用于肿瘤早期诊断与光学治疗的多功能纳米胶束及其应用
阅读：2发布：2020-07-30
专利汇可以提供用于肿瘤早期诊断与光学治疗的多功能纳米胶束及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于 肿瘤 早期诊断与光学 治疗 的多功能纳米胶束，其由功能化 单层 脂质膜 外壳 与包埋于内部的光敏分子和光热吸收剂组成。本发明的纳米胶束可用于癌症的早期 磁共振成像 、 光声成像 或 近红外 荧光 成像等 多模态成像 诊断。患者只需承受一次 造影剂 给药 ，即可达到多种诊断效果；且由于灵敏度的提高，进一步降低造影剂注射剂量，减轻对患者的毒 副作用 ；肿瘤在单 波长 近红外激光照射下，胶束内部的Chlorine6与Pdots，能够有效的将光能转化为 化学能 与 热能 ，产生大量ROS 氧 自由基与50～60℃过高热，用于诱导癌细胞凋亡与 坏死 ，发挥光动 力 、光热协同治疗功能；因此，该多功能纳米胶束不仅可作为造影剂用于癌症诊断，还可作为治疗剂用于癌症的协同治疗应用。，下面是用于肿瘤早期诊断与光学治疗的多功能纳米胶束及其应用专利的具体信息内容。
1.一种用于肿瘤早期诊断与光学治疗的Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束，由单层脂质膜外壳与其内部包埋的光敏剂与光热吸收剂组成，其直径为36～50nm；所述的
3+
单层脂质膜为表面修饰螯合有Gd 离子的DOTA耦合剂的DSPE-PEG脂质体膜，所述光敏剂为二氢卟吩e6，所述光热吸收剂为聚[2,1,3-苯并噻二唑-4,7-二基[4,4-双(2-乙基己基)-4H-环戊并[2,1-b:3,4-b']二噻吩-2,6-二基]]有机半导体聚合物经超声波法而形成的粒径3～4nm的有机半导体量子点。
2.如权利要求1所述的多功能纳米胶束，其特征在于所述多功能纳米胶束由如下方法制得：
3+
(1)由DSPE-PEG-NH2和DOTA-NHS进行酰胺偶联反应，并耦合Gd 离子，得到DSPE-PEG-Gd-DOTA；
(2)将聚[2,1,3-苯并噻二唑-4,7-二基[4,4-双(2-乙基己基)-4H-环戊并
[2,1-b:3,4-b']二噻吩-2,6-二基]]有机半导体聚合物溶解在四氢呋喃中，并向其中加入光敏剂二氢卟吩e6，氢化大豆磷脂和步骤(1)中制备的DSPE-PEG-Gd-DOTA，均衡混合后，将所得THF混合液注入到去离子水中，并利用40W的超声探头超声3min，然后利用10KDa的透析袋进行透析3天。最终，得到所述Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束；所述有机半导体聚合物、二氢卟吩e6和氢化大豆磷脂、DSPE-PEG-Gd-DOTA的质量之比为：2～4：
1～2：5～10：2～4。
3.如权利要求1所述的Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束在制备用于肿瘤的多模态成像的造影剂中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述造影剂用于MRI磁共振成像，光声成像或近红外荧光成像。
5.如权利要求1所述的Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束在制备用于肿瘤的光动力、光热治疗剂中的应用。
用于肿瘤早期诊断与光学治疗的多功能纳米胶束及其应用
(一)技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于肿瘤早期诊断与光学治疗的Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束及其应用。(二)背景技术
[0002] 肝细胞癌是消化系统中常见的恶性肿瘤之一，具有发展速度快、恶性程度高和预后差等特点，其发病率呈逐年上升的趋势。作为高发性恶性肿瘤,肝癌在福建省癌症死亡率居所有恶性肿瘤之首,约每10万人中32人死于肝癌。目前肝癌的治疗仍以手术切除为主，但很多患者在确诊时因肿瘤部位，身体耐受状态及肝硬化程度的影响而失去手术治疗机会。尽管局部化疗、介入治疗、射频消融治疗、免疫治疗甚至肝移植等方式均被广泛应用于肝癌的综合治疗，并取得了显著的疗效，但肝癌病人的远期生存率仍不够理想(5年生存率不足8％，5年复发转移率更是高达50-70％)。因此，急需发展新的诊断和治疗模式来进一步提高肝癌的远期生存率。近年来发展起来的“诊断治疗学”，将诊断和治疗整合于同一纳米探针上，同时实现肿瘤的高灵敏度检测与微创治疗，其优势在于操作简便、成像灵敏度更高、诊断和治疗同时进行等，为肝癌的“早诊早治”提供了新的思路和手段。
[0003] 磁共振成像是利用人体组织中氢原子核(质子)在磁场中受到射频脉冲的激励而产生磁共振信号，经电子计算机处理,可在亚毫米水平上提供高分辨率的组织信息和三维结构成像，对肝癌的诊断优于CT成像。但高对比度的获取较多依赖于造影剂的介入或灌注。而目前商用造影剂体内清除太快、无特异性分布等因素，导致对比效果不明显。
[0004] 近年来，基于光声效应的光声成像技术是快速发展的非侵入式、非电离的新型生物医学影像技术。它继承了光学成像与超声成像的技术特点，具备光学成像的高对比度与超声成像的高分辨率的特性，能够从形态与功能成像两方面同时对生物组织体进行成像。光声信号与光声图像所承载的大量信息，均与组织体的结构、成份、功能息息相关，而分析与研究这部分信息，将能够以无损的方式下实现对组织体的生理与病理的检测。然而，光声成像虽然具有诸多成像优势，但光声成像的光源对组织的穿透深度有一定的局限性。随着纳米技术的不断发展，将多种功能附加于同一纳米材料上已成为可能，而以优势互补的方式将磁共振与光声成像技术加以整合，将更有助于提高临床对癌症的检出率。
[0005] 光动力治疗与光热治疗是完全不同于手术治疗和化疗的肿瘤新疗法，已成为肿瘤防治研究的热点。光动力治疗是以光源、光敏剂、氧气三者相互作用为基础的光敏化治疗方1
式，其产生的强氧化活性的单线态氧(O2)，破坏胞内DNA、脂类等生物活性物质，诱导细胞凋亡；光热治疗是利用近红外激光照射生物体的治疗部位，促使胞内外源性光热转换物质吸收光能并转化为高热能，使局部温度升高到46℃以上，引发肿瘤组织坏死，达到肿瘤治疗的目的。但目前采用的光敏剂或光热转换材料均存在毒性较大、疏水性较强、体内代谢缓慢、易被网状内皮系统清除等问题，不利于光动力、光热治疗在临床上的进一步应用。
(三)发明内容
式，其产生的强氧化活性的单线态氧(O2)，破坏胞内DNA、脂类等生物活性物质，诱导细胞凋亡；光热治疗是利用近红外激光照射生物体的治疗部位，促使胞内外源性光热转换物质吸收光能并转化为高热能，使局部温度升高到46℃以上，引发肿瘤组织坏死，达到肿瘤治疗的目的。但目前采用的光敏剂或光热转换材料均存在毒性较大、疏水性较强、体内代谢缓慢、易被网状内皮系统清除等问题，不利于光动力、光热治疗在临床上的进一步应用。
(三)发明内容
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 一种用于肿瘤早期诊断与光学治疗的Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束，由单层脂质膜外壳与其内部包埋的光敏剂与光热吸收剂组成，直径约为36～50nm；3+
所述的单层脂质膜为表面修饰螯合有Gd 离子的DOTA耦合剂的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)脂质体膜，所述光敏剂为二氢卟吩e6(Chlorin e6，Ce6)，所述光热吸收剂为聚[2,1,3-苯并噻二唑-4,7-二基[4,4-双(2-乙基己基)-4H-环戊并[2,1-b:3,4-b']二噻吩-2,6-二基]](PCPDTBT)有机半导体聚合物经超声波法而形成的粒径为3～4nm的有机半导体量子点(Pdots)。
所述的单层脂质膜为表面修饰螯合有Gd 离子的DOTA耦合剂的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)脂质体膜，所述光敏剂为二氢卟吩e6(Chlorin e6，Ce6)，所述光热吸收剂为聚[2,1,3-苯并噻二唑-4,7-二基[4,4-双(2-乙基己基)-4H-环戊并[2,1-b:3,4-b']二噻吩-2,6-二基]](PCPDTBT)有机半导体聚合物经超声波法而形成的粒径为3～4nm的有机半导体量子点(Pdots)。
[0009] 本发明在聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)表面修饰螯合有Gd3+离子的DOTA耦合剂，在一定的磁场作用下具有MRI造影功能，而Chlorin e6为一种带负电的近红外光敏剂，可被670nm的近红外激光激发，并与分子氧作用，产生氧自由基(ROS)用于诱导癌细胞凋亡；而聚[2,1,3-苯并噻二唑-4,7-二基[4,4-双(2-乙基己基)-4H-环戊并[2,1-b:3,4-b']二噻吩-2,6-二基]](PCPDTBT)有机半导体聚合物在超声波法作用下，可形成粒径为3～4nm的有机半导体量子点(Pdots)，其近红外吸收波长在650nm～750nm之间，同时在利用670nm近红外激光激发下，能够将光能转变为过高热能，提高肿瘤区组织的温度，用于热诱导癌细胞坏死。
[0010] 上述构建的Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束具有较高的生物相容性与光热稳定性，具备可生物降解与生物利用率高等特点。而纳米化的Gd耦合剂具有更高的弛豫率(高于医用钆普胺)，以及血液清除缓慢等优势。因此，可有效提高磁共振成像对比度，延长磁共振显像时间；同时，在670nm的脉冲激光激发下，Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束良好的热声性能，可用于对肿瘤组织进行光声成像，用于癌症的早期诊断；在670nm近红外光照射下，内部包埋的Chlorin e6分子与Pdots能够有效的将光能分别转化为化学能与热能，产生大量的ROS与50～60℃的过高热，进而在氧自由基诱导癌细胞凋亡的同时协同过高热杀伤癌细胞。
[0011] 为提高纳米胶束的体内循环时间，降低网状内皮系统(Reticuloendothelial system)的吞噬作用，本发明采用FDA批准的、已用于临床的DSPE-PEG(聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺)脂质体膜，其可有效提高药物体循环时间。本发明为提高癌症的早期诊断，弥补传统成像手段对肿瘤组织成像对比度低与软组织定性诊断困难等问题，利用Gd螯合剂功能化的DSPE-PEG提高磁共振成像的对比度，利用新颖的光声成像提高对肿瘤组织的功能性成像检测。因此，本发明的脂质体颗粒外壳除了具有对肝癌细胞MRI成像功能，还具备良好的生物相容性。
[0012] 本发明构建的Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束，同时具备对肿瘤的核磁成像、光声成像与近红外荧光成像等多模态影像的功能，提高MRI的T1加权成像信号强度，提高对肿瘤组织的功能性与光声成像的分辨率，并且兼有对肿瘤的光热治疗与光动力治疗协同治疗功能。
[0013] 具体的，所述多功能纳米胶束由如下方法制得：
[0014] (1)由DSPE-PEG-NH2和DOTA-NHS(1,4,7,10-四乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺)进行3+
酰胺偶联反应，并耦合Gd 离子，得到DSPE-PEG-Gd-DOTA(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-1,4,7,10-四乙酸钆)；该步骤可得到DSPE-PEG-Gd-DOTA冻干粉；
酰胺偶联反应，并耦合Gd 离子，得到DSPE-PEG-Gd-DOTA(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-1,4,7,10-四乙酸钆)；该步骤可得到DSPE-PEG-Gd-DOTA冻干粉；
[0015] 具体方法如下：DSPE-PEG-NH2与DOTA-NHS在水溶液中，室温反应2h，转移到4℃反应12～24h，后用5KDa的超滤管离心后获得DSPE-PEG-DOTA，之后在水溶液中加入GdCl3粉末，强烈震荡48h后，利用5KDa超滤管离心，获得DSPE-PEG-Gd-DOTA；然后，利用低温冷冻干燥器将DSPE-PEG-Gd-DOTA冻干后备用；
[0016] (2)将聚[2,1,3-苯并噻二唑-4,7-二基[4,4-双(2-乙基己基)-4H-环戊并[2,1-b:3,4-b']二噻吩-2,6-二基]](PCPDTBT)溶解在1mL的四氢呋喃(THF)溶液中，然后向其中加入光敏剂二氢卟吩e6(Chlorin e6)，氢化大豆磷脂(HSPC)和步骤(1)中制备的DSPE-PEG-Gd-DOTA白色粉末，均衡混合后，将所得THF混合液注入到10mL去离子水中，用40W的超声探头超声3min，然后，将得到的混合液投入到50mL的圆底烧瓶中，在500rpm/min的室温、避光条件下搅拌24h，去除混合液中的THF溶剂；之后，将混合液置于10KDa的透析袋中进行透析，3天，最终，得到所述Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束；所述PCPDTBT、Chlorin e6和HSPC、DSPE-PEG-Gd-DOTA的质量之比为：2～4：1～2：5～10：2～4。
[0017] DSPE-PEG-Gd-DOTA、PCPDTBT和氢化大豆磷脂、Ce6的质量之比优选为2:1:5:2。
[0018] 本发明还涉及所述的Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束在制备用于肿瘤的多模态成像的造影剂中的应用。所述造影剂可用于MRI磁共振成像，光声成像或近红外荧光成像。
[0019] 本发明还涉及所述的Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束在制备用于肿瘤的光动力、光热治疗剂中的应用。所述的Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束，在单一近红外激光(670nm)的照射下，同时发挥对肿瘤的光动力治疗、光热治疗协同治疗应用。
[0020] 本发明以有机半导体量子点Pdots与光敏剂Chlorin e6为共载体，形成纳米胶束的核心，以独特的设计方案，将耦合有Gd-DOTA的脂质体膜，用于包埋Pdots与Chlorin e6，并设计合成Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束，获得具有多模态成像及单一激光激发同时发挥光动力、光热治疗功能的多功能纳米胶束。该Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束具有36-50nm的直径，其等同于存在于人和动物机体中的一些蛋白和生物有机化合物的尺寸，由此便于造影剂在关注区域的输送和吸收。
[0021] 本发明所构建的Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束可通过不同的剂量给药，这取决于早期成像诊断的癌细胞，组织及癌症患者的临床状况。本发明的造影剂和光动力、光热药物的给药剂量和浓度，可由临床医生例行确定。用药方案取决于各种因素，例如成像的癌细胞，组织或肿瘤是分散还是局部，患者的健康程度，年龄等。通过参照其他造影剂的用药方案，本领域技术人员能够确定本发明药物的最佳有效剂量及浓度。
[0022] 本发明的所构建的Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束可通过任何已知的递送方法方式给药：全身递送(静脉注射)，动脉内，肿瘤内，胃肠外，肺腔内，局部、或局部给药的区域递送形式。如动脉内注射能够被用来“局域效果”成像及特定区域的光动力、光热治疗。
[0023] 本发明Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束可用于肝癌的核磁成像(MRI)，光声成像，近红外荧光成像(Near-infrared(NIR)fluorescence imaging)等多种影像模式，只需承受一种造影剂给药，即可达到多种诊断效果；而且由于灵敏度的提高，可以降低造影剂用量，进一步减轻毒副作用。在670nm近红外光照射下，内部包埋的Pdots和Chlorin e6光敏分子，能够有效的将光能转化为热能或化学能，产生60～70℃的过高热或大量ROS氧自由基，进而用于杀伤肿瘤细胞；因此，该多功能纳米胶束不仅可用于癌症的多模态成像，还可作为肿瘤的光动力、光热协同治疗应用。(四)附图说明
[0024] 图1为Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束的透射电镜图像(200nm标尺)；
[0025] 图2为Pdots@lipid micelles，Ce6，Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA micelles的紫外可见近红外吸收光谱；(—)Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA micelles，(--)Ce6，(-·-)表示Pdots@lipid micelles的紫外可见近红外吸收光谱曲线图；
[0026] 图3为Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束的T1磁共振加权成像图(A)和Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束的光声成像图(B)；图4为Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA，Ce6，Pdots@lipid micelles分别对肝癌细胞的光热-光动力联合杀伤、光动力杀伤、光热杀伤。(五)具体实施方式
[0027] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0028] 实施例1：
[0029] 利用电子天平称取4.2mg的DSPE-PEG-NH2(聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，Nanocs公司)白色粉末和4.2mg的DOTA-NHS白色粉末(钆离子螯合剂，Macrocyclic公司)白色粉末，溶解在盛有1ml水溶液的1.5ml的离心管中，室温震荡反应2h后，转移到4℃冰箱，震荡反应24h，后用5KDa的超滤管过滤，收集DSPE-PEG-DOTA-NHS，之后向其中加入60mg的GdCl3(三氯化钆，百灵威试剂公司)白色粉末，强烈震荡12h后，利用5KDa的超滤管过滤，收集DSPE-PEG-Gd-DOTA，并利用低温冷冻干燥器将其冻干备用。
[0030] 实施例2：
[0031] 将0.25mg的聚[2,1,3-苯并噻二唑-4,7-二基[4,4-双(2-乙基己基)-4H-环戊并[2,1-b:3,4-b']二噻吩-2,6-二基]](PCPDTBT)(美国sigma公司)溶于1mL的THF中，并向其加入0.5mg的二氢卟吩e6(Chlorin e6)粉末、2.5mg的氢化大豆磷脂(HSPC，上海艾韦特医药科技有限公司)、0.5mg的DSPE-PEG-Gd-DOTA粉末，将其混合均匀后，快速注入10mL的Milli-Q超纯水(美国Millipore公司)中，利用40W的超声探头进行超声处理3min，之后将混合液倒入50ml的烧瓶中，加入磁子进行500rpm下，室温、避光搅拌过夜，除去混合液中的THF溶剂。之后利用10KDa的透析袋透析3天，除去多余的Chlorin e6分子和Pdots，得到Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA多功能纳米胶束。
[0032] 实施例3：
[0033] 实施例2制备的Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束的粒子直径约36±12nm，并具备了MRI、光声成像、近红外成像，光动力、光热治疗功能。
[0034] 使用透射电子显微镜(TEM)、紫外－可见分光光度计(UV-Vis-NIR)，磁共振成像系统，光声成像系统，对Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束进行表征，并利用670nm近红外激光分别照射Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束，Ce6，Pdots@lipid纳米胶束的肝癌细胞，用于鉴定其光动力、光热联合杀伤的优势与效果。具体测试结果如下：
[0035] (1)透射电子显微镜(TEM)
[0036] 透射电镜图像表示Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束的形貌和纳米尺寸。结果参照图1，表示在200nm的标尺下，检测Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束的分布及形貌，其说明Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束尺寸均一。
[0037] (2)紫外-可见-近红外分光光度计(UV-Vis-NIR)，荧光分光光度计[0038] 紫外-可见-近红外吸收光谱，表示Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束合成的特征光谱。结果参照图2，(—)Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA micelles的吸收光谱；(--)Ce6的吸收光谱；(-·-)表示Pdots@lipid micelles的吸收光谱；其中Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束在405nm及670nm具有比单独Pdots@lipid不载有Ce6的纳米胶束更高的吸光度，表明Ce6已经成功的载入Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA内部。
[0039] (3)MRI磁共振成像和光声成像
[0040] MRI磁共振成像和光声成像图像，显示Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束具有磁共振成像和光声成像功能，结果参照图3，A图为Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束的T1磁共振图像，随着编号1,2，其浓度分别为0，0.1mM，其Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束的T1信号强度随浓度的增加而增强。B图为Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束的光声成像图，从左到右，Pdots的浓度依次为0,16ug/ml，表明Pdots/Ce6@lipid-Gd-DOTA纳米胶束具有光声成像功能。
[0041] (4)细胞杀伤能力；
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