一种血清4型禽腺病毒悬浮培养扩增方法
专利汇可以提供一种血清4型禽腺病毒悬浮培养扩增方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种血清4型禽腺病毒悬浮培养扩增方法。具体过程为：将经PCR鉴定为血清4型禽腺病毒的病毒接种于鸡 肝细胞 ，通过细胞悬浮培养技术高效扩增血清4型禽腺病毒。本发明本发明利用鸡肝细胞，建立的血清4型禽腺病毒悬浮培养扩增方法，能实现对血清4型禽腺病毒高效扩增，与鸡胚接种比较，病毒滴度比鸡胚接种培养病毒高100倍以上(传统鸡胚毒效价小于106.0TCID50/ml)。这一血清4型禽腺病毒悬浮培养扩增方法为研制血清4型禽腺病毒 疫苗 提供了技术，具有很好的应用价值。，下面是一种血清4型禽腺病毒悬浮培养扩增方法专利的具体信息内容。
1.一种血清4型禽腺病毒悬浮培养扩增方法，其特征在于，将血清4型禽腺病毒接种于鸡肝细胞，通过细胞悬浮培养技术高效扩增血清4型禽腺病毒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，悬浮培养技术是利用激流式生物反应器扩增血清4型禽腺病毒；培养条件参数为激流式生物反应器转速为40r/min、200g载体初始细胞接种为1×109个；细胞培养液为10％FBS血清的DMEM/F12培养液、病毒感染及维持液为含
2％FBS血清的DMEM/F12培养基、最适PH为7.0-7.2。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，病毒接种于鸡肝细胞之前对鸡肝细胞进行培养，细胞培养液为10％FBS血清的DMEM/F12培养液，最适PH为7.0-7.2。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，接种鸡肝细胞后，每隔24h取样测糖耗，当残糖量低于1.5g/L，定量补充葡萄糖或进行换液。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，当鸡肝细胞生长6天后进行病毒的接种；具体过程为：
1)通过激流袋将灌注袋及激流袋的细胞培养液全部排出，然后在激流袋中加入6L含
200ml胎牛血清的DMEM/F12维持液，在灌注袋中接入4L不含血清的4型禽腺病毒(MOI为
0.1TCID50)DMEM/F12，吸附1h后，开始循环培养；
2)将感染后96小时收集的上清液收集病毒、分装，并测定病毒效果。
一种血清4型禽腺病毒悬浮培养扩增方法
技术领域
背景技术
发明内容
4型禽腺病毒效价分别达108.16，108.25以及108.0TCID50/ml。
胚接种培养病毒高100倍以上(传统鸡胚毒效价小于10 TCID50/ml)。这一血清4型禽腺病毒悬浮培养扩增方法为研制血清4型禽腺病毒疫苗提供了技术，具有很好的应用价值。
附图说明
具体实施方式
1000IU/ml，37℃反应30min；经0.45um微孔滤器过滤后，以0.2ml/胚的剂量，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后96-120小时后收取尿囊液；－20℃保存。取尿囊液400μL于1.5mL指形管内，加入400μL细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20mmol/L EDTA pH 8.0，2％SDS和蛋白酶K)，充分混匀后放置56℃水浴锅作用4小时；加入400uLTris平衡酚，充分混匀后
10000r/min离心10分钟，取上清液于另一1.5mL指形管；加入400μL酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后10000r/min离心5分钟，取上清液于另一1.5mL指形管；加入800μL无水乙醇，颠倒混匀后放入-20℃孵育30分钟，12000r/min离心15分钟，弃尽上清液；室温自然干燥后向沉淀加入30μL灭菌超纯水和2uLRNA酶，充分溶解后，即得病毒基因组，置-20℃备用。取2μL提取的病毒DNA作为模板,利用特异性引物进行PCR扩增。
1所示)。切下PCR特异性产物片段送至南京金斯瑞公司进行序列分析。
1.5g/L，定量补充葡萄糖或进行换液。当细胞生长6天后进行病毒的接种。通过激流袋将灌注袋及激流袋的细胞培养液全部排出，然后在激流袋中加入6L含200ml胎牛血清的DMEM/F12维持液，在灌注袋中接入4L不含血清的4型禽腺病毒(MOI为0.1TCID50)DMEM/F12，吸附1h后，开始循环培养。在感染后不同时间段收集上清液，分别对三批悬浮培养的血清4型禽腺病毒的生长动力学进行了测定。将感染后96小时收集的上清液收集病毒、分装，并测定病毒效果。结果显示通过悬浮培养扩增的三批血清4型禽腺病毒效价分别达到108.16，108.25以及
8.0
10 TCID50/ml。如表1所示：
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