技术领域
[0001] 本
发明涉及一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法，属于细胞培养技术领域。
背景技术
[0002]
血管疾病影响数百万人的健康。严重的
血管疾病导致截肢和危及生命的中
风。在所有血管腔内排列的内皮细胞在调节血管通透性，血管生成和组织再生起着至关重要的作用。在生理条件下，血管可以通过血管发生和血管生成产生。血管发生是指从祖细胞形成新血管，而血管生成是指通过现有血管细胞的迁移和增殖从现有血管形成新血管。然而，这些过程在患有中风，糖尿病或老年痴呆症的患者中受到损伤。在血管疾病中，由于内皮细胞的异常病变或者死亡导致血管功能恶化，最近有研究表明，内皮细胞具有形成血管的能
力，且对于改善血管疾病有很大的帮助，因此，需要获得大量的人源的内皮细胞来
治疗这些血管疾病。
[0003] 人多能干细胞，例如人胚胎干细胞(hESCs)和人诱导的多能干细胞(hiPSC)，能够自我更新并分
化成人体中的任何细胞类型，因此是产生内皮细胞(ECs)的理想资源。许多研究小组已经证明ECs可以来源于hiPSCs和hESCs。这些诱导得到内皮细胞可用于自体的缺血区域的血管重建和定制人造血管和组织,另外，体外利用多能干细胞分化内皮细胞也为研究调控内皮命运的分子机制提供了新的途径。通过机制研究有助于理解血管疾病的发病机制以及为治疗血管疾病提供有效的措施。然而，在开发临床应用之前，必须建立从多能干细胞中获得ECs的低成本且高效的方法。此外，需要进一步探索调控多能干细胞分化内皮细胞的机制。
[0004] 目前分化内皮祖细胞的方法有很多种，但普遍存在分化的过程复杂，分化周期长，成本较高，分化不稳定等缺点。首先，在贴壁细胞分化方法中：2015年，GopμSriram等，使用StemDiff APEL，ECGM-MV2等分化培养基，连续添加BMP4、FGF2、VEGF的情况下，获得CD31/CD144双阳性的细胞比例为80.7％。但是此方法所用StemDiff APEL、ECGM-MV2分化培养基价格过高，使分化成本大大增加。2017年，Kit Man Tsang等，在连续七天的缺
氧条件下，使用BMP4、FGF2、VEGF，使得内皮的分化效率由常氧下的12.4％提升为29.3％。在悬浮细胞分化的条件下，2010年，Hongkui Deng等，使用EB分化的方式，在七天的过程中，使用BMP4，VEGF的方法，获得27％的CD34阳性的祖细胞。
[0005] 目前，关于分化内皮细胞存在以下
缺陷：成本过高，mTeSR培养基，StemDiffAPEL，ECGM-MV2培养基价格过高，不适合大量培养和分化内皮细胞；
现有技术分化效率低，得率低。
发明内容
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法，本发明的方法降低了人胚胎干细胞和人多能诱导干细胞体外诱导内皮细胞的成本，并进一步用视黄酸RA提高内皮细胞的分化效率，在一次分化过程中获得更多的内皮细胞。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种促进人多能干细胞定向分化为内皮细胞的方法，包括如下步骤：
[0008] (1)在第0～1天，使用添加4～8μM的GSK3I的CDM3分化培养基，对细胞
密度达到95％以上的人多能干细胞进行诱导分化；
[0009] (2)在第2天，使用添加40～60ng/ml bFGF的CDM3分化培养基对步骤(1)诱导培养后的细胞进行进一步诱导分化；
[0010] (3)在第3～5天，使用添加40～60ng/ml VEGF和20～30ng/ml BMP4的CDM3分化培养基对步骤(2)诱导培养后的细胞进行进一步诱导分化；
[0011] (4)在第6天，添加细胞消化酶对步骤(3)诱导培养后的细胞进行消化，然后将消化后得到的细胞采用内皮细胞培养基继续培养3～4天；
[0012] 所述的CDM3培养基中含有RPMI-1640
基础培养基、双抗、
牛血清
白蛋白和
抗坏血酸。
[0013] 进一步地，在步骤(2)中，在添加bFGF的同时加入0.8～1.2μM视黄酸(RA)。
[0014] 进一步地，所述的人多能干细胞为人胚胎干细胞(hESCs)或人诱导的多能干细胞(hiPSC)。
[0015] 进一步地，在步骤(1)之前，还包括采用干细胞培养基对人多能干细胞进行传代培养至细胞密度达到95％以上。
[0016] 进一步地，所述的干细胞培养基为PSeasy-E8或mTeSR。
[0017] 进一步地，所述的培养和传代具体包括如下步骤：将人多能干细胞培养至细胞密度到达85～90％后，使用无
钙磷酸盐缓冲液(DPBS)清洗细胞碎片，随后加入0.5μM的EDTA，消化5～10min，然后将细胞吹散，吹散后按照1:6～1:10的比例传代至Matrigel包被的培养皿中，继续培养至细胞密度为95％以上。
[0018] 进一步地，在步骤(1)中，所述的GSK3I为CHIR99021。
[0019] 进一步地，所述的CDM3培养基中牛血清白蛋白的浓度为0.4～0.6mg/ml，抗坏血酸的浓度为0.20～0.25mg/ml，所述的双抗为青霉素和
链霉素，其中青霉素浓度为100U/ml，链霉素浓度为0.1mg/ml。
[0020] 进一步地，所述的细胞消化酶为胰酶细胞消化液或Accutase细胞消化液。
[0021] 进一步地，所述的内皮细胞培养基为ECM培养基。
[0022] 进一步地，在步骤(4)中，消化后得到的细胞接种至Gelatin包被的培养皿中进行培养。采用Gelatin包被的培养皿有利于辅助细胞贴壁，有利于内皮细胞生长。
[0023] 在本发明中，第0天指的是0～24h，第1天指的是24～48h，以此类推。
[0024] 本发明的有益效果是：
[0025] 本发明分化内皮细胞的方法更加的经济有效，分化过程更加方便快捷；分化过程中不使用血清，排除多种因素的干扰，并且分化结果更可靠；且添加RA可以促进内皮分化的效率，一次分化可以得到更多的内皮细胞。
附图说明
[0026] 图1为未分化的胚胎干细胞的显微照片；
[0027] 图2为添加RA与对照组在第6天的分化效率流式对比；
[0028] 图3为添加RA与对照组在第10天的分化效率流式对比；
[0029] 图4为第十天经过CD144
磁珠纯化后的内皮细胞流式图；
[0030] 图5为纯化后的内皮细胞免疫
荧光染色。
具体实施方式
[0031] 下面结合附图和具体
实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0032] 实施例1：定向分化的诱导因子和小分子化合物
[0033] 诱导因子：CHIR99021，作用浓度6μM；
碱性
成纤维细胞生长因子(bFGF),作用浓度100ng/μl；血管内皮细胞生长因子(VEGF)，作用浓度50ng/μl；骨形成蛋白4(BMP4)，作用浓度25ng/μl；
[0034] 小分子化合物：视黄酸(RA)，作用浓度1μM。
[0035] 实施例2：胚胎干细胞的培养和传代
[0036] 在Matrigel包被的培养皿上，使用PSeasy-E8培养基培养人胚胎干细胞(hESCs)，当细胞汇合度达到80％及以上时，吸走培养基，加入DPBS洗一次；加入EDTA，37℃很稳
培养箱中孵育3-5分钟；吸去消化液，立即加入新鲜的PSeasy-E8培养基，用移液枪扇形吹打培养皿底，使皿底贴附的细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀。然后按照1:8或者1:10的比例将细胞传至新的采用Matrigel包被的细胞培养板中，使用Pseasy-E8培养基进行传代培养，传代后的前24h，培养基中加入含10μM ROCK-I(Y27632),随后每天更换新的培养液，直至下次传代。
[0037] 将未分化的人胚胎干细胞在倒置荧光
显微镜下拍照，结果如图1，所示人胚胎干细胞H1系生长在Martrigel包被的培养皿中，用PSeasy-E8培养基培养，细胞排列紧密，呈集落状生长，细胞克隆和周围存在明显的界限。
[0038] 实施例3：内皮细胞的体外定向分化
[0039] 用PSeasy-E8培养基继续培养至密度在95％-100％时，更换分化培养基诱导。该分化培养基为CDM3(含有RPMI Medium 1640基础培养基，双抗、牛血清白蛋白和抗坏血酸)。
[0040] 视黄酸处理组(RA组)：从诱导时起记为第0天，分化的前两天(第0天-第1天)，加入6μM的CHIR99021。第2天，更换培养基CDM3并添加50ng/mlbFGF和1μM RA。第3天至第5天，更换培养基为CDM3添加50ng/ml VEGF、25ng/mlBMP4。第6天，用0.1％胰酶或Accutase消化，然后接种至Gelatin包被的60mm培养皿继续培养3-4天，更换培养基为ECM。
[0041] 对照组(DMSO组)：其培养过程与上述RA组步骤相同，区别在于第2天添加的培养基CDM3中添加的是50ng/ml bFGF和与RA组中RA体积相同的DMSO。
[0042] 将诱导的内皮细胞在第6天和第10天进行流式细胞检测，具体方法如下：
[0043] 1.使用0.1％胰酶消化，放入37℃恒温培养箱中3-5分钟，加入ECM培养基终止消化，用移液枪吹打细胞至单个，把细胞悬液加入1.5ml离心管中；
[0044] 2.离心，300g，5分钟；
[0045] 3.加入80μl PBS重悬细胞(3*105个细胞)，加入20μl CD34-APC或CD31-FITC或CD31-APC或CD144-PE
抗体，4℃，避光孵育30分钟，加入400μlPBS重悬细胞，上机检测。
[0046] 检测结果如图2和图3所示，图2中CD34是一种内皮祖细胞的标志分子，第6天检测到RA处理组的CD34阳性率(29.6％)比DMSO组的阳性率(16.0％)增加了10.9％。图3中，CD144和CD31都是内皮细胞的标志分子，第10天检测到RA处理组的CD144和CD31双阳性率(84.6％)比DMSO组的双阳性率(60.7％)增加了23.9％。
[0047] 实施例4：内皮细胞的纯化
[0048] 1.在第10天，使用0.1％的胰酶消化3-5分钟,使用10mLBuffer(PBS+0.5％BSA+2mM EDTA)重悬细胞；
[0049] 2.把细胞悬液通过30微米的过滤网，去除细胞团
块；
[0050] 3.300g，10分钟，离心；
[0051] 4.80μL Buffer重悬细胞，加入20ml CD144磁珠放入4℃，孵育15分钟；
[0052] 5.1-2mL Buffer洗去磁珠，300g，5分钟，离心；
[0053] 6.加入300μl Buffer重悬细胞，使细胞通过LS过滤柱(Miltenyi Biotec),5mlBuffer过柱，共三次；
[0054] 7.加入5ml Buffer，LS过滤柱分离磁
铁，使CD144磁珠标记的细胞流出，300g，5分钟离心；
[0055] 8.加入ECM培养基重悬细胞，使细胞在Fibronectin包被的皿里继续生长。
[0056] 采用与实施例3中相同的流式细胞检测方法对纯化过后的内皮细胞进行检测，结果见附图4，第10天诱导的内皮细胞使用CD144磁珠纯化后，流式检测CD144和CD31双阳性率为98.3％。
[0057] 使用CD144抗体进行免疫荧光染色，结果如图5所示，细胞边界为不规则的线状，细胞核用Hoechst染色为规则的椭圆状。
[0058] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。
本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以
权利要求书为准。
