检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
阅读：4发布：2020-07-26
专利汇可以提供检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种检测磺胺类药物的胶体金 免疫层析 试纸 条，包括样品垫、结合垫、 硝酸 纤维 素包被膜、吸 水 垫及PVC 底板 ，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸 纤维素 包被膜及所述吸水垫依次搭接在所述PVC底板上，所述结合垫包被设有磺胺类单克隆 抗体 -胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有磺胺类药物 抗原 ，所述质控线包被有羊抗鼠IgG；本发明同时公开了上述胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括胶体金的制备、金标抗体的制备及纯化及试纸条的组装步骤。本发明的胶体金免疫层析试纸条具有特异性强、灵敏度高、操作简便，检测快速、准确并适合现场使用的特点。，下面是检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水垫依次搭接在所述PVC底板上，其特征在于：所述结合垫包被设有磺胺类单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有磺胺类药物抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
2.如权利要求1所述的一种检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、胶体金的制备：取1个250 mL烧杯，加入100 mL 0.01%氯金酸溶液，于恒温磁力搅拌器上使用温度档350 ℃对其进行加热，转速为300r/min，加热至沸腾状态后，沸腾时的实际温度为100 ℃，向烧杯中快速加入500 µL 1%柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变为红色后再加热10 min，直至溶液透亮，冷却至室温，4℃密封保存，即制得胶体金；
步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7.4的所述胶体金1 mL于1.5 mL离心管中，向离心管中加入3µg/ml的磺胺类药物单克隆抗体，用涡旋仪涡旋10 min后静置20 min；向离心管中加入100 µL 10% BSA溶液，用涡旋仪涡旋10min，静置10 min，制得金标抗体，即磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物；
同时，将制得的金标抗体溶液于4 ℃ 2500 r/min，离心10 min，去除下层沉淀，将上清液转到另一离心管中，于4 ℃ 9000 r/min，离心30 min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液稀释至原体积的1/20，于4 ℃保存备用；
步骤三、试纸条的组装：（1）将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底板上，吸水垫压住NC膜上方1-2 mm；（2）将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切割成4 mm宽的试纸条；（3）将样品垫和结合垫切成4 mm宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗体溶液中，并于37℃烘干，制得金标垫；（4）烘干后的金标垫剪成1 cm长的小块并贴于PVC底板上，金标垫压住NC膜下方1-2 mm，同时用样品垫压住金标垫下方1-2 mm，根据试纸条长度修剪样品垫；（5）在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被磺胺类药物抗原和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速度40mm/s，单位喷量：检测线为0.8μL/cm，质控线为1.0μL/cm，使得磺胺类药物抗原包被浓度为0.05 mg/mL；羊抗鼠IgG包被浓度为0.8 mg/mL。
3.如权利要求2所述的一种检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：在所述步骤三（3）中，还包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫与金标结合垫用切条机分别切成4 mm宽的长条，用含有5%的蔗糖、5% BSA和终体积浓度为
0.1%的pH为7.4的0.01 mol/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37 ℃条件下烘干12 h备用。
4.如权利要求2所述的一种检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗：首先将试验所用容器在重铬酸钾洗液中浸泡24 h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡1 min后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中37℃进行干燥处理，备用。
检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 磺胺类药物(SAs)是具有对氨基苯磺酰胺这一母核结构的一类药物的总称，多被用来预防和治疗感染性疾病。磺胺类药物的发展至今已有70多年的历史，先后合成的磺胺类药物多达8500种，其中，药物毒性作用小、治疗效果好的有几十种，临床上常用的则有20多种，如SD、SMZ、SM2等。磺胺类药物是最早用于抗感染的合成药，具有广泛的抗菌作用，能很好的抑制大多数的革兰氏菌，也可以较好的抑制沙门氏菌、大肠杆菌和某些放线菌、衣原体等病菌。虽然1940年以后，新出现的各种抗生素逐渐取代了磺胺类药物的使用，但该类药物以其抗菌作用广泛、性质稳定、价格便宜等优点，仍被广泛的用于畜牧和水产养殖业中，来预防和治疗细菌感染性疾病，或被用作动物饲料添加剂，使动物饲料的利用率更高，同时也加快动物的生长速度。
[0003] 磺胺类药物可以通过各种途径进入动物体内，长期使用或使用不当时，药物会在动物体内残留并累积，当转移到肉、蛋、乳等食品中时，会对人体健康造成危害，主要表现为细菌的耐药性、过敏反应、对人体器官的毒性作用。 磺胺类药物残留损害泌尿系统，导致肾损伤，药物的抗原性可以刺激体内抗体的形成，造成过敏反应，主要表现为皮疹、药热、光敏性皮炎等症状，当产生剥脱性皮炎、多形性红斑时，可导致多器官衰竭而死亡。长时间摄入含有磺胺药物超标的食品，会使骨髓白细胞的生长受到抑制，引起再生障碍性贫血、溶血性贫血、血小板减少症。当细菌对某一磺胺药物形成耐药性以后，对其他的磺胺药也容易形成交叉的耐药性，长时间食用含有残留的磺胺药物的食物后，残留的药物除对人体产生毒副作用外，也容易产生耐药菌株，使药物失去治疗疾病的价值。
[0004] 目前，常用于检测磺胺药物残留量的方法主要包括：理化分析法、微生物学检测法和免疫分析检测法。常见的理化分析检测法有高效液相色谱法、色谱-质谱联用技术、薄层色谱法、毛细管电泳法等，这些检测方法灵敏度高，检测结果可靠，常作为确证方法检测药物残留，但设备昂贵，样品前处理过程复杂，对操作人员要求高，耗时较长，不适合批量样品的快速检测。微生物学检测法不需要专业昂贵的仪器，但操作耗时长，特异性、敏感性差，容易受其他药物的干扰，在定量上尚不成熟，检测结果有时不能满足国家最高残留限量的要求，不能满足现代检测的需要。随着免疫学和免疫技术的飞速发展，免疫分析法迅速发展起来，成为检测药物残留的一种新型方法。免疫分析法主要是利用抗原、抗体的特异性结合来检测药物、蛋白质、激素、微生物等各种物质，主要分为：放射性免疫法、酶联免疫吸附法、免疫传感器法、胶体金免疫层析技术等。胶体金免疫层析技术是一种新型的免疫标记技术，是在免疫层析的基础上建立起来的，以胶体金为示踪物与抗原、抗体特异性反应相结合的一种检测技术。该检测方法结果判读简单，不需要专业的操作人员，检测时间短，携带方便，特别适合大批量样品的药物残留的快速筛查。
[0005] 在现有技术中，利用胶体金免疫法检测磺胺类药物残留的研究也有不少，但大都是针对单个磺胺药物残留检测法的研究。王浩等研制了检测SM2的胶体金免疫试纸条，适用于检测牛奶样品，最低检测限：25ng/mL，冯梁采用胶体金免疫层析技术，建立了检测SM2残留的方法，研制的试纸条对SM2标准液的检出限达到了5ng/mL，猪尿样品的检出限：50 ng/mL，用市售的ELISA试剂盒检测的48份猪尿样品，试纸条法与ELISA法检测的阳性结果符合率可达96.9%。邹新海成功研制了检测SMZ的胶体金免疫试纸条，优化了实验条件，最终试纸条的检出限：100ng/mL，与其他药物无交叉性反应，在牛奶样品中的加标回收率为92.4%~112.6%。李奎等建立了快速检测磺胺类药物残留的免疫胶体金法，适用于检测鸡蛋和鸡肉样品，对SMM、SMD、SDM、SD四种磺胺药物的检出限均为10ng/mL，样品回收率为44.8%~60.9%。而临床、养殖中常用的磺胺药物有二十多种，在实际应用中，研究检测某一种磺胺药物残留的方法有很大局限性，多残留检测的方法更具有实际研究的价值。
[0006] 有鉴于此，本发明人研究和设计了一种检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，本案由此产生。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、操作简便，检测快速、准确并适合现场使用的专门用于检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，以便对多种磺胺类药物进行同时检测。
[0008] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：一种检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水垫依次搭接在所述PVC底板上，所述结合垫包被设有磺胺类单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有磺胺类药物抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
[0009] 一种检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：步骤一、胶体金的制备：取1个250 mL烧杯，加入100 mL 0.01%氯金酸溶液，于恒温磁力搅拌器上使用温度档350 ℃对其进行加热，转速为300r/min，加热至沸腾状态后，沸腾时的实际温度为100 ℃，向烧杯中快速加入500 µL 1%柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变为红色后再加热10 min，直至溶液透亮，冷却至室温，4℃密封保存，即制得胶体金；
步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7.4的所述胶体金1 mL于1.5 mL离心管中，向离心管中加入3µg/ml的磺胺类药物单克隆抗体，用涡旋仪涡旋10 min后静置20 min；向离心管中加入100 µL 10% BSA溶液，用涡旋仪涡旋10min，静置10 min，制得金标抗体，即磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物；
同时，将制得的金标抗体溶液于4 ℃ 2500 r/min，离心10 min，去除下层沉淀，将上清液转到另一离心管中，于4 ℃ 9000 r/min，离心30 min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液稀释至原体积的1/20，于4 ℃保存备用；
步骤三、试纸条的组装：（1）将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底板上，吸水垫压住NC膜上方1-2 mm；（2）将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切割成4 mm宽的试纸条；（3）将样品垫和结合垫切成4 mm宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗体溶液中，并于37℃烘干，制得金标垫；（4）烘干后的金标垫剪成1 cm长的小块并贴于PVC底板上，金标垫压住NC膜下方1-2 mm，同时用样品垫压住金标垫下方1-2 mm，根据试纸条长度修剪样品垫；（5）在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被磺胺类药物抗原和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速度40mm/s，单位喷量：检测线为0.8μL/cm，质控线为1.0μL/cm，使得磺胺类药物抗原包被浓度为0.05 mg/mL；羊抗鼠IgG包被浓度为0.8 mg/mL。
步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7.4的所述胶体金1 mL于1.5 mL离心管中，向离心管中加入3µg/ml的磺胺类药物单克隆抗体，用涡旋仪涡旋10 min后静置20 min；向离心管中加入100 µL 10% BSA溶液，用涡旋仪涡旋10min，静置10 min，制得金标抗体，即磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物；
同时，将制得的金标抗体溶液于4 ℃ 2500 r/min，离心10 min，去除下层沉淀，将上清液转到另一离心管中，于4 ℃ 9000 r/min，离心30 min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液稀释至原体积的1/20，于4 ℃保存备用；
步骤三、试纸条的组装：（1）将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底板上，吸水垫压住NC膜上方1-2 mm；（2）将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切割成4 mm宽的试纸条；（3）将样品垫和结合垫切成4 mm宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗体溶液中，并于37℃烘干，制得金标垫；（4）烘干后的金标垫剪成1 cm长的小块并贴于PVC底板上，金标垫压住NC膜下方1-2 mm，同时用样品垫压住金标垫下方1-2 mm，根据试纸条长度修剪样品垫；（5）在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被磺胺类药物抗原和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速度40mm/s，单位喷量：检测线为0.8μL/cm，质控线为1.0μL/cm，使得磺胺类药物抗原包被浓度为0.05 mg/mL；羊抗鼠IgG包被浓度为0.8 mg/mL。
[0010] 作为实施例的优选方式，在所述步骤三（3）中，还包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫与金标结合垫用切条机分别切成4 mm宽的长条，用含有5%的蔗糖、5% BSA和终体积浓度为0.1%的pH为7.4的0.01 mol/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37 ℃条件下烘干12 h备用。
[0011] 作为实施例的优选方式，还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗：首先将试验所用容器在重铬酸钾洗液中浸泡24 h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡1 min后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中37℃进行干燥处理，备用。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有下列优点：1、本发明的检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短等优点，可以同时检测出12种磺胺类药物；
2、本发明的检测试纸条不需要任何特殊仪器、设备，可现场操作，检测成本低；
3、本发明的检测试纸条操作简便，不需要专业人员操作；
4、本发明对样品垫与金标垫进行了前处理，使得样品垫与金标垫具有优异的吸水能力及释放能力，进而大大提高了检测能力；
5、本发明对试验所用容器都进行清洗，最终增强了金标抗体的稳定性；
6、本发明可以同时检测液体样品和组织样品，无需分开检测，而传统的试纸条对于这两种样品是分开检测的；
7、本发明的胶体金标记抗体时最佳蛋白标记量的确定采用了氯化钠破坏法与性能实验相结合的方法，在提高检测的灵敏度的同时，节省了抗体使用量。
说明书附图
2、本发明的检测试纸条不需要任何特殊仪器、设备，可现场操作，检测成本低；
3、本发明的检测试纸条操作简便，不需要专业人员操作；
4、本发明对样品垫与金标垫进行了前处理，使得样品垫与金标垫具有优异的吸水能力及释放能力，进而大大提高了检测能力；
5、本发明对试验所用容器都进行清洗，最终增强了金标抗体的稳定性；
6、本发明可以同时检测液体样品和组织样品，无需分开检测，而传统的试纸条对于这两种样品是分开检测的；
7、本发明的胶体金标记抗体时最佳蛋白标记量的确定采用了氯化钠破坏法与性能实验相结合的方法，在提高检测的灵敏度的同时，节省了抗体使用量。
说明书附图
[0013] 图1为本发明胶体金免疫层析试纸条的结构示意图；图2为本发明实施例4性能评价SMD标准品测试结果图；其中，SMD浓度依0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；
图3为本发明实施例4性能评价八种磺胺药物灵敏度测试结果图；
图4为本发明实施例4性能评价试纸条的特异性检测结果图；
图5 为本发明实施例4性能评价试纸条稳定性测试结果图；
图6为本发明实施例5样本测试的牛奶样品检测结果图；
图7为本发明实施例5样本测试的猪肉样品检测结果图；
图8为本发明实施例5样本测试的鱼肉提取液检测结果图。
图3为本发明实施例4性能评价八种磺胺药物灵敏度测试结果图；
图4为本发明实施例4性能评价试纸条的特异性检测结果图；
图5 为本发明实施例4性能评价试纸条稳定性测试结果图；
图6为本发明实施例5样本测试的牛奶样品检测结果图；
图7为本发明实施例5样本测试的猪肉样品检测结果图；
图8为本发明实施例5样本测试的鱼肉提取液检测结果图。
具体实施方式
[0014] 实施例1
[0015] 如图1所示，本发明揭示了一种用于检测水产品中四环素类药物的胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素包被膜3、吸水垫4及PVC底板5，所述样品垫1、所述结合垫2、所述硝酸纤维素包被膜3及所述吸水垫4依次搭接在所述PVC底板5上：
所述结合垫2包被设有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜3上设有检测线31和质控线32，所述检测线31包被有磺胺类药物抗原，所述质控线32包被有羊抗鼠IgG。
所述结合垫2包被设有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜3上设有检测线31和质控线32，所述检测线31包被有磺胺类药物抗原，所述质控线32包被有羊抗鼠IgG。
[0016] 实施例2
[0017] 一种检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：步骤一、胶体金的制备：取1个250 mL烧杯，加入100 mL 0.01%氯金酸溶液，于恒温磁力搅拌器上使用温度档350 ℃对其进行加热，转速为300r/min，加热至沸腾状态后，沸腾时的实际温度为100 ℃，向烧杯中快速加入500 µL 1%柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变为红色后再加热10 min，直至溶液透亮，冷却至室温，4℃密封保存，即制得胶体金；
步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7.4的所述胶体金1 mL于1.5 mL离心管中，向离心管中加入3µg/ml的磺胺类药物单克隆抗体，用涡旋仪涡旋10 min后静置20 min；向离心管中加入100 µL 10% BSA溶液，用涡旋仪涡旋10min，静置10 min，制得金标抗体，即磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物；
同时，将制得的金标抗体溶液于4 ℃ 2500 r/min，离心10 min，去除下层沉淀，将上清液转到另一离心管中，于4 ℃ 9000 r/min，离心30 min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液稀释至原体积的1/20，于4 ℃保存备用；
步骤三、试纸条的组装：（1）将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底板上，吸水垫压住NC膜上方1-2 mm；（2）将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切割成4 mm宽的试纸条；（3）将样品垫和结合垫切成4 mm宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗体溶液中，并于37℃烘干，制得金标垫；（4）烘干后的金标垫剪成1 cm长的小块并贴于PVC底板上，金标垫压住NC膜下方1-2 mm，同时用样品垫压住金标垫下方1-2 mm，根据试纸条长度修剪样品垫；（5）在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被磺胺类药物抗原和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速度40mm/s，单位喷量：检测线为0.8μL/cm，质控线为1.0μL/cm，使得磺胺类药物抗原包被浓度为0.05 mg/mL；羊抗鼠IgG包被浓度为0.8 mg/mL。
步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7.4的所述胶体金1 mL于1.5 mL离心管中，向离心管中加入3µg/ml的磺胺类药物单克隆抗体，用涡旋仪涡旋10 min后静置20 min；向离心管中加入100 µL 10% BSA溶液，用涡旋仪涡旋10min，静置10 min，制得金标抗体，即磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物；
同时，将制得的金标抗体溶液于4 ℃ 2500 r/min，离心10 min，去除下层沉淀，将上清液转到另一离心管中，于4 ℃ 9000 r/min，离心30 min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液稀释至原体积的1/20，于4 ℃保存备用；
步骤三、试纸条的组装：（1）将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底板上，吸水垫压住NC膜上方1-2 mm；（2）将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切割成4 mm宽的试纸条；（3）将样品垫和结合垫切成4 mm宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗体溶液中，并于37℃烘干，制得金标垫；（4）烘干后的金标垫剪成1 cm长的小块并贴于PVC底板上，金标垫压住NC膜下方1-2 mm，同时用样品垫压住金标垫下方1-2 mm，根据试纸条长度修剪样品垫；（5）在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被磺胺类药物抗原和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速度40mm/s，单位喷量：检测线为0.8μL/cm，质控线为1.0μL/cm，使得磺胺类药物抗原包被浓度为0.05 mg/mL；羊抗鼠IgG包被浓度为0.8 mg/mL。
[0018] 作为实施例的优选方式，在所述步骤三（3）中，还包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫与金标结合垫用切条机分别切成4 mm宽的长条，用含有5%的蔗糖、5% BSA和终体积浓度为0.1%的pH为7.4的0.01 mol/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37 ℃条件下烘干12 h备用。
[0019] 作为实施例的优选方式，还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗：首先将试验所用容器在重铬酸钾洗液中浸泡24 h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡1 min后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中37℃进行干燥处理，备用。
[0020] 实施例3 胶体金标记抗体时最佳蛋白标记量的确定
[0021] 氯化钠破坏法：将3mg/mL的磺胺类药物单克隆抗体稀释至浓度为0.5mg/mL后使用，稀释液为0.02mol/L pH7.4的PB缓冲液。按照表1所示，取5个1.5mL离心管，分别标为1~5号，向各个离心管中加入1mL胶体金溶液，加入适量碳酸钾，调节溶液至最佳pH，混匀，依次向各管中加入磺胺类药物单克隆抗体0µg、1µg、2µg、3µg、4µg，充分振摇混匀，静置20min，再分别向离心管中加入10% NaCl各 0.1mL，充分混匀，静置30min，观察各离心管中反应前后溶液颜色的变化。未加抗体蛋白或抗体蛋白加入量不足时，溶液会出现不同程度的聚沉现象，颜色由红变紫或变蓝，加入的抗体蛋白足够稳定整个体系时，溶液保持红色不变。因此，溶液保持红色不变的那个管中的蛋白加入量，就是胶体金标记蛋白最低稳定量，最佳蛋白标记量即为120%最低蛋白稳定量。
[0022] 表1最低标记蛋白量的确定管 号 1 2 3 4 5
胶体金﹙mL﹚ 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
碳酸钾（µL） 10 10 10 10 10
抗体（µg) 0 0.5 1 2 3
10%NaCl﹙mL﹚0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
性能实验：取3个离心管，编号为1~3号，各加1mL胶体金溶液，调节溶液至最佳pH，根据氯化钠破坏法的实验结果，实验中对1~3号管分别标记3μg、4μg、5μg的抗体蛋白，加入100μL 10% BSA封闭保护金标液，金标液经纯化、稀释，耦合到金标垫上，与NC膜组装成试纸条，分别测试100μg/L的阳性标准品和阴性PBS溶液，对比抗体加入量的不同对试纸条显色的影响，准确判断最佳标记量。
胶体金﹙mL﹚ 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
碳酸钾（µL） 10 10 10 10 10
抗体（µg) 0 0.5 1 2 3
10%NaCl﹙mL﹚0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
性能实验：取3个离心管，编号为1~3号，各加1mL胶体金溶液，调节溶液至最佳pH，根据氯化钠破坏法的实验结果，实验中对1~3号管分别标记3μg、4μg、5μg的抗体蛋白，加入100μL 10% BSA封闭保护金标液，金标液经纯化、稀释，耦合到金标垫上，与NC膜组装成试纸条，分别测试100μg/L的阳性标准品和阴性PBS溶液，对比抗体加入量的不同对试纸条显色的影响，准确判断最佳标记量。
[0023] 探索胶体金标记抗体蛋白的最佳标记量，各离心管中的溶液发生反应后颜色出现了变化，其中，1、2、3号管抗体蛋白的加入量不能够稳定胶体金体系，加入氯化钠后，产生的盐离子效应，破坏了胶体金的平衡，使溶液出现了由红色变蓝色或紫色的不同程度的聚沉现象，4号管溶液有轻微变色，说明加入氯化钠后对溶液的影响较小，5号管加入的抗体量可以稳定胶体金体系，所以加入氯化钠后对溶液没有影响，考虑到胶体金标记抗体后加入的稳定剂BSA对体系的保护作用，本探索实验初步选择4号、5号管两组为合适的抗体加入量，即最低抗体标记量为3μg/mL或4μg/mL。
[0024] 为更准确的确定最佳抗体标记量，结合氯化钠实验法的选择结果，选择抗体标记量为3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml进行了性能实验，分别对三种标记量的试纸条进行同浓度的阴性样本和阳性样本测试，三组试纸条的检测结果无差异，说明抗体标记量为3μg/mL时稳定剂BSA保护了反应体系，不影响试纸条性能，因此为节省抗体使用量和提高检测的灵敏度，本实验选择胶体金标记抗体蛋白时，最佳抗体标记量为3μg/mL。
[0025] 实施例4 试纸条的性能评价4.1 试纸条检出限的确定
[0026] 磺胺药物标准母液的配制：准确称取不同的磺胺标准品各1.000mg，各用1mL色谱纯的甲醇溶解，混匀，分别制成1.0mg/mL的磺胺标准溶液的母液，存放在棕色的试剂瓶中，冷藏备用。
[0027] 实验中配制了十二种磺胺药物的标准品母液，用PBS作为溶剂，分别将十二种磺胺药物标准品（SD、SM1、SM2、SDM、SMM、SMD、SP、SQX、SMP、SMZ、ST、SPD）的母液进行稀释，配制成一系列浓度梯度的磺胺标准品溶液，将梯度稀释的磺胺药物标准品溶液，分别滴加到试纸条的样品垫处进行层析，同时设定阴性对照试验（PBS溶液），每个浓度测试3条试纸条作为平行，10min后观察检测线消线情况，判断试纸条检测每种磺胺药物的检出限。
[0028] 优化实验条件下，制备胶体金试纸条，测定十二种磺胺标准品的试纸条检出限，以SMD的检测为例，图2所示为不同浓度的SMD标准品进行试纸条检测的结果，阴性样品PBS测试时，C、T线显色且颜色深浅基本一致，SMD含量在1ng/mL与10ng/mL之间时，检测线显色明显变浅，与C线颜色对比明显，但没有完全消失，此时1ng/mL称为此方法检测SMD浓度的最低视觉检出限，SMD含量大于10ng/mL时，T线完全消失，则10ng/mL称为SMD的最低消线检出限。
[0029] 表2 十二种磺胺药物的检出限磺胺药物名称 目视检出限（μg/L） 消线检出限（μg/L）
SMD 1 10
SM1 1 10
SM2 1 10
SMM 1 10
SD 1 20
SDM 1 20
SMP 1 20
SPD 1 20
SQX 5 50
SP 5 50
ST 25 100
SMZ 50 200
对十二种磺胺药物标准品进行检测，各药物的检出限结果见表2，由表可知，制备的试纸条对十二种磺胺药物的检出限相差较大，考虑到实际样品处理时待测物的回收率以及为消除基质影响可能对样品进行稀释等情况，会降低检测的灵敏度而无法满足对最高残留限量的要求，因此，实验中选择了试纸条检测灵敏度较高的八种磺胺药物（SMD、SM1、SM2、 SMM 、SD、SDM 、SMP、 SPD）进行后续检测研究，图3为优化方案条件下，八种磺胺药物标准品试纸条检测的结果。
4.2试纸条的特异性
SMD 1 10
SM1 1 10
SM2 1 10
SMM 1 10
SD 1 20
SDM 1 20
SMP 1 20
SPD 1 20
SQX 5 50
SP 5 50
ST 25 100
SMZ 50 200
对十二种磺胺药物标准品进行检测，各药物的检出限结果见表2，由表可知，制备的试纸条对十二种磺胺药物的检出限相差较大，考虑到实际样品处理时待测物的回收率以及为消除基质影响可能对样品进行稀释等情况，会降低检测的灵敏度而无法满足对最高残留限量的要求，因此，实验中选择了试纸条检测灵敏度较高的八种磺胺药物（SMD、SM1、SM2、 SMM 、SD、SDM 、SMP、 SPD）进行后续检测研究，图3为优化方案条件下，八种磺胺药物标准品试纸条检测的结果。
4.2试纸条的特异性
[0030] 用四环素、恩诺沙星、氯霉素、盐酸克伦特罗等四种常见兽药进行实验，每种兽药分别用PBS稀释成100ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL等不同浓度，用试纸条检测，每个浓度检测三条试纸条作为平行，同时设定阴性空白对照（PBS溶液），观察各试纸条与空白对照试纸条的检测线、质控线显色的差别。
[0031] 测试了研制的试纸条与其他四种常见兽药的交叉反应，结果表明，该抗体显示出了较好的特异性，检测结果如图4所示，从左到右依次为用PBS溶液、1μg/mL的四环素、1μg/mL的氯霉素、1μg/mL的恩诺沙星、1μg/mL的盐酸克伦特罗标准品进行试纸条测试的结果，检测线显色与对照试纸条检测线显色无明显差别，低浓度药物测试结果也是如此，表明研制的磺胺药物试纸条特异性较好。
4.3试纸条的重复性
4.3试纸条的重复性
[0032] 从A、B、C三个不同批次制备的试纸条中，随机抽取胶体金试纸条，分别用阴性样本及磺胺药物标准品进行测试，每组重复测定三个试纸条，根据显色结果判定试纸条的重复性。
[0033] 试纸条的重复性测试结果如表3所示，不同批次随机抽取的试纸条分别进行阴性和阳性测试，试纸条检测结果无差异，表明制备的磺胺药物试纸条批间、批内差异小，试纸条重复性良好。
[0034] 表3 试纸条的重复性4.4试纸条的稳定性
[0035] 将制备好的胶体金试纸条置于密封袋中，加入干燥剂，室温（15-25℃）干燥环境中保存，在试纸条保存的第1天，第15天，第30天，第60天，第90天，分别取出3条试纸条进行阴性样品（PBS）和10 ng/mL的磺胺二甲嘧啶标准品测试，观察检测线、质控线的有无、颜色的深浅及显色是否均匀等情况。
[0036] 室温（15~25℃）密封、避光、干燥条件保存的试纸条，在不同的保存时间内，分别进行阴性和阳性样本测定，结果如图5所示，保存时间为1天、15天、30天时，T、C线显色良好，线的颜色均匀，保存时间为60天和90天时，T、C线的显色都有不同程度的中空现象，显色不均匀，其中试纸条保存90天时，显色中空现象明显，应该是T、C线划线浓度较低，导致长时间保存时，蛋白在膜上的结合量减少，使得层析时显色不均匀。因此，在该条件下保存试纸条，在保证试纸条质量的前提下，试纸条的保存期至少为两个月，试纸条稳定性良好。
[0037] 实施例5 样品测试
[0038] 从厦门某超市购买了猪肉、鱼肉和纯牛奶作为实验用的实际样品，经乙腈提取，提取液净化，用液质联用仪检测，结果显示样品中不含磺胺类药物，可以作为空白样品进行待测物添加回收实验。5.1样品前处理
[0039] 磺胺类药物易溶于有机溶剂中，特别是极性有机溶剂，有机溶剂可以使样品中的蛋白质沉淀，同时使附着在蛋白质中的残留药物释放出来，从而使提取液得到净化，较少了基质的干扰。常用的有乙腈和乙酸乙酯，乙腈的极性强于乙酸乙酯，提取率较高，且有蛋白沉淀作用，乙酸乙酯带入的基质干扰较多，综合考虑，实验中选用乙腈作为组织样品中的待测物提取剂，对于猪肉、鱼肉等样品的处理过程如下：（1）称取2.00g绞碎的组织样品于50mL离心管中；
（2）加入8mL分析纯的乙腈，快速涡旋、振荡3min，充分提取待测物后，5000r/min离心
3min.，小心取出上清液，氮气吹干；
（3）用2.0mL PBST溶液溶解离心管中的残留物，涡旋振荡，使待测物充分溶解，取2mL正己烷加入溶液中，充分振摇2min，静置使溶液分层，取下层液体检测。
（2）加入8mL分析纯的乙腈，快速涡旋、振荡3min，充分提取待测物后，5000r/min离心
3min.，小心取出上清液，氮气吹干；
（3）用2.0mL PBST溶液溶解离心管中的残留物，涡旋振荡，使待测物充分溶解，取2mL正己烷加入溶液中，充分振摇2min，静置使溶液分层，取下层液体检测。
[0040] 牛奶样品的前处理方法：牛奶中的蛋白质、脂肪等大分子物质，在试纸条层析时会堵塞硝酸纤维素膜的孔径，导致层析速度变慢，检测线显色不均匀，显色变浅，胶体金残留导致膜上背景色严重等问题。实验中采用两种不同的方法，降低蛋白质对试纸条层析的影响：（1）稀释法：牛奶样品摇匀，移取1mL于离心管中，加入1mLPBST溶液，混匀，检测；
（2）离心法：牛奶样品摇匀，移取2mL于10mL离心管中，12000r/min离心5min，小心取上清液检测。
（2）离心法：牛奶样品摇匀，移取2mL于10mL离心管中，12000r/min离心5min，小心取上清液检测。
[0041] 经试纸条检测，两种方法处理的牛奶均可进行试纸条检测，其中，PBST直接稀释法无需大型仪器，操作简单，携带方便，适合现场的快速检测，达到初筛的目的，离心法适用于在实验室环境中的磺胺药物快速检测，灵敏度比稀释法更高，检测时可根据不同的环境，选用不同的牛奶样品处理方法。5.2磺胺药物标准品添加回收实验
[0042] 通过对各种磺胺药物标准品的测试，可知，研制的试纸条对八种磺胺药物的灵敏度都较高，都可以进行检测。在进行实际样品测试时，综合了养殖业中经常使用，食品检测时易超标，研制的试纸条检测灵敏度较高等三方面因素，选择了SD、SM2、SMP三种药物进行实际样品添加回收实验，鉴于同一动物源性食品中会有多种磺胺药物残留的可能性，实验中配制了常用的SD、SM2、SMD、SMZ、SMM、SQX等六种药物的混标，同时在实际样品中进行混标添加回收实验，具体方法如下：猪肉、鱼肉等组织样品：取22个离心管，分别编号为1~22，称取一定量的样品于各离心管中，1、2号管作样品空白，3~6号管分别加入SD标准品，使其浓度分别为20ng/g、35 ng/g、50 ng/g、100 ng/g，7~10号管分别加入SM2标准品，使其浓度分别为10ng/g、20 ng/g、30 ng/g、50 ng/g，11~14号管分别加入SMP标准品，使其浓度分别为10ng/g、20 ng/g、30 ng/g、50 ng/g，15~18号管分别加入6种药物的混标，使其浓度为30ng/g、50 ng/g、80 ng/g、100 ng/g，设置19、20、21、22号管分别作为4、8、12、17号管的平行管，来检验方法的重复性，各标准品加入到实际样品中以后，先充分混匀，然后进行样品前处理，所得样品提取液用试纸条进行检测，根据实验结果判定待测物的添加回收情况。
[0043] 牛奶样品：牛奶样品在进行加标回收实验时，选用了其中的离心法进行检测，具体方法为：准确移取牛奶样品2mL，分别向牛奶中添加SD、SM2、SMP、六种混标等标准品，每种标准品添加至不同的终浓度，充分混匀，12000r/min离心5min，取80μL样品进行试纸条测试，观察显色情况，判断试纸条的实用性。
[0044] 向三种实际样品中分别添加不同终浓度的SD、SM2、SMP及6种常用药物混标，经样品前处理，试纸条测试，其中，牛奶样品测试结果见图6，猪肉样品测试结果见图7，鱼肉样品测试结果见图8，鱼肉样品加标提取时，个别离心管有淡黄色物质提取出来，加样后会层析到吸水垫位置，不影响试纸条显色。由实验结果可知，牛奶样品中，SM2含量超过10ng/mL时，试纸条可以检出，SD、SMP含量超过20ng/mL时，试纸条可以检出，混标含量超过50ng/mL时，试纸条可以检出；猪肉及鱼肉样品中，SM2含量超过20ng/g时，试纸条可以检出，SD、SMP含量超过35ng/g时，试纸条可以检出，混标含量超过80ng/g时，试纸条可以检出，各平行实验检测结果一致，综合以上数据可以得出：当样品中SM2、SD、SMP、6种磺胺药物（SD、SM2、SMD、SMZ、SMM、SQX）混标的浓度高于国家限量的100μg/kg时，试纸条均可以检出，说明样品前处理方法可行，研制的试纸条具有实际应用价值，可以检测多种磺胺药物残留。
[0045] 本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
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