（一）技术领域
[0001] 本
发明涉及一种用于检测J亚群禽白血病病毒的斑点杂交方法。（二）背景技术
[0002] J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒（ALV-J）引起的一种
肿瘤性
疾病。临床感染主要表现为髓细胞瘤、免疫耐受、高死亡率和生长迟缓。目前，以J亚群禽白血病为主的肿瘤性疾病在鸡群中蔓延，特别是血管瘤型J亚群禽白血病的爆发给我国养禽业带来巨大的经济损失。
[0003] 1、J亚群禽白血病在我国鸡群发病特点
[0004] （1）早期感染普遍、发病日龄明显提前。目前在青年鸡群或开产前的鸡群中J亚群白血病已成为常见病。
[0005] （2）感染率及发病率居高不下。近10年来，在肉种鸡、蛋种鸡中感染率均在10%左右。
[0006] （3）宿主范围扩展。J亚群禽白血病最初在肉鸡中发病，目前在蛋鸡群中高发，我国特有鸡种麻鸡、柴鸡及芦花鸡中也检出了ALV-J，J亚群白血病宿主范围正在明显扩大。
[0007] （4）致病性增强。蛋鸡及地方鸡中发现的肿瘤要比肉种鸡中的病变更为严重，在患病肉鸡病变器官从未见过的髓细胞瘤，却在蛋鸡中比较常见，如颈部髓细胞瘤、腰荐髓细胞瘤、肠髓细胞瘤等。
[0008] （5）肿瘤趋于多样化。目前，我国感染鸡群中出现了诸多以前罕见的肿瘤,如血管瘤、成红细胞瘤、
肝细胞癌、腺癌、
纤维瘤、纤维肉瘤、
皮肤癌和输卵管癌等。
[0009] 2、禽肿瘤性疾病混合感染加大了诊断难度
[0010] 目前以ALV-J为主的禽肿瘤性疾病在蛋鸡群中广泛流行，与
马立克氏病、网状内皮增生症等肿瘤性疾病混合感染频发，国内报道从感染ALV-J肿瘤中检测出马立克氏病病毒和网状内皮增生症病毒、从马立克
疫苗中发现禽白血病病毒的污染。近年来，国内外均在鸡群中发现ALV群内的混合感染，这大大增加了疾病的诊断难度，给养禽业带来巨大的经济损失。
[0011] 3、J亚群禽白血病的诊断方法研究现状
[0012] 目前对J亚群禽白血病的诊断，可通过临床剖检和
组织病理学检查初步诊断，进一步确诊需要通过间接免疫
荧光或ELISA、PCR方法实现。
[0013] 间接免疫荧光方法需要对病毒分离鉴定，利用特异性单克隆
抗体进行，具有周期长、成本高易于出现非特异性
抗原反应干扰等缺点；目前，我们使用的ELISA
试剂盒产于国外，需要同时检测抗原和抗体进行综合性诊断，而且检测成本高，价格昂贵，同时由于ALV－J gp85基因高度变动，使国外检测试剂盒对国内毒株的检测结果不确实；PCR技术容易受到很多因素干扰，并可能出现
假阳性和假阴性结果。
[0014] 鉴于以上诊断手段具有易受非特异性干扰、不能全面确诊的缺点，对于大规模爆发J亚群禽白血病的情况，我们急需一种快速准确而又经济实用的诊断方法。
[0015] 4、ALV－J env基因具有重要的
生物学功能
[0016] env基因是ALV-J病毒特异性生物学功能基因，包括gp85和gp37两个结构基因。gp85基因编码表面蛋白(SU)，gp37基因编码跨膜蛋白(TM)，是病毒表面两个重要的抗原。
env基因对于病毒分型及感染转录具有重要的生物学意义。
[0017] 基于此，通过比较国内外各J亚群禽白血病病毒代表毒株env基因同源性，从gp37基因设计出高度保守长度约248bp目的基因
片段，用以作为制备核酸探针的基序。
[0018] 迄今为止，我国报道的禽血病为A、B、J亚群，C、D亚群仅出现在国外，在我国未见报道。（三）发明内容
[0019] 本发明的目的是提供一种用于检测J亚群禽白血病病毒的斑点杂交方法，为J亚群禽白血病及其他禽肿瘤性疾病的
鉴别诊断提供一种新的精准有效检测手段，以降低养禽业因ALV-J感染而造成的经济损失。
[0020] 本发明的主要内容：通过DNAstar分析
软件比较确定ALV-J各代表毒株env（囊膜蛋白基因）保守基因序列；制备标记ALV-J核酸探针;明确核酸探针与提取接毒细胞DNA斑点杂交的最佳反应条件。
[0021] 核酸探针与接毒细胞反应最适
温度以及探针反应浓度是斑点杂交反应的关键。
[0023] 1、本发明是基于ALV－J囊膜蛋白env保守基因而制备的ALV-J核酸探针，这在国内尚属首次，该探针特异性强，检测效果精准。
[0024] 2、本发明制备的检测J亚群禽白血病斑点杂交方法可以对ALV其他亚群、禽马立克氏病、网状内皮组织增生症进行鉴别诊断，若感染ALV-J白血病，可以检测到ALV-J反应阳性，而ALV其他亚群、马立克氏病和网状内皮增生症反应阴性。
[0025] 3、本发明可以提高诊断的精准度，减少检测的成本，大幅度降低因J亚群禽白血病造成的直接和间接经济损失，这是现有J亚群禽白血病诊断手段所不能达到的效果。（四）
附图说明
[0026] 图1为本发明检测J亚群禽白血病病毒的斑点杂交
流程图。
[0027] 图1中，1是提取接毒细胞DNA样品，2固定DNA，3是预杂交，4是制备核酸探针，5是标记核酸探针，6是加入标记核酸探针，7是杂交，8是漂洗，9是斑点杂交检测阳性结果。
[0028] 图2为ALV-J斑点杂交检测结果。
[0029] 图2中，1是检测ALV-A毒株DNA结果；2是检测ALV-B毒株DNA结果；3是检测马立克氏病病毒DNA结果；4是检测ALV-J宁夏毒株DNA结果；5是检测网状内皮组织增生症病毒DNA结果；6是正常细胞DNA阴性对照；7是酶切DNA片段阳性对照。
[0030] 说明：迄今为止，我国报道的禽血病为A、B、J亚群，C、D亚群仅出现在国外，在我国未见报道。据此，ALV的阳性对照选择A、B亚群。（五）具体实施方式
[0031] 下面结合附图对检测ALV-J的斑点杂交方法作进一步的详细说明。
[0032] 1、通过DNAstar分析软件比较同源性确定ALV-J各代表毒株env（囊膜蛋白基因）保守基因序列：
[0033] caagccatgaaggaacatacagagaagatacgggtggaagatgatcccataggggattggtttacgcgcacgtttggtgatctaggaaggtggctcgcgaaaggtgttaagacgctactgtttgccttgcttgtcatagcctgtctattagctatcattccatgtgtaatcaagtgctttcaggattgtctatcgagaacaatgaatcagtttatggatgaacgcataagatatcatagaattaggga
[0034] 2、利用随机引物法进行地高辛标记探针步骤如下：
[0035] 向离心管中加1μgDNA模板、高压灭菌的双蒸
水至最终体积为16μl;沸水水浴10min变性DNA,迅速放入
冰水中冷却2min;加4μl地高辛引物混合至离心管中并简单离心；在37℃温箱内孵化20h以上；65℃加热10min终止反应，即标记探针。
[0036] 3、经过反复试验，确定ALV－J核酸探针与ALV接毒细胞DNA的最佳杂交反应程序，基本步骤如下：
[0037] 裁一张适当大小带正电尼龙膜,划好格子（0.7mm×0.7mm）；提取接毒细胞DNA1μl点于膜上（流程图1），稍微凉干；将尼龙膜放于变性液（0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl）变性10min,再放于中和液（0.5mol/L Tris-cl，3.0mol/L NaCl）中和5min;用2×SSC(0.03mol/L
柠檬酸钠，0.3mol/L NaCl)冲洗1min，处理后的尼龙膜可放在2-8℃较长时间保存；将尼龙膜放于80℃
烤箱干烤2h,固定DNA（流程图2）；将尼龙膜加入装有地高辛预杂交液（DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I）的无菌三
角瓶中，42℃,30min,其间经常摇晃（流程图3）;加冷却的标记探针（浓度50-80ng/μl）于预热杂交液,混合后不产生
泡沫，即制备成探针杂交液（探针稀释浓度20-30ng/ml左右）；将尼龙膜放于含有探针的杂交液中（流程图7），温度范围42-54℃，培养过夜（10h）;杂交结束后，取尼龙膜放于洗液I（2×SSC，0.1%SDS）中冲洗2次，每次5min，常温15-25℃持续搅动；
然后放于提前预热到65-68℃洗液II(0.5×SSC，0.1%SDS)中冲洗2次，每次15min;室温下，将尼龙膜放培养皿冲洗液中((0.1mol/L马来酸、0.5mol/L NaCl、0.3%Tween20))内浸泡1-5min；放入100ml新配置封闭液中(0.1mol/L马来
酸溶液1：10稀释)浸泡，37℃摇晃
30-60min；接着放入抗体稀释液(Anti-Digoxigenin-AP用Blocking solution 1:5000稀释)中浸泡30min;然后在冲洗液中室温洗膜2次,每次15min;在20ml检测液中(0.1mol/L Tris-cl；0.1mol/L NaCl)平衡2-5min（流程图8）;避光，观察检测结果呈阳性（流程图
9），建立了ALV-J斑点杂交检测方法。
[0038] 从图2中的检测结果可以看到1、2、3结果阴性，4、5结果阳性，即可确定检测结果。
[0039] 图2中结果说明了本发明检测J亚群禽白血病的斑点杂交效果明显。
[0040] 本发明应用于禽白血病J亚群的病毒快速检测，通过该斑点杂交方法有效地提高了诊断速度，并且能对禽白血病各亚群、马立克氏病、网状内皮组织增生症进行鉴别诊断，降低了养禽业因ALV-J感染而造成的经济损失，为禽肿瘤性病毒诊断方法提供了一种新的思路和方法。
