1.总的信息
本文所用术语“衍生自”应被认为是表示一具体的整体(integer) 可以获自一特定来源，但是不是必须直接来自该来源。
除非上下文有需要或者特别指出相反教导，否则本文中作为单数 形式的整体、步骤或元件而叙述的本发明的整体、步骤或元件清楚地 包括单数和复数形式的所叙述的整体、步骤或元件。
本文中针对任一单个的实施方案以及特别是针对任何蛋白质或 其在结核分支杆菌的诊断、预后或治疗中的用途而描述的本发明的实 施方案应被理解为加以必要的变更而适用于本文描述的本发明的任 何其它实施方案。
本文描述的用于个体对象的诊断实施方案加以必要的变更后清 楚地适用于种群(population)、种族群体(racial group)或亚群 (sub-group)的流行病学或具有特定MHC限制性的个体的诊断或预 后。本领域技术人员基于本文描述的主题可以容易地获得本发明的所 有这类变异。
在本说明书中，除非上下文有需要，否则术语“包含”应被理解 为包括所描述的步骤或元件或整体或者步骤或元件或整体组，但不排 除任何其它步骤或元件或整体或元件或整体组。
本领域技术人员应理解本文描述的本发明可以有与特异描述不 同的变异和修改。应理解的是本发明包括所有这类变异和修改。本发 明还包括本说明书中个别或统一引用的或指出的步骤、特征、组合物 和化合物的全体以及所述步骤或特征的任何和全部的组合或者任何 两个或多个。
本发明范围不限于本文描述的具体实施例。功能等价的产品、组 合物和方法清楚地包括在本文所述的本发明范围内。
除非另有指明，否则使用分子生物学、微生物学、蛋白质组学、 病毒学、重组DNA技术、溶液肽合成、固相肽合成和免疫学的常规 技术无需过多实验即可实施本发明。这些程序例如在并入参考的下述 文献中描述：
1.Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Second Edition (1989)，whole of VoIs I，II，and III；
2.DNA Cloning：A Practical Approach，VoIs.I and II(D.N.Glover， ed.5 1985)，IRL Press，Oxford，whole of text；
3.Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(M.J.Gait，ed.， 1984)IRL Press，Oxford，whole of text，and particularly the papers therein by Gait，pp1-22；Atkinson et al，[rho]p35-81；Sproat et al，pp 83-115；and Wu et al，pp 135-151；
4.Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1985)IRL Press，Oxford，whole of text；
5.Immobilized Cells and Enzymes：A Practical Approach(1986) IRL Press，Oxford，whole of text；
6.Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；
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8.J.F.Ramalho Ortigao，″The Chemistry of Peptide Synthesis″In： Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website(Interactiva， Germany)；
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10.Merrifield，R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154.
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12.Wünsch，E.，ed.(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie(M[upsilon]ler，E.，ed.)，vol.15，4th edn.，Parts 1 and 2，Thieme，Stuttgart.
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17.Wilkins M.R.，Williams K.L.，Appel R.D.and Hochstrasser (Eds)1997 Proteome Research：New Frontiers in Functional Genomics Springer，Berlin.
2.相关技术描述
结核病是一种慢性传染病，通常由结核分支杆菌感染导致。它是 发展中国家的主要疾病并且在世界的发达区域也越来越成问题，每年 有约8百万新增病例，3百万人死亡。尽管在相当一段时间感染是无 症状的，但是该病最常见的表现形式是急性肺部炎症，导致发热和痰 咳。如果不治疗，结核分支杆菌感染可行进超出肺部原发感染部位而 到达身体任何器官，通常导致严重的并发症和死亡。
迅速增加的全球性结核病发病率和微生物抗性问题经常被医疗 保健行业许多研究人员描述并且为本领域技术人员所熟知。特别是越 来越认识到急需新的诊断剂、药物和疫苗。
结核分支杆菌在宿主内保持和增殖的免疫学机制尚不很清楚。其 结果是结核病与宿主之间的免疫学关系的任何新信息都可以被清楚 地以多种不同方式应用以改善该病的诊断、治疗。
结核病的发病在晚期AIDS病人中特别常见，他们大多数都受此 痛苦。事实上，HIV感染是在纯化蛋白衍生物(PPD)结核菌素对象 中发生活动性结核病的最重要的风险因子，并且与未被HIV感染的 个体相比在HIV感染的免疫抑制个体中发生结核病感染的风险可能 显著增加。另外还可能的是HIV-I和结核分支杆菌的共感染介导了无 HIV症状期的缩短以及对象存活时间缩短，这可能是通过引发增加的 病毒复制和病毒负荷，导致CD4+T细胞耗竭和免疫缺陷或免疫抑制 所致(Corbett et al 2003；Ho，Mem.Inst.Oswaldo Cruz，91，385-387， 1996)。
结核分支杆菌基因组的测序为鉴别理论上可能被该生物表达的 潜在结核分支杆菌蛋白质的无数研究努力提供了便利。然而测序数据 单独不足以总结出任一特定蛋白质在体内被该生物表达，更不用说在 感染人和其它动物期间表达了。结核分支杆菌基因组中阅读框的阐明 也不意味着所编码的或实际被该细菌表达的任何特定蛋白质包括制 备诊断、预后和治疗性免疫学试剂所需的任何免疫显性B细胞表位 或T细胞表位。例如，为了确定结核分支杆菌的一特定蛋白质或其衍 生片段具有作为免疫测定中的诊断试剂的功效或者适合用于疫苗制 备物中，需要表明该蛋白质在细菌的感染周期中表达并且宿主生物对 该蛋白质和/或包含B细胞表位或T细胞表位(例如，CD8+限制的 CTL表位)的肽片段产生免疫应答。
在培养物中生长结核分支杆菌的能力为鉴别体外表达的结核病 蛋白提供了一种方便的模型。但是，培养环境与体内发现结核分支杆 菌的人巨噬细胞、肺或肺外部位(extrapulmonary site)的环境显著不 同。最近的证据表明胞内寄生物如结核分支杆菌的蛋白质表达谱根据 环境信号而发生显著变化，从而该生物的体外表达谱可能不能准确反 映该生物的原位表达谱。
用结核分支杆菌感染或再激活潜伏的感染诱导了宿主应答，包括 单核细胞和巨噬细胞向感染部位的募集。随着更多免疫细胞的积累， 形成了肉芽结节，其包括免疫细胞和已被巨噬细胞的细胞毒性产物破 坏的宿主组织。随着疾病的进程，巨噬细胞酶导致蛋白质、脂质和核 酸水解，由此周围组织液化并形成肉芽。最终，损害破裂，杆菌释放 进周围肺、血液或淋巴系统。
在这一感染周期期间，杆菌暴露于四种不同的宿主环境，即肺泡 巨噬细胞、干酪肉芽(caseous granuloma)、胞外肺和肺外部位如肾或 腹膜腔、淋巴、骨或脊柱。
据认为杆菌可在所有这些环境中复制至不同程度，但是对每一部 位的环境条件却所知甚少。所有四种宿主环境是不同的，提示结核分 支杆菌在每一环境中的表达谱是不同的。
因此，对来自对数期培养物的结核分支杆菌蛋白质的鉴别不一定 提示哪些蛋白质在每种体内环境中被表达或是高度免疫原性的。类似 地，对在体外生长的巨噬细胞中的结核分支杆菌的鉴别不一定模拟了 在干酪肉芽、高充气肺或具有低氧含量的肺外部位中的结核分支杆菌 的蛋白质表达谱。
另外，宿主内的结核分支杆菌感染可见为一动态事件，其中宿主 免疫系统持续试图通过感染的巨噬细胞的破坏而包囊化杆菌并消灭 其。其结果是，结核分支杆菌经历胞内生长、破坏(其中胞内和分泌 的细菌蛋白均被暴露和破坏)和快速细胞外繁殖的周期。宿主和病原 体的相互作用是许多因素的结果，其不能在体外重现。
因此，直到本发明做出之前，尚不清楚哪些结核分支杆菌蛋白质 在任一体内特定环境中是最高表达的和/或高免疫学活性的或免疫原 性的结核分支杆菌蛋白质。
很明显，仍需要快速和廉价的诊断和预后试剂以确定结核分支杆 菌感染和/或与其相关的疾病症状。
发明概述
在导致完成本发明的工作中，本发明人希望阐明在一系列体内环 境中由结核分支杆菌表达的蛋白质范围，以便鉴别高表达的和/或高 免疫原性的结核分支杆菌蛋白质。
本发明人使用蛋白质组学途径来鉴别一组患者体液包括痰、胸膜 腔积液(pleural fluid)、血浆和血清中的结核分支杆菌蛋白质。在一 组结核分支杆菌感染的患者的样品中鉴别了一种在体内高表达的结 核分支杆菌蛋白质，它与预测由结核分支杆菌基因组编码的一个序列 具有高氨基酸序列相同性。本发明人鉴别的蛋白质包括SEQ ID NO：1 所示的氨基酸序列。在大规模筛选中，有47％的TB阳性对象显示出 产生抗该蛋白质的抗体应答，而仅有6％的TB阴性对象显示出产生 抗该蛋白质的抗体应答，提示该蛋白质的存在与TB诊断相关。
SEQ ID NO：1的氨基酸序列命名为“BSX”。序列分析表明结核 分支杆菌蛋白BSX的序列包括一在XRE家族样蛋白质(即与某些原 核基因(例如Cro，cl，HipB)上游区域中的cw作用异型生物质 (xenobiotic)应答元件结合的转录调节蛋白)中发现的螺旋-转角- 螺旋基序。
本发明人进一步产生了一PEPSET，其包括43个合成的重叠肽 (即SEQ ID NO：2-44)，它们覆盖了SEQ ID NO：1的氨基酸序列，用 以确定该鉴别的蛋白质是否跨地理和跨种族界限而存在，并且鉴别用 于后续单克隆和多克隆抗体产生的B细胞表位。筛选TB阴性血清和 来自包括对于人免疫缺陷病毒(HIV-I和/或HIV-2)呈血清学阴性或 血清学阳性的TB患者在内的TB阳性对象的血清，确定其中是否存 在对PEPSET中的每种肽的抗体。在TB阳性组中，这些肽中有六种 是免疫原性的。很高比例(80％)的HIV+ZTB+对象具有针对8种肽 的抗体，而仅有25％的HIVVTB+对象有所述抗体。所有这些肽(SEQ ID NO：14、20、21、22、24、25和36)在对照组中均不出现，提示 它们可用作特别是HIV感染的个体中结核分支杆菌的潜伏和活动感 染的诊断指示剂。
本发明人进一步示出抗SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其B 细胞表位的抗体在结核分支杆菌的肺外感染过程中存在于对象中，至 少在一个种群中。因此，本发明人检查了对这些抗体的检测是否可以 作为诊断结核病的合适的测定示值读数(readout)。有关这一点，本 发明人确定包含SEQ ID NO：1所示序列的重组BSX蛋白和包含SEQ ID NO：24-25内的免疫显性B细胞表位的肽(例如包含SEQ ID NO：45 的序列的肽)根据它们的高灵敏性和特异性可以用于基于抗体的结核 病诊断测试中，包括多分析物测试。衍生自BSX蛋白的全长序列的 其它肽，例如包含SEQ ID NO：46和47的序列的肽根据它们的高特 异性可用于这些测试中，例如在一多分析物测定形式中作为二级配 体。
本发明人还制备了抗BSX衍生肽的抗体，用于开发基于抗原的 诊断和预后测定。产生表达抗选定的肽的抗体的血浆细胞瘤，这些细 胞瘤可用于例如产生杂交瘤，所述杂交瘤表达单克隆抗体，这些单克 隆抗体结合患者样品中的结核分支杆菌BSX蛋白的B细胞表位，由 此检测细菌。为了选择能够检测患者血清中纳克/ml或皮克/ml以下 水平的血清中结核分支杆菌BSX蛋白的高亲和性抗体，还获得了其 它的抗体。
这些发现为产生用于检测对象中结核分支杆菌感染的新的诊断 剂和用于感染或与其相关的疾病状态的进程的新的预后指示剂提供 了措施。优选地，BSX蛋白或其B细胞表位用于感染或疾病的早期 诊断。本领域技术人员清楚本文所述的这类预后指示剂可与结核病或 其相关感染的治疗疗法结合使用。
因此，本发明为产生用于检测对象中结核分支杆菌感染的新的诊 断剂和用于感染或与其相关的疾病状态的进程的新的预后指示剂提 供了措施，其可以单独检测BSX，也可以作为多分析物检测的一部 分。优选地，BSX蛋白或其B细胞表位用于感染或疾病的早期诊断。 本领域技术人员清楚本文所述的这类预后指示剂可与结核病或其相 关感染的治疗疗法结合使用。
例如，本发明提供了分离的或重组的免疫原性结核分支杆菌BSX 蛋白或其免疫原性BSX肽或免疫原性BSX片段或表位。
优选地，所述分离的或重组的免疫原性结核分支杆菌BSX蛋白 包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO：1有至少约 95％相同性的氨基酸序列。
优选地，所述免疫原性BSX肽是一种合成肽。优选地，BSX肽、 片段或表位包含SEQ ID NO：1所示序列的至少约5个连续氨基酸残 基，更优选地，包含SEQ ID NO：1所示序列的至少约10个连续氨基 酸残基，还更优选地，包含SEQ ID NO：1所示序列的至少约15个连 续氨基酸残基，还更优选地，包含在N-末端和/或C-末端融合有约1-5 个额外氨基酸残基的SEQ ID NO：1所示序列的至少约5个连续氨基 酸残基。
在一个特别优选的实施方案中，BSX肽、肽或表位包含SEQ ID NO：2-53中的任一氨基酸序列，优选地，包含选自SEQ ID NO：14、 20、21、22、24、25、36、45、46和47的序列，更优选地，包含选 自SEQ ID NO：24、25、45、46和47的序列，还更优选地，包含选 自SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：45的序列，或任一所述序列的免疫 学交叉反应变体，所述变体包含与所述序列有至少约95％相同性的氨 基酸序列。
从本发明公开可以清楚优选的免疫原性BSX肽、片段或表位包 含位于SEQ ID NO：1的约残基65至约残基84之间的至少约5个连 续氨基酸残基的氨基酸序列，更优选地，位于SEQ ID NO：1的约残 基65至约残基75之间的至少约5个连续氨基酸残基的氨基酸序列。 还更优选地，优选的免疫原性BSX肽、片段或表位包含位于SEQ ID NO：1的残基67至残基73之间的至少约5个连续氨基酸残基的氨基 酸序列，相应于SEQ ID NO：45所示序列的至少5个连续残基。这包 括任何包含N-末端延伸至多约5个氨基酸残基长度和/或C-末端延伸 至多约5个氨基酸残基长度的肽。
本发明范围还清楚地包括包含用于例如促进检测或分离或固定 化的一或多个标记或检测部分的分离的或重组的免疫原性结核分支 杆菌BSX蛋白或其免疫原性BSX肽或免疫原性BSX片段或表位。 优选的标记包括例如生物素、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、FLAG表 位、六组氨酸、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、链霉抗生物素蛋白 或金。
本发明还提供了融合蛋白，其包含一或多个根据本文所述任一实 施方案的免疫原性BSX肽、片段或表位。例如，BSX蛋白的N-末端 和C-末端部分可被融合，如SEQ ID NO：46所提供的，其中7个N- 末端残基和7个C-末端通过一内部半胱氨酸残基而融合。本领域技 术人员能认识到这种内部连接残基是任选的或优选的并且对于融合 蛋白的生产或每种用途不是必需的。但是，优选的融合蛋白可包括一 接头，以将免疫原性BSX肽与一或两个其它肽部分分离，所述接头 例如是一个单氨基酸残基(例如甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸)、肽接 头(例如非免疫原性肽如聚赖氨酸或聚甘氨酸)、包含多至约6或8 或10或12个碳残基的多碳接头、或一种化学接头。这些接头例如通 过允许与脂质或半抗原连接或允许与配体交联或结合而可促进抗体 产生或疫苗配制。蛋白质作为融合体表达也可增加其可溶性。
优选的融合蛋白包含与载体蛋白、可检测标记或报道分子融合的 BSX蛋白、肽、片段或表位，所述载体蛋白、可检测标记或报道分 子例如为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、FLAG表位、六组氨酸、β-半 乳糖苷酶、硫氧还蛋白(TRX)(La Vallie et al，Bio/Technology 11， 187-193，1993)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、大肠杆菌NusA蛋白(Fayard， E.M.S.，Thesis，University of Oklahoma，USA，1999；Harrison， inNovations 11，4-7，2000)、大肠杆菌BFR(Harrison，inNovations 11，4- 7，2000)、大肠杆菌GrpE(Harrison，inNovations 11，4-7，2000)。
本发明还提供了分离的蛋白质聚集体，其包含一或多个本文所述 任一实施方案的免疫原性BSX肽、片段或表位。优选的蛋白质聚集 体包含与一种免疫球蛋白例如IgA、IgM或IgG复合的所述蛋白质、 肽、片段或表位，如循环免疫复合物(CIC)。示例性的蛋白质聚集 体可以被衍生，例如衍生自对象的含有抗体的生物学样品。
本发明还包括根据本文所述任一实施方案的分离的或重组的免 疫原性结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性BSX肽或免疫原性BSX 片段或表位用于检测对象中继往的或当前的结核分支杆菌感染或潜 伏感染的用途，其中所述感染通过得自对象的样品中的抗体与所述分 离的或重组的免疫原性BSX蛋白或免疫原性BSX肽或免疫原性BSX 片段或表位的结合而确定。
本发明还包括根据本文所述任一实施方案的分离的或重组的免 疫原性结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性BSX肽或免疫原性BSX 片段或表位用于引起结合结核分支杆菌BSX的抗体产生的用途。
本发明还包括根据本文所述任一实施方案的分离的或重组的免 疫原性结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性BSX肽或免疫原性BSX 片段或表位在制备用于免疫接种对象以抗结核分支杆菌感染的药物 中的用途。
本发明还提供了药物组合物，其包含与药物学可接受的稀释剂例 如佐剂组合的根据本文所述任一实施方案的分离的或重组的免疫原 性结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性BSX肽或免疫原性BSX片 段或表位。
本发明还提供了分离的核酸，其编码根据本文所述任一实施方案 的分离的或重组的免疫原性结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性 BSX肽或免疫原性BSX片段或表位，其用于制备基于核酸的疫苗或 用于表达免疫原性多肽、蛋白质、肽、片段或表位。
本发明还提供了表达根据本文所述任一实施方案的分离的或重 组的免疫原性结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性BSX肽或免疫原 性BSX片段或表位的细胞。所述细胞可优选地由例如在其表面表达 所述分离的或重组的免疫原性结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性 BSX肽或免疫原性BSX片段或表位的抗原呈递细胞(APC)组成。
本发明还提供了特异性结合根据本文所述任一实施方案的分离 的或重组的免疫原性结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性BSX肽或 免疫原性BSX片段或表位的、或者特异性结合包含所述免疫原性 BSX蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白质聚集体的分离的或 重组的抗体或抗体的免疫反应性片段。优选的抗体包括例如单克隆或 多克隆抗体制备物。这延及产生结合BSX蛋白或BSX蛋白的免疫原 性片段或包含衍生自BSX蛋白序列的序列的其它免疫原性肽的抗体 的任何分离的抗体产生细胞或抗体产生细胞群，例如杂交瘤或浆细胞 瘤。
本发明还提供了根据本文所述任一实施方案的分离的或重组的 抗体或其免疫反应性片段的药物用途。
本发明还提供了本文所述任一实施方案的分离的或重组的抗体 或其免疫反应性片段用于检测对象中继往的或当前的(活动性)结核 分支杆菌感染或潜伏感染的用途，其中所述感染通过所述抗体或片段 与得自对象的生物学样品中存在的结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫 原性片段或表位的结合而确定。
本发明还提供了本文所述任一实施方案的分离的或重组的抗体 或其免疫反应性片段用于鉴别结核分支杆菌或由结核分支杆菌感染 的细胞或用于选择或计数所述细菌或所述细胞的用途。
所述分离的或重组的抗体或其免疫反应性片段还可用于治疗性、 诊断性和研究性应用，用于检测结核分支杆菌的继往的或当前的感染 或潜伏的感染，这通过所述抗体与来自对象的生物学样品中存在的结 核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性片段或表位而确定(即基于抗原 的免疫测定)。
本发明抗体的其它应用包括纯化和研究诊断性/预后性BSX蛋 白、鉴别用结核分支杆菌感染的细胞或用于选择或计数所述细胞。
所述抗体及其片段还可用于治疗，包括预防、诊断或预后，以及 这些抗体或片段在制备用于治疗结核分支杆菌感染的药物中的应用。 例如，产生特异的人源化抗体或配体，它们特别是在体内结合并中和 BSX蛋白或结核分支杆菌。所述人源化抗体或配体被用于制备用于 治疗人类对象中TB特异性疾病或结核分支杆菌感染、如治疗活动性 或慢性结核分支杆菌感染的药物。
本发明还提供了一种组合物，其包含本文所述任一实施方案的分 离的或重组的抗体以及药物学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供了诊断对象中的结核病或结核分支杆菌感染的方 法，包括检测来自所述对象的生物学样品中的抗免疫原性BSX蛋白 或其免疫原性BSX肽或免疫原性BSX片段或表位的抗体，所述样品 中存在所述抗体是感染的指征。在一相关的实施方案中，所述样品中 存在所述抗体是感染的指征。感染可以是继往的或活动的感染，或潜 伏感染，但是这一测定形式特别用于检测活动感染和/或最近的感染。
例如，所述方法可以是一种免疫测定，例如包括将衍生自对象的 生物学样品与根据本文所述任一实施方案的分离的或重组的免疫原 性结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性BSX肽或免疫原性BSX片 段或表位(例如，如下的肽：其包含SEQ ID NO：2-53任一氨基酸序 列、优选地选自SEQ ID NO：14、20、21、22、24、25、36、45、46 和47的序列、更优选地选自SEQ ID NO：24、25、45、46和47的序 列、还更优选地选自SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：45的序列、或者 包含与上述任一所述序列有至少约95％相同性的氨基酸序列的上述 任一所述序列的免疫学交叉反应性变体)接触，接触的时间和条件为 足以形成抗原-抗体复合物，然后检测抗原-抗体复合物的形成。样品 是含抗体的样品，例如包含得自对象的血液或血清或免疫球蛋白级分 的样品。样品可以含有与BSX抗原片段复合形式的循环抗体。通常， 抗原-抗体复合物在使用能结合患者的免疫球蛋白的抗体例如抗人Ig 抗体的测定形式中检测。
本发明范围包括这一测定形式的多分析物检测，其中使用多个抗 原表位证实使用BSX肽获得的诊断。例如，患者样品可以与BSX或 免疫原性BSX肽或片段或表位接触或者与结核分支杆菌谷氨酰胺合 酶(GS)蛋白(例如SwissProt Database登录号033342)或自其衍生 的免疫原性肽例如衍生自GS蛋白的表面暴露区域的或包含序列 RGTDGSAVFADSNGPHGMSSMFRSFC(SEQ ID NO：54)或 WASGYRGLTPASDYNIDYAIC(SEQ ID NO：55)的肽接触。用于检测 结核病或结核分支杆菌感染的免疫原性结核分支杆菌GS和肽衍生物 也在本申请人的共同在审国际专利申请PCT/AU2005/000930(申请日 2005年6月24日)中详细描述，该申请全文引入本文作参考。用于 二级分析物例如抗谷氨酰胺合酶的抗体的测定可以方便以与检测血 清中的抗BSX的抗体相同的方式进行。这些测定可以同时或不同时 进行，使用相同或不同的患者样品。这些测定还可以在同一反应容器 中进行，只要是使用不同的检测系统来检测不同的抗体，例如用不同 的报道分子如不同颜色的染料、荧光团、放射性核苷酸 (radionucleotide)或酶标记的抗人Ig。
本文所用术语“感染”应理解为微生物、特别是细菌或病毒在对 象的呼吸道中的入侵和/或建群和/或微生物的增殖。这种感染可以是 不明显的或者导致局部细胞损伤。感染可以是局部的、亚临床的和暂 时的，或者可以通过蔓延而传播，变为急性或慢性临床感染。感染也 可以是继往感染(past infection)，其中宿主中还保留有残余的BSX 抗原或结合分离的BSX蛋白或肽的反应性宿主抗体。感染也可以是 潜伏感染，其中微生物存在于对象中，但是对象不表现出与该微生物 相关的疾病症状。优选地，感染是结核分支杆菌肺部感染或肺外感染， 更优选地，是肺外感染。“肺部”感染是指肺气道的感染，如肺组织、 支气管、细支气管、呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊或肺泡的感染。 “肺外(extra-pulmonary)”是指肺部之外，包括例如肾、淋巴、尿道、 骨、皮肤、脊髓液、小肠、腹膜、胸膜和心包腔。
本发明还提供了诊断对象中的结核病或结核分支杆菌感染的方 法，包括在来自所述对象的生物学样品中检测免疫原性BSX蛋白或 其免疫原性BSX肽或免疫原性BSX片段或表位，其中所述蛋白或免 疫原性片段或表位在样品中的存在是疾病、疾病进程或感染的指征。 在一相关的实施方案中，所述蛋白或免疫原性片段或表位在样品中的 存在是感染的指征。例如，所述方法可以包括免疫测定，例如将衍生 自对象的生物学样品与能够结合BSX蛋白或其免疫原性片段或表位 的一或多种抗体接触，并检测抗原-抗体复合物的形成。在一个特别 优选的实施方案中，抗体是分离的或重组的抗体或抗体的免疫反应性 片段，其特异性结合根据本文所述的任一实施方案的分离的或重组的 免疫原性结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性BSX肽或免疫原性 BSX片段或表位，或特异性结合包含所述免疫原性BSX蛋白、肽、 片段或表位的融合蛋白或蛋白质聚集体。本发明的诊断测定特别用于 检测无免疫应答的(immune compromised)或免疫缺陷的对象例如 HIV+对象中的TB。用于进行这种测定的样品包括例如(i)选自如 下一组的组织的提取物，所述的组由脑、乳腺、卵巢、肺、结肠、胰 腺、睾丸、肝、肌肉、骨骼及其混合物组成；(ii)选自如下一组的体 液，所述的组由痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜腔积液及其 混合物组成；(iii)衍生自体液的样品，所述体液选自由痰、血清、 血浆、全血、唾液、尿、胸膜腔积液及其混合物组成的一组。
本发明还提供了确定患有结核病或结核分支杆菌感染的对象对 用针对所述结核病或感染的治疗性化合物的治疗的应答的方法，所述 方法包括检测来自所述对象的生物学样品中的BSX蛋白或其免疫原 性片段或表位，其中所述蛋白或片段或表位的水平相比于在正常或健 康对象中可检测到的该蛋白或片段或表位的水平增加则表示该对象 对所述治疗无应答或者未消除疾病或感染。例如，所述方法可包括一 种免疫测定，例如，将衍生自所述对象的生物学样品与一或多种能与 BSX蛋白或其免疫原性片段或表位结合的抗体接触，并检测抗原-抗 体复合物的形成。在一个特别优选的实施方案中，抗体是一种分离的 或重组的抗体或抗体的免疫反应性片段，其特异性结合根据本文所述 的任一实施方案的分离的或重组的免疫原性结核分支杆菌BSX蛋白 或其免疫原性BSX肽或免疫原性BSX片段或表位，或特异性结合包 含所述免疫原性BSX蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白质聚 集体。本发明的诊断测定特别用于检测无免疫应答的或免疫缺陷的对 象例如HIV+对象中的TB。用于进行这种测定的样品包括例如(i) 选自如下一组的组织的提取物，所述的组由脑、乳腺、卵巢、肺、结 肠、胰腺、睾丸、肝、肌肉、骨骼及其混合物组成；(ii)选自如下一 组的体液，所述的组由痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜腔积 液及其混合物组成；(iii)衍生自体液的样品，所述体液选自由痰、 血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜腔积液及其混合物组成的一组。
本发明还提供了确定患有结核病或结核分支杆菌感染的对象对 用针对所述结核病或感染的治疗性化合物的治疗的应答的方法，所述 方法包括检测来自所述对象的生物学样品中的BSX蛋白或其免疫原 性片段或表位，其中所述蛋白或片段或表位的水平相比于在患有结核 病或结核分支杆菌感染的对象中可检测到的该蛋白或片段或表位的 水平降低则表示该对象对所述治疗有应答或者已经消除了疾病或感 染。例如，所述方法可包括一种免疫测定，例如，将衍生自所述对象 的生物学样品与一或多种能与BSX蛋白或其免疫原性片段或表位结 合的抗体接触，并检测抗原-抗体复合物的形成。在一个特别优选的 实施方案中，抗体是一种分离的或重组的抗体或抗体的免疫反应性片 段，其特异性结合根据本文所述的任一实施方案的分离的或重组的免 疫原性结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性BSX肽或免疫原性BSX 片段或表位，或特异性结合包含所述免疫原性BSX蛋白、肽、片段 或表位的融合蛋白或蛋白质聚集体。本发明的诊断测定特别用于检测 无免疫应答的或免疫缺陷的对象例如HIV+对象中的TB。用于进行 这种测定的样品包括例如(i)选自如下一组的组织的提取物，所述 的组由脑、乳腺、卵巢、肺、结肠、胰腺、睾丸、肝、肌肉、骨骼及 其混合物组成；(ii)选自如下一组的体液，所述的组由痰、血清、血 浆、全血、唾液、尿、胸膜腔积液及其混合物组成；(iii)衍生自体 液的样品，所述体液选自由痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜 腔积液及其混合物组成的一组。
本发明还提供了监测对象中的疾病进程、对治疗的应答性或结核 分支杆菌感染状态的方法，包括在不同的时间确定来自所述对象的生 物学样品中的BSX蛋白或其免疫原性片段或表位的水平，其中BSX 蛋白、片段或表位水平的改变表示对象的疾病进程、对治疗的应答性 或感染状态的改变。在一个优选的实施方案中，所述方法进一步包括 当BSX蛋白、片段或表位水平随时间增高时给予用于治疗结核病或 结核分支杆菌感染的化合物。例如，所述方法可以包括一种免疫测定， 例如，将衍生自所述对象的生物学样品与一或多种能结合BSX蛋白 或其免疫原性片段或表位的抗体接触，并检测抗原-抗体复合物的形 成。在一个特别优选的实施方案中，抗体是一种分离的或重组的抗体 或抗体的免疫反应性片段，其特异性结合根据本文所述的任一实施方 案的分离的或重组的免疫原性结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性 BSX肽或免疫原性BSX片段或表位，或特异性结合包含所述免疫原 性BSX蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白质聚集体。本发明 的诊断测定特别用于检测无免疫应答的或免疫缺陷的对象例如HIV +对象中的TB。用于进行这种测定的样品包括例如(i)选自如下一 组的组织的提取物，所述的组由脑、乳腺、卵巢、肺、结肠、胰腺、 睾丸、肝、肌肉、骨骼及其混合物组成；(ii)选自如下一组的体液， 所述的组由痰、血清、血浆、全血、唾液、尿、胸膜腔积液及其混合 物组成；(iii)衍生自体液的样品，所述体液选自由痰、血清、血浆、 全血、唾液、尿、胸膜腔积液及其混合物组成的一组。
在一个特别优选的实施方案中，在一种基于抗原的测定平台或基 于抗体的测定平台中检测循环免疫复合物(CIC)。对于基于抗原的 测定平台，通过检测CIC的免疫球蛋白，CIC的检测可以提供对循环 中的分离的抗原检测的显著的信号放大。根据这一实施方案，除了在 对象循环中的分离的抗原的捕获之外，还使用一种捕获试剂例如一种 捕获抗体来捕获与对象的免疫球蛋白复合的BSX抗原(BSX多肽或 其免疫反应性片段或表位)。使用任选地与检测标记缀合的抗Ig抗体 来特异性结合所捕获的CIC，由此检测CIC患者样品。在本发明范围 内，抗Ig抗体优先结合样品中的IgM、IgA或IgG。在一个特别优选 的实施方案中，抗Ig抗体与人Ig例如人IgA、人IgG或人IgM结合。 抗Ig抗体可以与现有技术已知的任何标准可检测标记缀合。这一点 对于检测病原体例如细菌或病毒的感染或者诊断与CIC相关的任何 疾病或失调是特别有用的。因此，本文任一实施方案所述的诊断方法 适于进行修改，其中衍生自对象的样品包含一或多种循环免疫复合 物，所述循环免疫复合物包含与结核分支杆菌的BSX蛋白或其一或 多种免疫原性BSX肽、片段或表位结合的免疫球蛋白(Ig)，并且其 中检测抗原-抗体复合物的形成包括将抗Ig抗体与循环免疫复合物的 免疫球蛋白部分接触，接触的时间和条件足以形成复合物，随后检测 结合的抗Ig抗体。
本发明范围还包括在一或多种前述基于抗原的测定形式中的多 分析物检测，其中使用不同特异性的多个抗体证实用抗BSX抗体获 得的诊断，由此增加特异性和/或选择性。例如，患者样品可以与抗 BSX或免疫原性BSX肽或片段或表位的抗体以及抗结核分支杆菌谷 氨酰胺合酶(GS)蛋白(例如SwissProt Database登录号033342)或 其衍生的免疫原性肽的抗体例如抗衍生自GS蛋白的表面暴露区或包 含序列RGTDGSAVFADSNGPHGMSSMFRSFC(SEQ ID NO：54)或 WASGYRGLTPASDYNIDYAIC(SEQ ID NO：55)的肽而制备的抗体 接触。抗免疫原性结核分支杆菌GS肽的抗体也在本申请人的共同未 决国际专利申请PCT/AU2005/000930(申请日：2005年6月24日) 中详细描述，该申请全文引入本文做参考。然后用能结合每一蛋白质 分析物的抗体(例如抗BSX和抗GS抗体)检测所形成的抗原-抗体 复合物，或者在CIC检测情况下，用能结合人免疫球蛋白的抗体进 行检测。测定可以同时进行或者可以在不同时间进行，使用相同或不 同患者样品。测定也可以在同一反应容器中进行，条件是使用不同的 检测系统来检测不同的抗原或包含不同抗原的CIC，例如用不同的报 道分子如不同颜色的染料、荧光团、放射性核苷酸或酶标记的抗人Ig； 或差异标记的抗BSX和抗GS抗体。与本文描述的其它免疫测定一 样，二级抗体任选地与合适的可检测标记如辣根过氧化物酶(HRP) 或β-糖苷酶、胶体金颗粒等缀合。在复合物的检测中采用这些标记的 标准方法是本领域技术人员熟知的。
本发明还提供了一种治疗结核病或结核分支杆菌感染的方法，包 括：
(i)实施根据本文所述任一实施方案的诊断方法，由此检 测在来自对象的生物学样品中结核分支杆菌感染的存 在；和
(ii)给予治疗有效量的药物组合物以降低对象的肺部、血 液或淋巴系统中的病原性杆菌的数目。
本发明还提供了一种治疗结核病或结核分支杆菌感染的方法，包 括：
(i)实施根据本文所述任一实施方案的诊断方法，由此检测 在来自正在用第一种药物组合物治疗的对象的生物学 样品中结核分支杆菌感染的存在；和
(ii)给予治疗有效量的第二种药物组合物以降低对象的肺 部、血液或淋巴系统中的病原性杆菌的数目。
本发明还提供了治疗对象中的结核病的方法，包括实施本文所述 的诊断方法或预后方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种预防 方法，包括：
(i)检测来自对象的生物学样品中的结核分支杆菌感染的 存在；和
(ii)给予治疗有效量的药物组合物以降低对象的肺部、血 液或淋巴系统中的病原性杆菌的数目。
更具体地，当被给予动物对象时，免疫原性BSX蛋白或其一或 多种免疫原性BSX肽、片段或表位诱导高效价抗体的特异性产生。
因此，本发明还提供了引起抗结核分支杆菌抗体产生的方法，包 括给予所述对象免疫原性BSX蛋白或其一或多种免疫原性BSX肽或 免疫原性BSX片段或表位，给予的时间和条件为足以引起抗体如抗 结核分支杆菌的中和抗体的产生。
本发明清楚地包括免疫原性BSX蛋白或其一或多种免疫原性 BSX肽或免疫原性BSX片段或表位在制备抗人类或其它动物对象中 的结核分支杆菌感染的治疗性或预防性亚单位疫苗中的用途。
因此，本发明还提供了一种疫苗，其包含与药物学可接受的稀释 剂组合的免疫原性BSX蛋白或其一或多种免疫原性BSX肽或免疫原 性BSX片段或表位。优选地，所述蛋白质或其肽或片段或表位用合 适的佐剂配制。
或者，通过给予自体或异源抗原呈递细胞(APC)或已在体外处 理而在其表面呈递肽的树突细胞，所述的肽或衍生物或变体可以配制 为细胞疫苗。
本发明还包括如下的基于核酸的疫苗，其包含克隆到合适的载体 (例如痘苗病毒、金丝雀痘病毒、腺病毒或其它真核生物病毒载体) 中的编码免疫原性BSX蛋白或其一或多种免疫原性BSX肽或免疫原 性BSX片段或表位的核酸如DNA或RNA。优选地，编码免疫原性 BSX蛋白或其免疫原性BSX肽或免疫原性BSX片段或表位的DNA 被配制成DNA疫苗，例如组合已知的Calmette-Guerin(BCG)或免 疫佐剂如痘苗病毒、弗氏佐剂或另一种免疫刺激剂。
本发明还提供了免疫原性BSX蛋白或其一或多种免疫原性BSX 肽或一或多种免疫原性BSX片段或一或多种表位在制备用于预防或 治疗性治疗或诊断对象、例如被HIV-1和/或HIV-2感染对象中的结 核病或结核分支杆菌感染、包括治疗性治疗人类对象中的潜伏结核分 支杆菌感染的组合物中的用途。
在一个替代的实施方案中，本发明提供了免疫原性BSX蛋白或 其一或多种免疫原性BSX肽或一或多种免疫原性BSX片段或一或多 种表位在制备用于预防或治疗性治疗或诊断对象中的结核病或结核 分支杆菌感染的组合物中的用途，其中所述对象先前已进行了抗 HIV-1和/或HIV-2的抗病毒治疗。
本发明还提供了用于检测生物学样品中的结核分支杆菌感染的 试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)一或多种特异性结合根据本文所述任一实施方案的分 离的或重组的免疫原性结核分支杆菌BSX蛋白或其免 疫原性BSX肽或免疫原性BSX片段或表位的、或者 特异性结合包含所述免疫原性BSX蛋白、肽、片段或 表位的融合蛋白或蛋白质聚集体的分离的或重组的抗 体或其免疫反应性片段；和
(ii)用于检测抗原-抗体复合物形成的手段， 任选地与使用说明一起包装。
本发明还提供了用于检测生物学样品中的结核分支杆菌感染的 试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)根据权利要求1-16任一项所述的分离的或重组的免疫 原性结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性BSX肽或免 疫原性BSX片段或表位；和
(ii)用于检测抗原-抗体复合物形成的手段，
任选地与使用说明一起包装。
本文所述的测定适于任何测定形式，特别适于固相ELISA、穿流 (flow through)免疫测定形式、毛细管形式，并用于纯化或分离免 疫原性蛋白质、肽、片段和表位以及CIC。
因此，本发明还提供了吸附有根据本文所述任一实施方案的分离 的或重组的免疫原性结核分支杆菌BSX蛋白或其免疫原性BSX肽或 免疫原性BSX片段或表位或者包含所述免疫原性BSX蛋白、肽、片 段或表位的融合蛋白或蛋白质聚集体的固相基质。例如，所述固相基 质可以包含聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔板或其部件(例如微滴板的一或 多个孔)、dipstick、玻璃支持体或层析树脂。
在一替代实施方案中，本发明还提供了吸附有结合根据本文所述 任一实施方案的分离的或重组的BSX蛋白或其免疫原性BSX肽或免 疫原性BSX片段或表位的、或者结合包含所述免疫原性BSX蛋白、 肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白质聚集体的抗体的固相基质。例如， 所述固相基质可包括膜例如尼龙或硝酸纤维素。或者，所述固相基质 可包括聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔板或其部件(例如微滴板的一或多个 孔)、dipstick、玻璃支持体或层析树脂。
特别是用于采用多个抗原或多个抗体的多分析物检测的包括进 行本文所述测定所需的额外的抗原和/或抗体的所述固相基质清楚地 包括在本发明范围内。
优选实施方案的详细描述
分离的或重组的BSX蛋白及其免疫原性片段和表位
本发明的一个方面提供了分离的或重组的BSX蛋白或其免疫原 性片段或表位。
本发明的这一方面包括任何衍生自本文所指的BSX蛋白的合成 或重组的肽，包括全长BSX蛋白和/或BSX蛋白的衍生物或类似物 或其免疫原性片段或表位。
本文所用术语“BSX”应被理解为指与SEQ ID NO：1的氨基酸 序列有至少约80％氨基酸序列相同性的任何肽、多肽或蛋白质。优选 地，BSX蛋白与SEQ ID NO：1的相同性百分比为至少约85％、更优 选地至少约90％、更优选地至少约95％、更优选地至少约99％。本 发明不限于使用所例举的结核分支杆菌BSX蛋白，因为如本领域技 术人员了解的，无需过多实验就可以定义与所例举的结核分支杆菌 BSX蛋白的一个区域有序列相同性好免疫学等价性的片段。
在确定两个氨基酸序列是否落入上述限定的相同性百分比之内 时，本领域技术人员能意识到可以进行氨基酸序列的并行比较。在这 种比较或对比中，根据用于进行对比的算法，在不相同残基的定位中 会产生差异。在本说明书中，两个或多个氨基酸序列之间的相同性和 相似性百分比应被理解为是指用本领域技术人员已知的任何标准算 法确定的所述序列之间的相同或相似残基的数目。特别地，氨基酸相 同性和相似性是用Computer Genetics Group，Inc.，University Research Park，Maddison，Wisconsin，United States of America的软件计算的，例 如使用Devereaux et al，Nucl.Acids Res.12，387-395，1984的GAP程 序，该程序利用Needleman and Wunsch，J MoI Biol.48，443-453，1970 的算法。或者使用Thompson et al，Nucl.Acids Res.22，4673-4680，1994 的CLUSTAL W算法获得多个序列的对比，其中需要或者希望的是最 大化相同/相似残基的数目并且最小化对比中序列缺口(gap)的数目 和/或长度。氨基酸序列对比也可以用各种其它可商购的序列分析程 序如在可在NCBI获得的BLAST程序进行。
特别优选的片段包括那些包括表位、特别是B细胞表位或T细 胞表位的片段。
B细胞表位可方便地衍生自免疫原性BSX蛋白的氨基酸序列。 本发明特别包括希望产生免疫应答的独特型和抗独特型B细胞表位， 以及脂质修饰的B细胞表位或B群蛋白(Group B protein)。优选的 B细胞表位是当被给予哺乳动物时能引起抗体生成，所述抗体优选是 抗结核分支杆菌的中和抗体，更优选地是高效价中和抗体。更短的B 细胞表位是促进肽合成所优选的。优选地，B细胞表位的长度不超过 约30个氨基酸。更优选地，B细胞表位序列由约25个氨基酸残基或 更少残基组成，更优选地少于20个氨基酸残基，更优选地为衍生自 全长B群蛋白序列的长度约5-20个氨基酸残基。
CTL表位也方便地衍生自BSX蛋白的全长氨基酸序列并且通常 由所述BSX蛋白的至少约9个连续氨基酸组成并具有经确定以显著 水平与MHC I类等位基因相互作用的氨基酸序列，所述相互作用用 确定MHC I类结合表位的预测算法例如德国Tuebingen大学的 SYFPEITHI算法或美国政府国立健康研究院的生物信息学和分子分 析部(BEVIAS)的HLA肽结合预测程序的算法来确定。更优选地， CTL表位具有结合和/或稳定抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC I 类分子的氨基酸序列。还更优选地，CTL表位具有诱导记忆CTL应 答或引起T细胞如CD8+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL)表达IFN-γ 的序列。还更优选地，CTL具有在标准细胞毒性测定中刺激CTL活 性的序列。特别优选的BSX蛋白的CTL表位能在人细胞或组织中例 如通过识别和溶解被结核分支杆菌感染的人细胞而引起细胞免疫应 答，由此提供或增强抗结核分支杆菌的细胞免疫。
合适的片段的长度至少为约5个、例如10、12、15或20个氨基 酸。它们的长度也可以少于200个、100个或50个氨基酸。
优选地，BSX的免疫原性片段或表位包含SEQ ID NO：2-53任一 氨基酸序列，优选地包含选自如下一组的氨基酸序列的免疫原性片段 或表位：MRQLAERSGVSNPYL(SEQ ID NO：14)， ERGLRKPSADVLSQI(SEQ ID NO：20)，LRKPSADVLSQIAKA(SEQ ID NO：21)，PSADVLSQIAKALRV(SEQ ID NO：22)， SQIAKALRVSAEVLY(SEQ ID NO：24)，AKALRVSAEVLYVRA (SEQ ID NO：25)，VRAGILEPSETSQVR(SEQ ID No：29)， TAITERQKQILLDIY(SEQ ID NO；36)，SQIAKALRVSAEVLYVRAC (SEQ ID NO：45)，MSSEEKLCDPTPTDD(SEQ ID NO：46)和 VRAGILEPSETSQVRC(SEQ ID NO：47)。
更优选地，结核分支杆菌BSX蛋白的免疫原性片段包含选自如 下一组的氨基酸序列：SQIAKALRVSAEVLY(SEQ ID NO：24)， AKALRVSAEVLYVRA(SEQ ID NO：25)， SQIAKALRVSAEVLYVRAC(SEQ ID NO：45)， MSSEEKLCDPTPTDD(SEQ ID NO：46)和VRAGILEPSETSQVRC (SEQ ID NO：47)，更优选地，选自SQIAKALRVSAEVLY(SEQ ID NO： 24)，AKALRVSAEVLYVRA(SEQ ID NO：25)，和 SQIAKALRVSAEVLYVRAC(SEQ ID NO：45)的序列。
BSX蛋白或其免疫原性片段或表位的氨基酸序列可以根据本领 域技术人员熟知的方法为特定目的而修饰，但不负面影响其免疫功 能。例如，特定的肽残基可以被衍生化或化学修饰以增强免疫应答或 允许肽与其它物质特别是脂质的偶联。还可以改变肽中的特定氨基酸 而不干扰肽的整体结构或抗原性。这种改变因此被称作“保守”改变 并倾向于依赖残基的亲水性或极性。侧链的大小和/或电荷也是确定 哪些取代是保守取代的相关因素。
本发明清楚地包括一个或多个免疫原性BSX肽之间的共价融合 体，包括肽的同源二聚体、同源三聚体、同源四聚体或更高的同源多 聚体，或包含两个或多个不同免疫原性肽的杂二聚体、杂三聚体、杂 四聚体或更高的杂多聚体。
本发明还包括一个或多个免疫原性BSX肽之间的非共价聚集体， 例如通过离子相互作用、流体净力学相互作用或现有技术已知的或本 文描述的其它相互作用而聚集在一起。
本领域技术人员能够理解生物学功能等价蛋白的定义内固有的 是这样的概念：可以在分子的限定部分内进行的并且仍产生具有可接 受水平的等价生物学活性的分子的改变数目是有限度的。因此本文中 定义的生物学功能等价蛋白是特异氨基酸被取代的那些蛋白质。特定 的实施方案包含在肽的氨基酸序列中有一个、二个、三个、四个、五 个或更多个变异的变体。当然，具有不同取代的多个不同蛋白质/肽 可以根据本发明而容易地制备和使用。
本领域技术人员熟知下列取代是可允许的保守取代：(i)涉及精氨 酸、赖氨酸和组氨酸的取代；(ii)涉及丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的取 代；和(iii)涉及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的取代。掺入这类保守 取代的衍生物在本文中被定义为生物学或免疫学功能等价物。
水合(hydropathic)氨基酸指数在赋予蛋白质以相互作用性生物 学功能中的重要性是本领域了解的(Kyte & Doolittle，J Mol.Biol.157， 105-132，1982)。已知某些氨基酸可以被取代为具有相似水合指数或 值的其它氨基酸并仍保持相似的生物学活性。氨基酸的水合指数在确 定产生功能等价分子的保守取代中也可被考虑。每个氨基酸基于其疏 水性和电荷特征被赋予如下水合指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸 (+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)； 甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1,8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)； 丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组 氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)； 天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在根据水合指数 进行改变时，优选的是水合指数在.+/-0.2之内的氨基酸取代。更优选 地取代涉及水合指数在.+/-0.1之内的氨基酸，更优选地在约+/-0.05 之内。
本领域还理解相似氨基酸的取代可有效地基于亲水性 (hydrophilicity)进行，特别是当由此产生的生物学功能等价蛋白或 肽如在本案中要用于免疫学实施方案中时(例如美国专利4,554,101)。 事实上，由其相邻氨基酸的亲水性所控制的蛋白质的最大局部平均亲 水性与其免疫原性和抗原性相关。如美国专利4,554,101所详细描述 的，氨基酸残基被赋予下述亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)； 天冬氨酸(+3.0+/-0.1)；谷氨酸(+3.0+/-0.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰 胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+/- 0.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬 氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(- 2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变时，优选的是取 代彼此的亲水性值在约+/-0.2之内的氨基酸，更优选地在约+/-0.1之 内，更优选地在约+/-0.05之内。
包含表位的BSX多肽或其肽片段可用标准技术容易地合成，如 Merrifield合成法(Merrifield，J Am Chem Soc，S5，：2149-2154，1963)及 该技术很多改进(参见例如Synthetic Peptides：A User′s Guide，Grant，ed. (1992)W.H.Freeman & Co.，New York，pp.382；Jones(1994)The Chemical Synthesis of Peptides，Clarendon Press，Oxford，pp.230.)； Barany，G.and Merrifield，R.B.(1979)in The Peptides(Gross，E.and Meienhofer，J.eds.)，vol.2，pp.1-284，Academic Press，New York； Wunsch，E.，ed.(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie(Müler，E.，ed.)，vol.15，4th edn.，Parts 1 and 2， Thieme，Stuttgart；Bodanszky，M.(1984)Principles of Peptide Synthesis， Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.& Bodanszky，A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky， M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25，449-474.d/
如现有技术所知，可以产生合成肽，其在衍生自全长BSX蛋白 的片段或B细胞表位的序列上添加额外的亲水性N-末端和/或C- 末端氨基酸，如促进合成或改善肽溶解性。甘氨酸和/或丝氨酸残基 特别优选用于这一目的。如本文所例举，SEQ ID NO：2-24所示的每 种肽包括位于BSX片段侧翼的额外间隔序列，所示间隔序列包含含 甘氨酸和丝氨酸的杂聚合物(三聚体或四聚体)。
本发明的肽可容易地被修饰以用于诊断目的，例如通过添加天然 或合成半抗原、抗生素、激素、类固醇、核苷、核苷酸、核酸、酶、 酶底物、酶抑制剂、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、聚 乙二醇、肽性多肽部分(例如tuftsin、聚赖氨酸)、荧光标记(例如 FITC、RITC、丹酰、鲁米诺或香豆素)、生物发光标记、spin标记、 生物碱、生物胺、维生素、毒素(例如地高辛、鬼笔环肽、鹅膏菌素、 河豚毒素)或复合物形成剂。
在另一个实施方案中，BSX作为重组蛋白产生。
为了用重组手段表达蛋白质，编码蛋白质的核苷酸序列以可操纵 连接方式与启动子或能够在无细胞系统或细胞系统中调节表达的其 它调节序列连接。在本发明的一个实施方案中，包含与合适的启动子 序列可操纵地连接的编码BSX蛋白或其表位的序列的核酸在足以使 表达发生的条件下在合适的细胞中表达一段足以使表达发生的时间。 编码BSX蛋白的核酸可容易地衍生自公共可获得的氨基酸序列。
在另一实施方案中，BSX蛋白以重组融合蛋白形式产生，以例如 有助于提取和纯化。为了产生重组多肽，例如用Ausubel等人所述的 标准克隆程序(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，ISBN 047150338，1992)将一些开放读框共价连接在同一 读框中，并在启动子控制下表达。融合蛋白配偶体的例子包括谷胱甘 肽-S-转移酶(GST)、FLAG(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)、 六组氨酸、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。 在融合蛋白配偶体与感兴趣的蛋白质序列之间也可以方便地包括蛋 白裂解位点以便于除去融合蛋白序列。优选地，融合蛋白不妨碍BSX 蛋白的免疫功能。
本文所称“启动子”应取其最广的含义并包括经典基因组基因的 转录调节序列，包括精确转录起始所需的TATA盒，有或没有CCAAT 盒序列和应答发育和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达 的额外的调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。在这一上 下文中，术语“启动子”也用于描述重组的、合成的或融合分子或衍 生物，其赋予、激活或增强与其可操纵连接的并编码多肽或肽片段的 核酸分子的表达。优选的启动子可以含有额外拷贝的一或多个特异性 调节元件以进一步增强所述核酸分子的表达和/或改变空间表达和/或 时间表达。
将核酸分子置于启动子序列的调节控制下，即“可操纵地连接” 是指将所述分子定位成其表达由启动子序列控制。启动子通常位于它 们所控制的编码序列的5’(上游)。
在细菌如大肠杆菌中产生完整多肽和肽的前提条件是使用具有 有效核糖体结合位点的强启动子。适于在细菌细胞如大肠杆菌中表达 的典型启动子包括但不限于lacz启动子、温度敏感型XL或λR启动子、 T7启动子或IPTG诱导型tac启动子。用于在大肠杆菌中表达本发明 的核酸分子的一些其它载体系统是本领域熟知的并例如在Ausubel等 人(In：Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，ISBN 047150338，1987)或Sambrook et al(In：Molecular cloning，A laboratory manual，second edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)中描述。具有用于在细菌中表达的合适启动子序列 和有效的核糖体结合位点的许多质粒已被描述，例如pKC30(λL： Shimatake and Rosenberg，Nature 292，128，1981)；ρKK173-3(tac： Amann and Brosius，Gene 40，183，1985)，pET-3(T7：Studier and Moffat， J MoI Biol 189，113，1986)；含有阿拉伯糖诱导型启动子的 pBAD/TOPO或pBAD/Thio-TOPO系列载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)， 后者设计用于产生与硫氧还蛋白的融合蛋白以增强表达的蛋白质的 溶解性；pFLEX系列表达载体(Pfizer Inc.，CT，USA)；或pQE系列表 达载体(Qiagen，CA)，等等。
用于在真核细胞病毒和真核细胞中表达的典型启动子包括SV40 晚期启动子、SV40早期启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV IE(巨细胞病毒立即早期)启动子等。用于在哺乳动物细胞(例如 293、COS、CHO、1OT细胞、293T细胞)中表达的优选的启动子包 括但不限于由Invitrogen提供的pcDNA载体系列，特别是包含CMV 启动子并编码C-末端6xHis和MYC标记的pcDNA 3.1myc-His-tag； 逆转录病毒载体pSRαtkneo(Muller et al，Mol Cell Biol，11，1785， 1991)。载体pcDNA 3.1myc-His(Invitrogen)特别优选用于在293T 细胞中表达分泌型BSX蛋白或其衍生物，其中表达的肽或蛋白质可 以用标准亲和技术被纯化为不含同种蛋白质，所述标准亲和技术采用 镍柱以经His标记结合蛋白质。
适于表达本发明的诊断蛋白质或其免疫学衍生物(例如表位或其 它片段)的各种其它宿主/载体系统是公众可获得的，并且在例如 Sambrook et al(In：Molecular cloning，A laboratory manual，second edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989) 中描述。
将分离的核酸分子或包含其的基因构建体导入细胞用于表达的 手段是本领域技术人员熟知的。用于给定生物体的技术取决于已知的 成功技术。将重组DNA导入动物细胞的手段包括显微注射、DEAE- 葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染如用脂转染胺试剂(Gibco， MD，USA)和/或cellfectin(Gibco，MD，USA)、PEG介导的DNA 摄入、电穿孔和微粒轰击如用DNA包被的钨或金颗粒(Agracetus Inc.， WI，USA)，等等。
本发明的蛋白质可以以分离的形式产生，优选地基本上不含同种 蛋白质。抗体和其它亲和配体特别优选用于产生分离的蛋白质。优选 地，蛋白质呈一制剂，其中制剂中超过90％(例如95％、98％或99％) 的蛋白质是BSX蛋白或其表位。
结合BSX蛋白或其表位的抗体
本发明的第二方面提供了特异性结合BSX蛋白或其免疫原性片 段或表位的抗体，如适于用在本文所述测定中的单克隆或多克隆抗体 制备物。
本文所称抗体包括完整的多克隆和单克隆抗体及其部分，它们单 独存在或缀合有其它部分。抗体部分包括Fab和F(ab)2片段和单链抗 体。抗体可以在合适的实验动物体内制备，或者在工程抗体(单链抗 体或SCABS等)情况下使用重组DNA技术体外制备。
根据本发明的这一方面，可以产生抗体用于给对象免疫接种，在 这种情况下，高效价或结合B细胞表位的中和抗体是特别优选的。 用于免疫接种的合适对象当然取决于免疫接种抗原或抗原性B细胞 表位。应理解本发明广泛用于接种各种动物，如农场动物(例如马、 牛、绵羊、猪、山羊、鸡、鸭、火鸡等)、实验室动物(例如大鼠、 小鼠、豚鼠、兔)、家养动物(猫、狗、鸟等)、野生或野生外来动物 (例如负鼠、猫、猪、水牛、野狗等)和人类。
或者，抗体可用于商业或诊断目的，在这种情况下被给予BSX 蛋白或其免疫原性片段或表位的对象最可能是实验室或农场动物。可 用各种动物物种产生抗血清。典型地，用于产生抗血清的动物是兔、 小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、山羊、绵羊、猪、狗、马或鸡。由于兔和 绵羊相对较大的血液体积，它们是产生多克隆抗体的优先选择。但是， 如本领域技术人员熟知的，与小型动物如小鼠相反，从大型动物获得 高抗体需要更大量的免疫原。在这些情况下，希望的是从免疫接种的 动物中分离抗体。
优选地，抗体是高效价抗体。“高效价”是指适于用在诊断或治 疗应用中的足够高的效价。本领域已知的是，何种被认为是“高效 价”可能会有一些差异。对于大多数应用，优选的是至少约103-104 的效价。更优选地，抗体效价在约104到约105的范围，更优选地在 约105到约106的范围。
更优选地，在来自病原体病毒或细菌的B细胞表位的情况下， 抗体是中和抗体(即它能够中和衍生B细胞表位的生物的感染性)。
为了产生抗体，以可注射组合物形式方便地给予任选地用任何合 适或所希望的载体、佐剂、BRM或药物学可接受赋形剂配制的BSX 蛋白或其免疫原性片段或表位。注射可以是鼻内、肌肉内、皮下、静 脉内、真皮内、腹膜内或其它已知途径。对于静脉内注射，希望的是 包括一或多种流体和营养补充剂。制备和鉴定抗体的手段是本领域熟 知的(参见例如ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，1988，引入本文作参考)。
用于产生多克隆或单克隆抗体的优选的免疫原性肽选自序列表 所列出的组。在一个实施方案中，一种免疫原性肽例如包含SEQ ID NO：24、25、45或46所示氨基酸序列的免疫原性肽或其免疫原性片 段与一种免疫原性载体蛋白如白喉类毒素(DT)、匙孔嘁血蓝蛋白 (KLH)、破伤风类毒素(TT)或流感病毒核蛋白(NP)使用本领域 已知的几种缀合化学之一种共价偶联。这增强了不然在动物例如小 鼠、大鼠、鸡等中不是高免疫原性的肽的免疫原性。
制备用于这种偶联的载体蛋白的方法是本领域熟知的。例如， DT优选地通过从白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)培养物 中纯化毒素随后化学脱毒而产生，但是也可以通过纯化重组的或遗传 学脱毒的该毒素类似物(例如CRM197，或美国专利4,709,017， 5,843,711，5,601,827，和5,917,017所述的其它突变体)而制备。优选 地，类毒素用最多6个碳原子的桥作为间隔物而衍生化，如由白喉类 毒素的己二酸酰肼衍生物(D-AH)而提供。
为了进行偶联，衍生自全长BSX蛋白的肽可以被化学合成或通 过重组表达手段产生，用羟胺处理以形成游离巯基，并经所述游离巯 基与马来酰亚胺修饰的白喉类毒素、破伤风类毒素或流感病毒NP蛋 白或其它载体分子交联。一种最特异性的可靠的缀合化学使用肽中的 半胱氨酸残基和添加到载体蛋白中的马来酰亚胺基团，以形成稳定的 硫醚键(Lee，A.C.，et al，Mol.Immunol.17，749-756 1980)。例如，如 果肽中不存在巯基，则BSX衍生的肽可以事先通过加入C-末端半胱 氨酸残基而修饰(例如SEQ ID NO：45)或加入内部半胱氨酸残基而 修饰(例如SEQ ID NO：46)以便于这一程序。免疫原性BSX肽优选 地在非变性条件下生产，用羟胺、硫醇还原剂或者酸或碱水解处理以 产生游离巯基，含有所述游离巯基的肽通过游离巯基与一载体经化学 键而缀合。这种缀合可以使用合适的双马来酰亚胺化合物。或者， HA蛋白可以与马来酰亚胺修饰的载体蛋白如白喉类毒素、破伤风类 毒素和流感病毒(NP)蛋白缀合或与碳水化合物如藻酸、葡聚糖或 聚乙二醇缀合。这种马来酰亚胺修饰的载体分子可以通过将载体分子 与马来酰亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺酯型杂双官能交联剂反应而形成。 这种双官能酯包括马来酰亚氨基-己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MCS)、 马来酰亚氨基-苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、马来酰亚氨基- 苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(sulfo-MBS)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来 酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧基酯(SMCC)、琥珀酰亚胺基-4-(p-马 来酰亚氨基苯基)丁酸酯(SMPP)、硫代琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰 亚氨基甲基)环己烷-1-羧基酯(sulfo-SMCC)和硫代琥珀酰亚胺基 -4-(p-马来酰亚氨基苯基)丁酸酯(sulfo-SMPP)。N-羟基琥珀酰亚胺酯 部分与载体蛋白的胺基团反应，使得马来酰亚胺部分游离以便与抗原 上的巯基反应而形成交联材料。
如此产生的缀合分子可以被纯化并在免疫原性组合物中使用而 在给予宿主时引起针对BSX肽的免疫应答，这一免疫应答与单独 BSX肽相比被增强。
白喉类毒素可以商业获得或者从在浸没式培养物中生长的白喉 棒杆菌用标准方法制备。白喉类毒素的生产分为5个阶段，即种子的 保持、白喉棒杆菌的生长、白喉毒素的收获、白喉毒素的脱毒和白喉 类毒素的浓缩。在制备物中用作载体的纯化的白喉类毒素(DT)优 选地是通过用水溶性碳二亚胺缩合方法附着间隔分子如己二酸二酰 肼(ADH)而修饰(衍生化)的商业类毒素。修饰的类毒素、典型 地是己二酸酰肼衍生物D-AH然后被处理以去掉未反应的ADH。
BSX蛋白或其免疫原性片段或表位在产生抗体中的功效如实施 例所述通过用包含BSX蛋白或其免疫原性片段或表位的配制品注射 动物如小鼠、鸡、大鼠、兔、豚鼠、狗、马、奶牛、山羊或猪，然后 监测对B细胞表位的免疫应答而确立。初次及再次免疫应答均被监 测。用常规免疫测定如ELISA或放射免疫测定确定抗体效价。
多克隆抗体的产生可以通过在免疫接种后各时间点取被免疫动 物的血液样品而监测。如果需要达到所希望的抗体效价，可以给予第 二次加强注射。重复加强和滴定程序直至达到合适的效价。当获得希 望水平的免疫原性时，给免疫的动物放血并分离和储存血清，和/或 用该动物产生单克隆抗体(MAb)。
单克隆抗体是特别优选的。为了产生单克隆抗体(MAb)，可以 使用本领域熟知的任何技术，如美国专利4,196,265中的程序，该引 入本文作参考。
例如，在足以刺激抗体生成细胞的条件下用有效量的BSX蛋白 或其免疫原性片段或表位接种合适的动物。啮齿类动物如兔、小鼠和 大鼠是优选的动物，但是也可以使用绵羊或青蛙细胞。使用大鼠可提 供一些优点，但是小鼠或兔是优选的，BALB/c小鼠最优选作为最常 用的动物并且通常给出更高百分比的稳定融合体。已知兔提供高亲和 性单克隆抗体。
免疫接种后，选择具有生成抗体潜力的体细胞、特别是B淋巴 细胞(B细胞)以用于MAb产生方案。这些细胞可以得自脾、扁桃 腺或淋巴结活检样品，或者得自外周血样品。脾细胞和外周血细胞是 优选的，前者是因为它们是处于分裂浆母细胞阶段的抗体生成细胞的 丰富来源，后者是因为外周血很容易获得。通常，一组动物被免疫并 取具有最高抗体效价的动物的脾。脾淋巴细胞通过用注射器匀浆脾而 获得。典型地，来自免疫小鼠的脾含有约5×107至2×108个淋巴细 胞。
来自免疫动物的B细胞然后与永生化骨髓瘤细胞的细胞融合， 所述永生化骨髓瘤细胞通常衍生自与用BSX蛋白或其免疫原性片段 或表位免疫的动物相同的物种。适于用在产生杂交瘤的融合程序中的 骨髓瘤细胞系优选地是非抗体生成性的，具有高融合效率和酶缺陷， 使它们不能在一些选择性培养基中生长，而这些选择性培养基仅支持 所希望的融合细胞或杂交瘤的生长。可以使用一些骨髓瘤细胞中的任 一种，它们是本领域技术人员已知的(例如小鼠P3-X63/Ag8， X63-Ag8.653，NS1/1.Ag 4 1，Sp210-Ag14，FO5NSO/U，MPC-Il， MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0；或者大鼠R210.RCY3，Y3-Ag 1.2.3，IR983F和4B210；和U-266，GM1500-GRG2，LICR-LON-HMy2 和UC729-6)。优选的小鼠骨髓瘤细胞是NS-I骨髓瘤细胞系(也称为 P3-NS-1-Ag4-1)，其可得自NIGMS人类遗传突变细胞保藏机构，登 录号为GM3573。或者，使用8-氮鸟嘌呤抗性的小鼠骨髓瘤SP2/0非 生产细胞系。
为产生生成抗体的脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交体，将体 细胞以大约20∶1至大约1∶1的比例在存在促进细胞膜融合的试剂(化 学或电子试剂)的条件下混和。使用仙台病毒的融合方法如Kohler and Milstein，Nature 256，495-497，1975；及Kohler and Milstein，Eur.J. Immunol.6，511-519，1976所述。使用聚乙二醇(PEG)如37％(v/v)PEG 的方法在Gefter et al，Somatic Cell Genet.3，231-236，1977中描述。也 可以应用电诱导的融合方法。
将杂交体通过在选择培养基中培养而扩增，所述培养基包含阻断 核苷酸在组织培养基中重新合成的物质。优选的该物质例如是氨基蝶 呤、氨甲喋呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和氨甲喋呤阻断嘌呤和嘧啶的 从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨基蝶呤或氨甲喋 呤时，培养基中补加次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸来源(HAT培养基)。 在使用重氮丝氨酸的情况中，培养基中补加次黄嘌呤。
优选的选择培养基是HAT，因为只有能进行核苷酸补救途径的 那些杂交瘤能在HAT培养基中存活，而骨髓瘤细胞缺少补救途径关 键的酶(例如次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶或HPRT)而不能存活。B细 胞可以进行这种补救途径，但是它们的培养寿命有限，通常在大约2 周内死亡。因此，能在选择培养基中存活的唯一的细胞是从骨髓瘤和 B细胞形成的那些杂交体。
扩增的杂交瘤针对抗体特异性和/或效价进行功能选择，例如通 过免疫测定(例如放射性免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性分析、噬 斑分析、斑点免疫测定等)。
将选择的杂交瘤系列稀释并克隆进各个抗体生成细胞系中，然后 这些克隆可以无限地繁殖以提供MAb。所述细胞系可以两种基本方 式用于MAb产生。杂交瘤样品被注射进用于提供体细胞和骨髓瘤细 胞进行原始融合的类型的组织相容的动物，通常是腹膜腔中。注射的 动物产生肿瘤，分泌由融合的杂种细胞产生的特异性单克隆抗体。然 后可以引流出动物的体液如血清或腹水以提供高浓度的MAb。所述 各个细胞系也可以在体外培养，其中mAb自然地分泌进培养基中， 从中可易于高浓度获得。通过任一方式产生的mAb如果需要的话可 以进一步使用过滤、离心和各种层析方法如HPLC或亲和性层析方法 进行纯化。
或者，使用ABL-MYC技术(NeoClone，Madison WI 53713，USA) 产生分泌抗免疫原性BSX肽抗原的单克隆抗体(mAb)的细胞系。在这 种方法中，将BALB/cByJ雌性小鼠用一定量的所述肽抗原免疫大约 2-3个月。在此期间，以一定间隔取血样以在标准ELISA中评定抗 体应答。将具有至少大约1,000抗体效价的小鼠的脾用于随后的 ABL-MYC感染中，感染采用包含致癌基因v-abl和c-myc的无复制 能力的逆转录病毒。将脾细胞移植到从未进行过试验的小鼠中，然后 该小鼠产生腹水，腹水中含有产生抗BSX肽抗原的单克隆抗体(mAb) 的细胞系。使用例如结合于固体基质的蛋白质G或蛋白质A，根据 mAb的同种型而从腹水中纯化mAb。由于没有杂交瘤融合，因此 ABL-MYC方法与常规的mAb产生方法相比的一个优点是更快、成 本更低及产量更高。另外，由这种方法产生的二倍体浆细胞瘤比多倍 体杂交瘤显然更稳定，因为ABL-MYC逆转录病毒仅感染已经用免疫 抗原刺激的脾中的细胞。然后ABL-MYC将那些激活的B细胞转化 成无限增殖的产生mAb的浆细胞，称作浆细胞瘤。“浆细胞瘤”是一 种无限增殖的浆细胞，其能不受控地细胞分化。由于浆细胞瘤仅从一 个细胞开始，因此由其产生的所有浆细胞瘤均是相同的，而且产生相 同的希望的“单克隆”抗体。结果，不需要淘选不希望的细胞系。 ABL-MYC技术在如下并入作参考的文献中详细描述：
1.Largaespada et ah，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，166，91-96. 1990；
2.Weissinger et ah.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，8735-8739， 1991；
3.Largaespada et ah，Oncogene，7，811-819，1992；
4.Weissinger et ah，J.Immunol.Methods 168，123-130，1994；
5.Largaespada et ah，J.Immunol.Methods.197(1-2)，85-95，1996；
6.Kumar et ah，Immuno.Letters 65，153-159，1999。
本发明的单克隆抗体还包括通过本领域熟知方法产生的抗独特 型抗体。本发明的单克隆抗体也可以是单克隆抗体异源缀合物(即两 或多个抗体分子的杂合体)。在另一个实施方案中，本发明的单克隆 抗体是嵌合的单克隆抗体。在一种方法中，所述嵌合的单克隆抗体是 通过克隆含有启动子、前导序列和来自小鼠抗PSA生成细胞的可变 区序列及来自人抗体基因的恒定区外显子的重组DNA而工程化。由 这种重组基因编码的抗体是小鼠一人嵌合体。其抗体特异性通过衍生 自小鼠序列的可变区而决定。由恒定区决定的其独特型衍生自人 DNA。
在另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体是通过本领域众多熟 知技术的任一种技术产生的“人源化的”单克隆抗体。即，将小鼠互 补决定区(CDR)从小鼠Ig的重和轻V链移至人V结构域，随后在构 架区中的一些人残基用相应的小鼠残基置换。本发明的“人源化的” 单克隆抗体特别适用于体内诊断和治疗方法中。
如上所述，本发明的单克隆抗体及其片段根据本领域熟知的体外 和体内方法增殖。体外增殖是在合适的培养基中进行，所述培养基如 Dulbecco′s修改的Eagle培养基或RPMI 1640培养基，任选补充哺乳 动物血清如胎牛血清或微量元素及支持生长的补充剂，例如饲养细 胞，如正常小鼠腹膜分泌物细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞等。体外生 产方法提供了相对纯的抗体制品，并且可以按比例扩大规模以提供大 量希望的抗体。在组织培养条件下的大规模杂交瘤培养技术为本领域 所已知，包括同质悬浮培养(例如在气升式反应器或者持续搅拌反应 器或固定或捕获细胞培养)。
大量的本发明单克隆抗体也可以通过在体内增殖杂交瘤细胞而 获得。将细胞克隆注射进与亲代细胞组织相容的哺乳动物中(例如同 种小鼠)，以使得产生抗体的肿瘤生长。任选地，将所述动物在注射 之前用烃、特别是油如Pristane(四甲基十五烷)刺激。
根据本发明，本发明的单克隆抗体的片段通过用酶如胃蛋白酶或 木瓜蛋白酶消化和/或通过化学还原裂解二硫键等方法而得自如上所 述产生的单克隆抗体。或者，本发明的单克隆抗体片段是使用自动肽 合成仪合成的，或者可以使用本领域熟知的技术人工产生。
本发明的单克隆缀合物是通过本领域已知的方法制备的，例如通 过将如上述制备的单克隆抗体与例如一种酶在存在偶联剂如戊二醛 或高碘酸盐的条件下反应。具有荧光素标记的缀合物在存在这些偶联 剂的条件下制备，或者通过与异硫氰酸盐反应而制备。具有金属螯合 物的缀合物类似地产生。可缀合于抗体的其它组分包括放射性核素例 如3Ii、125I、32P、35S、14C3、51Cr、36Cl、57Co、58Co、59Fe5、75Se及 152Eu。
本发明的放射性标记的单克隆抗体是根据本领域熟知的方法产 生的。例如，将单克隆抗体通过与碘化钠或碘化钾及一种化学氧化剂 如次氯酸钠或者一种酶促氧化剂如乳过氧化物酶接触而碘化。本发明 的单克隆抗体可以通过配体交换方法用锝标记，例如通过用锡溶液还 原高锝酸盐、将还原的锝螯合在Sephadex柱上、将所述抗体施加于 该柱，或者通过直接标记技术(例如通过保温高锝酸盐、还原剂如 SNCl2、缓冲溶液如邻苯二甲酸钠钾溶液和抗体)进行标记。
任何免疫测定均可用于监测针对BSX蛋白或其免疫原性片段或 表位产生的抗体。免疫测定最简单和最直接的含义是指结合测定。某 些优选的免疫测定是本领域已知的各种类型酶联免疫吸附测定 (ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测 也特别有效。然而，应理解检测不限于这些技术，也可以应用Western 印迹、斑点印迹、FACS分析等。
最优选地，测定能产生量化结果。
例如在简单的竞争分析中测试抗体。将结合B细胞表位的已知 抗体制品和测试抗体与抗原组合物一起保温，所述组合物包含优选地 在天然抗原中的B细胞表位。如本文所用，“抗原组合物”是指含有 一些可及形式(accessible form)的B细胞表位的任何组合物。特别 优选ELISA平板的抗原包被的孔。在一个实施方案中，在施加抗原 组合物之前，将已知抗体及不同量的测试抗体(例如1∶1、1∶10和1∶100) 预先混和一定时间。如果一种已知抗体是标记的，则可以直接检测与 抗原结合的标记；对比未混和的样品测定将确定测试抗体的竞争及因 此的交叉反应性。或者，使用特异于已知或测试抗体的二级抗体将能 确定竞争。
结合所述抗原组合物的抗体能有效地竞争已知抗体的结合，并因 此显著降低后者的结合。已知抗体在没有任何测试抗体存在下的反应 性作为对照。在存在测试抗体时的反应性的显著降低表明测试抗体与 B细胞表位结合(即其与已知抗体交叉反应)。
在一种举例性的ELISA中，将BSX蛋白或其免疫原性片段或B 细胞表位固定在呈现蛋白质亲和性的选定表面上，所述表面如聚苯乙 烯微滴定平板的孔。然后，向孔中加入含有包含B细胞表位的肽的 组合物。在结合及洗涤以除去非特异性结合的免疫复合物之后，可以 检测结合的表位。通常通过加入已知结合B细胞表位并与一种可检 测的标记连接的第二种抗体进行检测。这种类型的ELISA是一种简 单的“夹心ELISA”。也可以通过加入所述第二种抗体，随后加入与 第二种抗体具有结合亲和性的第三种抗体进行检测，所述第三种抗体 与一种可检测的标记连接。
在另一种既适用于流动相(flow through)ELISA也适用于固相 ELISA的免疫测定形式中，将结合免疫原性BSX蛋白或免疫原性 BSX片段或B细胞表位的抗体固定在呈现蛋白质亲和性的选定表面 上，如聚苯乙烯微滴定平板的孔或柱中。在足以使得抗原-抗体复合 物形成的条件下加入包含免疫原性BSX蛋白或免疫原性肽或含所述 抗体结合的B细胞表位的免疫原性片段的样品一段足以使得抗原- 抗体复合物形成的时间。在这种情况下，加入的BSX蛋白、肽或片 段与人Ig复合。在患者血清的情况中，例如通过患者对结核分支杆 菌BSX蛋白的应答，所述肽优选地与人Ig复合。在结合及洗涤以除 去非特异性结合的免疫复合物之后，结合的表位通过加入已知结合所 述免疫复合物中的人Ig并与可检测的标记连接的第二种抗体而检测。 这是一种经修改的“夹心ELISA”。通过加入所述第二种抗体，随后 加入与第二种抗体具有结合亲和性的第三种抗体而实现检测，所述第 三种抗体与一种可检测的标记连接。
本发明显然涵盖了用于诊断结核分支杆菌感染的多分析物测试。 例如检测抗结核分支杆菌BSX蛋白的抗体的测定可以与检测抗结核 分支杆菌谷氨酰胺合成酶(GS)的抗体的测定组合。在这方面，本发明 人也制备了浆细胞瘤，其产生的单克隆抗体与GS的免疫原性片段或 肽或表位结合，所述GS的免疫原性片段或肽或表位包含位于全长 GS的约第265位残基至约第300位残基、更优选地位于GS的约第 270位至约第295位、更优选地位于GS的约第271位至约第295位 残基的至少大约5个连续氨基酸残基的氨基酸序列，特别是氨基酸序 列RGTDGSAVFADSNGPHGMSSMFRSF(SEQ ID NO：54)中的至少5 个连续氨基酸残基。因此，所述抗体结合进一步包含对基本肽的免疫 原性无不利影响的N末端和C末端延伸的SEQ ID NO：54的5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24或25个连续氨基酸残基。
本发明的抗体可以结合在固体支持物上和/或与合适的试剂、对 照物、说明书等一起包装进在合适的容器中的试剂盒中。
检测结核病或结核分支杆菌感染的诊断/预后方法
1.基于抗原的测定
本发明提供了一种诊断对象中结核病或结核分支杆菌感染的方 法，所述方法包括检测所述对象生物学样品中BSX蛋白或其免疫原 性片段或表位，其中样品中所述蛋白质或其免疫原性片段或表位的存 在表明感染的存在。
与基于抗体的测定相反，检测结核分支杆菌抗原的一个优点是严 重无免疫应答的患者也许不产生可检测水平的抗体，并且任何患者中 抗体的水平均不反映细菌负荷。另一方面，抗原水平应反映细菌负荷， 并且作为细菌产物，抗原水平是检测其存在的直接方法。
在本发明诊断测定的一个实施方案中，提供了一种检测对象中结 核分支杆菌感染的方法，所述方法包括将所述对象的生物学样品与能 结合BSX蛋白或其免疫原性片段或表位的抗体接触，并检测抗原- 抗体复合物的形成。
在另一个实施方案中，本发明的诊断测定可用于确定对象中结核 病或结核分支杆菌感染的进展。根据本发明的这些预后应用，生物学 样品中的BSX蛋白或其免疫原性片段或表位的水平与感染状态呈正 相关。例如，所述BSX蛋白或其免疫原性片段的水平低于在表现出 结核病或感染症状的对象中检测到的BSX蛋白或其免疫原性片段的 水平，表明该对象从感染中恢复。相似地，如果所述对象生物学样品 中所述蛋白质或片段的水平高于健康个体，则表明该对象未消除疾病 或感染。
因此，本发明的另一个实施方案提供了一种确定患有结核病或结 核分支杆菌感染的对象对用针对所述结核病或感染的治疗性化合物 的治疗的应答的方法，所述方法包括检测来自所述对象的生物学样品 中BSX蛋白或其免疫原性片段或表位，其中所述蛋白质或其片段或 表位的水平高于在正常或健康个体中检测到的该蛋白质或其片段或 表位的水平，表明该对象对所述治疗无应答或者未消除疾病或感染。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种确定患有结核病或结核 分支杆菌感染的对象对用针对所述结核病或感染的治疗性化合物的 治疗的应答的方法，所述方法包括检测来自所述对象的生物学样品中 的BSX蛋白或其免疫原性片段或表位，其中所述蛋白质或其片段或 表位的水平低于在患有结核病或结核分支杆菌感染的对象中检测到 的所述蛋白质或其片段或表位的水平，表明所述对象应答所述治疗或 者已经消除疾病或感染。显然，如果BSX蛋白或其片段或表位的水 平在对象中检测不到，则该对象已经应答所述治疗。
在另一个实施方案中，将患者生物学样品中BSX蛋白的量与先 前得自同一患者的生物学样品中的相同蛋白质的量进行对比。如本领 域技术人员所明了，这种方法可用于持续监测潜伏期感染患者或者已 经发生结核病的患者。以这种方式，可以监测患者特别是HIV+个体 的感染或疾病的发作或进展，以在建立感染之前着手进行治疗。
或者或另外，可以将得自结核病对象的生物学样品中检测到的蛋 白质的量与参考样品对比，其中所述参考样品得自一或多个未经历感 染或疾病的结核病患者或者一或多个最近接受成功的感染治疗的结 核病患者和/或未患有结核病及未经历感染或疾病的一或多个对象。
在一个实施方案中，BSX蛋白或其免疫原性片段在参考样品中 检测不到，然而所述BSX蛋白或其免疫原性片段在患者样品中检测 到，表明该患者患有结核病或者结核分支杆菌感染或者即将发生急性 感染。
或者，患者样品中BSX蛋白或其免疫原性片段的量与在参考样 品中检测的水平相比可能是增高的。同样，这表明从中分离所述生物 学样品的患者患有结核病或者结核分支杆菌感染或者即将发生急性 感染。
在本文所述诊断/预后方法的一个实施方案中，所述生物学样品 预先得自对象。根据这个实施方案，所述预后或诊断方法是离体(ex vivo)进行的。
在另一个实施方案中，本发明的诊断/预后方法进一步包括处理 对象样品以产生包含分析物的衍生物或提取物(例如胸膜腔积液或痰 液)。
合适的样品包括如下组织的提取物：如脑、乳腺、卵巢、肺、结 肠、胰腺、睾丸、肝、肌和骨组织，或者体液如痰、血清、血浆、全 血、血清或胸膜腔积液。
优选地，生物学样品是选自如下的体液或组织样品：唾液、血浆、 血液、血清、痰、尿、及肺。不除外其它样品。
从本文描述中显而易见的是优选的样品可包含循环免疫复合物， 所述循环免疫复合物包含与人免疫球蛋白复合的BSX蛋白或其片 段。这种免疫复合物的检测显然在本发明的范围内。根据这个实施方 案，捕获试剂例如捕获抗体除了捕获对象循环系统中分离的抗原之 外，还用于捕获与对象的免疫球蛋白复合的BSX抗原(BSX多肽或其 免疫活性片段或表位)。抗Ig抗体，任选地与可检测的标记缀合，用 于特异性结合捕获的CIC，从而检测CIC患者样品。在本发明的范围 内，抗Ig抗体优先结合样品中的IgM、IgA或IgG。在特别优选的实 施方案中，抗Ig抗体结合人Ig，例如人IgA、人IgG或者人IgM。 抗Ig抗体可以与本领域已知的任何标准可检测的标记缀合。这特别 用于检测病原体例如细菌或病毒的感染，或者用于诊断与CIC相关 的任何疾病或失调。因此，本发明任一实施方案所述的诊断方法可以 进行修改，其中衍生自对象的样品包含一或多种循环免疫复合物，所 述复合物包含与结核分支杆菌的BSX蛋白或者一或多种免疫原性 BSX肽、其片段或表位结合的免疫球蛋白(Ig)，其中检测抗原-抗体 复合物的形成包括将抗Ig抗体与循环免疫复合物接触，接触的条件 和时间为以足以形成复合物的条件和时间，然后检测结合的抗Ig抗 体。
2.基于抗体的测定
本发明提供了一种诊断对象中结核病或结核分支杆菌感染的方 法，所述方法包括在来自所述对象的生物学样品中检测抗BSX蛋白 或其免疫原性片段或表位的抗体，其中所述样品中存在所述抗体表示 存在感染。所述感染可以是继往的或当前的感染或者潜伏感染。
基于抗体的测定主要用于检测结核分支杆菌的活动性感染。优选 地，由于在结核分支杆菌最近的继往感染或慢性感染中持续的残余抗 体水平而需要考虑对象的临床病史。
测定形式是廉价但高度敏感性的，然而不如基于抗原的测定形式 那样有效地检测无免疫应答的个体中的感染。然而，基于抗体的测定 显然可用于检测不是无免疫应答的HIV-或HIV+个体中的感染。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种检测对象中结核分支杆 菌感染的方法，所述方法包括将得自该对象的生物学样品与BSX蛋 白或其免疫原性片段或表位接触，并检测抗原-抗体复合物的形成。
在另一个实施方案中，本发明的诊断测定可用于确定对象中结核 病或结核分支杆菌感染的进展。根据本发明的这些预后应用，所述对 象的血液或血清或免疫球蛋白组分中的抗BSX蛋白或其片段或表位 的抗体的量与感染状态正相关。例如，抗BSX抗体的水平低于在患 有结核病症状或感染的对象中检测到的抗BSX抗体水平，表明该对 象正从感染中恢复。相似地，所述对象样品中抗体水平高于健康个体 抗体水平表明该对象未消除疾病或感染。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种确定患有结核病或结核 分支杆菌感染的对象对用针对所述结核病或感染的治疗性化合物治 疗的应答的方法，所述方法包括检测所述对象生物学样品中抗BSX 蛋白或其免疫原性片段的抗体，其中抗体水平与在正常或健康对象中 检测到的抗体水平相比增强，表明该对象对所述治疗无应答或者未能 消除疾病或感染。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种确定患有结核病或结核 分支杆菌感染的对象对用针对所述结核病或感染的治疗性化合物治 疗的应答的方法，所述方法包括检测所述对象生物学样品中的抗BSX 蛋白或其免疫原性片段或表位的抗体，其中抗体的水平低于在患有结 核病或结核分支杆菌感染的对象中检测到的抗体水平，表示该对象应 答所述治疗或者已经消除疾病或感染。
可以将在患有结核病的对象的生物学样品中检测到的抗BSX蛋 白或片段的抗体的量与参考样品相对比，其中参考样品得自先前未感 染过结核分支杆菌或者最近未感染过结核分支杆菌的健康对象。这种 阴性对照对象具有较低的循环抗体效价，使其成为基于抗体的测定形 式中的合适标准。例如，抗BSX蛋白或其免疫原性片段的抗体在参 考样品中未检测到，仅在患者样品中检测到，表明该患者患有结核病 或结核分支杆菌感染或者将发生急性感染。
在本文所述诊断/预后方法的一个实施方案中，所述生物学样品 是预先得自对象。根据这个实施方案，所述预后或诊断方法离体进行。
在另一个实施方案中，所述诊断/预后方法进一步包括对对象样 品进行处理以产生包含分析物的衍生物或提取物(例如血液、血清或 者含有免疫球蛋白的任何样品)。
合适的样品包括例如含免疫球蛋白的组织的提取物，如血液、骨、 或体液如血清、血浆、全血、含有免疫球蛋白的血清组分、含有免疫 球蛋白的血浆组分、含有免疫球蛋白的血液组分。
3.检测系统
本发明的优选检测系统包括检测分离自人对象的生物学样品中 蛋白质或抗体的任何已知测定，例如SDS/PAGE、等电位聚焦、包含 SDS/PAGE和等电位聚焦的双向凝胶电泳、免疫测定、使用蛋白质的 抗体或非抗体配体如小分子(例如蛋白质的化学化合物、激动剂、拮 抗剂、变构调节剂、竞争性抑制剂、或者非竞争性抑制剂)的检测系 统。根据这些实施方案，抗体或小分子可以用于适合检测蛋白质的任 何标准固相或溶液相测定形式中。本发明显然也涵盖了光学或荧光检 测，例如使用质谱分析、MALDI-TOF、生物传感器技术、倏逝光纤 (evanescent fiber optics)或者荧光共振能量转移。本发明特别涵盖了 适用于高通量筛选大量样品的测定系统，特别是高通量质谱共振方法 (例如MALDI-TOF、电喷雾(electrospray)MS或者纳升级电喷雾 (nano-electrospray)MS)。
特别优选的免疫测定形式，例如选自免疫印迹、Western印迹、 斑点印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、酶免 疫测定。也可以使用利用荧光共振能量转移(FRET)、同位素编码的亲 和性标记(ICAT)、基质辅助激光解析/电离飞行时间(MALDI-TOF)、 电喷雾电离(ESI)、生物传感器技术、倏逝光纤技术或蛋白质芯片技 术的改进的免疫测定。
优选地，所述测定是半定量测定或定量测定。
标准固相ELISA形式特别用于确定各种患者样品的蛋白质或抗 体浓度。
在一种形式中，这种测定包括将包含抗BSX抗体或者BSX蛋白 或其免疫原性片段的生物学样品固定在固相基质上，例如固定在聚苯 乙烯或聚碳酸酯微孔或者dipstick、膜或玻璃支持物(例如玻片)上。
在基于抗原的测定中，将特异性结合BSX蛋白的固定化抗体与 生物学样品直接接触，与所述样品中存在的任何其靶蛋白质形成直接 键合。对于基于抗体的测定，将固定化的分离或重组的BSX蛋白或 其免疫原性片段或表位与生物学样品接触。溶液中加入的抗体或蛋白 质通常用可检测的报道分子标记，例如荧光标记(例如FITC或Texas Red)，或酶(例如辣根过氧化物酶(HRP))、碱性磷酸酶(AP)或者β-半 乳糖苷酶。或者或另外，可以使用结合第一抗体或者结合分离/重组 的BSX抗原的第二种标记抗体。在洗涤除去任何未结合的抗体或 BSX抗原后，在荧光标记的情况中所述标记可以被直接检测或者通 过加入底物如过氧化氢、TMB、或者甲苯胺或者5-溴-4-氯-3-吲哚-β- D-吡喃半乳糖苷(x-gal)检测。
这种基于ELISA的系统特别适于定量样品中的蛋白质或抗体的 量，例如根据已知标准量校准该检测系统。
在另一种形式中，ELISA包括将特异性结合BSX蛋白的抗体固 定在固体基质上，例如固定在膜、聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔、聚苯乙 烯或聚碳酸酯dipstick或玻璃支持物上。然后将患者样品与所述抗体 进行物理接触，样品中的抗原被结合或“捕获”。然后使用标记抗体 检测结合的蛋白质。例如如果从人样品中捕获了所述蛋白质，则使用 抗人抗体检测捕获的蛋白质。
在一个实施例中，本发明包括：
(i)将特异性结合本发明的免疫原性BSX肽的抗体固定在固体基 质或支持物上(例如包含SEQ ID NO：2-53所示一或多个序列的肽)；
(ii)将结合的抗体与得自对象的样品、优选含有抗体的样品如血 液、血清或其含有Ig的组分接触，接触的条件和时间为足以使得固 定化抗体结合样品中的GS蛋白或其片段从而形成抗原-抗体复合物 的条件和时间；
(iii)检测形成的抗原-抗体复合物，包括将所述复合物与识别人 Ig的抗体接触，其中所述人Ig的存在表示患者样品中存在结核分支 杆菌。
根据这个实施方案，固定化抗体的特异性保证只有分离的或免疫 复合的BSX蛋白质或包含抗体识别的表位的片段发生实际结合，而 抗人Ig的特异性保证只有免疫复合的BSX蛋白或片段被检测。文中 术语“免疫复合的”是指患者样品中的BSX蛋白或其片段与人Ig如 人IgA或人IgM或人IgG等复合。因此，这一实施方案可特别用于 检测结核分支杆菌的存在或者在对象中已经产生免疫应答的结核分 支杆菌感染。通过适当地选择检测抗体，例如抗人IgA或抗人IgG或 者抗人IgM，可以进一步检测对象的免疫应答同种型。这种人IgA、 IgM和IgG的检测抗体在本领域是公众可获得的。
或者，或除了前述实施方案之外，可以使用与第二(检测)抗体 结合的第三标记抗体。
技术人员显然明白本发明所述测定形式适合高通量形式，例如自 动化筛选方法，或者如Mendoza et al，Biotechniques 27(4)：778-788， 1999所述的微阵列形式。另外，本领域技术人员显然明白上述测定 的变化形式，例如竞争性ELISA。
或者，抗BSX抗体或者BSX蛋白或其免疫原性片段的存在使用 放射性免疫测定(RIA)检测。该测定的基本原理是使用放射性标记的 抗体或抗原以检测抗体-抗原相互作用。例如，可以将特异性结合 BSX蛋白的抗体与一种固体支持物结合，及将生物学样品直接与所 述抗体接触。为了检测结合的抗原，将放射性标记的分离和/或重组 形式的抗原与所述抗体直接接触。在洗涤之后，检测结合的放射性的 量。由于生物学样品中的任何抗原均抑制放射性标记的抗原的结合， 因此检测到的放射性的量与样品中抗原的量成反比。这种测定可以通 过增加已知浓度的分离的抗原而利用标准曲线量化。
如技术人员所显然明白，这种测定可以进行修改以使用任何报道 分子，例如酶或荧光分子代替放射性标记。
Western印迹也可用于检测BSX蛋白或其免疫原性片段。在这种 测定中，来自生物学样品的蛋白质使用十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯 酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，所述分离使用本领域熟知的技术及 例如Scopes(Ini Protein Purification：Principles and Practice，Third Edition，Springer Verlag，1994)所述技术进行。然后使用本领域熟知的 方法如电子转移方法将分离的蛋白质移至固体支持物，如一种膜或更 具体地，PVDF膜。然后可以将这个膜用特异性结合BSX蛋白的标 记的抗体或配体封闭和探查。或者，可以使用标记的第二或者甚至第 三抗体或配体检测特异性第一抗体的结合。
特别优选的是检测抗BSX抗体或者BSX蛋白或其免疫原性片段 的存在的高通量方法。
在一个实施方案中，使用MALDI-TOF快速鉴别已经通过单向或 双向凝胶电泳分离的蛋白质。因此，不需要使用特异性结合感兴趣蛋 白质的抗体或配体检测感兴趣的蛋白质。优选使用本领域熟知的方法 利用凝胶电泳分离来自生物学样品的蛋白质，及使用MALDI-TOF测 定那些在大约正确分子量和/或等电点的蛋白质，以确定感兴趣蛋白 质的存在与否。
或者，使用MALDI或ESI或者组合方法确定生物学样品例如痰 中特定蛋白质的浓度。这种蛋白质优选地被预先充分鉴定一些参数如 分子量和等电点。
生物传感器装置通常采用一个电极表面组合电流或阻抗测定元 件，它们与测定底物集成在一个装置中(如美国专利No.5,567,301所 述)。特异性结合感兴趣的蛋白质的抗体或配体优选被掺入生物传感 器装置的表面上，分离自患者的生物学样品(例如使用本文所述方法 溶解的痰)与所述装置接触。通过生物传感器检测到电流或阻抗中的 变化表示蛋白质与所述抗体或配体结合。本领域已知的一些形式的生 物传感器也依赖于表而等离子体共振来检测蛋白质相互作用，从而表 面等离子体共振表面反射中的变化表示蛋白质与配体或抗体结合(美 国专利No.5,485,277和5,492,840)。
生物传感器由于其便于使系统适应微升(micro-)或纳升(nano-) 规模而特别用于高通量分析中。另外，这类系统便于适应掺入一些检 测试剂，可以在一个生物传感器单元中复用多个诊断试剂。这样可以 在少量体液中同时检测多个表位。
倏逝生物传感器(Evanescent biosensor)也是优选的，因为它们 不需要在检测感兴趣的蛋白质之前对生物学样品进行预处理。倏逝生 物传感器通常依赖于与荧光分子例如附着在探针表面附近的荧光抗 体相互作用的预定波长的光在诊断蛋白质与抗体或配体结合时发出 不同波长的荧光。
为了产生蛋白质芯片，将能特异性结合感兴趣抗体或蛋白质的蛋 白质、肽、多肽、抗体或配体结合在固体支持物上，所述支持物例如 是玻璃、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、氧化硅、金属或氮化硅。 这种固定是直接(例如通过共价键如Schiff’s碱形成，二硫键、或者酰 胺或尿素键形成)或间接固定。产生蛋白质芯片的方法为本领域所已 知，在例如美国专利申请No.20020136821、20020192654、20020102617 及美国专利No.6,391,625中描述。为了将蛋白质与固体支持物结合， 通常需要处理所述固体支持物以在表面上产生化学反应基团，例如用 含有醛的硅烷试剂处理。或者，抗体或配体可以被捕获在显微制造的 (microfabricated)聚丙烯酰胺凝胶垫上及使用Arenkov et al.Anal. Biochem.278：123-131，2000所述微电泳方法加速进入凝胶中。
优选产生的蛋白质芯片上排列一些蛋白质、配体或抗体阵列。这 种形式可以同时筛选样品中多种蛋白质的存在。
或者，蛋白质芯片可以仅包含一种蛋白质、配体或抗体，用于筛 选一或多个患者样品中的一种感兴趣多肽的存在。这种芯片也可用于 同时筛选一组患者样品的感兴趣多肽。
优选地，待使用蛋白质芯片分析的样品附着于报道分子如使用本 领域熟知方法可检测的荧光分子、放射性分子、酶，或者抗体。因此， 通过将蛋白质芯片与标记的样品接触，随后洗涤以除去任何未结合的 蛋白质，使用本领域熟知的方法例如使用DNA微阵列读数器可以检 测到结合的蛋白质的存在。
或者，使用生物分子相互作用分析-质谱分析(BIA-MS)快速检 测和鉴定复杂的生物学样品中存在的低fmol至亚fmol水平的蛋白质 (Nelson et al.Electrophoresis 21：1155-1163，2000)。一种可用于蛋白质 芯片分析中的技术是表面增强的激光解吸/离子化-飞行时间-质谱 分析(SELDI-TOF-MS)技术，其鉴定与蛋白质芯片结合的蛋白质。或 者，使用如美国专利申请20020139751所述的ESI分析蛋白质芯片。
如技术人员所显然明白，蛋白质芯片特别适合检测试剂的多元 化。因此，一些能特异性结合不同的肽或蛋白质的抗体或配体可以结 合所述蛋白质芯片的不同区域。然后使用所述芯片进行的生物学样品 分析可以检测多个感兴趣的蛋白质或者BSX蛋白的多个B细胞表位。 本发明特别涵盖了诊断和预后标记的多元化。
在进一步的实施方案中，使用ICAT、特别是如美国专利申请No. 20020076739所述的方法分析样品。这个系统依赖于用第一种试剂标 记来自一个来源(即健康个体)的蛋白质样品及用第二种试剂标记来 自另一个来源(即结核病患者)的蛋白质样品，第二种试剂与第一种试 剂在化学性质上相同，但是由于同位素组成而在质量上不同。优选的 是所述第一种和第二种试剂还包含生物素分子。然后混和等浓度的两 种样品，通过抗生物素蛋白亲和层析回收肽。然后使用质谱分析法分 析样品。重与轻肽离子之间峰高度的任何差异与生物学样品中蛋白质 丰度差异直接相关。然后使用本领域熟知的方法确定这种蛋白质的身 份，例如通过MALDI-TOF或ESI确定。
在一个特别优选的实施方案中，将包含抗BSX抗体或者BSX蛋 白或其免疫原性片段的生物学样品进行双向凝胶电泳。根据这个实施 方案，优选在电泳之前除去样品中某些微粒物质，例如通过离心、过 滤或者组合离心与过滤。然后分离生物学样品中的蛋白质。例如，蛋 白质可根据其电荷使用等电位聚焦和/或根据其分子量而分离。双向 分离(two-dimensional separation)可以鉴别蛋白质的各种同种型，因 为具有相似分子量的蛋白质也通过其电荷而分离。使用质谱分析可以 确定患者样品中是否存在感兴趣的蛋白质。
如本领域技术人员所显然明白，本文描述的诊断或预后测定可以 是多元测定。如本文所用术语“多元(multiplex)”不仅是指在单一 样品中同时检测两或多种诊断或预后标记，而且还涵盖相继检测单一 样品中两或多种诊断或预后标记、同时检测不同但匹配的样品中两或 多种诊断或预后标记、及相继检测不同但匹配的样品中两或多种诊断 或预后标记。如本文所用术语“匹配的样品”是指衍生自相同初始生 物学样品的两或多种样品，或者在同一时间点分离的两或多种生物学 样品。
因此，多元测定可包括在同一反应中检测若干抗BSX抗体和/或 BSX表位的测定，并且同时或替代地其可检测除了一或多种抗BSX 抗体和/或BSX表位之外的其它一或多种抗原/抗体。
本发明清楚地涵盖了通过细胞表面上的一或多种受体和/或一或 多种HIV-I和/或HIV-2抗原除了检测CD4+T辅助细胞之外还检测 BSX抗体和表位的多元测定。这种测定特别用于同时获得关于结核 分支杆菌与HIV-I和/或HIV-2共同感染的信息，和/或用于确定具有 结核分支杆菌的对象是否是无免疫应答的。显然，这种多元测定形式 可用于监测HIV+/TB+个体的健康状况。
正如技术人员所明了，如果这种测定是基于抗体或配体，则这些 抗体必须在相同条件下起作用。
4.生物学样品和参考样品
优选地，要检测其中的BSX蛋白或抗BSX抗体的生物学样品是 选自如下的样品：肺、与肺相关的淋巴组织、鼻旁窦、支气管、细支 气管、肺泡、呼吸道纤毛粘膜上皮、呼吸道粘膜上皮、支气管肺泡灌 洗液(BAL)、肺泡内液、痰、粘液、唾液、血液、血清、血浆、尿、 腹膜液、心包液、胸膜腔积液、呼吸道鳞状上皮细胞、肥大细胞、杯 状细胞、肺泡上皮细胞(pneumocyte)(1型或2型)、上皮内(intra epithelial)树突细胞、PBMC、嗜中性粒细胞、单核细胞，或者任一 或多种所述组织、体液或细胞的任何含有免疫球蛋白的组分。
在一个实施方案中，生物学样品是预先从患者获得的。
在一个实施方案中，生物学样品通过选自如下一组的方法得自 对象：手术或者其它切除方法、抽吸体液如高渗盐水或丙二醇、支气 管肺泡(broncheoalveolar)灌洗、支气管镜检、用玻璃管收集唾液、 salivette(Sarstedt AG，Sevelen，Switzerland)、Ora-sure(Epitope Technologies Pty Ltd，Melbourne，Victoria，Australia)、omni-sal(Saliva Diagnostic Systems，Brooklyn，NY，USA)及使用本领域熟知的任何方 法例如使用注射器收集血液。
特别优选的是生物学样品是痰，使用例如Gershman，N.H.et al，J Allergy CHn Immunol，10(4)：322-328，1999所述方法分离自患者肺 部。
在另一个优选的实施方案中，生物学样品是使用本领域熟知的方 法分离自从患者收集的血液的血浆。
在一个实施方案中，生物学样品被处理以使其中的细胞溶解。这 类方法包括使用去污剂、酶、重复冷冻与解冻所述细胞、超声或在存 在玻璃珠的情况下涡旋所述细胞等等。
在另一个实施方案中，生物学样品被处理以使其中存在的蛋白质 变性。变性蛋白质的方法包括加热样品，用2-巯基乙醇、二硫苏糖醇 (DTT)、去污剂或其它化合物如胍盐或尿素处理样品。例如优选使用 DTT液化痰。在另一个实施方案中，处理生物学样品浓缩其中的蛋 白质。浓缩蛋白质的方法包括沉淀、冻干、使用漏斗管凝胶(TerBush and Novick，Journal of Biomolecular Techniques，10(3)；1999)、超滤或 透析。
显然，本发明提供的诊断和预后方法需要一定程度的定量以确定 诊断或预后感染或疾病的蛋白质的量。这种定量可以通过在本文所述 的测定中包括进合适的参考样品而确定，其中所述参考样品衍生自健 康或正常个体。
在一个实施方案中，所述参考样品包含例如来自先前或最近未受 感染并且未处于感染或疾病中的健康对象的细胞、体液或组织。这种 参考样品来自不需要手术切除或介入而方便地获得的体液或组织。因 此，优选体液及其衍生物。高度优选的参考样品包括痰、粘液、唾液、 血液、血清、血浆、尿液、BAL液、腹膜液、心包液、胸膜腔积液、 PBMC、嗜中性粒细胞、单核细胞，或者任一或多种所述组织、体液 或细胞的含有免疫球蛋白的任何组分。
对参考样品和测试(或患者)样品进行处理、分析或测定，并比 较针对参考样品和测试样品获得的数据。在一个实施方案中，在同一 时间对参考样品和测试样品进行处理、分析和测定。在另一个实施方 案中，在不同时间对参考样品和测试样品进行处理、分析和测定。
在另一个实施方案中，在测定中不包括参考样品。代之是参考样 品可以衍生自预先产生的已建立的数据集。因此，在一个实施方案中， 参考样品包含来自健康个体的样品群研究的数据，例如，对于健康范 围的被测试的整数为统计学显著的数据。然后将得自测试样品的处 理、分析或测定的数据与针对所述样品群获得的数据相比较。
从足够大量的参考样品中获得的作为群体代表的数据可以用于 产生数据集以确定特定参数的平均水平。因此，可以针对任何个体群、 衍生自所述个体的任何样品、针对测定样品确定的表达产物的水平的 随后比较而确定诊断或预后感染或疾病的蛋白质的量。当依赖这种标 准化数据集时，优选包含在所进行的每一测定中包括内部对照以控制 差异。
诊断测定试剂盒
本发明提供了一种检测生物学样品中结核分支杆菌感染的试剂 盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含：
(i)一或多种结合BSX蛋白或其免疫原性片段或表位的抗体；和
(ii)检测抗原-抗体复合物形成的手段。
在另一个实施方案中，试剂盒包含：
(i)分离或重组的BSX蛋白或其免疫原性片段或表位；和
(ii)检测抗原-抗体复合物形成的手段。
本发明试剂盒的抗体、免疫原性BSX肽和检测手段优选地选自 本文上述的抗体和免疫原性BSX肽，那些实施方案应并入作参考。 技术人员通过本文教导可易于选择对任一测定形式适合的试剂盒成 分。
在一特别优选的实施方案中，所述试剂盒包含：
(i)结合包含选自SEQ ID NO：24、25和45的氨基酸序列的分离 或重组或合成的肽的抗体；和
(ii)抗人Ig。
优选地，所述试剂盒进一步包含适量的一或多种肽或者任两或多 种所述肽的融合体，所述每种肽包含选自SEQ ID NO：2-23、26-44 和46-55的氨基酸序列。
任选地，所述试剂盒进一步包含检测抗体、其片段或配体与BSX 蛋白结合的手段。这种手段包括报道分子例如酶(如辣根过氧化物酶 或碱性磷酸酶)、底物、辅因子、抑制剂、染料、放射性核素、发光 基团、荧光基团、生物素，或者胶体颗粒如胶体金或硒。优选地这种 报道分子与所述抗体或配体直接连接。
在另一个实施方案中，试剂盒可另外包含参考样品。这种参考样 品可例如是衍生自从一或多个结核病对象分离的生物学样品的蛋白 质样品。或者，参考样品可包含分离自一或多个健康个体的生物学样 品。这种参考样品任选地包含在试剂盒中以进行诊断或预后分析。
在另一个实施方案中，参考样品包含通过抗体或配体检测的肽。 优选地，所述肽的浓度已知。这种肽特别用作标准物。因此，使用本 文所述预后或诊断测定可以检测各种已知浓度的这种肽。
在另一个实施方案中，试剂盒任选地包含样品制备的手段，例如 细胞溶解的手段。优选地这种手段是溶解痰的手段，例如去污剂(例 如三丁基膦，C7BZO，硫酸葡聚糖或者聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂 酸酯)。
在另一个实施方案中，试剂盒包含蛋白质分离的手段(Scopes(In： Protein Purification：Principles and Practice，Third Edition，Springer Verlag，1994)。
预防和治疗方法
BSX蛋白或其免疫原性片段或表位当被给予动物对象时可诱导 高效价抗体的特异性产生。
因此，本发明提供了一种引起抗结核分支杆菌抗体生成的方法， 所述方法包括将分离的BSX蛋白或其免疫原性片段或表位给予所述 对象，给予的条件和时间为足以引起抗体例如抗结核分支杆菌的中和 抗体生成的条件和时间。
优选地，所述中和抗体是高效价中和抗体。
产生抗体的BSX蛋白或表位的有效量根据免疫原性B细胞表位 的性质、给予途径、用于免疫的动物、抗体的性质而变化。所有这些 变量通过本领域公认的方式凭经验而确定。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种诱导对象中针对结 核分支杆菌的免疫的方法，所述方法包括给予所述对象分离或重组的 BSX蛋白或其免疫原性片段或表位，给予的条件和时间为引起针对 所述分离或重组的BSX蛋白或其免疫原性片段或表位的体液免疫应 答的条件和时间。
所述免疫抗原可以如本文所述的任何常规配制品形式给予。
“体液免疫应答”是指针对免疫抗原产生的足以预防结核分支杆 菌感染的二次免疫应答。
优选地，产生的体液免疫包括引起对象中持续水平的针对免疫抗 原中的B细胞表位的抗体。“持续水平的抗体”是指抗B细胞表位的 足以预防结核分支杆菌感染水平的循环抗体。
优选地，抗体水平持续至少大约6个月或9个月或12个月或2 年。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种增强对象免疫系统的方 法，所述方法包括给予免疫学活性BSX蛋白或表位或包含所述BSX 蛋白或表位的疫苗组合物，给予的时间和条件是足以赋予或增强抗所 述对象中结核分支杆菌的抗性的时间和条件。
“赋予或增强抗性”是指在所述对象中发生结核分支杆菌特异性 免疫应答，所述应答选自如下一组：
(i)在对象中产生抗结核分支杆菌的BSX蛋白或所述蛋白的表位 的抗体；
(ii)在所述对象中产生抗结核分支杆菌的中和抗体；
(iii)所述对象中特异于结核分支杆菌的BSX蛋白的细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)和/或CTL前体被激活；
(iv)所述对象具有对后来的结核分支杆菌感染或者潜伏的结核 分支杆菌感染的再活动的增强的免疫。
本发明涵盖一种在未感染的人对象中提供或增强抗结核分支杆 菌的免疫的方法，所述方法包括将免疫学活性的BSX蛋白或其表位 或包含所述BSX蛋白或其表位的疫苗组合物给予所述对象，给予的 时间和条件为足以提供对抗未来的结核分支杆菌感染的免疫记忆的 时间和条件。
本发明提供了一种治疗对象的结核病的方法，包括进行本发明所 述的诊断方法或预后方法。
在一个实施方案中，本发明提供了一种预防方法，所述方法包括：
(i)检测对象的生物学样品中感染的存在；和
(ii)给予治疗有效量的药物组合物以降低对象肺、血液或淋巴系 统中病原菌的数目。
优选地，将BSX蛋白或表位或疫苗给予具有潜伏的或活动的结 核分支杆菌感染的对象。
不受任何理论或作用模式的限制，所述治疗方法以瞬时或持续方 式增强T细胞识别并溶解携带结核分支杆菌的细胞的能力，或者增强 T细胞识别结核分支杆菌抗原的T细胞表位的能力。相似地，T细胞 群的再激活可以在潜伏的结核分支杆菌感染活动之后或者在重新感 染结核分支杆菌之后或者在用本发明的BSX蛋白或表位或疫苗组合 物免疫先前感染的对象之后而发生。可以使用标准方法确定对象中 CTL激活发生与否，例如使用细胞毒性分析、ELISPOT，或者确定对 象的PBMC中IFN-γ的产生。
优选地，给予所述肽或衍生物或疫苗组合物，时间和条件为足以 引起或增强CD8+T细胞的扩增。更优选地，给予所述肽或衍生物或 疫苗组合物，时间和条件为足以增强对象中结核分支杆菌特异性细胞 介导的免疫(CMI)。
“结核分支杆菌特异性CMI”是指激活的及克隆扩增的CTL是 MHC限制性的并且特异于本发明的CTL表位。CTL是基于抗原特异 性和MHC限制进行分类(即非特异性CTL和抗原特异性的MHC限 制性CTL)。非特异性CTL由多种细胞类型组成，包括NK细胞和抗 体依赖性细胞毒性，可以非常早地在免疫应答中起作用以降低病原体 负荷，而此时抗原特异性应答仍在建立过程中。相反，MHC-限制的 CTL比非特异性CTL较晚达到最佳活性，通常在抗体产生之前。抗 原特异性CTL抑制或降低结核分支杆菌的传播，优选地终止感染。
CTL激活、克隆扩增或者CMI可以全身性诱导或者分区定位 (compartmentally localized)。在分区定位的情况中，优选利用适合给 予该分区而配制的疫苗组合物。另一方面，对于在对象中全身性诱导 CTL激活、扩增或CMI无这种严格要求。
单独给予或者于疫苗组合物中给予的以引起CTL激活、克隆扩 增或者CMI的BSX蛋白或其表位的有效量，基于免疫原性表位的性 质、给予途径、免疫对象的体重、年龄、性别或者一般健康状况及 CTL应答的性质而变化。所有这种变量通过本领域公认的手段凭经验 确定。
BSX蛋白或其表位任选地与任何合适的或希望的载体、佐剂、 BRM或药物可接受的赋形剂一起配制，以可注射的组合物形式常规 给药。注射可以是鼻内、肌内、皮下、静脉内、皮内、腹膜内注射或 者通过其它已知途径。对于静脉内注射，希望所述配制品包括一或多 种液体和营养补充物。
给予的最佳剂量和优选的给予途径使用动物模型确定，例如，为 小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、马、牛、山羊或猪注射包含所述肽的配 制品，然后使用常规测定监测对所述表位的CTL免疫应答。
过继转移技术也可用于赋予或增强抗结核分支杆菌感染的抗性， 或者预防或降低再活动的潜伏感染的严重性。因此，在一个相关的实 施方案中，本发明提供了一种增强或赋予未感染的人对象抗结核分支 杆菌的免疫的方法，包括将得自人对象的T细胞与免疫学活性BSX 蛋白或其表位或包含所述蛋白质或表位的疫苗离体接触，接触的时间 和条件为足以赋予所述T细胞以结核分支杆菌活性。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种增强人对象的结核 分支杆菌特异性细胞介导的免疫的方法，所述方法包括：
(i)将得自人对象的T细胞与免疫学活性BSX蛋白或其CTL表位 或包含所述蛋白质或表位的疫苗组合物离体接触，接触的时间和条件 为足以赋予所述T细胞结核分支杆菌活性；
(ii)将激活的T细胞导入对象自体中或者导入同种异体的另一人 对象中。
所述T细胞可以是CTL或CTL前体细胞。
用于获得T细胞的人对象可以是与治疗对象相同或不同的对象。 治疗对象可以是携带潜伏或活动性结核分支杆菌感染或者处于结核 分支杆菌感染或者结核分支杆菌感染再活动的危险中的任何人对象 或者需要或者期望获得抗结核分支杆菌的免疫接种的人。
优选进行这种过继转移，及基本如Einsele et at，Blood 99， 3916-3922，2002所述测定结核分支杆菌反应性，所述方法在此并入作 参考。
“结核分支杆菌活性”是指如上所述使T细胞能被激活(即T细 胞识别并溶解携带结核分支杆菌的细胞或者能瞬时或者持续识别结 核分支杆菌抗原的T细胞表位)。因此，特别优选的是T细胞是CTL 前体，通过本发明的方法使其能识别并溶解携带结核分支杆菌的细胞 或者能瞬时或持续识别结核分支杆菌抗原的T细胞表位。
对于这种离体应用，T细胞优选包含在得自人对象的生物学样品 中，例如包含初级或中枢淋巴器官(例如骨髓或胸腺)或者次级或周围 淋巴器官(例如血液、PBMC、或者衍生自其中淡黄色外层(buffy coat)级分)的活检组织样品。
优选地，T细胞或者包含T细胞的样品预先从人对象中获得，例 如由接诊医生将样品送至病理学实验室进行分析。
优选地，所述方法进一步包括获得包含对象T细胞的样品及更优 选获得所述对象的所述样品。
配制品
本发明明确涉及BSX蛋白或其免疫原性片段或表位在制备抗人 或其它动物对象中结核分支杆菌感染的治疗或预防性亚单位疫苗中 的应用。
因此，本发明提供了一种药物组合物或疫苗，其包含组合药物可 接受的稀释剂的BSX蛋白或其免疫原性片段或表位。
BSX蛋白或其免疫原性片段或表位在药物学可接受的赋形剂或 稀释剂中常规配制，例如水性溶剂、非水性溶剂、无毒赋形剂如盐、 防腐剂、缓冲剂等。非水性溶剂例如是丙二醇、植物油及可注射的有 机酯如乙基油酸酯。水性溶剂包括水、醇性/水性溶液、盐水溶液、 肠道外载体如氯化钠、Ringer′s葡萄糖等。防腐剂包括抗微生物剂、 抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。药物组合物的各种成分的pH和精确 浓度根据本领域常规技术调节。
在某些情况中，还希望的是将BSX蛋白或其免疫原性片段或表 位与一种佐剂一起配制，以增强对B细胞表位的免疫应答。同样， 这不是严格必需的。这种佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物，例 如细胞因子、毒素或者合成的组合物。佐剂例如包括IL-1、IL-2、BCG、 氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thur-MDP)、 N-乙酰基-正-胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称作 nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸 -2-(r-2′-二棕榈酰-sn-丙三基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 1983A，称作 MTP-PE)、脂质A、MPL和RIBI，其含有从细菌中提取的三种成分、 单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯及于2％角鲨烯/Tween 80乳液中的 细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
用于抗结核分支杆菌疫苗中的特别优选的佐剂例如Elhay and Andersen Immunol.Cell Biol.75，595-603，1997或者Lindblad et ah， Infect.Immun.65，1997所述。
希望的是共同给予生物应答修饰剂(BRM)和BSX蛋白或其免疫 原性片段或表位，以负调节阻抑物T细胞活性。BRM例如包括但不 限于Cimetidine(CEVI；1200mg/d)(Smith/Kline，PA，USA)； Indomethacin(IND；150mg/d)(Lederle，NJ，USA)；或者小剂量的环磷 酰胺(CYP；75、150或者300mg/m.su.ρ.2)(Johnson/Mead，NJ，USA)。
给予BSX蛋白或其免疫原性片段或表位的优选运载体包括脂质 体。脂质体是由围绕水性区室的一或多个脂质双层组成的微型小泡 (Bakker-Woudenberg et ah，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl. I)，S61(1993)；及Kim，Drugs 46，618(1993))。脂质体在成分上与细胞 膜相似，因此脂质体通常可安全给予并且是可生物降解的。
本领域技术人员熟知制备脂质体及配制(例如包囊化)各种分子 包括肽和寡核苷酸的技术。
根据制备方法，脂质体可以是单层或多层的，其直径大小可以在 0.02μm至超过10μm范围内变化。许多物质在脂质体中包囊化。疏 水性物质分隔成双层，亲水性物质分隔在内部水性空间内(Machy et al，LIPOSOMES IN CELL BIOLOGY AND PHARMACOLOGY(John Libbey 1987)及Ostro et al，American J.Hosp.Pharm.46，1576(1989))。
脂质体也可吸附于基本上任何类型的细胞，然后释放包囊化的物 质。或者，脂质体与靶细胞融合，从而脂质体的内容物注入靶细胞中。 或者，吸附的脂质体可以由吞噬性的细胞吞噬。胞吞后是脂质体脂质 经溶酶体内降解及包囊化物质的释放(Scherphof et al，Ann.KY.Acad. ScL 446，368(1985))。在本发明中，BSX蛋白或其免疫原性片段或表 位可以定位于脂质体表面上，以促进抗原呈递而不破坏脂质体或胞 吞。然而，不论机制或输送如何，结果是相关的BSX蛋白或其免疫 原性片段或表位在细胞内分布。
脂质体载体可以是阴离子或者阳离子载体。阴离子脂质体载体包 括pH敏感性脂质体，其在胞吞和内体(endosome)酸化后破坏内体 膜或者与之融合。阳离子脂质体优选的是介导哺乳动物细胞体外转染 或者一般输送核酸，但是也可用于输送其它治疗剂如肽或脂肽。
阳离子脂质体制品是通过常规方法产生的(Feigner et al，Proc. NatI Acad.Sci USA 84，7413(1987)；Schreier，Liposome Res.2，145 (1992))。可易于获得商业制品如Lipofectin(Life Technologies，Inc.， Gaithersburg，Md.USA)。给予的脂质体的量基于剂量应答曲线而优化 (Feigner et al.，如前)。
本发明方法中使用的其它合适的脂质体包括多层脂质体 (multilamellar vesicle，MLV)、寡层脂质体(oligolamellar vesicle， OLV)、单层脂质体(unilamellar vesicle，UV)、小单层脂质体(SUV)、 中等大小的单层脂质体(MUV)、大单层脂质体(LUV)、巨大单层脂质 体(GUV)、多泡脂质体(multivesicular vesicle，MW)、通过反相蒸发方 法(REV)产生的单层或寡层脂质体、通过反相蒸发方法产生的多层脂 质体(MLV-REV)、稳定的多层脂质体(stable plurilamellar vesicle， SPLV)、冷冻或解冻的MLV(FATMLV)、通过挤出方法(VET)制备的 脂质体、通过French press制备的脂质体(FPV)、通过融合制备的脂质 体(FUV)、脱水-再水合脂质体(DRV)及泡沫体(bubblesomes，BSV)。 本领域技术人员意识到制备这些脂质体的技术为本领域所熟知(见 COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS，vol.66，J.Kreuter，ed.， Marcel Dekker，Inc.1994)。
本发明还涵盖了其它形式的输送BSX蛋白或其免疫原性片段或 表位的输送颗粒，例如微球体等。
制备合适的配制品和药物学有效运载体的指导见例如并入参考 的REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第83-92章， 第1519-1714页所述(Mack Publishing Company 1990)(Remington′s)。
或者，通过给予自体同源或同种异源的抗原呈递细胞(APC)或者 已经在体外处理以将所述肽呈递在其表面上的树突细胞，将所述肽或 其衍生物或变体配制为细胞疫苗。
本发明还涵盖了基于核酸的疫苗，所述疫苗包含例如编码免疫学 活性BSX蛋白或表位的DNA或RNA的核酸，及克隆进合适载体中 (例如痘苗病毒、金丝雀痘病毒、腺病毒或其它真核病毒载体)。优选 地，将编码BSX蛋白的DNA配制成DNA疫苗，例如组合现有的 Calmette-Guerin(BCG)或者免疫佐剂如痘苗病毒、Freund′s佐剂或者 另一种免疫刺激剂。
参考如下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例1：用于进行蛋白质组学分析的血清的制备
将HIV+和结核分支杆菌培养呈阳性的血清及HIV+结核分支杆 菌培养呈阴性的血清独立地解冻及处理。加入CHAPS至终浓度为 0.5％(w/v)。然后将样品与9份的冷(-20℃)丙酮混和，在-20℃沉 淀大约1小时。将该沉淀物在4℃以5000g离心沉淀20分钟，通过 在10份的7M尿素、2M硫脲、CHAPS 2％、5mM Tris中旋动而再 悬浮。将此悬浮液用5mM三丁基膦在室温还原1小时，然后用15mM 碘乙酰胺(碘乙酰胺新鲜制备成300mM的溶液)烷基化1小时。
实施例2：分析方法
多通道电泳(Multi Compartmental Electrophoresis)
通过将2.5μl TEMED及5μl的40％APS与immobiline溶液组合， 在这一溶液中浸泡微纤维玻璃滤纸并在50℃干燥1小时，而在pH 3、 5.5、6.3和10.5制备MCE膜。干燥后，将该膜在7M尿素中洗涤4 次30分钟。
将还原和烷基化的样品加样于MCE的中心腔室(central chamber)中。与该中心腔室相邻的各腔室加样7M尿素、2M硫脲 和CHAPS 2％。末端的酸性腔室加样7M尿素、2M硫脲和正磷酸(最 终浓度0.28％v/v)。酸性腔室溶液的pH为大约2.5，并用正磷酸调节 使其比相邻腔室pH值低大约0.5pH单位。将末端碱性腔室加样7M 尿素、2M硫脲和大约7mM氢氧化钠(从10M原液中稀释)。将碱性 腔室溶液的pH调节为大约11，高于相邻腔室pH值大约0.5pH单位。 每个腔室在实验期间均强力搅拌。
将样品在600-800伏特及恒定瓦特在MCE中聚焦40-48小时。 从每个腔室中取样，用移液管分成1ml等份，在-80℃贮存。每个大 的MCE运行产生3个级分：酸(pH3-5.5)，白蛋白(5.5-6.3)和碱(6.3 -10.5)。
第一向电泳(first dimension electrophoresis)
根据实验目的，将样品用7cm或者11cm LPG条集中(focus)。 所述7cm条在45,000-50,000Vh集中；所述11cm条在大约110,000 Vh集中。
第二向电泳
将所有条带均使用Invitrogen NuPage Bis-Tris 4-12％、1.5mm、 2D mini凝胶或者Proteome Systems 11cm Gel Chips电泳。当在 Invitrogen NuPage Bis-Tris凝胶中电泳11cm条时，将IPG条切成两 半。将每一半加样于单独的凝胶中。如Invitrogen所述，将IPG条包 埋在制备于1×MOPS凝胶电泳缓冲液中的0.5％琼脂糖中。所述凝 胶电泳程序为以5mA/凝胶电泳30分钟，以10mA/凝胶电泳30分钟， 及以30mA/凝胶电泳直至追踪染料距离凝胶底部大约3mm。 Proteome Systems Gel Chips在50mM Tris、50mM Tricine、1％SDS 中以50mA/凝胶电泳1.1-1.3小时。凝胶用G-250胶体考马斯蓝或 SyproRuby或银染色。用SyproRuby染色的凝胶在染色之前首先固定 在2次变化的7％乙酸和10％甲醇中，在相同试剂中脱色过夜。
质谱分析
将双向(2D)凝胶用Alphalnnotech凝胶成像仪成像和/或使用HP ScanJet 5200C扫描成文件。切下2D凝胶中的蛋白质斑点，置于150 μl 50％v/v乙腈(MeCN)中，用胶带密封，在30℃保温1小时以除去 考马斯蓝染色。除去MeCN，将凝胶片在烤箱中干燥20分钟。将在 30μl的50mM NH4HCO3缓冲液中的5μg/ml胰蛋白酶加入凝胶片中， 在30℃消化过夜。在用胰蛋白酶消化过夜后，提取肽并使用MAPπ/8 自动加样于指定平板中。在这个步骤之后，剩余的蛋白质提取物贮存 在-20℃以备进一步分析。注意如果材料是用于LC MS-MS分析而 不是MALDI或MALDI PSD分析，则最后的MAP π/8步骤可以省略。 因此，根据实验目的，可以使用如下MS技术的任何组合用于i)鉴 别或者ii)核实推定的鉴别：MALDI-MS-TOF、MALDI-MS-TOF-PSD 和LC MS-MS，包括nano-spray LC-MS-MS。对于MALDI分析，使 用Shimadzu Kratos Axima-CFR或者Bruker Biflex III仪器。
生物信息学分析
在自动收集质谱峰之后，如下处理数据。首先检测所有质谱的肽 质量正确校准。然后处理质谱以除去包括相应于胰蛋白酶峰和基质的 质量在内的背景噪声。然后针对可公开获得的SwissProt和TrEMBL 数据库，使用Proteome Systems搜索引擎IonlQ v69检索该数据。针 对相同的数据库使用内部搜索引擎FragmentastlQ检索PSD数据。针 对所述数据库使用SEQUEST搜索引擎软件检索LC MS-MS数据。
实施例3：结核分支杆菌感染的诊断标记的鉴别
在TB+ZHIV+样品(凝胶编号P802，蛋白质斑点17)中鉴别了等电 点为大约5.23及分子量为大约15356道尔顿的蛋白质。有六种来自 MALDI-TOF数据库中的肽(SEQ ID NO：48-53)匹配这种蛋白质，其 中两种具有1个漏掉的(missed)裂解，四种没有漏掉的裂解。这六 种肽(SEQ ID NO：48-53)覆盖GenBank登记号为No.053759(SEQ ID NO：1)的蛋白质的百分比为32.1％，提示这些肽片段衍生自相同的蛋 白质标记。有两种肽具有甲硫氨酸亚砜修饰。这些数据示于表1，并 且是从用于分析PMF数据的Ion1Q数据库中提取的。
基于通常在XRE家族样蛋白质(即结合某些原核生物基因(例如 Cro、cl、HipB)的上游区域中的顺式作用xenobiotic应答元件的转录 调节蛋白)中发现的螺旋-转角-螺旋基序的存在，将经鉴别具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质称作BSX，。
SEQ ID NO：1所示氨基酸序列相应于从结核分支杆菌基因组的 开放读框的in silico翻译中鉴别的一种结核分支杆菌假设蛋白质。因 此，本文首次揭示了结核分支杆菌的BSX蛋白在人宿主的活动性结 核病感染期间被表达。这些数据提示在TBVHIV+血清中鉴别的结核 分支杆菌BSX蛋白是制备结核病的诊断和治疗试剂的良好候选蛋 白。
                    表1：结核分支杆菌感染的诊断标记的鉴别
肽ID＝肽身份编号
DB质量＝肽的理论质量
User质量＝肽的观察质量
PPM erroi＝以百万分之份数表示的与肽质量相关的误差
MC＝错误裂解
Pep Start＝肽起始处的氨基酸编号
Pep End＝肽末端的氨基酸编号
Mods＝修饰
登录号：053759  序列名称：推定的调节蛋白(转录调节物，PbsX家族)
物种：结核分支杆菌  分子量：15356  等电点：5.23
MSSEEKLAAK VSTKASDVAS DIGSFIRSQR ETAHVSMRQL AERSGVSNPY LSQVERGLRK PSADVLSQIA
KALRVSAEVL YVRAGILEPS ETSQVRDAIITDTAITERQK QILLDIYASF THQNEATREE CPSDPTPTDD(SEQ ID NO：1)
氨基酸覆盖：45覆盖百分比：32.14％   肽ID   DB质量   User质量   PPM误差   MC   Pep Start  Pep End   Mods   序列   O53759.06.1.0.10000T   726.297980   726.225000   100.4923   0   1   6   MSO：1    MSSEEK(SEQ ID NO：48)   O53759.06.31.0.10000T   946.441620   946.506000   -68.0186   0   31   38   MSO：1    ETAHVSMR(SEQ ID NO：49)   O53759.06.15.0.00000T   1337.670080   1337.710000   -29.8420   0   15   27    ASDVASDIGSFIR(SEQ ID NO：50)   O53759.06.44.0.00000T   1435.718110   1435.700000   12.6141   0   44   56    SGVSNPYLSQVER(SEQ ID NO：51)   O53759.06.15.1.00000T   1708.861800   1708.850000   6.9052   1   15   30    ASDVASDIGSFIRSQR(SEQ ID NO：52)   O53759.06.39.1.00000T   2033.041560   2032.990000   25.3617   1   39   56    QLAERSGVSNPYLSQVER   (SEQ ID NO：53)
实施例4：结核分支杆菌的BSX蛋白的B细胞表位作图
1.合成肽
为了鉴别BSX蛋白的免疫原性表位，从SEQ ID NO：1所示的一 级氨基酸序列中产生一系列合成肽(PEPSET)。所述合成肽包含SEQ ID NO：2-44所示的氨基酸序列，它们与SEQ ID NO：1中相应片段的 序列相比加入了额外的N末端和/或C末端序列延伸。
特别地，产生了一种合成肽(表2中#1)，其由SEQ ID NO：1的N 末端15个残基及C末端延伸Gly-Ser-Gly组成。这种肽的基本肽序列 如SEQ ID NO：2所示。PEPSET中其它合成肽(即表2中#2至#43)含 有在分别由SEQ ID No：3-44所示的BSX的基本肽序列中加入的N 末端延伸Ser-Gly-Ser-Gly。
所述肽的结构如表2所示。除了基本肽序列即包含衍生自SEQ ID NO：1的序列及N末端和/或C末端延伸序列之外，表2中所示结构包 括加入在每种肽的N末端和/或C末端的标记(例如生物素， BioCytAm)，以便于它们在免疫测定例如ELISA中的应用。相反，SEQ ID No：2-44所示序列仅示出基本肽序列，即衍生自SEQ ID NO：1的 序列及N末端和/或C末端延伸序列，不包括修饰的残基。技术人员 使用肽合成及蛋白质的免疫学检测的标准方法能加入这种修饰。
                                  表2   编号   肽结构   Hydro   MbI Wt  SEQ ID NO：  (基本肽)   #1   #2   #3   #4   #5   #6   #7   #8   #9   #10   #11   #12   #13   #14   #15   #16   #17   #18   #19   #20   #21   #22   #23   #24   #25   #26   #27   #28   #29   #30   #31   #32   #33   #34   #35   #36   #37   #38   #39   #40   #41   #42   #43   生物素-MSSEEKLAAKVSTKAGSG-BiocytAm   生物素-SGSGEEKLAAKVSTKASDV-NH2   生物素-SGSGLAAKVSTKASDVASD-NH2   生物素-SGSGKVSTKASDVASDIGS-NH2   生物素-SGSGTKASDVASDIGSFIR-NH2   生物素-SGSGSDVASDIGSFIRSQR-NH2   生物素-SGSGASDIGSFIRSQRETA-NH2   生物素-SGSGIGSFIRSQRETAHVS-NH2   生物素-SGSGFIRSQRETAHVSMRQ-NH2   生物素-SGSGSQRETAHVSMRQLAE-NH2   生物素-SGSGETAHVSMRQLAERSG-NH2   生物素-SGSGHVSMRQLAERSGVSN-NH2   生物素-SGSGMRQLAERSGVSNPYL-NH2   生物素-SGSGLAERSGVSNPYLSQV-NH2   生物素-SGSGRSGVSNPYLSQVERG-NH2   生物素-SGSGVSNPYLSQVERGLRK-NH2   生物素-SGSGPYLSQVERGLRKPSA-NH2   生物素-SGSGSQVERGLRKPSADVL-NH2   生物素-SGSGERGLRKPSADVLSQI-NH2   生物素-SGSGLRKPSADVLSQIAKA-NH2   生物素-SGSGPSADVLSQIAKALRV-NH2   生物素-SGSGDVLSQIAKALRVSAE-NH2   生物素-SGSGSQIAKALRVSAEVLY-NH2   生物素-SGSGAKALRVSAEVLYVRA-NH2   生物素-SGSGLRVSAEVLYVRAGIL-NH2   生物素-SGSGSAEVLYVRAGILEPS-NH2   生物素-SGSGVLYVRAGILEPSETS-NH2   生物素-SGSGVRAGILEPSETSQVR-NH2   生物素-SGSGGILEPSETSQVRDAI-NH2   生物素-SGSGEPSETSQVRDAIITD-NH2   生物素-SGSGETSQVRDAIITDTAI-NH2   生物素-SGSGQVRDAIITDTAITER-NH2   生物素-SGSGDAIITDTAITERQKQ-NH2   生物素-SGSGITDTAITERQKQILL-NH2   生物素-SGSGTAITERQKQILLDIY-NH2   生物素-SGSGTERQKQILLDIYASF-NH2   生物素-SGSGQKQILLDIYASFTHQ-NH2   生物素-SGSGILLDIYASFTHQNEA-NH2   生物素-SGSGDIYASFTHQNEATRE-NH2   生物素-SGSGASFTHQNEATREECP-NH2   生物素-SGSGTHQNEATREECPSDP-NH2   生物素-SGSGNEATREECPSDPTPT-NH2   生物素-SGSGATREECPSDPTPTDD-OH   0.24   0.07   0.16   0.13   0.25   0.20   0.18   0.27   0.18   0.13   0.14   0.17   0.27   0.31   0.17   0.20   0.22   0.17   0.19   0.25   0.36   0.29   0.38   0.33   0.51   0.42   0.42   0.24   0.27   0.17   0.28   0.23   0.17   0.35   0.38   0.37   0.44   0.47   0.15   0.14   0.03   0.08   0.06   2,360.82   2,089.37   1,976.21   1,978.18   2,080.32   2,151.36   2,151.36   2,201.47   2,359.69   2,256.52   2,185.44   2,184.46   2,234.56   2,133.38   2,162.39   2,259.59   2,214.55   2,168.48   2,182.50   2,110.48   2,081.44   2,113.44   2,161.53   2,159.56   2,172.60   2,117.43   2,147.45   2,155.43   2,128.36   2,174.34   2,146.38   2,215.49   2,216.47   2,256.62   2,318.70   2,338.69   2,318.66   2,248.52   2,295.45   2,233.40   2,227.35   2,160.30   2,148.24  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44
2.血清样品
用PEPSET的肽筛选30个TB阳性样品和52个TB阴性样品。这 些样品包括来自南非(S.A.)祖鲁族人TB阳性个体、南非祖鲁族人TB 阴性个体、南非高加索人TB阴性个体、世界卫生组织(WHO)未知种 族的TB阳性个体、WHO未知种族TB阴性个体、及澳洲高加索人 TB阴性对照个体的血清及来自中国人TB阳性个体和中国人TB阴性 个体的血浆。
使用如下所述开发的ELISA系统筛选样品的抗体存在情况。
3.ELISA分析
将Nunc-Immuno module maxisorp孔在室温或者4℃用于milli-Q 水中稀释的5μg/ml链霉抗生物素以100μl/孔浓度包被过夜度过周末。 将链霉抗生物素从孔中轻轻拂去，并将每个孔用含有1.0％(w/v)酪 蛋白、0.1％(v/v)Tween 20和0.1％(w/v)Azide(封闭剂)的200μl磷酸 盐缓冲盐水(PBS)封闭。1小时后，除去封闭剂，经搅拌平板将每个 孔用100μl于封闭剂中的生物素酰化的肽包被1小时。随后，将每个 孔用PBS/0.1％Tween 20洗涤5次，在吸水纸上干燥，用干燥剂在4 ℃贮存或者立即使用。接着的是与在封闭剂中1∶50稀释的50μl患者 血清或血浆搅拌保温1小时。在保温后，将所有孔均使用PBS/0.1％ Tween 20经层流洗涤5次，轻拍干燥。然后向每个孔中加入100μl 绵羊抗人IgG-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物。将此缀合物在PBS/0.1％ (w/v)酪蛋白/0.1％(v/v)Tween 20/0.1％(w/v)水杨乙汞(thimerosal) 中1∶10,000(v/v)稀释，搅拌保温1小时。然后将每个孔使用PBS/0.1％ (v/v)Tween 20洗涤4次，使用PBS洗涤2次。最后，向每个孔中加 入100μl液体的基于TMB底物的系统(Sigma)，将孔在室温黑暗下保 温20分钟。通过加入100μl的0.5M硫酸而终止反应。一式两份分析 每种肽，如果一式两份不呈现重复性则再次重复进行。
与患者样品一起，也测试了如下4个对照样品：
1.阴性对照：链霉抗生物素/肽24/无血清或血浆/缀合物；
2.肽对照：链霉抗生物素/无肽/患者血清或血浆/缀合物；
3.阳性对照：链霉抗生物素/肽24/南非血清7/缀合物；
4.血清背景：无链霉抗生物素/无肽/患者血清或血浆/缀合物。
南非血清7由于其在初步的ELISA实验中的持续可再现阳性结 果而用作阳性对照。
4.数据分析
免疫原性肽代表肽吸光率分布中的异常值，根据通过计算正常统 计学分值而进行的对数变换标准化而检测，并且以平均值和通过稳健 M估计(robust M-Estimator)而估计的标准偏差表示。
5.结果
对TB阳性和TB阴性样品针对抗体BSX抗体的存在进行的大规 模筛选表明47％的TB阳性样品含有抗BSX抗体(表3)。对于任一BSX 肽测试呈阳性的TB阴性患者包括1个中国人、1个南非高加索人及 1个澳洲高加索人。
表3：具有抗BSX蛋白抗体的患者数概述   患者的TB状态   具有抗BSX抗体的样品数   总人群   HIV+   HIV-   TB阳性(TB+)   14/30(47％)   13/17(76％)   1/13(8％)   TB阴性(TB-)*   3/52(6％)   0/6(0％)   3/46(7％)
*BSX测试为阳性的对照患者无一对BSX肽24测试呈阳性
总患者群包括HIV状态的区别说明TB/HIV相关性，其中76％ 的含有抗BSX抗体的TB阳性样品也是HIV+(表3)。这一点在南非组 样品中进一步得到证实，其中80％被筛选的南非TB阳性/HIV+样品 含有BSX抗体(表4)。
表4：含有抗BSX抗体的南非TB患者(HIV+和HIV-)的比例   患者的TB状态   HIV+状态   HIV-状态   TB阳性(TB+)   12/15(80％)   1/4(25％)   TB阴性(TB-)   0/5(0％)   1/26(4％)*
*这里包括南非高加索人1/10(10％)
表5例证了在南非TB阳性/HIV+患者群中发现的抗BSX抗体的 特异性和再现性(recurrence)。全部8个BSX肽对于筛选的南非TB 阳性/HIV+血清样品是独特的。抗BSX 24抗体(包含SEQ ID NO：25 所示基本肽)在12例中的9例中发现，抗BSX 23抗体(包含SEQ ID NO：24所示基本肽)在12例中的3例中出现，抗BSX 20(包含SEQ ID NO：21所示基本肽)及抗BSX 35(包含SEQ ID NO：36所示基本肽)在 12例中的2例中发现，抗BSX 13(包含SEQ ID NO：14所示基本肽)、 抗BSX 19(包含SEQ ID NO：20所示基本肽)、抗BSX 21(包含SEQ ID NO：22所示基本肽)及抗B SX 42(包含SEQ ID NO：43所示基本肽)仅 在12例中的1例中发现。
表5：含有抗BSX抗体的南非祖鲁人HIV+血清中的再现的肽   免疫原性BSX肽编号(SEQ ID NO)   出现率   BSX 24(SEQ ID NO：25)   9/12   BSX 23(SEQ ID NO：24)   3/12   BSX 20(SEQ ID NO：21)，BSX 35(SEQ ID NO：36)   2/12   BSX 13(SEQ ID NO：14)，BSX 19(SEQ ID NO：20)   BSX 21(SEQ ID NO：22)，BSX 42(SEQ ID NO：43)   1/12
相反，针对BSX筛选的所有中国人患者血清均为HIV-，并根据 其肺部诊断分类(表6)。无一肺部外或肺部TB阳性血浆含有BSX的 抗体，而仅一个所筛选的TB阴性血浆含有针对一种BSX肽的抗BSX 抗体。
表6：显示肺部状态的中国人患者中含有抗BSX抗体的血浆比例   患者的TB状态   总数   肺TB   肺外   TB阳性(TB+)   0/9(0％)   0/4(0％)   0/5(0％)   TB阴性(TB-)   1/9(11％)   -   -
最后针对抗BSX抗体筛选的TB阳性组是4个未知种族来源的 WHO血清样品。样品中有两个是TB阳性/HTV-，其中一个经测试 BSX抗体阳性，特别是针对包含SEQ ID NO：25所示基本肽的BSX 24 的抗体阳性。
在3个TB阴性样品中鉴别到抗BSX抗体，然而无论种族如何 无一含有对于TB独特的8个候选肽的抗体。这8个候选肽包SEQ ID NO：14、20、21、22、24、25、29、36。
6.讨论
对TB阴性和TB阴性血清或血浆进行ELISA分析鉴别了含有结 核分支杆菌的全长BSX蛋白的B细胞表位的许多免疫原性BSX肽。
在测试的任何对照TB阴性血清或对照血浆中均未发现肽BSX 24(SEQ ID NO：25)是免疫原性的。也未发现任何这8个独特的候选肽 在TB阴性南非祖鲁人对象血清中是免疫原性的，因此增强了BSX 和/或其任何肽作为诊断试剂及作为免疫原制备适用于针对结核分支 杆菌感染的基于抗原的测定中的单克隆抗体的适宜性。
另外，HIV状态与TB状态之间关于BSX肽24(SEQ ID NO：25) 血清学反应性的相关性具有许多治疗性优势，例如可以检测TB和 HIV状态和/或监测HIV+个体中TB状态。为了进一步强调TB与HIV 之间的相关性，重要的是注意到所有所研究的中国人样品均是HIV 阴性的。
中国人患者群的血浆中可检测的抗BSX抗体的不存在与限于肺 部的肺部TB相关，而在南非患者中HIV状态通常与肺外疾病相关， 其是更全身性的。或者，BSX在中国TB患者中不象在南非TB患者 中那样高度表达。
实施例5：针对衍生自BSX蛋白(SEQ ID NO：1)的合成肽对TB和非 TB血清的筛选
1.合成肽
从转录调节因子PbsX家族的氨基酸序列(SwissProt登记号 053759)中合成三个肽，并作为人免疫球蛋白G的捕获剂在TB阳性 血清中进行评价。一种称作BSX(23-24)(SEQ ID NO：45)的肽包含在 前述实施例中确定的SEQ ID NO：25所示的高免疫原性的肽的序列， 并且具有额外的在全长蛋白质(SEQ ID NO：1)中位于这一序列两侧的 N末端和C末端序列，且C末端与一个半胱氨酸残基缀合。称作N-C 末端(N-C terminal)的另一种肽(SEQ ID NO：46)包含SEQ ID NO：1 的N末端7个残基，其通过一个间插的半胱氨酸残基与SEQ ID NO：1 的C末端7个残基融合。称作肽28的第三种肽(SEQ ID NO：47)包含 SEQ ID NO：29所示序列，其在C末端与一个半胱氨酸残基缀合。这 三种另外的肽的序列示于下表7。
表7：另外的肽的序列   BSX(23-24)肽   SQIAKALRVSAEVLYVRAC(SEQ ID NO：45)   N-C末端   MSSEEKLCDPTPTDD(SEQ ID NO：46)   肽28   VRAGILEPSETSQVRC(SEQ ID NO：47)
对于ELISA形式，SEQ ID NO：45-47所示的肽另外包含与前述 实施例的基本肽连接的N末端接头(Ser-Gly-Ser-Gly)，以促进所述肽 与固体基质的结合。
C末端和内部半胱氨酸残基被包括进来是为了促进所述肽的交 联以用于随后的抗体产生。
2.血清
每个实验中的血清是得自41-44个TB阳性患者(即TB阳性血 清)及51个健康对照对象(即非TB血清)的一组血清。
3.ELISA分析
以3μg/mL将包含SEQ ID NO：45-47的肽包被在ELISA平板上 的5μg/mL链霉抗生物素基底上，然后(封闭后)用非TB对照血清 和已知的TB阳性血清探查。血清在使用之前1/50(v/v)稀释。人IgG 的捕获用酶联绵羊抗HuIgG/四甲基联苯胺(TMB)底物追踪。
4.统计学分析
通过取平均底物产物OD值(来自缀合的过氧化物酶/TMB反应) 并计算在超出平均两标准偏差(two standard deviations above the average)和超出平均三标准偏差(three standard deviations above the mean)(即分别在95％和99.7％显著性水平)的截断值而分析敏感性和 特异性。对于对照血清，一个样品通过Dixon’s异常值检验(N＝30) 产生了异常值OD值。比较包括和排除这一异常值的分析。
如本文所用，所用的与诊断/预后测定相关联的术语“敏感性” 是指使用特定的测定方法诊断的TB阳性对象的比例(即“真”阳性)。 因此，具有增加的敏感性的测定与具有降低或较低的敏感性的测定相 比能检测更高比例的TB感染的对象。
如本文所用，所用的与诊断/预后测定相关联的术语“特异性” 是指使用特定测定方法不转成阳性结果的非TB对象(即未被感染的 对象)的比例(即“真”阴性)。因此，具有增加或增强的特异性的 测定与具有降低的特异性的测定相比假阳性结果更少或者能更大程 度地区分感染的和未感染的对象。
4.结果
a)BSX(23-24)肽(SEQ ID NO：45)
BSX(23-24)肽序列示出与证实的TB阳性血清的明显结合。敏 感性与特异性数据概括示于表8。表8中针对每个对象提供的数据表 明包含SEQ ID NO：45所示序列的肽选择性鉴别患者血清中的抗结核 分支杆菌的抗体。数据还示出使用这些修订的标准的敏感性和特异性 无论异常值忽略与否是相对不变的，然而在3个标准偏差水平敏感性 有边际增加。
表8：BSX(23-24)肽(SEQ ID NO：45)的敏感性和特异性数据     包括对照血清异常值         的％测定值    忽略对照血清异常值        的％测定值   2σ   3σ   2σ   3σ  检测TB阳性  血清的测定敏  感性(n＝41)   46.3％   43.9％   48.8％   46.3％  不检测TB阴  性血清的测定  特异性(n＝51)   94.1％   98.0％   92.0％   98.0％
b)N-C末端(SEQ ID NO：46)和肽28(SEQ ID NO：47)
这两种肽示出与一些证实的TB阳性血清仅微弱相互作用。如表 9和10所示，如果忽略假阳性检测结果，使用这些肽的测定不是高 度敏感性的但却是特异性的。
表9：N-C末端肽(SEQ ID NO：46)的敏感性和特异性数据     包括对照血清异常值         的％测定值     忽略对照血清异常值         的％测定值   2σ   3σ   2σ   3σ  检测TB阳性  血清的测定敏  感性(n＝41)   13.3％   6.7％   17.8％   8.9％  不检测TB阴  性血清的测定  特异性(n＝51)   95.8％   95.8％   93.6％   95.7％
表10：肽28(SEQ ID NO：47)的敏感性和特异性数据     包括对照血清异常值         的％测定值     忽略对照血清异常值         的％测定值   2σ   3σ   2σ   3σ  检测TB阳性  血清的测定敏  感性(n＝41)   11.1％   4.4％   未进行   未进行  不检测TB阴  性血清的测定  特异性(n＝51)   94.1％   96.1％   未进行   未进行
表8-10示出的数据表明BSX(23-24)肽(SEQ ID NO：45)可用于 基于抗体的测定中，以检测患者样品、特别是血清中的结核病。本实 施例中测试的其它两种肽(SEQ ID NO：46和/或47)也可用于消除假阳 性的检测中，例如与SEQ ID NO：45一起作为多分析物测试的一部分。 鉴于前述实施例中呈现的数据，即证实肽23和24(即分别为SEQ ID No：24和25)特别是包含在SEQ ID NO：45序列中的SEQ ID NO：25 组成或包含全长BSX蛋白的免疫原性B细胞表位，这个发现不特别 令人惊奇。
实施例6：针对重组全长BSX蛋白(SEQ ID NO：1)对TB和非TB血清 的筛选
1.血清
血清来自44个TB阳性(涂片或培养物)中国和南非患者(即TB阳 性血清)及44个健康对照对象(即非TB血清)。
2.ELISA测定
以5μg/mL将重组BSX蛋白(SEQ ID NO：1)或者BSX(23-24)肽 (SEQ ID NO：45)直接包被在ELISA平板上，然后(封闭后)用在缓 冲液中1/100(v/v)稀释的非TB对照血清和已知TB阳性血清探查。 人IgG的捕获用酶联绵羊抗HulgG/四甲基联苯胺(TMB)底物追踪。
3.统计学分析
通过取平均底物产物OD值(来自缀合的过氧化物酶/TMB反应) 并计算超出平均两标准偏差和超出平均三标准偏差的显著性(即分别 在95％和99.7％显著性水平)的截断值而分析敏感性和特异性。
4.结果
如表11所示，在这些条件下测定的重组BSX蛋白在检测TB阳 性血清中是高度特异性的。所述测定在测试人群中的敏感性居于SEQ ID NO：45与SEQ ID NO：46-47之中间。
另一方面，所述测定在南非人涂片或培养物TB阳性血清中的敏 感性高于总体的敏感性(即在三个标准偏差截断值为35％对25％)。使 用中国人涂片或培养物TB血清，所述测定的敏感性低于总体敏感性 (即在三个标准偏差截断值为11％对25％)。在中国和南非人群中，所 述测定的特异性是100％，表明这个参数的鲁棒性(robustness)。
                            表11：
          重组BSX蛋白(SEQ ID NO：1)的敏感性和特异性数据     包括对照血清异常值          的％测定值     忽略对照血清异常值          的％测定值   2σ   3σ   2σ   3σ  检测TB阳性  血清的测定敏  感性(n＝44)   29.5％   25.0％   未进行   未进行  不检测TB阴  性血清的测定  特异性(n＝44)   95.5％   100.0％   未进行   未进行
实施例7：根据HIV状态对TB和非TB血清的筛选
1.血清
血清是得自如下对象的一组血清：
(i)5个涂片或培养物TB-阳性和HIV-阴性的南非患者(即TB+ HIV-血清)；
(ii)21个涂片或培养物TB-阳性和HIV-阳性的南非患者(即TB+ HIV+血清)；
(iii)20个涂片或培养物TB-阴性和HIV阴性对象(即健康对照血 清)。
2.ELISA测定
以5μg/mL将重组BSX蛋白(SEQ ID NO：1)或BSX(23-24)肽(SEQ ID NO：45)直接包被在ELISA平板上，然后(封闭后)用在缓冲液 中1/100(v/v)稀释的非TB对照血清和已知TB阳性血清探查。或者， 如前述实施例所述使用BSX(23-24)肽。人IgG的捕获用酶联绵羊抗 HulgG/四甲基联苯胺(TMB)底物追踪。
3.统计学分析
通过取平均底物产物OD值(来自缀合的过氧化物酶/TMB反应) 并计算超出平均两标准偏差和超出平均三标准偏差的显著性(即分别 在95％和99.7％显著性水平)的截断值而分析敏感性和特异性。
4.结果
如表12所示，在这些条件下测定的重组BSX蛋白在检测TB阳 性血清中是高度特异性的。所述测定对测试人群的敏感性对于HIV+ 患者也非常高。使用BSX(23-24)肽获得相似结果。因此，全长重组 BSX蛋白和BSX(23-24)肽独立地检测约40-45％的TB+HIV+对象， 在多分析物测试形式中检测约65％-70％的TB+HIV+对象，仅大约 5％为假阳性。
另一方面，所述测定在南非人涂片或培养物TB阳性血清中的敏 感性高于总体的敏感性(即在三个标准偏差截断值对比为35％对 25％)。使用中国人涂片或培养物TB血清，所述测定的敏感性低于总 体敏感性(即在三个标准偏差截断值为11％对25％)。在中国和南非人 群中，所述测定的特异性是绝对的，即100％，表明这个参数的鲁棒 性。
                             表12
           重组BSX蛋白(SEQ ID NO：1)的敏感性和特异性   重组BSX   (SEQ ID NO：1)  BSX(23-24)肽  (SEQ ID NO：45)   组合的   (蛋白质和肽)  检测TB+HIV-血清  的测定敏感性  (n＝5)   0％   0％   0％  检测TB+HIV+血清  的测定敏感性  (n＝21)   40％   43％   67％  对组合TB+HIV+和  TB+HIV-血清的测  定敏感性(n＝26)   31％   35％   54％  对健康对照血清  的测定敏感性  (n＝20)   0％   5％   5％  不检测TB+血清的  测定特异性  (n＝20)   100％   95％   95％
这些数据表明全长BSX蛋白，例如重组蛋白质，可与包含本发 明鉴别的显性B细胞表位的合成肽例如肽24(SEQ ID NO：25)或 BSX(23-24)肽(SEQ ID NO：45)组合使用，以诊断结核分支杆菌的活 动性感染或近期继往感染的存在。
例如，重组全长BSX(SEQ ID NO：1)和BSX(23-24)肽均是生物素 酰化的且固定在已经预先附着在微滴定平板的孔上的链霉抗生物素 基底(5μg/ml)上。进行标准ELISA反应，其中(i)将在缓冲液中1/100 (v/v)稀释的患者血清和对照血清加入单独的孔中，(ii)固定化蛋白质 和肽对血清中人IgG的捕获使用经四甲基联苯胺(TMB)底物检测的 酶联绵羊抗HuIgG追踪。
                                 序列表
<110>蛋白质组系统知识产权有限公司
<120>结核分支杆菌感染的诊断和治疗方法及所用试剂
<130>124450/MRO
<150>US 60/603243
<151>2004-08-19
<160>55
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>140
<212>PRT
<213>M.tuberculosis Bsx protein
<400>1
Met Ser Ser Glu Glu Lys Leu Ala Ala Lys Val Ser Thr Lys Ala Ser
1               5                   10                  15
Asp Val Ala Ser Asp Ile Gly Ser Phe Ile Arg Ser Gln Arg Glu Thr
            20                  25                  30
Ala His Val Ser Met Arg Gln Leu Ala Glu Arg Ser Gly Val Ser Asn
        35                  40                  45
Pro Tyr Leu Ser Gln Val Glu Arg Gly Leu Arg Lys Pro Ser Ala Asp
    50                  55                  60
Val Leu Ser Gln Ile Ala Lys Ala Leu Arg Val Ser Ala Glu Val Leu
65                  70                  75                  80
Tyr Val Arg Ala Gly Ile Leu Glu Pro Ser Glu Thr Ser Gln Val Arg
                85                  90                  95
Asp Ala Ile Ile Thr Asp Thr Ala Ile Thr Glu Arg Gln Lys Gln Ile
            100                 105                 110
Leu Leu Asp Ile Tyr Ala Ser Phe Thr His Gln Asn Glu Ala Thr Arg
        115                 120                 125
Glu Glu Cys Pro Ser Asp Pro Thr Pro Thr Asp Asp
    130                 135                 140
<210>2
<211>15
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<400>2
Met Ser Ser Glu Glu Lys Leu Ala Ala Lys Val Ser Thr Lys Ala
1               5                   10                  15
<210>3
<211>15
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<400>3
Glu Glu Lys Leu Ala Ala Lys Val Ser Thr Lys Ala Ser Asp Val
1               5                   10                  15
<210>4
<211>15
<212>PRT
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<220>
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<400>4
Leu Ala Ala Lys Val Ser Thr Lys Ala Ser Asp Val Ala Ser Asp
1               5                   10                  15
<210>5
<211>15
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<400>5
Lys Val Ser Thr Lys Ala Ser Asp Val Ala Ser Asp Ile Gly Ser
1               5                   10                  15
<210>6
<211>15
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Thr Lys Ala Ser Asp Val Ala Ser Asp Ile Gly Ser Phe Ile Ara
1               5                   10                  15
<210>7
<211>15
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Ser Asp Val Ala Ser Asp Ile Gly Ser Phe Ile Arg Ser Gln Arg
1               5                   10                  15
<210>8
<211>15
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<400>8
Ala Ser Asp Ile Gly Ser Phe Ile Arg Ser Gln Arg Glu Thr Ala
1               5                   10                  15
<210>9
<211>15
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Ile Gly Ser Phe Ile Arg Ser Gln Arg Glu Thr Ala His Val Ser
1               5                   10                  15
<210>10
<211>15
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Phe Ile Arg Ser Gln Arg Glu Thr Ala His Val Ser Met Arg Gln
1               5                   10                  15
<210>11
<211>15
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Ser Gln Arg Glu Thr Ala His Val Ser Met Arg Gln Leu Ala Glu
1               5                   10                  15
<210>12
<211>15
<212>PRT
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<400>12
Glu Thr Ala His Val Ser Met Arg Gln Leu Ala Glu Arg Ser Gly
1               5                   10                  15
<210>13
<211>15
<212>PRT
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<400>13
His Val Ser Met Arg Gln Leu Ala Glu Arg Ser Gly Val Ser Asn
1               5                   10                  15
<210>14
<211>15
<212>PRT
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<400>14
Met Arg Gln Leu Ala Glu Arg Ser Gly Val Ser Asn Pro Tyr Leu
1               5                   10                  15
<210>15
<211>15
<212>PRT
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Leu Ala Glu Arg Ser Gly Val Ser Asn Pro Tyr Leu Ser Gln Val
1               5                   10                  15
<210>16
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
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<400>16
Arg Ser Gly Val Ser Asn Pro Tyr Leu Ser Gln Val Glu Arg Gly
1               5                   10                  15
<210>17
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
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<400>17
Val Ser Asn Pro Tyr Leu Ser Gln Val Glu Arg Gly Leu Arg Lys
1               5                   10                  15
<210>18
<211>15
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<400>18
Pro Tyr Leu Ser Gln Val Glu Arg Gly Leu Arg Lys Pro Ser Ala
1               5                   10                  15
<210>19
<211>15
<212>PRT
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<400>19
Ser Gln Val Glu Arg Gly Leu Arg Lys Pro Ser Ala Asp Val Leu
1               5                   10                  15
<210>20
<211>15
<212>PRT
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<400>20
Glu Arg Gly Leu Arg Lys Pro Ser Ala Asp Val Leu Ser Gln Ile
1               5                   10                  15
<210>21
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
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<400>21
Leu Arg Lys Pro Ser Ala Asp Val Leu Ser Gln Ile Ala Lys Ala
1               5                   10                  15
<210>22
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>22
Pro Ser Ala Asp Val Leu Ser Gln Ile Ala Lys Ala Leu Arg Val
1               5                   10                  15
<210>23
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>23
Asp Val Leu Ser Gln Ile Ala Lys Ala Leu Arg Val Ser Ala Glu
1               5                   10                  15
<210>24
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>24
Ser Gln Ile Ala Lys Ala Leu Arg Val Ser Ala Glu Val Leu Tyr
1               5                   10                  15
<210>25
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>25
Ala Lys Ala Leu Arg Val Ser Ala Glu Val Leu Tyr Val Arg Ala
1               5                   10                  15
<210>26
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>26
Leu Arg Val Ser Ala Glu Val Leu Tyr Val Arg Ala Gly Ile Leu
1               5                   10                  15
<210>27
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>27
Ser Ala Glu Val Leu Tyr Val Arg Ala Gly Ile Leu Glu Pro Ser
1               5                   10                  15
<210>28
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>28
Val Leu Tyr Val Arg Ala Gly Ile Leu Glu Pro Ser Glu Thr Ser
1               5                   10                  15
<210>29
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>29
Val Arg Ala Gly Ile Leu Glu Pro Ser Glu Thr Ser Gln Val Arg
1               5                   10                  15
<210>30
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>30
Gly Ile Leu Glu Pro Ser Glu Thr Ser Gln Val Arg Asp Ala Ile
1               5                   10                  15
<210>31
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>31
Glu Pro Ser Glu Thr Ser Gln Val Arg Asp Ala Ile Ile Thr Asp
1               5                   10                  15
<210>32
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>32
Glu Thr Ser Gln Val Arg Asp Ala Ile Ile Thr Asp Thr Ala Ile
1               5                   10                  15
<210>33
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>33
Gln Val Arg Asp Ala Ile Ile Thr Asp Thr Ala Ile Thr Glu Arg
1               5                   10                  15
<210>34
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>34
Asp Ala Ile Ile Thr Asp Thr Ala Ile Thr Glu Arg Gln Lys Gln
1               5                   10                  15
<210>35
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>35
Ile Thr Asp Thr Ala Ile Thr Glu Arg Gln Lys Gln Ile Leu Leu
1               5                   10                  15
<210>36
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>36
Thr Ala Ile Thr Glu Arg Gln Lys Gln Ile Leu Leu Asp Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>37
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>37
Thr Glu Arg Gln Lys Gln Ile Leu Leu Asp Ile Tyr Ala Ser Phe
1               5                   10                  15
<210>38
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>38
Gln Lys Gln Ile Leu Leu Asp Ile Tyr Ala Ser Phe Thr His Gln
1               5                   10                  15
<210>39
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>39
Ile Leu Leu Asp Ile Tyr Ala Ser Phe Thr His Gln Asn Glu Ala
1               5                   10                  15
<210>40
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>40
Asp Ile Tyr Ala Ser Phe Thr His Gln Asn Glu Ala Thr Arg Glu
1               5                   10                  15
<210>41
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>41
Ala Ser Phe Thr His Gln Asn Glu Ala Thr Arg Glu Glu Cys Pro
1               5                   10                  15
<210>42
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>42
Thr His Gln Asn Glu Ala Thr Arg Glu Glu Cys Pro Ser Asp Pro
1               5                   10                  15
<210>43
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>43
Asn Glu Ala Thr Arg Glu Glu Cys Pro Ser Asp Pro Thr Pro Thr
1               5                   10                  15
<210>44
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence
<400>44
Ala Thr Arg Glu Glu Cys Pro Ser Asp Pro Thr Pro Thr Asp Asp
1               5                   10                  15
<210>45
<211>19
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence coupled to c
     ysteine
<400>45
Ser Gln Ile Ala Lys Ala Leu Arg Val Ser Ala Glu Val Leu Tyr Val
1               5                   10                  15
Arg Ala Cys
<210>46
<211>15
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic fusion peptide comprising N-terminal and C-terminal por
     tions of SEQ ID NO：1 coupled by internal cysteine residue
<400>46
Met Ser Ser Glu Glu Lys Leu Cys Asp Pro Thr Pro Thr Asp Asp
1               5                   10                  15
<210>47
<211>16
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>synthetic peptide derived from SEQ ID NO：1 sequence coupled to c
     ysteine residue
<400>47
Val Arg Ala Gly Ile Leu Glu Pro Ser Glu Thr Ser Gln Val Arg Cys
1               5                   10                  15
<210>48
<211>6
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>sequence of MALDI-TOF peptide fragment present in TB+/HIV+ sample
     also present in SEQ ID NO：1
<400>48
Met Ser Ser Glu Glu Lys
1               5
<210>49
<211>8
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>sequence of MALDI-TOF peptide fragment present in TB+/HIV+ sample
     also present in SEQ ID NO：1
<400>49
Glu Thr Ala His Val Ser Met Arg
1               5
<210>50
<211>13
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>sequence of MALDI-TOF peptide fragment present in TB+/HIV+ sample
     also present in SEQ ID NO：1
<400>50
Ala Ser Asp Val Ala Ser Asp Ile Gly Ser Phe Ile Arg
1               5                   10
<210>51
<211>13
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>sequence of MALDI-TOF peptide fragment present in TB+/HIV+ sample
     also present in SEQ ID NO：1
<400>51
Ser Gly Val Ser Asn Pro Tyr Leu Ser Gln Val Glu Arg
1               5                   10
<210>52
<211>16
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>sequence of MALDI-TOF peptide fragment present in TB+/HIV+ sample
     also present in SEQ ID NO：1
<400>52
Ala Ser Asp Val Ala Ser Asp Ile Gly Ser Phe Ile Arg Ser Gln Arg
1               5                   10                  15
<210>53
<211>18
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>sequence of MALDI-TOF peptide fragment present in TB+/HIV+ sample
     also present in SEQ ID NO：1
<400>53
Gln Leu Ala Glu Arg Ser Gly Val Ser Asn Pro Tyr Leu Ser Gln Val
1               5                   10                  15
Glu Arg
<210>54
<211>26
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>immuogenic peptide derived from M.tuberculosis glutamine synthet
     ase
<400>54
Arg Gly Thr Asp Gly Ser Ala Val Phe Ala Asp Ser Asn Gly Pro His
1               5                   10                  15
Gly Met Ser Ser Met Phe Arg Ser Phe Cys
            20                  25
<210>55
<211>21
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>immuogenic peptide derived from M.tuberculosis glutamine synthet
     ase
<400>55
Trp Ala Ser Gly Tyr Arg Gly Leu Thr Pro Ala Ser Asp Tyr Asn Ile
1               5                   10                  15
Asp Tyr Ala Ile Cys
            20