系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一累 及全身多个系统的自身免疫性疾病，自从糖皮质激素与免疫抑制剂被用 于治疗SLE后，患者的预后虽已经有明显改善，但总的来说该病治疗现 状仍不容过分乐观，仍有约15％的患者在发病5年内死亡或出现肾功能 衰竭，同时复发也是治疗过程中面临着的一个严峻问题。SLE是自身免 疫性疾病的原型，临床上可累及多种脏器或系统。SLE组织损伤主要是 由于免疫复合物沉积于相应的组织而引起。临床疾病谱很广，具有缓解 和恶化交替发生的特征。为了更好的治疗和控制SLE，有必要及时而有 效的判断SLE的疾病活动性和损伤情况。
需要寻找一种能反应疾病当时的活动情况的生物标志物，这种标志 物还应该具有疾病特异性，对治疗后的变化敏感，能预测疾病的转归。 单一的标志物可能不能满足所有这些要求，因此需要联合使用不同标志 物用于监测疾病发生过程中的不同分子事件。人类血清中存在数千种多 肽，它们当中的绝大多数被认为是由内源性蛋白降解酶部分分解较大分 子量蛋白质所得的片段，这些多肽确切的性质还没有被解析。但是，研 究表明这些多肽所组成的复杂的集合(肽组学)能够作为一种新颖和成 熟的预测方法来判断整个机体的生物学事件。
一旦红斑狼疮临床症状出现后，对SLE做出迅速诊断和适当治疗仍 然是内科医生的巨大挑战。因此，需要寻找新的具有更高敏感性和特异 性的狼疮诊断标志物。

本发明的目的在于提供一种用于系统性红斑狼疮诊断的蛋白质指 纹图谱模型，其可以高灵敏度、特意性检测出系统性红斑狼疮。
本发明采用一种新的技术平台(Clinprot)，该平台使用了以反向磁 珠为基础的样品处理和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS)分析。首先根据SLEDAI-2000评分标准把系统性红斑 狼疮(SLE)病人分为活动期和稳定期两组，并选取类风湿性关节炎(RA) 疾病对照组和健康对照组，收集血液、准备血清，以反向磁珠为基础进 行样品处理，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析仪进行 MALDI-TOF MS检测，得到数据后用Clinprotools Software2.1软件进 行分析，建立四组样本的血清蛋白指纹图谱，分析并筛选到差异性多肽， 利用差异性多肽建立并验证疾病相关的高敏感性和高特异性的蛋白质 指纹图谱模型。根据各蛋白质的质荷比m/z及其蛋白质波峰强度系数 Arb.U建立了系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎及正常人间鉴别的蛋白 质指纹图谱模型，所说的特异蛋白质质荷比m/z和波峰强度系数Arb.U 分别为m/z＝3192.34，Arb.U≤8.47；m/z＝9289.29，Arb.U≤15.56；m/z ＝4267.96，Arb.U≤1.91；m/z＝2952.17，Arb.U≤13.47；m/z＝2660.7， Arb.U≥33.04；m/z＝3263.03，Arb.U≤15.52；m/z＝1778.75，Arb.U ≥1.93；m/z＝5904.74，Arb.U≤66.26；其中系统性红斑狼疮患者与正常 人鉴别的蛋白质指纹图谱模型由m/z＝3192.34，Arb.U≤8.47；m/z＝ 9289.29，Arb.U≤15.56；m/z＝4267.96，Arb.U≤1.91；m/z＝2952.17， Arb.U≤13.47绘制而成；类风湿性关节炎患者与正常人鉴别的蛋白质指 纹图谱模型由m/z＝2660.7，Arb.U≥33.04；m/z＝3263.03，Arb.U≤ 15.52；m/z＝1778.75，Arb.U≥1.93；m/z＝5904.74，Arb.U≤66.26绘 制而成。
所述软件为Clinprotools Software2.1。
其鉴别系统性红斑狼疮与正常人的识别率为92.36％，预测能力为 90.27％；其鉴别类风湿性关节炎与正常人的识别率为100％，预测能力为 87.88％。
利用该蛋白质指纹图谱模型，可用于系统性红斑狼疮诊断，对于系 统性红斑狼疮的临床诊断及病情了解具有重要的意义，并为从蛋白质组 学的角度探讨SLE的发病机制及早期诊断提供新思路和新依据。
本发明采用的Clinprot技术平台使用了以反向磁珠为基础的样品处 理和MALDI-TOF MS分析，磁珠捕获待分析物比芯片表面捕获更灵敏， 因为球形微粒具有更大的结合表面，因此比小直径的芯片的结合容积更 大。它能够同时检测血清中的大量多肽。这种技术平台具有高敏感性和 分辨率，它能够在一滴血清中检测到分子量范围为800-15000Da的超 过400多种多肽，用此方法建立的用于系统性红斑狼疮诊断的蛋白质指 纹图谱模型具有高灵敏性和特意性。自动化液体处理机械臂的应用保证 了这种技术的高通量和重复性。
附图说明
图1是本发明技术路线图。

1材料
1.1主要仪器
“红盖”真空采血管                              广州阳普医疗用品 有限公司
Z4M条码打印机                                   Zebra技术公司
Genesis Freedom 100液体机械臂                   Tecan公司
自动化用枪头                                    Tecan公司
长磁体(2.75×0.25×0.125英寸)                   K&D磁性材料公司
圆盘磁体(直径0.25英寸，厚度0.25英寸)            Forcefield公司
定制分装管架
定制侧向磁架
定制底部磁架
模板III PCR非裙边板                             USA科学公司
模板III PCR半裙边板                     USA科学公司
振荡器                                  Barnstead/Thermolyne公司
PCR冷却器起始装置                       USA科学公司
Autoflex MALDI-TOF质谱仪                Bruker公司
Bruker 384-点MALDI靶板                  Bruker公司
Gemini软件                              Tecan公司
FlexControl软件                         Bruker公司
FlexAnalysis软件                        Bruker公司
1.2主要试剂
a-氰-4-羟基苯丙烯酸                     Agilent公司
多肽内标及蛋白内标                      Bruker公司
人工合成多肽3897                        Sigma公司
细胞色素C                               Sigma公司
Dynabeads WCX                           Dynal公司
乙氰                                    Burdick&Jachkson公司
三氟乙酸(TFA)                           Piere公司
人血清                                  Sigma公司
Milli-Q水系统                           USFilter公司
10×PBS                                 Bio-Rad公司
异丙醇                                  J.T.Baker公司
1.3样本
系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)患者50 例，均为女性，年龄14～54岁(中位年龄35岁)，均符合美国风湿病协 会(ARA)1982年修订的诊断标准。根据SLEDAI-2000评分标准把SLE病 人分为活动期(SLEDAI＞8)和稳定期(SLEDAI≤8)两组，所有病例均 在增加糖皮质激素用量或加用环磷酰胺之前取血。另外，选择25例类 风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)患者，均符合美国风湿病 协会1987年修订的诊断标准，选择性别和年龄相配的健康志愿者24名 作为对照组。
2操作步骤
2.1收集血液和准备血清
收集静脉血到真空采血管。
缓慢颠倒采血管5次，使促凝剂与血液充分混合，室温条件下垂直 放置采血管1小时使血液凝固。
冰上放置采血管，2小时内进行下一步。
室温条件下，2000g，离心10分钟。
EP管贴上与样品对应的标签。
用移液器将上层血清转移到已贴好标签的EP管，每管1ml，这种装 好血清的EP管就是“血清样品来源管”。
立即将所有血清样品保存在-80℃，避免反复冻融。血清样品需放 置干冰上运输到质谱分析实验室。
2.2为血清样品来源管编码
将所有样品信息输入到实验室信息管理系统。每次提交样品信息 时，原始样品管的条形码标签将自动生成。将样品与标签一样排序以使 后续处理更容易。在给样品管贴标签的同时生成并确认样品管清单。
在给样品管贴标签时需将样品管放置于干冰上，贴标签前需将样品 管用纸巾擦干以保证贴紧。
用盒子装好已经贴好标签的样品管，在盒子外标记好课题名称、日 期及“待分装样品管”字样，然后放置于-80℃冰箱。
2.3分装样品
将装有待分装样品管的盒子拿出冰箱，放置样品管于干冰上。
扫描第一个待分装样品管上的条形码。如果数据库能正确识别样 品，那么一个“样本身份”将会生成。选择样品管中的血清体积及每管 待分装的体积，计算出分装管数，打印所有分装管的新标签。
将分装条形码标签贴到干净的0.5mlEP管上，按照原始样品管的次 序排列分装管。将这些分装管直接放到Tecan液体操作器的分装架上， 排成16列，每列9管。
在所有的分装管贴好标签并排列和确认好后，将样品管放置于湿冰 上，按照它们将被分装的顺序放置在大冰盒上融解60min。
将铝制的分装架放置在自动化机器载体上，样品管按照分装管的次 序也置于架上。分装过程开始前应把样品管架放置于湿冰上。
打开桌面电脑上的Gemini程序，运行Gemini分装程序自动进行分 装过程。
盖上分装管，将它们放置到干冰上，每个样本仅取一分装管做下一 步分析，其余的放置在-80℃冰箱。
将待分析分装管单独放置在一个盒子里并贴好标签。
2.4血清样品随机化排序
扫描待分析分装管的条形码，建立一个清单，以普通文本文档格式 保存这个清单。分装管应一直放置于干冰上。
运行随机化软件，输入待分析样品的数目，每个MALDI靶一次最多 能分析96份分装血清，如果添加了更多份的血清，程序将生成两个或 者更多的MALDI靶板排序。
按下“开始”按钮，程序会要求选择文件(刚刚建立的那个普通文 本文档)，一旦你选择这个文件后，样品在MALDI靶上的随机分布位置 即会显示出来，另外，还有内标的位置也会显示出来。随机化软件生成 的排序并不代表96孔板中血清样品在做磁珠分选前的位置。
随后，程序会询问保存输出文件(自动实施文件)的目录，输出文 件包含有使FlexControl程序运行自动质谱分析的指令。
需要打印这些靶图，因为它们将在已分装血清的随机化排序中需 要。
按照靶图中显示的次序，将已分装血清放置在已经预冷的96孔板。 时刻要核对样品清单和靶图以确认清单中的样品、靶图中的信息和分装 管的标示是一致的。分装管应一直放置于干冰上。
将输出文件传输到MALDI-TOF电脑中。
2.5建立自动化处理程序
首先，需要确认以下几项：所有待测样品都已经随机化的放置于96 孔板，检查2次以确认每个样品都在正确位置，然后将它们放到-80℃ 冰箱；所有所需的试剂和材料都已经准备就绪。
自动化处理程序的建立选择在早上进行，清洗Tecan液体机械臂， 给机器要使用的水抽气，保证垃圾容器有足够大的空间来接受分析过程 中产生的丢弃物，确认自动吸头是干净的。刷新系统两次。
进行质控试验(具体详见下文)。
开始解冻样品，置于湿冰上60min，保证样品在塑料架中的摆放次 序。
320μl的磁珠用200μl去离子水各洗涤两次，然后用320μl去离 子水重悬，以清除磁珠储存液中的乙醇。
在振荡器中轻柔的混匀磁珠约5min直到磁珠彻底分散，将磁珠吸 到0.2ml薄壁八孔条，每孔40μl，然后放到机器台面的适当位置。
将新鲜配制的0.1％的TFA加入到TFA槽。
开始准备内标，详见表1，内标必须当天配制。
准备一个96孔半边裙板，第一列每孔加入75μl 50％的乙氰，第二 列每孔加入95μl的基质溶液。第三列A排孔加入65μl“master mix” 内标，第三列B排孔加入70μl基质溶液。
将上面准备96孔半边裙板放置到冷却架并系好，冷却架需在-20℃ 预冷几个小时才能使用。
将MALDI靶放到预定位置。
表1内标

a All the m/z are calculated for single-charged ions except when otherwise it is indicated.
b double-charqed ion.
2.6头半部分样品处理
将每一样品50μl加入到一个无裙边96孔板的左侧48孔的适当位 置，检查样品相应的随机化位置以确认。将该96孔板放置到机器台面 的相应位置。
刷新系统一次，再一次检查是否已经准备就绪。
运行Tecan程序以执行以下操作：
用枪反复吹打10次混匀八孔条内的磁珠。
每个自动枪头吸取40μl八孔条内的磁珠。
丢弃5μl以避免在磁珠与血清混合时，枪头中含有气泡。
在含有样品的48孔中，每孔加入5μl磁珠。
缓慢吹打5次以混合磁珠和血清。
将96孔板转移到侧向磁架以便将磁珠吸附到侧壁。
吸走并丢弃上清。
每样品孔中加入200μl 0.1％的TFA溶液。
前后移动96孔板，洗涤磁珠。
吸走并丢弃洗液。
重复洗涤一次。
第二次洗涤后，缓慢吸取并丢弃80μl洗液。
将板转移到原先位置。
用枪上下吹打5次，将磁珠重悬在剩余的洗液中。
将96孔板转移到底部磁架上，等待160s，使磁珠被吸附到管底。
非常小心地吸走并丢弃剩余的洗液。
每样品孔中加入6μl 50％的乙氰。
快速上下吹打10次以重悬磁珠。
将板转移到侧向磁架。
转移每样品孔中5μl洗脱液到96孔板右侧的48个孔中。
在右侧的48个孔中加入10μl预制好的基质溶液。
吹打混合基质与洗脱液。
吸取1μl混合液并将其点到MALDI靶上。
将在冷却架上放置的微孔板中的内标液和基质液1∶1混合，上下吹 打5次。
吸取90μl混合物，在另一非裙边96孔板的A列的每孔中加入10 μl。
吸取8μl，在每个MALDI靶的内标点加1μl。每个内标点上的混 合物虽然是相同的，但是它们在靶上的位置不同。
2.7后半部分样品处理
准备下一批分析的48份血清。开始解冻样品，置于湿冰上60min， 保证样品在塑料架中的摆放次序。
将血清加入一个新的无裙边96孔板，置于湿冰上。
从侧向磁架上移去及丢弃第一批分析结束后带有血清和磁珠的微 孔板。余下步骤与第一批样品分析的过程相同。
打开Gemini程序，选择384点MALDI靶的第二半部分的点样次序。 检查错误后，刷新系统两次，运行程序，程序将会执行完全相同的步骤， 唯一不同的是洗脱物和基质的混合物这次被点在384点MALDI靶的第二 半部分。
移去MALDI靶板，将其转移到MALDI-TOF质谱分析仪，靶板必须在 3-4小时内读出结果。
2.8质谱分析和图谱输出
将待分析的靶板插入到MALDI-TOF质谱分析仪。
打开正确的自动执行文件，开始自动运行以下步骤(“自动执行方 法”必须更新才能使用合适的激光能源)：
转移到MALDI板的第一个靶点。
开始收集0.7-4kDa m/z范围内片段的肽谱：平均发射400次激光， 分四组对准基质点表面四个不同的位置，每组发射100次，频率为50Hz。 图谱在线性模式几何学的状态下获得，20kv下离子加速(延时引出电压 为18.6kv)，倍增管电压为-1.3kv，设置离子栅为m/s＝400。延时引 出时间保持在80ns，这样在每次发射激光后有适当的时间延迟能量聚 焦。传送到靶上的有效激光能量控制在每次发射16μJ(±10％)(下同)。 整个照射程序由仪器的“自动运行”功能按照以下步骤自动控制：在优 化的仪器设置下采用正确的图谱采集方法，找到MALDI板上的正确靶点， 输送4组(每组100次)激光发射(从一组螺旋运动到下一组)。
移动到下一靶点，采集0.7-4kDa m/z范围内的肽谱。然后继续采 集所有(包括样品和内标)此质量范围内的图谱。
再次转移到MALDI板的第一个靶点。开始收集4-15kDa m/z范围 内片段的第一个肽谱：平均发射500次激光，分五组对准基质点表面五 个不同的位置，每组发射100次，频率为50Hz。图谱在线性模式几何学 的状态下获得，20kv下离子加速(延时引出电压为18.6kv)，倍增管 电压为-1.3kv，设置离子栅为m/s＝3000。延时引出时间保持在50ns， 这样在每次发射激光后有适当的时间延迟能量聚焦。在第二个质量范围 (4-15kDa)的最初100次激光发射会被传送到与第一个质量范围(4-15 kDa)的最初100次激光发射相同的区域，因为对于每一个MALDI靶点 来说，自动运行功能会记住一个初始位置。因此，在第二个质量范围 (4-15kDa)需要额外的100次激光发射，原因是初始位置不存在晶体。
移动到下一靶点，采集4-15kDa m/z范围内的肽谱。然后继续采 集所有(包括样品和内标)此质量范围内的图谱。
分析结束后打开FlexAnalysis程序，使用“打开多个图谱”功能 打开刚刚已经被建立的所有质谱图，检查是否所有的质谱已经生成。
通过FlexAnalysis的“处理”功能进行图谱分析。另外，也可将 图谱转换成标签分隔的文本文档，这样，每个图谱含有x和y两个变量。
2.9质量控制
每周进行一次质量控制试验以评估Tecan液体机械臂和AutoFlex MALDI-TOF质谱仪的重复性。使用市场购买的人类血清，每次质量控制 分析用2管即可，保证96孔板中的10个孔有足够的样品，其余的孔用 PBS充填。血清样品在微孔板上的分布要均匀和分散。质控分析步骤如 下：
在湿冰上解冻血清1小时。
同时，准备Tecan自动化仪器及试验所用试剂。
运行Gemini程序(与临床样本测试相同)。
移去靶板，转移到MALDI-TOF质谱仪。
插入待分析的靶板，选择方法文件“serum_1-4kda.par”。
检查并记录MS激光的状态，打开“状态标签”，点击“详细”，检 查激光的状态并调整激光能量到16μJ。
打开质量控制自动实施模板，编辑此文件，改变日期及保存图谱的 目标文件夹。编辑后，保存在质量控制自动实施文件目录。
在FlexControl程序中打开编辑后的自动实施文件并运行它。
运行完毕后打开FlexAnalysis程序，使用“打开多个图谱”功能打 开刚刚已经被建立的所有质控质谱图。
叠放这10张质谱图，另外，分别放大942.43，1，211.70，1，449.76 和1，864.95这四个肽峰区域，分别测量10副图谱中的这四个峰的强度。 每一个峰的平均强度的变异应该不大于20-30％。
2.10统计分析
数据分析工作使用Clinprotools Software2.1。Clinprotools中 的统计学检验方法(参数T-Test和非参数方法Wilcoxon Test)寻找差异 蛋白，分析有差异趋势的多肽，并利用软件中的遗传算法结合 KNN(k-nearest neighboure，k＝1，3，5，7)建立分类预测模型。首先使用 遗传算法，设变异率为0.2，交叉率为0.5，初始染色体个数为1000， 适应度函数用KNN判定结果的准确率，最终经过10000次进化，遍历k， 最终在差异蛋白中，选用其中差异性多肽，建立模型。计算模型的特异 性、敏感性及平均准确率。用随机抽样方法(随机选择80％样本建立模 型，其余的20％作为验证样本，运行十次)，验证模型的有效性。
实施例1鉴别系统性红斑狼疮患者和健康人
收集静脉血液和准备血清，按照上述步骤得到其血清蛋白质指纹图 谱，系统性红斑狼疮患者与正常人鉴别的蛋白质指纹图谱模型，若受检 者m/z＝3192.34，Arb.U≤8.47；且m/z＝9289.29，Arb.U≤15.56；且 m/z＝4267.96，Arb.U≤1.91；且m/z＝2952.17，Arb.U≤13.47，诊断 为系统性红斑狼疮患者。
实施例2鉴别类风湿性关节炎患者和健康人
收集静脉血液和准备血清，按照上述步骤得到其血清蛋白质指纹图 谱，类风湿性关节炎患者与正常人鉴别的蛋白质指纹图谱，若受检者m/z ＝2660.7，Arb.U≥33.04；且m/z＝3263.03，Arb.U≤15.52；且m/z ＝1778.75，Arb.U≥1.93；且m/z＝5904.74，Arb.U≤66.26，诊断为类 风湿性关节炎患者。