一种肿瘤疫苗治疗方法
专利汇可以提供一种肿瘤疫苗治疗方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 肿瘤 疫苗 治疗 方法，包括如下步骤：患者准备、术前检查、知情同意、肿瘤组织 切除 、术后处理、gp96蛋白纯化和临床治疗，本发明按照免疫程序,给患者皮下或皮内注射肿瘤自体gp96疫苗，gp96与 抗原 呈递细胞表面的热休克蛋白受体(CD91,CD36,SR-A,Lox-1,TLR2和TLR4等)相互作用,促进抗原呈递细胞的成熟和激活，抗原呈递细胞的激活和成熟是通过上调细胞表面的分子和分泌细胞因子和趋化因子实现的,gp96的佐剂特性和其结合的肿瘤来源的多肽为交叉呈递MIHC I和MHC Ⅱ限制性的多肽提供理想环境,肿瘤自体gp96激活靶向患者体内残留的肿瘤细胞和微转移的肿瘤细胞特异性的CD4+辅助性T细胞和细胞毒性的CD8+T细胞,具有较好的免疫特性，治疗效果优于手术、化疗等。，下面是一种肿瘤疫苗治疗方法专利的具体信息内容。
1.一种肿瘤疫苗治疗方法，其特征在于：包括如下步骤：
1.1受试者的准备
1.1.1纳入排除标准
(1)纳入标准：
a,符合结直肠癌手术适应征者；
b,白细胞(WBC)及血小板(PL)计数正常，血红蛋白(Hb)>10g/l；
c,肝肾功能正常。
(2)排除标准：
a,脑转移者；
b,复用其它具有免疫抑制作用的抗癌药物；
c,伴随自身免疫疾病者。
1.1.2术前检查
(1)血液学检查：如生化、血常规、乙肝五项、性病三项等，心电图、B超检查；
(2)腹部平片：检查是否属于富于血运的肿瘤；
(3)医师心理辅导，使患者从心理上消除紧张、恐惧，增强信心。
1.1.3知情同意
受试者自愿接受肿瘤疫苗治疗，并已充分了解肿瘤疫苗治疗的风险及可能出现的并发症。
1.2肿瘤组织的切除
1.2.1体位的选择：根据患者肿瘤的部位选择使用的体位；
1.2.2切口的选择：根据拍摄片子中肿瘤位置确定切口位置；
1.2.3麻醉：采用丙泊酚、氯胺酮、咪达唑仑、利多卡因基础麻醉，术中常规吸氧并监测生命体征，出现紧急情况参照应急预案处理；
1.2.4肿瘤切除：在手术显微镜的辅助下进行肿瘤切除。
1.3术后处理
1.3.1术后心电监护6小时；
1.3.2骶前闭式引流，引流液正常者术后4－5天拔除，有异常情况者对症处理，尿管术后5－6天拔除；
1.3.3加强护理，由护士第2－3给予流质饮食，逐渐增加量和过渡到普通饮食；
1.3.42天内预防感染，术后开始抗生素静脉点滴7天；
1.3.5功能训练：术后48小时后在相关科室附设的康复中心接受相应的综合康复训练；
1.3.6术后定期复查：血常规，腹部CT每月1次，如有复发则立即停止gp96–多肽复合物免疫治疗，结合病情安排常规化疗或再手术等其他治疗。
1.4gp96–多肽复合物纯化：
1.4.1肿瘤组织破碎
(1)将手术所取肿瘤组织研碎后，过滤一次，用300目网筛；
(2)按固体物体积比1/10，加入低渗裂解液，4℃浸10分钟后再粉碎；
(3)将低渗裂解液浸泡物放入超声粉碎机，破碎三次，每次4秒，在冰水中进行，再离心，
1小时，取上清液。
1.4.2肿瘤组织中SCM流式分选并体外扩增
(1)手术所取肿瘤组织量少，预估不足以提供足够HSPPC-gp96时(非坏死肿瘤组织≤
5g)；将肿瘤组织制备悬液并进行结直肠癌细胞建株及传代。a,在15ml无菌离心管中准备
5ml Basal Medium 1+培养液；b,在无菌条件下从手术切除的新鲜肿瘤组织边缘处切取直径约2～3mm组织立即转移到5ml Basal Medium 1+中；c,在生物安全柜中将组织块及培养液倒入无菌培养皿；d,将组织块切成0.5mm或更细小的碎片，转移到15ml离心管；5.5ml PBS润洗培养皿后转移到同一离心管，1500rpm 5min离心；e,弃上清后10ml PBS洗涤，1500rpm
5min离心，重复3次；f,从冰箱取出基质胶待其在冰上缓慢溶解；g,组织碎片最后一次离心后弃上清，向试管中加入10ml消化液和100ul，轻轻混匀后放入37℃消化60min，每隔10min震荡混合一次；h,离心，弃上清后10ml PBS洗涤2次并离心；i,用5ml PBS将消化的组织块重新悬浮，用100μl微量加样器将细小组织挑出，与300μl Basal Medium 1+和300μl基质胶混合，接种到12孔板上待基质胶变硬，再加入1ml Basal Medium 1+，余下的用70μm细胞滤网过滤，将>和<70μm的组织块离心后分别转入2个超低吸附培养皿添加12mlSCM培养液。j,基质胶中细胞回收：对于基质胶中的细胞团，显微镜下确认细胞克隆生长良好时，将12孔板从培养箱取出吸走培养液，每孔加冰PBS，并放在冰上至少10min，基质胶慢慢溶解，其中的细胞团随之进入PBS，转移到无菌离心管，离心、弃上清、洗涤3次。k,传代：培养液颜色变黄或一周后更换培养液；
(2)再将分选肿瘤细胞放置37℃培养箱培养，加入含重组粒细胞集落刺激因子(Recombinant granulocyte-colony stimulating factor,rhG-CSF)(美国,Sciencell,CA102-02)的SCM完全培养基刺激肿瘤细胞的体外扩增，收集到足够量SCM细胞,提取gp96-多肽复合物；
(3)按扩增细胞每瓶T25cm2，加入低渗裂解液2ml，4℃浸10min后再粉碎；
(4)将低渗裂解液浸泡物放入超声粉碎机，破碎3次，每次4秒，在冰水中进行，再离心，1小时，取上清液。
1.5临床治疗
gp96–多肽复合物的注射免疫：
(1)术后4-6周开始，25μg；皮下注射；每周一次；共四次；
(2)首轮治疗结束8周后，2.5μg、25μg或100μg；皮内注射；每周一次；共四次(第一个疗程)；
(3)二轮治疗结束8周后，2.5μg、25μg或100μg；皮内注射；每两周一次；共四次(第二个疗程)。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤疫苗治疗方法，其特征在于：所述乙肝五项：①乙肝表面抗原(HBsAg)、②乙肝表面抗体(抗-HBs)、③乙肝e抗原(HBeAg)、④乙肝e抗体(抗-HBe)、⑤乙肝核心抗体(抗-HBc)。
3.根据权利要求1所述的一种肿瘤疫苗治疗方法，其特征在于：所述遗传代谢病筛查包括氨基酸、有机酸、脂肪酸代谢筛查和酶学筛查；所述染色体分析及基因病筛查包括染色体分析和G显带分析；所述常见传染病筛查包括乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒标志物、巨细胞病毒(CMV)和EB病毒。
4.根据权利要求1所述的一种肿瘤疫苗治疗方法，其特征在于：成熟的gp96蛋白由4个结构域组成：N端结构域,含有ATP/核苷酸/药物结合区及结合抗原肽的区域；带电铰链区，位于N端结构域之后，是gp96发挥活性必需的，调节gp96构象的改变；中间结构域，含有参与蛋白-蛋白相互作用的亮氨酸拉链和KEKE区；C端结构域含有二聚化区,还有内质网定位信号KDEL基序。gp96N端的21个氨基酸的信号肽介导gp96分子进入内质网,进入内质网后信号肽被切除，gp96分子通过C端的KDEL序列与内质网中的KDEL受体相互作用滞留在内质网。
5.根据权利要求1所述的一种肿瘤疫苗治疗方法，其特征在于：所述上清液经ConA-Sepharose层析柱透析浓缩后，再用快速液相蛋白系统(FPLC)、过DEAE-52层析柱进行第二次分离，用20-500mmol/LNaCl洗脱，浓缩样品按1:5比例配DEAE-52，经上述步骤得到的HSPs可达电脉纯。
6.根据权利要求1和3所述的分离纯化方法，其特征在于：层析时省去ConA-Sepharose层析柱步骤，而只用DEAE-52层析柱进行两次层析分离，细胞破碎后，直接于FPLC系统上过DEAE-52柱，用20-500m mol/LNaCl洗脱。收集各峰蛋白，行SDS-PAGE，再行Western-Blot，然后寻找HSPs的相应蛋白峰，再行一次DEAE-52，以纯化，再纯度及产率，直到HSPs达到电脉纯。
7.根据权利要求1所述的一种肿瘤疫苗治疗方法，其特征在于：所述肿瘤的血运障碍的检查诊断：
7.1临床症状
7.1.1腹痛，为阵发性绞痛；
7.1.2呕吐，早期为反射性；晚期可为频繁呕吐，高位梗阻呕吐早，低位者呕吐迟；
7.1.3腹胀，一般高位者不明显；低位或麻痹性显著且范围广；
7.1.4肛门停止排便排气，高位或梗阻早期仍可有排气，有绞窄者可排粘液血便；
7.1.5可见肠型及蠕动波，肠鸣音亢进伴气过水声，腹膜炎、压痛及反跳痛为肠绞窄表现。
7.2诊断依据
7.2.1阵发性腹绞痛为早期或不全梗阻之表现；而持续性腹痛阵发性加重则为绞窄性梗阻早期特点。剧烈的持续性腹痛为梗阻晚期表现且可出现休克症状；
7.2.2早期频繁呕吐多为高位梗阻，出现较明显腹胀后才出现呕吐多为低位梗阻；
7.2.3停止肛门排气、排便；
7.2.4腹胀伴肠型、蠕动波、肠鸣音亢进和气过水声；
7.2.5局限或广泛腹部压痛反跳痛或抽出血性腹液为肠绞窄或穿孔、腹膜炎表现；
7.2.6腹平片中显示明显扩张肠管及气液面；
7.2.7明显或严重的全身性脱水伴电解质及酸碱平衡紊乱。
一种肿瘤疫苗治疗方法
技术领域
背景技术
发明内容
5min离心，重复3次；f,从冰箱取出基质胶待其在冰上缓慢溶解；g,组织碎片最后一次离心后弃上清，向试管中加入10ml消化液和100ul，轻轻混匀后放入37℃消化60min，每隔10min震荡混合一次；h,离心，弃上清后10ml PBS洗涤2次并离心；i,用5ml PBS将消化的组织块重新悬浮，用100μl微量加样器将细小组织挑出，与300μl Basal Medium 1+和300μl基质胶混合，接种到12孔板上待基质胶变硬，再加入1ml Basal Medium 1+，余下的用70μm细胞滤网过滤，将>和<70μm的组织块离心后分别转入2个超低吸附培养皿添加12mlSCM培养液。j,基质胶中细胞回收：对于基质胶中的细胞团，显微镜下确认细胞克隆生长良好时，将12孔板从培养箱取出吸走培养液，每孔加冰PBS，并放在冰上至少10min，基质胶慢慢溶解，其中的细胞团随之进入PBS，转移到无菌离心管，离心、弃上清、洗涤3次。k,传代：培养液颜色变黄或一周后更换培养液；
具体实施方式
5min离心，重复3次；f,从冰箱取出基质胶待其在冰上缓慢溶解；g,组织碎片最后一次离心后弃上清，向试管中加入10ml消化液和100ul，轻轻混匀后放入37℃消化60min，每隔10min震荡混合一次；h,离心，弃上清后10ml PBS洗涤2次并离心；i,用5ml PBS将消化的组织块重新悬浮，用100μl微量加样器将细小组织挑出，与300μl Basal Medium 1+和300μl基质胶混合，接种到12孔板上待基质胶变硬，再加入1ml Basal Medium 1+，余下的用70μm细胞滤网过滤，将>和<70μm的组织块离心后分别转入2个超低吸附培养皿添加12mlSCM培养液。j,基质胶中细胞回收：对于基质胶中的细胞团，显微镜下确认细胞克隆生长良好时，将12孔板从培养箱取出吸走培养液，每孔加冰PBS，并放在冰上至少10min，基质胶慢慢溶解，其中的细胞团随之进入PBS，转移到无菌离心管，离心、弃上清、洗涤3次。k,传代：培养液颜色变黄或一周后更换培养液；
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