随着生命科学后基因组时代的到来，围绕基因及其产品的研究和应用越发 引起研究者的广泛关注，而转基因动物技术是其中最有效的一种技术手段，目 前国际上在转基因动物制备方面的策略分别从三个方面即处理受精卵、卵子和 精子来获得转基因动物。鉴于卵子和精子处理方法的不稳定性，故而在转基因 动物制备中，对于受精卵处理法仍然是最有效、最经典的方法，现就对现有制 备转基因动物法，以对受精卵为对象处理进行综述如下。
原核期显微注射外源DNA法(Gordon JW，Scangos GA，Plotkin DJ，Barbosa JA，Ruddle FH.Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.Proc Natl Acad Sci USA.1980 Dec；77(12)：7380-4.)。 该方法在小鼠上较为成功，但对于大动物(牛、羊、猪等)成功率极低，仅为 0.3～1％。尽管有一些研究者对此方法作了些改进，取得了一些进展，如美国专 利4736866(1984年)和4873191(1986年)。但是该方法存在不可避免的缺陷： 需要利用显微操作系统，将外源DNA精确的注入受精卵中的雄原核中，其不可避 免会对早期胚胎造成损伤，且外源基因整合效率随机不定，整体效率很低。这 都造成了该法制备转基因动物成本较高，如制备一头转基因牛需要约50万美元。
胚胎干细胞技术是继原核显微注射后被广泛研究的转基因技术之一，该方 法利用胚胎干细胞的具有的全能性，既可以发育成一个个体的能力，将分离获 得的重组胚胎干细胞转入外源基因后，直接移入受体动物，获得转基因动物， 由此看来，该方法的关键之处是首先要建立由胚胎干细胞系，便于获得还有目 标基因的阳性胚胎干细胞。但是目前为止，只有小鼠的胚胎干细胞获得成功建 系，且有欧洲专利建立体外胚胎干细胞建系方法来制备转基因动物
(WO2008017704：METHOD OF PRODUCTION OF TRANSGENIC AVIAN USING EMBRYONIC STEM CELLS)。而其他大动物，如猪、牛、羊很难获得胚胎干细胞系，所以限 制大动物转基因动物的制备。结合核移植技术可以使解决胚胎干细胞来源的不 足，近年来取得了很多成功的研究报道(Macháty Z，Bondioli KR，Ramsoondar JJ，Fodor WL.The use of nuclear transfer to produce transgenic pigs. Cloning Stem Cells.2002；4(1)：21-7.)，但是，该方法前期细胞筛选操作工 作量大，最终容易产生嵌合体，从而增大了转基因动物制备的成本。
转基因动物制备中最关键环节之一便是外源基因的导入，最早的玻璃管直 接注射是一种简便的方法，但是对受精卵损伤很大，且操作需要昂贵仪器以及 操作复杂；故直接通过构建含有外源基因的载体是一种非常有效的手段之一。 尽管常用的细胞导入方法很多，但是由于受精卵的特殊性，它具有很厚的细胞 膜，即透明带组织，故常用的方法(如磷酸钙法、电击法、脂质体法)难以对 其操作，获得成功的目标基因导入。近年来，病毒转染技术被认为是转染效率 最高的外源目标基因导入技术，可实现100％的目标基因的导入。在目前病毒转 染方法中主要是应用逆转录病毒法来制备转基因动物，逆转录病毒即RNA病毒， 需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋 白酶作用下扩增的一类病毒。近年来，已设计构建成一些缺陷型病毒(defective virus)使逆转录病毒成为有用的基因载体，成功地把外源目标基因转入了人体 细胞，并在细胞中表达。逆转录病毒的许多特点使其成为转基因载体的上佳选 择。最重要的一点是它可以有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带 的外源基因。病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所 携带的外源基因也不会改变。尽管逆转录病毒曾被广泛应用于人类基因治疗和 转基因动物的制备，但是该法有其局限性，首先，该体系允许装入的外源基因 大小受到限制，也就是逆转录病毒载体系统包装外源基因的能力有限，不能超 过4Kb；其次，该系统包装的目标基因要求最好不要含有内含子序列，从而限 制了目标基因的有效调控表达；最重要的是逆转录病毒整合到宿主染色体后容 易生成野生型病毒颗粒，还会激活原癌基因，造成宿主安全性问题。
腺病毒(adenovirus)是线状双链DNA病毒，基因组内有14个基因。腺病毒大 小约90～100nm，无外套膜二十面体的双股DNA病毒。由于腺病毒载体具有高效 转基因效率以及安全性较好的特点，已被应用于人类基因治疗的临床近20年的 时间。腺病毒由于其能够感染非分裂和分裂细胞，故可将其应用于外源基因带 入受精卵中，然后整合到宿主细胞染色体。然而，有关腺病毒载体来制备转基 因动物方面却报道极少，仅见日本学者Tsukui等报道了其利用腺病毒载体来进 行转基因小鼠的制备研究(Tsukui T，Miyake S，Azuma S，Ichise H，Saito I， Toyoda Y.Gene transfer and expression in mouse preimplantation embryos by recombinant adenovirus vector.Mol Reprod Dev.1995 Nov； 42(3)：291-7.)，然而在该研究中，所用的报告基因LacZ在转基因后代13.5d 的胎龄小鼠中未能检测到表达。在随后的研究中，该小组获得了小鼠的转基因 后代，并首次探索了利用腺病毒载体进行转基因动物制备的可能性(Tsukui T， Kanegae Y，Saito I，Toyoda Y.Transgenesis by adenovirus-mediated gene transfer into mouse zona-free eggs.Nat Biotechnol.1996 Aug；14(8)：982-5.)。日本专利(JP，09-140292，A)同时公开了使用CAG启动 子和LacZ为报告基因的重组腺病毒AxCANLacZ为载体的转基因小鼠的制备方法， 并由此方法仅获得了用Southern blotting杂交检测LacZ阳性的转基因小鼠。综 上所述，目前国际上，并没有找到一种简便高效的转基因方法。

针对现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种重组腺病 毒载体制备转基因动物的方法。
实现上述发明目的的技术方案是一种重组腺病毒载体制备转基因动物的方 法，其特征在于，将含有不同目标基因的重组腺病毒颗粒直接感染卵或动物受 精卵内外，经实验室体外受精及胚胎培养，转基因卵或早期胚鉴定与筛选，获 得具有稳定遗传的阳性转基因卵或早期胚胎，然后移植入受体动物获得稳定遗 传的具有不同目标基因功能的转基因动物。
所述的卵包括自然交配或人工授精获得的受精卵，以及体外受精获得的受 精卵。
所述的动物是指非人哺乳类动物或禽类。
所述的目标基因包括非编码蛋白的功能基因和蛋白质编码基因，可用于体 外转录表达的所有目的基因，包括多肽类、抗体、细胞因子和酶等。
用本方法所制备的转基因小鼠、猪、羊、兔的整合阳性率可达60％以上，远 高于传统显微注射法。
由此，我们以构建的重组腺病毒AdCMVatIII为载体，以人凝血酶III为例， 进行了转基因牛、羊、猪、兔子的制备，并探索出了一种更加简便、高效率的 转基因动物的方法。所制备的转基因动物可应用于疾病模型、生物制药以及基 因功能确证等研究和应用。
附图说明
图1重组人凝血酶III腺病毒载体构建图谱。
图2重组人凝血酶III基因腺病毒载体鉴定电泳图谱。
图3重组腺病毒在细胞中生产的显微镜观察图。
图4重组腺病毒载体携人凝血酶III导入猪受精卵。

下面结合发明人给的具体实施例对本发明的方法做进一步阐明，但是应当 理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1人凝血酶III转基因动物制备方法
(一)目标蛋白(如人凝血酶III)cDNA的合成、克隆和序列测定：
1.人肝组织总RNA的提取
(1)切取一小块冷冻的组织，快速称量后即移入新鲜配制的裂解缓冲液中， 按每50mg组织加裂解缓冲液1ml量。
(2)对肝组织进行匀浆破细胞，预过滤离心一次，收集虑出液。
(3)加入等体积氯仿，振荡混匀，离心后吸取上清。
(4)加入等体积70％乙醇，轻轻混匀，离心获得总RNA。
(5)用0.01％DEPC处理过的无Rnase的水溶解沉淀，常规方法进行含量 测定。
2.反转录法合成总cDNA
(1)取1～2μg乳腺总RNA，加入DEPC处理的水至9.5μl，70℃，5～ 10min，冰上存。
(2)50μL反应体系：2.5μl OligodT(20pmol/L)，5μL10×RNA PCR buffer，10μl MgCl2(25mmol/L)，5μL dNTP(各10mmol/L)，1.25μL Rnase 抑制剂(40U/μL)，2.5μL AMV反转录酶(5U/μL)，加入9.5μL处理后的 总RNA。
(3)反应条件：30℃，10min，42℃ 15min，99℃ 5min，4℃ 10min， 产物保存于-70℃备用。
3.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增hATIIIcDNA
(1)以人凝血酶III为例，设计如下特异引物用于PCR扩增，使引物终浓度 为20μM。
(2)上游引物：5’—TCA GGTACCATGTATTCCAATGTGATAG—3’(划线处 为KpnI酶切位点)
下游引物：5’—TCTCTCGAGCTACTTAACACAAGGGTTG—3’(划线处为XhoI 酶切位点)
(3)100μL反应体系中连续加入：10×PCR buffer 10μL，dNTP(各 2.5mmol/L)16μL，上游引物1μl，下游引物1μl，2中合成的cDNA产 物2μL，补加dH2O至100μL。
(4)PCR反应条件：94℃预变性5min，97℃变性30s，60℃退火30s， 72℃延伸2min，30个循环，72℃再延伸10min。产物保存于—70℃备用。
4.PCR产物纯化
将hATIIIPCR产物纯化，使用商用试剂盒，如BIOTECH公司PCR产物快速 纯化Kit。
(1)标准琼脂电泳分离上述PCR产物，琼脂糖浓度为1％，100V稳压状 态，电泳40min。
(2)在紫外灯下，准确切取凝胶上DNA大小1.4Kb左右的片断，并称重。
(3)按试剂盒要求，一定比例加入溶胶缓冲液，于37～55℃溶胶，期间 不停晃动。
(4)添加溶胶后样品于吸附柱子上，吸附DNA，用Washing Buffer漂洗 2次。
(5)加入dH2O于吸附柱子中，离心洗脱DNA，于—20℃保存。
5.目标基因hATIII的克隆化
将目标基因hATIII PCR纯化产物用KpnI和XhoI酶切后，同时用将pUC19 克隆载体用可产生相同粘性末端的SalI和KpnI酶切后进行连接反应。
连接反应：1μL PCR纯化产物，0.5μLpUC19质粒，0.5μL T4 DNA Ligase酶，1μL 10×T4DNA Ligase Buffer，7μL dH2O。16℃过夜孵 育。
细菌转化：取5～10μl上述连接反应产物，用常规CaCl2化学法，热刺 激方法转化感受态DH5α。
转化菌铺板于氨苄抗性(100μg/mL Ampr)的固体细菌培养板，37℃培养。
次日，挑取单菌落，接种于3～5mL液体LB培养液中，37℃保温10～15h。
常规碱裂解法小提质粒，限制性酶切分析重组质粒。
6.hATIII基因序列测定
将限制性酶切分析正确的重组阳性质粒，纯化后送至基因测序公司进行基 因序列测定。本基因序列在上海杰瑞生物工程(GENERAY)有限公司完成了测序， 应用国际上通用NCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)基 因序列软件对测序结果分析表明，所克隆的序列与国际GENBANK中目标基因序 列(如人凝血酶III，ACCESSION：NM_000488)一致，其完整的序列如序列表 SEQ1.TXT所示。
由生物软件自动翻译，本发明所生产的重组蛋白，结合具体实例，以人凝 血酶III为例是464肽，其序列如下，序列前32个肽为信号肽段，如序列表SEQ2.TXT 所示。
(二)目标基因蛋白(如人凝血酶III基因为例)腺病毒载体的构建和病毒 载体生产
将目标基因cDNA序列(人凝血酶cDNA序列)连入载体，经测序验证后， 与腺病毒骨架质粒载体共同构建成重组目标蛋白(如人凝血酶)腺病毒载体。 用限制性内切酶Kpn1和Xho1双酶切hATIIIcDNA序列，同样酶切载体质粒(如， pShuttle-cmv)，按(一)5步骤连接、转化，获得重组子(如 pShuttle-cmv-hATIII)，见图1。
将质粒重组子(pShuttle-cmv-hATIII)与含有腺病毒基因组的骨架质粒一 起构建获得重组人乳铁蛋白腺病毒载体AdhLTF，见图1。并经过限制性内切酶 分析，验证重组腺病毒基因组的正确性见图2，图2中(A)PCR扩增鉴定 AdCMVatIII，(B)限制性内切酶消化重组腺病毒基因组，1：重组腺病毒基因 组AdCMVatIII；2：不含有目标基因的腺病毒基因组；3：未加酶的重组腺病毒 基因组。
用重组人蛋白基因(如人凝血酶III基因)腺病毒载体AdCMVatIII在HEK293、 911细胞系中生产病毒载体以及大量扩增。通过GFP报告基因可以示踪目标蛋白 的表达效率，如图3中(A)普通显微镜下观察结果，(B)荧光显微镜下观察结 果，目标蛋白表达效率很高。
氯化铯梯度离心法获得用于动物实验的高纯度的重组腺病毒颗粒，携带目 标基因，如人凝血酶III，AdCMVatIII病毒滴度1012PFU/mL以上。
选用真核细胞表达系统，如CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、羊乳腺上皮细胞、 兔、牛、猪乳腺上皮细胞等，利用RT—PCR、Western blotting等检测重组腺 病毒载体携带目标基因的体外表达效率。
(三)重组人蛋白基因(如人凝血酶III基因)腺病毒载体感染动物受精卵 细胞
将重组人蛋白基因(如人凝血酶III基因)腺病毒载体感染动物受精卵细胞， 体外培养，荧光显微镜观察，筛选获得目标基因转录与表达的阳性胚胎。
(1)小鼠自然交配后2～4h，获得原核期受精卵；以腺病毒AdCMVatIII， 滴度2～8×108PFU/mL，进行共孵育。
(2)猪卵母细胞来自河北昌黎屠宰场，体外成熟培养后，以猪鲜精(河北 昌黎种猪场)进行体外受精，受精处理1～2h；腺病毒AdCMVatIII，滴度0.8～ 1×109PFU/mL，进行共孵育，以AdCMVatIII重组病毒颗粒感染猪的受精卵，24～ 48小时，检测目标基因的转录与表达。经筛选获得的阳性猪胚胎体外发育至囊 胚期后，移植入假孕母猪，正常产仔，Southern blot法检测目标基因是否整合 到宿主基因组，Western blot检测目标基因是否正常表达。如图4abc，其中A： 未成熟的猪卵母细胞；B：用于体外受精的猪卵母细胞；C：转基因阳性猪胚胎， 腺病毒感染48h后荧光显微镜下猪胚胎。
(3)牛卵母细胞来自地方屠宰场，体外卵母细胞培养成熟，经体外受精； 腺病毒AdCMVatIII，滴度0.8～1×109PFU/mL，进行共孵育。
(4)羊来自地方农家，饲养后激素处理超数排卵，自然交配后活体采卵， 获得受精卵；腺病毒AdCMVatIII，滴度0.8～1×109PFU/mL，进行共孵育。
(5)兔来自河北昌黎牛头崖地方农家，饲养后激素处理超数排卵，本交后 手术法采卵，获得受精卵；腺病毒AdCMVatIII，滴度0.8～1×109PFU/mL，进 行共孵育。
(四)转基因动物的检测与鉴定
常规Sorthern blotting法检测目标基因组在动物(鼠、猪、牛、羊、兔) 染色体中的整合，Western Blotting法检测目标基因在转基因动物组织中的表 达。所用一抗为兔(鼠)抗目标蛋白(如人凝血酶III)单克隆抗体，二抗为 HRP辣根过氧化酶标记抗兔(鼠)Ig，目标蛋白(如人凝血酶III)标准品为Sigma 产品。
此外应当理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，以此方法或技术产生的各种形式转基因动物、 转基因动物模型和基因蛋白药物同样属于本申请所属权利要求书所限定范围之 内。
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<120>一种重组腺病毒载体制备转基因动物的方法
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<210>1
<211>464
<212>DNA
<213>人凝血酶III
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TTGCTGCTCATTGGCTTCTGGGACTGCGTGACCTGTCACGGGAGCCCTGTGGACATCTGC120
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AAGGCAACTGAGGATGAGGGCTCAGAACAGAAGATCCCGGAGGCCACCAACCGGCGTGTC240
TGGGAACTGTCCAAGGCCAATTCCCGCTTTGCTACCACTTTCTATCAGCACCTGGCAGAT300
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<211>464
<212>DNA
<213>人凝血酶III
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