欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法
专利汇可以提供欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种欧、美型猪繁殖与综合症病毒 抗体 鉴别 诊断 试剂 盒 的制备方法，该方法是针对PRRSV VR-2332株的ORF7基因中欧、美型毒株的保守表位25aa～30aa，37aa～52aa及50aa～66aa的基因缺失，构建针对美洲型PRRSV N蛋白的原核表达载体pGEX-6P-1-N；针对欧洲型PRRSV N蛋白表位2aa～12aa、40aa～46aa及67aa～128aa的 氨 基酸序列，建立针对欧洲型PRRSVN蛋白的原核重组表达载体PQE30-N，重组质粒在大肠杆菌中成功表达，利用表达纯化的北美洲型N蛋白，制备用于PRRS抗体检测的间接ELISA诊断试剂盒，该抗体试剂盒与IDEXX试剂盒的符合率均可达到90％，以纯化的欧洲型蛋白作为包被 抗原 ，优化了欧洲型PRRSV抗体检测间接ELISA方法，为PRRS抗体分型检测打下 基础 。，下面是欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法专利的具体信息内容。
1.欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
1)目的蛋白的表达及纯化：
针对PRRSV VR-2332的ORF7基因中欧、美型毒株的保守表位25aa～30aa，37aa～52aa及50aa～66aa的基因缺失，构建针对美洲型PRRSV N蛋白的原核表达载体pGEX-6P-1-N；
设计并合成针对欧洲型PRRSV N蛋白表位2aa～12aa、40aa～46aa及67aa～128aa的核酸序列，建立了针对欧洲型PRRSV N蛋白的原核重组表达载体PQE30-N，利用表达纯化的蛋白为抗原，建立欧洲型PRRS抗体试剂盒和美洲型PRRS抗体试剂盒；
复性后的重组蛋白GST-N，经还原型谷胱甘肽洗脱，得到目的蛋白，亲和层析纯化后目的蛋白纯度达到90％以上，重组融合蛋白HIS-N经镍亲和层析柱纯化后，存在极少量的杂蛋白，其纯度可达95％以上，纯化效果达到预期目的；
1.1重组蛋白的Western-Blot分析
分别用猪PRRSV美洲型与欧洲型阳性血清对纯化后基因工程重组菌表所表达的蛋白进行Western-Blot分析，结果显示GST-N在大约32.1KDa处出现一条清晰的棕褐色印迹，HIS-N在大约10.5KDa处也有一条清晰印迹，表明重组蛋白均可被PRRSV阳性血清所识别，且具有良好反应原性；
将电泳后的SDS-PAGE凝胶进行薄层扫描，结果显示pGEX-6P-1-N表达的重组融合蛋白量占菌体总蛋白的47.8％，PQE30-N表达的重组融合蛋白量占菌体总蛋白的46.5％；
2)重组蛋白抗原最适包被浓度和待检血清稀释浓度的确定
用包被液将提纯得到的重组蛋白抗原GST-N分别作18μg/ml、9μg/ml、4.5μg/ml、
2.25μg/ml、1.125μg/ml、0.56μg/m、0.30μg/ml、0.15μg/ml8个倍比稀释度，包被酶标反应板，4℃过夜，用包被液将提纯得到的重组蛋白抗原HIS-N分别作32μg/ml、16μg/ml、
8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/m、0.5μg/ml、0.25μg/ml8个倍比稀释度，包被酶标反应板，4℃过夜，用血清稀释液将PRRS阳性血清及阴性血清分别进行1∶20、1∶40、1∶80、
1∶160倍比稀释，两种抗原各自组成方阵，将包被好的酶标板倾去孔内液体，进行洗涤，各孔加满PBS-T洗涤液，约300μl，在室温下放置4分钟，倒掉，如此重复4次，在吸水纸上拍干，加入5％BSA封闭液，200μl/空，放入温箱内37℃封闭，封闭后，与前面一样进行洗涤，洗涤后，分别加入倍比稀释好的PCV2阳性血清和阴性血清，每个抗原稀释度加1孔阳性血清和1孔阴性血清，100μl/孔，37℃反应30分钟，洗涤后，按照方阵每孔加入1∶1000稀释好的HRP-兔抗猪IgG100μl，37℃反应30分钟，洗涤后，加入底物100μl/孔，室温显色
10分钟，加2mol/L H2SO450μl终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD450值，比较阴阳性血清的OD450值，选择阳性血清的OD450值为1左右和阴性血清OD450值低的抗原浓度和血清工作浓度，从而确定抗原最适包被浓度和血清的稀释度；
3)重组抗原包被条件的确定
以最适抗原浓度包被酶标板，100μl/孔，分成4组，第一组：37℃包被2个小时加4℃过夜；第二组：37℃包被1个小时加4℃过夜；第三组：4℃过夜，包被后，将包被好的酶标板进行洗涤，37℃封闭30分钟，封闭后每孔加入最适的血清稀释度，在37℃反应30分钟，洗涤后每孔加入1∶1000稀释的HRP-兔抗猪IgG二抗，在37℃反应30分钟，洗涤后每孔加入底物溶液100μl/孔，室温显色10分钟，加2mol/L H2SO450μl终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD450值，比较阴阳性血清的OD450值和P/N值，以确定最佳的包被条件；
4)封闭液的确定
以最适的抗原浓度和最佳抗原包被条件包被酶标板，洗涤后，分成4组：第一组：用含
5％明胶的PBS-T封闭；第二组：用含5％的牛血清封闭；第三组：用1％的BSA封闭；第四组：用含5％的脱脂奶封闭，200μl/孔，37℃反应1小时，PCV2阴、阳性血清分别作最适稀释100μl/孔，重复2孔，37℃反应30分钟，洗涤后，加入1∶1000稀释的HRP-兔抗猪IgG二抗，100μl/孔，在37℃反应30分钟，洗涤后每孔加入新鲜配制的底物溶液100μl，室温显色10分钟，2mol/L H2SO450μl终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD450值，比较阴阳性血清的OD450值和P/N值，以确定合适的封闭液；
5)血清最佳作用时间的确定
以最适的抗原浓度和最佳抗原包被条件包被酶标板，洗涤后，分为4组，将PRRS阳性、阴性血清按最适稀释度稀释，37℃分别作用30分钟、60分钟、90分钟、120分钟，加入
1∶1000稀释的HRP-兔抗猪IgG二抗，100μl/孔，在37℃反应30分钟，洗涤后，每孔加入新鲜配制的底物溶液100μl，室温显色10分钟，2mol/L H2SO450μl终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD450值，比较阴阳性血清的OD450值和P/N值，以确定合适的作用时间；
6)酶标二抗稀释倍数和作用时间的确定
以最适的抗原浓度和最佳抗原包被条件包被酶标板，将PRRS阳性、阴性血清按最适稀释度稀释，37℃作用最佳时间，二抗按1∶1000与1∶2000稀释，每个稀释度作4个平行孔，作用20分钟、40分钟、60分钟和90分钟，洗涤后，每孔加入新鲜配制的底物溶液
100μl，室温显色10分钟，2mol/LH2SO450μl终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD450值，比较阴阳性血清的OD450值和P/N值，以确定合适的稀释倍数和作用时间；
7)间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
随机收集送检无PRRSV感染的猪血清30份，30份血清经猪瘟、猪伪狂犬
ELISA(GST-N-ELISA)试剂盒检测，PRV、CSF抗体均为阴性，经猪细小病毒胶乳凝集试验试剂盒检测，PPV抗体为阴性，用已建立的间接ELISA方法检测，作1∶40倍稀释，100μl/孔，每份血清重复2孔，按照已经确立的ELISA(GST-N-ELISA)程序进行ELISA测定，读出OD450值，计算出30份血清的OD450值的平均值和标准差SD，阴阳性临界值等于阴性血清OD450值的平均值X+3×标准差，从而算出阴阳性临界值，根据统计学原则，OD450值＞X+3SD时，可以在99.9％的水平上判定为阳性；
8)间接ELISA方法的特异性交叉试验
用纯化好的重组蛋白在最适包被条件下包被酶标反应板，洗涤封闭后，分别将猪瘟、猪伪狂犬病、猪日本乙型脑炎、猪细小病毒的阳性血清作1∶40稀释，同时作PRRS阳性和阴性血清对照，100μl/孔加入酶联反应板，37℃反应30分钟，洗涤后，加入1∶1000稀释的HRP-兔抗猪IgG二抗，100μl/孔，37℃反应30分钟，洗涤各孔加入新鲜配制的底物溶液
100μl，室温显色10分钟，2mol/L H2SO450μl终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD450值，进行结果判定；
9)间接ELISA方法的敏感性试验
取250份血清分别用本组建立的重组GST-N蛋白-ELISA(GST-N-ELISA)方法与武汉科前动物生物制品责任有限公司的ELISA检测试剂盒进行检测，比较两者的检测结果，阴性血清中的阴性检出率即为特异性，阳性血清中的检出率即为相对灵敏度，两种方法检测结果均为阳性或阴性的血清样本总数占总检血清样本的比例即为两者的符合率；
10)重复性试验
10.1批内重复
用同一批制备的重组GST-N蛋白包被板条，取已知的阴阳性血清各一份，另外取三份待检血清，在其它条件不变的情况下，应用本方法进行检测，每份样品重复四孔，根据OD值判定批内重复性；
10.2批间重复
取不同时间制备并纯化的重组GST-N蛋白，用包被稀释液稀释至最佳包被浓度，经包被、封闭后，对已知的阴阳性血清及另外三份待检血清进行检测，每份血清检测4孔，重复检测五次，根据OD值判定不同批次制备的抗原建立的ELISA的可重复性；
11)包被抗原保存期的确定
纯化蛋白以最佳工作浓度包被并经封闭后，用包装袋封好，置于4℃保存，以后每隔1月取出用已知阴阳性血清按所建立的方法进行检测，共检测6次；
当重组蛋白抗原GST-N的包被浓度为4.5μg/ml～9μg/ml，血清1∶40稀释时，阳性血清的OD450值在1.0左右，且阴性血清OD450值低，P/N值高(4.75)，据此确定抗原GST-N的包被浓度为4.5μg/ml，血清的稀释度为1∶40，重组蛋白抗原HIS-N的包被浓度为8μg/ml，血清1∶40稀释时，阳性血清的OD450值在1.0左右，且阴性血清OD450值低，P/N值高(4.76)，所以，确定抗原HIS-N的包被浓度为8μg/ml，血清的稀释度为1∶40，确定用1％的BSA作为封闭液，37℃1个小时加4℃过夜作为两种抗原的包被条件，酶标抗体使用浓度为1∶1000，结合时间30分钟作为二抗的最佳反应条件；
针对美洲型N蛋白ELISA，确定抗原GST-N的包被浓度为4.5μg/ml，血清的稀释度为
1∶40，样本阴阳性临界值为0.43，即当样本OD450≥0.43，判定为阳性；OD450值＜0.43的判定为阴性，针对欧洲型N蛋白ELISA，确定抗原HIS-N的包被浓度为8μg/ml，血清的稀释度为1∶40，样本阴阳性临界值为0.40，即当样本OD450≥0.40，判定为阳性；OD450值＜0.40的判定为阴性；
批内重复试验的变异系数均值C.V％为5.30％，批间重复试验的变异系数均值C.V％为6.67％，表明该包被板具有良好的重复性，ELISA试剂盒保存期在五个月以上。
2.根据权利要求1所述的欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包被的抗原对猪瘟、伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪细小病毒病阳性血清的OD450值均小于0.40，均为阴性，表明该重组蛋白抗原与猪瘟、伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪细小的阳性血清没有交叉反应，证明ELISA方法具有良好的特异性，适用于PRRS抗体的检测。
欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备
方法
1、技术领域
67aa～128aa的核酸序列，建立了针对欧洲型PRRSV N蛋白的原核重组表达载体PQE30-N，利用纯化试剂盒进行蛋白纯化。
1∶160倍比稀释，两种抗原各自组成方阵。将包被好的酶标板倾去孔内液体，进行洗涤，各孔加满PBS-T洗涤液(约300μl)，在室温下放置4分钟，倒掉，如此重复4次，在吸水纸上拍干，加入5％BSA封闭液，200μl/空，放入温箱内37℃封闭。封闭后，与前面一样进行洗涤(下同)，洗涤后，分别加入倍比稀释好的PCV2阳性血清和阴性血清，每个抗原稀释度加1孔阳性血清和1孔阴性血清，100μl/孔，37℃反应30分钟，洗涤后，按照方阵每孔加入稀释好的HRP-兔抗猪IgG(1∶1000)100μl，37℃反应30分钟，洗涤后，加入底物100μl/孔，室温显色10分钟，加2mol/L H2SO450μl终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD450值，比较阴阳性血清的OD450值，选择阳性血清的OD450值为1左右和阴性血清OD450值低的抗原浓度和血清工作浓度，从而确定抗原最适包被浓度和血清的稀释度。
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