一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因及制备方法和应用
阅读：422发布：2023-01-31
专利汇可以提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因及制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂Lm8的基因及制备方法和应用，其方法为：首先是构建细尖狼蝎毒腺细胞cDNA文库；从细尖狼蝎毒腺cDNA文库中筛选细尖狼Kv1.3阻断剂基因Lm8的阳性克隆子；进行测序，序列分析其细尖狼蝎Kv1.3阻断剂Lm8的编码特征，确定该阻断剂Lm8的 氨 基酸序列；采用基因工程的方法构建细尖狼蝎Kv1.3阻断剂Lm8重组大肠杆菌。表达和纯化了高纯度的重组Lm8多肽；膜片钳证实了重组Lm8多肽对 电压 门 控mKv1.3的高效阻断作用。细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽在制备 治疗 或 预防 自身免疫 疾病 的药物中的应用。，下面是一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因及制备方法和应用专利的具体信息内容。
1、一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因，其特征在于：细尖狼蝎Kv1.3阻断剂 基因重组大肠杆菌Escherichia coli DH5a/Lm8/pSPORT1，CCTCC NO：M207131。
2、一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因重组大肠杆菌，其特征在于：细尖狼蝎 Kv1.3阻断剂基因重组大肠杆菌Escherichia coli Rossetta(DE3)/Lm8 /pGEX-6p-1，CCTCC NO：M207132。
3、一种分离的多肽，其基因序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
4、一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
5、一种实现权利要求1所述的一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因的制备方法， 它包括下列步骤：
A、构建细尖狼蝎毒腺组织cDNA文库，包括其毒腺用于总RNA的分离； 取500mg的蝎尾腺在液氮中研成细粉末，通过Trizol方法制备的蝎毒腺总RNA；
B、通过A步骤制备的蝎毒腺总RNA量为3mg，采用PolyA Tract mRNA分 离系统分离和纯化mRNA，紫外分光光度计测定其获得的蝎毒腺mRNA；
C、用5μgmRNA为起始量，进行cDNA的第一链和第二链合成；
D、继续双链cDNA与SalI衔接头的连接，NotI消化双链cDNA，去除双链 cDNA分子中的过量SalI衔接头和酶切片段；
E、双链cDNA与pSPORT1载体的连接和转化，毒腺细胞cDNA文库的鉴 定，从细尖狼蝎毒腺细胞cDNA文库中挑选100克隆子，测序，为一个新的细 尖狼蝎钾离子通道毒素基因。
6、一种实现权利要求2所述的细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因重组大肠杆菌的 制备方法，其步骤是：
A、根据细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因序列设计与合成PCR上游引物，8-FP: 5-GATGGATCCGATGACGATGACAAGAATGAAGCGGTGCCAACA-3和下游引物，8-RP: 5-GCTCTCGAGTCAGATAGAACATTTACA-3，用PCR技术从细尖狼蝎毒腺cDNA库 中扩增Kv1.3阻断剂基因的成熟肽编码片段，并通过表达载体转化到受体菌大肠 杆菌DE3；
B、设计的PCR引物含小肠激酶酶切位点gatgacgatgacaag:DDDDK，将PCR 扩增的Kv1.3阻断剂成熟肽编码片段经过限制性内切酶酶切；
C、回收纯化后与经BamHI和XhoI酶切的pGEX-6p-1质粒连接，连接产物 转化大肠杆菌感受态DH5a中；
D、PCR方法和双酶切法鉴定阳性克隆子，阳性克隆子测序确证Kv1.3阻断 剂成熟肽编码片段克隆到表达载体中，提取重组测序正确的重组阳性克隆子质粒 Lm8/pGEX-6p-1，转化到大肠杆菌DE3中获得重组大肠杆菌Rossetta (DE3)/Lm8/pGEX-6p-1；
E、将重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1经0.1mM的IPTG诱导， 表达了谷胱甘肽转移酶-Lm8融合蛋白，经谷胱甘肽亲和层析柱纯化得到了融合 蛋白GST-Lm8，超虑离心脱盐后用小肠激酶28℃酶切过夜，酶切产物经过高效液 相色谱HPLC将Lm8和GST分开，收集Lm8蛋白峰，低温冷冻冻干，获得了重组 细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽Lm8。
7、一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽在制备治疗或预防自身免疫疾病的药物 中的应用。
技术领域
本发明属于生物技术领域，本发明涉及一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因，该 基因的分离方法和生产这种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂。具体地说，本发明涉及一种 细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因的分离；涉及一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂重组大肠杆 菌及其构建方法；还涉及一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂的制备方法，同时还涉及 Kv1.3阻断剂在自身免疫疾病中的用途。
背景技术
蝎(scorpion)是我国的一种传统名贵中药，2000多年前就记载了蝎子的 药用史。明朝《本草纲目》更详细记载蝎主治“诸风瘾疹、中风、半身不遂、口 眼歪斜、语涩、手足抽挚，小儿惊痫风搐”等多种疾病，具有抗肿瘤，杀虫，抑 菌和抗菌功效，其作用主要来源于蝎尾毒腺分泌的毒液。毒液的主要成分是一类 由10-100个氨基酸组成的具有多种生物活性的小分子多肽，它们可以选择性、 特异性的与细胞膜上的膜蛋白相互作用，从而改变细胞对离子的通透能力，调节 细胞体积、pH、膜电位、兴奋性等多种细胞代谢过程和细胞分泌、激素作用和信 号转导等多种生理过程。因此，蝎毒素具有重要的理论研究意义和应用开发价值。 但是由于蝎毒成分复杂，结构相似，难以分离，许多成分所起的作用甚至相反， 而且有效成分往往含量低，这些无疑都限制了蝎毒的研究和应用。很有必要采用 现代分子生物学技术研究蝎毒单体成分的生理功能。
离子通道(ion channel)是细胞膜上的一类特殊亲水性蛋白质微孔道，由于离 子通道的功能、结构异常与许多疾病的发生和发展有关，因此离子通道的相关研 究已成为了各国科学家们研究的重点之一。钾离子通道是细胞膜上重要的离子通 道，是离子进出细胞的必经之路，对于细胞功能的调节具有十分重要的作用，而 且由于其功能异常会引起多种神经精神疾病，因此钾离子通道的结构与功能研究 也是目前分子神经生物学的前沿热点。近年来，电压门控的钾离子通道Kv1.3已 成为了一个治疗众多疾病的有效靶标。对钾通道Kv1.3的研究表明，Kv1.3控制 人类T淋巴细胞的活化，专一性的Kv1.3离子通道抑制剂将对T淋巴细胞的活 化产生影响，这类抑制剂很可能成为新的免疫抑制因子，可用于防治移植排斥反 应和治疗自身免疫疾病。
目前涉及蝎毒腺毒素基因的专利有7项：①东亚钳蝎毒素BmKAS在制药中 的应用，该发明涉及东亚钳蝎毒素BmKAS在制备抗外周伤害药中的应用，以及 东亚钳蝎毒素BmKAS在制备抗痛觉过敏药中的应用；②一种含有双价抗虫基因 的重组杆状病毒，该发明涉及东亚钳蝎昆虫特异性神经毒素基因BmKIT与一种 昆虫几丁质酶基因(Chi)，获得含双价抗虫基因的重组杆状病毒 AcNPV-BmKIT-Chi；③蝎抗心律失常肽重组大肠杆菌及其构建方法，该发明涉 及了一种蝎抗心律失常肽BmKIM基因重组大肠杆菌，用于大量生产可溶、具有 抗心律失常活性的重组肽；④蝎抗心律失常肽及其制备方法和应用，该发明公开 了一种蝎抗心律失常肽BmKIM及其制备方法和应用，本发明所得到的重组 BmKIM多肽具有高效抗心律失常活性，且可溶性好，产量高；⑤一种人工合成 的蝎氯离子通道神经毒素基因-rBmKCTa，该专利涉及到氯离子通道神经毒素 BmKCT基因，采用基因工程所得的改良的重组蝎氯离子通道神经毒素对神经胶 质细胞具有抑制作用，可用于制备通过抑制神经胶质细胞可以治疗的疾病的药 物；⑥一种过渡型蝎毒素BmKabT的用途，本发明公开了的过渡型蝎毒素BmKabT 的用途，它可以作为一个独特的钠通道调制剂，研究钠通道组成、结构和功能的 探针，可调节和治疗钠通道相关疾病的调制剂和药品，可制备调节或治疗高血钾性 麻痹、先天性肌强直及其它骨骼肌疾病、第三类长QT间隔症(LQT3)、原发性 心室纤颤及其他心脏疾病的调制剂或药品；⑦一种重组蝎昆虫毒素及其可溶性表 达和纯化方法，该发明涉及一种重组蝎昆虫毒素rBmKIT及其可溶性表达和纯化 方法。
尽管①②③④⑤⑥⑦专利都是关于东亚钳蝎毒素的内容，专利涉及的蝎毒素 基因BmKAS、BmKIT、BmKIM、BmKCT、BmKabT与本发明获得的来自于细 尖狼蝎(Lychas mucronatus，Lm)Lm8基因是完全不同的毒素基因，并且①② ③④⑤⑥⑦专利发明都没有涉及到钾离子通道阻断剂的功能。
离子通道(ion channel)是细胞膜上的一类特殊亲水性蛋白质微孔道，由于离 子通道的功能、结构异常与许多疾病的发生和发展有关，因此离子通道的相关研 究已成为了各国科学家们研究的重点之一。钾离子通道是细胞膜上重要的离子通 道，是离子进出细胞的必经之路，对于细胞功能的调节具有十分重要的作用，而 且由于其功能异常会引起多种神经精神疾病，因此钾离子通道的结构与功能研究 也是目前分子神经生物学的前沿热点。近年来，电压门控的钾离子通道Kv1.3已 成为了一个治疗众多疾病的有效靶标。对钾通道Kv1.3的研究表明，Kv1.3控制 人类T淋巴细胞的活化，专一性的Kv1.3离子通道抑制剂将对T淋巴细胞的活 化产生影响，这类抑制剂很可能成为新的免疫抑制因子，可用于防治移植排斥反 应和治疗自身免疫疾病。
目前涉及蝎毒腺毒素基因的专利有7项：①东亚钳蝎毒素BmKAS在制药中 的应用，该发明涉及东亚钳蝎毒素BmKAS在制备抗外周伤害药中的应用，以及 东亚钳蝎毒素BmKAS在制备抗痛觉过敏药中的应用；②一种含有双价抗虫基因 的重组杆状病毒，该发明涉及东亚钳蝎昆虫特异性神经毒素基因BmKIT与一种 昆虫几丁质酶基因(Chi)，获得含双价抗虫基因的重组杆状病毒 AcNPV-BmKIT-Chi；③蝎抗心律失常肽重组大肠杆菌及其构建方法，该发明涉 及了一种蝎抗心律失常肽BmKIM基因重组大肠杆菌，用于大量生产可溶、具有 抗心律失常活性的重组肽；④蝎抗心律失常肽及其制备方法和应用，该发明公开 了一种蝎抗心律失常肽BmKIM及其制备方法和应用，本发明所得到的重组 BmKIM多肽具有高效抗心律失常活性，且可溶性好，产量高；⑤一种人工合成 的蝎氯离子通道神经毒素基因-rBmKCTa，该专利涉及到氯离子通道神经毒素 BmKCT基因，采用基因工程所得的改良的重组蝎氯离子通道神经毒素对神经胶 质细胞具有抑制作用，可用于制备通过抑制神经胶质细胞可以治疗的疾病的药 物；⑥一种过渡型蝎毒素BmKabT的用途，本发明公开了的过渡型蝎毒素BmKabT 的用途，它可以作为一个独特的钠通道调制剂，研究钠通道组成、结构和功能的 探针，可调节和治疗钠通道相关疾病的调制剂和药品，可制备调节或治疗高血钾性 麻痹、先天性肌强直及其它骨骼肌疾病、第三类长QT间隔症(LQT3)、原发性 心室纤颤及其他心脏疾病的调制剂或药品；⑦一种重组蝎昆虫毒素及其可溶性表 达和纯化方法，该发明涉及一种重组蝎昆虫毒素rBmKIT及其可溶性表达和纯化 方法。
尽管①②③④⑤⑥⑦专利都是关于东亚钳蝎毒素的内容，专利涉及的蝎毒素 基因BmKAS、BmKIT、BmKIM、BmKCT、BmKabT与本发明获得的来自于细 尖狼蝎(Lychas mucronatus，Lm)Lm8基因是完全不同的毒素基因，并且①② ③④⑤⑥⑦专利发明都没有涉及到钾离子通道阻断剂的功能。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因，该基因小，易 于操作。
本发明的另一个目的还在于提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂重组大肠杆菌 的构建方法，方法简便，安全性高，生产成本低廉，纯化简单且产物纯度高。
本发明再有一个目的是提供一种用基因工程方法生产的细尖狼蝎Kv1.3阻 断剂的高效生物活性，细尖狼蝎Kv1.3阻断剂在制备治疗或预防自身免疫疾的病 药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明的构思为：①构建一个高质量细尖狼蝎毒腺组织 cDNA文库；②以上述①毒腺组织cDNA文库为基础，通过随机测序方法筛选到 了一个克隆子8(编号)，序列分析为一种钾离子通道毒素基因，命名为Lm8， 该菌已经保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武 汉大学，保藏日期：2007年8月29日，保藏编号：CCTCC NO：M207131，分 类命名：Escherichia coli DH5α/Lm8/pSPORT1；③构建了表达和生产重组蝎 毒素Lm8的基因工程菌，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武 汉.武汉大学，保藏日期：2007年8月29日，保藏编号：CCTCC NO：M207132， 分类命名：Escherichia coli Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1；④采用基因工 程的方法，获得了高纯度的重组蝎毒素Lm8，纯度达95％；⑤通过膜片钳方法， 测定了④获得的重组蝎毒素Lm8对电压门控钾离子通道Kv1.3的高效阻断效用， 其半效抑制剂量IC50为26.40±1.62nM。细尖狼蝎毒素Lm8在制备治疗或预防 自身免疫疾病的药物中具有重要应用价值。
本发明的一个目的在于提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因。首先构建高质 量细尖狼蝎毒腺组织cDNA文库。包括其毒腺用于总RNA的分离；取500mg 的蝎尾腺在液氮中研成细粉末，通过Trizol方法制备的蝎毒腺总RNA；制备的 蝎毒腺总RNA采用甲醛变性凝胶电泳检测其质量。
通过上述方法制备的蝎毒腺总RNA量为3mg，采用PolyATract mRNA分离 系统(购自美国Promega)分离和纯化mRNA。紫外分光光度计测定其获得的蝎 毒腺mRNA量约10μg；用5μgmRNA作为起始量，进行cDNA的第一链和第二 链合成，继续双链cDNA与SalI衔接头的连接，NotI消化双链cDNA，去除双 链cDNA分子中的过量SalI衔接头和酶切小片段，双链cDNA与pSPORT1载体 (购自美国Invitrogen)的连接和转化，毒腺细胞cDNA文库的鉴定等步骤。结 果获得了一个丰度为1.5*106个克隆子/μgcDNA。采用该方法构建的蝎毒腺cDNA 文库阳性插入率达到95％以上，细尖狼蝎的毒素基因覆盖率达到95％以上。
随机从构建好的细尖狼蝎毒腺细胞cDNA文库中挑选100克隆子，送公司 测序。序列分析表明克隆子8为一个新的细尖狼蝎钾离子通道毒素基因，命名为 Lm8。一种分离的多肽基因，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列： ggaaggaaaatgaacaaagtttgctttgtcgtcgttcttgttctcttcgtggctctggctgcatatgtgtcacctatcgaaggtgt accaacaggaggatgcccactttcggattcgctgtgtgccaaatattgcaagtcccacaaatttggcaaaaccggaagatg caccggaccaaacaagatgaaatgtaaatgtctcgtgtaataaaatgtaagcgaataaagatttgtgaatgaaaaaaaaaaa aa(图1)。
本发明的另一个目的还在于提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽。一种分 离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。Lm8的前体组织形式 编码65个氨基酸残基(SEQ ID NO：2)，由二个部分组成，即信号肽(25个残基) 和成熟肽(40个残基)： MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSPIEGVPTGGCPLSDSLCAKYCKSHKFGKTG RCTGPNKMKCKCLV(SEQ ID NO：2)，信号肽序列为前25个氨基酸残基 MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSPIEG，其成熟肽是由40个氨基酸组成： VPTGGCPLSDSLCAKYCKSHKFGKTGRCTGPNKMKCKCLV(图1)。
本发明的另一个目的在于提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂重组大肠杆菌的 构建方法(构建重组表达载体的示意图见图2)。包括设计与合成PCR上游引物 (8-FP：5-GATGGATCCGATGACGATGACAAGAATGAAGCGGTGCCAACA-3)和下游引 物(8-RP：5-GCTCTCGAGTCAGATAGAACATTTACA-3)，用PCR技术从细尖狼蝎毒 腺cDNA库中扩增Kv1.3阻断剂基因的成熟肽编码片段，并通过表达载体转化到 受体菌大肠杆菌DE3(购自美国NOVAGEN)。其特征是，设计的PCR引物含小 肠激酶酶切位点(gatgacgatgacaag：DDDDK)，将PCR扩增的Kv1.3阻断剂成熟 肽编码片段经过限制性内切酶(BamHI和XhoI)酶切，回收纯化后与经BamHI 和XhoI酶切的pGEX-6p-1(购自美国Novagen)质粒连接，连接产物转化大肠 杆菌感受态DH5a(购自中国典型培养物保藏中心)中，PCR方法和双酶切法鉴 定阳性克隆子(图3和图4)。阳性克隆子进一步测序确证Kv1.3阻断剂成熟肽 编码片段克隆到表达载体中。提取重组测序正确的重组阳性克隆子质粒Lm8/ pGEX-6p-1，转化到大肠杆菌DE3中获得重组大肠杆菌Rossetta (DE3)/Lm8/pGEX-6p-1，用于生产可溶的且有活性的重组细尖狼蝎Kv1.3阻断剂 多肽。
本发明的另一个目的在于提供一种生产细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽的基因 工程方法。将重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1经0.1mM的IPTG诱 导，高表达了谷胱甘肽转移酶-Lm8融合蛋白(GST-Lm8)(图5)，经谷胱甘肽亲 和层析柱纯化得到了高纯度的融合蛋白GST-Lm8(图5)，超虑离心脱盐后用小肠 激酶28℃酶切过夜(图5)，酶切产物经过高效液相色谱HPLC将Lm8和GST分开 (图6)，手工收集Lm8蛋白峰，低温冷冻冻干(—40℃)，获得了高纯度和可溶 性好的重组细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽Lm8，最终得率达到1mg/L。质谱分析重 组细尖狼Kv1.3阻断剂多肽Lm8与预期分子量大小一致(图7)。根据本发明的 生产方法，所得到的重组肽有以下特点：重组肽中不含有多余氨基酸残基，与由 cDNA推测的成熟肽一致；所得到的重组肽是可溶的非包涵体状态，而且产量高， 产量为1mg/L培养物。
本发明还有一个目的是提供一种用基因工程方法生产的细尖狼蝎Kv1.3阻 断剂对电压门控钾离子通道Kv1.3的高效抑制作用。包括稳定超表达人电压门控 钾离子通道Kv1.3绿色荧光蛋白细胞系Cos7/mKv1.3的构建(图8)，采用全细 胞膜片钳的方法，发现重组细尖狼蝎毒素多肽Lm8对表达于Cos7细胞系Kv1.3 电流有明显的阻断作用，且具有剂量依赖性(图9)。通过浓度依赖曲线测定了 重组细尖狼蝎毒素多肽Lm8对Kv1.3电流的半效抑制浓度IC50为26.40±1.62nM (图10)。采用本发明的方法生产的细尖狼蝎Kv1.3阻断剂具有高效抑制电压门 控的钾离子通道Kv1.3的作用，在制备治疗或预防自身免疫疾病(如哮喘、肌肉 硬化症、红斑狼疮、硬皮病、类风湿性关节炎等)的药物中有重要的应用价值。
本发明是一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因及制备方法和应用。获得了一个全 新的钾离子电压门控通道Kv1.3阻断剂基因。并且，构建了一种细尖狼蝎Kv1.3 阻断剂重组大肠杆菌，其方法简便，安全性高，生产成本低廉，纯化简单且产物 纯度高。可以大规模基因工程生产Kv1.3阻断剂，用于防治自身免疫疾病。
附图说明
图1细尖狼蝎Lm8基因及其氨基酸。
cDNA序列下方为推断的对应氨基序列；信号肽氨基酸以单下划线标记；双下 划线部分为PolyA加尾信号。
图2构建重组表达载体Lm8-pGEX-6p-1示意图。
抽提pGEX-6p-1质粒；PCR扩增Kv1.3阻断剂基因；BamHI和XhoI酶切 pGEX-6p-1和Kv1.3阻断剂基因的PCR扩增产物；酶切的质粒和片段的连接， 获得重组克隆子质粒Lm8-pGEX-6p-1。
图3PCR方法鉴定重组Lm8-pGEX-6p-1阳性克隆子。
M为DNA Marker；1为PCR阴性对照；2为PCR阳性对照；3-5为阳性转化子。
图4酶切方法鉴定重组Lm8-pGEX-6p-1阳性克隆子。
M为DNA Marker；1为Lm8基因片段的阳性对照；2为BamHI和XhoI双酶切 重组质粒Lm8-pGEX-6p-1；3为BamHI单酶切重组质粒Lm8-pGEX-6p-1。
图5重组GST-Lm8、Lm8的表达与纯化的SDS-PAGE。
A：1为标准蛋白质分子量Marker；2为重组大肠杆菌Rossetta (DE3)/Lm8/pGEX-6p-1未经IPTG诱导；3为重组大肠杆菌Rossetta (DE3)/Lm8/pGEX-6p-1经IPTG诱导；4为重组大肠杆菌Rossetta (DE3)/pGEX-6p-1未经IPTG诱导；5为重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/ pGEX-6p-1经IPTG诱导。
B：1为标准蛋白质分子量Marker；2为经谷胱甘肽亲和层析柱纯化得到了高 纯度的融合蛋白GST-Lm8；3为GST蛋白；4为HPLC纯化的Lm8蛋白；5为小 肠激酶28℃酶切过夜产物。
图6HPLC分离GST和Lm8蛋白。
箭头指示纯化的Lm8蛋白。
图7重组Lm8蛋白的质谱分析。
图8稳定超表达人电压门控钾离子通道Kv1.3绿色荧光蛋白细胞系 Cos7/mKv1.3。
图9重组Lm8蛋白对Kv1.3电流的浓度阻断效用。
图10重组Lm8蛋白对Kv1.3电流的浓度依赖曲线。
本发明的另一个目的还在于提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂重组大肠杆菌 的构建方法，方法简便，安全性高，生产成本低廉，纯化简单且产物纯度高。
本发明再有一个目的是提供一种用基因工程方法生产的细尖狼蝎Kv1.3阻 断剂的高效生物活性，细尖狼蝎Kv1.3阻断剂在制备治疗或预防自身免疫疾的病 药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明的构思为：①构建一个高质量细尖狼蝎毒腺组织 cDNA文库；②以上述①毒腺组织cDNA文库为基础，通过随机测序方法筛选到 了一个克隆子8(编号)，序列分析为一种钾离子通道毒素基因，命名为Lm8， 该菌已经保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武 汉大学，保藏日期：2007年8月29日，保藏编号：CCTCC NO：M207131，分 类命名：Escherichia coli DH5α/Lm8/pSPORT1；③构建了表达和生产重组蝎 毒素Lm8的基因工程菌，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武 汉.武汉大学，保藏日期：2007年8月29日，保藏编号：CCTCC NO：M207132， 分类命名：Escherichia coli Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1；④采用基因工 程的方法，获得了高纯度的重组蝎毒素Lm8，纯度达95％；⑤通过膜片钳方法， 测定了④获得的重组蝎毒素Lm8对电压门控钾离子通道Kv1.3的高效阻断效用， 其半效抑制剂量IC50为26.40±1.62nM。细尖狼蝎毒素Lm8在制备治疗或预防 自身免疫疾病的药物中具有重要应用价值。
本发明的一个目的在于提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因。首先构建高质 量细尖狼蝎毒腺组织cDNA文库。包括其毒腺用于总RNA的分离；取500mg 的蝎尾腺在液氮中研成细粉末，通过Trizol方法制备的蝎毒腺总RNA；制备的 蝎毒腺总RNA采用甲醛变性凝胶电泳检测其质量。
通过上述方法制备的蝎毒腺总RNA量为3mg，采用PolyATract mRNA分离 系统(购自美国Promega)分离和纯化mRNA。紫外分光光度计测定其获得的蝎 毒腺mRNA量约10μg；用5μgmRNA作为起始量，进行cDNA的第一链和第二 链合成，继续双链cDNA与SalI衔接头的连接，NotI消化双链cDNA，去除双 链cDNA分子中的过量SalI衔接头和酶切小片段，双链cDNA与pSPORT1载体 (购自美国Invitrogen)的连接和转化，毒腺细胞cDNA文库的鉴定等步骤。结 果获得了一个丰度为1.5*106个克隆子/μgcDNA。采用该方法构建的蝎毒腺cDNA 文库阳性插入率达到95％以上，细尖狼蝎的毒素基因覆盖率达到95％以上。
随机从构建好的细尖狼蝎毒腺细胞cDNA文库中挑选100克隆子，送公司 测序。序列分析表明克隆子8为一个新的细尖狼蝎钾离子通道毒素基因，命名为 Lm8。一种分离的多肽基因，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列： ggaaggaaaatgaacaaagtttgctttgtcgtcgttcttgttctcttcgtggctctggctgcatatgtgtcacctatcgaaggtgt accaacaggaggatgcccactttcggattcgctgtgtgccaaatattgcaagtcccacaaatttggcaaaaccggaagatg caccggaccaaacaagatgaaatgtaaatgtctcgtgtaataaaatgtaagcgaataaagatttgtgaatgaaaaaaaaaaa aa(图1)。
本发明的另一个目的还在于提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽。一种分 离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。Lm8的前体组织形式 编码65个氨基酸残基(SEQ ID NO：2)，由二个部分组成，即信号肽(25个残基) 和成熟肽(40个残基)： MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSPIEGVPTGGCPLSDSLCAKYCKSHKFGKTG RCTGPNKMKCKCLV(SEQ ID NO：2)，信号肽序列为前25个氨基酸残基 MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSPIEG，其成熟肽是由40个氨基酸组成： VPTGGCPLSDSLCAKYCKSHKFGKTGRCTGPNKMKCKCLV(图1)。
本发明的另一个目的在于提供一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂重组大肠杆菌的 构建方法(构建重组表达载体的示意图见图2)。包括设计与合成PCR上游引物 (8-FP：5-GATGGATCCGATGACGATGACAAGAATGAAGCGGTGCCAACA-3)和下游引 物(8-RP：5-GCTCTCGAGTCAGATAGAACATTTACA-3)，用PCR技术从细尖狼蝎毒 腺cDNA库中扩增Kv1.3阻断剂基因的成熟肽编码片段，并通过表达载体转化到 受体菌大肠杆菌DE3(购自美国NOVAGEN)。其特征是，设计的PCR引物含小 肠激酶酶切位点(gatgacgatgacaag：DDDDK)，将PCR扩增的Kv1.3阻断剂成熟 肽编码片段经过限制性内切酶(BamHI和XhoI)酶切，回收纯化后与经BamHI 和XhoI酶切的pGEX-6p-1(购自美国Novagen)质粒连接，连接产物转化大肠 杆菌感受态DH5a(购自中国典型培养物保藏中心)中，PCR方法和双酶切法鉴 定阳性克隆子(图3和图4)。阳性克隆子进一步测序确证Kv1.3阻断剂成熟肽 编码片段克隆到表达载体中。提取重组测序正确的重组阳性克隆子质粒Lm8/ pGEX-6p-1，转化到大肠杆菌DE3中获得重组大肠杆菌Rossetta (DE3)/Lm8/pGEX-6p-1，用于生产可溶的且有活性的重组细尖狼蝎Kv1.3阻断剂 多肽。
本发明的另一个目的在于提供一种生产细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽的基因 工程方法。将重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1经0.1mM的IPTG诱 导，高表达了谷胱甘肽转移酶-Lm8融合蛋白(GST-Lm8)(图5)，经谷胱甘肽亲 和层析柱纯化得到了高纯度的融合蛋白GST-Lm8(图5)，超虑离心脱盐后用小肠 激酶28℃酶切过夜(图5)，酶切产物经过高效液相色谱HPLC将Lm8和GST分开 (图6)，手工收集Lm8蛋白峰，低温冷冻冻干(—40℃)，获得了高纯度和可溶 性好的重组细尖狼蝎Kv1.3阻断剂多肽Lm8，最终得率达到1mg/L。质谱分析重 组细尖狼Kv1.3阻断剂多肽Lm8与预期分子量大小一致(图7)。根据本发明的 生产方法，所得到的重组肽有以下特点：重组肽中不含有多余氨基酸残基，与由 cDNA推测的成熟肽一致；所得到的重组肽是可溶的非包涵体状态，而且产量高， 产量为1mg/L培养物。
本发明还有一个目的是提供一种用基因工程方法生产的细尖狼蝎Kv1.3阻 断剂对电压门控钾离子通道Kv1.3的高效抑制作用。包括稳定超表达人电压门控 钾离子通道Kv1.3绿色荧光蛋白细胞系Cos7/mKv1.3的构建(图8)，采用全细 胞膜片钳的方法，发现重组细尖狼蝎毒素多肽Lm8对表达于Cos7细胞系Kv1.3 电流有明显的阻断作用，且具有剂量依赖性(图9)。通过浓度依赖曲线测定了 重组细尖狼蝎毒素多肽Lm8对Kv1.3电流的半效抑制浓度IC50为26.40±1.62nM (图10)。采用本发明的方法生产的细尖狼蝎Kv1.3阻断剂具有高效抑制电压门 控的钾离子通道Kv1.3的作用，在制备治疗或预防自身免疫疾病(如哮喘、肌肉 硬化症、红斑狼疮、硬皮病、类风湿性关节炎等)的药物中有重要的应用价值。
本发明是一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因及制备方法和应用。获得了一个全 新的钾离子电压门控通道Kv1.3阻断剂基因。并且，构建了一种细尖狼蝎Kv1.3 阻断剂重组大肠杆菌，其方法简便，安全性高，生产成本低廉，纯化简单且产物 纯度高。可以大规模基因工程生产Kv1.3阻断剂，用于防治自身免疫疾病。
附图说明
图1细尖狼蝎Lm8基因及其氨基酸。
cDNA序列下方为推断的对应氨基序列；信号肽氨基酸以单下划线标记；双下 划线部分为PolyA加尾信号。
图2构建重组表达载体Lm8-pGEX-6p-1示意图。
抽提pGEX-6p-1质粒；PCR扩增Kv1.3阻断剂基因；BamHI和XhoI酶切 pGEX-6p-1和Kv1.3阻断剂基因的PCR扩增产物；酶切的质粒和片段的连接， 获得重组克隆子质粒Lm8-pGEX-6p-1。
图3PCR方法鉴定重组Lm8-pGEX-6p-1阳性克隆子。
M为DNA Marker；1为PCR阴性对照；2为PCR阳性对照；3-5为阳性转化子。
图4酶切方法鉴定重组Lm8-pGEX-6p-1阳性克隆子。
M为DNA Marker；1为Lm8基因片段的阳性对照；2为BamHI和XhoI双酶切 重组质粒Lm8-pGEX-6p-1；3为BamHI单酶切重组质粒Lm8-pGEX-6p-1。
图5重组GST-Lm8、Lm8的表达与纯化的SDS-PAGE。
A：1为标准蛋白质分子量Marker；2为重组大肠杆菌Rossetta (DE3)/Lm8/pGEX-6p-1未经IPTG诱导；3为重组大肠杆菌Rossetta (DE3)/Lm8/pGEX-6p-1经IPTG诱导；4为重组大肠杆菌Rossetta (DE3)/pGEX-6p-1未经IPTG诱导；5为重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/ pGEX-6p-1经IPTG诱导。
B：1为标准蛋白质分子量Marker；2为经谷胱甘肽亲和层析柱纯化得到了高 纯度的融合蛋白GST-Lm8；3为GST蛋白；4为HPLC纯化的Lm8蛋白；5为小 肠激酶28℃酶切过夜产物。
图6HPLC分离GST和Lm8蛋白。
箭头指示纯化的Lm8蛋白。
图7重组Lm8蛋白的质谱分析。
图8稳定超表达人电压门控钾离子通道Kv1.3绿色荧光蛋白细胞系 Cos7/mKv1.3。
图9重组Lm8蛋白对Kv1.3电流的浓度阻断效用。
图10重组Lm8蛋白对Kv1.3电流的浓度依赖曲线。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式 限制本发明。
实施例1：蝎毒腺总RNA的提取(Trizol LS一步法：Trizo1LS购自美Invitrogen)
①取500mg的蝎尾腺在液氮中研成细粉末，加入10ml TRIZOLreagent混匀， 室温(20-25℃，以下相同)放置5分钟；②然后加入2ml氯仿混合15秒，室温放 置2-3分钟，4℃下12000g离心15分钟；③取水相加1倍体积异丙醇，室温放 置10分钟，4℃下12000g离心10分钟得RNA沉淀；④沉淀用5ml 75％乙醇洗 涤，7500g离心5分钟；⑤RNA沉淀干燥后溶于DEPC-treated water，55-60℃保 温10分钟以彻底溶解RNA。整个过程参照TR1ZOL(Total RNA Isolation)Reagent Kit推荐方法进行。
实施例2：mRNA的分离纯化
采用PolyA Tract mRNA分离系统(Promega，USA)分离和纯化mRNA，其工 作原理是基于Oligo(dT)与mRNA 3’端poly(A)尾的互补配对特性，用生物素 标记Oligo(dT)，通过它与mRNA 3’端poly(A)的退火形成杂交体，然后用标 有亲合素的磁珠和磁性分离架捕获并洗涤生物素Oligo(dT)/mRNA杂交体，最后 用无RNA酶的ddH2O将之洗脱下来，达到从总RNA中分离mRNA的目的。①样品 的制备：将RNA加入到含有32μl β-巯基乙醇的800μl的GTC中。②探针 的退火：取250pM浓度Oligo(dT)5μl，加蒸馏水至50μl；加入1.6ml预 热(70℃)的dilution buffer(dilution buffer已加入32μl β—巯基 乙醇)，与RNA混匀，70℃温育5分钟。③磁珠的活化：取1.2ml的磁珠 SA-PMPS(购自美国Promega公司)于1.5ml的离心管中；用0.5×SSC(0.15 摩尔/升的氯化钠和0.015摩尔/升的柠檬酸钠，pH7.0)重悬SA-PMPS，以 磁架吸附磁珠，原体积0.5×SSC洗涤SA-PMPS3次。④mRNA的获取：将 70℃温育的RNA与SA-PMPS混合，室温放置5分钟放磁架上吸附磁珠，弃 上清液；2ml的0.5XSSC悬浮磁珠，洗涤重复2次，最后一次尽量去除SSC； 加入无RNA酶的ddH2O至磁珠中，轻轻混匀，然后离心(12000g×3分钟) 或磁架吸附磁珠；取上清，获得mRNA。通过电泳和紫外测定mRNA的浓度 和纯度。⑤mRNA的沉淀：将④获得的mRNA中加入糖原和2.5倍体积的无 水乙醇，沉淀过夜，mRNA将用于cDNA的合成。
实施例3：第一链cDNA合成
①在1.5ml Ep管中加入2μl Not I Primer-adapter(美国INVITOGEN公 司)和6μlmRNA(含3μg mRNA)，70℃温育10min，迅速放于冰上，离心后，加 入下列成分：4μl 5X first strand buffer(美国INVITOGEN公司)；2μl 0.1M DTT；1μl 10mM dNTPs；1μl DEPC·H2O。轻轻混匀后离心，37℃放至2min；②加 入5μl逆转录酶，混匀后取2μl，加1μl[α-32P]dCTP(4μCi)(示踪管)。与上 述反应组分(样品管)同时37℃温育1h，然后放入冰上终止反应；③对于示踪 管，依次加入43μl 20mM EDTA和5μl酵母tRNA，混匀后，分别取两份10μl点 于两张滤膜上，1份用10％ TCA洗3次，每次5min，95％乙醇洗1次，空气干燥 后，放入1.5ml闪烁液中(为1#样品)；另1份空气干燥后，放入1.5ml闪烁液 (为2#样品)。另30μl示踪液，加1.5μl 7.5M NH4OAc和90μl无水乙醇(-20 ℃)，混匀后立即14,000rpm离心20min，弃上清，加入0.5ml70％无水乙醇(-20 ℃)，14,000rpm离心2min，弃上清，37℃干燥10min让乙醇挥发，溶于10μl TEN 溶液，加入10μl 2X加样缓冲液，取10μl用于碱性凝胶电泳。用[α-32P]dCTP 标记λDNA HindIII片段作分子量标记；④混匀后室温下放置15min，加入2μl 0.2 M EDTA终止反应。取6μl反应液和6ml 2X碱性电泳缓冲液混匀，电泳5h后， 用7％ TCA浸泡20min，直至溴酚兰变黄。然后用卫生纸吸干(8h左右)，进行放 射自显影；⑤对于样品管，用于第二链的合成。
实施例4：第二链cDNA合成
①冰上在样品管中依次加入下列成分；②轻轻混匀后，16℃温育2h；③加 入2μl(10units)T4 DNA聚合酶，继续16℃反应5min；④转入冰上，加入10μl 0.5M EDTA；⑤加入等体积(150μl)酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，彻底涡旋后， 室温下14,000rpm离心5min。将水相(140μl)转入另一1.5ml Ep管；⑥加入 70μl的7.5M NH4OAc和0.5ML无水乙醇(-20℃)，涡旋后，室温下14,000rpm 离心20min；⑦弃上清，加入0.5ml70％乙醇(-20℃)，同上离心2min。弃上清， 37℃干燥10min。
实施例5：双链cDNA与Sal I衔接头的连接
①用25μl DEPC·ddH2O溶解实施例4的cDNA样品，然后按下表依次加入； ②轻轻混匀，16℃反应过夜(约20h)。③用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽提和 NH4Oac/乙醇沉淀后，37℃干燥10min。
实施例6：Not I消化双链cDNA
①将实施例5的样品溶于41μl，然后按下表依次加入；②混匀后，37℃温 育2h；③用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽提一次，然后用7.5M NH4Oac/乙醇沉 淀，37℃干燥10min。④溶于70μlTEN，取1μl用于定量，其余-20℃保存备用。
实施例7：去除双链cDNA分子中的过量Sal I衔接头和酶切小片段
用nucleon extraction and purification kit(Amersham，USA)去除过 量Sal I衔接头和酶切小片段。①室温下悬浮树脂，然后取600μl加于离心柱中， 2000rpm离心10s，去掉液体。在树脂中央加入40μl上述cDNA溶液。同上离 心；②收集洗脱液用于连接反应。
实施例8：双链cDNA与pSPORT1载体的连接和转化
①在1.5ml Ep管中依次加入下列成分；②室温下反应16h；③在②反应液 中依次加入下列成分：5.0μl yeast tRNA，12.5μl 7.5M NH4Oac，70μl无水 乙醇(-20℃)。涡旋混匀后立即14000离心20min；④沉淀用70％乙醇(-20℃) 洗涤，37℃干燥后溶于4μl；⑤取2μl电击转化50μl E.coli K12 MC1061。
实施例9：毒腺细胞cDNA文库的初步鉴定
用PCR方法鉴定文库的质量，正向引物：5’TCGACCCACGCGTCCG3’(按SalI 衔接头序列设计)；反向引物：5’GAGCGGCCGCCCT153’(按NotI引物-衔接头 的序列设计)。
实施例10：随机测序策略筛选cDNA文库
随机从构建好的细尖狼毒腺细胞cDNA文库中挑选100克隆子，送上海三 博公司测序。序列录入软件为BioEdit v4.5.8(Tom Hall，1999)，同源性比较和信 号肽切割位点预测软件分别为CLUSTAL X 1.8(Thompson et al.，1997)和 PC/GENE(Intelligenetics Inc.，Switzerland)。序列分析表明克隆子8为一个全新的 毒素基因，命名为Lm8。其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列： ggaaggaaaatgaacaaagtttgctttgtcgtcgttcttgttctcttcgtggctctggctgcatatgtgtcacctatcgaaggtgt accaacaggaggatgcccactttcggattcgctgtgtgccaaatattgcaagtcccacaaatttggcaaaaccggaagatg caccggaccaaacaagatgaaatgtaaatgtctcgtgtaataaaatgtaagcgaataaagatttgtgaatgaaaaaaaaaaa aa。该基因含有一个完整的开放阅读框，有两个加尾信号aataaa。Lm8的前体组 织形式编码65个氨基酸残基，由二个部分组成，即信号肽(25个残基)和成熟 肽(40个残基)：MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSPIEGVPTGGCPLSDSLC AKYCKSHKFGKTGRCTGPNKMKCKCLV(SEQ ID NO：2)。信号肽序列为前25 个氨基酸残基MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSPIEG，其成熟毒素是由40个氨基 酸组成：VPTGGCPLSDSLCAKYCKSHKFGKTGRCTGPNKMKCKCLV(图1)。
实施例11：设计引物及PCR扩增细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因
按照SEQID NO：1所提供的细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因(Lm8基因)序列 设计PCR正向和反向引物：8-FP(8-FP： 5-GCGGGATCCGATGACGATGACAAGGTACCAACAGGAGGATGC-3)和8-RP(8-RP： 5-GCCCTCGAGTTACACGAGACATTTACA-3)，以从蝎毒腺细胞cDNA库中筛选所获 得的Lm8基因(SEQ ID NO：1)克隆子为模板，进行PCR反应，大量扩增细尖狼 蝎Kv1.3阻断剂基因的成熟肽区序列。PCR反应条件：1μl Taq聚合酶(1U)、0.5μl 四种(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)脱氧单核苷酸等比混合液(10mmol/L)、 16.5μl无菌双蒸水、2.5μl 10倍PCR缓冲液、1.5μl氯化镁(25mmol/L)、A1 (10μmol/L)和A2(10μmol/L)引物以及Lm8基因模板各1μl，总体积为25μl。 PCR反应过程：94℃预变性300秒、94℃变性60秒、55℃复性60秒、72℃延伸 60秒、循环35次、72℃最后延伸300秒。
实施例12：Lm8和pGEX-6p-1的双酶切与连接
将实施例1中所得PCR产物经过酚:氯仿:异戊醇(25：24：1)抽提，无水 乙醇(2.5倍体积)沉淀后用50μl灭菌水溶解沉淀。用限制性内切酶BamHI和 XhoI(Takara公司产品)对回收的PCR产物和表达载体pGEX-6p-1质粒进行酶 切。酶切反应：BamHI(14U/μl)和XhoI(20U/μl)各1μl，10倍缓冲液2.5μl，，PCR 产物或pGEX-6p-1质粒50-100ng，加无菌水至总体积为25μl。37℃水浴5小时， 酶切产物经酚:氯仿:异戊醇抽提，无水乙醇(2.5倍体积)沉淀后用T4DNA连接 酶将PCR产物与表达载体pGEX-6p-1连接。连接反应：T4DNA连接酶(1U/μl) 1μl，PCR产物与表达载体pGEX-6p-1的摩尔比为3∶1，并且DNA总量为0.1μg， 5倍连接酶反应缓冲液4μl，加无菌水至总体积为20μl，16℃放置24小时。
实施例13：大肠杆菌DH5a和ROSSETTA(DE3)感受态细胞的制备
DH5α感受态细胞的制备：在划线平板上挑取DH5α单菌落，接种于5ml LB 培养液，37℃，250rpm摇床中培养过夜；以1％量转接于5ml LB培养基中，生 长至OD600到0.4～0.6，取菌液1ml于预冷的1.5ml Eppendorf管中，冰浴5～10 分钟，4℃ 12,000rpm离心20～30秒，收集菌体，倒置1分钟，再冰浴10分钟； 沉淀重悬于1ml预冷的0.1M CaCl2中，冰浴20～40分钟(可省略)，4℃ 12,000rpm 离心20～30秒，收集菌体，将菌体重悬于150μl预冷的CaCl2中，冰浴2～7小 时，4℃冰箱保存，如放置在-70℃则可保存6个月。
Rossetta(DE3)感受态细胞的制备同于DH5α感受态细胞的制备。
实施例14：连接产物的转化和阳性克隆的鉴定
将实施例12中的20μl连接反应液加到100μl的DH5α感受态细胞，混匀， 冰浴30分钟，42℃水浴90秒(不能摇动)，再冰浴2分钟；加等体积2×LB培 养液，37℃摇床(120rpm)温育1小时；摇匀菌液，取200μl涂布于LB/AP+琼 脂平板上，待菌液吸干后倒置于37℃培养12～16小时，观察结果。
LB/AP+琼脂平板上挑取单菌落10个，于500μl含氨苄的LB液体培养基中 37℃振摇4小时，取2μl菌液作为模板，以实施例11中的正反向引物进行PCR。 PCR筛选的阳性克隆子进一步使用限制性酶切反应鉴定。两者都为阳性结果的 克隆子送上海三博公司进行测序分析。测序引物是针对pGEX-6p-1质粒的通用 测序引物pGEX5’primer。
实施例15：重组表达质粒Lm8/pGEX-6p-1提取和基因工程菌Rossetta(DE3) (Lm8/pGEX-6p-1)的制备
将实施例14中测序确证的阳性克隆子按照碱裂解法提取重组表达质粒 Lm8/pGEX-6p-1(方法见《分子克隆》第二版)。按照实施例14中的转化方法将 提取的Lm8/pGEX-6p-1质粒转入实施例13制备的大肠杆菌感受态Rossetta(DE3) 细胞中。平板为LB/AP+琼脂平板。挑取单克隆子获得基因工程菌Rossetta(DE3) (Lm8/pGEX-6p-1)，保存于中国典型培养物保藏中心。重组大肠杆菌Escherichia coli Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1，CCTCC NO：M207132。
实施例16：重组GST-Lm8的表达和亲和层析
在含氨苄青霉素的LB液体培养基中以1:100的比例接种克隆子(重组大肠 杆菌Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1)，37℃培养至OD600 0.8时加入IPTG(终 浓度为0.1mM)对培养物进行诱导，然后将培养物在28℃培养4小时以进行目的 基因的表达(见图5)。浓缩诱导后的培养物50倍，超声波破细胞(80HZ，30秒/ 次，至培养物变清亮为止)，12000rpm离心15分钟，所得上清加入到GST亲和 层析胶中充分混合后26℃作用1小时使融合蛋白GST-Lm8与GST亲和层析胶充 分结合。用含50mM的EDTA的Tris-Cl缓冲溶液(1.0mM，pH8.0)反复冲洗GST亲 和层析胶去除杂蛋白。然后用10mM的GSH溶液按照50ml/L培养物洗脱融合蛋白 GST-Lm8。
实施例17：重组GST-Lm8蛋白的浓缩脱盐和小肠激酶酶切
将实施例16中洗脱的融合蛋白GST-Lm8通过15ml的10KDa超虑管(Millipore， Centricon，USA)离心浓缩脱盐，离心速度为3500rpm/min，温度为4℃。然后浓 缩脱盐的GST-Lm8融合蛋白进行小肠激酶(Biowisdom，China)消化。小肠激酶酶 切反应体系如下：小肠激酶10U，10倍缓冲液100μl，GST-Lm8融合蛋白10mg，加 无菌水至总体积为1000μl。37℃水浴12小时。酶切消化的蛋白结果可以在 Tricine-SDS-PAGE电泳中检测(见图6)。
实施例18：HPLC分离rLm8蛋白和质谱分析rLm8蛋白
将实施例17中消化的GST-Lm8融合蛋白通过HPLC(美国安吉伦公司产品)， 把Lm8蛋白和GST蛋白分离。HPLC的参数设置为：分离柱子C18 column (EliteHPLC，China，10×250mm，5μm)，流速5ml/min，液相为含有0.1％TFA的 CH3CN(10％ to 80％)洗脱液，紫外检测设置在230nm处。手工收集Lm8蛋白峰， 并且冷冻干燥(—40℃)。通过Tris-Tricine缓冲液的SDS-PAGE蛋白质电泳检测 收集液中的重组Lm8蛋白，并用Bradford方法测定含量。高纯度的rLm8蛋白 通过MALDI-TOF-MS(Voyager-DESTR，Applied Biosystems)测定其分子量为 4241.05(见图7)，与理论推导一致，表明成功的获得了高纯度的与天然Lm8蛋 白完全一致的重组蛋白质。
实施例19：稳定超表达mKv1.3的绿色荧光蛋白的Cos7细胞系
鼠的电压门控钾离子通道Kv1.3克隆到真核绿色荧光表达载体pIRES2-EGFP 中，构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-mKv1.3。测序确证正确的阳性克隆 子用来大量提取pIRES2-EGFP-mKv1.3质粒。
质粒pIRES2-EGFP-mKv1.3转染Cos7细胞使用购自广州太阳马公司的转染试 验盒。转染的最适DNA浓度约为5-30μg/mL。为了获得最好的转染效率，细胞 密度应该为60-70％。对于24孔板，最理想条件是在转染前18-24h，每孔接种 8×104-2.0×105个细胞。0.6μg DNA质粒稀释于30μL不含血清和抗菌素的 DMEM中，轻轻混匀；1-2μL梭华-SofastTM稀释于30μLDMEM中，轻轻混匀； 30μL梭华-SofastTM稀释液滴加到DNA稀释液中，一边滴加一边混匀；室温孵 育15-20min；60μL梭华-SofastTM/DNA复合物加到每孔中并轻轻摇动使均匀 混合；放置37℃ CO2孵育箱孵育24-48h后，观察并分析报告基因转染效率。然 后吸出培养液和沉淀物，用PBS将单层细胞再洗一次，每孔加入2mL预加温(37 ℃)的完全培养基。在非选择性培养基上培养72h后，使所转移基因得到充分表 达，再用胰蛋白酶消化细胞，以1：10的浓度转接，加非选择性培养基培养24h 后，再换含有适当浓度G418(800μg/mL)的选择性培养基，这种培养基在2-3 周内每2-4d须更换1次，以便除去死细胞残骸并使抗性细胞集落得以生长。筛 选得到的稳定转染细胞系可以通过绿色荧光蛋白表达得以鉴定(见图8)。将强 烈表达绿色荧光蛋白的Cos7细胞集落传代培养，用于下一步膜片钳试验。
实施例20：重组Lm8蛋白对mKv1.3电流的高效阻断作用
采用微电极拉制器(PP-83，日本光电)双步拉制玻璃电极，再进行抛光处理， 选择尖端整齐，开口直径约为0.5-2μm的电极。用全细胞膜片钳的方法对重组肽 Lm8的活性进行检测。吸取实施例19中细胞放置于样品池中，用细胞外液洗三遍， 再加入细胞外液，以备测量。膜片钳试验采用EPC-10放大器记录， Pulse/Pulsefit(HEKA elektronik，Germany)软件操作。膜片钳操作的外液(mM)： NaCl 125，KCl5，MgSO4 1.2，CaCl2 1.0，Na2HPO4 1.6，NaH2PO4 0.4，Glucose 10.5 和HEPES 32.5，用1mM NaOH调至pH 7.4。内液(mM)：KF 145，MgCl2 2，EGTA 10 and HEPES 10，用1mM KOH调至pH 7.2。钳制电压为-80mV，测试电压为-80mV ——+50mV，步增长为10mv，刺激频率0.5Hz，25℃进行。电压刺激细胞并记录 mKv1.3电流，通过给药系统加入重组细尖狼Lm8多肽，再记录mKv1.3电流的变化。 结果表明，重组细尖狼Lm8多肽对mKv1.3电流有高效的阻断作用(见图9)，其半 效抑制剂量为26.40±1.62nM(见图10)。
SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120>一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因及制备方法和应用
<130>一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因及制备方法和应用
<160>2
<170>PatentIn version3.1
<210>1
<211>251
<212>DNA
<213>Lychas mucronatus
<400>1
<210>2
<211>65
<212>PRT
<213>Lychas mucronatus
<400>2
实施例1：蝎毒腺总RNA的提取(Trizol LS一步法：Trizo1LS购自美Invitrogen)
①取500mg的蝎尾腺在液氮中研成细粉末，加入10ml TRIZOLreagent混匀， 室温(20-25℃，以下相同)放置5分钟；②然后加入2ml氯仿混合15秒，室温放 置2-3分钟，4℃下12000g离心15分钟；③取水相加1倍体积异丙醇，室温放 置10分钟，4℃下12000g离心10分钟得RNA沉淀；④沉淀用5ml 75％乙醇洗 涤，7500g离心5分钟；⑤RNA沉淀干燥后溶于DEPC-treated water，55-60℃保 温10分钟以彻底溶解RNA。整个过程参照TR1ZOL(Total RNA Isolation)Reagent Kit推荐方法进行。
实施例2：mRNA的分离纯化
采用PolyA Tract mRNA分离系统(Promega，USA)分离和纯化mRNA，其工 作原理是基于Oligo(dT)与mRNA 3’端poly(A)尾的互补配对特性，用生物素 标记Oligo(dT)，通过它与mRNA 3’端poly(A)的退火形成杂交体，然后用标 有亲合素的磁珠和磁性分离架捕获并洗涤生物素Oligo(dT)/mRNA杂交体，最后 用无RNA酶的ddH2O将之洗脱下来，达到从总RNA中分离mRNA的目的。①样品 的制备：将RNA加入到含有32μl β-巯基乙醇的800μl的GTC中。②探针 的退火：取250pM浓度Oligo(dT)5μl，加蒸馏水至50μl；加入1.6ml预 热(70℃)的dilution buffer(dilution buffer已加入32μl β—巯基 乙醇)，与RNA混匀，70℃温育5分钟。③磁珠的活化：取1.2ml的磁珠 SA-PMPS(购自美国Promega公司)于1.5ml的离心管中；用0.5×SSC(0.15 摩尔/升的氯化钠和0.015摩尔/升的柠檬酸钠，pH7.0)重悬SA-PMPS，以 磁架吸附磁珠，原体积0.5×SSC洗涤SA-PMPS3次。④mRNA的获取：将 70℃温育的RNA与SA-PMPS混合，室温放置5分钟放磁架上吸附磁珠，弃 上清液；2ml的0.5XSSC悬浮磁珠，洗涤重复2次，最后一次尽量去除SSC； 加入无RNA酶的ddH2O至磁珠中，轻轻混匀，然后离心(12000g×3分钟) 或磁架吸附磁珠；取上清，获得mRNA。通过电泳和紫外测定mRNA的浓度 和纯度。⑤mRNA的沉淀：将④获得的mRNA中加入糖原和2.5倍体积的无 水乙醇，沉淀过夜，mRNA将用于cDNA的合成。
实施例3：第一链cDNA合成
①在1.5ml Ep管中加入2μl Not I Primer-adapter(美国INVITOGEN公 司)和6μlmRNA(含3μg mRNA)，70℃温育10min，迅速放于冰上，离心后，加 入下列成分：4μl 5X first strand buffer(美国INVITOGEN公司)；2μl 0.1M DTT；1μl 10mM dNTPs；1μl DEPC·H2O。轻轻混匀后离心，37℃放至2min；②加 入5μl逆转录酶，混匀后取2μl，加1μl[α-32P]dCTP(4μCi)(示踪管)。与上 述反应组分(样品管)同时37℃温育1h，然后放入冰上终止反应；③对于示踪 管，依次加入43μl 20mM EDTA和5μl酵母tRNA，混匀后，分别取两份10μl点 于两张滤膜上，1份用10％ TCA洗3次，每次5min，95％乙醇洗1次，空气干燥 后，放入1.5ml闪烁液中(为1#样品)；另1份空气干燥后，放入1.5ml闪烁液 (为2#样品)。另30μl示踪液，加1.5μl 7.5M NH4OAc和90μl无水乙醇(-20 ℃)，混匀后立即14,000rpm离心20min，弃上清，加入0.5ml70％无水乙醇(-20 ℃)，14,000rpm离心2min，弃上清，37℃干燥10min让乙醇挥发，溶于10μl TEN 溶液，加入10μl 2X加样缓冲液，取10μl用于碱性凝胶电泳。用[α-32P]dCTP 标记λDNA HindIII片段作分子量标记；④混匀后室温下放置15min，加入2μl 0.2 M EDTA终止反应。取6μl反应液和6ml 2X碱性电泳缓冲液混匀，电泳5h后， 用7％ TCA浸泡20min，直至溴酚兰变黄。然后用卫生纸吸干(8h左右)，进行放 射自显影；⑤对于样品管，用于第二链的合成。
实施例4：第二链cDNA合成
①冰上在样品管中依次加入下列成分；②轻轻混匀后，16℃温育2h；③加 入2μl(10units)T4 DNA聚合酶，继续16℃反应5min；④转入冰上，加入10μl 0.5M EDTA；⑤加入等体积(150μl)酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，彻底涡旋后， 室温下14,000rpm离心5min。将水相(140μl)转入另一1.5ml Ep管；⑥加入 70μl的7.5M NH4OAc和0.5ML无水乙醇(-20℃)，涡旋后，室温下14,000rpm 离心20min；⑦弃上清，加入0.5ml70％乙醇(-20℃)，同上离心2min。弃上清， 37℃干燥10min。
实施例5：双链cDNA与Sal I衔接头的连接
①用25μl DEPC·ddH2O溶解实施例4的cDNA样品，然后按下表依次加入； ②轻轻混匀，16℃反应过夜(约20h)。③用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽提和 NH4Oac/乙醇沉淀后，37℃干燥10min。
实施例6：Not I消化双链cDNA
①将实施例5的样品溶于41μl，然后按下表依次加入；②混匀后，37℃温 育2h；③用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽提一次，然后用7.5M NH4Oac/乙醇沉 淀，37℃干燥10min。④溶于70μlTEN，取1μl用于定量，其余-20℃保存备用。
实施例7：去除双链cDNA分子中的过量Sal I衔接头和酶切小片段
用nucleon extraction and purification kit(Amersham，USA)去除过 量Sal I衔接头和酶切小片段。①室温下悬浮树脂，然后取600μl加于离心柱中， 2000rpm离心10s，去掉液体。在树脂中央加入40μl上述cDNA溶液。同上离 心；②收集洗脱液用于连接反应。
实施例8：双链cDNA与pSPORT1载体的连接和转化
①在1.5ml Ep管中依次加入下列成分；②室温下反应16h；③在②反应液 中依次加入下列成分：5.0μl yeast tRNA，12.5μl 7.5M NH4Oac，70μl无水 乙醇(-20℃)。涡旋混匀后立即14000离心20min；④沉淀用70％乙醇(-20℃) 洗涤，37℃干燥后溶于4μl；⑤取2μl电击转化50μl E.coli K12 MC1061。
实施例9：毒腺细胞cDNA文库的初步鉴定
用PCR方法鉴定文库的质量，正向引物：5’TCGACCCACGCGTCCG3’(按SalI 衔接头序列设计)；反向引物：5’GAGCGGCCGCCCT153’(按NotI引物-衔接头 的序列设计)。
实施例10：随机测序策略筛选cDNA文库
随机从构建好的细尖狼毒腺细胞cDNA文库中挑选100克隆子，送上海三 博公司测序。序列录入软件为BioEdit v4.5.8(Tom Hall，1999)，同源性比较和信 号肽切割位点预测软件分别为CLUSTAL X 1.8(Thompson et al.，1997)和 PC/GENE(Intelligenetics Inc.，Switzerland)。序列分析表明克隆子8为一个全新的 毒素基因，命名为Lm8。其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列： ggaaggaaaatgaacaaagtttgctttgtcgtcgttcttgttctcttcgtggctctggctgcatatgtgtcacctatcgaaggtgt accaacaggaggatgcccactttcggattcgctgtgtgccaaatattgcaagtcccacaaatttggcaaaaccggaagatg caccggaccaaacaagatgaaatgtaaatgtctcgtgtaataaaatgtaagcgaataaagatttgtgaatgaaaaaaaaaaa aa。该基因含有一个完整的开放阅读框，有两个加尾信号aataaa。Lm8的前体组 织形式编码65个氨基酸残基，由二个部分组成，即信号肽(25个残基)和成熟 肽(40个残基)：MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSPIEGVPTGGCPLSDSLC AKYCKSHKFGKTGRCTGPNKMKCKCLV(SEQ ID NO：2)。信号肽序列为前25 个氨基酸残基MNKVCFVVVLVLFVALAAYVSPIEG，其成熟毒素是由40个氨基 酸组成：VPTGGCPLSDSLCAKYCKSHKFGKTGRCTGPNKMKCKCLV(图1)。
实施例11：设计引物及PCR扩增细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因
按照SEQID NO：1所提供的细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因(Lm8基因)序列 设计PCR正向和反向引物：8-FP(8-FP： 5-GCGGGATCCGATGACGATGACAAGGTACCAACAGGAGGATGC-3)和8-RP(8-RP： 5-GCCCTCGAGTTACACGAGACATTTACA-3)，以从蝎毒腺细胞cDNA库中筛选所获 得的Lm8基因(SEQ ID NO：1)克隆子为模板，进行PCR反应，大量扩增细尖狼 蝎Kv1.3阻断剂基因的成熟肽区序列。PCR反应条件：1μl Taq聚合酶(1U)、0.5μl 四种(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)脱氧单核苷酸等比混合液(10mmol/L)、 16.5μl无菌双蒸水、2.5μl 10倍PCR缓冲液、1.5μl氯化镁(25mmol/L)、A1 (10μmol/L)和A2(10μmol/L)引物以及Lm8基因模板各1μl，总体积为25μl。 PCR反应过程：94℃预变性300秒、94℃变性60秒、55℃复性60秒、72℃延伸 60秒、循环35次、72℃最后延伸300秒。
实施例12：Lm8和pGEX-6p-1的双酶切与连接
将实施例1中所得PCR产物经过酚:氯仿:异戊醇(25：24：1)抽提，无水 乙醇(2.5倍体积)沉淀后用50μl灭菌水溶解沉淀。用限制性内切酶BamHI和 XhoI(Takara公司产品)对回收的PCR产物和表达载体pGEX-6p-1质粒进行酶 切。酶切反应：BamHI(14U/μl)和XhoI(20U/μl)各1μl，10倍缓冲液2.5μl，，PCR 产物或pGEX-6p-1质粒50-100ng，加无菌水至总体积为25μl。37℃水浴5小时， 酶切产物经酚:氯仿:异戊醇抽提，无水乙醇(2.5倍体积)沉淀后用T4DNA连接 酶将PCR产物与表达载体pGEX-6p-1连接。连接反应：T4DNA连接酶(1U/μl) 1μl，PCR产物与表达载体pGEX-6p-1的摩尔比为3∶1，并且DNA总量为0.1μg， 5倍连接酶反应缓冲液4μl，加无菌水至总体积为20μl，16℃放置24小时。
实施例13：大肠杆菌DH5a和ROSSETTA(DE3)感受态细胞的制备
DH5α感受态细胞的制备：在划线平板上挑取DH5α单菌落，接种于5ml LB 培养液，37℃，250rpm摇床中培养过夜；以1％量转接于5ml LB培养基中，生 长至OD600到0.4～0.6，取菌液1ml于预冷的1.5ml Eppendorf管中，冰浴5～10 分钟，4℃ 12,000rpm离心20～30秒，收集菌体，倒置1分钟，再冰浴10分钟； 沉淀重悬于1ml预冷的0.1M CaCl2中，冰浴20～40分钟(可省略)，4℃ 12,000rpm 离心20～30秒，收集菌体，将菌体重悬于150μl预冷的CaCl2中，冰浴2～7小 时，4℃冰箱保存，如放置在-70℃则可保存6个月。
Rossetta(DE3)感受态细胞的制备同于DH5α感受态细胞的制备。
实施例14：连接产物的转化和阳性克隆的鉴定
将实施例12中的20μl连接反应液加到100μl的DH5α感受态细胞，混匀， 冰浴30分钟，42℃水浴90秒(不能摇动)，再冰浴2分钟；加等体积2×LB培 养液，37℃摇床(120rpm)温育1小时；摇匀菌液，取200μl涂布于LB/AP+琼 脂平板上，待菌液吸干后倒置于37℃培养12～16小时，观察结果。
LB/AP+琼脂平板上挑取单菌落10个，于500μl含氨苄的LB液体培养基中 37℃振摇4小时，取2μl菌液作为模板，以实施例11中的正反向引物进行PCR。 PCR筛选的阳性克隆子进一步使用限制性酶切反应鉴定。两者都为阳性结果的 克隆子送上海三博公司进行测序分析。测序引物是针对pGEX-6p-1质粒的通用 测序引物pGEX5’primer。
实施例15：重组表达质粒Lm8/pGEX-6p-1提取和基因工程菌Rossetta(DE3) (Lm8/pGEX-6p-1)的制备
将实施例14中测序确证的阳性克隆子按照碱裂解法提取重组表达质粒 Lm8/pGEX-6p-1(方法见《分子克隆》第二版)。按照实施例14中的转化方法将 提取的Lm8/pGEX-6p-1质粒转入实施例13制备的大肠杆菌感受态Rossetta(DE3) 细胞中。平板为LB/AP+琼脂平板。挑取单克隆子获得基因工程菌Rossetta(DE3) (Lm8/pGEX-6p-1)，保存于中国典型培养物保藏中心。重组大肠杆菌Escherichia coli Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1，CCTCC NO：M207132。
实施例16：重组GST-Lm8的表达和亲和层析
在含氨苄青霉素的LB液体培养基中以1:100的比例接种克隆子(重组大肠 杆菌Rossetta(DE3)/Lm8/pGEX-6p-1)，37℃培养至OD600 0.8时加入IPTG(终 浓度为0.1mM)对培养物进行诱导，然后将培养物在28℃培养4小时以进行目的 基因的表达(见图5)。浓缩诱导后的培养物50倍，超声波破细胞(80HZ，30秒/ 次，至培养物变清亮为止)，12000rpm离心15分钟，所得上清加入到GST亲和 层析胶中充分混合后26℃作用1小时使融合蛋白GST-Lm8与GST亲和层析胶充 分结合。用含50mM的EDTA的Tris-Cl缓冲溶液(1.0mM，pH8.0)反复冲洗GST亲 和层析胶去除杂蛋白。然后用10mM的GSH溶液按照50ml/L培养物洗脱融合蛋白 GST-Lm8。
实施例17：重组GST-Lm8蛋白的浓缩脱盐和小肠激酶酶切
将实施例16中洗脱的融合蛋白GST-Lm8通过15ml的10KDa超虑管(Millipore， Centricon，USA)离心浓缩脱盐，离心速度为3500rpm/min，温度为4℃。然后浓 缩脱盐的GST-Lm8融合蛋白进行小肠激酶(Biowisdom，China)消化。小肠激酶酶 切反应体系如下：小肠激酶10U，10倍缓冲液100μl，GST-Lm8融合蛋白10mg，加 无菌水至总体积为1000μl。37℃水浴12小时。酶切消化的蛋白结果可以在 Tricine-SDS-PAGE电泳中检测(见图6)。
实施例18：HPLC分离rLm8蛋白和质谱分析rLm8蛋白
将实施例17中消化的GST-Lm8融合蛋白通过HPLC(美国安吉伦公司产品)， 把Lm8蛋白和GST蛋白分离。HPLC的参数设置为：分离柱子C18 column (EliteHPLC，China，10×250mm，5μm)，流速5ml/min，液相为含有0.1％TFA的 CH3CN(10％ to 80％)洗脱液，紫外检测设置在230nm处。手工收集Lm8蛋白峰， 并且冷冻干燥(—40℃)。通过Tris-Tricine缓冲液的SDS-PAGE蛋白质电泳检测 收集液中的重组Lm8蛋白，并用Bradford方法测定含量。高纯度的rLm8蛋白 通过MALDI-TOF-MS(Voyager-DESTR，Applied Biosystems)测定其分子量为 4241.05(见图7)，与理论推导一致，表明成功的获得了高纯度的与天然Lm8蛋 白完全一致的重组蛋白质。
实施例19：稳定超表达mKv1.3的绿色荧光蛋白的Cos7细胞系
鼠的电压门控钾离子通道Kv1.3克隆到真核绿色荧光表达载体pIRES2-EGFP 中，构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-mKv1.3。测序确证正确的阳性克隆 子用来大量提取pIRES2-EGFP-mKv1.3质粒。
质粒pIRES2-EGFP-mKv1.3转染Cos7细胞使用购自广州太阳马公司的转染试 验盒。转染的最适DNA浓度约为5-30μg/mL。为了获得最好的转染效率，细胞 密度应该为60-70％。对于24孔板，最理想条件是在转染前18-24h，每孔接种 8×104-2.0×105个细胞。0.6μg DNA质粒稀释于30μL不含血清和抗菌素的 DMEM中，轻轻混匀；1-2μL梭华-SofastTM稀释于30μLDMEM中，轻轻混匀； 30μL梭华-SofastTM稀释液滴加到DNA稀释液中，一边滴加一边混匀；室温孵 育15-20min；60μL梭华-SofastTM/DNA复合物加到每孔中并轻轻摇动使均匀 混合；放置37℃ CO2孵育箱孵育24-48h后，观察并分析报告基因转染效率。然 后吸出培养液和沉淀物，用PBS将单层细胞再洗一次，每孔加入2mL预加温(37 ℃)的完全培养基。在非选择性培养基上培养72h后，使所转移基因得到充分表 达，再用胰蛋白酶消化细胞，以1：10的浓度转接，加非选择性培养基培养24h 后，再换含有适当浓度G418(800μg/mL)的选择性培养基，这种培养基在2-3 周内每2-4d须更换1次，以便除去死细胞残骸并使抗性细胞集落得以生长。筛 选得到的稳定转染细胞系可以通过绿色荧光蛋白表达得以鉴定(见图8)。将强 烈表达绿色荧光蛋白的Cos7细胞集落传代培养，用于下一步膜片钳试验。
实施例20：重组Lm8蛋白对mKv1.3电流的高效阻断作用
采用微电极拉制器(PP-83，日本光电)双步拉制玻璃电极，再进行抛光处理， 选择尖端整齐，开口直径约为0.5-2μm的电极。用全细胞膜片钳的方法对重组肽 Lm8的活性进行检测。吸取实施例19中细胞放置于样品池中，用细胞外液洗三遍， 再加入细胞外液，以备测量。膜片钳试验采用EPC-10放大器记录， Pulse/Pulsefit(HEKA elektronik，Germany)软件操作。膜片钳操作的外液(mM)： NaCl 125，KCl5，MgSO4 1.2，CaCl2 1.0，Na2HPO4 1.6，NaH2PO4 0.4，Glucose 10.5 和HEPES 32.5，用1mM NaOH调至pH 7.4。内液(mM)：KF 145，MgCl2 2，EGTA 10 and HEPES 10，用1mM KOH调至pH 7.2。钳制电压为-80mV，测试电压为-80mV ——+50mV，步增长为10mv，刺激频率0.5Hz，25℃进行。电压刺激细胞并记录 mKv1.3电流，通过给药系统加入重组细尖狼Lm8多肽，再记录mKv1.3电流的变化。 结果表明，重组细尖狼Lm8多肽对mKv1.3电流有高效的阻断作用(见图9)，其半 效抑制剂量为26.40±1.62nM(见图10)。
SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120>一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因及制备方法和应用
<130>一种细尖狼蝎Kv1.3阻断剂基因及制备方法和应用
<160>2
<170>PatentIn version3.1
<210>1
<211>251
<212>DNA
<213>Lychas mucronatus
<400>1
<210>2
<211>65
<212>PRT
<213>Lychas mucronatus
<400>2
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