人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型及其制备方法
专利汇可以提供人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种人白血病－NOD/SCID小鼠髓外浸润模型的制备方法，包括以下步骤：一、白血病人骨髓单个核细胞制备，二、NOD/SCID小鼠预处理，三、模型建立，四、模型鉴定。本发明率先采用了尾静脉注射白血病人白血病人骨髓单个核细胞的方式建立人白血病－NOD/SCID小鼠髓外浸润模型的方法，且制备的白血病小鼠髓外浸润模型成功率高，存活时间长，可以为白血病髓外浸润机制研究，白血病药物筛选，基因和 分子靶向 治疗 提供新的动物模型。，下面是人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型的制备方法，包括以下步骤： 1)白血病人骨髓单个核细胞制备：选取急性白血病人或慢性粒白血病急变病人，常规无菌采集骨髓5ml，肝素抗凝，加入5ml淋巴细胞分离液，1800r/min水平离心10min，移入超净工作台，吸取中间白色单个核细胞悬浮层，移入另一支离心管中，加入5mlPBS液，水平离心1000r/min，10min；倒去上清，再次加入5mlPBS液，水平离心1000r/min，10min，弃去上清，0.9％的生理盐水调匀细胞，2％台盼蓝计数活细胞，将活细胞终浓度调至5×107/ml； 2)NOD/SCID小鼠预处理：SPF级NOD/SCID小鼠，5至6周龄，饲养于SPF级层流室，标准颗粒饲养，饮水酸化处理，垫料及一切与鼠接触物品均灭菌处理，接种前将小鼠置于无菌透气木盒中，处罩无菌消毒巾，在137cs源环境下照射270cGy，预处理后24h内接种白血病人单个骨髓核细胞，对小鼠所有操作均在无菌层流室内进行； 3)模型建立：将调整好浓度的白血病人白血病人骨髓单个核细胞尾静脉注射于预处理后的NOD/SCID小鼠，每只注射剂量为0.2ml，建议人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型； 4)模型鉴定。
2. 根据权利要求l所述的'种人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型的制备方 法，其特征在于，所述的选取急性白血病人或慢性粒白血病急变病人，外周 血白细胞^20X107ml且外周血涂片原始细胞加幼稚细胞数》60%。
3. 根据权利要求1所述的一种人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型的制备方 法，其特征在于，所述的模型鉴定采用如下指标：2) 小鼠外周血及骨髓细胞形态学特征；3) 小鼠各脏器病理变化；4) 白血病小鼠骨髓是否有人源性细胞的表达。
4. 根据权利要求3所述的一种人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型的制备方法，其特征在于，所述的模型鉴定指标采用如下鉴定方法：1) 小鼠外周血白细胞计数---自动血细胞分析仪；2) 外周血及骨髓细胞形态学改变——瑞氏-吉姆萨染色观察；3) 各脏器病理变化--HE染色观察；4) 白血病小鼠是否有人源性细胞表型的鉴定——流式细胞术。
5. 由权利要求1到4任一权利要求所述的一种人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸 润模型的制备方法制得的人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型，其特征在 于，所述模型具有下列特征：1) 小鼠外周血白细胞计数增高3倍以上增高；2) 小鼠骨髓有人源性细胞表达；3) 至少具有下列一项：a. 肝脏、脾脏和（或）肾脏肿大，经病理切片形态学观察有白血病细胞浸润；b. 头顿脑实质内、脑膜病理切片形态学观察有白血病细胞浸润；c. 胸部肺内、胸膜、纵隔病理切片形态学观察有白血病细胞浸润；d. 胰腺、后腹膜、肠系膜淋巴结病理切片形态学观察有白血病细胞浸润；e. 眼球肿大，经病理切片形态学观察有白血病细胞浸润；f. 胸骨和（或）股骨经病理切片形态学观察有白血病细胞浸润；g. 睾丸肿大，经病理切片形态学观察有白血病细胞浸润；h. 有腹水，腹水图片形态学观察有白血病细胞浸润。
人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型及其制备方法
技术领域
背景技术
N0D/SCID小鼠具有多方免疫缺陷，包括缺乏功能性淋巴细胞、血清免疫球 蛋白水平低，NK细胞活性明显减弱，成熟巨噬细胞减少，补体活性减低，渗漏 率低等，人源性细胞更容易在其体内生长，复制出更合适的人源性疾病模型， 在研究开发疫苗、药物试验、肿瘤防治等方面具有重要意义。
国外学者采取直接注射白血病人白血病人单个骨髓核细胞的方式，将处于慢性期、加速期、急变期CML患者外周血细胞，植入经全身照射预处理后的NOD/SCID 小鼠体内，发现可以顺利植入，建立白血病小鼠模型。但是目前国内外尚没有 利用尾静脉注射白血病人白血病人骨髓单个核细胞的方式建立人白血病 -NOD/SCID小鼠髓外浸润模型的报道。是否可以用注射白血病人白血病人骨髓 单个核细胞的方式建立长期存活的人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型，目 前并不清楚。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：人白血病-NOD/SCID 小鼠髓外浸润模型的制备方法，包括以下步骤：
一、 白血病人骨髓单个核细胞制备：选取急性白血病人或慢性 粒白血病急变病人，常规无菌采集骨髓5ml，肝素抗凝。加入5ml淋巴细胞分离 液，1800r/min水平离心10min，移入超净工作台，吸取中间白色单个核细胞悬 浮层，PBS液洗两遍，2%台盼蓝计数活细胞，将活细胞终浓度调至5X107ml， 即制得白血病人白血病人骨髓单个核细胞；
二、 NOD/SCID小鼠预处理：SPF级N0D/SC1D小鼠，5至6周龄，饲养于 SPF级层流室，标准颗粒饲养，饮水酸化处理，垫料及一切与鼠接触物品均灭 菌处理，接种前将小鼠置于无菌透气木盒中，外罩无菌消毒巾，在137"源环境下照射270cGy，预处理后24h内接种细胞，对小鼠所有操作均在无菌层流室内 进行；
三、 模型建立：将调整好浓度的白血病人白血病人骨髓单个核细胞尾静脉 注射于预处理后的NOD/SCID小鼠，每只注射剂量为0.2ml，建立人白血病 -NOD/SCID小鼠髓外浸润模型；
四、 模型鉴定
所述的模型鉴定采用如下指标：
1) 小鼠外周血白细胞计数…-自动血细胞分析仪；
2) 外周血及骨髓细胞形态学改变一-瑞氏-吉姆萨染色观察；
3) 各脏器病理变化--HE染色观察；
4) 白血病小鼠人源性细胞表型的鉴定--流式细胞术； 所述模型具有下列特征：
1) 小鼠竖毛、弓背、消瘦、活动性差，外周血白细胞计数明显增高；
2) 流式细胞术检测小鼠骨髓有人源性细胞表达；
3) 至少具有下列一项：
a) 肝脏、脾脏和（或）肾脏肿大，经病理切片形态学观察有白血病细胞 浸润；
b) 头颅脑实质内、脑膜病理切片形态学观察有白血病细胞浸润；
c) 胸部肺内、胸膜、纵隔病理切片形态学观察有白血病细胞浸润；
d) 胰腺、后腹膜、肠系膜淋巴结病理切片形态学观察有白血病细胞浸润；
e) 眼球肿大，经病理切片形态学观察有白血病细胞浸润；
f) 胸骨和（或）股骨经病理切片形态学观察有白血病细胞浸润g) 睾丸肿大，经病理切片形态学观察有白血病细胞浸润；
h) 有腹水，腹水图片形态学观察有白血病细胞浸润；
所述的选取急性白血病人或慢性粒白血病急变病人，应达到外周血白细胞 ^20X107ml且外周血涂片原始细胞加幼稚细胞数》60%。
所述的NOD/SCID小鼠饲养于SPF级层流室，对小鼠所有操作均在无菌层 流室内进行，137cs源环境下照射270cGy，预处理后24h内接种细胞1 X 107。
所述的人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型可以在白血病药物筛选，基 因和分子靶向治疗等领域得到广泛的应用。
本发明的有益效果是：本发明是采用尾静脉注射白血病人白血病人骨髓单 个核细胞的方式建立人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型的方法，且制备的 白血病小鼠髓外浸润模型成功率高，存活时间长，可以为白血病髓外浸润机制 研究，白血病药物筛选，基因和分子靶向治疗提供新的动物模型。
附图说明 图1白血病发病小鼠外在表现；
图2肿大的白血病小鼠肝脏，脾脏和肾脏；
图3组织病理切片：肝多发性灶性坏死，炎细胞浸润，肝血管旁瘤细胞浸润； 图4组织病理切片：脾大量瘤细胞浸润，正常组织结构破坏，脾中央动脉周瘤 细胞呈套袖状浸润；
图5组织病理切片：股骨骨髓大量瘤细胞浸润，正常组织结构破坏；
图6组织病理切片：胰腺大量瘤细胞浸润，瘤细胞坏死；
图7组织病理切片：胸骨骨髓人量瘤细胞浸润，瘤细胞侵犯周围肌肉组织；图8组织病理切片：脑膜瘤细胞浸润；
图9组织病理切片：眼球瘤细胞浸润，正常组织破坏；
图10腹水涂片可见大量白血病细胞；
图ll小鼠外周血白细胞计数图表；
图12流式细胞仪检测到小鼠骨髓人CD45阳性表达以及人源性白细胞CD2、 CD3 阳性表达；
具体实施方式：
结合下述实施实例对本发明做进一步说明，但本发明不仅限于下述实施实例。
1. 白血病人骨髓单个核细胞制备
选取急性白血病人或慢性粒细胞白血病急变病人，常规无菌采集骨髓5ml 肝素抗凝。用15ml离心管，先注入5ml淋巴细胞分离液，再将骨髓液缓缓注入， 使其浮于分离液上层；水平离心1800r/min， 10min;将离心管垂直缓慢移入超 净工作台，吸取中间白色单个核细胞悬浮层，PBS液洗两遍，2%台盼蓝计数活 细胞，将活细胞终浓度调至5 X 107m]。
2. NOD/SCID小鼠预处理
SPF级NOD/SCID小鼠，5至6周龄，饲养于SPF级层流室，标准颗粒饲养， 饮水酸化处理，垫料及一切与鼠接触物品均灭菌处理。接种前将小鼠置于无菌 透气木盒中，外罩无菌消毒巾，在137cs源环境下照射270cGy，预处理后24h内 接种细胞。对小鼠所有操作均在无菌层流室内进行；
3. 白血病小鼠髓外浸润模型的建立预处理后的N0D/SCID小鼠采用尾静脉注射的方式，使实验I组注射白血 病人骨髓单个核细胞1X10V只；实验II组：白血病人骨髓单个核细胞2X107 /只；设立CEM阳性对照组（CEM细胞1X10V只）；空白对照组（生理盐水0.2 ml/只）。注射后观察生存状态，并每周取外周血计数白细胞。在SPF级层流室 连续饲养4至8w后，处死小鼠，研究有无肝、脾、肾、淋巴结肿大以及脏器 病理改变。结果显示，注射白血病人白血病人骨髓单个核细胞的小鼠18只有1 5只相继出现竖毛，消瘦，嗜卧，腹水等症状（图1)，有肝、脾、肾、淋巴结 肿大（图2)等髓外浸润表现的有12只，CEM组9只均有髓外浸润表现。8 w后 注射白血病人白血病人骨髓单个核细胞的小鼠18只存活14只，阳性对照组存 活0只。
4.白血病小鼠髓外浸润模型的鉴定
4.1发病小鼠临床表现、腹水涂片镜检、外周血白细胞计数
发病小鼠出现消瘦乏力、竖毛弓背、毛色黯淡无光、歩态不稳，尚有部分 出现腹部肿块、腹水、淋巴结肿大、额头肿胀、失明等表现。有腹水的小鼠腹 水涂片镜可见大量白血病细胞，比例约为25至30%，这些肿瘤细胞胞浆丰富， 核大，呈深紫色，染色质细颗粒状，可见多个核仁（图IO)。外周血白细胞计数 从第三周开始明显升高（图11)，至末期达到31X107L，是空白对照组的5至 6倍。
4.2发病小鼠组织病理切片结果
取发病小鼠肝、脾、肾、脑、肺、胰腺、淋巴结、眼球、睾丸、胸骨、股 骨等组织器官石蜡包埋切片，进行HE染色，按步骤进行固定、洗涤和脱水、 透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片。结果显 示肝多发性灶性坏死，炎细胞浸润，肝血管旁瘤细胞浸润（图3);脾大量瘤细胞浸润，正常组织结构破坏，脾中央动脉周瘤细胞呈套袖状浸润（图4);股骨 骨髓大量瘤细胞浸润，正常组织结构破坏（图5);胰腺大量瘤细胞浸润，瘤细 胞坏死（图6);胸骨骨髓大量瘤细胞浸润，瘤细胞侵犯周围肌肉组织（图7);
脑膜瘤细胞浸润（图8);眼球瘤细胞浸润，正常组织破坏（图9);
4. 3发病小鼠流式细胞术分析免疫表型
剪取发病小鼠股骨，PBS液冲洗至骨髓腔发白，流式细胞仪检测骨髓细胞，
均有CD45表达，且可见表达HLA-DR、 CDllb、、 CD 2、 CD 5等人源性白细胞表 型（图12)。
综上所述，本发明通过给与N0D/SCID小鼠137cs源照射270cGy预处理，尾 静脉注射白血病人白血病人骨髓单个核细胞1X107，观察小鼠生存状态，定期 检测外周血白细胞计数，8w后处死，解剖查看肝、脾、肾、淋巴结等器官肿大 情况，组织病理切片检测白细胞浸润情况，流式细胞术检测发病小鼠骨髓人源 性细胞表型。
本发明的白血病小鼠髓外浸润模型成功率高，存活时间长，可以为白血病 髓外浸润机制研究，白血病药物筛选，基因和分子靶向治疗提供新的动物模型。
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