技术领域
[0001] 本
发明属于
生物医学技术领域，具体涉及一种分离和扩增人尿源间充质干细胞的方法。
背景技术
[0002] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是成体干细胞家族的重要成员，MSC最初在骨髓中发现，后相继从脂肪、脐带、脐血等组织提取出间充质干细胞，作为多能干细胞，MSC具有多项分化潜能、促进免疫调控和自我更新能
力强等特点，成为最广泛应用的成体干细胞，可作为理想的
种子细胞用于衰老、
疾病等引起的组织器官修复。但其分离提取方法通常有创，且成本较高，制约了其在临床科研中的应用。从尿液中分离提取间充质干细胞具有干细胞特性，包括多向分化和自我更新能力，由于其提取方法无创，来源简便，容易获取，自体移植无免疫排斥问题，成为了生物研究及组织工程领域理想的种子细胞。
[0003] 目前，用于其培养的培养基大致分为以下几类：
[0004] (1)Alessandra Ferlini等报道的培养基成分为50％肾上皮细胞生长培养基、50％DMEM、10％胎
牛血清、1％GlutaMAX、1％非必需
氨基酸、1％抗生素/抗
真菌溶液、5ng/ml
碱性
成纤维细胞生长因子、5ng/ml血小板衍生生长因子、5ng/ml表皮生长因子；(2)Zhang等报道的培养基，其具体成分为50％
角质细胞无血清培养液、2.5μg/L表皮生长因子、25μg/L牛脑垂体提取物、1％青
链霉素、1％L-谷氨酰胺、37.5％DMEM、12.5％Ham’sF-12培养液、5％胎牛血清、0.2mg/L氢化可的松、5μg/L胰岛素、2.5mg/L转
铁蛋白、1×10-9mol/L三碘甲腺原氨酸、5μg/L表皮生长因子、0.9×10-4mol/L腺嘌呤；(3)Yang Wang等报道的培养基成分为DMEM培养基添加2％胎牛血清、10ng/mL人表皮生长因子、2ng/mL血小板衍生生长因子、1ng/mL转化生长因子-b、2ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、0.5mM皮质醇、25mg/mL胰岛素、20mg/mL转铁蛋白、549ng/mL肾上腺素、50ng/mL三碘甲腺原氨酸、L-谷氨酰胺和抗生素。通常添加一定量的胎牛血清，
[0005] 上述三种用于培养尿源间充质干细胞的培养基中均添加一定量的胎牛血清，然而在实际应用中，含血清培养基存在多种缺点：(1)增加了干细胞对血清的外源性依赖；(2)血清由于不同批次成分不一，给细胞培养的标准化带来困难，同时也给细胞表达的目的产物纯化带来困难；(3)血清中成分不明的生长/抑制因子会影响干细胞特性和分化潜能；(4)血清易受病毒、支原体或其他病原体的污染，成为潜在致病源；(5)血清获取成本高，价格较贵。
发明内容
[0006] 为了解决
现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种用于分离和扩增人尿源间充质干细胞的培养基及分离和扩增方法，所述分离培养基和扩增培养基均包括
基础培养基和添加剂。应用本发明所述培养基对人尿源MSC进行分离和扩增的方法简便易行，并且能够有效降低细胞污染
风险。
[0007] 本发明所采用的技术方案为：
[0008] 用于分离和扩增人尿源间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0009] (1)将尿液进行离心，得到细胞沉淀；向所述细胞沉淀中加入低血清分离培养基或无血清分离培养基，吹打混匀后进行培养，得到原代细胞，记作第0天；
[0010] (2)第12-13天，对所述原代细胞进行消化，使用所述低血清分离培养基或无血清分离培养基对细胞进行重悬、接种，记为P1代，即完成人尿源间充质干细胞的分离；
[0011] (3)使用低血清扩增培养基或无血清扩增培养基对P1代细胞进行传代培养，即完成人尿源间充质干细胞的扩增。
[0012] 进一步地，步骤(1)和(2)中，所述低血清分离培养基和无血清分离培养基均包含基础培养基和添加剂；
[0013] 所述基础培养基为DMEM培养基、F12-K培养基和KSFM培养基组成的混合体系；
[0014] 以基础培养基的体积作为基准，所述添加剂的组成为：谷氨酰胺0.2-2mM、抗生素10-100U/mL、重组人胰岛素1×10-3-0.1mg/mL、人表皮生长因子1×10-6-5×10-5mg/mL、血小板衍生生长因子1×10-6-5×10-5mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1×10-6-5×10-5mg/mL、人转铁蛋白1×10-3-5×10-2mg/mL、亚硒酸1×10-3-8×10-2mg/mL、甘氨酸1-20mg/L、L-丙氨酸
1-20mg/L、L-天冬酰胺1-20mg/L、L-天冬氨酸1-20mg/L、L-谷氨酸1-20mg/L、L-脯氨酸1-
20mg/L、L-丝氨酸1-20mg/L、三碘甲状腺氨酸1×10-6-5×10-5mg/mL、营养添加剂0.1-
100ul/mL、氢化可的松0.1-10uM、肾上腺素1×10-4-1×10-2mg/mL。
[0015] 进一步地，所述低血清分离培养基中，所述营养添加剂为胎牛血清，所述胎牛血清的浓度为0.1-50ul/mL。
[0016] 进一步地，所述无血清分离培养基中，所述营养添加剂为血清替代成分，所述血清替代成分的浓度为0.1-100ul/mL。
[0017] 进一步地，所述DMEM培养基、F12-K培养基和KSFM培养基的体积比为(1-2):(1-2):(1-2)。
[0018] 进一步地，步骤(3)中，所述低血清扩增培养基和无血清扩增培养基均包含基础培养基和添加剂；
[0019] 所述基础培养基为DMEM培养基和F12-K培养基的混合体系；
[0020] 以基础培养基的体积作为基准，所述添加剂的组成为：谷氨酰胺0.2-2mM、抗生素10-100U/mL、重组人胰岛素1×10-3-0.2mg/mL、人表皮生长因子1×10-6-1×10-4mg/mL、血小板衍生生长因子1×10-6-1×10-4mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1×10-6-1×10-4mg/mL、人转铁蛋白1×10-3-0.1mg/mL、亚硒酸1×10-3-0.16mg/mL、甘氨酸1-40mg/L、L-丙氨酸1-
40mg/L、L-天冬酰胺1-40mg/L、L-天冬氨酸1-40mg/L、L-谷氨酸1-40mg/L、L-脯氨酸1-40mg/-6 -4
L、L-丝氨酸1-40mg/L、三碘甲状腺氨酸1×10 -1×10 mg/mL、营养添加剂0.1-100ul/mL、氢化可的松0.1-20uM、肾上腺素1×10-4-2×10-2mg/mL。
[0021] 进一步地，所述DMEM培养基和F12-K培养基的体积比为(1-2):(1-2)。
[0022] 进一步地，所述低血清扩增培养基中，所述营养添加剂为胎牛血清，所述胎牛血清的浓度为0.1-20ul/mL。
[0023] 进一步地，所述无血清扩增培养基中，所述营养添加剂为血清替代成分，所述血清替代成分的浓度为0.1-100ul/mL。
[0024] 进一步地，所述血清替代成分为粘附因子、
白蛋白和维生素按照
质量比1×10-4-1×10-2：1-50：1×10-3-1×10-2组成的混合物
[0025] 本发明的有益效果为：
[0026] 本发明所述用于分离和扩增人尿源MSC(间充质干细胞)的培养基包括分离培养基和扩增培养基，所述分离培养基和扩增培养基的组成均包括基础培养基和添加剂。本发明培养基优化了既往培养基成分配比，通过添加多种促细胞生长的物质，降低了血清含量，甚至无血清，从而降低了胎牛血清对尿源干细胞特性和分化的不利影响，使得培养基
稳定性更佳，更加符合科学研究；维持了干细胞特性和旺盛的
细胞增殖能力；降低了成本，生产成本可以控制在国内外同类型培养基价格1/5左右。应用本发明所述培养基对人尿源MSC进行分离和扩增的方法简便易行，并且能够有效降低细胞污染风险。
附图说明
[0027] 为了更清楚地说明本发明
实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028] 图1是无血清分离培养基分离人尿源间充质干细胞及其克隆形成的形态图；
[0029] 图2是低血清分离培养基分离人尿源间充质干细胞及其克隆形成的形态图；
[0030] 图3是低血清扩增培养基扩增人尿源间充质干细胞的形态图；
[0031] 图4是无血清扩增培养基扩增人尿源间充质干细胞的形态图；
[0032] 图5是低血清扩增培养基和无血清扩增培养基培养所得的人尿源间充质干细胞表面标记物鉴定图；
[0033] 图6是低血清扩增培养基和无血清扩增培养基培养所得的人尿源间充质干细胞体外定向诱导标记图。
具体实施方式
[0034] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
[0035] 实施例1
[0036] 本实施例提供一种用于分离人尿源间充质干细胞的低血清培养基，包括基础培养基和添加剂；所述基础培养基为DMEM培养基、F12-K培养基和KSFM培养基的混合体系，DMEM培养基、F12-K培养基和KSFM培养基的体积比为1:2:2；以基础培养基的体积作为基准，所述添加剂包括：谷氨酰胺0.2mM、抗生素10U/mL、重组人胰岛素1×10-3mg/mL、人表皮生长因子1×10-6mg/mL、血小板衍生生长因子1×10-6mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1×10-6mg/mL、-3 -3人转铁蛋白1×10 mg/mL、亚硒酸1×10 mg/mL、甘氨酸1mg/L、L-丙氨酸1mg/L、L-天冬酰胺
1mg/L、L-天冬氨酸1mg/L、L-谷氨酸1mg/L、L-脯氨酸1mg/L、L-丝氨酸1mg/L、三碘甲状腺氨酸1×10-6mg/mL、胎牛血清0.1ul/mL、氢化可的松0.1uM、肾上腺素1×10-4mg/mL。
[0037] 进一步，本实施例提供所述培养基用于分离人尿源间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
[0038] (1)取适量0.1％明胶包被6孔板，36℃下放置35min，弃除多余明胶后风干，得到明胶包被的6孔板备用；
[0039] (2)将尿液在离心速度为1400rpm下离心8min，弃上清，得到尿液沉淀物；向所述尿液沉淀物中加入
磷酸缓冲盐溶液吹打混匀，1400rpm离心8min后弃上清，得到细胞沉淀；向所述细胞沉淀中加入所述培养基吹打混匀，接种于所述明胶包被的6孔板中培养，得到原代细胞，记作第0天；
[0040] (3)第3天，对所述原代细胞补加所述培养基；第9天，去除6孔板中培养液，使用磷酸缓冲盐溶液清洗后添加所述培养基继续培养；第12天，使用0.25％EDTA-胰酶对细胞进行消化，使用所述培养基对细胞进行重悬，之后进行接种，记为P1代，即完成人尿源间充质干细胞的分离。
[0041] 实施例2
[0042] 本实施例提供一种用于分离人尿源间充质干细胞的无血清培养基，包括基础培养基和添加剂；所述基础培养基为DMEM培养基、F12-K培养基和KSFM培养基的混合体系，DMEM培养基、F12-K培养基和KSFM培养基的体积比为2:2:1；以基础培养基的体积作为基准，所述添加剂包括：谷氨酰胺2mM、抗生素100U/mL、重组人胰岛素0.1mg/mL、人表皮生长因子5×10-5mg/mL、血小板衍生生长因子5×10-5mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子5×10-5mg/mL、人转铁蛋白5×10-2mg/mL、亚硒酸8×10-2mg/mL、甘氨酸20mg/L、L-丙氨酸20mg/L、L-天冬酰胺
20mg/L、L-天冬氨酸20mg/L、L-谷氨酸20mg/L、L-脯氨酸20mg/L、L-丝氨酸20mg/L、三碘甲状腺氨酸5×10-5mg/mL、粘附因子1×10-2mg/mL、白蛋白50mg/mL、维生素1×10-2mg/mL、氢化可的松10uM、肾上腺素1×10-2mg/mL。
[0043] 进一步，本实施例提供所述培养基用于分离人尿源间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
[0044] (1)取适量0.1％明胶包被6孔板，38℃下放置40min，弃除多余明胶后风干，得到明胶包被的6孔板备用；
[0045] (2)将尿液在离心速度为1600rpm下离心12min，弃上清，得到尿液沉淀物；向所述尿液沉淀物中加入磷酸缓冲盐溶液吹打混匀，1600rpm离心12min后弃上清，得到细胞沉淀；向所述细胞沉淀中加入所述培养基吹打混匀，接种于所述明胶包被的6孔板中培养，得到原代细胞，记作第0天；
[0046] (3)第4天，对所述原代细胞补加所述培养基；第11天，去除6孔板中培养液，使用磷酸缓冲盐溶液清洗后添加所述培养基继续培养；第13天，使用0.25％EDTA-胰酶对细胞进行消化，使用所述培养基对细胞进行重悬，之后进行接种，记为P1代，即完成人尿源间充质干细胞的分离。
[0047] 实施例3
[0048] 本实施例提供一种用于分离人尿源间充质干细胞的低血清培养基，包括基础培养基和添加剂；所述基础培养基为DMEM培养基、F12-K培养基和KSFM培养基的混合体系，DMEM培养基、F12-K培养基和KSFM培养基的体积比为2:1:2；以基础培养基的体积作为基准，所述添加剂包括：谷氨酰胺1.1mM、抗生素55U/mL、重组人胰岛素4.55×10-2mg/mL、人表皮生长因子2.55×10-5mg/mL、血小板衍生生长因子2.55×10-5mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子2.55×10-5mg/mL、人转铁蛋白2.55×10-2mg/mL、亚硒酸3.95×10-2mg/mL、甘氨酸10.5mg/L、L-丙氨酸10.5mg/L、L-天冬酰胺10.5mg/L、L-天冬氨酸10.5mg/L、L-谷氨酸10.5mg/L、L-脯氨酸10.5mg/L、L-丝氨酸10.5mg/L、三碘甲状腺氨酸2.55×10-5mg/mL、胎牛血清25.75ul/mL、氢化可的松5.95uM、肾上腺素5.95×10-3mg/mL。
[0049] 进一步，本实施例提供所述培养基用于分离人尿源间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
[0050] (1)取适量0.1％明胶包被6孔板，37℃下放置38min，弃除多余明胶后风干，得到明胶包被的6孔板备用；
[0051] (2)将尿液在离心速度为1500rpm下离心10min，弃上清，得到尿液沉淀物；向所述尿液沉淀物中加入磷酸缓冲盐溶液吹打混匀，1500rpm离心10min后弃上清，得到细胞沉淀；向所述细胞沉淀中加入所述培养基吹打混匀，接种于所述明胶包被的6孔板中培养，得到原代细胞，记作第0天；
[0052] (3)第4天，对所述原代细胞补加所述培养基；第10天，去除6孔板中培养液，使用磷酸缓冲盐溶液清洗后添加所述培养基继续培养；第13天，使用0.25％EDTA-胰酶对细胞进行消化，使用所述培养基对细胞进行重悬，之后进行接种，记为P1代，即完成人尿源间充质干细胞的分离。
[0053] 实施例4
[0054] 本实施例提供一种用于扩增人尿源间充质干细胞的低血清培养基，包括基础培养基和添加剂；所述基础培养基为DMEM培养基和F12-K培养基的混合体系，DMEM培养基和F12-K培养基的体积比为1:1；以基础培养基的体积作为基准，所述添加剂包括：谷氨酰胺0.2mM、抗生素10U/mL、重组人胰岛素1×10-3mg/mL、人表皮生长因子1×10-6mg/mL、血小板衍生生长因子1×10-6mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1×10-6mg/mL、人转铁蛋白1×10-3mg/mL、亚硒酸1×10-3mg/mL、甘氨酸1mg/L、L-丙氨酸1mg/L、L-天冬酰胺1mg/L、L-天冬氨酸1mg/L、L-谷氨酸1mg/L、L-脯氨酸1mg/L、L-丝氨酸1mg/L、三碘甲状腺氨酸1×10-6mg/mL、胎牛血清0.1ul/mL、氢化可的松0.1uM、肾上腺素1×10-4mg/mL。
[0055] 进一步，本实施例提供所述培养基用于扩增人尿源间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
[0056] 使用0.25％EDTA-胰酶对所述P1代细胞消化小于30s，使用所述培养基重悬，得到细胞重悬液；向所述细胞重悬液中加入2.5倍体积的所述培养基进行传代培养，得到P2代细胞；再将P2代细胞进行传代培养，即可实现人尿源间充质干细胞的扩增。
[0057] 实施例5
[0058] 本实施例提供一种用于扩增人尿源间充质干细胞的低血清培养基，包括基础培养基和添加剂；所述基础培养基为DMEM培养基和F12-K培养基的混合体系，DMEM培养基和F12-K培养基的体积比为2:1；以基础培养基的体积作为基准，所述添加剂包括：谷氨酰胺2mM、抗生素100U/mL、重组人胰岛素0.2mg/mL、人表皮生长因子1×10-4mg/mL、血小板衍生生长因子-4 -41×10 mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1×10 mg/mL、人转铁蛋白0.1mg/mL、亚硒酸
0.16mg/mL、甘氨酸40mg/L、L-丙氨酸40mg/L、L-天冬酰胺40mg/L、L-天冬氨酸40mg/L、L-谷氨酸40mg/L、L-脯氨酸40mg/L、L-丝氨酸40mg/L、三碘甲状腺氨酸1×10-4mg/mL、胎牛血清
20ul/mL、氢化可的松20uM、肾上腺素0.02mg/mL。
[0059] 进一步，本实施例提供所述培养基用于扩增人尿源间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
[0060] 使用0.25％EDTA-胰酶对所述P1代细胞消化小于50s，使用所述培养基重悬，得到细胞重悬液；向所述细胞重悬液中加入3.5倍体积的所述培养基进行传代培养，得到P2代细胞；再将P2代细胞进行传代培养，即可实现人尿源间充质干细胞的扩增。
[0061] 实施例6
[0062] 本实施例提供一种用于扩增人尿源间充质干细胞的无血清培养基，包括基础培养基和添加剂；所述基础培养基为DMEM培养基和F12-K培养基的混合体系，DMEM培养基和F12-K培养基的体积比为1:2；以基础培养基的体积作为基准，所述添加剂包括：谷氨酰胺1.1mM、抗生素55U/mL、重组人胰岛素0.1005mg/mL、人表皮生长因子5.05×10-5mg/mL、血小板衍生-5 -5生长因子5.05×10 mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子5.05×10 mg/mL、人转铁蛋白5.05×
10-5mg/mL、亚硒酸8.05×10-5mg/mL、甘氨酸20.5mg/L、L-丙氨酸20.5mg/L、L-天冬酰胺
20.5mg/L、L-天冬氨酸20.5mg/L、L-谷氨酸20.5mg/L、L-脯氨酸20.5mg/L、L-丝氨酸20.5mg/L、三碘甲状腺氨酸5.05×10-5mg/mL、粘附因子5.05×10-3mg/mL、白蛋白25.5mg/mL、维生素-3 -4
5.5×10 mg/mL、氢化可的松10.95uM、肾上腺素1.095×10 mg/mL。
[0063] 进一步，本实施例提供所述培养基用于扩增人尿源间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
[0064] 使用0.25％EDTA-胰酶对所述P1代细胞消化小于40s，使用所述培养基重悬，得到细胞重悬液；向所述细胞重悬液中加入3倍体积的所述培养基进行传代培养，得到P2代细胞；再将P2代细胞进行传代培养，即可实现人尿源间充质干细胞的扩增。
[0065] 本实施例1-6中使用的
试剂厂家名称如表1所示。
[0066] 表1-试剂厂家列表
[0067]
[0068] 实验例
[0069] 1、取实施例2所得的无血清分离培养基和实施例3所得低血清分离培养基，并利用其相应方法进行人尿源间充质干细胞的分离培养。由图1可以看到使用实施例2所得的无血清分离培养基分离人尿源间充质干细胞及其克隆的形成：图1a为分离培养第1天的细胞形态图，图1b为分离培养第5-9天的细胞形态图，图1c为分离培养第10-14天的细胞形态图。由图2可以看到使用实施例3所得低血清分离培养基分离人尿源间充质干细胞及其克隆的形成，图2a为分离培养第1天的细胞形态图，图2b为分离培养第5-9天的细胞形态图，图2c为分离培养第10-14天的细胞形态图。由图1和图2中可以看出无血清分离培养基和低血清分离培养基分离培养的细胞无明显差异。
[0070] 2、取实施例5所得的低血清扩增培养基和实施例6所得无血清扩增培养基，并利用其相应方法进行人尿源间充质干细胞的扩增培养。由图3可以看到使用实施例5所得的低血清扩增培养基扩增人尿源间充质干细胞的形态图：图3a为扩增培养第3代的细胞形态图，图3b为扩增培养第5代的细胞形态图，图3c为扩增培养第7代的细胞形态图。由图4可以看到使用实施例6所得无血清扩增培养基扩增人尿源间充质干细胞的形态图：图4a为扩增培养第3代的细胞形态图，图4b为扩增培养第5代的细胞形态图，图4c为扩增培养第7代的细胞形态图。由图3和图4中可以看出低血清扩增培养基和无血清扩增培养基扩增培养的细胞无明显差异。
[0071] 3、对实施例5所得的低血清扩增培养基和实施例6所得无血清扩增培养基培养所得的人尿源间充质干细胞进行表面标记物鉴定(如图5所示)：由图中可以看出CD29、CD73、CD90、CD44等MSC特异性表面标记物强阳性表达，SSEA-4多潜能干性标记物强阳性表达，造血干细胞、内皮细胞来源的标记物CD45、CD34、CD31、HLA-DR等均阴性，提示其MSC来源，在低血清扩增培养基培养过程中，扩增所得细胞维持间充质干细胞特性。
[0072] 4、将实施例5所得的低血清扩增培养基和实施例6所得无血清扩增培养基培养所得的人尿源间充质干细胞进行体外定向诱导，成功的向脂肪、成骨、软骨细胞分化，由图6可以看出(图6a为茜素红标记，图6b为ALP标记，图6c为RUNX2标记，图6d为OCN标记，图6e为脂滴标记，图6f为油红O标记，图6g为
甲苯胺蓝标记，图6h为SOX9标记，图6i为COL II标记)，其中成骨标记物：ALP+，茜素红+，RUNX2、OCN+；成脂标记物：脂滴+；油红O+；成软骨标记物：甲苯胺蓝+，SOX9、COL II+。提示在该低血清及无血清扩增培养基中所得细胞干性强，可向成脂、成骨、成软骨分化。
[0073] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉
本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述
权利要求的保护范围为准。
