技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术研发分析技术领域，特别是涉及到鹿皮蛋白肽对巨噬细胞免疫细胞调节作用的分析方法。
背景技术
[0002] 鹿皮为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck或
马鹿Cervus elaphus Linnaeus的皮。具有补气，涩精，敛疮的功效。主治白带，血崩不止，肾虚滑精，漏疮。鹿皮为传统名贵中药材，以其为原料经过加工精制而成的鹿皮
胶原蛋白入药具有很强的药理活性，属药中上品。本文对鹿皮胶原蛋白的研究现状，包括其基源、化学成分、药理作用进行了较为全面的综述。同时在目前的研究
基础上，提出应在较为空白的药理作用机制方面进行深入研究的建议，本文为中药鹿皮胶原蛋白的进一步深入研究提供了较全面的研究综述和建议。鹿皮化学成分多样，以
氨基酸、维生素、肽类成分为主。其中，肽类成分易吸收，活性高等优点，已被广泛关注，但目前对鹿皮蛋白肽对巨噬细胞RAW264.7免疫调节的研究尚未开展。
[0003] 免疫系统是
机体发挥免疫应答作用的重要系统，可防卫病原体入侵机体，它能发现引起内环境紊乱的外来异物和病原
微生物等。其中，巨噬细胞作为机体最重要的吞噬细胞，是病原微生物进入机体的第一道防线，发挥免疫功能，具有吞噬、表达相应
抗原递呈分子、分泌多种细胞因子等功能，在机体广泛参与清除病原微生物与衰老细胞，发挥免疫调节作用，以维持机体内环境的稳态，在天然免疫中起重要作用。细胞因子是指一类由免疫细胞产生的调节细胞功能的高活性多功能多肽或
蛋白质分子，可以调节全身的免疫应答反应。细胞因子不仅具有免疫调节、抗病毒、抗
肿瘤等多方面的作用，还可介导发生病理性作用，导致某些病理过程的发生。TNF-α、IL-6是细胞因子中重要的促炎性因子。现代研究表明，鹿皮中含有多种活性成分，如生物活性肽、免疫球蛋白、氨基酸、矿物质等其他成分，是一种较为理想的免疫调节剂，其作用机制为通过调控巨噬细胞吞噬和抗原递呈功能以及相关细胞因子的表达，从而参与巨噬细胞免疫应答反应。另有研究表明，生物活性肽类成分在免疫调节及抗
氧化等方面表现出了重要的生理活性。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种鹿皮蛋白肽对巨噬细胞免疫细胞调节作用的分析方法，采用闪提法提取鹿皮蛋白肽，将各
超滤组分通过噻唑蓝MTT实验检测不同浓度鹿皮蛋白肽的增殖活性，通过酶联
免疫吸附检测法检查鹿皮蛋白肽对免疫功能的影响，进而验证鹿皮蛋白肽对免疫调节的作用。
[0005] 鹿皮蛋白肽对巨噬细胞免疫细胞调节作用的分析方法，其特征是：包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，
[0006] 步骤一、制备上清液
[0007] 取鹿皮生品40g，剪碎至长为0.5cm的碎
块，取鹿皮生品
质量10倍～30倍量的蒸馏
水，添加至鹿皮生品碎块中，在4℃的条件下，应用闪式提取器提取5次～10次，每次持续1分钟～2分钟，离心10分钟～30分钟后，取上清液；
[0008] 步骤二、制备冻干粉
[0009] 取步骤一获得的上清液经过双层滤油纸虑取后，经过0.45μm滤膜微滤、采用分离纯化方法得到鹿皮蛋白肽总提液DSPs冻干粉备用；
[0010] 步骤三、建立蛋白质含量标准曲线回归方程
[0011] 精密称定1.0mg
牛血清
白蛋白牛血清白蛋白BSA于10mL容量瓶中，以蒸馏水溶解并定容至刻度，获得浓度为0.1mg/mL的牛血清白蛋白BSA标准溶液；
[0012] 分别吸取牛血清白蛋白BSA标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL以及1.0mL，各管用蒸馏水补足至1.0mL，以空白管调零，每管加入5mL考马斯亮蓝
试剂，快速涡旋混匀，室温反应5min，于5min～20min之间595nm处测吸光度值，以BSA标准溶液在每管中的蛋白浓度为横坐标x，以测得吸光度值为纵坐标Y作线性回归，获得测定蛋白质含量的标准曲线回归方程；
[0013] 步骤四、样品溶液测定
[0014] 取步骤二获得的冻干粉1mg，加入1mL蒸馏水，配置1mg/mL样品溶液，吸取1mL加入5mL考马斯亮蓝试剂，涡旋混匀，室温反应5min，于5min～20min之间595nm处测吸光度值；
[0015] 步骤五、测定RAW264.7巨噬细胞增值指数
[0016] 取对数生长期RAW264.7巨噬细胞以105个/孔于96孔培养板，每孔150μL，37℃、5％CO2
培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃去上清液，分别加入步骤二所得的冻干粉配置成100μg/mL的溶液150μL，空白对照组为150μL含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，阳性对照组为10μg/mL脂多糖LPS150μL，每组5个复孔；在37℃、5％CO2条件下分别培养12h、24h、48h，弃去上清液，每孔加入5mg/mL的MTT
染色剂10μL，4h后加入二甲基亚砜DMSO 150μL，振荡
5min，于490nm
波长处测其吸光度值，计算
细胞增殖指数；
[0017] 步骤六、测定各质量浓度鹿皮蛋白肽DSPs溶液下的RAW264.7巨噬细胞增值指数[0018] 分别向DMEM高糖培养基中加入步骤二所得鹿皮蛋白肽冻干粉配置成25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL溶液150μL，空白对照组为150μL含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，阳性对照组为10μg/mL脂多糖LPS 150μL，每组5个复孔；在37℃、5％CO2条件下培养24h，弃掉培养上清液，每孔加入5mg/mL的MTT染色剂10μL，4h后加入二甲基亚砜DMSO 150μL，振荡5min，于490nm波长处测其吸光度值，计算细胞增殖指数；
[0019] 步骤七、测定鹿皮蛋白肽DSPs溶液对细胞分泌及活
力的影响
[0020] 将对数生长期的RAW264.7巨噬细胞接种于96孔培养板，每孔体积200μL，
密度为105个/孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃去上清液，分别加入25μg/mL、
50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的鹿皮蛋白肽样品溶液150μL，设定空白组和脂多糖LPS组，每组5个复孔，于37℃、5％CO2条件下培养24h后，取上清液150μL，按各
试剂盒说明书分别测定NO的分泌量、溶菌酶KZM活力、因子IL-6以及因子TFN-α的分泌量；
[0021] 采用SPSS 19.0统计学
软件进行
配对t检验、单因素方差分析，实验结果以 表示，其中 为平均值、s为标准差，当p＜0.01和p＜0.05时有统计学差异，其中，p为显著性；
[0022] 至此，一种鹿皮蛋白肽对巨噬细胞免疫细胞调节作用的分析完成。
[0023] 所述步骤三和步骤四中加入的考马斯亮蓝试剂的制备方法为，称取50mg的考马斯亮蓝G-250，以25mL的95％
乙醇溶解，加入50mL的85％
磷酸摇匀后，以蒸馏水定容至50mL的棕色瓶内备用。
[0024] 通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：鹿皮蛋白肽对巨噬细胞免疫细胞调节作用的分析方法，通过比较不同浓度样品的增殖活性，结果显示随鹿皮蛋白肽浓度增加RAW264.7细胞的增殖指数随之升高，且浓度为200μg/mL与LPS阳性对照组最为接近；鹿皮胶中氨基酸与驴皮胶中含量大致相同，可推出鹿皮胶与驴皮胶功效相似，具有很大的研究价值，在关于鹿皮功效的初步研究基础上针对免疫功能的进一步研究对动物药材鹿皮的开发具有很大的研究价值。
[0025] 采用闪提法提取鹿皮蛋白肽，闪式提取法工作原理主要是高速
电机带动内刀高速旋转，内外刀之间产生强大的剪切作用，同时外刀腔内产生强大
负压，使外刀腔内外发生分子渗透现象，样品被
破碎，并在负压、剪切、高速碰撞等各种外力作用下，被
溶剂分子包围、解离、溶解、替代、脱离，迅速进入溶剂中，瞬间达到溶剂浓度的平衡，数秒内完成提取过程。此过程巧妙结合了剪切、
真空、渗透、
流体动力等原理，实现了技术间的组合相承。本发明主体为动物药材鹿皮，质地坚韧柔软，相比于其他常用提取蛋白肽的方法闪式提取法更为适合。
[0026] 将各超滤组分通过噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)实验检测不同浓度鹿皮蛋白肽的增殖活性，通过酶联免疫吸附检测法检查鹿皮蛋白肽对免疫功能的影响，进而验证鹿皮蛋白肽对免疫调节的作用，本发明采用的免疫学检测技术具有检测速度快、
费用低廉、仪器简单易携、灵敏度高和选择性强等优点。它将酶催化反应的放大作用和抗原
抗体亲和反应的高度专一性、特异性相结合，以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂进行免疫测试，所以具有很高的灵敏度。
[0027] 染料采用考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中与蛋白质中的
碱性氨基酸(特别是精氨酸)及芳香族氨基酸残基相结合，使染料最大吸收峰的
位置由465nm变为595nm，溶液的
颜色也由棕黑色变为蓝色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质浓度呈正比。此方法测定蛋白灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响。
[0028] 为了验证鹿皮肽对免疫调节作用的影响，本发明研究了不同质量浓度鹿皮蛋白肽对NO分泌量和LZM活力、细胞因子如IL-6、TNF-α的释放的影响，结果显示，随样品浓度的增加NO分泌量也随之增长；在50μg/mL时，Raw264.7巨噬细胞分泌NO的量与LPS阳性对照组在Raw264.7中生成NO的量相接近。
[0029] 鹿皮蛋白肽作用24h后，RAW264.7细胞因子的分泌功能明显的增大，鹿皮肽可显著上调巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α、IL-6的表达，在低浓度下对细胞因子的分泌能力也具有显著(P<0.05)的促进作用。当浓度为50μg/mL时，细胞各因子水平接近于LPS组，这表明鹿皮肽具有上调巨噬细胞促炎性细胞因子的分泌。
[0030] 综上所述，鹿皮蛋白肽具有增强免疫能力的潜在作用，可为后续研究提供参考。
附图说明
[0031] 以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：
[0032] 图1为本发明鹿皮蛋白肽对巨噬细胞免疫细胞调节作用的分析方法
实施例牛血清白蛋白标准曲线图。
[0033] 图2为本发明鹿皮蛋白肽对巨噬细胞免疫细胞调节作用的分析方法实施例不同质量浓度DSPs对RAW264.7细胞增殖能力的影响柱形图。
[0034] 图3为本发明鹿皮蛋白肽对巨噬细胞免疫细胞调节作用的分析方法实施例不同浓度DSPs对RAW264.7细胞NO分泌量的影响柱形图。
[0035] 图4为本发明鹿皮蛋白肽对巨噬细胞免疫细胞调节作用的分析方法实施例不同浓度DSPs对RAW264.7细胞溶菌酶LZM活力的影响柱形图。
[0036] 图5为本发明鹿皮蛋白肽对巨噬细胞免疫细胞调节作用的分析方法实施例不同浓度DSPs RAW264.7细胞IL-6分泌量的影响柱形图。
[0037] 图6为本发明鹿皮蛋白肽对巨噬细胞免疫细胞调节作用的分析方法实施例不同浓度DSPs RAW264.7细胞TFN-α分泌量的影响柱形图。
具体实施方式
[0038] 鹿皮蛋白肽对巨噬细胞免疫细胞调节作用的分析方法，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，
[0039] 步骤一、取鹿皮生品40g，进行剪碎成长约0.5cm小块，取鹿皮生品质量10～30倍量的蒸馏水，添加至剪碎后鹿皮生品中，在4℃的条件下，应用闪式提取器提取5～10次，每次持续1～2分钟，离心10～30分钟后，取上清液；
[0040] 步骤二、将所述步骤一中获得的上清液经过双层滤油纸虑取后，经过0.45μm滤膜微滤、采用分离纯化方法得到鹿皮蛋白肽总提液DSPs冻干备用；
[0041] 步骤三、取所述步骤二中获得的冻干粉采用考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)方法测定蛋白含量，称取50mg的考马斯亮蓝G-250，以25mL的95％乙醇溶解，再加入50mL的85％磷酸摇匀后，以蒸馏水定容至50mL的棕色瓶内，备用；
[0042] 步骤四、蛋白质的标准曲线的建立：精密称定1.0mg牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)于10mL容量瓶中，以蒸馏水溶解并定容至刻度，即得浓度为0.1mg/mL的BSA标准溶液。
[0043] 步骤五、分别吸取步骤四所得的牛血清白蛋白BSA标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，各管用蒸馏水补足至1.0mL，以空白管调零，每管加入5mL考马斯亮蓝试剂，快速涡旋混匀，室温反应5min，于5-20min之间595nm处测吸光度值。以牛血清白蛋白BSA标准溶液在每管中的蛋白浓度(μg/mL)为横坐标x，以测得吸光度值为纵坐标Y作线性回归，得测定蛋白质含量的标准曲线回归方程。
[0044] 步骤六、样品溶液的测定：取步骤二所得的冻干粉各1mg，加入1mL蒸馏水，配置1mg/mL样品溶液，吸取1mL加入5mL考马斯亮蓝试剂，快速涡旋混匀，室温反应5min，于5min～20min之间595nm处测吸光度值。
[0045] 步骤七、取对数生长期RAW264.7细胞以105个/孔于96孔培养板，每孔150μL，37℃、5％CO2培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃去上清液，分别加入步骤二所得的冻干粉配置成100μg/mL的溶液150μL，空白对照组为150μL含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，阳性对照组为10μg/mL脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)150μL，每组5个复孔。在37℃、5％CO2条件下分别培养12h、24h、48h，弃去上清液，每孔加入5mg/mL的MTT染色剂10μL，4h后加入二甲基亚砜DMSO 150μL，振荡5min，于490nm波长处测其OD吸光度值，计算细胞增殖指数。
[0046] 步骤八、分别向DMEM高糖培养基中加入步骤二所得的鹿皮蛋白肽冻干粉配置成25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL溶液150μL，空白对照组为150μL含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，阳性对照组为10μg/mL脂多糖LPS150μL，每组5个复孔。在37℃、5％CO2条件下培养24h，弃掉培养上清液，每孔加入5mg/mL的MTT染色剂10μL，4h后加入二甲基亚砜DMSO 150μL，振荡5min，于490nm波长处测其吸光度OD值，计算细胞增殖指数。
[0047] 步骤九、将对数生长期细胞接种于96孔培养板，每孔体积200μL，密度为105个/孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃去上清液，分别加入25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的鹿皮蛋白肽样品溶液150μL，设定空白组和脂多糖LPS组，每组5个复孔。于37℃、5％CO2条件下培养24h后，取上清液150μL，按NO试剂盒说明书测定NO的分泌量。
[0048] 具体操作步骤为
[0049] 1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
[0050] 2.加祥：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
[0051] 3.加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外；
[0052] 4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟；
[0053] 5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用；
[0054] 6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
[0055] 7.显色：每孔先加入
显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
[0056] 8.终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
[0057] 9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
[0058] 步骤十、按步骤九的方法测定溶菌酶KZM活力及因子IL-6、因子TFN-α的分泌量。
[0059] 步骤十一、实验结果以 ( 为平均值；s为标准差)表示，采用SPSS 19.0统计学软件进行配对t检验、单因素方差分析，当p＜0.01和p＜0.05时有统计学差异。
[0060] 关于上清液提取的实施例：
[0061] 实施例一、
[0062] 取鹿皮生品40g，进行剪碎至长约为0.5cm的小块，取鹿皮生品质量10倍量的蒸馏水，添加至剪碎后鹿皮生品中，在4℃的条件下，闪提5次，每次持续1分钟，转速为3600r/min，离心10分钟后，取上清液。得率为0.148％。
[0063] 实施例二、
[0064] 取鹿皮生品40g，进行剪碎至长约为0.5cm的小块，取鹿皮生品质量20倍量的蒸馏水，添加至剪碎后鹿皮生品中，在4℃的条件下，闪提5次，每次持续1分钟，转速为3600r/min，离心20分钟后，取上清液。得率为0.286％。
[0065] 实施例三、
[0066] 取鹿皮生品40g，进行剪碎至长约为0.5cm的小块，取鹿皮生品质量25倍量的蒸馏水，添加至剪碎后鹿皮生品中，在4℃的条件下，闪提8次，每次持续1小时，转速为3600r/min，离心30分钟后，取上清液。得率为0.447％。
[0067] 关于鹿皮蛋白肽对巨噬细胞RAW264.7免疫调节研究的实施例
[0068] 实施例一、鹿皮肽蛋白含量测定
[0069] 以牛血清白蛋白质量浓度(X)为横坐标，以吸光度OD值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线如图1所示，经公式计算得鹿皮蛋白肽溶液的蛋白含量分别为0.3660mg/mL。
[0070] 实施例二、不同质量浓度DSPs对RAW264.7巨噬细胞的增殖作用
[0071] LPS和DSPs均能促进RAW264.7细胞的增殖，在质量浓度为25μg/mL～200μg/mL的范围内，RAW264.7细胞的增值指数呈先上升后下降的趋势。不同浓度的DSPs对巨噬细胞增殖活性的影响如图2所示。在添加浓度为25.0μg/mLDSPs培育24h后，Raw264.7细胞的增殖率较空白组出现显著增长。并且在试验浓度范围内，巨噬细胞Raw264.7的增殖率随DSPs剂量的增加而增加(P<0.01)，呈剂量依赖关系，且对Raw264.7无细胞毒害作用。
[0072] 实施例三、DSPs对RAW264.7巨噬细胞NO分泌量的影响
[0073] DSPs对RAW264.7细胞NO分泌量的刺激作用与剂量相关，鹿皮蛋白肽质量浓度为50μg/mL时，Raw264.7巨噬细胞分泌NO的量为9.83mmol/ml，与LPS阳性对照组在Raw264.7中生成NO(9.88μmol/ml)的量相接近，如图3所示，横坐标为鹿皮蛋白肽添加浓度，两组之间没有明显的差异(P>0.05)。
[0074] 实施例四、鹿皮蛋白肽对RAW264.7巨噬细胞LZM活力的影响
[0075] 鹿皮蛋白肽对RAW264.7细胞NO分泌量的刺激作用与剂量相关，鹿皮蛋白肽对巨噬细胞内LZM的含量有一定促进作用，并随着浓度的升高，促进作用增强，当鹿皮蛋白肽质量浓度超过50μg/mL时，巨噬细胞内的LZM含量较对照组显著提高。如图4所示，横坐标为鹿皮蛋白肽添加浓度，鹿皮蛋白肽具有提高巨噬细胞LZM含量的作用。
[0076] 实施例五、皮蛋白肽对RAW264.7巨噬细胞的细胞因子释放的影响
[0077] 鹿皮蛋白肽对RAW264.7细胞中细胞因子分泌量的影响与剂量呈相关性。经50μg/mL鹿皮蛋白肽处理后，如图5和图6所示，横坐标为鹿皮蛋白肽添加浓度，细胞因子IL-6和TNF-α的分泌量与空白组相比均有极显著性作用(p＜0.01)，且其各因子的分泌量最高，趋近于阳性对照组。
[0078] 综上所述，利用本发明分析方法可以有效验证鹿皮蛋白肽对免疫调节的作用。
