技术领域
[0001] 本
发明涉及双光子荧光成像技术领域，尤其涉及一种高速三维双光子荧光成像系统及其成像方法和应用。
背景技术
[0002]
哺乳动物大脑皮层的神经细胞通过大量的树突相互连接组成神经网络，从而形成了大脑计算功能的物质
基础。近期研究表明，树突自身能够主动地产生电尖峰脉冲，故被认为具有主动处理外界输入信息的能
力，使得大脑的计算能力扩大。因此，通过对树突行为的深入研究，有助于理解大脑神经回路的运行模式和信息处理机制。但是，现有的对神经细胞的研究技术在实际操作过程中存在如下问题：
[0003] 1、目前，神经科学领域广泛采用的研究技术是膜片钳电生理技术，该技术采用微
电极接触神经细胞，适用于记录单个神经细胞的胞体、轴突和树突的电位，具有很高的时间和空间分辨力，然而由于微电极尺寸的限制，该方法难以实现对树突棘和突触等细小功能部位的探索，同时也无法记录神经细胞群的电生理活动。
[0004] 2、随着科学技术的发展，双光子荧光成像技术被广泛应用于神经科学领域的多个方面，该技术具有激发区域小，成像深度高，焦点外
光漂白作用小等优势。因此，商用双光子
显微镜被用于记录单个神经细胞
钙离子的尖峰传播，大脑视觉皮层内的神经细胞均呈三维分布形态，而该显微镜采用二维扫描，每次只能获取单个神经细胞中某一部位的钙离子荧光浓度随时间变化的信息，如果需要测量单个神经细胞的不同树突或神经细胞群的钙离子动力学变化，只能采用分时记录的方法，无法完成同时观测需求。
[0005] 3、为了系统性地了解大脑皮层神经网络互联结构，探索神经细胞钙离子的动力学现象，同时记录神经细胞群大量树突上的钙离子尖峰传播现象，一些研究组采用了Z轴焦点调制和随机扫描方法，以实现高速三维双光子荧光成像。这其中，随机扫描方法需要采用声光偏转器件，而声光偏转器件是一种强色散元件，超短激光脉冲通过声光偏转器件后无论从时间还是空间上都会产生展宽效应，因此往往需要复杂的光学补偿技术，另外，声光偏转器件本身的时间和空间
分辨率相互制约，基于声光偏转器件的双光子成像技术仍然需要声光偏转器件本身性能的提高。
发明内容
[0006] 本发明的主要目的在于解决
现有技术中存在的问题，提供一种简单实用，通过Z轴高速扫描与X轴的共振扫描镜及Y轴的检流计扫描镜相配合，并借助两次三维成像及优化三维成像空间的方法进一步提高三维成像速度，从而解决了扫描速度过慢的问题，且避免了对声光偏转器件的使用的高速三维双光子荧光成像系统及其成像方法和应用。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种高速三维双光子荧光成像系统，其中所述高速三维双光子荧光成像系统包括双光子显微镜、
近红外飞秒
激光器、X轴扫描装置、Y轴扫描装置、Z轴扫描装置和
图像识别装置；
[0008] 所述X轴扫描装置设置为包括共振扫描镜，所述共振扫描镜用于实现所述双光子显微镜对检测样品X轴方向的扫描，且该共振扫描镜设置为电性连接所述图像识别装置；
[0009] 所述Y轴扫描装置设置为包括检流计扫描镜，所述检流计扫描镜实现了检测样品Y轴方向的线性扫描，且该检流计扫描镜设置为电性连接所述图像识别装置；
[0010] 所述Z轴扫描装置设置为包括高速压电扫描装置，所述高速压电扫描装置设置为通过振动物镜实现高数值孔径聚焦光斑沿Z轴方向的移动，且该高速压电扫描装置设置为电性连接所述图像识别装置，所述高速压电扫描装置用于实现Z轴方向的线性扫描；
[0011] 所述图像识别装置设置为包括
图像采集部分、信息处理部分和控制部分，所述图像采集部分设置为采集所述共振扫描镜、所述检流计扫描镜与所述高速压电扫描装置对检测样品的扫描信息，且该图像采集部分设置为将采集信息传递至所述信息处理部分，由所述信息处理部分将数据信息反馈至所述控制部分，所述控制部分根据反馈信息控制所述共振扫描镜、所述检流计扫描镜与所述高速压电扫描装置的工作情况，从而完成对整个样品的检测。
[0012] 进一步地，所述共振扫描镜设置为每秒完成32000条扫描线的双向扫描方式。
[0013] 进一步地，所述高速压电扫描装置设置为100um、80um以及40um的线性扫描范围，由于
三维扫描范围的成像速率由Z轴扫描速率所决定，因此本设计可以提供20Hz-200Hz的三维成像速度。
[0014] 进一步地，所述近红外飞秒激光器的激光
光源设置为800nm
波长，其脉冲宽度为100fs，且投射至检测样品的光功率为10-20mW。
[0015] 一种高速三维双光子荧光成像系统的成像方法，包括如下成像步骤：
[0016] 步骤一、所述图像识别装置控制所述共振扫描镜与所述检流计扫描镜对成像目标进行逐层X-Y方向二维扫描；
[0017] 步骤二、对成像目标进行逐层X-Y方向二维扫描过程中，每隔2um，所述图像识别装置控制所述高速压电扫描装置沿Z轴方向对成像目标进行扫描，从而实现将大量二维扫描图像沿Z轴方向的堆叠，以重建出三维形态学图像；
[0018] 步骤三、在重建出的三维形态学图像的成像数据中进行识别和人工确定选择部分；
[0019] 步骤四、通过所述图像识别装置计算出步骤三中选择部分的三维扫描轨迹；
[0020] 步骤五、根据计算出的三维扫描轨迹进行第二次扫描，即重复步骤一与步骤二，实现选择部分的成像。
[0021] 一种高速三维双光子荧光成像系统的应用，其中所述高速三维双光子荧光成像系统的应用设置为实时记录视觉皮层神经细胞群兴奋时产生的钙
信号的变化。
[0022] 本发明具有的优点和积极效果是：
[0023] (1)通过共振扫描镜、检流计扫描镜与高速压电扫描装置的配合，以及由振动物镜实现高数值孔径聚焦光斑沿Z轴方向的移动，保证系统的轴向分辨率、横向分辨率、成像速度与
生物实验样品的特性，从而完成对整个样品高速三维成像。
[0024] (2)通过图像识别技术计算三维扫描轨迹，且由两次成像及优化三维成像空间的方法进一步提高三维成像速度，以解决共振扫描镜速度过慢的问题，并避免了声光偏转器件的使用。
[0025] (3)通过该高速三维双光子荧光成像系统应用于视觉皮层神经细胞群兴奋时产生的钙信号情况的记录，能够在测量神经细胞群钙离子的动力学变化时，同时实现对三维空间内神经细胞群兴奋后引起的钙离子尖峰的传播进行观察。
附图说明
[0026] 图1是本发明的结构示意图。
[0027] 图2是图1中高速压电扫描装置的
频率响应曲线图。
[0028] 图3是本发明实施实例部分的操作过程示意图。
[0029] 图中：10-双光子显微镜，20-X轴扫描装置，30-Y轴扫描装置，40-Z轴扫描装置，50-图像识别装置，501-图像采集部分，502-信息处理部分，503-控制部分。
具体实施方式
[0030] 为了更好的理解本发明，下面结合具体
实施例和附图对本发明进行进一步的描述。
[0031] 如图1-图3所示，一种高速三维双光子荧光成像系统，包括双光子显微镜10、近红外飞秒激光器、X轴扫描装置20、Y轴扫描装置30、Z轴扫描装置40和图像识别装置50，双光子显微镜10具有激发区域小，成像深度高，焦点外光漂白作用小等优点，而通过近红外飞秒激光器则能辅助实现钙离子荧光成像。
[0032] X轴扫描装置20设置为包括共振扫描镜，共振扫描镜用于实现双光子显微镜10对检测样品X轴方向的扫描，且该共振扫描镜设置为电性连接图像识别装置50。
[0033] Y轴扫描装置30设置为包括检流计扫描镜，检流计扫描镜实现了检测样品Y轴方向的线性扫描，且该检流计扫描镜设置为电性连接图像识别装置50，由共振扫描镜与检流计扫描镜相配合，完成检测样品X-Y方向的逐层二维扫描成像目标。
[0034] Z轴扫描装置40设置为包括高速压电扫描装置，高速压电扫描装置设置为通过振动物镜实现高数值孔径聚焦光斑沿Z轴方向的移动，且该高速压电扫描装置设置为电性连接图像识别装置50，高速压电扫描装置用于实现Z轴方向的线性扫描。
[0035] 图像识别装置50设置为包括图像采集部分501、信息处理部分502和控制部分503，图像采集部分501设置为采集共振扫描镜、检流计扫描镜与高速压电扫描装置对检测样品的扫描信息，且该图像采集部分501设置为将采集信息传递至信息处理部分502，由信息处理部分502将数据信息反馈至控制部分503，控制部分503根据反馈信息控制共振扫描镜、检流计扫描镜与高速压电扫描装置的工作情况，从而完成对整个样品的检测。
[0036] 共振扫描镜设置为每秒完成32000条扫描线的双向扫描方式。
[0037] 高速压电扫描装置设置为100um、80um以及40um的线性扫描范围，由于三维扫描范围的成像速率由Z轴扫描速率所决定，因此本设计可以提供20Hz-200Hz的三维成像速度。
[0038] 近红外飞秒激光器的激光光源设置为800nm波长，其脉冲宽度为100fs，且投射至检测样品的光功率为10-20mW。
[0039] 一种高速三维双光子荧光成像系统的成像方法，由高速三维双光子荧光成像系统实现扫描系统的控制和扫描轨迹的计算，以进行两次成像并优化三维成像空间，该方法包括如下成像步骤：
[0040] 步骤一、图像识别装置50控制共振扫描镜与检流计扫描镜对成像目标进行逐层X-Y方向二维扫描；
[0041] 步骤二、对成像目标进行逐层X-Y方向二维扫描过程中，每隔2um，图像识别装置50控制高速压电扫描装置沿Z轴方向对成像目标进行扫描，从而实现将大量二维扫描图像沿Z轴方向的堆叠，以重建出三维形态学图像；
[0042] 步骤三、在重建出的三维形态学图像的成像数据中进行识别和人工确定选择部分；
[0043] 步骤四、通过图像识别装置50计算出步骤三中选择部分的三维扫描轨迹；
[0044] 步骤五、根据计算出的三维扫描轨迹进行第二次扫描，即重复步骤一与步骤二，实现选择部分的成像。
[0045] 一种高速三维双光子荧光成像系统的应用，其中高速三维双光子荧光成像系统的应用设置为实时记录视觉皮层神经细胞群兴奋时产生的钙信号的变化。
[0046] 实施实例：使用本发明的高速三维双光子荧光成像系统用于对活体小鼠大脑视觉皮层神经细胞群的钙信号的变化进行记录，其操作过程如下：
[0047] (1)小鼠头部外科手术：采用C57BL/6 28-40天小鼠，首先将小鼠麻醉，然后将小鼠置于恒温加热板之上，通过仪器监测小鼠的呼吸和体温以保持麻醉深度。剪去小鼠头部的毛发，在头皮下注射
盐酸利多卡因进行局部麻醉。移除头骨上的头皮和局部组织。采用氰基
丙烯酸盐
粘合剂将一个记录腔固定在暴露的头骨上。用高速微型电钻和
钢针
切除头骨，切除面积约为2mmx2.5mm。用ACSF(人工
脑脊液)对脑组织进行灌流后，用琼脂糖溶液
覆盖脑组织形成保护层；
[0048] (2)双光子辅助下微型移液管插入：在该高速三维双光子荧光成像系统的高分辨率图像辅助下，通过微操作器将微型移液管与目标神经细胞群建立稳定接触，相对于常规电生理技术采用“盲插”法而言，该方法提高了微型移液管与神经细胞群稳定接触的成功率；
[0049] (3)
荧光染料注射：通过微型移液管对感兴趣的神经细胞注入红色荧光染料(Alex Fluro 594)和钙离子荧光染料(Oregon Green 488 BAPTA-1)进行荧
光标记，同时在高速三维双光子荧光成像系统上配备多个
光电倍增管和相应的滤光片，使得该成像系统的灵敏度更高且时间响应更快，可采用较弱光源，有效降低对细胞造成的损伤；
[0050] (4)第一次形态学三维扫描：将高速三维双光子荧光成像系统设置为全幅扫描模式，使得该模式下实现512x512
像素@4fps扫描，并在该扫描模式下进行二维
逐行扫描，每完成一
帧，高速三维双光子荧光成像系统的高速Z载物台向上移动0.25um，再进行下一帧扫描，重复该过程，以生成三维形态学图像；
[0051] (5)形态识别和选择：通过图像识别装置在(4)中第一次扫描获得的三维形态学图像中识别出感兴趣的神经细胞的主要部分，并人工进行选择；
[0052] (6)三维扫描轨迹计算：图像识别装置50根据选择的神经细胞计算出三维扫描轨迹，用于第二次钙信号三维扫描；
[0053] (7)第二次钙信号三维扫描以及H.视觉刺激：高速三维双光子荧光成像系统进行二维扫描过程中，同时设置一视觉刺激器，视觉刺激器设置为
液晶显示器，对该系统和视觉刺激器进行同步和控制，根据(6)中计算出的三维扫描轨迹进行第二次钙信号三维扫描，此时液晶显示器产生旋转的矩形光栅条纹，矩形光栅条纹用于刺激小鼠大脑视觉皮层，以记录神经细胞群在视觉刺激下产生的钙离子浓度变化造成的荧光强度变化；
[0054] (8)重复选择和记录：重复步骤(5)至(10)，选取不同的神经细胞群进行研究；
[0055] (9)数据分析和计算：对三维成像获得的大量数据进行
可视化处理等。
[0056] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本
专利涵盖范围之内。
