一种荧光探针及其制备方法、应用及应用方法
阅读：1发布：2021-02-20
专利汇可以提供一种荧光探针及其制备方法、应用及应用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 适用于检测技术领域，提供了一种 荧光 探针及其制备方法、应用及应用方法，其中，所述荧光探针为二维 硼 烯纳米片。该荧光探针为二维硼烯纳米片，呈现明显的二维层状堆叠结构、厚度约为20nm，具有较强的荧光发光特性，并且，开发成本低廉，且制备工艺简便、绿色无污染。经对该硼烯纳米片进行细胞的 生物 相容性 的测试，结果表明，即使在400μg/mL的高浓度下，HeLa细胞依然能够在硼烯纳米片保持80％以上的存活率，说明硼烯纳米片具有较高的生物相容性，适合用于细胞生物成像。，下面是一种荧光探针及其制备方法、应用及应用方法专利的具体信息内容。
1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为二维硼烯纳米片。
2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括：
将硼粉分散于异丙醇中配制成浓度为0.1-10mg/mL的第一分散液；
将所述第一分散液进行探头超声剥离处理，得第二分散液；
将所述第二分散液进行水浴超声剥离处理，得第三分散液；
将所述第三分散液进行分速离心处理，并将所得沉淀物制成硼烯纳米片，即得。
3.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述将所述第一分散液进行探头超声剥离处理，得第二分散液的步骤，具体包括：
将所述第一分散液在超声功率为500-900W、温度为5～20℃的条件下每超声1～5秒后，停歇5～10秒，共超声0.5～2小时。
4.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述将所述第二分散液进行水浴超声剥离处理，得第三分散液的步骤，具体包括：
将所述第二分散液在超声功率为500～1200W、温度为5～20℃的条件下超声1～5小时。
5.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述将所述第三分散液进行分速离心处理，并将所得沉淀物制成硼烯纳米片，即得的步骤，具体包括：
在温度为5～15℃的条件下，将所述第三分散液进行8000～10000rpm离心10～20分钟后，取上层液体，备用；
将所述上层液体进行11000～13000rpm离心10～20分钟，取下层沉淀物，并将所述下层沉淀物制成硼烯纳米片，即得。
6.一种如权利要求1所述的荧光探针在活细胞内的成像应用。
7.一种如权利要求1所述的荧光探针在活细胞内的成像应用方法，其特征在于，包括：
用功能溶剂对荧光探针进行功能化处理；
将活细胞与所述功能化处理后的荧光探针进行3～5小时孵育；
孵育完成后，用冲洗溶剂对所述活细胞进行冲洗，并用共聚焦显微镜成像。
8.如权利要求7所述的荧光探针在活细胞内的成像应用方法，其特征在于，所述功能溶剂为mPEG-NH2、mPEG-SH、FA-PEG-NH2中的一种或几种。
9.如权利要求7所述的荧光探针在活细胞内的成像应用方法，其特征在于，所述冲洗溶剂为PBS、HBSS、生理盐水中的一种或几种。
10.如权利要求7所述的荧光探针在活细胞内的成像应用方法，其特征在于，所述活细胞为HeLa、Huh7、HepG2、HEK293T、永生化细胞系、肿瘤细胞系中的一种或几种。
一种荧光探针及其制备方法、应用及应用方法
技术领域
[0001] 本发明属于检测技术领域，尤其涉及一种荧光探针及其制备方法、应用及应用方法。
背景技术
[0002] 生物成像是一项重要的生物技术，旨在开发新的方法对活细胞或人体中特定分子通路进行原位、实时、动态检测分析，是研究物种生理功能与人类疾病的重要媒介工具。而研制绿色廉价、高效稳定的荧光探针则是在分子水平上实现体内生物过程的非侵入性研究的重要前提。
[0003] 当前，常见的荧光探针主要可分为有机，无机和有机/无机杂化三大体系。而最常见的无机材料荧光探针主要可分为石墨烯基纳米片/量子点、半导体纳米片/量子点(如SiO2,MoS2,MXenes等)和稀土金属荧光探针这三大体系；其中，石墨烯基纳米片/量子点的制备往往需要采用水热反应，并且对工艺的要求较高，这不利于实现其大规模，低成本的可控制备；对于半导体纳米片/量子点，其发光能力与生物相容性往往较差，需要进行额外的表面改性；而对于稀土金属探针，受其原料储备的影响，其价格较高，不利于可持续的发展；另外，有机探针的分子结构比较复杂，且稳定性较差；有机/无机杂化体系探针的制备工艺往往比较繁琐，不易于大规模生产制备。
[0004] 由此可见，现有技术的荧光探针普遍存在制备工艺复杂、开发成本高昂以及稳定性较差的问题，不易于大规模生产制备。
发明内容
[0005] 本发明实施例的目的在于提供一种荧光探针，旨在解决现有技术的荧光探针普遍存在制备工艺复杂、开发成本高昂以及稳定性较差，不易于大规模生产制备的问题。
[0006] 本发明实施例是这样实现的，一种荧光探针，所述荧光探针为二维硼烯纳米片。
[0007] 本发明实施例的另一目的在于一种荧光探针的制备方法，包括：
[0008] 将硼粉分散于异丙醇中配制成浓度为0.1～10mg/mL的第一分散液；
[0009] 将所述第一分散液进行探头超声剥离处理，得第二分散液；
[0010] 将所述第二分散液进行水浴超声剥离处理，得第三分散液；
[0011] 将所述第三分散液进行分速离心处理，并将所得沉淀物制成硼烯纳米片，即得。
[0012] 本发明实施例的另一目的在于一种上述荧光探针在活细胞内的成像应用。
[0013] 本发明实施例的另一目的在于一种上述荧光探针在活细胞内的成像应用方法，包括：
[0014] 用功能溶剂对荧光探针进行功能化处理；
[0015] 将活细胞与所述功能化处理后的荧光探针进行3～5小时孵育；
[0016] 孵育完成后，用冲洗溶剂对所述活细胞进行冲洗，并用共聚焦显微镜成像。
[0017] 本发明实施例提供的一种荧光探针，该荧光探针为二维硼烯纳米片，呈现明显的二维层状堆叠结构、厚度约为20nm，具有较强的荧光发光特性，并且，开发成本低廉，且制备工艺简便、绿色无污染。经对该硼烯纳米片进行细胞的生物相容性的测试，结果表明，即使在400μg/mL的高浓度下，HeLa细胞依然能够在硼烯纳米片保持80％以上的存活率，说明硼烯纳米片具有较高的生物相容性，适合用于细胞生物成像。附图说明
[0018] 图1是本发明实施例所制备得到的硼烯纳米片的场发射电镜图：(a)实施例1；(b)实施例2；(c)实施例3；
[0019] 图2是本发明实施例所制备得到的硼烯纳米片的透射电镜图：(a)实施例1；(b)实施例2；(c)实施例3；
[0020] 图3是本发明实施例提供的块状硼粉与实施例3所制备得到的硼烯纳米片的晶体衍射图；
[0021] 图4是本发明实施例3所制备得到的硼烯纳米片的原子力显微镜图；
[0022] 图5是本发明实施例3所制备得到的硼烯纳米片分散液的荧光发射光谱图；
[0023] 图6是本发明实施例3所制备得到的硼烯纳米片的生物相容性测试图；
[0024] 图7是本发明实施例提供的HeLa细胞内(a,b)有硼烯纳米片与(c,d)无硼烯纳米片的荧光成像图。
具体实施方式
[0025] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0026] 在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
[0027] 应当理解，尽管在本发明实施例中可能采用术语第一、第二等来描述各种物质，但这些物质不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的物质彼此区分开。
[0028] 硼烯是一种新型的二维纳米功能材料，具有优异的机械、光学特性，并且由于硼原子的缺电子特性使得硼烯具有复杂的结构多样性，极具发展潜力。而液相超声剥离是一种能够实现大规模制备形貌与微观结构均一纳米材料的绿色技术。本发明在前期的研究中通过采用液相剥离技术实现了硼烯纳米片的高效制备，且该过程工艺简便，绿色无污染。并且在此基础上，发现所制得的硼烯纳米片具有较强的荧光发光特性，而考虑到硼材料的储量丰富，毒性低，将会是一种潜在的无机荧光探针。因此，本发明提出一种基于二维硼烯纳米片的新型荧光探针，并将其应用于生物细胞成像。
[0029] 本发明实施例提供的一种荧光探针，该荧光探针为二维硼烯纳米片，呈现明显的二维层状堆叠结构、厚度约为20nm，具有较强的荧光发光特性，并且，开发成本低廉，且制备工艺简便、绿色无污染。经对该硼烯纳米片进行细胞的生物相容性的测试，结果表明，即使在400μg/mL的高浓度下，HeLa细胞依然能够在硼烯纳米片保持80％以上的存活率，说明硼烯纳米片具有较高的生物相容性，适合用于细胞生物成像。
[0030] 在本发明实施例中，该荧光探针的制备方法，包括：
[0031] 将硼粉分散于异丙醇中配制成浓度为0.1～10mg/mL的第一分散液；
[0032] 将所述第一分散液进行探头超声剥离处理，得第二分散液；
[0033] 将所述第二分散液进行水浴超声剥离处理，得第三分散液；
[0034] 将所述第三分散液进行分速离心处理，并将所得沉淀物制成硼烯纳米片，即得。
[0035] 在本发明一个优选的实施例中，上述将硼粉分散于异丙醇中配制成浓度为0.1～10mg/mL的第一分散液，具体包括：
[0036] 将硼粉分散于异丙醇中配制成浓度为1mg/mL的第一分散液。
[0037] 在本发明一个优选的实施例中，上述将所述第一分散液进行探头超声剥离处理，得第二分散液的步骤，具体包括：
[0038] 将所述第一分散液在超声功率为500～900W、温度为5～20℃的条件下每超声1～5秒后，停歇5～10秒，共超声0.5～2小时。
[0039] 在本发明一个优选的实施例中，上述将所述第一分散液进行探头超声剥离处理，得第二分散液的步骤，具体包括：
[0040] 将所述第一分散液在超声功率为780W、温度为10℃的条件下每超声3秒后，停歇8秒，共超声1小时。
[0041] 在本发明一个优选的实施例中，上述将所述第二分散液进行水浴超声剥离处理，得第三分散液的步骤，具体包括：
[0042] 将所述第二分散液在超声功率为500～1200W、温度为5～20℃的条件下超声1～5小时。
[0043] 在本发明一个优选的实施例中，上述将所述第二分散液进行水浴超声剥离处理，得第三分散液的步骤，具体包括：
[0044] 将所述第二分散液在超声功率为1050W、温度为10℃的条件下超声3小时。
[0045] 在本发明一个优选的实施例中，上述将所述第三分散液进行分速离心处理，并将所得沉淀物制成硼烯纳米片，即得的步骤，具体包括：
[0046] 在温度为5～15℃的条件下，将所述第三分散液进行8000～10000rpm离心10～20分钟后，取上层液体，备用；
[0047] 将所述上层液体进行11000～13000rpm离心10～20分钟，取下层沉淀物，并将所述下层沉淀物制成硼烯纳米片，即得。
[0048] 在本发明一个优选的实施例中，上述将所述第三分散液进行分速离心处理，并将所得沉淀物制成硼烯纳米片，即得的步骤，具体包括：
[0049] 在温度为10℃的条件下，将所述第三分散液进行9000rpm离心15分钟后，取上层液体，备用；
[0050] 将所述上层液体进行12000rpm离心15分钟，取下层沉淀物，并将所述下层沉淀物制成硼烯纳米片，即得。
[0052] 以下通过具体实施例对本发明的荧光探针的技术效果做进一步的说明。
[0053] 实施例1
[0054] 将块体硼粉分散于异丙醇(IPA)中配制成浓度为0.1mg/mL的分散液，然后先将分散液进行探头超声剥离处理(具体参数：900W超声功率，总时间0.5小时，超声1s，停歇5s，恒温5℃)，紧接着，将探头超声后所得分散液进行水浴超声剥离处理(具体参数：1200W超声功率，总时间1小时，恒温5℃)，最后将剥离后的分散液进行分速离心处理(具体参数：10000rpm离心10分钟，取上层液体，再13000rpm离心10分钟，取下层沉淀物，恒温5℃)，制得粒径均匀，厚度较薄的硼烯纳米片。
[0055] 实施例2
[0056] 将块体硼粉分散于异丙醇(IPA)中配制成浓度为10mg/mL的分散液，然后先将分散液进行探头超声剥离处理(具体参数：500W超声功率，总时间2小时，超声5s，停歇10s，恒温20℃)，紧接着，将探头超声后所得分散液进行水浴超声剥离处理(具体参数：500W超声功率，总时间5小时，恒温20℃)，最后将剥离后的分散液进行分速离心处理(具体参数：
8000rpm离心20分钟，取上层液体，再11000rpm离心10分钟，取下层沉淀物，恒温15℃)，制得粒径均匀，厚度较薄的硼烯纳米片。
8000rpm离心20分钟，取上层液体，再11000rpm离心10分钟，取下层沉淀物，恒温15℃)，制得粒径均匀，厚度较薄的硼烯纳米片。
[0057] 实施例3
[0058] 将块体硼粉分散于异丙醇(IPA)中配制成浓度为1mg/mL的分散液，然后先将分散液进行探头超声剥离处理(具体参数：780W超声功率，总时间1小时，超声3s，停歇8s，恒温10℃)，紧接着，将探头超声后所得分散液进行水浴超声剥离处理(具体参数：1050W超声功率，总时间3小时，恒温10℃)，最后将剥离后的分散液进行分速离心处理(具体参数：9000rpm离心15分钟，取上层液体，再12000rpm离心15分钟，取下层沉淀物，恒温10℃)，制得粒径均匀，厚度较薄的硼烯纳米片。
[0059] 测试例1
[0060] 对实施例1-3所制备得到的荧光探针(硼烯纳米片)采用场发射电子显微镜(型号：JSM-7800F&TEAM Octane Plus)进行微观形貌的表征，所得产品的场发射形貌图见图1所示；可以看出实施例1-3所制备得到的硼烯纳米片的尺寸均较小，且大部分都团聚在一起。
[0061] 测试例2
[0062] 对实施例1-3所制备得到的荧光探针(硼烯纳米片)采用高分辩透射电子显微镜(型号：Tecnai G2 F30)进行微观结构的表征；所得产品的透射电镜图见图2所示；可以看出实施例1-3所制备得到的硼烯纳米片均呈现明显的二维层状堆叠结构。
[0063] 测试例3
[0064] 将块状硼粉以及实施例3所制备得到的荧光探针(硼烯纳米片)分别采用X射线衍射仪(型号：Bruker,D8 Advance with Cu-Kαradiation)进行物相结构的表征，剥离前后材料的晶体衍射图谱如图3所示；由X-射线衍射仪测试结果表明，相比于块体硼粉，经过剥离后硼烯纳米片的一些衍射峰变弱，甚至消失，这主要是由于纳米片结构的高度取向，及部分无定形化导致表面缺陷的综合结果。
[0065] 测试例4
[0066] 将实施例3所制备得到的荧光探针(硼烯纳米片)采用原子力显微镜(型号：Dimension ICON,Bruker,America)进行纳米片厚度的表征，表征结果见图4所示；通过原子力显微镜测试结果表明，所得的硼烯纳米片厚度约为20nm。
[0067] 测试例5
[0068] 采用荧光分光光度计(型号：爱丁堡FS5)对IPA/B分散液(实施例3所制备得到的硼烯纳米片与IPA的分散液)的荧光性质进行测试表征(采用370nm的激发波长)，表征结果见图5所示，通过荧光分光光度计测试结果表明，所得的硼烯纳米片分散液在约400-500nm的区间范围内存在明显的荧光特征峰；另外，使用370nm的激光手电筒进行照射，发现硼烯纳米片分散液能够发出明显的蓝光。
[0069] 测试例6细胞毒性实验
[0070] 为了测试实施例3所制备得到的硼烯纳米片对于细胞的生物相容性，采用宫颈癌细胞株HeLa进行培育测试：将HeLa在不同浓度的硼烯纳米片中进行孵育，24小时后采用CCK-8法测定细胞的存活率，具体为：将宫颈癌细胞株HeLa在杜贝克改良的鹰隼培养基(Hyclone)中进行培养，培养基中添加10％胎牛血清(Gibco)和1％青霉素/链霉素(Gibco)；在96孔板上接种细胞进行生物相容性试验；24小时后将不同浓度的材料加入培养基中；再孵育24小时后，按照制造商的指示(Beyotime)，用CCK-8法测定细胞的存活率，测试结果见图6所示。。
[0071] 结果表明，即使在400μg/mL的高浓度下，HeLa细胞依然能够在硼烯纳米片保持80％以上的存活率，这说明硼烯纳米片具有较高的生物相容性，适合用于细胞生物成像。
[0072] 本发明实施例还提供了一种上述荧光探针在活细胞内的成像应用。
[0073] 本发明实施例还提供了一种上述荧光探针在活细胞内的成像应用方法，包括：
[0074] 用功能溶剂对荧光探针进行功能化处理；
[0075] 将活细胞与所述功能化处理后的荧光探针进行3～5小时孵育；
[0076] 孵育完成后，用冲洗溶剂对所述活细胞进行冲洗，并用共聚焦显微镜成像。
[0077] 上述细胞成像所使用的细胞为在外部条件下孵化所得的活细胞。
[0078] 其中，所述功能溶剂为mPEG-NH2、mPEG-SH、FA-PEG-NH2等各种PEG衍生物以及其他适用于纳米材料功能化的包覆材料中的一种或几种；
[0079] 其中，所述冲洗溶剂为PBS、HBSS、生理盐水等缓冲液中的一种或几种；
[0080] 其中，所述活细胞为HeLa、Huh7、HepG2、HEK293T等各种原代细胞、永生化细胞系、肿瘤细胞系中的一种或几种。
[0081] 以下通过具体实施例4对本发明的荧光探针在活细胞内的成像应用做进一步的说明。
[0082] 实施例4
[0083] 将实施例3所制得的荧光探针在活细胞内的进行成像应用，具体为：为了进一步提高硼烯纳米片在水溶液中的分散性，采用mPEG-NH2(瑞喜)对硼烯纳米片材料进行功能化修饰；然后将HeLa细胞在硼烯纳米片中孵育4小时后用PBS冲洗细胞，并用共聚焦显微镜(Leica)进行成像(405nm激发光)测试，测试结果见图7所示。
[0084] 结果表明，有硼烯纳米片存在的细胞能够发出明显的蓝光，而没有硼烯纳米片存在的细胞则没有明显的发光现象，这说明硼烯纳米片具有较强的荧光发光特性，能够用于细胞的成像应用。
[0085] 综上，本发明实施例提供的一种荧光探针，该荧光探针为二维硼烯纳米片，呈现明显的二维层状堆叠结构、厚度约为20nm，具有较强的荧光发光特性，并且，开发成本低廉，且制备工艺简便、绿色无污染。经对该硼烯纳米片进行细胞的生物相容性的测试，结果表明，即使在400μg/mL的高浓度下，HeLa细胞依然能够在硼烯纳米片保持80％以上的存活率，说明硼烯纳米片具有较高的生物相容性，适合用于细胞生物成像。
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