、7x10 、8x
108、9x 108、1x 109、2x 109、3x 109、4x 109、5x 109、6x109、7x 109、8x 109、9x 109、1x 1010、
2x 1010、3x 1010、4x 1010、5x 1010、6x 1010、7x 1010、8x 1010、9x 1010或1x 1011个遮掩的细胞)施用至受试者中的移植部位或其附近，或施用到待移植的器官或组织中。
[0271] 用于将遗传修饰的细胞移植到同种异体宿主的移植部位中的技术在本文描述并且通常是本领域中已知的。
[0272] 由遮掩的细胞表达治疗剂
[0273] 可进一步修饰本文所述的遮掩的细胞以表达治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂是蛋白质。治疗性蛋白质可以是受试者中缺乏的蛋白质的野生型形式，如通过受试者的细胞突变或以不足的量产生(例如，以低水平产生或未产生)的蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是抑制性抗体(例如，阻断或中和蛋白质功能的抗体)。可修饰遮掩的细胞以产生抑制性抗体来治疗患有与蛋白质的过度产生或异常产生(例如，由通常不产生蛋白质的细胞产生、在正常情况下不产生蛋白质的时间或位置产生所述蛋白质或产生过量的蛋白质)有关的疾病或疾患或处于发展所述疾病或疾患的风险的受试者。在一些实施方案中，治疗性抗体是激动剂抗体(例如，活化抗体)。激动剂抗体可通过结合至并活化内源性受体而起作用(例如，诱导或增加受体活化下游的信号传导或将内源性受体的构象改变为开放或活性状态)。可修饰遮掩的细胞以产生激动剂抗体来治疗患有与受体或信号传导途径的活化有关的疾病或疾患或处于发展所述疾病或疾患的风险的受试者。可修饰遮掩的细胞以使用本文所述的方法或使用本领域技术人员已知的其他方法来产生治疗性蛋白质或抗体。产生分泌的蛋白质或抗体的遮掩的细胞可作为循环细胞递送、注射到需要治疗性蛋白质或抗体的组织、器官或身体部位中，或皮下注射以产生遮掩的皮下组织。可将产生跨膜或膜结合蛋白的遮掩的细胞注射在对治疗性蛋白质有响应的内源性细胞的部位处或附近。
[0274] 在一些实施方案中，本文所述的遮掩的细胞提供在受试者中突变的基因的野生型拷贝(例如，遮掩的细胞是不具有所述疾病的遗传原因并且表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及SerpinB9(Spi6)中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种的“野生型细胞”)。此类细胞可用于治疗患有由内源性基因中的突变引起的疾病或疾患的受试者(例如，患有与下文所述的一种或多种突变相关的代谢病症的受试者)。
[0275] 可与遮掩的细胞一起施用或由遮掩的细胞产生的示例性治疗剂以及可使用这些治疗剂治疗的相关疾病或疾患的列表提供于以下表2中。
[0276] 表2：可与遮掩的细胞一起施用或由遮掩的细胞表达以治疗疾病的示例性治疗剂[0277]
[0278]
[0279]
[0280]
[0281]
[0282] 用于表达治疗剂的诱导型系统
[0283] 如果需要连续施用由遮掩的细胞表达的治疗剂来治疗疾病或疾患，则可使用本文所述或本领域技术人员已知的组成型启动子(例如，CAG、CMV或其他组成型启动子)来表达治疗剂。如果间歇地需要治疗剂(例如，在疾病或疾患期间发生的复发或发作期间需要治疗剂，但在受试者无症状时不需要)，则可通过诱导型启动子来表达治疗剂，所述启动子提供仅在需要时表达治疗剂的能力。可使用诱导型启动子递送的一类示例性治疗剂是TNFα抑制剂。TNFα抑制剂目前用于治疗类风湿性关节炎，但是仅在关节炎症发作期间间歇性地施用，因为TNFα的组成型施用可导致全身性免疫遏制。如果将遮掩的细胞修饰为在诱导型启动子的控制下表达TNFα抑制剂，则遮掩的细胞可用于间歇性地递送TNFα，因此无需重复注射。如果连续施用则具有潜在不良作用的其他治疗剂也可使用如本文所述的诱导型启动子间歇性地表达。示例性诱导型表达系统在下文进行了描述。
[0284] 四环素响应元件
[0285] 一种广泛使用的诱导型表达系统是基于四环素控制的转录活化。在这种系统中，抗生素四环素或其衍生物之一(例如强力霉素)用于可逆地活化或抑制基因表达。为了使用这种系统，将四环素响应元件(TRE)置于目标基因(例如，待由遮掩的细胞表达的治疗性转基因)的上游，通常与具有极低基础表达的最小启动子一起。称为rtTA的蛋白质(其也需要由遮掩的细胞表达)与TRE结合并在四环素或强力霉素的存在下活化转录。当除去四环素或强力霉素时，rtTA不再与TRE结合，并且目标基因不再表达。这种系统的高级型式，即Tet-On Advanced反式活化因子(rtTA2s-M2)和Tet-On 3G对于人疗法而言可能特别有用，因为它们是人密码子优化的并且对低浓度的强力霉素有响应。
[0286] 光诱导型系统
[0287] 用于基因表达的诱导型活化的另一种方法涉及光遗传学的使用，其使用光敏蛋白来操纵基因表达。可用于在遮掩的细胞中诱导性地表达治疗剂的光遗传学的最新发展涉及一类蛋白质，所述蛋白质经历构象变化并响应蓝光而二聚化。这些蛋白质已经融合至DNA结合和转录组分，所述组分已显示与特定启动子序列结合并在通过暴露于蓝光集合在一起时活化转录(Wang等人,NatMethods,9:266-269,2012)。这种诱导性地活化基因表达的方法可用于控制皮下施用的遮掩的细胞中治疗剂的产生，因为可将蓝光照射到遮掩的皮下组织附近的皮肤上，以诱导遮掩的细胞产生治疗剂。
[0288] 放射遗传学
[0289] 诱导性地活化基因表达(例如，由遮掩的细胞表达治疗剂)的第三种方法涉及使用无线电波。在无线电波诱导型表达系统的一种型式中，TRPV1受体与GFP结合结构域融合，并与连接至GFP的一种形式的铁蛋白共表达(Stanley等人,Nat Med 21:92-98,2015)。GFP-铁蛋白与TRPV1受体的GFP结合结构域结合。当将特定频率的无线电波施加至细胞时，铁蛋白与TRPV1相互作用并允许钙的流入，其活化转录因子NFAT。如果治疗剂与NFAT敏感性启动子元件(如SRE-CRE-NFATRE)可操作地连接并与TRPV1-GFP和GFP-铁蛋白共表达，则可使用这种系统来诱导性地表达治疗剂。无线电波诱导的表达提供能够在远离身体外部的细胞中诱导表达的优点，因为无线电波可穿过组织。例如，放射遗传学可用于调控视网膜中的基因表达。因此，这种方法可用于通过无创且无害的无线电波在遮掩的细胞中诱导性地表达治疗性转基因。
[0290] 去稳定结构域系统
[0291] 基因表达也可使用去稳定结构域系统来调控。编码目标蛋白质(例如本文所述的治疗剂)的转基因也可包含去稳定结构域，以使得所得蛋白质产物包含融合至去稳定结构域的目标蛋白质。示例性去稳定结构域包括人FK506-和雷帕霉素结合蛋白(FKBP12)的突变体，其赋予与其融合的蛋白质不稳定。FKBP12突变体包括N-末端突变体F15S、V24A、H25R、E60G和L106P，以及C-末端突变体M66T、R71G、D100G、D100N、E102G和K105I，如Banaszynski等人,Cell126:995(2006)中所表征，其公开内容以引用的方式并入本文，因为它涉及FKBP12去稳定结构域。去稳定结构域促进蛋白质降解。当需要表达目标蛋白质(例如治疗剂)时，可使用小分子合成配体来使含去稳定结构域的蛋白质稳定。小分子配体Shield-1(Shld1)可用于通过保护含FKBP12突变体的蛋白质免于降解来使它们稳定。可用于调控目标表达蛋白质的其他去稳定结构域包括大肠杆菌二氢叶酸还原酶(ecDHFR)的突变体和人雌激素受体配体结合结构域(ERLBD)的突变体，所述突变体当与目标蛋白质融合时赋予不稳定性、从而导致降解，并且可分别通过小分子配体甲氧苄啶(TMP)或通过CMP8或4-羟基他莫昔芬(4OHT)来稳定，如Iwamoto等人,Chem Biol.17:981(2010)和Miyazaki等人,J Am Chem Soc.,134:3942(2012)中所描述，其各自的公开内容以引用的方式并入本文，因为它们涉及去稳定结构域系统。
[0292] 香豆酸盐开关诱导型系统
[0293] 用于基因表达的诱导型活化的另一种方法涉及使用香豆酸盐基因开关系统。在这种系统的阻遏物构型中，通过阻遏物(CymR)与置于强组成型启动子下游的操纵子位点(CuO)的结合而介导调控。添加香豆酸盐(一种小分子)可减轻阻遏，从而允许转基因的表达。或者，可将反向-香豆酸盐-反式活化因子(rcTA)插入最小CMV启动子的上游，所述启动子可操作地连接至编码治疗剂的转基因。可刚好在治疗性转基因的翻译起始(ATG)之前插入香豆酸盐操纵子的6倍重复(6xCuO)。在没有香豆酸盐的情况下，rcTA不能结合至6xCuO，因此编码治疗剂的转基因将不被转录，因为6xCuO没有活性。当添加香豆酸盐时，它将与rcTA形成复合物，从而允许结合至6xCuO并转录编码治疗剂的转基因(Mullick等人，2006)。
[0294] 蜕皮激素诱导型系统
[0295] 诱导型基因表达系统的另一个实例是蜕皮激素诱导型系统，其中将融合至Vp16(VpEcR)的活化结构域的类视黄醇X受体(RXR)和蜕皮激素受体(EcR)的N-末端截短插入由遮掩的细胞表达的基因的5’非翻译区中，以使得它们由内源性启动子共表达。可将具有下游最小启动子的蜕皮激素响应元件(EcRE)插入编码治疗剂的转基因起始密码子的正好上游。共表达的RXR和VpEcR可与彼此异二聚化。在不存在蜕皮激素或合成药物类似物米乐甾酮(muristerone)A的情况下，二聚化的RXR/VpEcR不能结合至EcRE，因此不会转录编码治疗剂的转基因。在蜕皮激素或米乐甾酮A存在下，二聚化的RXR/VpEcR可结合至EcRE，以使得转录编码治疗剂的转基因(No等人，1996)。由于蜕皮激素施用对哺乳动物没有明显作用，因此其用于调控基因的用途对于任何基因的瞬时诱导型表达都应该是优异的。
[0296] 配体可逆的二聚化系统
[0297] 在另一个实例中，可修饰编码治疗剂的转基因，以使得其在功能上分为部分/结构域，如5’部分和3’部分，并且FKBP肽序列可插入每个结构域中。可将IRES(内部核糖体进入位点)序列置于两个结构域之间，其允许两个不同结构域的同时转录以产生两种单独的蛋白质。在不存在二聚化剂的情况下，治疗剂的两个单独结构域将是功能失活的。在引入诸如雷帕霉素或AP20187的二聚化剂后，FKBP肽将二聚化，从而使治疗剂的5'和3'结构域结合在一起并重建活性蛋白质(Rollins等人，2000)。
[0298] 治疗剂的基于细胞的递送
[0299] 年龄相关性黄斑变性或视网膜营养不良的治疗
[0300] 在一个实例中，可修饰遮掩的细胞以产生VEGF抑制剂，如VEGF捕获剂(例如，以引用的方式并入本文的Holash等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A.99:11383-11398,2002中描述的可溶性诱饵受体，如阿柏西普)来治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)或视网膜营养不良。VEGF捕获剂是结合至并抑制VEGF(一种可促进异常血管形成的血管生成蛋白)的生物制剂。
VEGF捕获剂用于治疗湿性AMD，所述湿性AMD的特征在于可导致视网膜脱离和进行性视力丧失的视网膜下血管的异常生长。为了治疗AMD，通常通过定期注射到眼睛中来递送VEGF捕获剂。可修饰遮掩的细胞以通过表达编码VEGF捕获剂或与组成型或诱导型启动子可操作连接的另一种VEGF抑制剂的转基因的表达来产生VEGF捕获剂或另一种VEGF抑制剂。可在向眼睛施用之前使用本领域技术人员已知的方法使表达VEGF抑制剂(例如，VEGF捕获剂)的遮掩的细胞(例如，干细胞)分化成视网膜色素上皮(RPE)细胞，或者可修饰分离的RPE细胞以表达遮掩转基因和VEGF抑制剂。可将表达VEGF抑制剂(例如VEGF捕获剂)的2.5万至10万个遮掩的RPE细胞(例如25,000、50,000、75,000或100,000个遮掩的RPE细胞)注射到每只眼睛的视网膜下间隙，以治疗湿性AMD或视网膜营养不良。适用于本文所述的组合物和方法中的其他VEGF抑制剂包括VEGF受体的可溶性形式(例如可溶性VEGFR-1或NRP-1)、血小板因子-4、催乳素、SPARC和VEGF抑制性抗体(例如，贝伐单抗和兰尼单抗)。
VEGF捕获剂用于治疗湿性AMD，所述湿性AMD的特征在于可导致视网膜脱离和进行性视力丧失的视网膜下血管的异常生长。为了治疗AMD，通常通过定期注射到眼睛中来递送VEGF捕获剂。可修饰遮掩的细胞以通过表达编码VEGF捕获剂或与组成型或诱导型启动子可操作连接的另一种VEGF抑制剂的转基因的表达来产生VEGF捕获剂或另一种VEGF抑制剂。可在向眼睛施用之前使用本领域技术人员已知的方法使表达VEGF抑制剂(例如，VEGF捕获剂)的遮掩的细胞(例如，干细胞)分化成视网膜色素上皮(RPE)细胞，或者可修饰分离的RPE细胞以表达遮掩转基因和VEGF抑制剂。可将表达VEGF抑制剂(例如VEGF捕获剂)的2.5万至10万个遮掩的RPE细胞(例如25,000、50,000、75,000或100,000个遮掩的RPE细胞)注射到每只眼睛的视网膜下间隙，以治疗湿性AMD或视网膜营养不良。适用于本文所述的组合物和方法中的其他VEGF抑制剂包括VEGF受体的可溶性形式(例如可溶性VEGFR-1或NRP-1)、血小板因子-4、催乳素、SPARC和VEGF抑制性抗体(例如，贝伐单抗和兰尼单抗)。
[0301] 帕金森氏病的治疗
[0302] 在另一个实例中，可向患有帕金森氏病(其特征在于多巴胺能神经元的丧失)的受试者施用遮掩的细胞，如多巴胺能神经元或可使用本领域技术人员已知的方法在体外分化以产生多巴胺能神经元的细胞(例如干细胞)。可向对患有帕金森氏病的受试者的大脑施用((例如，立体定向注射到黑质中)2.5万至10万个遮掩的多巴胺能神经元(例如25,000、50,000、75,000或100,000个遮掩的多巴胺能神经元)。
[0303] 心肌梗塞的治疗
[0304] 本文所述的遮掩的细胞也可用于治疗心肌梗塞(例如，心肌梗塞，通常称为心脏病发作)。当血流减少或停止至心脏的一部分时发生心肌梗塞，从而损害心肌。为了治疗患有心肌梗塞的受试者，可使用本领域技术人员已知的方法使遮掩的细胞(例如干细胞)分化成心肌细胞，或者可修饰分离的心肌细胞以表达遮掩的转基因。可通过注射到心肌中向受试者施用五亿至五十亿个遮掩的心肌细胞(例如5x 108、6x 108、7x 108、8x 108、9x 108、1x 109、2x 109、3x 109、4x 109或5x 109个遮掩的心肌细胞)以治疗患有心肌梗塞的受试者(例如，替代死亡或受损的心肌细胞)。
[0305] 骨关节炎和类风湿性关节炎的治疗
[0306] 在另一个实例中，本文所述的遮掩的细胞可用于治疗骨关节炎或类风湿性关节炎。骨关节炎和类风湿性关节炎(RA)的特征在于关节发炎，并且通常用抗炎治疗剂治疗。为了治疗患有骨关节炎或RA的受试者，可修饰遮掩的细胞以表达抗炎生物制剂，如已经在临床上用于RA治疗的TNFα抑制剂(例如，TNFα抑制性抗体)。可修饰遮掩的细胞以通过表达编码与组成型或诱导型启动子可操作连接的抗炎生物制剂的转基因来产生抗炎生物制剂，如TNFα抑制剂。可在向关节施用之前使用本领域技术人员已知的方法使表达抗炎生物制剂(例如，TNFα抑制剂)的遮掩的细胞(例如干细胞)分化成关节成纤维细胞，或者可修饰分离的关节成纤维细胞以表达遮掩转基因和抗炎生物制剂。可将一百万至一亿个表达抗炎生物制剂的遮掩的关节成纤维细胞(例如，1x 106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7
10、8x10、9x 10 、1x 10 、2x 10、3x 10、4x 10、5x 10 、6x 10 、7x10、8x 10、9x 10 或
1x 108个遮掩的关节成纤维细胞)注射到关节炎性或发炎的关节(取决于关节的大小)中以治疗骨关节炎或RA。可由遮掩的细胞表达以治疗骨关节炎或RA的抗炎生物制剂包括TNFα抑制剂(阿达木单抗、依那西普、英夫利昔单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗)、白介素-6(IL6)受体抑制剂(例如托珠单抗)、IL1受体抑制剂(例如阿那白滞素)或用于治疗RA的其他剂(例如，阿巴西普、利妥昔单抗)。
10、8x10、9x 10 、1x 10 、2x 10、3x 10、4x 10、5x 10 、6x 10 、7x10、8x 10、9x 10 或
1x 108个遮掩的关节成纤维细胞)注射到关节炎性或发炎的关节(取决于关节的大小)中以治疗骨关节炎或RA。可由遮掩的细胞表达以治疗骨关节炎或RA的抗炎生物制剂包括TNFα抑制剂(阿达木单抗、依那西普、英夫利昔单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗)、白介素-6(IL6)受体抑制剂(例如托珠单抗)、IL1受体抑制剂(例如阿那白滞素)或用于治疗RA的其他剂(例如，阿巴西普、利妥昔单抗)。
[0307] 糖尿病的治疗
[0308] 遮掩的细胞可用于治疗糖尿病(例如1型或2型糖尿病)。1型糖尿病由于胰腺无法产生足够的胰岛素而导致。2型糖尿病始于胰岛素抵抗，但随着疾病进展可能发展胰岛素缺乏。为了治疗患有糖尿病的受试者，可修饰遮掩的细胞以表达胰岛素，或者可修饰来自健康受试者的表达胰岛素的细胞(例如，来自没有糖尿病的受试者的胰腺β细胞)以表达遮掩转基因PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及SerpinB9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)并施用至患有糖尿病的受试者。可修饰遮掩的细胞以通过表达编码与组成型或诱导型启动子可操作连接的胰岛素的转基因来产生胰岛素。可在施用之前使用本领域技术人员已知的方法使表达胰岛素的遮掩的细胞(例如干细胞)分化成产生胰岛素的细胞(例如胰腺β细胞)或者可在不分化的情况下施用，或者可修饰分离的胰腺β细胞以表达遮掩转基因并任选地表达编码胰岛素的转基因。可将表达胰岛素(例如，内源性地表达胰岛素或由于编码胰岛素的转基因的表达而表达胰岛素)的八亿至三十亿个遮掩的胰岛β细胞(例如，8x 108、9x 108、1x 109、2x 109或3x 109个遮掩的胰岛β细胞)皮下注射到受试者体内以产生遮掩的皮下组织，所述遮掩的皮下组织产生用于治疗糖尿病的胰岛素。
[0309] 血友病的治疗
[0310] 在另一个实例中，本文所述的遮掩的细胞可用于治疗血友病。血友病患者不产生功能性因子VIII蛋白，其是凝血所需的关键血液组分。这些患者可具有严重出血，并且护理标准包括每周多次注射纯化的因子VIII蛋白。为了治疗患有血友病的受试者，可修饰遮掩的细胞以表达编码因子VIII的另外转基因。因子VIII将通过与组成型启动子(例如CMV或CAG)可操作地连接而在遮掩的细胞中组成性地表达。可在施用之前使用本领域技术人员已知的方法使表达因子VIII的遮掩的细胞(例如干细胞)分化成产生凝血因子的细胞(例如肝窦细胞或内皮细胞)或可在不分化的情况下施用，或者可修饰来自健康受试者(例如，没有血友病的受试者)的分离的表达因子VIII的肝窦细胞或内皮细胞以表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及SerpinB9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)并施用至患有血友病的受试者。如果需要确保因子VIII以高水平表达，则可进一步修饰被修饰为表达一种或多种遮掩转基因的来自健康受试者的分离的表达因子VIII的肝窦细胞或内皮细胞以表达编码因子VIII的转基因。可将表达因子VIII(例如内源性地表达因子VIII或由于编码因子VIII的转8 8 9
基因的表达而表达因子VIII)的八亿至三十亿个遮掩的细胞(例如，8x 10、9x 10、1x 10 、
2x 109或3x 109个遮掩的细胞)皮下注射到受试者体内以产生遮掩的皮下组织，所述遮掩的皮下组织产生用于治疗血友病的因子VIII。
基因的表达而表达因子VIII)的八亿至三十亿个遮掩的细胞(例如，8x 10、9x 10、1x 10 、
2x 109或3x 109个遮掩的细胞)皮下注射到受试者体内以产生遮掩的皮下组织，所述遮掩的皮下组织产生用于治疗血友病的因子VIII。
[0311] 代谢病症的治疗
[0312] 本发明的遮掩的细胞也可用于治疗遗传性代谢病症。在大多数遗传性代谢病症中，人体不产生单一酶，或者其以有缺陷的形式产生。遗传性代谢病症包括溶酶体贮积症，如赫尔勒综合征(α-L艾杜糖醛酸酶缺乏)、尼曼-匹克病(SMPD1、NPC1或NPC2中的突变)、泰-萨二氏病(HEXA中的突变)、戈谢病(GBA基因中的突变)、法布里病(由于GLA中的突变所致的α半乳糖苷酶缺乏)和克拉伯病(由于GALC中的突变所致的半乳糖神经酰胺酶缺乏)；半乳糖血症(半乳糖激酶或半乳糖-1-磷酸尿嘧啶转移酶缺乏)；枫糖尿症(酶BCKD缺乏)；苯丙酮尿症(酶PAH缺乏)；糖原贮积病(GSD)如GSD0(糖原合酶(GYS2)缺乏)、GSD1/冯·吉尔克氏病(von Gierke’s disease)(葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)缺乏)、GSD 2/庞贝氏病(酸性α-葡糖苷酶(GAA)缺乏)、GSD 3/科里病(Cori’s disease)或福布斯病(Forbes’disease)(糖原脱支酶AGL缺乏)、GSD 4/安德森病(糖原分支酶(GBE1)缺乏)、GSD 5/麦卡德尔病(McArdle disease)(肌肉糖原磷酸化酶(PYGM)缺乏)、GSD 6/赫尔斯病(Hers’disease)(肝糖原磷酸化酶(PYGL)或肌肉磷酸甘油酸变位酶(PGAM2)缺乏)、GSD 7/塔里病(Tarui’s disease)(肌肉磷酸果糖激酶(PKFM)缺乏)、GSD 9(磷酸化酶激酶(PHKA2、PHKB、PHKG2或PHKA1)缺乏)、GSD 10(烯醇酶3(ENO3)缺乏)、GSD 11(肌肉乳酸脱氢酶(LDHA)缺乏)、范科尼-比克尔综合征(葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)缺乏)、GSD 12(醛缩酶A(ALDOA)缺乏)、GSD 13(β-烯醇酶(ENO3)缺乏)或GSD 15(糖原蛋白-1(GYG1)缺乏)；线粒体病症，如线粒体肌病(卡恩斯塞尔综合征(KSS，由线粒体DNA缺失引起)和慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO，由线粒体DNA缺失或复制或ANT1、POLG、POLG2或PEO1中的突变引起)、糖尿病和耳聋(DAD，由位置3243处的线粒体DNA(其编码tRNALeu(UUR)中的突变引起)、莱伯遗传性视神经病变(LHON，由MT-ND1、MT-ND4、MT-ND4L和MT-ND6中的突变引起)、莱氏综合征(与SURF1、MT-ATP6、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND5、MT-ND6、BCS1L、NDUFA10、SDHA、NDUFS4、NDUFAF2、NDUFA2、NDUFAF6、COX15、NDUFS3、NDUFS8、FOXRED1、NDUFA9、NDUFA12、NDUFS7中的突变相关)、神经病、共济失调、色素性视网膜炎和下垂症(NARP，由MT-ATP6中的突变引起)、肌肉神经源性胃肠脑病(MNGIE，由TYMP中的突变引起)、肌阵挛性癫痫伴蓬毛样红纤维(MERRF，由MT-TK、MT-TL1、MT-TH、MT-TS1、MT-TS2或MT-TF中的突变引起)或线粒体肌病、脑肌病、乳酸性酸中毒、中风样症状(MELAS，由MT-ND1、MT-ND5、MT-TH、MT-TL1或MT-TV中的突变引起)；弗里德里希共济失调(FXN中的突变)；过氧化物酶体紊乱，如泽尔韦格氏综合征(Zellweger syndrome)(PEX1、PEX2、PEX3、PEX5、PEX6、PEX10、PEX12、PEX13、PEX14、PEX16、PEX19或PEX26中的突变)和肾上腺脑白质营养不良(ABCD1中的突变)；金属代谢病症，如威尔逊病(威尔逊病蛋白ATP7B中的突变)和血色素沉着病(人血色素沉着蛋白HFE中的突变)；有机酸血症，如甲基丙二酸血症(MUT、MMAA、MMAB、MMADHC或MCEE中的突变)和丙酸血症(PCCA或PCCB中的突变)；尿素循环障碍，如鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、精氨酸酶(ARG1)缺乏症、精氨基琥珀酸裂解酶缺乏(ASL)缺乏症、精氨基琥珀酸合酶1(ASS1)缺乏症、希特林蛋白缺乏症、氨基甲酰磷酸合酶1(CPSI)缺乏症、N-乙酰谷氨酸合酶(NAGS)缺乏症和鸟氨酸转位酶(ORNT1)缺乏症。
[0313] 为了治疗患有代谢病症的受试者，可修饰遮掩的细胞以表达在受试者中突变的基因的野生型形式或编码在受试者中缺失或缺乏的酶的转基因(参见表2)，或者可修饰来自健康受试者(例如，未患代谢病症的受试者)的表达在受试者中突变的基因或在受试者中缺乏的酶的野生型形式的细胞以表达遮掩转基因PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及SerpinB9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)并施用至患有代谢病症的受试者。可通过与组成型启动子(如CMV或CAG)可操作地连接来在遮掩的细胞中组成性地表达或者可使用本文所述的诱导型表达系统中的一种诱导性地表达在受试者中突变的基因的野生型形式或编码在受试者中缺失或缺乏的酶的转基因。经修饰以表达在受试者中突变的基因的野生型形式或在受试者中缺失或缺乏的酶的遮掩的细胞(例如干细胞)可在施用之前施用本领域技术人员已知的方法分化成通常表达所述基因或酶的细胞或者可在不分化的情况下施用，或者可修饰来自健康受试者的表达所述基因的野生型形式或在受试者中突变或缺乏的酶的分离的细胞以表达遮掩转基因PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)并施用至患有代谢病症的受试者。如果受试者在治疗之前尚未被诊断为具有特定突变，则可使用标准方法对受试者进行评价以鉴定与代谢病症有关的突变的基因，以确保遮掩的细胞表达相应的野生型基因。可皮下注射表达在受试者中突变的基因的野生型形式的八亿至三十亿个遮掩的细胞(例如，8x 108、9x 108、1x 109、2x 109或
3x 109个遮掩的细胞)以产生遮掩的皮下组织，所述遮掩的皮下组织产生相应的野生型蛋白。
3x 109个遮掩的细胞)以产生遮掩的皮下组织，所述遮掩的皮下组织产生相应的野生型蛋白。
[0314] 控制遮掩的细胞的分裂的方法
[0315] 在一方面，提供了一种控制同种异体宿主中的移植部位处的细胞增殖的方法(例如，降低所述移植部位处的细胞的致瘤潜能或降低在移植部位处已经变得致瘤性的细胞的增殖)。
[0316] 所述方法包括：提供经遗传修饰以包含至少一种用于在移植到同种异体宿主中时在移植部位提供局部免疫遏制的机制的细胞或此类细胞群；在所述细胞中遗传修饰细胞分裂基因座/多个细胞分裂基因座(CDL)，所述CDL是其转录产物由分裂细胞(例如，所有分裂细胞含有免疫遏制性转基因中的一种或多种)表达的一个或多个基因座，所述CDL的遗传修饰包含以下中的一种或多种：a)消除连接(ALINK)系统，所述ALINK系统包含与编码所述CDL的DNA序列转录连接的编码阴性选择性标记物的DNA序列；以及b)CDL调控的诱导型外源性活化因子(EARC)系统，所述EARC系统包含与所述CDL可操作连接的基于诱导型活化因子的基因表达系统；通过在不存在所述阴性选择性标记物的诱导剂的情况下维持包含所述ALINK系统的遗传修饰的细胞来允许包含所述ALINK系统的遗传修饰的细胞的增殖，和/或通过将包含所述ALINK系统的遗传修饰的细胞暴露于所述阴性选择性标记物的诱导剂来消除和/或抑制包含所述ALINK系统的细胞的增殖；和/或通过将包含所述EARC系统的遗传修饰的细胞暴露于所述基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂来允许包含所述EARC系统的遗传修饰的细胞的增殖，或通过在不存在所述基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂的情况下维持包含所述EARC系统的遗传修饰的细胞来预防或抑制包含所述EARC系统的细胞的增殖；以及将所述细胞或细胞群体移植在同种异体宿主中的移植部位。在一个或多个CDL(例如2、3、4或更多个CDL)中使用一种或多种ALINK和/或EARC系统进行了修饰以控制细胞分裂的细胞可称为“失效安全细胞”。在单个失效安全细胞失去通过遗传突变控制细胞分裂的所有系统(例如ALINK或EARC)的活性之前可所述细胞生长的细胞的数量(例如，克隆容量)(例如，基于数学建模，细胞从控制中“逃逸”出来并表现出不可控制的细胞增殖所需要的细胞分裂的数量)决定失效安全容量。失效安全容量将取决于ALINK的数量和ALINK靶向的CDL的数量。表3中进一步描述了失效安全性质。
[0317] 表3.使用数学建模来计算失效安全细胞容量及其与人体的关系。所述模型未考虑其中CDL表达与阴性选择性标记物活性的丧失共同丧失、从而损害细胞增殖的事件。因此，值被低估并且假设阴性选择性标记物的106正向突变率进行计算。人体中估计的细胞数量13
为3.72x10 取自(Bianconi等人，2013)。
为3.72x10 取自(Bianconi等人，2013)。
[0318]
[0319] 在各种实施方案中，CDL是如Wang等人，2015(其以引用的方式整体并入本文)中所述被鉴定为“必需基因”的基因座。Wang等人，2015年中的必需基因是通过计算每种基因的得分(即CRISPR得分)来鉴定的，所述得分反映由所述基因的失活强加的适合度代价。在一个实施方案中，CDL具有小于约-1.0的CRISPR得分(CS)(表5，第5列)。
[0320] 在各种实施方案中，CDL是编码与细胞分裂和/或复制有关的基因产物的基因座/基因座(表5，第6列)。例如，在各种实施方案中，CDL是编码与以下中的一项或多项有关的基因产物的基因座/基因座：i)细胞周期；ii)DNA复制；iii)RNA转录和/或蛋白质翻译；以及iv)代谢(表5，第7列)。
[0321] 在一个实施方案中，CDL是涉及调控细胞周期的进程(例如，控制G1/S G2/M和中期至后期转变)的一种或多种细胞周期蛋白依赖性激酶，如CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK8、CDK9和/或CDK11(Morgan，2007)。在一个实施方案中，CDL是涉及通过活化一种或多种CDK来控制细胞周期进程的一种或多种细胞周期蛋白，例如像，细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白C、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白H、细胞周期蛋白C、细胞周期蛋白T、细胞周期蛋白L和/或细胞周期蛋白F(FUNG和POON，2005)。在一个实施方案中，CDL是参与后期促进复合物的一个或多个基因座，所述复合物控制细胞周期的M期中的中期至后期转变的进程(Peters，2002)。在一个实施方案中，CDL是涉及着丝粒组分的一个或多个基因座，所述着丝粒组分控制细胞周期的M期中的中期至后期转变的进程(Fukagawa，2007)。在一个实施方案中，CDL是涉及微管组分的一个或多个基因座，所述微管组分控制细胞周期所需的微管动力学(Cassimeris，1999)。
[0322] 在各种实施方案中，CDL是参与管家的基因座/基因座。如本文所用，术语“管家基因”或“管家基因座”是指维持基本细胞功能所需的一种或多种基因。管家基因在正常和病理-生理条件下在生物体的所有细胞中表达。
[0323] 在各种实施方案中，CDL是编码与细胞分裂和/或增殖有关的基因产物并且具有小于约-1.0的CRISPR得分的基因座/基因座。例如，在一个实施方案中，CDL是编码与以下中的一项或多项有关的基因产物的基因座/基因座：i)细胞周期；ii)DNA复制；iii)RNA转录和/或蛋白质翻译；以及iv)代谢，并且具有小于约-1.0的CRISPR得分。在一个实施方案中，CDL还可以是管家基因。
[0324] 在一些实施方案中，CDL是Cdk1/CDK1、Top2A/TOP2A、Cenpa/CEPNA、Birc5/BIRC5或Eef2/EEF2。在一些实施方案中，CDL是Cdk1/CDK1。在一些实施方案中，CDL是Top2A/TOP2A。在一些实施方案中，CDL是Eef2/EEF2。在一些实施方案中，CDL是Cdk1/CDK1和Top2A/TOP2A或Cdk1/CDK1和Eef2/EEF2。
[0325] 通过将CDL的表达与编码阴性选择性标记物的DNA序列的表达联系起来，可将细胞修饰为“失效安全”细胞，从而允许药物诱导的表达CDL和阴性选择性标记物两者的有丝分裂活性细胞的消除。例如，当细胞增殖相对于细胞的正常分裂速率不受控制和/或加速时(例如由癌细胞表现出的不受控制的细胞分裂)，或者当细胞的治疗需求已经过去时，可能希望消除增殖细胞。可经由对细胞的遗传修饰来实现增殖细胞的消除，在本文中称为“消除连接”(ALINK)，其将编码阴性选择性标记物的DNA序列的表达与CDL的表达联系起来，从而允许消除或充分抑制ALINK修饰的增殖细胞，因此表达CDL基因座(充分抑制是将细胞增殖速率抑制到太低以至于不能促成肿瘤形成的速率)。在阴性选择性系统的前药或其他诱导剂存在下，表达阴性选择性标记物的细胞将停止增殖或死亡，这取决于选择性标记物的作用机制。可修饰细胞以包含纯合的、杂合的、半合子的或复合杂合的ALINK。在一个实施方案中，为了提高消除的保真度，可将阴性选择性标记物引入CDL的所有功能性等位基因中。在一个优选的实施方案中，可将阴性选择性标记物引入CDL的所有功能性等位基因中。如果需要，失效安全系统可用于消除所有遮掩的细胞。
[0326] ALINK可插入CDL的任何位置，其允许CDL和阴性选择性标记物的共表达。
[0327] 在一些实施方案中，ALINK系统包括单纯疱疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韦系统、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统、羧基酯酶/伊立替康系统或iCasp9/AP1903系统。
[0328] 可将编码阴性选择性标记物(例如HSV-TK)的DNA插入宿主细胞中的CDL(例如CDK1)中，以使所述阴性选择性标记物的表达引起宿主细胞表达所述阴性选择性标记物，并且必然地，引起所述CDL在所述阴性选择性标记物(例如更昔洛韦(GCV))的诱导剂(例如前药)存在下被杀死。在此实例中，用ALINK修饰的宿主细胞将产生胸苷激酶(TK)，并且TK蛋白将GCV转化为GCV单磷酸，其然后通过细胞激酶转化为GCV三磷酸。GCV三磷酸在S期期间并入复制DNA中，其导致DNA延伸终止和细胞凋亡(Halloran和Fenton，1998)。
[0329] 本文公开了修饰的HSV-TK基因(Preuβ等人，2010)作为编码阴性选择性标记物的DNA的一个实例，所述DNA可用于ALINK遗传修饰中以选择性地消除包含不希望的细胞分裂速率的细胞。
[0330] 本文中考虑可在本文提供的工具和/或方法中使用替代和/或另外的阴性选择性系统。各种阴性选择性标记物系统是本领域已知的(例如，dCK.DM(Neschadim等人，2012))。
[0331] 例如，在“基因导向的酶/前药疗法”(GEPT)领域中，具有临床相关性的各种阴性选择性系统已经在积极开发中，其目的是在无副作用或副作用极少的情况下提高常规癌症疗法的治疗功效(Hedley等人，2007；Nawa等人，2008)。通常，GEPT涉及使用病毒载体来将基因递送到哺乳动物细胞中未发现并产生酶的癌细胞区域内的癌细胞中或癌细胞附近，所述酶可将相对无毒的前药转化成有毒剂。
[0332] HSV-TK/GCV、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)和羧基酯酶/伊立替康(CE/CPT-11)是在GEPT临床前和临床试验中评价的阴性选择性标记物系统的实例(Danks等人，
2007；Shah，2012)。
2007；Shah，2012)。
[0333] 为克服1型单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦(TK/GCV)系统的潜在免疫原性，已经通过将人脱氧胞苷激酶工程化以变得具有胸苷活性并与无毒前药一起作为阴性选择性(自杀)系统抗体而开发了“人源化”自杀系统：溴乙烯基-脱氧尿苷(BVdU)、L-脱氧胸苷(LdT)或L-脱氧尿苷(LdU)(Neschadim等人，2012)。
[0334] CD/5-FC阴性选择性标记物系统是广泛使用的“自杀基因”系统。胞嘧啶脱氨酶(CD)是可从细菌或酵母(例如，分别从大肠杆菌或酿酒酵母)获得的非哺乳动物酶(Ramnaraine等人，2003)。CD催化胞嘧啶转化成尿嘧啶，并且是原核生物和真菌中的嘧啶补救途径的重要成员，但它在哺乳动物细胞中不存在。5-氟胞嘧啶(5-FC)是在人体内引起较低水平的细胞毒性的抗真菌前药(Denny，2003)。CD催化5-FC转化为遗传毒性剂5-FU，其在人体中具有高水平的毒性(Ireton等人，2002)。
[0335] CE/CPT-11系统是基于羧基酯酶，其是在哺乳动物物种的不同组织中发现的丝氨酸酯酶(Humerickhouse等人，2000)。抗癌剂CPT-11是通过CE活化以产生称为7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)(其是强大的哺乳动物拓扑异构酶I抑制剂)的活性物质的前药(Wierdl等人，2001)。SN-38诱导分裂细胞中双链DNA断裂的累积(Kojima等人，1998)。
[0336] 阴性选择性标记物系统的另一个实例是iCasp9/AP1903自杀系统，所述系统是基于与人FK506结合蛋白(FKBP)融合以允许使用小分子AP1903的化学二聚化的修饰人半胱天冬酶9，所述小分子已在人中进行了安全测试。施用二聚化药物诱导表达工程化的半胱天冬酶9组分的细胞的细胞凋亡。这种系统具有若干优点，例如像包括低的潜在免疫原性，因为它由人基因产物组成，所以二聚体药物仅影响表达工程化的半胱天冬酶9组分的细胞(Straathof等人，2005)。iCasp/AP1903自杀系统正在临床环境中进行测试(Di Stasi等人，
2011)。
2011)。
[0337] 本文考虑ALINK系统的阴性选择性标记物系统可用增殖拮抗剂系统代替。如本文所用，术语“增殖拮抗剂”是指其存在抑制(完全或部分)细胞的分裂的天然或工程化的化合物。例如，OmomycER是MYC显性阴性Omomyc与突变型鼠雌激素受体(ER)结构域的融合蛋白。当用他莫昔芬(TAM)诱导时，融合蛋白OmomycER定位至细胞核，其中显性阴性Omomyc与C-Myc、L-Myc和N-Myc二聚化，从而将它们敖合在不能结合Myc DNA结合共有序列的复合物中(Soucek等人，2002)。由于缺乏Myc活性，所以细胞不能分裂(Oricchio等人，2014)。增殖拮抗剂的另一个实例是A-Fos，其是在等摩尔竞争中抑制DNA结合的显性阴性活化蛋白-1
(AP1)(致癌基因Fos与Jun的异二聚体)(Olive等人，1997)。A-Fos也可与ER结构域融合，从而使其核定位受TAM诱导。OmomycER/他莫昔芬或A-FosER/他莫昔芬可以是TK/GCV的替代以成为ALINK。
(AP1)(致癌基因Fos与Jun的异二聚体)(Olive等人，1997)。A-Fos也可与ER结构域融合，从而使其核定位受TAM诱导。OmomycER/他莫昔芬或A-FosER/他莫昔芬可以是TK/GCV的替代以成为ALINK。
[0338] 通过将CDL与EARC(例如基于诱导型活化因子的基因表达系统)可操作地连接，还可将细胞修饰为“失效安全”。在这些条件下，CDL将仅在基于诱导型活化因子的基因表达系统的诱导剂存在下表达(并且细胞只能分裂)。在这些条件下，取决于基于诱导型活化因子的基因表达系统和CDL功能的作用机理，在不存在诱导剂的情况下，EARC修饰的细胞停止分裂、显著减缓或死亡。细胞可进行修饰以包含纯合的或复合杂合的EARC，或者可进行改变以使得仅EARC修饰的等位基因可产生功能性CDL。在一个实施方案中，例如，可将EARC修饰引入CDL的所有等位基因中以提供用于细胞分裂控制的机制。
[0339] 可将EARC插入CDL的任何位置，所述位置允许在诱导剂存在下CDL和诱导型系统的活化因子组分的共表达。
[0340] 在一个实施方案中，基于“活化因子”的基因表达系统优于基于“阻遏物”的基因表达系统。例如，如果使用阻遏物来遏制CDL，则阻遏物功能突变的丧失可释放CDL表达，从而使细胞增殖。在细胞分裂的基于活化的遏制中，活化因子功能(突变)的丧失将关闭CDL表达，从而阻止细胞增殖。
[0341] 在一些实施方案中，EARC系统是dox-桥系统、香豆酸盐开关诱导型系统、蜕皮激素诱导型系统、无线电波诱导型系统或配体可逆的二聚化系统。
[0342] 可将dox-桥插入宿主细胞中的CDL(例如CDK1)中，以使得在存在诱导剂(例如强力霉素或“DOX”)的情况下，dox-桥允许CDL表达，从而允许细胞分裂和增殖。用dox-桥EARC修饰的宿主细胞可包含在启动子的转录控制下的反向四环素反式活化因子(rtTA)基因(Urlinger等人，2000)，其在分裂细胞中(例如在CDL中)具有活性。这种靶向插入使得CDL启动子不再可用于CDL转录。为了恢复CDL转录，在CDL转录物之前插入四环素响应元件启动子(例如TRE(Agha-Mohammadi等人，2004))，所述启动子将仅在表达rtTA和强力霉素存在的情况下表达CDL基因。当CDL表达的唯一来源是dox-桥接等位基因时，在没有强力霉素的情况下不存在CDL基因表达。CDL表达的缺乏引起EARC修饰的细胞通过死亡、停止细胞分裂或使细胞有丝分裂速率变得如此缓慢以致EARC修饰的细胞无法促成肿瘤形成而在其增殖方面受到损害。
[0343] 如本文所用的术语“dox-桥”是指通过内源性或外源性启动子表达rtTA(Gossen等人，1995)来使启动子的活性与靶转录区域分离并在TRE控制下实现靶区域的转录的机制。如本文所用，“rtTA”是指四环素诱导型系统的反向四环素反式活化因子元件(Gossen等人，
1995)，并且“TRE”是指由最小启动子上游的TetO操纵子序列组成的启动子。在强力霉素存在下rtTA与TRE启动子的结合后，TRE启动子下游的基因座的转录增加。rtTA序列可插入与CDL相同的转录单元中，或者插入基因组的不同位置中，只要靶区域的转录表达的允许或不允许状态受强力霉素控制即可。dox-桥是EARC的一个实例。
1995)，并且“TRE”是指由最小启动子上游的TetO操纵子序列组成的启动子。在强力霉素存在下rtTA与TRE启动子的结合后，TRE启动子下游的基因座的转录增加。rtTA序列可插入与CDL相同的转录单元中，或者插入基因组的不同位置中，只要靶区域的转录表达的允许或不允许状态受强力霉素控制即可。dox-桥是EARC的一个实例。
[0344] 本文还考虑将EARC系统引入CDL的5'调控区。
[0345] 本文中考虑可在本文提供的工具和/或方法中使用替代和/或另外的基于诱导性活化因子的基因表达系统以产生EARC修饰。各种基于诱导型活化因子的基因表达系统是本领域已知的。
[0346] 例如，当需要细胞分裂和/或增殖时，与编码CDL的作用蛋白产物融合的去稳定蛋白结构域(Banaszynski等人，2006)可与小分子合成配体结合使用以使CDL融合蛋白稳定。在没有稳定剂的情况下，不稳定的CDL蛋白将被细胞降解，其进而将停止增殖。当添加稳定剂化合物时，它将结合至不稳定的CDL蛋白，所述不稳定的CDL蛋白不会被降解，从而允许细胞增殖。
[0347] 例如，转录活化因子样效应物(TALE)技术(Maeder等人，2013)可与二聚体调控的表达诱导组合(Pollock和Clackson，2002)。TALE技术可用于产生被设计为对序列具有特异性并与替代CDL启动子的最小启动子置于一起的DNA结合结构域。TALEDNA结合结构域还用药物二聚化结构域延伸。后者可结合至具有相应二聚化结构域和转录活化结构域的另一种工程化的蛋白质。
[0348] 例如，可在CDL的5'非翻译区域插入反向-香豆酸盐-反式活化因子(rcTA)，以使得它将由内源性CDL启动子表达。可刚好在CDL的翻译起始(ATG)之前插入香豆酸盐操纵子的6倍重复(6xCuO)。在系统中不存在香豆酸盐的情况下，rcTA不能结合至6xCuO，因此CDL将不被转录，因为6xCuO没有活性。当添加香豆酸盐时，它将与rcTA形成复合物，从而实现与6xCuO结合并实现CDL转录(Mullick等人，2006)。
[0349] 例如，可将融合至Vp16(VpEcR)的活化结构域的类视黄醇X受体(RXR)和蜕皮激素受体(EcR)的N-末端截短插入CDL的5’非翻译区中，以使得它们由内源性CDL启动子共表达。具有下游最小启动子的蜕皮激素响应元件(EcRE)也可在起始密码子的刚好上游插入CDL中。共表达的RXR和VpEcR可与彼此异二聚化。在不存在蜕皮激素或合成药物类似物米乐甾酮A的情况下，二聚化的RXR/VpEcR不能结合至EcRE，因此CDL不被转录。在蜕皮激素或米乐甾酮A存在下，二聚化的RXR/VpEcR可结合至EcRE，以使得转录CDL(No等人，1996)。
[0350] 例如，瞬时受体电位香草素-1(TRPV1)与铁蛋白一起可插入CDL的5'非翻译区中，并由内源性CDL启动子共表达。可由NFAT诱导的启动子(NFATre)也可在起始密码子的正好上游插入CDL中。在正常环境下，NFAT启动子是无活性的。然而，在暴露于低频无线电波后，TRPV1和铁蛋白产生进入细胞的Ca++波，其进而将细胞质NFAT(NFATc)转化成核NFAT(NFATn)，其最终将或阿虎NFATre并转录CDL(Stanley等人，2015)。
[0351] 例如，CDL可在功能上分成多个部分/结构域：5'-CDL和3'CDL，并且FKBP肽序列可插入到每个结构域中。可将IRES(内部核糖体进入位点)序列置于两个结构域之间，其将由CDL启动子同时转录，但将产生两种单独的蛋白质。在不存在诱导剂的情况下，两个单独的CDL结构域将在功能上失活。在引入诸如雷帕霉素或AP20187的二聚化剂后，FKBP肽将二聚化，从而使5'和3'CDL部分结合在一起并重建活性蛋白质(Rollins等人，2000)。
[0352] 在所述方法的一个实施方案中，遗传修饰的细胞包含：一组转基因，每种转基因编码为细胞质、膜结合或局部作用并且其功能是减轻宿主免疫系统的功能(例如，攻击移植物的白细胞和NK细胞活化)或充当针对攻击白细胞的防御机制的基因产物。
[0353] 当在同种异体宿主中移植细胞或此类细胞群体时，用于对细胞进行遗传修饰以包含至少一种用于在移植部位提供局部免疫遏制的机制的方法描述于例如WO 2016/141480，其全部教义以引用的方式并入本文。
[0354] 所述组转基因包括以下基因中的一种或多种：PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)。在一个实施方案中，所述组转基因包括PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及SerpinB9(Spi6)。
[0355] 任选地，所述方法还包括在细胞中表达以下转基因中的一种或多种：TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1以及IFNγR1 d39。在一个实施方案中，所述TGF-β或生物制剂在移植物环境中局部作用。
[0356] 用于将各种遗传修饰如转基因引入动物细胞中的技术在本文描述并且通常是本领域中已知的。
[0357] 在所述方法的一个实施方案中，所述细胞是干细胞、适用于基因组编辑的细胞或可充当治疗性细胞类型的来源的细胞(例如，可定向分化为可用于细胞疗法的谱系限制性或终末分化的细胞的细胞，或所需靶组织的细胞)。在一个实施方案中，细胞是胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、成体干细胞、组织特异性干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞或祖细胞、种系干细胞、肺干细胞或祖细胞、乳腺干细胞、嗅成体干细胞、毛囊干细胞、多潜能干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞或神经干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，细胞源自靶组织，例如皮肤、心脏、脑或脊髓、肝、肺、肾、胰腺、膀胱、骨髓、脾、肠或胃。在一些实施方案中，细胞是成纤维细胞、上皮细胞或内皮细胞。细胞可以是脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，如人或小鼠细胞。
[0358] 用于将遗传修饰的细胞移植到同种异体宿主的移植部位中的技术在本文描述并且通常是本领域中已知的。
[0359] 在本公开的任何方法的各种实施方案中，宿主患有可用细胞疗法治疗的变性疾病或疾患。此类疾病或疾患的实例包括但不限于：失明、关节炎(例如，骨关节炎或类风湿性关节炎)、局部缺血、糖尿病(例如，1型或2型糖尿病)、多发性硬化症、脊髓损伤、中风、癌症、肺病、血液疾病、神经系统疾病(如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和ALS)、酶或激素缺乏症、代谢病症(例如，溶酶体贮积症、半乳糖血症、枫糖尿病、苯丙酮尿症、糖原贮积病、线粒体病症、弗里德里希共济失调、过氧化物酶体病症、金属代谢病症或有机酸血症、自身免疫性疾病(例如，银屑病、全身性红斑狼疮、格雷夫斯病、炎性肠病、艾迪生病、斯耶格伦综合征)、桥本甲状腺炎、血管炎、自身免疫性肝炎、斑秃、自身免疫性胰腺炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、皮肌炎)、年龄相关性黄斑变性、视网膜营养不良、感染性疾病、血友病、变性疾病(例如，夏科-马利-杜斯氏病、慢性阻塞性肺病、慢性创伤性脑病、克罗伊茨费尔特-雅格布病、囊性纤维化、细胞色素C氧化酶缺乏症、埃勒斯-当洛斯综合征、特发性震颤、进行性骨化性纤维发育不良症、婴儿神经轴索营养不良、圆锥形角膜、球形角膜、肌营养不良、神经元蜡样脂褐质沉积症、既往疾病、进行性核上性麻痹、桑德霍夫病、脊髓性肌萎缩症、视网膜色素变性)或年龄相关性疾病(例如，动脉粥样硬化、心血管疾病(例如，心绞痛、心肌梗塞)、白内障、骨质疏松症或高血压)。
[0360] 药物组合物
[0361] 可将本文所述的遮掩的细胞并入媒介物中，以施用至患者，如接受移植物或患有本文所述疾病或疾患的人患者中。可使用本领域已知的方法来制备含有遮掩的细胞的药物组合物。例如，可使用例如生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and Practice of Pharmacology第22版,Allen,L.编辑(2013)；其以引用的方式并入本文)并且以所需的形式，例如以水溶液的形式来制备此类组合物。
[0362] 本文所述的遮掩的细胞可在任何生理上相容的载体如缓冲盐水溶液中施用。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、缓冲水溶液、溶剂和/或分散介质。此类载体和稀释剂的使用是本领域公知的。其他实例包括液体培养基，例如杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)、无菌盐水、无菌磷酸盐缓冲盐水、莱博维茨氏培养基(Leibovitz's medium)(L15，Invitrogen,Carlsbad,Calif.)、无菌水中的右旋糖以及任何其他生理上可接受的液体。分散液也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及油中制备。载体可以是含有以下各项的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和/或植物油。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过维持所需的粒径并且通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。溶液优选地是无菌的并且存在达到容易注射的程度的流动性。优选地，溶液在制造和储存条件下为稳定的并且通过使用例如对羟基苯甲酸、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等保存对抗微生物如细菌和真菌的污染作用。可通过使用药学上可接受的载体或稀释剂以及根据需要使用上面列举的其他成分、随后过滤灭菌且然后并入如本文所述的遮掩的细胞来制备本发明的溶液。
[0363] 例如，如果需要，可适当地缓冲含有本文所述的药物组合物的溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。就这一点而言，可使用的无菌水性介质将为本领域技术人员根据本公开内容所已知的。负责施用的个人将在任何情况下决定用于个别受试者的适当剂量。此外，对于人施用，制剂可满足FDA办公室关于生物制品标准的无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准的要求。
[0364] 通常将在半固体或固体载体中包含遮掩的细胞的药物组合物配制成用于在受试者的移植部位或疾病或疾患的受影响部位进行手术植入。应当理解，液体组合物也可通过外科手术程序来施用。在特定实施方案中，半固体或固体药物组合物可包含可以是不可生物降解或可生物降解的半渗透性凝胶、基质、细胞支架等。例如，在某些实施方案中，可能希望或适当的是将遮掩的细胞与它们的周围隔离，但仍使细胞能够分泌生物分子并将生物分子(例如，表2中所列的治疗剂)递送至周围细胞。
[0365] 在其他实施方案中，不同种类的可降解凝胶和网络用于本发明的药物组合物。例如，可降解材料包括生物相容性聚合物，如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原等。
[0366] 在另一个实施方案中，一种或多种水凝胶用于药物组合物。一种或多种水凝胶可包括胶原、去端肽胶原、纤维蛋白构建体、亲水性乙烯基和丙烯酸类聚合物、多糖如藻酸钙以及聚(环氧乙烷)。此外，水凝胶可由聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(丙烯酸)、自组装肽(例如RAD16)、聚(甲基丙烯酸)、聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)及其彼此以及与疏水性单体如甲基丙烯酸甲酯、乙酸乙烯酯等的共聚物形成。还优选的是含有大的聚(环氧乙烷)嵌段的亲水性聚氨酯。其他优选的物质包括包含可通过加成或通过缩聚形成的聚合物的互穿网状结构的水凝胶，所述聚合物的组分可包含亲水性和疏水性单体，诸如刚才列举的那些单体。原位形成的可降解网络也适用于本发明(参见例如，Anseth,K S等人J.ControlledRelease,2002；78:199-209；Wang,D.等人,Biomaterials,2003；24:3969-
3980；美国专利公布2002/0022676)。这些原位形成物质被配制成适合于注射的流体；然后可通过多种方式如温度、pH值的变化以及原位或体内暴露于光而诱导形成水凝胶。在一个实施方案中，构建体包含含有纤维蛋白胶的凝胶。在另一个实施方案中，构建体包含含有去端肽胶原的凝胶。
3980；美国专利公布2002/0022676)。这些原位形成物质被配制成适合于注射的流体；然后可通过多种方式如温度、pH值的变化以及原位或体内暴露于光而诱导形成水凝胶。在一个实施方案中，构建体包含含有纤维蛋白胶的凝胶。在另一个实施方案中，构建体包含含有去端肽胶原的凝胶。
[0367] 用于形成基质的聚合物可呈水凝胶的形式。通常，水凝胶是可在水中吸收其重量的超过20％、同时保持独特的三维结构的交联的聚合物材料。此定义包括在水性环境中将溶胀的干燥的交联聚合物以及水溶胀的材料。无论聚合物是生物来源的、半合成的还是全合成的，都可使许多亲水性聚合物交联以产生水凝胶。水凝胶可由合成聚合物材料产生。可将此类合成聚合物定制为具有一定范围的性质和可预测的批间一致性，并且代表通常无需担心免疫原性的可靠材料来源。基质可包括由自组装肽形成的水凝胶，如在美国专利号5,670,483和5,955,343、美国专利申请号2002/0160471和PCT申请号WO02/062969中论述的那些。
[0368] 使水凝胶在药物递送应用中有价值的性质包括平衡溶胀度、吸附动力学、溶质渗透性及其体内性能特征。化合物的渗透性部分取决于溶胀度或水含量以及生物降解速率。由于凝胶的机械强度可能与溶胀度成比例地下降，因此还在本发明的考虑范围内的是水凝胶可附着至基底，以使得复合体系提高机械强度。在一些实施方案中，水凝胶可被浸渍在多孔基底中，以便获得基底的机械强度以及水凝胶的有用的递送性质。
[0369] 在其他实施方案中，药物组合物包含由天然、改性的天然或合成生物可降解聚合物(包括均聚物、共聚物和嵌段聚合物及其组合)制成的生物相容性基质。
[0370] 合适的生物可降解的聚合物或聚合物类别的实例包括本公开中论述的任何生物可降解的聚合物，包括但不限于纤维蛋白、I、II、III、IV和V型胶原、弹性蛋白、明胶、玻连蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、凝血酶、聚(氨基酸)、氧化纤维素、弹性蛋白原、丝状纤维、核糖核酸、脱氧核糖核酸、蛋白质、多核苷酸、阿拉伯树胶、重组基底膜基质、淀粉、右旋糖酐、藻酸盐、透明质酸、几丁质、壳聚糖、琼脂糖、多糖、透明质酸、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乙二醇、脱细胞组织、自组装肽、多肽、糖胺聚糖、它们的衍生物以及它们的混合物。合适的聚合物还包括可由L(+)和D(-)聚合物形成的聚(丙交酯)(PLA)、聚羟基丁酸酯、聚氨酯、聚磷腈、聚(乙二醇)-聚(丙交酯-共-乙交酯)共聚物、可降解的聚氰基丙烯酸酯和可降解的聚氨酯。对于乙醇酸和乳酸两者，可在聚合之前制备并纯化中间体环状二聚体。这些中间二聚体分别称为乙交酯和丙交酯。
[0371] 其他有用的生物可降解的聚合物或聚合物类别包括但不限于脂族聚酯、聚(草酸亚烷基酯)、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚亚氨基碳酸酯、聚原酸酯、聚氧杂酯(polyoxaester)、聚酰胺酯、含胺基团的聚氧杂酯、聚(富马酸丙烯酯)、聚富马酸酯、聚二氧杂环己酮、聚碳酸酯、聚草酸酯、聚(α-羟基酸)、聚(酯)、聚氨酯、聚(酯氨基甲酸酯)、聚(醚氨基甲酸酯)、聚酸酐、聚乙酸酯、聚己内酯、聚(原酸酯)、聚氨基酸、聚酰胺以及其共混物和共聚物。另外有用的生物可降解的聚合物包括但不限于L-和D-乳酸的立体聚合物，双(对羧基苯氧基)丙烷和癸二酸的共聚物，癸二酸共聚物，己内酯、聚(乳酸)/聚(乙醇酸)/聚乙二醇共聚物的共聚物，聚氨酯和聚乳酸的共聚物，α-氨基酸的共聚物，α-氨基酸和己酸的共聚物，α-谷氨酸苄基酯和聚乙二醇的共聚物，琥珀酸酯和聚(二醇)的共聚物，聚磷腈，聚(羟基链烷酸酯)以及其混合物。也可考虑二元和三元系统。
[0372] 通常，用于形成基质的材料被理想地配置成使得它：(1)具有适合于预期应用的机械性质；(2)保持足够完整，直到组织向内生长并愈合为止；(3)不引起炎性或毒性响应；(4)在实现其目的后在体内代谢；(5)容易加工成待成型的所需最终产品；(6)表现出可接受的保质期；以及(7)容易灭菌。
[0373] 在另一个实施方案中，可通过使用支架来施用遮掩的细胞群体。支架的组成、形状和孔隙率可以是上述的任一种。通常，这些三维生物材料含有附着至支架、分散在支架内或并入包埋在支架中的细胞外基质中的活细胞。一旦植入身体的目标区域，这些植入物就变得与宿主组织整合在一起，其中移植的细胞逐渐变得建立。
[0374] 可使用的支架的非限制性实例包括织物结构，如机织物、针织物、编织物、网状织物、非织造物和经编针织物；多孔泡沫、半多孔泡沫、穿孔膜或片、微粒、珠和球以及为上述结构的组合的复合结构。非织造垫可例如使用由乙醇酸和乳酸的合成可吸收共聚物(PGA/PLA)组成的纤维形成，所述纤维以商标名VICRYL缝合线(Ethicon,Inc.,Somerville,N.J.)出售。还可利用如美国专利号6,355,699中论述的由例如聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物组成、通过诸如冷冻干燥或冻干的方法形成的泡沫。
[0375] 在另一个实施方案中，框架是毡，其可由从生物可吸收的材料制成的复丝构成。可使用包括卷曲、切割、梳理和针刺的标准织物加工技术将纱线制成毡。在另一个实施方案中，将细胞接种到可用作复合结构的泡沫支架上。
[0376] 框架可被模制成有用的形状，以便填充组织空隙。因此，可将框架成形为不仅提供用于神经生长的通道，而且提供用于支撑和围绕组织(如血管组织、肌肉组织等)的支架。此外，将理解的是，细胞群体可在预形成的、不可降解的外科或可植入装置上培养。
[0377] 药物组合物可包括由遮掩的细胞制成的制剂，所述遮掩的细胞与药学上可接受的载体或介质一起配制。合适的药学上可接受的载体包括本公开中论述的任何载体，包括但不限于水、盐溶液(如林格氏溶液)、醇、油、明胶、聚乙烯吡咯烷、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉或淀粉)、脂肪酸酯和羟甲基纤维素。此类制剂可进行灭菌，并且如果需要，可与诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂和着色剂的辅助剂混合。适用于本发明的药物载体是本领域已知的，并且描述于例如Pharmaceutical Sciences(第17版,Mack Pub.Co.,Easton,Pa.)和WO 96/05309中。
[0378] 治疗方法
[0379] 本文所述的遮掩的细胞和组合物可通过多种途径施用至有需要的受试者(例如，正在接受或已经接受移植物的受试者，或患有本文所述的疾病或疾患的受试者)，所述途径如局部施用至移植部位或移植部位附近、局部施用至对受疾病或疾患影响的部位(例如，注射至关节用于治疗RA、注射至视网膜下腔中用于治疗湿性AMD、直接施用至中枢神经系统(CNS)(例如，脑内、脑室内、鞘内、脑池内或立体定向施用)用于治疗神经系统疾病如帕金森氏病、直接注射到心肌中用于治疗心肌梗塞)、静脉内、胃肠外、皮内、透皮、肌内、鼻内、皮下、经皮、气管内、腹膜内、动脉内、血管内、吸入、灌注、灌洗和口服施用。在任何给定情况下最合适的施用途径将取决于所施用的特定细胞或组合物、患者、药物配制方法、施用方法(例如，施用时间和施用途径)、患者的年龄、体重、性别、所治疗疾病的严重程度、患者的饮食以及患者的排泄率。组合物可施用一次或多于一次(例如，每年一次、每年两次、每年三次、每月两次或每月一次)。对于局部施用，可通过将细胞群体置于所需位置中的任何方式施用遮掩的细胞，包括导管、注射器、分流器、支架、微导管、泵、用装置植入或用支架植入。
[0380] 如本文所述，在施用之前，可在一种或多种因子存在下或在刺激干细胞分化成所需细胞类型(例如，神经元、心肌细胞、RPE细胞、产生胰岛素的细胞、产生凝血因子的细胞、关节成纤维细胞或本文所述的其他细胞类型)的条件下孵育所述细胞群体。此类因子在本领域中是已知的，并且本领域技术人员将理解，可通过常规实验来确定合适的分化条件。此类因子包括生长或营养因子、趋化因子、细胞因子、细胞产物、脱甲基剂以及已知例如沿血管生成、成血管(hemangiogenic)、生血管(vasculogenic)、骨骼肌、血管平滑肌、周细胞、神经元或血管内皮途径或谱系刺激干细胞的分化的其他刺激物。或者，施用至患者的组合物包含具有一种或多种刺激细胞分化成所需细胞类型的因子的遮掩的细胞群体，其中细胞分化在体内在组织部位发生。在一些实施方案中，可使用本领域技术人员已知的方法在体外使遮掩的细胞分化成器官或组织，并施用至需要器官或组织移植的受试者。
[0381] 在一些实施方案中，从患者或从供体(例如，从例如没有疾病或疾患的HLA匹配或错配的供体)收集特定细胞类型的细胞，进行修饰以表达一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种)遮掩转基因，且随后施用至受试者。这种方法可用于治疗携带特定基因的突变的受试者，因为遮掩的供体细胞可内源性地表达所述基因的野生型型式；或者用于缺乏特定分泌的蛋白或酶的受试者(例如，使用内源性地表达在受试者体内缺乏的蛋白质或酶的遮掩的供体细胞)。这种方法还可用于治疗接受器官或组织移植的受试者，因为器官或组织移植中的细胞可在进行移植之前进行修饰以表达一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种)遮掩转基因。
[0382] 可如本文所述治疗的受试者是已接受移植物的受试者，或患有本文所述的疾病或疾患(例如湿性AMD或视网膜营养不良、神经变性疾病如帕金森氏病、心脏梗塞、骨关节炎或RA、糖尿病、血友病、代谢病症或表2中列出的疾病或疾患)的受试者。本文所述的细胞、组合物和方法可用于治疗由细胞丧失、蛋白质的突变或缺乏或蛋白质的异常产生所引起或与其相关的疾病或疾患，所述疾病或疾患可使用细胞替代蛋白质或细胞疗法、治疗性蛋白质的产生、激动剂抗体的产生或抑制性抗体的产生来进行治疗。本文所述的方法可包括在用本文所述的组合物治疗或施用本文所述的组合物之前，针对与蛋白质产生不足相关的基因中的突变筛选受试者的步骤。可使用本领域技术人员已知的标准方法(例如，遗传测试)来筛选受试者的遗传突变。本文所述的方法还可包括在用本文所述的遮掩的细胞或组合物治疗或施用本文所述的遮掩的细胞或组合物之前评价受试者的疾病或疾患的症状的步骤。在施用遮掩的细胞或组合物后，可使用相同的诊断测试对受试者进行评价，以确定受试者的病情是否有所改善。本文所述的组合物和方法可在患者表现出任何组织或器官排斥迹象之前作为预防性治疗施用至已接受组织或器官移植物的患者。
[0383] 本文所述的遮掩的细胞、组合物和方法可用于替代受试者中的死亡或垂死细胞(例如，替代患有神经变性疾病的受试者中的神经元，或替代患有心肌梗塞的受试者中的心肌细胞)。本文所述的遮掩的细胞、组合物和方法也可用于在组织或器官移植物的区域中提供免疫遏制，或降低组织或器官移植物排斥的风险。表达治疗剂(如蛋白质或激动剂抗体)的遮掩的细胞、包含此类细胞的组合物或施用此类细胞的方法可用于替代或提供在受试者中突变或缺乏的蛋白质的野生型型式(例如，产生但由于遗传突变而无法正常起作用的蛋白质，如截短的蛋白质或电荷、极性或结合型式改变的蛋白质；或未产生或以不足的量产生的蛋白质，例如与表2中的疾病或疾患相关的不足蛋白质产生)。表达治疗剂(如抑制性或中和抗体)的遮掩的细胞、包含此类细胞的组合物或施用此类细胞的方法可用于阻断或中和在受试者中过表达的蛋白质或异常产生的蛋白质(例如，在与健康受试者中所述蛋白质的产生不同的时间或位置产生的蛋白质，例如与表2中列出的疾病或疾患相关的异常蛋白质产生)。
[0384] 治疗可包括施用遮掩的细胞或含有各种单位剂量的遮掩的细胞的组合物。每个单位剂量通常将含有预定量的本文所述的遮掩的细胞。待施用的量以及特定施用和配制途径在临床领域技术人员的技能范围内。单位剂量不需要作为单次注射施用，而是可包括在设定的时间段内连续输注。给药可使用导管、注射器、分流器、支架、微导管、泵、用装置植入或用支架植入进行。所施用的细胞的数量可取决于是将细胞施用至与疾病或损伤相关的组织、器官或身体部位还是皮下施用以产生遮掩的皮下组织而变化。对于施用至组织、器官或身体部位，遮掩的细胞可以例如1x 104个细胞至1x 1010个细胞(例如，1x 104、2x 104、3x 104、4x 104、5x 104、6x 104、7x 104、8x 104、9x 104、1x 105、2x 105、3x 105、4x 105、5x 105、
5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6
6x 10 、7x 10、8x 10、9x 10、1x 10 、2x 10 、3x 10 、4x 10 、5x 10、6x 10、7x 10、8x
106、9x 106、1x 107、2x 107、3x 107、4x 107、5x 107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107、1x 108、
2x 108、3x 108、4x 108、5x 108、6x 108、7x 108、8x 108、9x 108、1x 109、2x 109、3x 109、4x
109、5x 109、6x 109、7x 109、8x 109、9x 109、1x 1010个细胞)的剂量施用至患者。所施用的细
4 5
胞的数量将取决于接受者组织、器官或身体部位的大小。例如，2.5x 10至1x 10个细胞(例如，2.5x 104、3x 104、4x 104、5x 104、6x 104、7x 104、8x 104、9x 104或1x 105个细胞)可施用(例如注射)至眼睛的视网膜下腔或特定脑区域；1x 106至1x108个细胞(例如，1x 106、2x
106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、1x 107、2x 107、3x 107、4x 107、
5x 107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107或1x 108个细胞)可施用(例如注射)至关节，其中细胞的量取决于关节的大小；并且5x 108至5x 109个细胞(例如，5x 108、6x 108、7x 108、8x
108、9x 108、1x 109、2x 109、3x 109、4x 109或5x 109个细胞)可施用至心肌。为了产生遮掩的皮下组织，可皮下施用(例如注射)8x 108个细胞至3x 109个细胞(例如，8x 108、9x 108、
1x 109、2x 109、3x 109个细胞)。遮掩的细胞可以两种或多种剂量施用(例如，两种、三种、四种、五种或更多种不同的剂量，例如，施用至患有RA的患者的不同大小的关节)或以相同剂量施用两次或更多次(例如，在一小时、一天、一周、一个月或一年的过程内两次、三次、四次、五次、六次或更多次)。在一些实施方案中，本文所述的遮掩的细胞以组织(例如，已经从遮掩的细胞体外生长和/或分化的组织)的形式施用。在一些实施方案中，用凝胶、生物相容性基质或支架施用(例如，植入)遮掩的组织。
5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6
6x 10 、7x 10、8x 10、9x 10、1x 10 、2x 10 、3x 10 、4x 10 、5x 10、6x 10、7x 10、8x
106、9x 106、1x 107、2x 107、3x 107、4x 107、5x 107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107、1x 108、
2x 108、3x 108、4x 108、5x 108、6x 108、7x 108、8x 108、9x 108、1x 109、2x 109、3x 109、4x
109、5x 109、6x 109、7x 109、8x 109、9x 109、1x 1010个细胞)的剂量施用至患者。所施用的细
4 5
胞的数量将取决于接受者组织、器官或身体部位的大小。例如，2.5x 10至1x 10个细胞(例如，2.5x 104、3x 104、4x 104、5x 104、6x 104、7x 104、8x 104、9x 104或1x 105个细胞)可施用(例如注射)至眼睛的视网膜下腔或特定脑区域；1x 106至1x108个细胞(例如，1x 106、2x
106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、1x 107、2x 107、3x 107、4x 107、
5x 107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107或1x 108个细胞)可施用(例如注射)至关节，其中细胞的量取决于关节的大小；并且5x 108至5x 109个细胞(例如，5x 108、6x 108、7x 108、8x
108、9x 108、1x 109、2x 109、3x 109、4x 109或5x 109个细胞)可施用至心肌。为了产生遮掩的皮下组织，可皮下施用(例如注射)8x 108个细胞至3x 109个细胞(例如，8x 108、9x 108、
1x 109、2x 109、3x 109个细胞)。遮掩的细胞可以两种或多种剂量施用(例如，两种、三种、四种、五种或更多种不同的剂量，例如，施用至患有RA的患者的不同大小的关节)或以相同剂量施用两次或更多次(例如，在一小时、一天、一周、一个月或一年的过程内两次、三次、四次、五次、六次或更多次)。在一些实施方案中，本文所述的遮掩的细胞以组织(例如，已经从遮掩的细胞体外生长和/或分化的组织)的形式施用。在一些实施方案中，用凝胶、生物相容性基质或支架施用(例如，植入)遮掩的组织。
[0385] 本文所述的组合物以足以预防或减轻移植排斥或改善表2中所列疾病或疾患的症状(例如，减轻骨关节炎或RA的症状(例如，减轻炎症、关节痛、僵硬或不动性)；减轻视网膜营养不良或湿性AMD的症状(例如，改善视力、减缓或减少眼睛的血管形成)；减轻帕金森氏病的症状(例如，减少震颤、僵直、运动迟缓或改善姿势或步态)；减轻糖尿病的症状(例如，提高胰岛素水平、减少定期胰岛素注射的需求)；减轻心肌梗塞的症状(例如，改善心功能、减小梗塞面积)；减轻血友病生物症状(例如，提高凝血因子如因子VIII的水平、减少过度出血、减少瘀伤、减少鼻血、减轻关节疼痛或肿胀)；或减轻代谢病症的症状(例如，食欲增加、生长或体重增加或减轻嗜睡、体重减轻、黄疸、癫痫发作、腹痛或呕吐))的量施用。移植排斥可使用本领域技术人员已知的标准方法来评价，并且与未经治疗通常观察到的移植排斥率相比可降低5％或更高(例如，5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高)。在一些实施方案中，本文所述的遮掩的细胞或组合物的施用导致移植排斥的结果与施用免疫遏制剂的受试者中观察到的结果等效。本文所述的疾病和疾患的症状可使用本领域技术人员已知的标准方法来评价，并且与施用本文所述的遮掩的细胞或组合物之前的症状相比可减轻(例如，受试者的状况可改善)5％或更高(例如，5％、10％、
15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高)。这些作用可在例如施用本文所述的组合物之后1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周或更长时间内发生。可根据用于治疗的剂量和施用途径在施用遮掩的细胞或组合物之后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间对患者进行评价。根据评价结果，患者可接受另外的治疗。
15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高)。这些作用可在例如施用本文所述的组合物之后1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周或更长时间内发生。可根据用于治疗的剂量和施用途径在施用遮掩的细胞或组合物之后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间对患者进行评价。根据评价结果，患者可接受另外的治疗。
[0386] 组合疗法
[0387] 在一些实施方案中，本文所述的遮掩的细胞与一种或多种另外的治疗剂组合施用。可在施用遮掩的细胞之前、施用遮掩的细胞之后或与遮掩的细胞的施用同时施用另外的治疗剂。遮掩的细胞和另外的治疗剂也可经由共同配制同时施用。遮掩的细胞和治疗剂也可顺序施用，以使得遮掩的细胞和治疗剂的作用重叠，并且它们的组合作用是使得症状或与病症有关的其他参数减少大于单独递送的遮掩的细胞或治疗剂或在另一者不存在的情况下所观察到的减少。遮掩的细胞和治疗剂的作用可部分累加、完全累加或大于累加(例如，协同作用)。顺序或实质上同时施用遮掩的细胞和治疗剂可通过任何适当的途径来实现，所述途径包括但不限于口服途径、静脉内途径、肌内途径、局部途径或皮下途径。遮掩的细胞和治疗剂可通过相同的途径或不同的途径施用。例如，遮掩的细胞可通过皮下注射施用，而另外的治疗剂经口服施用。遮掩的细胞可在另外的治疗剂之前或之后立即、至多1小时、至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多7小时、至多8小时、至多到9小时、至多10小时、至多11小时、至多12小时、至多13小时、14小时、至多16小时、至多17小时、至多18小时、至多19小时、至多20小时、至多21小时、至多22小时、至多23小时、至多24小时或至多1-7、1-14、1-21或1-30天施用。
[0388] 在一个实例中，另外的治疗剂是通常给予用于器官或组织移植的一种或多种免疫遏制剂。免疫遏制剂可以是在移植后立即给予以预防急性排斥的剂(例如，甲基泼尼松龙、atgam、抗胸腺细胞球蛋白、OKT3、巴利昔单抗或达利珠单抗)或用于维持的免疫遏制剂(例如，泼尼松)、钙调磷酸酶抑制剂(例如，环孢菌素、他克莫司)、吗替麦考酚酯、硫唑嘌呤或雷帕霉素)。在器官移植物后给予的其他免疫遏制剂包括皮质类固醇(例如，甲基泼尼松龙、地塞米松、泼尼松龙)、细胞毒性免疫遏制剂(例如，硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、巯基嘌呤、甲氨蝶呤)、免疫遏制剂抗体(例如，抗胸腺细胞球蛋白、巴利昔单抗、英夫利昔单抗)、西罗莫司衍生物(例如，依维莫司、西罗莫司)和抗增殖剂(例如，吗替麦考酚酯、霉酚酸钠和硫唑嘌呤)。在这种情况下，将遮掩的细胞施用至移植部位或移植部位附近，或修饰待移植的组织以表达一种或多种(例如，一种、二种、三种、四种、五种、六种、七种或八种)遮掩转基因，并在需要时施用免疫遏制剂作为免疫遏制的另一种来源。
[0389] 为了用于治疗炎症和自身免疫相关的疾病或疾患，另外的剂可以是疾病改善性抗风湿药物(DMARD)、生物响应调节剂(一种类型的DMARD)、皮质类固醇或非类固醇抗炎药物(NSAID)。在一些实施方案中，另外的剂是泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、甲氨蝶呤、羟氯喹、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、环磷酰胺、硫唑嘌呤或生物制剂如托法替尼、阿达木单抗、阿巴西普、阿纳金拉、阿那白滞素、塞妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗或托珠单抗。在一些实施方案中，另外的剂是6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿巴西普、阿达木单抗、阿仑单抗(Lemtrada)、氨基水杨酸盐(5-氨基水杨酸、柳氮磺胺吡啶、美沙拉嗪、巴柳氮、奥沙拉嗪)、抗生素、抗组胺剂、抗TNFα(英夫利昔单抗、阿达木单抗、培化赛妥珠单抗、那他珠单抗)、硫唑嘌呤、贝利木单抗、β干扰素、钙调磷酸酶抑制剂、赛妥珠单抗、皮质类固醇、可玛林(cromolyn)、环孢菌素A、环孢霉素、富马酸二甲酯(tecfidera)、依那西普、捷灵亚(Gilenya)、富马酸酯、克帕松(Copaxone)、戈利木单抗、羟基脲、IFNγ、IL-11、英夫利昔单抗、来氟米特、白三烯受体拮抗剂、长效β2激动剂、米托蒽醌、吗替麦考酚酯、泰斯布雷(tysabri)、奥瑞珠单抗、吡美莫司、益生菌(VSL#3)、类视黄醇、利妥昔单抗、水杨酸、短效β2激动剂、柳氮磺胺吡啶、他克莫司、奥巴捷(Aubagio)、茶碱、托珠单抗、优特克单抗(抗IL-12/IL-23)或维多珠单抗(抗α3β7整联蛋白)。在这种情况下，可施用遮掩的细胞来替代因炎症或自身免疫相关疾病或疾患而受损的组织或器官。在另一个实例中，可修饰所施用的遮掩的细胞以表达针对特定炎症或自身免疫相关疾病或疾患的治疗的生物治疗剂(例如抗体)，并且所述另外的剂可以是化合物或一般抗炎剂(例如，NSAID或皮质类固醇)。
[0390] 例如，如果疾病是类风湿性关节炎，则另外的剂可以是以下中的一种或多种：泼尼松、泼尼松龙和甲基泼尼松龙、甲氨蝶呤、羟氯喹、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、环磷酰胺和硫唑嘌呤、托法替尼、阿达木单抗、阿巴西普、阿纳金拉、阿那白滞素、塞妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗或托珠单抗。所施用的遮掩的细胞可以是关节的软骨或骨产生细胞。在一些实施方案中，可修饰遮掩的细胞以产生抗TNFα抗体，并且可与抗炎剂(例如皮质类固醇)组合施用。
[0391] 在另一个实例中，为了用于治疗AMD或视网膜营养不良，另外的治疗剂可以是另外的生物剂(例如，贝伐单抗、兰尼单抗或阿柏西普)、光动力疗法或光凝固。所施用的遮掩的细胞可以是视网膜细胞(例如，RPE细胞)。在一些实施方案中，可修饰遮掩的细胞以产生VEGF抑制剂，并且可与光动力疗法或光凝固组合施用。
[0392] 为了用于治疗帕金森氏病，本文所述的遮掩的细胞可与卡比多巴-左旋多巴、多巴胺激动剂(例如，普拉克索、罗匹尼罗、罗替戈汀或阿扑吗啡)、MAO-B抑制剂(例如，司来吉兰、雷沙吉兰)、邻苯二酚-O-甲基转移酶抑制剂(例如，恩他卡朋或托卡朋)、抗胆碱能药(例如，苯并托品或苯海索)、金刚烷胺或深部脑刺激。所施用的遮掩的细胞可以是多巴胺能神经元。
[0393] 用于治疗心肌梗塞的另外的剂包括抗凝剂(例如，利伐沙班、达比加群、阿哌沙班、肝素、华法林)、抗血小板剂(例如，阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫(dipyramidole)、普拉格雷、替卡格雷)、血管紧张素转化酶抑制剂(例如，贝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、莫昔普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、群多普利)、血管紧张素II受体阻滞剂(例如，坎地沙坦、依普沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、替米沙坦、缬沙坦)、血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂(例如，沙库比曲/缬沙坦)、β阻滞剂(例如，醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、索他洛尔)、组合的α和β阻滞剂(例如，卡维地洛、盐酸拉贝洛尔)、钙通道阻滞剂(例如，氨氯地平、地尔硫卓、非洛地平、硝苯地平、尼莫地平、尼索地平、维拉帕米)、降胆固醇药物(例如，他汀类药物(例如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀)、烟酸(例如，洛伐他汀)、胆固醇吸收抑制剂(例如，依泽替米贝/辛伐他汀))、洋地黄制剂(例如，拉诺辛)、利尿剂(例如，阿米洛利、布美他尼、氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、氢-氯噻嗪、吲达帕胺、螺内酯)、血管扩张剂(例如，二硝酸异山梨酯、奈西立肽、肼酞嗪、硝酸盐、米诺地尔)、双重抗血小板疗法(例如，阿司匹林和P2Y12抑制剂)或心脏手术(例如，血管成形术、人工心脏瓣膜手术、粥样斑块切除术、搭桥手术、心肌成形术、心脏移植、微创心脏手术、射频消融术、支架手术或心肌血运重建术)。所施用的遮掩的细胞可以是心肌细胞。
[0394] 为了用于治疗感染性疾病，另外的剂可以是抗病毒化合物(例如，阿糖腺苷、阿昔洛韦、更昔洛韦、缬更昔洛韦、核苷类似物逆转录酶抑制剂(NRTI)(例如，AZT(齐多夫定)、ddI(地达诺新)、ddC(扎西他滨)、d4T(司他夫定)或3TC(拉米夫定))、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)(例如，(奈韦拉平或地拉夫定)、蛋白酶抑制剂(沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦或奈非那韦)、利巴韦林或干扰素)；抗细菌化合物；抗真菌化合物；抗寄生虫化合物。所施用的遮掩的细胞可以是免疫细胞(例如，可帮助抵抗感染性疾病的细胞，例如遮掩的T细胞或B细胞)。
[0395] 为了用于治疗糖尿病，另外的剂可以是胰岛素、磺酰脲(例如，氯丙酰胺、格列吡嗪、格列本脲、格列美脲)、双胍(例如，二甲双胍)、美格列奈(例如，瑞格列奈、那格列奈)、噻唑烷二酮(例如，罗格列酮、吡格列酮)、DPP-4抑制剂(西格列汀、沙格列汀、利拉列汀、阿格列汀)、SGLT2抑制剂(例如，卡格列净、达格列净)、α-葡糖苷酶抑制剂(例如，阿卡波糖、米格列醇)、胆汁酸螯合剂(例如，考来维仑)、阿司匹林或饮食方案。所施用的遮掩的细胞可以是胰腺β细胞，其可任选地进行修饰以表达编码胰岛素的转基因。
[0396] 为了用于治疗血友病，另外的治疗剂可以是凝血因子、去氨加压素、凝块保存药物(例如，抗纤维蛋白溶解剂，例如抑肽酶、氨基己酸、纤维蛋白原或氨甲环酸)、纤维蛋白密封剂或物理疗法。所施用的遮掩的细胞可以是肝窦细胞或内皮细胞，其可任选地进行修饰以表达编码因子VIII的转基因。
[0397] 为了治疗代谢缺乏症或病症，另外的治疗剂可以是辅酶(例如，生物素、羟钴胺素、核黄素、吡哆醇、叶酸、硫胺素、泛醌(ubichinone)、四氢生物蝶呤)、骨髓移植物、器官移植物(例如，肝脏、肾脏或心脏移植)、血液透析、血液滤过、交换输血、腹膜透析、中链三酰甘油、麦格司他、酶补充疗法或饮食限制(例如，对于患有苯丙酮酸尿症的患者，低蛋白或苯丙氨酸限制饮食)。遮掩的细胞可以是携带在患有代谢病症的受试者中突变的基因的野生型拷贝的细胞，或内源性产生在患有代谢病症的受试者中缺乏的酶的细胞(例如，肝细胞、肾细胞、心脏细胞或携带在患有代谢病症的受试者中突变或产生在患有代谢病症的受试者中缺乏的酶的基因的野生型拷贝的任何其他细胞)。
[0398] 为了用于治疗癌症，另外的剂可以是检查点抑制剂、化学治疗药物、生物药物、非药物疗法(例如，放射疗法、冷冻疗法、热疗或手术切除或肿瘤组织)或抗癌疫苗。遮掩的细胞可以是可帮助抵抗癌症的免疫细胞(例如，巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突细胞或T细胞)。
[0399] 检查点抑制剂可分为至少4个主要类别：i)直接阻断T细胞或自然杀伤(NK)细胞上的抑制途径的剂如抗体(例如，靶向PD-1的抗体，如纳武单抗、匹地利珠单抗/CT-011和派姆单抗、靶向TIM-3的抗体和靶向LAG-3、2B4、CD160、A2aR、BTLA、CGEN-15049或KIR的抗体)，ii)直接活化T细胞或NK细胞上的刺激性途径的剂如抗体(例如，靶向OX40、GITR或4-1BB的抗体)，iii)阻断免疫细胞上的遏制途径或依赖于抗体依赖性细胞毒性以消减免疫细胞的遏制群体的剂如抗体(例如，靶向CTLA-4的抗体如伊匹单抗或曲美木单抗)、靶向VISTA的抗体以及靶向PD-L2的抗体(例如，PDL2/Ig融合蛋白如AMP224)、Gr1或Ly6G)，以及iv)直接阻断癌细胞上的遏制途径或依赖于抗体依赖性细胞毒性来增强对癌细胞的细胞毒性剂的剂如抗体或小分子(例如，利妥昔单抗、靶向PD-L1的抗体或小分子(例如，MPDL3280A/RG7446；MEDI4736；MSB0010718C；BMS 936559)以及靶向B7-H3的抗体或小分子抑制剂(例如，
MGA271)、B7-H4、Gal-9或MUC1)。在一个实施方案中，检查点的抑制剂是HVEM、CD160、CHK 1、CHK2、B-7家族配体或其组合的抑制剂(例如，抑制性抗体或小分子抑制剂)。可例如通过本领域中已知的常规方法(例如，Templeton,Gene and Cell Therapy,2015；Green和
Sambrook,Molecular Cloning,2012)来设计并生产本文所述的此类剂。在一个实施方案中，检查点的抑制剂是抑制性抗体(例如，单特异性抗体，如单克隆抗体)。抗体可以是例如人源化或完全人的。在其他实施方案中，检查点的抑制剂是融合蛋白，例如Fc-受体融合蛋白。在一些实施方案中，检查点的抑制剂是与检查点蛋白相互作用的剂，如抗体。在其他实施方案中，检查点的抑制剂是与检查点蛋白的配体相互作用的剂，如抗体。
MGA271)、B7-H4、Gal-9或MUC1)。在一个实施方案中，检查点的抑制剂是HVEM、CD160、CHK 1、CHK2、B-7家族配体或其组合的抑制剂(例如，抑制性抗体或小分子抑制剂)。可例如通过本领域中已知的常规方法(例如，Templeton,Gene and Cell Therapy,2015；Green和
Sambrook,Molecular Cloning,2012)来设计并生产本文所述的此类剂。在一个实施方案中，检查点的抑制剂是抑制性抗体(例如，单特异性抗体，如单克隆抗体)。抗体可以是例如人源化或完全人的。在其他实施方案中，检查点的抑制剂是融合蛋白，例如Fc-受体融合蛋白。在一些实施方案中，检查点的抑制剂是与检查点蛋白相互作用的剂，如抗体。在其他实施方案中，检查点的抑制剂是与检查点蛋白的配体相互作用的剂，如抗体。
[0400] 化学治疗剂包括烷化剂、抗代谢药、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和相关的抑制剂、长春花生物碱、表鬼臼毒素、抗生素、L-天冬酰胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位络合物、蒽二酮取代的尿素、甲基肼衍生物、肾上腺皮质遏制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及促性腺激素释放激素类似物。还包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、亚叶酸(LV)、伊立替康、奥沙利铂、卡培他滨、紫杉醇和多西他赛。化学治疗剂的非限制性实例包括烷化剂，如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，如苯佐多巴(benzodopa)、卡波醌、米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；乙酰精宁(特别是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；海绵他汀；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物、KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素
(eleutherobin)；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氮芥氧化物盐酸盐、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，尤其卡奇霉素γII和卡奇霉素ωIl；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐，如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉基-阿霉素、氰基吗啉基-阿霉素、2-吡咯啉并-阿霉素和去氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双去氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素药，如氨鲁米特、米托坦、曲洛斯坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；
恩尿嘧啶；安吖啶；倍曲布西；比生群；依达曲沙；德福法明；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；
依利醋铵；埃坡西龙；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登醇，如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；
吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；根霉素(rhizoxin)；西佐喃；
锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(特别是T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂配位络合物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；卡培他滨；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。可在混合物中使用两种或更多种化学治疗剂，以与本文所述的遮掩的细胞组合施用。组合化学疗法的合适给药方案是本领域已知的。
(eleutherobin)；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氮芥氧化物盐酸盐、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，尤其卡奇霉素γII和卡奇霉素ωIl；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐，如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉基-阿霉素、氰基吗啉基-阿霉素、2-吡咯啉并-阿霉素和去氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双去氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素药，如氨鲁米特、米托坦、曲洛斯坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；
恩尿嘧啶；安吖啶；倍曲布西；比生群；依达曲沙；德福法明；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；
依利醋铵；埃坡西龙；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登醇，如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；
吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；根霉素(rhizoxin)；西佐喃；
锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(特别是T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂配位络合物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；卡培他滨；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。可在混合物中使用两种或更多种化学治疗剂，以与本文所述的遮掩的细胞组合施用。组合化学疗法的合适给药方案是本领域已知的。
[0401] 抗癌生物制剂包括用于癌症治疗的细胞因子(例如，干扰素或白介素(例如，IL-2))。在其他实施方案中，生物制剂是抗血管生成剂，如抗VEGF剂，例如贝伐单抗。在一些实施方案中，生物制剂是基于免疫球蛋白的生物制剂，例如人源化抗体、完全人抗体、Fc融合蛋白或其功能片段)，其激动靶标以刺激抗癌响应或拮抗对癌症重要的抗原。此类剂包括利妥昔单抗；达利珠单抗；巴利昔单抗；帕利珠单抗；英夫利昔单抗；曲妥珠单抗；吉妥珠单抗奥佐米星；阿仑单抗；替伊莫单抗；阿达木单抗；奥马珠单抗；托西莫单抗-I-131；依法利珠单抗；西妥昔单抗；贝伐单抗；那他珠单抗；托珠单抗；帕尼单抗；兰尼单抗；依库珠单抗；培化赛妥珠单抗；戈利木单抗；康纳单抗；优特克单抗；奥法木单抗；地诺单抗；莫维珠单抗；雷西巴单抗；贝利木单抗；伊匹单抗；本妥西单抗维多汀；帕妥珠单抗；阿多-曲妥珠单抗恩他新；以及奥比妥珠单抗。还包括抗体-药物缀合物。
[0402] 药盒
[0403] 本发明的特征还在于一种药盒，其含有本文所述的遮掩的细胞(例如，表达本文所述的一组遮掩转基因(例如，PD-L1、H2-M3、Cd47、Cd200、FasL、Ccl21b、Mfge8和Spi6中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或8种)，任选地进一步表达以下转基因中的一种或多种：TGF-β、Cd73、Cd39、Lag3、Il1r2、Ackr2、Tnfrsf22、Tnfrs23、Tnfrsf10、Dad1以及IFNγR1 d39的遮掩的细胞)。在一些实施方案中，对遮掩的细胞进行进一步修饰以包含一种或多种用于调控细胞分裂的系统(例如，ALINK或EARC系统)和/或治疗剂(例如，编码蛋白质或抗体的转基因)。遮掩的细胞可药物组合物的形式提供。所述药盒还可包括用于施用遮掩的细胞或药物组合物的注射器和用于施用遮掩的细胞或药物组合物以治疗本文所述的疾病或疾患的说明书。
[0404] 实施例
[0405] 提供以下实施例以进一步说明本发明的一些实施方案，但不意图限制本发明的范围；通过它们的示例性性质将理解，可替代地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。
[0406] 实施例1：材料和方法
[0407] 表达同种异体耐受性必不可少的靶基因的载体的构建
[0408] 含有参与同种异体耐受性的基因的cDNA序列的质粒如下获得：
[0409] PD-L1：Mount Sinai Hospital，克隆#V102001
[0410] FasL：Mount Sinai Hospital，#75719
[0411] Cd47：Mount Sinai Hospital，#V75535
[0412] Cd200：GE Dharmacon，ID#17470
[0413] H2-M3：Mount Sinai Hospital，克隆#8188
[0414] Ccl21：Mount Sinai Hospital，克隆#V77120
[0415] Mfge8：Mount Sinai Hospital，克隆#V72614
[0416] Spi6：Mount Sinai Hospital，克隆#V8907
[0417] 使用Gateway克隆系统(Thermo Fisher)产生了含有这些目标基因(GOI)或荧光素酶的表达载体。Cd47、Ccl21、Mfge8和Spi6 cDNA以含有cDNA侧接attB位点的形式获得。对于H2-M3、Cd200、FasL和PD-L1，设计引物以扩增cDNA序列，并添加attB位点(图15(a))。在PCR扩增后，通过BP(attB与attP位点之间的重组)反应将含attB的cDNA重组到pDONR221载体(Thermo Fisher，#1256017)中，以产生进入(pENTRY)克隆(图15(b))。BP反应需要将attB侧接的转基因cDNA与pDONR221质粒连同由Invitrogen提供的缓冲液和BP酶在1mL试管中混合，其中BP酶将GOI重组到pDONR221质粒的对接位点中。通过DNA测序(多伦多应用基因组学中心的TCAG测序设备)验证了转基因插入到pDONR221质粒中。然后经由gateway LR(attL与attR位点之间的重组)反应将含有GOI的pENTRY克隆重组到目的载体中(图15(c))。LR反应需要将含有GOI的pDONR221质粒和目的载体连同由Invitrogen提供的缓冲液和LR酶在1mL管中混合，其中LR酶将GOI盒从pDONR221质粒重组到目的质粒的对接位点中。用于所有转基因构建的目的载体含有CAGG启动子，随后是Gateway进入位点、内部核糖体进入位点(IRES)和嘌呤霉素抗性选择性标记物或绿色荧光蛋白(GFP)报告子。整个盒由可转座的PB位点侧接。在LR重组后，通过限制性酶消化验证了含有GOI的最终目的载体(图15(d))。
[0418] ES细胞培养、转染、选择和克隆
[0419] 将源自近交系C57BL/6N小鼠品系(Gertsenstein 2010)的小鼠ES细胞在补充有15％胎牛血清(FBS，测试与ES细胞培养物的相容性)和标准量的丙酮酸钠、非必需氨基酸(NEAA)、Glutamax、青霉素/链霉素、β-巯基乙醇和白血病抑制因子(LIF)的DMEM高葡萄糖中培养(Behringer等人2014)。将细胞在丝裂霉素C灭活的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的饲养层上培养。将培养物在37和5％CO2下保持在标准细胞培养孵育箱中。
[0420] 按照制造商的方案使用JetPRIME试剂(Polyplus，目录号14-07)进行转染，并以三个步骤进行：1)仅用PD-L1-IRES-GFP目的载体转染，2)用携带嘌呤霉素选择性标记物的所有其他转基因转染，和3)用eLuciferase-IRES-GFP转基因转染。
[0421] 步骤1：在用PD-L1-IRES-GFP转染后，将细胞以低密度涂铺，以使得在5-6天多轮增殖后，基于GFP表达的强度选择单个细胞克隆-作为细胞聚集体(集落)存在，且然后扩增为克隆细胞培养物。选择具有最高和最一致的GFP表达的克隆用于下一步骤。
[0422] 步骤2：用含有嘌呤霉素选择标记物的转基因转染24小时后，将嘌呤霉素添加至培养基。在第三天，将细胞以克隆密度涂铺，并继续进行嘌呤霉素选择，直到挑出单个集落并扩增为克隆。在体内筛选了大量这些克隆，并且能够在同种异体环境中形成畸胎瘤的克隆被指定为“NT2”。
[0423] 步骤3：如上所述将NT2用PB-CAG-eLuciferase-IRES-GFP转染，并以克隆密度涂铺。挑选GFP+克隆并扩增。选择了具有高水平的GFP表达的10个克隆用于进一步研究。
[0424] 转基因表达水平的评价
[0425] 从在30mm培养板上生长的培养物以及从体内生长的肿瘤中分离RNA。将细胞用胰蛋白酶解离、离心并除去上清液。将细胞团块立即在干冰上冷冻并储存在-80。将肿瘤组织解剖，立即在干冰上冷冻并储存在-80。使用Sigma GeneElute Total RNA Miniprep试剂盒#RTN350，按照标准方案分离RNA。使用Qiagen Quantifast逆转录酶试剂盒#205313通过逆转录酶反应获得cDNA。使用来自Bioline,#Bio-98020的Sensifast主混合物、基因特异性引物和1:50稀释的RNA进行定量PCR。使用Eppendorf epMotion 5070机器人将样品涂铺在384孔板中，并根据标准方案在BioRad CFX384实时系统C1000热循环仪上进行定量PCR。通过BioRad CFXManager 3.1软件捕获qPCR数据，并使用Microsoft Excel计算表达水平。
[0426] 畸胎瘤测定
[0427] 将Matrigel Matrix High Concentration(Corning目录号354248)在冰上用冷7
DMEM培养基1:1稀释。将5x10个细胞悬浮到500uL的DMEM和等体积的Matrigel中。将100ul
5x10个细胞的悬浮液皮下注射到B6N(同基因)或FVB/N(同种异体)小鼠的每个背侧腹中。注射后2-4周形成所得畸胎瘤。使用卡尺测量畸胎瘤大小，并用式V＝(LxWxH)/2计算体积。允许肿瘤生长至大约500mm2，其是具有良好耐受性且也非常适合于下游实验的大小。将所有转基因递送到含有“失效安全系统”的细胞中(例如，如WO 2016/141480中所述，其全部内容以引用的方式并入本文。这种遗传系统允许通过施用更昔洛韦(GCV)对细胞分裂的完全抑制。一旦来自前述实验的畸胎瘤达到500mm2，就每2-3天向小鼠腹膜腔注射50mg/kg GCV持续2-3周。这种处理方案导致肿瘤的初始短暂缩小，然后在2-3周处理后稳定在400-500mm2的肿瘤大小。在实验结束时，处死小鼠并解剖肿瘤。将一小部分组织速冻用于RNA提取，而其余部分固定在4％多聚甲醛中。
DMEM培养基1:1稀释。将5x10个细胞悬浮到500uL的DMEM和等体积的Matrigel中。将100ul
5x10个细胞的悬浮液皮下注射到B6N(同基因)或FVB/N(同种异体)小鼠的每个背侧腹中。注射后2-4周形成所得畸胎瘤。使用卡尺测量畸胎瘤大小，并用式V＝(LxWxH)/2计算体积。允许肿瘤生长至大约500mm2，其是具有良好耐受性且也非常适合于下游实验的大小。将所有转基因递送到含有“失效安全系统”的细胞中(例如，如WO 2016/141480中所述，其全部内容以引用的方式并入本文。这种遗传系统允许通过施用更昔洛韦(GCV)对细胞分裂的完全抑制。一旦来自前述实验的畸胎瘤达到500mm2，就每2-3天向小鼠腹膜腔注射50mg/kg GCV持续2-3周。这种处理方案导致肿瘤的初始短暂缩小，然后在2-3周处理后稳定在400-500mm2的肿瘤大小。在实验结束时，处死小鼠并解剖肿瘤。将一小部分组织速冻用于RNA提取，而其余部分固定在4％多聚甲醛中。
[0428] 生物发光成像
[0429] 在成像前10分钟，向发展源自用eLuciferase转基因转染的细胞的畸胎瘤的小鼠以100uL/25g体质量注射30mg/mL的VivoGlo荧光素(Promega#P104C)。将动物用异氟烷麻醉，并置于由Living Image软件驱动的IVIS Lumina II成像仪(Caliper Life Sciences)中。根据信号强度，将暴露时间设置在5秒与5分钟之间。
[0430] 组织学
[0431] 将固定的肿瘤包埋在石蜡中，切片并用苏木精/曙红染色，以在CMHD病理学核心处进行组织学分析。用NDPview2软件处理组织学图像。
[0432] 实施例2：遮掩的细胞的产生
[0433] 将编码表1中的基因的转基因克隆到表达载体中，并通过聚合酶链反应(PCR)、限制性酶消化和测序进行序列验证，所有都使用本领域已知的标准方法。
[0434] 将含有转基因Cd47、Cd200、FasL和H2-M3的一组构建体(组1)转染到源自发明人的C57BL/6小鼠ES系(C2)的小鼠胚胎干细胞中。通过PCR验证了转基因的存在，并且通过免疫组织化学记录了表达的蛋白质的表达(图1A-D)。将含有转基因Ccl21、Mfge8、TGF-β和Spi6的第二组构建体(组2)转染到源自FVB/N的ES细胞(ES系C2)中。
[0435] 除培养基使用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基外，使用类似的方法来产生遮掩的B16F10黑素瘤细胞。
[0436] 实施例3：用于抑制T细胞活化的筛选方法
[0437] 改良的体外混合淋巴细胞反应(MLR)测定用于筛选转基因组合，从而产生T细胞活化的最有效抑制。使用了用来自实施例1的组1和组2遮掩转基因转染的细胞系。用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯CFSE标记供体OT-1脾细胞，并向96孔板的每个孔中添加60,000个细胞。将ES或黑素瘤细胞与卵细胞表达细胞10:1混合。将这些中的10,000个添加至脾细胞的每个孔中。添加IL-2作为一般活化剂，并在3天后通过流式细胞术测量T细胞增殖(图2A-2E)。最初将细胞门控为仅包括CD8+细胞，并将所有条件设置为一式四份。
[0438] 阴性对照(仅脾细胞)产生基线6.12％增殖率(图2A)。野生型B16黑素瘤(+10％卵细胞表达)细胞导致增殖明显加速至17.1％(图2B)，而遮掩的细胞将这种增殖降低至9.51％(图2C)。与遮掩的ES细胞(图2E)相比，对于野生型(图2D)获得相似的结果。
[0439] 实施例4：在同系和同种异体移植的B16F10黑素瘤细胞中使用WT和遮掩的癌细胞的研究
[0440] 由于一些候选遮掩转基因意图抑制或调节免疫识别级联的起始阶段，因此这些转基因的作用可单独通过MLR进行评价，因为这些事件作用于宿主APC向局部淋巴结的成熟和物理迁移，其中它们随后活化初始T和B细胞。
[0441] 这需要可在体内同种异体环境中筛选大量转基因组合的替代测定。尝试将携带多种转基因组合的腹膜内和静脉内注射ES细胞作为选择。然而，畸胎瘤形成取决于最少数量的ES细胞的聚集(1x105–5x106，取决于注射部位)，从而使这种选择与这种筛选不相容。然而，源自C57BL/6小鼠的鼠黑素瘤癌细胞系B16F10不限于这种方式。静脉内注射少于5x103导致有效诱导肺中的大量小癌结节。通过限制注射的细胞的数量，可预期癌细胞被捕获在肺泡中将形成源自单个或非常少量的细胞的结节。通过分离这些结节并对这些结节进行基因分型，可鉴定转基因。
[0442] 将B16F10黑素瘤细胞注射到C57BL/6小鼠的血流中(同基因移植物对照)导致在肺中形成癌结节(图3A，左图)。然而，当在注射后第14天观察时，阴性对照-移植到同种异体对照FVB小鼠中的野生型B16F10黑素瘤的肺部也形成了小的黑素瘤结节。然而，当黑素瘤允许生长24天时，结节几乎完全消退(图3A，右图)。
[0443] 通过注射表达使用PiggyBac转座子系统产生的候选遮掩基因的随机组合的癌细胞混合物，重复上述实验。在同种异体环境中发展的肺结节含有保护同种异体移植物免受识别和排斥所需的一个或多个成功组合(图3B，右图)。相同的免疫遮掩的细胞也引起同基因宿主中的加速发展(图3B，左图)。
[0444] 实施例5：非遮掩的胚胎干细胞在同种异体环境中不形成畸胎瘤
[0445] 如表4所示，证实了源自C57BL/6小鼠的野生型ESC不能在FVB/N小鼠中形成畸胎瘤。同样，还表明，源自FVB/N本底的野生型ESC不能在C57BL/6宿主中形成畸胎瘤。将ES细胞集落用胰蛋白酶解离，用不含添加剂的DMEM洗涤一次，并以每毫升约5000万个细胞的浓度重悬于Matrigel HC中。麻醉接受者小鼠，并在每个侧腹区域中皮下注射一百微升。追踪发展中畸胎瘤12周，并通过触诊和用卡尺测量体积来验证。
[0446] 表4：在FVB/N小鼠和C57BL/6宿主(注射有源自C57BL/6小鼠的野生型ESC或源自FVB/N本底的野生型ESC)中形成的畸胎瘤
[0447]
[0448] 实施例6：遮掩的ES细胞可在同基因宿主和同种异体宿主中增殖
[0449] 为了验证候选转基因的遮掩能力，用相同的转基因转染ESC，同时还添加可通过成像检测的荧光素酶转基因。简言之，如上所述制备ES细胞。通过成像重复测量活细胞的存在。图4中的图像是在注射后第17天拍摄的。
[0450] 在图4中，上图示出同基因宿主中免疫遮掩的细胞的增殖，而下图示出同种异体宿主中免疫遮掩的细胞的增殖。
[0451] 在另一项实验中，将来自具有8种免疫调节转基因(克隆NT2)的高表达的C57BL/6小鼠的遮掩的ES细胞皮下注射到具有错配的MHC等位基因的不同同种异体小鼠品系(C3H、FVB/N和CD1)中。红色箭头指示所形成的畸胎瘤(图5A-5C)。
[0452] 实施例7：具有遮掩的组织的小鼠不会受到免疫损害
[0453] 将非免疫遮掩的(野生型)ESC移植到携带现有免疫遮掩的组织的小鼠中，并对小鼠进行评价，以确定其是否能够有效排斥非免疫遮掩的移植物(图6)。在15天的时期内对相同的小鼠进行若干次成像。如图6的左图所示，在同基因小鼠对照中，移植物未随时间推移受到排斥。对于同种异体FVB小鼠，在图6的右图中的左侧小鼠具有预先存在的免疫遮掩的移植物(箭头)。在图6的右图中的中间小鼠先前已植入C57BL/6同种异体ESC，但排斥了所述移植物(尽管不局限于理论，但排斥可能是由于针对C57BL/6细胞的预先形成的抗体)。图6的右图中的右侧的小鼠之前从未移植。所有三只小鼠均成功排斥了非免疫遮掩的移植物。右侧的小鼠较慢地排斥移植物，这可能是因为它不具有针对C57BL/6细胞的任何预先形成的抗体。
[0454] 进行了类似的实验，其中检测到野生型胚胎干细胞直至注射到具有遮掩的畸胎瘤的FVB/N小鼠中后9天(图7)。然而，在第12天，未能检测到剩余细胞的证据。对照动物是也携带遮掩的肿瘤的C57BL/6小鼠。这些小鼠中的信号随实验的时程推移而增加。
[0455] 实施例8：遮掩的和失效安全的胚胎干细胞系
[0456] 当用5种候选遮掩转基因(PD-L1、FasL、Cd47、Cd200和H2-M3)共转染失效安全C57BL/6ES细胞系(例如如WO/2016/141480中所述)时，这些转基因系均未在同种异体移植物环境中产生畸胎瘤。当通过三种另外的候选遮掩基因：Spi6、Ccl21b和Mfge8扩增所述组共转染的基因时，生成了38个克隆系。这些系之一NT2在同种异体接受者(FVB)中产生畸胎瘤。使用定量PCR测量38个克隆系(包括NT2系)(参见图8A-8H中的箭头)中的遮掩基因的表达水平(图8A-8H)。在38个克隆中，与WT ES细胞相比，NT2是Ccl21b(16,000x)、FasL(25,000x)、Cd200(1700x)、Cd47(16x)、Mfge8(34x)、Spi6(600x)和H2-M3(750x)的最高过表达。
PD-L1虽然不是克隆中最高水平的表达子，但相对于ES细胞的350x表达也显著增加。还在Project Grandiose数据集(www.stemformatics.org/project_grandiose)中检查了这些基因的表达，并且发现Ccl21b、FasL、Cd200、PD-L1和Spi6表达低于检测阈值，因此它们相对于ES细胞的表达非常高。基于该数据，这八种高度活化的基因可在诱导同种异体移植物的免疫耐受性中具有主要作用。
PD-L1虽然不是克隆中最高水平的表达子，但相对于ES细胞的350x表达也显著增加。还在Project Grandiose数据集(www.stemformatics.org/project_grandiose)中检查了这些基因的表达，并且发现Ccl21b、FasL、Cd200、PD-L1和Spi6表达低于检测阈值，因此它们相对于ES细胞的表达非常高。基于该数据，这八种高度活化的基因可在诱导同种异体移植物的免疫耐受性中具有主要作用。
[0457] 将NT2细胞注射到C57BL/6中以在FVB同种异体环境(图11A-11B)和FVB iso C57Bl/6同种异体环境中产生畸胎瘤。从第12天至第38天，同种异体畸胎瘤(n＝6)稳定生长。在500mm2的大小下，更昔洛韦(GCV)处理开始除去肿瘤的增生组分(图12A-12B，上图(图
12A)等基因畸胎瘤；底图(图12B)同种异体畸胎瘤)。20天的处理使同种异体移植物生长终止。这一实验表明：1)失效安全且遮掩的(NT2)细胞来源的畸胎瘤与GCV处理类似地响应；它们在短暂GCV暴露之后进入休眠；2)在GCV后，畸胎瘤保持稳定。不存在休眠组织的排斥迹象；和3)FVB动物中的畸胎瘤生长的动力学与C57BL/6不同。
12A)等基因畸胎瘤；底图(图12B)同种异体畸胎瘤)。20天的处理使同种异体移植物生长终止。这一实验表明：1)失效安全且遮掩的(NT2)细胞来源的畸胎瘤与GCV处理类似地响应；它们在短暂GCV暴露之后进入休眠；2)在GCV后，畸胎瘤保持稳定。不存在休眠组织的排斥迹象；和3)FVB动物中的畸胎瘤生长的动力学与C57BL/6不同。
[0458] 以高水平表达的遮掩转基因在同种异体小鼠中存活以形成畸胎瘤。在我们的系统中，遮掩转基因在非常强的合成启动子CAG下表达(如图19中的示意图中描绘)。CAG启动子是巨细胞病毒早期增强子元件、兔β-珠蛋白基因的剪接体受体以及还有鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子的组合。对许多不同的ES细胞克隆中的转基因转录物的水平进行了广泛qPCR分析，每个克隆具有不同的转基因表达水平。只有具有遮掩转基因的最高表达的那些ES克隆才能在同种异体宿主中存活。
[0459] 如图9所示，与遮掩技术有关的免疫调节基因的转录物表达水平在ES细胞克隆之间变化。同心圆以log10标度描绘。黑色粗线是1x，下一个外环是10x，且然后是100x。最内环是0.1x。所有值均归一化至阳性对照，所述阳性对照是从鼠淋巴器官分离的活化的白细胞，其天然表达免疫调节转基因。左上图示出没有转基因修饰的野生型ES细胞用于参考-它们表达很少或不表达任何相关的免疫调节转基因。相比之下，均具有所述基因的高表达的克隆NT2和克隆15(通过红色方块表示)在同种异体宿主中存活。图9中所示的所有其他克隆在同种异体宿主中都未存活。
[0460] 遮掩转基因的高表达也在图10中描绘。如图10所示，NT2细胞系和NT2来源的畸胎瘤中的所有8种遮掩转基因的表达水平均在ES细胞基因组中所有基因的前5％中，其中5种遮掩转基因的表达水平在ES细胞基因组中所有基因的前1％中。这些基因的表达在WT ES细胞中低得多，因为所述基因中的仅一种具有在基因组中所有基因的前5％中的表达水平。
[0461] 实施例9：遮掩的ESC促成同种异体畸胎瘤中的全部三个胚层
[0462] 接下来询问免疫遮掩是否允许ESC的完全多能发育潜力在畸胎瘤中显露。通过组织病理学(苏木精和曙红染色)分析了将源自C57BL/6小鼠的遮掩的和未遮掩的ESC注射到同基因和同种异体宿主中产生的畸胎瘤。图13A-13B(上图中的等基因宿主神经元、骨和柱状上皮(图13A)；以及下图中的同种异体宿主神经元、骨、柱状上皮和血管(图13B))示出从两种本底获得的代表性图像，从而证明遮掩转基因的表达不会干扰这些ES细胞的正常发育潜能，并且肿瘤良好地血管化。同基因和同种异体组织两者均未显示任何免疫细胞浸润。
[0463] 在另一个实验中，通过测试遮掩的ES细胞是否能够从所有三个胚层–内胚层、外胚6 7
层和中胚层形成细胞来测试它们是否真正是多能的(图14A-14D)。通过将10 与10之间个遮掩的ES细胞皮下注射到小鼠体内并允许它们增殖且分化成称为畸胎瘤的组织块来对此进行测定。然后在ES细胞注射后3-4周取出畸胎瘤，并且切割组织切片并用H&E染色。在显微镜下分析这些切片的细胞形态，以确定是否存在所有三个胚层。
层和中胚层形成细胞来测试它们是否真正是多能的(图14A-14D)。通过将10 与10之间个遮掩的ES细胞皮下注射到小鼠体内并允许它们增殖且分化成称为畸胎瘤的组织块来对此进行测定。然后在ES细胞注射后3-4周取出畸胎瘤，并且切割组织切片并用H&E染色。在显微镜下分析这些切片的细胞形态，以确定是否存在所有三个胚层。
[0464] 询问插入ES细胞并以高水平表达的8种遮掩转基因是否会破坏它们形成所有三个胚层的能力。它们不会。图14A-14C示出三个胚层(ec＝外胚层，图14A中所示；en＝内胚层，图14C中所示；me＝中胚层，图14B中所示)。图14D示出血管，其证实这些组织良好血管化。
[0465] 实施例10：表达遮掩转基因的ES细胞产生由转基因编码的蛋白质
[0466] 直接使用基于荧光抗体的显微术证实了在NT2 ES细胞(具有最高表达的克隆之一)中由遮掩转基因编码的蛋白质的存在(图16A-16H)。这些数据证实由转基因编码的蛋白质在ES细胞中以易于检测的水平表达，这是基于高水平的mRNA表达所预期的。
[0467] 实施例11：表达高水平的遮掩转基因的ES细胞具有典型的形态并表达共同的ES细胞标记物
[0468] 我们对遮掩的ES细胞进行了分析以确定它们是否表达ES细胞的标记物并保留正常ES细胞形态。遮掩的ES细胞具有在健康和多能ES细胞情况下观察到的典型形态(图17A)，并且也对碱性磷酸酶染色呈阳性(图17B)，其是健康和多能ES细胞的特征。此外，使用荧光抗体，我们遮掩的ES细胞对转录因子Oct4(图18A)以及SSEA(图18B)(正常多能ES细胞的两种常见标记物)染色呈阳性。这些数据表明，表达高水平的8种免疫调节遮掩转基因的ES细胞就其形态和常见ES细胞标记物的表达而言均表现为正常ES细胞。插图示出Oct4和SSEA1的染色(左下插图)与ES细胞共定位(在右上插图中使用DAPI可视化)。
[0469] 实施例12：IFNγR1 d39预防ES细胞中MHC的上调
[0470] 活化的T细胞分泌IFNγ，所述IFNγ与许多细胞类型(包括组织和来源于ES细胞的细胞)上表达的IFNγR1/R2复合物结合。IFNγ与IFNγ受体的结合诱导细胞表面上的HLA(小鼠中MHC)和HLA相关分子的上调，这增加同种异体移植物的同种异体性和免疫排斥的可能性。供体与接受者之间的HLA蛋白(也称为主要抗原)中的差异是所有同种异体移植排斥的主要原因。
[0471] 为了评价破坏IFNγ信号传导是否阻止或减少HLA上调，我们用含有野生型IFNγR1或显性阴性IFNγR1(IFNγR1 d39，其在细胞质尾中缺少39个氨基酸)转基因的背驮式整合型载体转染C57BL/6ES细胞。这些转基因在同一背驮式整合盒上所含的转基因上游的组成型CAG启动子的控制下表达。
[0472] 然后使野生型和转染的ES细胞在培养物中生长，并暴露于100ng/mL的IFNγ配体24小时。在野生型ES和IFNγR1转染的细胞中(分别是图20的左图和中图)，IFNγ暴露导致H-2kb和H-2Db主要组织相容性表面分子(MHC I类)的表达增加，但在IFNγR1 d39细胞中未如此(图20的右图)。暴露于单独的PBS没有作用。通过荧光抗体染色检测I类MHC水平，并通过流式细胞术测量平均荧光强度(MFI)来定量表达水平。这些数据表明，IFNγR1 d39的过表达完全抑制ES细胞中IFNγ介导的MHC上调，从而表明ES细胞中IFNγR1 d39的表达可用于阻止免疫系统的活化并降低免疫排斥的可能性。因此，IFNγR1d39是有用的免疫遏制性转基因，所述转基因可由本文所述的遮掩的细胞表达以减少免疫活化和移植排斥。
[0473] 实施例13：将表达VEGF抑制剂的遮掩的细胞施用至患有湿性AMD的受试者
[0474] 根据本文公开的方法，本领域的医师可治疗患有湿性AMD的患者(如人患者)，以减轻眼睛的血管化或者预防或减轻疾病进展。为此，本领域的医师可向人患者施用在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)以及在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达VEGF抑制剂(例如，VEGF-捕获剂，例如阿柏西普)的遮掩的细胞(例如，遮掩的RPE细胞或已经分化成RPE细胞的遮掩的干细胞)。可将遮掩的细胞例如通过局部施用至眼睛(例如，注射到视网膜下腔中)而施用至患者以治疗湿性AMD。可向每只受影响的眼睛施用2.5万至十万个遮掩的细胞(例如25,000、50,000、75,000或100,000个遮掩的细胞)。
[0475] 在将遮掩的细胞施用至患者后，本领域的技术人员可通过多种方法监测VEGF抑制剂的表达以及患者响应于治疗的改善。例如，医师可使用标准方法监测患者的视力和眼睛的血管化。与施用遮掩的细胞之前进行的测量相比，患者的视力有所改善或未恶化或者眼睛的血管化减少或未恶化的发现表明患者对治疗响应良好。后续剂量可根据需要确定和施用。
[0476] 实施例14：向患有帕金森氏病(PD)的受试者施用遮掩的多巴胺能神经元
[0477] 根据本文公开的方法，本领域的医师可治疗患有PD的患者(如人患者)，以减轻PD的运动症状(例如，运动迟缓、震颤或僵直)或预防或减轻疾病进展。为此，本领域的医师可向人患者施用在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及SerpinB9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)的遮掩的细胞(例如，已进行修饰以表达遮掩的转基因的多巴胺能神经元或已分化成多巴胺能神经元的遮掩的干细胞)。可将遮掩的细胞例如通过局部施用至中枢神经系统(例如，立体定向注射到黑质中)而施用至患者以治疗PD。可施用2.5万至十万个遮掩的细胞(例如25,000、50,000、75,000或100,000个遮掩的细胞)。可任选地向患者施用PD的另外疗法，如多巴胺激动剂。
[0478] 在将遮掩的细胞施用至患者后，本领域的技术人员可通过多种方法监测患者响应于治疗的改善。例如，医师可使用标准神经学测试来监测患者的运动。与施用遮掩的细胞之前进行的测量相比，患者的运动症状有所改善或未恶化的发现表明患者对治疗响应良好。后续剂量可根据需要确定和施用。
[0479] 实施例15：向患有心肌梗塞的受试者施用遮掩的心肌细胞
[0480] 根据本文公开的方法，本领域技术人员可治疗最近患有心肌梗塞的患者(如人患者)以改善心脏功能(例如，替代死亡或受损的心肌细胞)。为此，本领域的医师可向人患者施用在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及SerpinB9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)的遮掩的细胞(例如，遮掩的心肌细胞或已分化成心肌细胞的遮掩的干细胞)。可将遮掩的细胞例如通过局部施用至心脏(例如，注射到心肌中)而施用至患者，以促进心肌梗塞后的恢复。可将细胞作为单一疗法注射到心肌中，或者可在进行搭桥手术或另一种开放性心脏手术程序期间递送细胞。可施用一百万至五十亿个遮掩的心肌细胞(例如，1x 106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、1x 107、2x 107、3x 107、4x 107、5x 107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107或1x 108、2x
8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9
10、3x 10、4x 10 、5x 10 、6x 10、7x 10、8x 10、9x 10 、1x 10 、2x 10、3x 10、4x 10或5x 109个遮掩的细胞)。
8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9
10、3x 10、4x 10 、5x 10 、6x 10、7x 10、8x 10、9x 10 、1x 10 、2x 10、3x 10、4x 10或5x 109个遮掩的细胞)。
[0481] 在将遮掩的细胞施用至患者后，本领域的技术人员可通过多种方法监测患者响应于治疗的改善。例如，医师可使用标准方法(例如，EKG、超声心动图、血管造影、应激测试或核成像)来监测患者的心脏功能。与施用遮掩的细胞之前进行的测量相比，患者的心脏功能有所改善或稳定的发现表明患者对治疗响应良好。后续剂量可根据需要确定和施用。
[0482] 实施例16：将表达TNFα抑制剂的遮掩的细胞施用至患有RA的受试者
[0483] 根据本文公开的方法，本领域的医师可治疗患有类风湿性关节炎的患者(如人患者)以减轻关节僵硬、肿胀或疼痛。为此，本领域的医师可向人患者施用在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)以及在诱导型启动子(例如，四环素响应元件)控制下表达TNFα抑制剂(例如，TNFα抑制性抗体，如阿达木单抗)的遮掩的细胞(例如，遮掩的关节成纤维细胞或已经分化成关节成纤维细胞的遮掩的干细胞)。可将遮掩的细胞例如通过局部施用至关节(例如注射到关节炎性关节，如手的关节中)而施用至患者以治疗RA。可将一百万至一亿个表达抗炎生物制剂的遮掩的关节成纤维细胞(例如，1x 106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、1x 107、2x 107、3x 107、4x 107、5x 107、6x 107、7x 107、
8x 107、9x 107或1x 108个遮掩的关节成纤维细胞)施用至每个受影响的关节。当患者经历RA症状的发作时，可用四环素或强力霉素治疗患者以驱动TNFα抑制剂的表达。当患者的发作已经消退后，可撤回四环素或强力霉素。
8x 107、9x 107或1x 108个遮掩的关节成纤维细胞)施用至每个受影响的关节。当患者经历RA症状的发作时，可用四环素或强力霉素治疗患者以驱动TNFα抑制剂的表达。当患者的发作已经消退后，可撤回四环素或强力霉素。
[0484] 在将遮掩的细胞和四环素或强力霉素施用至患者后，本领域的技术人员可通过多种方法监测TNFα抑制剂的表达以及患者响应于治疗的改善。例如，医师可使用标准方法来监测患者的关节疼痛、肿胀和僵硬。与施用遮掩的细胞之前进行的测量相比，患者的关节疼痛、肿胀和僵硬减轻的发现表明患者对治疗响应良好。后续剂量可根据需要确定和施用。
[0485] 实施例17：将表达胰岛素的遮掩的细胞施用至患有1型糖尿病的患者
[0486] 根据本文公开的方法，本领域的医师可治疗患有1型糖尿病的患者(如类患者)以增加胰岛素水平。为此，本领域的医师可向人患者施用在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)以及在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达胰岛素的遮掩的细胞(例如，遮掩的干细胞、遮掩的胰腺β细胞或已经分化成胰腺β细胞的遮掩的干细胞)。可将遮掩的细胞例如通过皮下注射(例如，以产生遮掩的皮下组织)而施用至患者以治疗1型糖尿病。可皮下施用一百万至三十亿个表达胰岛素的遮掩的细胞(例如，1x 106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、1x 107、2x 107、3x 107、4x 107、5x 107、6x 107、7x 107、8x
107、9x 107或1x 108、2x 108、3x 108、4x 108、5x 108、6x 108、7x 108、8x 108、9x 108、1x
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10、2x 10或3x 10个遮掩的细胞)。
107、9x 107或1x 108、2x 108、3x 108、4x 108、5x 108、6x 108、7x 108、8x 108、9x 108、1x
9 9 9
10、2x 10或3x 10个遮掩的细胞)。
[0487] 在将遮掩的细胞施用至患者后，本领域的技术人员可通过多种方法监测患者的表达响应于治疗的改善。例如，医师可使用标准方法监测胰岛素水平或1型糖尿病的症状(例如，意外的体重减轻、疲劳或视力模糊)。与施用遮掩的细胞之前进行的测量相比，患者的胰岛素水平升高或1型糖尿病的症状减轻的发现表明患者对治疗响应良好。后续剂量可根据需要确定和施用。
[0488] 实施例18：将表达因子VIII的遮掩的细胞施用至患有血友病的患者
[0489] 根据本文公开的方法，本领域的医师可治疗患有血友病的患者(如人患者)以增加凝血因子的水平或减轻过度出血或瘀伤。为此，本领域的医师可向人患者施用在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)以及在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达因子VIII的遮掩的细胞(例如，遮掩的干细胞、遮掩的内皮细胞或已经分化成内皮细胞的遮掩的干细胞)。可将遮掩的细胞例如通过皮下注射(例如，以产生遮掩的皮下组织)而施用至患者以治6
疗血友病。可皮下施用一百万至三十亿个表达因子VIII的遮掩的细胞(例如，1x 10 、2x
106、3x 106、4x106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、1x 107、2x 107、3x107、4x 107、5x
107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107或1x 108、2x 108、3x 108、4x 108、5x 108、6x 108、7x
108、8x 108、9x 108、1x 109、2x 109或3x 109个遮掩的细胞)。
疗血友病。可皮下施用一百万至三十亿个表达因子VIII的遮掩的细胞(例如，1x 10 、2x
106、3x 106、4x106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、1x 107、2x 107、3x107、4x 107、5x
107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107或1x 108、2x 108、3x 108、4x 108、5x 108、6x 108、7x
108、8x 108、9x 108、1x 109、2x 109或3x 109个遮掩的细胞)。
[0490] 在将遮掩的细胞施用至患者后，本领域的技术人员可通过多种方法监测患者的表达响应于治疗的改善。例如，医师可使用标准方法来监测因子VIII水平或血友病的症状(例如，过度出血或频繁的瘀伤)。与施用遮掩的细胞之前进行的测量相比，患者的因子VIII水平升高或血友病的症状减轻的发现表明患者对治疗响应良好。后续剂量可根据需要确定和施用。
[0491] 实施例19：将表达葡糖脑苷脂酶的遮掩的细胞施用至患有戈谢病的受试者
[0492] 根据本文公开的方法，本领域的医师可治疗患有戈谢病的患者(如人患者)以减少葡糖脑苷脂的累积或减轻戈谢病的症状(例如，疲劳、贫血、低血液血小板计数、肝脏或脾脏肿大)。为此，本领域的医师可向人患者施用在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)以及在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达葡糖脑苷脂酶的遮掩的细胞(例如，遮掩的干细胞)。可将遮掩的细胞例如通过皮下注射(例如，以产生遮掩的皮下组织)而施用至患者以治疗戈谢病。可皮下施用一百万至三十亿个表达葡糖脑苷脂酶的遮掩的细胞(例如，1x 106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、1x 107、2x 107、3x 107、4x
107、5x 107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107或1x 108、2x 108、3x 108、4x 108、5x 108、6x
108、7x 108、8x 108、9x 108、1x 109、2x 109或3x 109个遮掩的细胞)。
107、5x 107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107或1x 108、2x 108、3x 108、4x 108、5x 108、6x
108、7x 108、8x 108、9x 108、1x 109、2x 109或3x 109个遮掩的细胞)。
[0493] 在将遮掩的细胞施用至患者后，本领域的技术人员可通过多种方法监测患者的表达响应于治疗的改善。例如，医生可使用标准方法监测葡糖脑苷脂的累积或戈谢病的症状(例如，疲劳、贫血、血小板计数低、肝脏或脾脏肿大)。与施用遮掩的细胞之前进行的测量相比，患者的葡糖脑苷脂累积或戈谢病的症状减轻的发现表明患者对治疗响应良好。后续剂量可根据需要确定和施用。
[0494] 实施例20：将遮掩的细胞施用至接受肝移植的受试者
[0495] 根据本文公开的方法，本领域的医师可治疗正在接受肝移植的患者(如人患者)以降低移植排斥的风险。为此，本领域的医师可向人患者施用在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)的遮掩的细胞(例如，遮掩的干细胞、遮掩的干细胞或已分化成肝细胞的遮掩的干细胞)。遮掩的细胞可例如通过注射到肝脏中或移植的肝脏的部位附近而施用至患者以降低移植排斥的风险。可将一百万至一千亿个遮掩的细胞(例如，1x 106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x106、9x 106、1x 107、2x 107、3x 107、4x 107、5x 107、6x 107、
7x107、8x 107、9x 107、1x 108、2x 108、3x 108、4x 108、5x 108、6x108、7x 108、8x 108、9x
108、1x 109、2x 109、3x 109、4x 109、5x109、6x 109、7x 109、8x 109、9x 109、1x 1010、2x 1010、
3x 1010、4x 1010、5x 1010、6x 1010、7x 1010、8x 1010、9x 1010或1x 1011个遮掩的细胞)施用至肝脏或肝脏附近。
7x107、8x 107、9x 107、1x 108、2x 108、3x 108、4x 108、5x 108、6x108、7x 108、8x 108、9x
108、1x 109、2x 109、3x 109、4x 109、5x109、6x 109、7x 109、8x 109、9x 109、1x 1010、2x 1010、
3x 1010、4x 1010、5x 1010、6x 1010、7x 1010、8x 1010、9x 1010或1x 1011个遮掩的细胞)施用至肝脏或肝脏附近。
[0496] 在将遮掩的细胞施用至患者后，本领域的技术人员可通过多种方法监测患者的表达响应于治疗的改善。例如，医师可使用标准方法监测患者的预测移植排斥的症状。与施用一种或多种免疫遏制剂的受试者中观察到的移植排斥等效的移植排斥结果的发现表明患者对治疗响应良好。后续剂量可根据需要确定和施用。
[0497] 实施例21：向患有1型糖尿病的受试者施用表达胰岛素的遮掩的且失效安全的细胞
[0498] 根据本文公开的方法，本领域的医师可治疗患有1型糖尿病的患者(如类患者)以提高胰岛素水平。为此，本领域的医师可向人患者施用在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)以及在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达胰岛素的遮掩的细胞(例如，遮掩的干细胞、遮掩的胰腺β细胞或已经分化成胰腺β细胞的遮掩的干细胞)。还可修饰遮掩的细胞以通过将CDL的表达与编码阴性选择性标记物的DNA序列的表达联系起来而允许控制其增殖。例如，可修饰遮掩的细胞以在两个CDL基因座(例如Cdk1和Top2A)中包含纯合的ALINK(例如，HSV-TK系统)。可将遮掩的细胞例如通过皮下注射(例如，以产生遮掩的皮下组织)而施用至患者以治疗1型糖尿病。可皮下施用一百万至三十亿个表达胰岛素的遮掩的细胞(例如，1x 106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、1x 107、2x 107、3x 107、4x 107、5x 107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107或1x 108、2x 108、3x 108、4x 108、5x
108、6x 108、7x 108、8x 108、9x 108、1x 109、2x 109或3x 109个遮掩的细胞)。
108、6x 108、7x 108、8x 108、9x 108、1x 109、2x 109或3x 109个遮掩的细胞)。
[0499] 在将遮掩的细胞施用至患者后，本领域的技术人员可通过多种方法监测患者的表达响应于治疗的改善。例如，医师可使用标准方法监测胰岛素水平或1型糖尿病的症状(例如，意外的体重减轻、疲劳或视力模糊)。与施用遮掩的细胞之前进行的测量相比，患者的胰岛素水平升高或1型糖尿病的症状减轻的发现表明患者对治疗响应良好。后续剂量可根据需要确定和施用。
[0500] 本领域的技术人员还可监测遮掩的皮下组织的大小。如果看起来遮掩的皮下组织正变得致瘤，则从业人员可将更昔洛韦施用至受试者以消除增殖遮掩的细胞。非增殖遮掩的细胞将表达CDL，并且因此将不被更昔洛韦治疗消除。
[0501] 实施例22：向患有1型糖尿病的受试者施用表达胰岛素的遮掩的且失效安全的细胞
[0502] 根据本文公开的方法，本领域的医师可治疗患有1型糖尿病的患者(如人类患者)以增加胰岛素水平。为此，本领域的医师可向人患者施用在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达PD-L1、HLA-G(H2-M3)、Cd47、Cd200、FASLG(FasL)、Ccl21(Ccl21b)、Mfge8以及Serpin B9(Spi6)中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种)以及在组成型启动子(例如，CMV或CAG)控制下表达胰岛素的遮掩的细胞(例如，遮掩的干细胞、遮掩的胰腺β细胞或已经分化成胰腺β细胞的遮掩的干细胞)。还可修饰遮掩的细胞以通过将CDL的表达与编码诱导型活化因子系统的DNA序列的表达联系起来而允许控制其增殖。例如，可将dox-桥插入两个CDL(例如Cdk1和Top2A)中，以在遮掩的细胞中的两个CDL中产生纯合修饰，以使得在存在诱导剂(例如强力霉素)的情况下，dox-桥允许CDL表达，从而允许细胞分裂和增殖。可将遮掩的细胞例如通过皮下注射(例如，以产生遮掩的皮下组织)而施用至患者以治疗1型糖尿病。可皮下施用一百万至三十亿个表达胰岛素的遮掩的细胞(例如，1x 106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、6x 106、7x 106、8x 106、9x 106、1x 107、2x 107、3x 107、4x 107、5x 107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107或1x 108、2x 108、3x 108、4x
108、5x 108、6x 108、7x 108、8x 108、9x 108、1x 109、2x 109或3x 109个遮掩的细胞)。
108、5x 108、6x 108、7x 108、8x 108、9x 108、1x 109、2x 109或3x 109个遮掩的细胞)。
[0503] 在将遮掩的细胞施用至患者后，本领域的技术人员可通过多种方法监测患者的表达响应于治疗的改善。例如，医师可使用标准方法监测胰岛素水平或1型糖尿病的症状(例如，意外的体重减轻、疲劳或视力模糊)。与施用遮掩的细胞之前进行的测量相比，患者的胰岛素水平升高或1型糖尿病的症状减轻的发现表明患者对治疗响应良好。后续剂量可根据需要确定和施用。如果从业者确定受试者需要更高水平的胰岛素，则从业者可通过用强力霉素治疗受试者来使遮掩的细胞增殖。一旦达到所需的胰岛素水平，就可停止用强力霉素治疗，并且遮掩的细胞将停止增殖。
[0504] 表5：预测的CDL(ID是指EntrezGene标识号；CS得分是指Wang等人，2015中提供的CRISPR得分平均值；功能是指基因座的已知或预测的功能，预测是基于GO术语，如基因本体联盟(Gene Ontology Consortium)网站http://geneontology.org/中所列出；功能性类别是指基于GO术语预测的功能的4种细胞功能类别；CDL(基础)是指发明人用来预测基因是CDL的信息，预测是基于CS得分、可用基因敲除(KO)数据、基因功能和WO 2016141480中提供的实验数据)。
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